KR102628844B1 - 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물은 천연 물질로 구성되어 피부에 안전하고, 우수한 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 갖는다. 보다 구체적으로는 본 발명의 조성물은 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성을 저해하여 피부미백에 효과적으로 작용하며, 피부주름의 생성에 직접적으로 작용하는 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하고, 콜라겐 단백질의 발현을 증가시켜 피부주름의 예방 및 개선에 효과적으로 작용한다.

Description

등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for anti-oxidation, skin whitening and anti-wrinkle containing a mixed fermentation extracts of Wisteria floribunda flowers, Aralia elata flowers, Camellia japonica leafs and Camellia japonica flowers as effective component}
본 발명은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근 천연물 유래의 화장품에 관한 관심이 점점 커지고 있다. 또한 기능성 화장품에 대한 요구가 증가하면서 기능성 성분으로 사용되는 각종 화학성분들로 인하여 오히려 피부의 보호능력이나 재생능력이 저하되는 문제가 발생하고 있다. 이에 따라 스킨, 로션을 비롯해 색조 화장품에 이르기까지 천연물 소재의 화장품을 직접 만들어 사용하는 것이 유행하고 있기도 하다. 아토피 등의 피부질환을 가지고 있거나, 민감성 피부를 가진 사람들의 경우에는 피부 자극을 최소화하면서 피부 개선활성이 우수한 천연물 유래의 화장품에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.
본 발명자들은 독성이 없고 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 우수한 천연소재에 대하여 연구를 수행하였으며, 등나무 꽃 발효 추출물이 우수한 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 나타낸다는 사실을 발견하였다. 또한, 상기 등나무 꽃 발효 추출물에 대한 연구를 계속하던 중, 등나무 꽃을 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃과 혼합하여 발효시킨 경우 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 더욱 좋아질 뿐만 아니라 우수한 항산화 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2011-0001538 A KR 10-2018-0005991 A
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기한 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혼합물의 발효 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혼합물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃이 1 : 0.05-0.5 : 0.2-2 : 0.1-1의 중량비일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혼합물은 상기 혼합물 100 중량부에 대하여 10 내지 20 중량부의 우방자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효는 락토바실러스 람노서스균을 이용하여 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혼합물의 발효 추출물은 상기 혼합물을 발효한 후 초고압 추출하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 혼합물의 발효 추출물은 하기 (1) 내지 (5)의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물일 수 있다:
(1) MMP-1 단백질의 발현 억제 활성;
(2) 프로콜라겐 타입 I 단백질의 발현 촉진 활성;
(3) 티로시나제 활성 저해 활성;
(4) 멜라민 합성 저해 활성; 및
(5) DPPH(1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거 활성.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장 연고, 스프레이, 젤, 팩, 자외선 차단제, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더 및 메이크업 제거제 중에서 선택되는 제형일 수 있다.
또한, 본 발명은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물은 천연물질인 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하여 피부에 안전하고, 우수한 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 갖는다. 보다 구체적으로는 본 발명의 조성물은 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성을 저해하여 피부미백에 효과적으로 작용하며, 피부주름의 생성에 직접적으로 작용하는 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하고, 콜라겐 단백질의 발현을 증가시켜 피부주름의 예방 및 개선에 효과적으로 작용한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 천연 식물 소재들을 대상으로 소재의 활용성을 증대시키기 위해 예의 연구노력한 결과, 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃을 혼합하여 발효시키는 경우, 피부미백 및 피부주름 개선에 탁월한 효과가 있음을 발견하였고, 또한, 피부에 적용시 안전성에도 문제가 없음을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 세포독성이 없고, 항산화 효과가 우수하며, 기질 단백질 분해효소-1(matrix metallo-proteinase, 이하 'MMP'라 함) 단백질 발현을 억제하고 프로콜라겐 타입 I 단백질 발현을 촉진함으로써 피부주름을 효과적으로 억제 및 개선할 수 있는 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 발효 추출물은 시중에서 쉽게 구할 수 있고 안전성이 확보된 천연 식물소재들을 사용하여 현저하게 개선된 피부 미백 및 피부주름 개선 효과를 나타낼 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에서, 상기 “혼합물의 발효 추출물”은 “혼합 발효 추출물”로 기재될 수 있다.
또한, 본 명세서에서, 용어 “등나무 꽃 혼합 발효 추출물”은 “등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 발효 추출물”을 의미한다.
본 발명에서 “등나무(Wisteria floribunda)”는 콩목 콩과의 나무이다. 낙엽이 지는 덩굴성 갈잎나무로 덩굴은 10m 이상이나 길게 뻗어 오른쪽으로 돌면서 다른 물체를 감싼다. 잎은 깃꼴 겹잎으로 어긋나며, 4~6쌍의 작은 잎을 가지는데, 작은 잎들은 끝이 뾰족한 달걀 모양으로 짧은 잎자루를 가지고 있다. 봄이 되면 많은 청자색 나비꽃들이 잎겨드랑이에서 길이 수십 센티미터의 총상꽃차례를 이루면서 달린다. 열매는 길이가 15cm정도 되는 긴 협과를 이루는데, 아래로 늘어지며, 익으면 벌어져 씨가 튀어나오게 된다. 본 발명에서는 등나무 꽃을 사용하였다.
본 발명에서 “두릅나무(Aralia elata)”는 두릅나무과의 낙엽활엽 관목으로서, 새순은 식용하며, 생약의 총목피는 나무껍질을 말린 것이며, 한방에서는 열매와 뿌리를 해수, 위암, 당뇨병, 소화제에 사용하고, 민간에서는 당뇨병에 나무껍질이나 뿌리를 달여 먹는다. 본 발명에서는 두릅나무 꽃을 사용하였다.
본 발명에서 “동백나무(Camellia japonica L.)”는 차나무과에 속하며, 전북 고창, 전남 해남, 완도, 강진, 여수, 광양, 경남, 거제, 남해안 지역과 제주도 등지에서 자라는 상록활엽 소교목이다. 키는 약 15 m, 직경이 약 50 ㎝ 정도로 자라며, 잎 표면은 짙은 녹색이고 광택이 나며 뒷면은 황록색이고 타원형으로 마주나며 길이는 5~12 ㎝, 폭이 3~7 cm 이고 물결 모양의 잔 톱니가 있다. 본 발명에서는 동백나무 잎 및 꽃을 사용하였다.
본 발명에서 “우방자”는 국화과의 두해살이풀인 우엉(Arctium lappa L.)의 열매로써, 대도자, 우채자, 흑풍자 등의 이명으로도 알려져 있다. 우방자는 9월에 수과가 달려 회갈색으로 익는데 갈색의 갓털이 붙어 있고 속에서 검은씨가 나온다. 우방자의 주요 효능으로는 풍열에 의한 해수, 객담, 인후종통 등의 증상을 완화하는데 효과적이다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃의 혼합 발효 추출물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 각각에서 추출한 추출물을 혼합한 후 발효시킨 발효물의 추출물, 또는 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃을 혼합한 후 발효시킨 발효물의 추출물을 의미한다.
본 발명에서 상기 혼합물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃을 1 : 0.05-0.5 : 0.2-2 : 0.1-1의 중량비일 수 있고, 바람직하게는 1 : 0.1-0.4 : 0.5-1.5 : 0.25-0.75의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.15-0.35 : 0.8-1.2 : 0.4-0.6의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.2-0.3 : 0.9-1.1 : 0.45-0.55, 가장 바람직하게는 1 : 0.25 : 1 : 0.5의 중량비일 수 있다. 각각의 중량비가 상기 범위일 때 상기 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃의 혼합 발효에 의한 상승효과를 극대화할 수 있다. 한편, 상기 혼합물의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 피부미백 및 피부주름 개선 효능이 기대에 미치지 못하게 된다.
특히, 본 발명에서 상기 혼합물은 상기 동백나무 잎 및 동백나무 꽃이 2 : 0.5-1.5의 중량비일 수 있고, 바람직하게는 2 : 0.8-1.2의 중량비, 더욱 바람직하게는 2 : 1의 중량비일 수 있다.
또한, 바람직한 일 구체예에서, 상기 혼합물은 상기 혼합물 100 중량부에 대하여 10 내지 30 중량부, 바람직하게는 10 내지 20 중량부, 더욱 바람직하게는 12 내지 18 중량부의 우방자를 더 포함할 수 있다. 상기 우방자가 상기 혼합물에 대하여 상기 중량비로 더 포함될 때 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 더욱 좋아진다. 상기 혼합물에 대한 우방자의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 우방자의 첨가로 인한 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 우방자의 첨가로 인해 증가하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과가 오히려 낮아지는 문제점이 있다.
또한, 본 발명의 혼합 발효 추출물은 상기 혼합물을 통상의 방법에 따라 증류수와 혼합한 현탁액으로 제조한 후 발효시킨 것일 수 있고, 또는 혼합 추출물로 제조한 후 발효시킨 것일 수 있다. 또한, 상기 혼합 추출물은 특별히 제한되지는 않으나 용매 추출법 또는 초고압 처리 추출법으로 추출한 것일 수 있다.
상기 용매 추출에 의한 혼합 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 추출한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 용매 추출에 의한 혼합 추출물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃의 혼합물을 추출용매와 1 : 10 내지 30, 바람직하게는 1 : 15 내지 25, 더욱 바람직하게는 1 : 18 내지 22의 중량비로 혼합하여 65 내지 95 ℃, 바람직하게는 70 내지 90 ℃, 더욱 바람직하게는 75 내지 85 ℃에서 1 내지 10시간, 바람직하게는 1 내지 5시간 동안 추출한 후 감압농축을 수행하여 제조한 것일 수 있다. 상기 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
상기 용매 추출을 위한 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 상기 저급알코올로는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올을 들 수 있다.
상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 60 내지 80%의 에탄올 수용액으로 추출된 추출물이 피부미백 및 피부주름 개선에 바람직하게 작용한다.
또한, 상기 초고압 추출에 의한 혼합 추출물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃의 혼합물을 초고압 처리하여 추출한 것일 수 있다. 이때, 초고압 처리는 100 내지 3000 ㎫의 압력에서 40 내지 90℃의 온도로 1 내지 24 시간 동안 처리하는 것을 의미하며, 바람직하게는 500 내지 1000 ㎫의 압력에서 40 내지 60℃의 온도 및 12 내지 24시간 처리이며, 가장 바람직하게는 1000 ㎫의 압력에서 50℃의 온도 및 24 시간 동안 처리하는 것을 의미한다. 상기 초고압 처리를 위해 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리에칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매를 가할 수 있다.
상기와 같이 수득된 혼합물의 현탁액 또는 혼합 추출물은 발효균을 이용하여 20 내지 40℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 7을 유지하면서 1 내지 7일간 발효시켜 혼합 발효 추출물로 제조될 수 있다.
이때, 상기 현탁액 또는 혼합 추출물은 발효균의 기본 배지에 1 내지 20 중량%로 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 발효균은 효모균, 유산균, 바실러스속 균 및 이의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 유산균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스속 유산균일 수 있고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 람노너스, 락토바실러스 플란타럼, 및 락토바실러스 애시도필러스 중에서 선택되는 1종 이상의 유산균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 람노너스일 수 있고, 가장 바람직하게는 락토바실러스 람노너스 HK-9(KCCM11254P4)일 수 있다.
상기 발효균은 발효균 자체로 첨가되거나 배양액으로 접종될 수 있다. 상기 배양액은 균주를 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 농축한 농축액 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 혼합 발효 추출물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 현탁액, 또는 혼합 추출물에 락토바실러스 람노너스 HK-9(KCCM11254P4)을 적정한 양, 예를 들면 1 × 108 내지 5 × 109 cfu/mL 농도로 접종한 후, 25 내지 45 ℃에서 36 내지 60 시간 동안, 바람직하게는 30 내지 40 ℃에서 40 내지 55 시간 동안 발효시켜 수득한 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 혼합 발효 추출물은 피부미백 및 피부주름 개선 활성을 증가시키기 위하여 상기 혼합물을 발효시킨 후 초고압 추출한 것일 수 있다.
바람직한 일 구체예로서, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃의 혼합물을 용매 추출하여 등나무 꽃 혼합 추출물을 수득하는 단계; 상기 등나무 꽃 혼합 추출물을 효모균, 유산균, 바실러스속 균 및 이의 혼합물 중에서 선택되는 균으로 발효시켜 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 100 내지 3000 ㎫의 압력에서 40 내지 90℃의 온도로 1 내지 24 시간 동안 초고압 추출하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물에 초고압 추출하는 단계를 더 추가하여 수행하는 경우 초고압 추출을 하지 않은 경우에 비해 피부미백 및 피부주름 개선 효능이 현저히 증가한다.
또한, 본 발명의 혼합 발효 추출물은 발효 후 여과, 유기용매 환류추출, 감압농축, 동결건조 등의 과정을 추가하여 거칠 수도 있다. 상술한 혼합 발효 추출물을 여과, 정제 및 농축 과정을 거친 혼합 발효 추출물도 본 발명에 포함되는 것은 당업계에서 자명한 일이다.
특히, 본 발명의 일 실시예에서는 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 발효 추출물 내 유효성분들 간의 상승효과 또는 협업작용에 의하여 상기 각각의 식물의 단독 발효 추출물에 비해 더욱 우수한 MMP-1 단백질 발현 억제 활성, 프로콜라겐 타입 I 단백질의 발현 촉진 활성, 티로시나제 활성 저해 활성, 및 멜라민 합성 저해 활성이 있음을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 각각의 단독 발효 추출물 보다 MMP-1 단백질의 발현을 더욱 감소시키고, 프로콜라겐 타입 I 단백질의 발현을 더욱 증가시켜, 결과적으로 더욱 우수한 피부주름 개선 효능을 나타낼 수 있었다.
특히, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 혼합 발효 추출물 내 유효성분들 간의 상승효과 또는 협업작용에 의하여 상기 각각의 식물의 단독 발효 추출물에 비해 티로시나제 활성 및 멜라민 합성을 더욱 저해하여, 결과적으로 더욱 우수한 피부미백 효능을 나타낼 수 있었다.
한편, 본 발명의 발명자들은 구체적인 실험을 통해 상기 조성물에 대한 피부누적 자극을 시험한 결과 인체에 무해한 물질임을 확인하였다. 또한, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 혼합 발효 추출물은 혼합 발효 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 발효 추출 후 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 혼합 발효 추출물은 광의로는 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃을 동물에게 도포 또는 투여할 수 있도록 제형화된 등나무 꽃 혼합 발효 추출물의 가공물, 예컨대, 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 등나무 꽃 혼합 발효 추출물로 실험을 진행하긴 하였으나, 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 등나무 꽃 혼합 발효 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 효과적인 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효능을 제공하기에 바람직한 임의의 함량으로 조성물에 존재할 수 있다. 일 양태에 따르면, 상기 혼합 발효 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 99.9 중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.0001 내지 30 중량%, 더욱 바람직하게는 0.0001 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 5 중량%로 포함될 수 있다. 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 피부 개선 효과가 나타나지 않고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적인 면에서도 바람직하지 못하다. 즉, 본 발명의 혼합 발효 추출물이 조성물 내에 상기 범위로 포함됨으로써, 우수한 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선 효과를 구현할 수 있고 제형 및 제품 안정성을 가지며 경제성 면에서도 최적의 함량으로 우수한 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 인 비트로 실험 결과, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물의 농도가 상기 범위인 경우에는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선에 대하여 유의적인 효과가 나타나면서도 세포독성 등의 부작용이 나타나지 않았다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 등나무 꽃 혼합발효 추출물을 유효성분으로 포함하여 미백 효과를 발휘할 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물로부터 유래한 미백 활성 성분을 유효성분으로 포함하므로, 현저한 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내어 멜라닌 생합성 억제 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 피부주름은 광노화 또는 자연노화에 의한 것일 수 있고, 광노화에 의한 것이 보다 바람직하며, UV 노출에 의한 광노화인 것이 더욱 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 피부주름은 MMP 효소의 활성을 기반으로 하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, UV 노출 후 피부의 주요 구성물질인 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP의 발현 및 활성 증가로 인하여 피부주름 생성이 촉진된다.
또한, 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 콜라겐 분해를 촉진시키는 기질 단백질 분해효소-1(matrix metallo-proteinase)의 발현을 억제시키면서, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시키는바, 피부 탄력 증가, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과 등을 가질 수 있다. 즉, 피부주름의 예방 또는 개선의 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 피부주름 개선용 화장료 조성물에 포함된 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 그 자체로 피부주름을 제거하는 효과가 있으며, 기존에 알려진 피부 주름 개선에 효과가 있다고 공지된 물질들과 혼합하여 사용하는 경우에도 피부 주름의 예방 또는 개선 효과를 지속적으로 유지할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물은 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 이외에 피부학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 보습제는 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 솔비톨, 헥실렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 디글리세린, 1,2-헥산디올, 판테놀, 베타인, 스쿠알란, 바셀린, 유동파라핀 및 하이드롤라이즈드 밀 글루텐 중 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형 비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 피부 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서의 용어, “혼합 발효 추출물”은 상술한 바와 같다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 용어 “예방”이란, 상기 피부색소 침착 또는 피부주름 증가를 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 것을 의미한다.
본 발명의 용어 “개선”이란, 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 피부색소 침착 또는 피부주름의 정도를 적어도 감소시키는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 개선 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일 양태에 따르면, 상기 등나무 꽃 혼합 발효 추출물은 0.001 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
상기 건강식품 조성물에 함유된 상기 유효성분의 유효용량은 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류, 섭취자의 연령, 체중, 일반 건강상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 섭취 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 피부미백 및 피부주름 개선 효능을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 상기 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 및 비교예>
실시예 1: 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 제조 - 1 : 0.25 : 1 : 0.5의 중량비
(1) 등나무 꽃 혼합 추출물의 제조
등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃을 1 : 0.25 : 1 : 0.5의 중량비로 혼합하고 분쇄한 후 300 메시 체에 통과시켜 분쇄물을 제조하였다.
상기 혼합 분쇄물과 70% 에탄올 수용액을 1 : 20의 중량비로 혼합한 후 80 ℃에서 3 시간 동안 추출하여 등나무 꽃 혼합 용매 추출물을 수득하였다. 상기 수득된 추출물은 여과 및 감압 농축을 거쳐 동결건조로 분말화하였다.
(2) 등나무 꽃 혼합 발효 추출물의 제조
1) 한국미생물보존센터로부터 수득한 락토바실러스 람노서스 HK-9(기탁번호: KCCM11254P)를 55%의 MRS 배지와 0.5% L-Cysteine hydrochloride를 첨가하여 제조한 배지가 있는 진탕항온배양기에 넣고, 50~60 rpm, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하여 유산균 배양액을 제조하였다.
2) 증류수에 (1) 단계에서 수득한 등나무 꽃 혼합 추출물 5 중량%를 혼합하고, 121 ℃에서 15분 동안 멸균하여 발효를 위한 등나무 꽃 혼합 추출물을 준비하였다.
3) 상기 등나무 꽃 혼합 추출물에 유산균 배양액(3×109 cfu/ml) 5 %(v/v)를 접종하고, 37 ℃, 150 rpm 조건에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 이후, 상기 발효물을 3,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 상등액을 취한 후 0.25 μM 여과지를 이용하여 여과하고 감압 농축을 거쳐 동결건조로 분말화하였다.
실시예 2: 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 제조 - 1 : 1 : 1 : 1의 중량비
실시예 1과 동일하게 실시하되, 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃을 1 : 1 : 1 : 1의 중량비로 혼합하여 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 제조하였다.
실시예 3: 등나무 꽃 혼합 발효 추출물의 제조 - 우방자 추가
실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물 100 중량부에 대하여 우방자 15 중량부를 더 혼합하여 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 제조하였다.
실시예 4: 등나무 꽃 혼합 초고압 추출물의 제조
실시예 1의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물에 2배 부피의 증류수를 가한 후 고압처리기를 이용하여 압력 1000MPa 하에서 온도를 50℃로 승온시키고 24시간 동안 초고압 처리한 후 실온으로 냉각시켰다. 상기 초고압 처리한 등나무 꽃 혼합 발효 추출물과 70%(v/v) 에탄올 수용액을 1 : 20의 중량비로 혼합한 후 80 ℃에서 3 시간 동안 추출하여 등나무 꽃 혼합 발효 초고압 추출물을 수득하였다. 상기 수득된 추출물은 여과 및 감압 농축을 거쳐 동결건조로 분말화하였다.
비교예 1: 등나무 꽃 단독 발효 추출물
실시예 1과 동일하게 실시하되, 등나무 꽃만을 이용하여 등나무 꽃 단독 발효 추출물을 제조하였다.
비교예 2: 두릅나무 꽃 단독 발효 추출물
실시예 1과 동일하게 실시하되, 두릅나무 꽃만을 이용하여 두릅나무 꽃 단독 발효 추출물을 제조하였다.
비교예 3: 동백나무 잎 단독 발효 추출물
실시예 1과 동일하게 실시하되, 동백나무 잎만을 이용하여 동백나무 잎 단독 발효 추출물을 제조하였다.
비교예 4: 동백나무 꽃 단독 발효 추출물
실시예 1과 동일하게 실시하되, 동백나무 꽃만을 이용하여 동백나무 꽃 단독 발효 추출물을 제조하였다.
비교예 5: 등나무 꽃을 제외한 혼합 발효 추출물
실시예 1과 동일하게 실시하되, 등나무 꽃을 제외하고 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃만을 이용하여 혼합 발효 추출물을 제조하였다.
비교예 6: 등나무 꽃 혼합 추출물 - 발효 생략
실시예 1과 동일하게 실시하되, (1) 단계만을 실시하여 등나무 꽃 혼합 추출물을 제조하였다.
<시험예>
통계 처리
모든 통계 분석은 SPSS 버전 18.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었다. Duncan의 post-hoc test를 이용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 실험군 간의 평균값의 차이(p <0.05)를 결정하였다. 하기 실험은 각각 적어도 3번 이상 반복하였으며, 각각의 실험데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시하였다.
시험예 1: MTT assay를 이용한 세포독성 평가
세포 독성은 MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)환원 방법을 이용하여 측정하였다.
전배양된 HaCaT 세포를 DMEM 배지에 잘 혼합한 후 1x105 cells/mL로 조정한 다음, 24-well 배양판에 준비된 세포를 1 mL씩 첨가한 후 3-4일 배양하였다. 세포가 80% 정도 성장했을 때 우태아 혈청과 항생제를 첨가하지 않은 배지에 다양한 농도의 시료(50, 100, 500, 1000 및 2000 ㎍/mL)로 처리한 후, 24시간 더 배양을 하고, 배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT 환원 방법을 이용하여 측정하였다.
각 well에 MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지 부피의 10분의 1 가량 가한 후, 다시 37 ℃에서 4시간 더 배양하였다. 그리고, MTT를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 조심하며 배지를 제거하고, 남아 있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 DMSO를 이용하여 시료를 용해시킨 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 수학식 1과 같이 계산한 후, 하기 표 1에 나타내었다.
[수학식 1]
세포 생존율(%) = (시료처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100
구분 세포 생존율(%)
시료 처리농도(㎍/mL)
50 100 500 1000 2000
대조군 (무처리군) 100
실시예 1 113.1 132.3 116.5 99.7 94.9
실시예 2 121.2 141.4 123.1 110.3 96.6
실시예 3 108.6 124.5 110.2 101.2 95.4
실시예 4 108.7 126.1 109.9 102.4 93.8
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 혼합 발효 추출물은 2,000 ㎍/mL까지는 인간 피부에 안전하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
시험예 2: 항산화 활성(DPPH 라디칼 소거능)
시험물질을 증류수에 녹인 후, 다양한 농도로 희석한 시험액을 준비하였다.
96-well plate에 다양한 농도로 희석한 시험액 100 μL와 0.15 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액 100 μL을 넣고 혼합하여 실온에 30분간 반응시킨 후 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 유리 라디칼의 제거 활성을 나타냈으며, 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다. DPPH radical 소거능은 아래의 식으로 산출하였고, SC50값은 각 농도별 radical 소거능에 대한 검량선에서 radical 소거능이 50%가 되는 농도를 계산하여 하기 표 2에 나타내었다.
[수학식 2]
DPPH 라디칼 소거능(%) = (1-A/B) x 100
(A: 시료 첨가구의 흡광도, B: 무처리구의 흡광도)
구분 DPPH 라디칼 소거능(%) SC50
(㎍/mL)
시료 처리농도(㎍/mL)
50 100 200 300 500
대조군
(무처리군)		 100
실시예 1 27.7±2.5 39.5±4.8 55.1±3.3 64.4±5.9 69.8±6.3 166.5±9.4
실시예 2 20.4±0.6 31.1±1.2 48.2±2.3 56.7±1.4 60.7±1.7 225.6±11.7
실시예 3 33.1±1.2 44.7±3.5 60.4±4.7 69.7±5.2 76.3±0.7 137.8±16.3
실시예 4 43.1±2.9 54.1±2.3 69.6±1.2 76.2±1.6 83.6±2.6 82.7±9.1
비교예 1 13.7±1.1 19.8±0.7 26.2±1.5 32.1±2.4 35.7±2.0 -
비교예 5 16.7±1.3 25.4±1.9 40.6±2.8 51.2±3.7 54.8±1.5 290.4±21.6
비교예 6 15.3±1.4 24.5±3.3 36.3±2.6 47.1±2.1 51.4±3.3 451.8±10.2
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 혼합 발효 추출물이 비교예에 비해 현저히 우수한 항산화 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3: 미백 효과
3-1: 티로시나제 활성 저해능
Tyrosine을 수산화 (hydroxylation)하여 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)로 변화하는 tyrosinase의 tyrosine hydroxylase 활성 저해능을 평가하였다. 시험물질을 증류수로 녹이고 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5)에 희석하여 다양한 농도의 시험액을 각각 준비하였다. 96-well plate에 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) 170 μL, 다양한 농도로 희석한 시험액 10 μL, 2000 unit/mL mushroom tyrosinase 10 μL 및 1.5 mM L-tyrosine 10 μL를 순차적으로 넣은 후 혼합하여 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 공시험액의 흡광도는 시험액 대신 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5)를 넣어 동일한 방법으로 반응하여 측정하였다. 티로시나제 효소 활성 억제율은 아래의 식으로 산출하여 하기 표 3에 나타내었다.
[수학식 3]
효소 활성 억제율 (%) = (A-B)/A x 100
(A: 공시험액의 반응 후 흡광도, B: 시험액의 반응 후 흡광도)
구분 티로시나제 활성 억제율(%)
시료 처리농도(㎍/mL)
50 100 200 300
대조군 (무처리군) 100
실시예 1 19.3±3.0 39.1±0.5 58.5±1.3 62.5±1.3
실시예 2 14.4±1.5 28.2±1.3 45.2±1.0 49.7±0.5
실시예 3 23.2±2.2 48.6±1.2 67.6±0.6 71.7±1.0
실시예 4 26.7±0.2 56.8±0.4 74.5±0.5 79.1±2.4
비교예 1 11.5±2.3 21.2±1.5 29.3±2.7 34.6±0.5
비교예 2 8.6±1.2 15.4±0.8 17.5±1.9 21.5±0.1
비교예 3 7.5±2.0 11.3±0.7 15.1±0.5 17.5±0.6
비교예 4 - 8.5±1.3 12.5±0.8 15.4±0.3
비교예 5 10.3±1.3 19.5±2.2 27.7±2.6 31.6±1.9
비교예 6 13.7±1.1 21.6±1.9 32.4±2.4 39.5±2.0
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 혼합 발효 추출물의 티로시나제 억제 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
3-2: 멜라민 합성 저해능
B16F10 세포 배양
생쥐에서 유래한 흑색종 세포인 B16F10 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco-Invitrogen, carlabad, CA, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 세포배양액을 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
B16F10 세포에서 생성된 melanin 함량 측정
B16F10 세포를 5 × 104 cells/well이 되도록 12-well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 100 nM α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH, Sigma-Aldrich) 및 다양한 농도의 시험물질을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환하여 세포를 배양하였다. 72시간 동안 세포를 배양한 후 세포 단층을 PBS로 세척한 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA를 처리하여 세포를 회수하였고, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 pellet을 얻었다. 획득한 pellet에 10% dimethylsulfoxide (DMSO)를 함유된 1 N NaOH를 넣어 60℃에서 용해시킨 후 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 합성 melanin을 이용한 검량선으로부터 melanin의 양을 산출하였고, BCA protein assay kit (Thermo Scientific)을 사용하여 단백질을 측정하여 melanin 생성량을 단백질 양으로 표준화한 후 α-MSH(자극제) 만을 처리한 군의 값을 100으로 하여 상대적인 값으로 나타내었다. 이때 양성대조군은 멜라졸브(Melasolv) 40 μM을 처리한 시험군이다. 참고로, α-MSH 및 시료를 모두 처리하지 않은 무처리군의 멜라닌 함량은 44.1±8.8%로 측정되었다.
구분 멜라닌 함량 (% of control)
시료 처리농도(㎍/mL)
50 100 200 300
α-MSH only 100
멜라졸브 + α-MSH 39.6±4.7
실시예 1 + α-MSH 89.9±2.4 78.7±6.2 64.2±1.5 55.0±2.7
실시예 2 + α-MSH 95.3±1.5 86.6±2.1 73.1±0.7 64.2±1.6
실시예 3 + α-MSH 86.2±1.3 74.5±2.7 58.5±2.4 47.3±2.1
실시예 4 + α-MSH 83.1±1.2 68.1±0.8 52.6±0.3 41.1±1.6
비교예 1 + α-MSH 98.4±0.6 95.2±2.7 89.1±1.2 83.3±1.5
비교예 2 + α-MSH 99.5±1.3 98.3±1.1 95.6±2.9 91.6±2.2
비교예 3 + α-MSH 98.2±2.6 97.3±2.0 95.1±2.6 90.3±3.1
비교예 4 + α-MSH 98.9±2.1 96.1±1.3 92.2±1.5 87.4±1.3
비교예 5 + α-MSH 98.1±0.2 96.2±1.8 92.3±0.7 85.1±0.3
비교예 6 + α-MSH 92.9±1.4 89.2±2.0 83.4±3.8 76.7±2.6
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 혼합 발효 추출물의 멜라닌 합성 억제 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
시험예 4: 피부주름 개선 효과
4-1: 타입 1 프로콜라겐 단백질의 합성 촉진
HS68 세포 배양
인간에서 유래한 피부 섬유아세포인 HS68 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. HS68 세포는 DMEM 배지 (Welgene)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액 (complete DMEM 배양액)을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
HS68 세포가 생성 분비한 타입 1 프로콜라겐 함량 측정
HS68 세포를 1 × 105 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도로 함유한 serum-free 세포배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 Procollagen Type I C-Peptide (PIP) EIA Kit (Takara)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 함량을 측정하였고, 시료를 처리하지 않은 무처리군의 값에 대한 상대적인 값으로 하기 표 5에 나타내었다. 이때 양성대조군은 TGF-β1 5 ng/mL를 처리한 시험군이다.
구분 타입 1 프로콜라겐 함량 (% of control)
시료 처리농도(㎍/mL)
50 100 200 300 500
무처리군 100
TGF-β1 371.0±6.0
실시예 1 246.6±22.7 255.1±20.7 271.8±15.9 275.4±0.7 282.9±5.1
실시예 2 150.2±11.0 163.1±12.6 172.4±9.7 189.8±8.9 205.1±6.5
실시예 3 267.7±13.8 284.3±3.4 309.4±6.7 316.8±9.1 325.5±1.9
실시예 4 292.8±11.2 326.6±11.6 345.8±11.2 357.9±1.6 368.5±6.2
비교예 1 103.6±2.3 109.2±10.4 116.4±11.5 115.9±10.1 125.6±4.7
비교예 2 100.8±11.2 102.5±11.0 103.7±13.6 106.1±12.7 105.5±6.3
비교예 3 131.2±10.5 148.6±12.4 155.4±9.5 172.2±10.2 186.6±8.1
비교예 4 109.4±5.1 116.1±10.1 124.8±11.3 134.8±9.9 137.2±10.8
비교예 5 134.8±13.5 156.4±11.0 162.8±16.1 186.1±7.6 195.1±7.3
비교예 6 128.6±10.7 148.8±7.5 156.3±10.4 174.7±5.7 183.6±9.7
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 혼합 발효 추출물이 타입 1 프로콜라겐의 생성을 촉진시키는 작용을 통해 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
4-2: MMP-1 단백질의 합성 저해
HS68 세포를 1 × 105 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도로 함유한 serum-free 세포배양액으로 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 Human MMP-1 ELISA Kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 MMP-1 함량을 측정하였고, 시료를 처리하지 않은 무처리군의 값에 대한 상대적인 값으로 하기 표 6에 나타내었다. 참고로, 시료를 처리하지 않은 무처리군의 MMP-1 함량은 4.21±0.10 ng/mL로 측정되었다.
구분 MMP-1 함량 (% of control)
시료 처리농도(㎍/mL)
50 100 200 300 500
무처리군 100
실시예 1 64.6±2.7 58.1±2.7 54.8±1.9 51.4±0.7 48.3±5.1
실시예 2 73.2±1.0 66.1±2.6 63.4±4.7 60.8±4.9 57.1±6.5
실시예 3 58.7±3.8 49.3±3.4 46.4±3.7 45.8±4.1 42.5±1.9
실시예 4 56.8±1.2 45.6±1.6 42.8±1.2 40.9±1.6 38.5±2.2
비교예 1 93.6±2.3 89.2±10.4 83.4±11.5 82.9±10.1 83.6±4.7
비교예 2 100.8±11.2 102.5±11.0 98.7±3.6 96.1±7.7 95.5±6.3
비교예 3 88.2±10.5 83.6±1.4 75.4±9.5 72.2±10.2 70.6±5.1
비교예 4 92.4±5.1 86.1±10.1 83.8±6.3 79.8±9.9 77.2±1.8
비교예 5 84.8±3.5 78.4±8.0 72.8±6.1 70.1±7.6 68.1±1.3
비교예 6 86.5±2.6 80.1±3.4 75.9±2.7 72.5±6.1 68.6±2.4
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예에 따른 혼합 발효 추출물이 MMP-1 발현을 억제하는 작용을 통해 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
<제조예 1> 화장품(에센스)의 제조
하기 표 7 및 표 8에 나타낸 바와 같은 조성으로 실시예 및 비교예에 따른 혼합 발효 추출물을 각각 적용한 화장료 조성물로 에센스를 제조하였다.
구성성분 함량(중량%)
제조예 1-1 제조예 1-2 제조예 1-3 제조예
1-4
실시예 1 0.2 - - -
실시예 2 - 0.2 - -
실시예 3 - - 0.2 -
실시예 4 - - - 0.2
트리에탄올아민 0.25 0.25 0.25 0.25
카르복시비닐폴리머(1) 0.22 0.22 0.22 0.22
글리세린 4.0 4.0 4.0 4.0
프로필렌글리콜 0.2 0.2 0.2 0.2
파라옥시안식향산
에스테르		 0.2 0.2 0.2 0.2
밀납 0.5 0.5 0.5 0.5
세토스테아릴알콜 1.0 1.0 1.0 1.0
글리세릴모노
스테아레이트		 1.0 1.0 1.0 1.0
모노스테아린산
소르비탄(2) 		0.5 0.5 0.5 0.5
모노스테아린산
폴리에틴렌글리콜		 8.0 8.0 8.0 8.0
파라옥시안식향산프로필 0.1 0.1 0.1 0.1
디메틸실록산 0.3 0.3 0.3 0.3
이소세틸
옥타노에이트(3) 		3.0 3.0 3.0 3.0
스쿠알란 5.0 5.0 5.0 5.0
향료 적량 적량 적량 적량
증류수 잔량 잔량 잔량 잔량
* 주1: 카르복시비닐폴리머 - 미국 비.에프.굿리치(B.F.Goodrich)사의 카보폴 941(Carbopol 941) 1 중량% 수용액* 주2: 모노스테아린산소르비탄 - 영국 아이시아이(ICI)사의 아라셀 60(Arlacel 60)
* 주3: 이소세틸옥타노에이트 - 일본 니혼 고쿄 알코올(Nihon KoKyu Alcohol)사의 아이시이에이치(ICEH)
구성성분 함량(중량%)
비교제조예 1 비교제조예 2 비교제조예 3 비교제조예 4 비교제조예 5 비교제조예 6
비교예 1 0.2 - - - - -
비교예 2 - 0.2 - - - -
비교예 3 - - 0.2 - - -
비교예 4 - - - 0.2 - -
비교예 5 - - - - 0.2 -
비교제조예 6 - - - - - 0.2
트리에탄올아민 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
카르복시비닐폴리머(1) 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22
글리세린 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
프로필렌글리콜 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
파라옥시안식향산
에스테르		 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
밀납 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
세토스테아릴알콜 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
글리세릴모노
스테아레이트		 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
모노스테아린산
소르비탄(2)		 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
모노스테아린산
폴리에틴렌글리콜		 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0
파라옥시안식향산프로필 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
디메틸실록산 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
이소세틸
옥타노에이트(3)		 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
스쿠알란 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
향료 적량 적량 적량 적량 적량 적량
증류수 잔량 잔량 잔량 잔량 잔량 잔량
시험예 5: 피부 보습 효과
제조예 및 비교제조예의 화장료 조성물에 대한 임상 보습 효과 및 지속력을 다음과 같이 측정하였다.
설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 120명을 선정하여 무작위로 12개의 그룹(각 10명)으로 나눈 뒤, 각각의 그룹에 제조예 1-1 내지 1-6 및 비교제조예 1 내지 5에 따라 제조된 에센스를 매일 2회씩(아침/저녁) 30일 동안 얼굴 전면에 도포하게 하였다. 이때, 상기 에센스를 도포하기 전에 미리 항온, 항습 조건(24 ℃, 습도 40%)에서 수분측정기(Corneometer, CM825 courage Khazaka electronic GmbHtk, Germany)를 이용하여 피부 수분량을 측정한 뒤 이를 기본값으로 하고, 30일이 경과한 후 피부 수분량을 측정하여, 이의 변화량을 평가하였다. 참고로, 상기 수분측정기의 측정 수치는 피부 수분량이 높을수록 증가하며, 측정 계수는 Arbitrary unit(A.U.)이다. 실험 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
구분 도포 전 30일 경과 후 피부 수분 증가율(%)
대조군(무처리군) 25.76 26.03 1.05
제조예 1-1 24.95 45.62 84.26
제조예 1-2 24.20 39.52 63.31
제조예 1-3 25.17 49.19 95.45
제조예 1-4 25.06 51.80 107.21
비교제조예 1 23.90 38.18 59.75
비교제조예 2 23.50 31.09 32.30
비교제조예 3 23.22 25.64 10.42
비교제조예 4 25.23 34.46 36.58
비교제조예 5 23.19 34.41 48.37
비교제조예 6 24.25 36.42 50.19
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 제조예에 따른 화장료 조성물이 비교제조예의 화장료 조성물에 비해 피부 보습 효과 및 지속력이 현저히 높은 것이 확인되었다.
시험예 6: 인체 첩포 시험
인체 첩포시험은 헬싱키 선언에 근거한 윤리규정 및 식품의약품안전처 화장품 인체적용시험가이드라인에 따라 실시되었으며, Frosch & Kligman이 고안한 방법(J. Am. Acad. Dermatol, 1(1) 35 (1979))을 응용하여 특정 피부질환 및 알레르기가 없는 20세 ~ 60세의 건강한 여성 피험자 48명(평균연령 41.34±8.06세)을 대상으로 실시하였다. 먼저, 첩포 부위를 70% ethanol로 소독한 후 실시예 1 내지 6의 시료(5.0 mg/mL) 20 ㎕가 적용된 Van der Bend (Van der Bend, Netherlands)를 첩포하였다. 48 h 후 첩포를 제거하고 skin marker (Chemotechnique Diagnostics AB, Sweden)로 시험 부위를 표시하였으며, 20 min, 24 h 후에 각 시험 부위의 반응도를 평가하였다. 일차 피부자극 시험(Skin Primary irritation Test)의 평가 기준은 하기 표 10에 제시한 PCPC Guidelines의 판정 기준에 따랐으며, 2회에 걸쳐 평가한 피부 반응의 정도(평균 반응도)를 하기 수학식 4에 따라 점수화하였다.
반응도 임상 증상(반응)
0 무반응
1 희미한 또는 가벼운 홍반
2 보통의 홍반; 및 첩포 경계에서 가까스로 감지할 수 있는 부종 및/또는 구진 형성
3 보통의 홍반; 및 첩포 부위 전반에 퍼진 부종
4 심한 홍반; 및 심한 부종; 또는 수포 발생
5 첩포 부위를 넘어서서 심각한 반응이 퍼짐
[수학식 4]
평균반응도 = [(반응도 × 반응이 나타난 피검자수)/(총피검자수 × 최고점수(5점)) × 100] × 1/2
인체 피부에서의 피부 자극 정도를 평가하기 위하여 액상 상태의 실시예 1 내지 6의 시료 20 μL를 각각 8명의 피험자(총 48명)에 첩포하여 인체 첩포 시험을 실시하고, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
구분 반응이 나타난 피검자수(명) 반응도
24 시간 48 시간 평균
음성 대조군 0 0.0 0.0 0.0
실시예 1 0 0.0 0.0 0.0
실시예 2 0 0.0 0.0 0.0
실시예 3 0 0.0 0.0 0.0
실시예 4 0 0.0 0.0 0.0
상기 표 11를 살펴보면, 본 발명의 실시예에 따른 조성물을 첩포하여 피부 자극 정도를 평가한 결과 48명의 피험자가 모두 반응 등급이 0.0으로서 음성 반응을 나타냈으므로, 본 발명의 조성물은 인체 피부 일차 자극 측면에서 무자극 물질로 판단된다.
하기 본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 2> 화장품의 제조
<2-1> 유연화장수(스킨)
본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 항산화용, 피부 보습용, 피부 여드름 개선용 또는 피부 트러블 개선용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 표 12에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 0.2
글리세린 6.0
1,3-부틸렌글라이콜 3.0
피이지1500 1.0
알란토인 0.1
DL-판테놀 0.3
EDTA-2Na 0.02
벤조페논-9 0.04
소듐하이알루로네이트 5.0
에탄올 10.0
폴리소르베이트20 0.2
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
<2-2> 영양화장수(로션)
본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 항산화용, 피부 보습용, 피부 여드름 개선용 또는 피부 트러블 개선용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 13에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 0.2
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 1.2
토코페릴아세테이트 3.0
유동 파라핀 5.0
스쿠알란 3.0
마카다미너트오일 2.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 1.0
카르복시비닐폴리머 1.0
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
<2-3> 영양크림
본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 항산화용, 피부 보습용, 피부 여드름 개선용 또는 피부 트러블 개선용 영양크림을 제조하기 위해 하기 표 14에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 0.2
친유형 모노스테아린산글리세린 1.5
세테아릴 알코올 1.5
스테아린산 1.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.6
이소스테아릴이소스테아레이트 5.0
스쿠알란 5.0
광물유 35.0
디메치콘 0.5
하이드록시에칠셀룰로오스 0.12
글리세린 6.0
트리에탄올아민 0.7
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
<2-4> 마스크 팩용 유액
본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 포함하는 항산화용, 피부 보습용, 피부 여드름 개선용 또는 피부 트러블 개선용 마스크팩용 유액을 제조하기 위해 하기 표 15에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량(중량%)
실시예 1의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 0.2
폴리비닐알코올 15.0
셀룰로오스 검 0.15
글리세린 3.0
PEG 1500 2.0
사이클로덱스트린 0.15
DL-판테놀 0.4
알란토인 0.1
글리시리진산모노암모늄 0.3
니코틴아마이드 0.5
에탄올 6.0
PEG 40 경화 피마자유 0.3
방부제, 향, 색소 미량
증류수 잔량
합계 100
<제조예 3> 건강기능식품의 제조
<3-1> 건강 음료의 제조
본 발명의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물을 하기 표 16의 성분 및 함량으로 포함하는 건강 음료를 통상적인 방법에 따라 제조하였다.
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 표 16의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
성분 함량
실시예 1의 등나무 꽃 혼합 발효 추출물 500 mg
구연산 1000 mg
올리고당 10 g
매실 농축액 2.0 g
타우린 1.0 g
정제수 잔량
합계 100g
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (7)

  1. 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃 혼합물의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하되,
    상기 혼합물은 등나무 꽃, 두릅나무 꽃, 동백나무 잎 및 동백나무 꽃이 1 : 0.05-0.5 : 0.2-2 : 0.1-1의 중량비이고,
    상기 발효는 락토바실러스 람노서스균을 이용하여 이루어진 것을 특징으로 하는 항산화, 피부미백 및 피부주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물의 발효 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물은 상기 혼합물 100 중량부에 대하여 10 내지 20 중량부의 우방자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 혼합물의 발효 추출물은 상기 혼합물을 발효한 후 초고압 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물의 발효 추출물은 하기 (1) 내지 (5)의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    (1) MMP-1 단백질의 발현 억제 활성;
    (2) 프로콜라겐 타입 I 단백질의 발현 촉진 활성;
    (3) 티로시나제 활성 저해 활성;
    (4) 멜라민 합성 저해 활성; 및
    (5) DPPH(1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거 활성.
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