KR102617148B1 - 비이온성 계면활성제 및 폴리펩티드를 포함하는 조성물에서 비이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 크로마토그래피 방법 - Google Patents
비이온성 계면활성제 및 폴리펩티드를 포함하는 조성물에서 비이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 크로마토그래피 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리펩타이드 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물 중의 비이온성 계면활성제를 정량화하는 방법을 제공하고, 여기서 정량화는 비이온성 계면활성제와 폴리펩타이드 사이에 감소된 간섭을 나타낸다. 또한, 조성물이 N-아세틸 트립토판을 추가로 포함하고, 정량화가 비이온성 계면활성제, 폴리펩타이드 및 N-아세틸 트립토판 사이에 감소된 간섭을 나타내는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2016년 8월 15일자로 출원된, 미국 가특허출원 제62/375,373호에 대한 우선권을 청구하며, 이의 기재내용은 본 명세서에 이의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 폴리소르베이트의 존재를 위한, 폴리펩타이드의 제형을 분석하기 위한 방법을 제공한다.
폴리소르베이트 20 (PS20)은 가공 및 저장 동안의 물리적 손상으로부터 생성물을 보호하기 위하여 폴리펩타이드 제형 내에서 통상적으로 사용되는 계면활성제이다 (Kerwin, B., 2007, J. Pharm. Sci., 97(8): 2924-2935). 생성물 안정성에 대한 이의 중요성으로 인하여, PS20은 각 생성물의 조절 시스템 내에서 정확하게 정량화되어야 한다. PS20은 분광광도법 검정, 형광 미셀 검정, 또는 고성능 액체 크로마토그래피-증발 광 산란 검출기 (HPLC-ELSD) 검정에 의해 정량화될 수 있다 (참고: 예를 들어, Kim, J. and Qiu, J., Analytica chimica acta 806:144-151, 2014; Hewitt 외, Journal of Chromatography A, 1215(1):156-160, 2008).
증발 광 산란 검출기 (ELSD) 검정은, 형광 미셀 검정에 비해, 긴 컨디셔닝 시간을 필요로 하지 않기 때문에, 대조군 시스템 검정으로서 바람직하다. ELSD 방법은 또한 생산에 사용된 표준 곡선 준비를 위해 동일한 폴리소르베이트 로트(lot)를 사용할 필요성을 제거할 수 있다. 추가로, 형광 미셀 검정은 특히 소수성 단백질 및 항체 약물 콘주게이트(ADC)에 대한 비특이적 단백질 간섭(interference)에 민감하다. ADC의 vcMMAE 링커-약물은 단백질에 추가의 소수성을 도입하고, 이는 PS20을 정량화할 경우 단백질 간섭의 증가를 유도할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 비특이적 단백질 간섭은 HPLC-ELSD 검정을 사용함으로써 완화될 수 있다.
HPLC-ELSD 검정은 단백질 간섭 정도를 감소시킬 수 있지만, 이 간섭은 완전히 제거되지 않는다. 단백질 간섭 사안은 낮은 폴리소르베이트 농도 및 보다 소수성 및/또는 농축된 단백질에서 특히 문제가 된다. 추가로, 단백질 간섭의 효과는 사용된 카트리지 수지 로트에 따라 매우 달라진다. 이들 사안을 완화시키는 전략은 a) PS20 반응을 감소시키지 않고 단백질 간섭을 희석하기 위한 PS20의 스파이크(spike) 첨가 및 b) 단백질 침전에 의한 샘플로부터의 단백질 제거를 포함한다.
스파이크 첨가 접근법은 샘플을 제형 표적 농도로 PS20 모액으로 희석하는 것을 수반한다. 이 샘플 제제는 대략 변함없는 PS20 농도를 유지하면서 단백질 농도를 희석시킨다. 이어서, 샘플에 스파이킹(spiked)된 PS20의 양은 데이터 분석 동안 공제된다. ELSD 반응과 검출기에서 분석된 질량 사이의 관계가 지수 법칙(power-law)을 따르기 때문에, PS20의 스파이킹은 ELSD 신호에 대한 단백질의 기여를 불균형하게 감소시킨다. 스파이크 첨가 접근법은 일부 경우에 PS20 정량화의 정확도를 개선시키는 것으로 나타났지만, 이것이 실행 가능한 해결책이 아닌 경우에, 단백질 침전이 사용되어야 한다. 단백질 간섭을 제거하는 데 효과적이지만, HPLC-ELSD 침전 방법은 밤새 샘플 제조 시간, 큰 샘플 용적 및 샘플 제조 가변성으로 인해 이상적이지 않다. 반대로, 단백질의 제거는 동일한 HPLC-ELSD 조건을 사용하지만, 유의미한 샘플 제조 절차는 없다. 필요한 것은, 단백질 간섭을 제거하고 모든 크로마토그래피 조건에 걸쳐 일관된 PS20 정량화를 생성하는 보다 강력한 해결책이다.
출원 및 문헌들을 비롯하여 본원에 언급된 모든 참조들은 그 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
일부 양태에서, 본 발명은 비이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중의 비이온성 계면활성제를 정량화하는 방법을 제공하고, 여기서 정량화 동안 상기 비이온성 계면활성제와 상기 폴리펩타이드 사이의 간섭은 감소되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 여기에서 이동상 A는 수중 산을 포함하고, 이동상 B는 메탄올 중 산을 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하는, 단계; b) 이동상 A와 이동상 B를 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 용리시키는 단계로서, 여기에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 a)에 비해 증가되는, 단계; c) 이동상 A와 이동상 B를 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 상기 비이온성 계면활성제 및 상기 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 용리시키는 단계로서, 여기에서 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계 c)에 비해 증가되는, 단계; d) 상기 비이온성 계면활성제를 정량화하는 단계로서, 정량화 동안 상기 비이온성 계면활성제와 상기 폴리펩타이드 사이의 간섭이 감소되는, 단계. 일부 구현예에서, 단계 a)에서의 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 b)에서 약 40:60으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 c)에서 약 100:0으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 약 2%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 약 2%의 산을 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 1.25 ㎖/min이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 1분 후에 개시되고, 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 3.4분 후에 종결된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 3.5분 후에 개시되고, 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 4.6분 후에 종결된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) 범위 내이다. 일부 구현예에서, 조성물 내의 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해, 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 양태에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 여기에서 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B는 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 이동상 A와 이동상 B를 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 용리시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계 a)에 비해 증가되는, 단계; c) 이동상 A와 이동상 B를 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 비-이온성 계면활성제를 용리시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 c)에 비해 증가되는, 단계; d) 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서의 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 b)에서 약 45:55으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 c)에서 약 100:0으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 1.4㎖/min이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 1분 후에 개시되고, 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 4.4분 후에 종결된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 4.5분 후에 개시되고, 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 7.6분 후에 종결된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) 범위 내이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서의 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 b)에서 약 40:60으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비는 단계 c)에서 100:0으로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상 A는, 수중 또는 43% 메탄올 중, 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴록사머의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) 범위 내이다. 일부 구현예에서, 조성물은 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 내의 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖이다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해, 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
도 1은 5% 메탄올 증가형의 다단계 구배를 사용한, PS20-비함유 A1 ADC 및 0.6mg/㎖ PS20 표준의 오버레이이다. 용리 용매는 2% 포름산을 함유한다.
도 2는 상이한 카트리지 상에서의 메탄올 다단계 구배 실험 및 이소프로판올 단계 구배 실험 (둘 모두 2% 포름산을 함유함)의 비교를 나타낸다. 각각의 오버레이의 경우, 제1 카트리지 상에서의 PS20-비함유 A1 ADC(추적 1), 제2 카트리지 상에서의 PS20-비함유 A1 ADC(추적 2), 및 PS20 표준 (추적 3)이 있다.
도 3은 실험 방법 최적화의 설계 결과를 나타낸다. 실선은 JMP10 소프트웨어가 데이터에 적합한 통계적 모델에 따르는 방향성을 나타낸다. 각 실선을 경계짓는 점선은 적합도와 관련된 오류를 나타낸다. 선의 기울기는 각 인자가 PS20 피크 면적 및 PS20 피크 폭에 미치는 효과를 나타낸다.
도 4는 40% MeOH 세정 및 50% MeOH 세정에 의한 DoE 방법 최적화로부터의 PS20 방법 크로마토그램의 비교를 나타낸다. 이들 실험의 경우, 유속은 1.25㎖/min이고, 12㎍의 PS20이 부하되고, 세정 기간은 3분이었다.
도 5는 이동상 중 0.2% 트리플루오로아세트산을 사용하는 PS20-비함유 10mg/㎖ A10 ADC 및 0.6mg/㎖ PS20 표준을 나타낸다.
도 6은 이동상 중 2% 포름산을 사용하는 PS20-비함유 20mg/㎖ A1 ADC 및 0.6mg/㎖ PS20 표준을 나타낸다.
도 7은 이동상 중 2% 아세트산을 사용하는 PS20-비함유 20mg/㎖ A1 ADC 및 0.7mg/㎖ PS20 표준을 나타낸다.
도 8은 하기 샘플을 사용한 이동상을 함유하는 아세트산 및 포름산 사이의 비교를 나타낸다: 물 (추적 1), PS20-비함유 A1 ADC, 20mg/㎖ (추적 2), 및 0.2mg/㎖ PS20 (A1 ADC로 스파이킹됨), 20mg/㎖ (추적 3).
도 9는 메탄올/아세트산에 의한 용리를 사용하여 상이한 OASIS® MAX 카트리지에서 실행되는 PS20 표준의 다양한 프로파일을 나타낸다. 전형적인 프로파일 (추적 1), 테일링을 갖는 피크 (추적 2), 분할(splitting)을 나타내는 피크 (추적 3), 및 약간의 테일링을 갖는 피크 (추적 4). 이러한 프로파일의 가변성은 표준, 대조군 또는 단백질 샘플의 정량화에 영향을 미치지 않는다.
도 10은 MeOH/아세트산 방법을 나타낸다. 전형적으로, 물 (추적 1), PS20-비함유 A1 ADC 제형 완충제 (추적 2), PS20-비함유 A1 ADC (추적 3), 및 0.1mg/㎖의 최저 PS20 표준 (추적 4)의 20㎕의 주입을 수행하였다.
도 11a 및 11b는 실시예 1의 방법 1을 사용한, PS20-비함유 A16/A17의 평가를 도시한다. 도 1a는 ELSD를 도시하고, 그리고 도 1b는 UV (280nm)를 도시한다. 물 (추적 1), PS20-비함유 A16/A17 제형 완충제 (추적 2) 및 PS20-비함유 A16/A17 단백질 (추적 3)을 실시예 1의 방법 1을 사용하여 평가하였다.
도 12a 및 12b는 실시예 1의 방법을 사용한, 상이한 A16/A17 완충제 성분의 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 12a는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 240 mM 수크로스 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM NAT (추적 3)을 갖는 완충제를 도시한다. 도 12b는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 25 mM 메티오닌 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl (추적 3)이 없는 완충제를 도시한다. 50㎕의 완충제를 주입하였다.
도 13a 및 도 13b는 변형된 방법 (이동상 중 수산화암모늄 및 MCX 카트리지)을 사용한, 상이한 완충제 성분들의 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 13a는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 240 mM 수크로스 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM NAT (추적 3); 및 NAT를 갖는 PS20-비함유 단백질 (추적 4)을 갖는 완충제를 도시한다. 도 13b는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 25 mM 메티오닌 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl (추적 3)이 없는 완충제를 도시한다. 50㎕를 주입하였다.
도 14a 및 14b는 이동상 중 0.15 내지 1.50% 수산화암모늄 첨가제에 의한 PS20-비함유 A16/A17 단백질의 평가를 도시한다. 도 14a는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 14b는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. 이동상 중 0.15, 0.29, 0.73 및 1.5% 수산화암모늄을 갖는 PS20-비함유 A16/A17 단백질 (각각 추적 1, 2, 3, 및 4), 및 1.5% 수산화암모늄을 갖는 PS20-비함유 A16/A17 제형 완충제 (추적 5)의 50㎕를 주입하였다.
도 15a 및 15b는 20 내지 60% 이동상 B 세정 단계의 평가를 도시한다. 도 15a는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 15b는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. PS20-비함유 A16/A17 단백질의 15㎕ 주입을 수행하였다. 20, 30, 40, 50, 및 60% 이동상 B (세정 단계) (각각, 추적 1, 2, 3, 4, 및 5로 도시된 바와 같음).
도 16은 ELSD 크로마토그래피에 의한, PS20-비함유 A16/A17 단백질에 대한 세정 횟수 및 주입 용적의 평가를 도시한다. 25㎕의 PS20-비함유 A16/A17 샘플 주입: 3.4분 세정 단계 (추적 1). 50㎕의 PS20-비함유 A16/A17 샘플 주입: 3.4분 세정 단계 (추적 2) 및 2.4분 세정 단계 (추적 3).
도 17a 및 17b는 PS20-비함유 A18/A19에 대한 상이한 유속의 평가를 도시한다. 도 17a는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 17b는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. 1.6, 1.4, 1.25, 1.0, 및 0.8 ㎖/min의 상이한 유동 속도(각각 추적 1, 2, 3, 4, 및 5에 상응함)를 갖는, PS20-비함유 A18/A19 (150mg/㎖)를 25㎕ 주입하였다.
도 18은 ELSD 크로마토그래피에 의한 수중 PS20에 대한 상이한 용리 시간의 평가를 도시한다. 수중 0.1mg/㎖ PS20의 50㎕ 주입, 3.1분 용리 단계 (추적 1) 또는 1.1분 용리 단계 (추적 2).
도 19는 ELSD 크로마토그래피에 의한 최종 방법 2의 평가를 도시한다. 방법 2에 대한 최종 파라미터를 사용한, 물 (추적 1), 150mg/㎖ PS20-비함유 A18/A19 (추적 2), 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 3), 및 A18/A19에 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 4)의 25㎕ 주입.
도 20a 내지 20f는 3개의 상이한 생성물의 특이성 평가를 도시한다. 도 20a (A18/A19), 20c (A16/A17), 및 20e (A14/A20)는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 20b (A18/A19), 20d (A16/A17), 및 20f (A14/A20)는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. PS20-비함유 제형 (추적 1), PS20-비함유 단백질 (추적 2), 및 수중 0.1mg/㎖ PS20 (추적 3).
도 21은 ELSD 크로마토그래피에 의한, 물 또는 PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 PS20을 사용하는 카트리지 대 카트리지(cartridge to cartridge) 가변성의 평가를 도시한다. 카트리지 2, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.1mg/㎖ PS20 (추적 1); 카트리지 6, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.1mg/㎖ PS20 (추적 2); 카트리지 2, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 3); 및 카트리지 6, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 4).
도 22는 ELSD 크로마토그래피에 의한, 물 또는 PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 PS20을 사용하는 카트리지 대 카트리지 가변성의 평가를 도시한다. 카트리지 4, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 1); 카트리지 6, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 2); 카트리지 4, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 3); 및 카트리지 6, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 4).
도 23은 단일 카트리지 상의 100 A18/A19 주입을 포함하는 시퀀스(sequence)에 사용된 대조군 샘플에 대한 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 시퀀스 전반에 걸쳐 주입된 11개 대조군 샘플의 오버레이.
도 24는 단일 카트리지 상의 100 A18/A19 주입을 포함하는 시퀀스에 사용된 A18/A19 샘플에 대한 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 시퀀스 전반에 걸쳐 100회 A18/A19 샘플 주입의 오버레이.
도 25a 및 25b는 단일 카트리지 상의 100 A18/A19 주입을 포함하는 일 시퀀스로부터 1번째, 50번째, 및 100번째 단백질 주입의 크로마토그램을 도시한다.
도 26a 및 26b는 카트리지 4를 사용한, A18/A19 샘플 (공칭 0.2mg/㎖ PS20)의 100회 주입으로부터의 정량화 결과를 도시한다. 도 26a는 PS20 면적 대(vs) 주입 횟수를 도시한다. 도 26b는 PS20 농도 대(vs) 주입 횟수를 도시한다.
도 27a 및 27b는 카트리지 5를 사용한, A18/A19 제형 완충제 (공칭 0.2mg/㎖ PS20)의 100회 주입으로부터의 정량화 결과를 도시한다. 도 27a는 PS20 면적 대(vs) 주입 횟수를 도시한다. 도 27b는 PS20 농도 대(vs) 주입 횟수를 도시한다.
도 28a 및 28b는 카트리지 3을 사용한, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20의 100회 주입으로부터의 정량화 결과를 도시한다. 도 28a는 PS20 면적 대(vs) 주입 횟수를 도시한다. 도 28b는 PS20 농도 대(vs) 주입 횟수를 도시한다.
도 29a-29f는 ELSD 크로마토그래피에 의한 방법 1 및 방법 2를 사용한, 3개의 저 pI 생성물의 평가를 도시한다. 도 29a, 29c, 및 29e는, 각각 A21, A14/A15, 및 A14를 사용하는, 방법 1에 대한 크로마토그램을 도시한다. 도 29b, 29d, 및 29f는, 각각 A21, A14/A15, 및 A14를 사용하는, 방법 2에 대한 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 상이한 카트리지 상에서의 메탄올 다단계 구배 실험 및 이소프로판올 단계 구배 실험 (둘 모두 2% 포름산을 함유함)의 비교를 나타낸다. 각각의 오버레이의 경우, 제1 카트리지 상에서의 PS20-비함유 A1 ADC(추적 1), 제2 카트리지 상에서의 PS20-비함유 A1 ADC(추적 2), 및 PS20 표준 (추적 3)이 있다.
도 3은 실험 방법 최적화의 설계 결과를 나타낸다. 실선은 JMP10 소프트웨어가 데이터에 적합한 통계적 모델에 따르는 방향성을 나타낸다. 각 실선을 경계짓는 점선은 적합도와 관련된 오류를 나타낸다. 선의 기울기는 각 인자가 PS20 피크 면적 및 PS20 피크 폭에 미치는 효과를 나타낸다.
도 4는 40% MeOH 세정 및 50% MeOH 세정에 의한 DoE 방법 최적화로부터의 PS20 방법 크로마토그램의 비교를 나타낸다. 이들 실험의 경우, 유속은 1.25㎖/min이고, 12㎍의 PS20이 부하되고, 세정 기간은 3분이었다.
도 5는 이동상 중 0.2% 트리플루오로아세트산을 사용하는 PS20-비함유 10mg/㎖ A10 ADC 및 0.6mg/㎖ PS20 표준을 나타낸다.
도 6은 이동상 중 2% 포름산을 사용하는 PS20-비함유 20mg/㎖ A1 ADC 및 0.6mg/㎖ PS20 표준을 나타낸다.
도 7은 이동상 중 2% 아세트산을 사용하는 PS20-비함유 20mg/㎖ A1 ADC 및 0.7mg/㎖ PS20 표준을 나타낸다.
도 8은 하기 샘플을 사용한 이동상을 함유하는 아세트산 및 포름산 사이의 비교를 나타낸다: 물 (추적 1), PS20-비함유 A1 ADC, 20mg/㎖ (추적 2), 및 0.2mg/㎖ PS20 (A1 ADC로 스파이킹됨), 20mg/㎖ (추적 3).
도 9는 메탄올/아세트산에 의한 용리를 사용하여 상이한 OASIS® MAX 카트리지에서 실행되는 PS20 표준의 다양한 프로파일을 나타낸다. 전형적인 프로파일 (추적 1), 테일링을 갖는 피크 (추적 2), 분할(splitting)을 나타내는 피크 (추적 3), 및 약간의 테일링을 갖는 피크 (추적 4). 이러한 프로파일의 가변성은 표준, 대조군 또는 단백질 샘플의 정량화에 영향을 미치지 않는다.
도 10은 MeOH/아세트산 방법을 나타낸다. 전형적으로, 물 (추적 1), PS20-비함유 A1 ADC 제형 완충제 (추적 2), PS20-비함유 A1 ADC (추적 3), 및 0.1mg/㎖의 최저 PS20 표준 (추적 4)의 20㎕의 주입을 수행하였다.
도 11a 및 11b는 실시예 1의 방법 1을 사용한, PS20-비함유 A16/A17의 평가를 도시한다. 도 1a는 ELSD를 도시하고, 그리고 도 1b는 UV (280nm)를 도시한다. 물 (추적 1), PS20-비함유 A16/A17 제형 완충제 (추적 2) 및 PS20-비함유 A16/A17 단백질 (추적 3)을 실시예 1의 방법 1을 사용하여 평가하였다.
도 12a 및 12b는 실시예 1의 방법을 사용한, 상이한 A16/A17 완충제 성분의 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 12a는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 240 mM 수크로스 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM NAT (추적 3)을 갖는 완충제를 도시한다. 도 12b는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 25 mM 메티오닌 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl (추적 3)이 없는 완충제를 도시한다. 50㎕의 완충제를 주입하였다.
도 13a 및 도 13b는 변형된 방법 (이동상 중 수산화암모늄 및 MCX 카트리지)을 사용한, 상이한 완충제 성분들의 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 13a는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 240 mM 수크로스 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM NAT (추적 3); 및 NAT를 갖는 PS20-비함유 단백질 (추적 4)을 갖는 완충제를 도시한다. 도 13b는, NAT: 20 mM 히스티딘-HCl, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스 (추적 1); 20 mM 히스티딘-HCl, 25 mM 메티오닌 (추적 2); 20 mM 히스티딘-HCl (추적 3)이 없는 완충제를 도시한다. 50㎕를 주입하였다.
도 14a 및 14b는 이동상 중 0.15 내지 1.50% 수산화암모늄 첨가제에 의한 PS20-비함유 A16/A17 단백질의 평가를 도시한다. 도 14a는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 14b는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. 이동상 중 0.15, 0.29, 0.73 및 1.5% 수산화암모늄을 갖는 PS20-비함유 A16/A17 단백질 (각각 추적 1, 2, 3, 및 4), 및 1.5% 수산화암모늄을 갖는 PS20-비함유 A16/A17 제형 완충제 (추적 5)의 50㎕를 주입하였다.
도 15a 및 15b는 20 내지 60% 이동상 B 세정 단계의 평가를 도시한다. 도 15a는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 15b는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. PS20-비함유 A16/A17 단백질의 15㎕ 주입을 수행하였다. 20, 30, 40, 50, 및 60% 이동상 B (세정 단계) (각각, 추적 1, 2, 3, 4, 및 5로 도시된 바와 같음).
도 16은 ELSD 크로마토그래피에 의한, PS20-비함유 A16/A17 단백질에 대한 세정 횟수 및 주입 용적의 평가를 도시한다. 25㎕의 PS20-비함유 A16/A17 샘플 주입: 3.4분 세정 단계 (추적 1). 50㎕의 PS20-비함유 A16/A17 샘플 주입: 3.4분 세정 단계 (추적 2) 및 2.4분 세정 단계 (추적 3).
도 17a 및 17b는 PS20-비함유 A18/A19에 대한 상이한 유속의 평가를 도시한다. 도 17a는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 17b는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. 1.6, 1.4, 1.25, 1.0, 및 0.8 ㎖/min의 상이한 유동 속도(각각 추적 1, 2, 3, 4, 및 5에 상응함)를 갖는, PS20-비함유 A18/A19 (150mg/㎖)를 25㎕ 주입하였다.
도 18은 ELSD 크로마토그래피에 의한 수중 PS20에 대한 상이한 용리 시간의 평가를 도시한다. 수중 0.1mg/㎖ PS20의 50㎕ 주입, 3.1분 용리 단계 (추적 1) 또는 1.1분 용리 단계 (추적 2).
도 19는 ELSD 크로마토그래피에 의한 최종 방법 2의 평가를 도시한다. 방법 2에 대한 최종 파라미터를 사용한, 물 (추적 1), 150mg/㎖ PS20-비함유 A18/A19 (추적 2), 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 3), 및 A18/A19에 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 4)의 25㎕ 주입.
도 20a 내지 20f는 3개의 상이한 생성물의 특이성 평가를 도시한다. 도 20a (A18/A19), 20c (A16/A17), 및 20e (A14/A20)는 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 도 20b (A18/A19), 20d (A16/A17), 및 20f (A14/A20)는 UV (280nm) 크로마토그램을 도시한다. PS20-비함유 제형 (추적 1), PS20-비함유 단백질 (추적 2), 및 수중 0.1mg/㎖ PS20 (추적 3).
도 21은 ELSD 크로마토그래피에 의한, 물 또는 PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 PS20을 사용하는 카트리지 대 카트리지(cartridge to cartridge) 가변성의 평가를 도시한다. 카트리지 2, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.1mg/㎖ PS20 (추적 1); 카트리지 6, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.1mg/㎖ PS20 (추적 2); 카트리지 2, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 3); 및 카트리지 6, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 4).
도 22는 ELSD 크로마토그래피에 의한, 물 또는 PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 PS20을 사용하는 카트리지 대 카트리지 가변성의 평가를 도시한다. 카트리지 4, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 1); 카트리지 6, PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 2); 카트리지 4, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 3); 및 카트리지 6, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 (추적 4).
도 23은 단일 카트리지 상의 100 A18/A19 주입을 포함하는 시퀀스(sequence)에 사용된 대조군 샘플에 대한 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 시퀀스 전반에 걸쳐 주입된 11개 대조군 샘플의 오버레이.
도 24는 단일 카트리지 상의 100 A18/A19 주입을 포함하는 시퀀스에 사용된 A18/A19 샘플에 대한 ELSD 크로마토그램을 도시한다. 시퀀스 전반에 걸쳐 100회 A18/A19 샘플 주입의 오버레이.
도 25a 및 25b는 단일 카트리지 상의 100 A18/A19 주입을 포함하는 일 시퀀스로부터 1번째, 50번째, 및 100번째 단백질 주입의 크로마토그램을 도시한다.
도 26a 및 26b는 카트리지 4를 사용한, A18/A19 샘플 (공칭 0.2mg/㎖ PS20)의 100회 주입으로부터의 정량화 결과를 도시한다. 도 26a는 PS20 면적 대(vs) 주입 횟수를 도시한다. 도 26b는 PS20 농도 대(vs) 주입 횟수를 도시한다.
도 27a 및 27b는 카트리지 5를 사용한, A18/A19 제형 완충제 (공칭 0.2mg/㎖ PS20)의 100회 주입으로부터의 정량화 결과를 도시한다. 도 27a는 PS20 면적 대(vs) 주입 횟수를 도시한다. 도 27b는 PS20 농도 대(vs) 주입 횟수를 도시한다.
도 28a 및 28b는 카트리지 3을 사용한, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20의 100회 주입으로부터의 정량화 결과를 도시한다. 도 28a는 PS20 면적 대(vs) 주입 횟수를 도시한다. 도 28b는 PS20 농도 대(vs) 주입 횟수를 도시한다.
도 29a-29f는 ELSD 크로마토그래피에 의한 방법 1 및 방법 2를 사용한, 3개의 저 pI 생성물의 평가를 도시한다. 도 29a, 29c, 및 29e는, 각각 A21, A14/A15, 및 A14를 사용하는, 방법 1에 대한 크로마토그램을 도시한다. 도 29b, 29d, 및 29f는, 각각 A21, A14/A15, 및 A14를 사용하는, 방법 2에 대한 크로마토그램을 도시한다.
본 발명은 폴리펩타이드 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물에서 비이온성 계면활성제를 정량화하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 정량화는 비이온성 계면활성제와 폴리펩타이드 사이에 감소된 간섭을 나타낸다. 또한 조성물이 N-아세틸 트립토판을 추가로 포함하고, 그리고 상기 정량화가 비이온성 계면활성제, 폴리펩타이드 및 N-아세틸 트립토판 사이에 감소된 간섭을 나타내는 방법이 제공된다.
I. 정의
용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 이는 비-아미노산에 의하여 저해될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 중재(intervention); 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 가공 또는 변형, 예를 들어, 표지화 성분 또는 독소로의 콘주게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들면, 아미노산 (예컨대, 비천연 아미노산 등 포함)의 하나 이상의 유사체, 뿐만 아니라 당해 기술에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드가 또한 상기 정의 내에 포함된다. 본 명세서에서 사용된 용어들 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 구체적으로 항체를 포괄한다.
"정제된" 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 면역접합체)는, 폴리펩타이드의 순도가 증가되어, 이로써 이것이 천연 환경 및/또는 실험실 조건 하에서 초기 합성되고/되거나 증폭될 경우에서 존재하는 것보다 더욱 순수한 형태로 존재한다는 것을 의미한다. 순도는 상대적인 용어이며, 절대적인 순도를 필연적으로 의미하지 않는다.
용어 "길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 천연 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전하게 차단, 억제, 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "효능제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 천연 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자는 특히 천연 폴리펩타이드 등의 효능제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 단편 또는 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 효능제 또는 길항제를 식별하는 방법은 하기를 포함할 수 있다: 폴리펩타이드를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 폴리펩타이드와 정상적으로 연관된 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 단계.
관심 항원, 예컨대 종양-관련 폴리펩타이드 항원 표적에 "결합하는" 폴리펩타이드는 충분한 친화성으로 항원에 결합하는 펩타이드이므로, 상기 폴리펩타이드는 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하고, 다른 폴리펩타이드와 유의하게 교차 반응하지 않는다. 이러한 구현예에서, "비-표적" 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드의 결합 정도는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전 (RIA)에 의해 계측 시 이의 특정 표적 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드의 결합의 약 10% 미만일 것이다.
표적 분자에 폴리펩타이드의 결합에 관하여, 특정한 폴리펩타이드 또는 특정한 폴리펩타이드 표적 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적인"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과는 다른 측정가능한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들면, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합에 비교된 분자의 결합을 계측함에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어 과량의 비표지된 표적과 유사한 조절 분자와의 경쟁에 의해 계측될 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 저해되는 경우 특이적 결합이 나타난다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 적어도 2종의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체), 및 이들이 목적 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다.
항체는 전부 면역글로불린 접힘을 기반으로 가변 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자이다. 예를 들면, IgG 항체는 작용성 항체를 형성하도록 디설파이드-결합된 2개의 "중" 쇄 및 2개의 "경" 쇄를 갖는다. 각 중쇄 및 경쇄 자체는 "불변(C) 및 "가변"(V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하는 반면, C 영역은 면역 효과기와 비-항원-특이적 상호작용에서 구조적 지지 및 작용을 제공한다. 항체의 항원 결합 특이성 또는 항체의 항원-결합 단편은 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적 특징에 의해 계측된다. 가변성은 가변 도메인의 110개-아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"(HVR)이라 불리는 극단적인 가변성의 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 불변의 연신부로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 크게는 β-시트 입체배치를 채택한 4개의 FR을 포함하며, 이는 β-시트 구조를 연결하고, 그리고 일부 경우에는 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변성 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 그리고 다른 쇄로부터의 초가변성 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참고: Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 작용을 나타낸다.
각 V 영역은 전형적으로 3개의 HVR, 예컨대 상보성 결정 영역 ("CDR", 각각은 "초가변성 루프"를 포함함) 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 특정한 목적 항원에 실질적인 친화도로 결합하는데 요구되는 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 따라서 전형적으로 적절한 형태로 CDR을 보유하고 존재하도록 그 사이에 산재된 3개의 CDR, 및 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 고전적 4개의 쇄 항체는 협력하여 VH 및 VL 도메인에 의해 정의되는 항원 결합 부위를 갖는다. 낙타 및 상어 항체와 같은 특정 항체는 경쇄가 부재하고 중쇄에 의해서만 형성된 결합 부위에 의존한다. 단일 도메인으로 조작된 면역글로불린은 VH 와 VL 사이의 협력의 부재로 중쇄 또는 경쇄 단독으로 결합 부위가 형성되어 제조될 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에 서열에서 광범위하게 상이하고 그리고 이의 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 고르게 분포되어 있지 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변성 영역으로 불리는 3개 절편에 집중된다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 크게는 β-시트 입체배치를 채택한 4개의 FR을 포함하며, 이는 β-시트 구조를 연결하고, 그리고 일부 경우에는 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변성 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 그리고 다른 쇄로부터의 초가변성 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참고: Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 작용을 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "초가변성 영역" (HVR)은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변성 영역은 하기를 포함할 수 있다: "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래의 아미노산 잔기 (예컨대, VL 내에 대략 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내에 대략 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변성 루프" 유래의 이들 잔기 (예컨대 VL 내 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH 내 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기들은 본원에 정의된 바와 같이 초가변 영역 잔기들 이외의 다른 가변 도메인 잔기들이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 이들의 항원-결합 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체(예를 들면, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata 외, Protein Eng 8(10):1057-1062 (1995)); 일편 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대, 비제한적으로, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv, 또는 탠덤 (di,tri)-scFv를 포함함); 및 이중특이적 T-세포 연관체 (BiTE)를 포함한다.
항체의 파파인 분해는, "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하는데, 이는 각각 단일 항원-결합 부위 및 잔류 "Fc" 단편(쉽게 결정화하는 이들의 능력을 반영한 명칭임)을 갖는다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하고 비-공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. VH-VL 이량체의 표면에 항원-결합 부위를 정의하기 위해 각 가변 도메인의 3개의 초가변성 영역이 상호 작용하는 것이 이러한 입체배치에 존재한다. 종합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 비록 전체 결합 부위보다 낮은 친화도를 갖지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기가 첨가되어, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본 명세서에서의 지정사항이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린) "경쇄"는, 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체가 상이한 "부류"에 배정될 수 있다. 하기 5개 주요 부류의 온전한 항체가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM (이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2 로 추가 구분될 수 있음). 항체의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 부류의 하부단위 구조 및 3차원 입체배치가 잘 알려져 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하는데, 이것은 scFv가 항원 결합을 위한 목적 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, 하기를 참고한다: in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
용어 "디아바디(diabody)"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 간에 쌍을 형성을 하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 또 하나의 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 하기에 더욱 충분히 기술된다: 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포괄한다. 그러한 다중특이적 항체는 비제한적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서 VHVL 단위는 하기를 갖는다: 폴리에피토프 특이성, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 VHVL 단위를 가짐), 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 단일 가변 도메인을 가짐), 전장 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 항체, 트리아바디, 3작용성 항체), 공유적이거나 비-공유적으로 연결된 항체 단편. "폴리에피토프 특이성"은 동일한 또는 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. "단일특이적"은 오직 1개의 에피토프에 결합하는 능력을 지칭한다. 일 구현예에 따라서, 다중특이적 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 각 에피토프에 결합하는 IgG 항체이다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAbs) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 환언하면, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타과 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예를 들면, 수염 상어) 및 인간과 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유도된 것들을 포함한다 (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에 사용된 용어 "단클론성 항체"는, 실질적으로 동일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별 항체는, 단클론성 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 항체 (상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대하여 지향된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제조와 대조되게, 각각의 단클론성 항체는 항원에서 단일 결정인자에 대하여 지향된다. 이들의 특이성에 부가하여, 단클론성 항체는 이들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라 사용되는 단클론성 항체는 우선 하기에 의해 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다: Kohler 외, Nature 256:495 (1975). 단클론성 항체는 또한 예를 들면 하기에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다: 예를 들어, Clackson 외, Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks 외, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).
본원의 단클론성 항체는 구체적으로 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함하고, 여기서, 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 특정 종으로부터 유래된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성이거나 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하고, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편 뿐만 아니라 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속한다 (미국 특허 번호 4,816,567; Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 본 명세서에서 관심 키메라성 항체는 비-인간 영장류 (예를 들면 구대륙 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레수스 또는 사이노몰구스 원숭이)로부터 유도된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다 (미국 특허번호 5,693,780).
비인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수령체의 초가변성 영역으로부터의 잔기가 목적 특이성, 친화도, 및 수용력을 가지는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변성 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 만들어졌다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프는 비-인간 면역글로불린의 것과 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다 (상기 주지된 FR 치환(들) 제외). 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대해서는, 하기를 참고한다: Jones 외, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
본 명세서에서의 목적상, "온전한 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들면, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 온전한 항체는 하나 이상의 효과기 작용을 가진다.
"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2개의 동일한 중 (H) 쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 디설파이드 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 중에서 가변한다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 가교를 가진다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에서 가변 도메인(VH) 다음에 복수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인을(VL) 그리고 그 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 간 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
"네이키드(naked) 항체" (본원에 정의됨)는 이형 분자, 예컨대 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 콘주게이트되지 않은 항체이다.
일부 구현예에서, 항체 "효과기 작용"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 이들 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 가변한다. 항체 효과기 기능의 실례에는 하기가 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR) (예를 들면 자연 살해 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고 그리고 차후에 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개된 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 하기 문헌의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된, 시험관내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 해당 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면, 문헌 [Clynes 외, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)]에 기술된 바와 같은 동물 모델과 같이 생체내 평가된다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현시키고 ADCC 효과기 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초 혈액 단핵구(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구가 포함되며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원으로 복합된 분자 (예컨대 폴리펩타이드 (예컨대, 항체))에 대한 보체계 (C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면 하기에 기술된 CDC 검정이 수행될 수 있다: Gazzano-Santoro 외, J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, 그리고 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이스된 형태를 포함하는, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 아부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이는 이의 세포질 도메인 내에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRlIB는 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다. (참고: , Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR은 하기에 검토된다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel 외, Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas 외, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). 향후 확인될 것들을 포함하는 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어에는 또한 신생아 수용체, FcRn이 포함되며, 이는 모계 IgG의 태아로의 전달에 관여한다 (Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994)).
"불순물"은 목적 폴리펩타이드 생성물과 상이한 물질을 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 불순물은 폴리펩타이드의 전하 변이체를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 불순물은 항체 또는 항체 단편의 전하 변이체를 포함한다. 본 발명의 기타 구현예에서, 불순물은 비제한적으로 하기를 포함한다: 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출 단백질 A; 핵산; 목적 폴리펩타이드의 변이체, 단편, 응집물 또는 유도체; 또 다른 폴리펩타이드; 내독소; 바이러스 오염물질; 세포 배양 배지 성분, 등.
본원에서 사용된 용어 "면역접합체(immunoadhesin)"는, 이종성 폴리펩타이드의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 작용과 조합하는 항체-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역접합체는 목적 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열의 융합을 포함하고, 이는 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (즉, "이종"임) 및 면역글로불린 불변 도메인 서열 이외의 것이다. 면역접합체 분자의 접합체 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역접합체 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "계면활성제"는 표면-활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본원에서 계면활성제의 예는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 나트륨 도데실 설페이트 (SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미토프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미토프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 2나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT™ 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, 플루로닉스, PF68 등); 등. 일 구현예에서, 본원에서 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 계면활성제는 폴록사머 188이다.
크로마토그래피에 관해 본 명세서에서 사용된 용어 "순차적인"은, 제1 크로마토그래피 그 다음 제2 크로마토그래피를 갖는 것을 지칭한다. 추가의 단계는 제1 크로마토그래피와 제2 크로마토그래피 사이에 포함될 수 있다.
크로마토그래피에 관해 본 명세서에서 사용된 용어 "연속적인"은, 제1 크로마토그래피 그 다음 제2 크로마토그래피를, 직접적으로 연결하여, 또는 상기 2개 크로마토그래피 물질 사이의 연속적 유동을 가능하도록 하는 일부 기타 기전을 갖는 것을 지칭한다.
"부하 밀도(loading density)"는 크로마토그래피 물질의 용적, 예를 들면 리터와 접촉하는 조성물의 양, 예를 들면 그램을 지칭한다. 일부 예시에서, 부하 밀도는 g/L로 표시된다.
종(예: 비이온성 계면활성제)의 정량화와 관련하여 본원에 사용된 용어 "간섭"은, 정량화에 대한 종 이외의 일부 성분(예: 폴리펩타이드)의 기여를 의미한다. 예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리펩타이드 둘 모두를 함유하는 크로마토그래피 분획에 대한 ELSD 신호는 폴리소르베이트 20 및 폴리펩타이드 둘 모두로부터의 기여를 가질 것이고, 분획 중 폴리소르베이트 20의 정량화는 폴리펩타이드로부터의 간섭을 가질 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 "본질적으로 동일한"은 값 또는 파라미터가 유의한 효과에 의해 변경되지 않았음을 가리킨다. 예를 들어, 칼럼 출구에서의 크로마토그래피 이동상의 이온 강도는 이온 강도가 유의하게 변하지 않으면 이동상의 초기 이온 강도와 본질적으로 동일하다. 예를 들어, 초기 이온 강도의 10%, 5% 또는 1% 이내인 칼럼 출구에서의 이온 강도는 초기 이온 강도와 본질적으로 동일하다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 지칭은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 변이를 포함한다 (그리고 기재한다). 예를 들면, "약 X"를 언급하는 기술은 "X"의 언급을 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 본원에 기술된 발명의 양태 및 구현예는 "구성되는(consisting)" 및/또는 "~로 본질적으로 구성되는"의 양태 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
II. 크로마토그래피 방법
일부 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드 및 비이온성 계면활성제(예: 폴리소르베이트 20 또는 PS20)를 포함하는 조성물을 분석하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 부하 완충제를 사용하여 혼합 방식 이온 교환 크로마토그래피 물질에 폴리펩타이드 및 비이온성 계면활성제를 결합시키는 단계; 및 폴리펩타이드 및 비이온성 계면활성제를 별개의 분획으로 크로마토그래피 물질로부터 용리되도록, 완충제를 사용하여 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드 및 비이온성 계면활성제를 용리시키는 단계;를 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 방법은 다양한 pI를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다중 폴리펩타이드(예: 폴리펩타이드 생성물)를 포함하는 조성물에 적합하다. 예를 들어, 상기 방법은 비이온성 계면활성제 및 다수의 상이한 항체 생성물, 예를 들어, 6.0 내지 9.5 범위의 pI을 갖는 항체 생성물을 포함하는 조성물을 분석하는데 사용될 수 있다. 기타 구현예에서, 크로마토그래피 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 확인된 최적의 조건 (예: 크로마토그래피 물질, 완충제, 구배, 단계 기간, 유속, 샘플 부하)의 사용을 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질은, 하기 작용기 중 하나 이상이 가능한 작용기를 포함하는 혼합 방식 물질이다: 음이온 교환, 양이온 교환, 수소 결합, 및 소수성 상호작용. 일부 구현예에서, 혼합 방식 물질은 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 물질은 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 상기 일부 구현예에서, 혼합 방식 물질은 혼합 방식 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지, 예컨대 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지, 또는 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다.
본 명세서에서 기재된 임의의 방법 중 일부 구현예에서, 이온 교환 물질은, 기존 크로마토그래피 물질 또는 대류 크로마토그래피 물질을 사용할 수 있다. 종래의 크로마토그래피 물질은, 예를 들면, 살포성의 물질(예컨대, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지) 및 확산성의 물질(예컨대, 가교결합된 아가로스 수지)을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지는 Poros® 수지일 수 있다. 일부 구현예에서, 가교결합된 아가로스 수지는 설포프로필-Sepharose® 패스트 플로우(Fast Flow) ("SPSFF") 수지일 수 있다. 대류성 크로마토그래피 물질은 막(예를 들면, 폴리에테르설폰) 또는 모놀리스 물질(예를 들면 가교결합된 중합체)일 수 있다. 폴리에테르설폰 막은 머스탱(Mustang)일 수 있다. 가교결합된 중합체 모놀리스 물질은 가교결합된 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-코-에틸렌 디메트아크릴레이트)일 수 있다.
본 발명의 상기 방법들의 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질은, 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지; 예를 들어 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지 또는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지 내에 있다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지는 액체 크로마토그래피에 사용된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 사용된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지는 HPLC 크로마토그래피 칼럼 또는 카트리지; 예를 들어, 혼합 방식 양이온 교환 HPLC 칼럼 또는 카트리지 또는 혼합 방식 음이온 교환 HPLC 칼럼 또는 카트리지 내에 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 (예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ [예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계로서, 상기 비-이온성 계면활성제의 정량화는 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 (예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5 (예컨대, 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)) 이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계로서, 상기 용리액은 조성물 중 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 (예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min [예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 아세트산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 아세트산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 (예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)[예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ [예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2 이상 중 임의의 것) 분 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 35:65 내지 약 45:55의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 40:60이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 [예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 [예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)[예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min [예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 [상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) [예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 비-이온성 계면활성제의 정량화는 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 (예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 용리액은 조성물 중 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 (예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 아세트산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 아세트산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 30:70 내지 약 50:50 (예컨대, 약 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 및 48:52 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 35:65 내지 약 45:55의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 40:60이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 아세트산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 아세트산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 35:65 내지 약 45:55의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 비-이온성 계면활성제의 정량화는 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 40:60이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 아세트산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 아세트산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 35:65 내지 약 45:55의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 단계 c)로부터의 용리액은 조성물 중 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 40:60이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 아세트산을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 20 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트 20을 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 10:90의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 약 2%의 아세트산을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 약 2%의 아세트산을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 40:60의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트 20을 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 폴리소르베이트를 정량화시키는 단계. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 1.25㎖/min이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 20㎕이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 1분 (예를 들어, 적어도 약 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4분 또는 그 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 단백질 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 추가로 N-아세틸 트립토판 (또한 N-아세틸-DL-트립토판으로서 지칭됨) 및/또는 메티오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ [예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계로서, 상기 비-이온성 계면활성제의 정량화는 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계로서, 상기 단계 c)로부터의 용리액은 조성물 중 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 이하 중 임의의 것 미만)의 총 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)[예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ [예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 40:60 내지 약 50:50의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
제형 중 N-아세틸 트립토판 (NAT)을 함유하는 생성물이 HPLC-ELSD 조건을 사용하여 시험되는 경우, PS20 영역에서 유의미한 간섭이 관찰된다. 따라서, 일부 상황에서, NAT 및 단백질 관련 간섭 둘 모두를 제거하기 위한 대안적인 조건이 필요하다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비-이온성 계면활성제, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 비-이온성 계면활성제를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 비-이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머이다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 비-이온성 세정제의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 폴리소르베이트의 정량화는 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 구현예에서, 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물에서 폴리소르베이트를 정량화하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비를 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피로부터 폴리펩타이드를 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 폴리소르베이트를 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액에서 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 단계 c)의 용리액이 조성물 중 전체 폴리펩타이드 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만) 및 조성물 중 총 NAT 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판를 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A에 대한 이동상 B의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제2 비율은 상기 제1 비율을 초과하는, 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 이동상 A에 대한 이동상 B의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 0:100 내지 약 20:80 (예컨대, 약 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84, 및 18:82 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 35:65 내지 약 55:45 (예컨대, 약 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48, 및 54:46 중 임의의 것 (상기 비율들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 80:20 내지 약 100:0 (예컨대, 약 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 및 98:2 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 40:60 내지 약 50:50의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다. 일부 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 45:55이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 유기 용매 (예컨대, 메탄올 또는 아세토니트릴) 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 [예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함)]의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 40:60 내지 약 50:50의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 폴리소르베이트의 정량화는 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 45:55이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 40:60 내지 약 50:50의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 단계 c)로부터의 용리액은, 조성물 중 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 이하 중 임의의 것 미만)의 총 폴리펩타이드, 및 조성물 중 약 5% 미만 (예컨대 약 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 이하 중 임의의 것 미만)의총 NAT를 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 45:55이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 40:60 내지 약 50:50의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 상기 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 상기 폴리소르베이트의 정량화는 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비특이적으로 결합하고, 적어도 약 90% (예를 들어, 적어도 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 중 임의의 것)의 폴리펩타이드는 단계 b)에서 용리된다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 비특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 45:55이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트를 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 약 5:95 내지 약 15:85의 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 40:60 내지 약 50:50의 이동상 B 대 이동상 A의 제2 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트를 약 90:10 내지 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 제3 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 상기 제3 비율은 상기 제2 비율을 초과하는, 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 폴리소르베이트를 정량화하는 단계로서, 단계 c)로부터의 용리액은, 조성물 중 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 이하 중 임의의 것 미만)의 총 폴리펩타이드, 및 조성물 중 약 5% 미만 (예컨대 약 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 이하 중 임의의 것 미만)의총 NAT를 포함하는, 상기 단계. 일부 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 제1 비율은 약 10:90이다. 일부 구현예에서, 제2 비율은 약 45:55이다. 일부 구현예에서, 제3 비율은 약 100:0이다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 수중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 수산화암모늄을 약 0.5% 내지 약 5% (v/v)(예를 들어, 약 임의의 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 및 4.5% (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))로 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 20, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트 20을 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 10:90의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 약 1.5% 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 메탄올 중 약 1.5% 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 45:55의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트 20을 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 폴리소르베이트 20을 정량화시키는 단계. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 1.40㎖/min이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 25㎕이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 폴리소르베이트 20, 폴리펩타이드, 및 N-아세틸 트립토판을 포함하는 조성물 중 폴리소르베이트 20을 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 10:90의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 약 1.5% 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 아세토니트릴 중 약 1.5% 수산화암모늄을 포함하는, 단계; b) 상기 폴리펩타이드를 약 45:55의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; c) 상기 폴리소르베이트 20을 약 100:0의 이동상 B 대 이동상 A의 비율을 포함하는 용액으로 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계; 및 d) 단계 c)의 용리액 중 폴리소르베이트 20을 정량화시키는 단계. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 전체 폴리펩타이드의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 임의의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 c)의 용리액은 조성물 중 약 5% 미만 (예를 들어, 약 임의의 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 총 NAT를 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 0.5 내지 2.5㎖/min (예컨대 약 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7, 1.9, 2.1, 및 2.3㎖/min 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 유속은 약 1.40 ㎖/min이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 1 내지 50㎕ (예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45㎕ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질에 적용된 조성물의 용적은 약 25㎕이다. 일부 구현예에서, 단계 b)는 단계 a)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.5분 (예를 들어, 적어도 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 단계 c)는 단계 b)가 개시된 시점으로부터 적어도 약 0.05분 (예를 들어, 적어도 약 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 1.5, 2분 또는 그 이상 중 임의의 것) 후에 개시되고, 적어도 약 2분 (예를 들어, 적어도 약 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.1, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.5, 5분 이상 중 임의의 것) 동안 계속된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v) (예컨대 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9% 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물은 메티오닌을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM (예컨대 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 mM 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖ (예컨대 약 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 및 240mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 4.5 내지 약 7.5 (예를 들어, 약 임의의 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내 함유된다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다. 일부 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트의 정량화는, 폴리펩타이드 및 NAT 유래의 약 10% 미만 (예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 그 이하 중 임의의 것 미만)의 간섭값을 갖는다.
상기 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 조성물에 폴리펩타이드를 첨가하기 전에 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물에서 정량화된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 비-이온성 계면활성제의 농도는, 폴리펩타이드의 첨가 (예를 들어, 조성물 중 비-이온성 계면활성제가 폴리펩타이드의 첨가로 희석되기) 이전에, 보다 높아질 것이다. 상기 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 사전에 조성물에 대한 폴리펩타이드의 부재 하에서 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물에서 정량화된다. 이러한 정량화는 비이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 대조군 또는 비교군으로서 사용될 수 있다.
상기 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 분석될 조성물의 샘플은 크로마토그래피 기기(예: HPLC 기기)의 자동시료주입기에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자동시료주입기 중의 샘플을 냉장시킨다(예: 5±3℃). 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질을 포함하는 하나 이상의 칼럼이 크로마토그래피 기기의 칼럼 구획에 배치된다. 일부 구현예에서, 온도 제어 특징은 분석 동안 설정 온도로부터 좁은 범위 (예: ±1℃) 내로 칼럼 구획 온도를 유지하도록 채택될 수 있다. 일부 구현예에서, 칼럼 유출물은 280nm에서 모니터링된다.
상기 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 분석될 조성물의 샘플은 약 0.1mg/㎖ 내지 약 75mg/㎖ (예컨대 약 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70mg/㎖ 중 임의의 것 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함))의 표적 폴리펩타이드 농도까지 부하 완충제로 희석된다.
상기 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 크로마토그래피 기기는 구배 펌프 (예: 저압 4차 구배 펌프), 자동시료주입기 (예: 온도 제어능을 갖는 자동시료주입기), 칼럼 구획 (예: 열-제어된 칼럼 구획), UV 검출기 (예: 다이오드 어레이 UV 검출기), 및 증발 광 산란 검출기 (ELSD)를 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 기기는 실시간으로 pH 및 전도도 데이터를 수집하기 위해 pH 및 전도도 모니터 (예: PCM-3000)를 추가로 포함한다. 기기 제어, 데이터 수집, 및 데이터 분석은 적절한 소프트웨어 (예: JMP10)를 사용하여 수행한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 이동상, 예를 들어, 용리 완충제의 이온 강도는 이동상의 전도도에 의하여 측정된다. 전도도는 두 전극 사이에 전류를 전도하는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수용액에서 존재하는 이온의 양이 증가하므로, 용액은 보다 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도에 대한 측정의 기본 단위는 Siemen (또는 mho), mho (mS/cm)이며, 전도도 측정기, 예컨대 오리온(Orion) 전도도 측정기의 다양한 모델을 사용하여 측정될 수 있다. 전해 전도도는 전류를 나르는 용액 내의 이온의 수용력이기 때문에, 용액의 전도도는 그 안의 이온의 농도를 변화함에 의해 변경될 수 있다. 예를 들면, 용액 내의 완충제의 농도 및/또는 염(예컨대 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 염화칼륨)의 농도는 목적 전도도를 달성하기 위해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충제의 염 농도는 목적 전도도를 달성하기 위해 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피의 이동상은 약 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 또는 20.0 mS/cm 중 임의의 것 초과의 초기 전도도를 갖는다. 일부 구현예에서, 이동상의 전도도는 크로마토그래피의 경과에 따라, 예를 들어, 이온성 강도 구배에 따라서, 증가된다. 일부 구현예에서, 용리의 완결시 이동상의 전도도는 약 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 또는 20.0 mS/cm 중 임의의 것 초과이다. 일부 구현예에서, 이동상의 전도도는 선형 구배로 증가된다. 일부 구현예에서, 이동상의 전도도는 하나 이상의 단계를 포함하는 단계 구배에 따라서 증가된다.
본원에 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 및 비-이온성 계면활성제를 포함하는 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000㎍ 중 임의의 것 초과의 폴리펩타이드의 양으로 크로마토그래피 물질 상에 부하된다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150mg/㎖ 중 어느 하나 이상의 농도로 크로마토그래피 물질에 부하된다. 일부 구현예에서, 조성물은 크로마토그래피 물질 상에 부하되기 전에 희석되고; 예를 들어, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 또는 1:10 초과로 희석된다. 일부 구현예에서, 조성물은 크로마토그래피의 이동상으로 희석된다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 부하 완충제로 희석된다.
본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 크로마토그래피 물질은 칼럼 또는 카트리지 내에 있다. 일부 구현예에서, 칼럼은 HPLC 칼럼 또는 카트리지이다. 칼럼 또는 카트리지는 크로마토그래피 기기와 양립가능한 임의의 치수를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 칼럼 또는 카트리지는 하기 치수 중 임의의 것을 갖는다: 2.1×20mm, 4×50mm, 4×100mm, 4×150mm, 4×200mm, 4×250mm, 또는 2×250mm.
III.
폴리펩타이드
임의의 이온 교환 크로마토그래피의 방법에 사용하기 위한 폴리펩타이드가 제공되고, 이때 분리 조건은 본원에 기술된 바와 같이 최적화된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 조성물은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석한다. 그와 같은 방법은 조성물 내의 폴리펩타이드의 전하 변이체를 확인하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는 항체이다. 일부 구현예에서, 전하 곡선에서의 변곡점 (IP) 대 폴리펩타이드의 pH는 본 발명의 방법에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 온도 변화에 따른 IP의 변화 (dIP/dT)는 본 발명의 방법에 의해 제공된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 면역접합체이다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 약 임의의 5,000 달톤, 10,000 달톤, 15,000 달톤, 25,000 달톤, 50,000 달톤, 75,000 달톤, 100,000 달톤, 125,000 달톤, 또는 150,000 달톤 초과의 분자량을 갖는다. 폴리펩타이드는 약 임의의 50,000 달톤 내지 200,000 달톤 또는 100,000 달톤 내지 200,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용하기 위한 폴리펩타이드는 약 120,000 달톤 또는 약 25,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
pI는 등전점이고, 특정 분자 또는 표면이 순 전하를 띄지 않는 pH이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 폴리펩타이드를 포함하는 복수의 조성물에 사용될 수 있고, 여기서 조성물 내의 폴리펩타이드의 pI, 예를 들어, 항체는 약 6.0 내지 약 9.5 범위이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 약 9.5 초과; 예를 들어, 약 9.5 내지 약 12의 pI을 갖는다. 본원에 기술된 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 pI, 예를 들어, 항체는 약 7 미만, 예를 들어, 약 4 내지 약 7일 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법의 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물 중 하나 이상의 오염물은 폴리펩타이드 전하 변이체이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 전하 변이체는 이의 원상태로부터 변형된 폴리펩타이드이며, 이로써 폴리펩타이드의 전하가 변경되도록 한다. 일부 구현예에서, 전하 변이체는 모 폴리펩타이드보다 더욱 산성이며; 즉, 모 폴리펩타이드보다 더 낮은 pI를 갖는다. 기타 구현예에서, 전하 변이체는 모 폴리펩타이드보다 더욱 염기성이며; 즉, 모 폴리펩타이드보다 더 높은 pI를 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 전하 변이체는 조작된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 전하 변이체는 자연 과정; 예를 들어, 산화, 탈아마이드화, 라이신 잔기의 C-말단 가공, N-말단 피로글루타메이트 형성, 및 글리코실화 반응의 결과이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 전하 변이체는 당단백질이며, 여기서 단백질에 부착된 글리칸은 변형되어, 이로써 당단백질의 전하가 모 당단백질과 비교하여; 예를 들어, 시알산 또는 이의 유도체의 첨가에 의하여, 변경되도록 한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 전하 변이체는 항체 전하 변이체이다.
본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여 분석되는 폴리펩타이드는 재조합 기술을 사용하여 일반적으로 생산된다. 재조합 단백질을 생산하는 방법은, 예컨대, 참고로 본원에 명시적으로 포함된 미국 특허 제5,534,615호 및 제4,816,567호에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생산된다 (예컨대 WO 제94/11026호 참고). 일부 구현예에서, 관심 폴리펩타이드는 이.콜라이 세포에서 생산된다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237; 미국 특허 번호 5,789,199, 및 미국 특허 번호 5,840,523 (발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기술함). 또한 참고: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254 (이. 콜라이 내 항체 단편의 발현을 기술함). 재조합 기술을 이용하는 경우, 폴리펩타이드는 세포 내에서 생산되거나, 원형질막 주위 공간에서 생산되거나 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다.
폴리펩타이드는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현에 이용된 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 교란, 또는 세포 용해제에 의해 교란될 수 있다. 폴리펩타이드가 세포 내로 생산되는 경우, 제1 단계로 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 잔해가, 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter 외, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 폴리펩타이드를 단리하기 위한 절차를 기재한다. 간략히, 세포 페효모를 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐서 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리로 제거할 수 있다. 폴리펩타이드가 배지 내로 분비되는 경우, 그와 같은 발현 시스템의 상청액은 일반적으로 시판용 폴리펩타이드 농축 필터, 예를 들면 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용해서 먼저 농축된다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF가 전술된 어느 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물질의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물 내의 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에 의해 분석하기 전에 정제되거나 부분적으로 정제되었다. 예를 들어, 상기 방법의 폴리펩타이드는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용리제에 존재한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액 중에 존재한다.
본 발명의 방법에 의해 분석될 수 있는 폴리펩타이드의 예는, 면역글로불린, 면역접합체, 항체, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역콘주게이트, 사이토카인 및 인터류킨을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. (A) 항체
본원에 기술된 방법 중 어느 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 포함 제형을 분석하는 임의의 방법에서 사용하기 위한 폴리펩타이드는 항체이다.
항체에 대한 분자 표적은 하기를 포함한다: (i) 하기를 비제한적으로 포함하는 CD 단백질 및 이의 리간드: CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD27, CD28, CD34, CD40, CD79α (CD79a), CD79β (CD79b), CD122, 및 CD137; (ii) 예컨대, 비제한적으로 하기를 포함하는, 사이토카인: IL-13, IL-17, IL-22, 및 IL-33; (iii) ErbB 수용체 계열 구성원 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iv) 세포 부착 분자 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (이의 알파 또는 베타 하부단위 포함) (예컨대, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (v) 성장 인자 예컨대 VEGF; TGFβ, IgE; 혈액 그룹 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; (vi) 면역조절 단백질 예컨대 OX40, GITR, ICOS, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM-3, 및 VISTA; 및 (vii) 세포 표면 및 막투과성 종양-관련 항원 (TAA), 예컨대 비제한적으로 NaPi2b를 포함하는, 미국 특허 번호 7,521,541에서 기술된 것들.
기타 예시적 항체는 하기로부터 선택된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-TGFβ 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-TIM-3 항체, 항-VISTA 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막아세포종 단백질 항체, 항-ras 종양 단백질 항체, 항-루이스(Lewis) X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD27 항체, 항-CD28 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD40 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-CD122 항체, 항-CD137 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-StaphA 항체, 항-FcRH5 항체, 항-Ly6E 항체, 항-STEAP 항체, 항-FluB 항체, 항-VEGF 항체, 항-Ang2 항체, 항-FGFR1 항체, 항-KLB 항체, 항-c-myc 항체, 항-사이토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체, 항-Tn-항원 항체, 및 MetMab.
(i) 단클론성 항체
일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 단클론성 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지며, 즉 집단을 포함하는 개별적인 항체는 단클론성 항체의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체를 제외하고 동일한 에피토프와 동일하고/하거나, 상기에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 별개의 항체 또는 다클론성 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이, 단클론성 항체는 먼저 문헌 [Kohler 외, Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터가 본원에 기술된 바와 같이 면역화되어, 면역화를 위해 사용된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 이를 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 림프구는 이후 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 분주하고 성장시킨다. 예를 들어, 만약 모 골수종 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)가 부재하다면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
일부 구현예에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정된 고 수준의 항체 생산을 지원하는 것들이고, 이는 예컨대 HAT 배지와 같은 배지에 감수성을 갖는다. 무엇보다도, 일부 구현예에서, 골수종 세포주는, 쥐 골수종 세포주, 예컨대 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 솔크 연구소 세포 분배 센터로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 메릴랜드주 록빌 소재의 미국 종균 협회로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유도된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종성골수종 세포주가 또한, 인간 단클론성 항체의 생산에 대해 하기와 같이 기술되었다: Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는, 항원에 대해 유도된 단클론성 항체의 생성에 대해 검정된다. 일부 구현예에서, 하이브리도마 세포에 의하여 생산된 단클론성 항체의 결합 특이성은 하기에 의하여 계측된다: 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA).
단클론성 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 하기에 의하여 계측될 수 있다: 스케쳐드(Scatchard) 분석 (Munson 외, Anal. Biochem. 107:220 (1980).
목적 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 식별된 후, 클론은 희석 절차를 제한함에 의해 아클론화되고 그리고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 본 목적을 위한 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로 생체내에서 성장될 수 있다.
아클론에 의하여 분비된 단클론성 항체는 기존 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 폴리펩타이드 A-세파로오스®(Sepharose®), 하이드록시아퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해, 배양 배지 또는 복수 유체 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 용이하게 단리되고, (예를 들어, 특히 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 종래의 방법에 의해 용이하게 분리 및 서열분석된다. 일부 구현예에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 사용된다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내에 있을 수 있으며, 그 다음 발현 벡터는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 원래는 면역글로불린 폴리펩타이드를 생성하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체를 합성할 수 있다. 항체를 암호화하는 DNA의 세균내 재조합 발현에 대한 검토 기사는 하기를 포함한다: Skerra 외, Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 , Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
추가 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은, 예를 들면 하기에 기재된 기술을 사용하여 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다: McCafferty 외, Nature 348:552-554 (1990). 문헌 [Clackson 외, Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks 외, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]는 각각 파아지 라이브러리를 사용한, 쥐 및 인간 항체의 단리를 기술한다. 추후 문헌은 사슬 셔플링에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생산(Marks 외, Bio/Technology 10:779-783 (1992)), 뿐만 아니라 매우 큰 파아지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합된 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse 외, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))에 대해 기술한다. 따라서, 이들 기술은 단클론성 항체의 단리를 위한 전통적인 단클론성 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들면, 상동성 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 위한 암호화 서열을 치환함으로써 [미국 특허 번호 4,816,567; Morrison 외, Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)], 또는 면역글로불린 암호화 서열을 비- 폴리펩타이드를 위한 암호화 서열의 일부 또는 전부에 공유적으로 연결함으로써 변형될 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 항체의 불변 도메인으로 치환되거나, 또는 그들은 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환되어, 하나의 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항원을 생성하기 된다.
본 명세서에서 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG 단클론성 항체이다.
(ii)
인간화된 항체
일부 구현예에서, 항체는 인간화된 항체이다. 비-인간 항체의 인간화 방법은 당해기술에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 상기 내로 도입된 1종 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "도입" 가변 도메인으로부터 전형적으로 얻은 "도입" 잔기로 지칭된다. 인간화는 Winter와 동료들의 방법 (Jones 외, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 외, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen 외, Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라서, 초가변 영역 서열로 인간 항체의 대응하는 서열을 치환함으로써, 필수적으로 수행될 수 있다. 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 키메라성 항체(미국 특허 번호 4,816,567)이며, 여기서 실질적으로 1개 미만의 온전한 인간 가변 도메인은 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 인간 항체이며, 여기서 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기는 쥐 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된다.
인간화 항체를 제조하는 데 있어서 사용되는 인간 가변 도메인, 즉 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 선별된다. 이후 설치류의 서열에 가장 밀접한 인간 서열이 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로 허용된다 (Sims 외, J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia 외, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위 그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 가지 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta 외, J. Immunol. 151:2623 (1993)).
항체는 추가로 항원에 대한 높은 친화도의 유지 및 다른 유리한 생물학적 특성을 갖고 인간화되는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 상기 방법의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 모 서열의 분석 공정, 및 모 서열과 인간화 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념의 인간화 산물에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택되는 후보 면역글로불린 서열의 가능성이 있는 3차원 입체 구조를 설명하고 현시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 작용에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방법으로, FR 잔기는 수여체 및 도입 서열로부터 선택되고 조합되어, 목적 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성된다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적이면서 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치도록 관여한다.
(iii)
인간 항체
일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 인간화에 대한 대안으로, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들면, 면역화 시, 내인성 면역글로불린 생산이 없이, 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들면, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라성 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 저해를 초래한다는 것이 기재되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 전이는 항원 유발에 의한 인간 항체의 생성을 초래할 것이다. 참고: 예를 들면, Jakobovits 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits 외, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann 외, Year in Immuno. 7:33 (1993); 및 미국 특허 번호 5,591,669; 5,589,369; 및 5,545,807.
대안적으로, 파아지 디스플레이 기술 (McCafferty 외, Nature 348:552-553 (1990))은 비면역화된 공여체 유래의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내 인간 항체 및 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 섬유상 박테리오파아지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 피막 폴리펩타이드 유전자에 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 그리고 파아지 입자의 표면에 기능적 항체 단편으로서 제시된다(display). 섬유상 입자는 파아지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기반한 선별도 또한 결과적으로 그 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자를 선별하게 된다. 따라서, 파아지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파아지 디스플레이는 다양한 포멧으로 수행될 수 있으며; 검토를 위해 하기를 참고한다: 예를 들면, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). V-유전자 분절의 몇 개의 공급원이 파아지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson 외, Nature 352:624-628 (1991)]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여체 유래의 V 유전자의 레퍼토리가 제조될 수 있고, 그리고 본질적으로 다양한 배열의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체는 하기에 기재된 기술에 따라서 단리될 수 있다: Marks 외, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith 외, EMBO J. 12:725-734 (1993). 또한 참고: 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905.
인간 항체는 또한 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (참고: 미국 특허 5,567,610 및 5,229,275).
(iv) 항체 단편
일부 구현예에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생성을 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백분해 소화를 통해 유도되었다 (참고: 예를 들면, Morimoto 외, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan 외, Science 229:81 (1985)). 그러나, 이러한 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 고찰된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이에서 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab)2 단편을 형성할 수 있다 (Carter 외, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 구현예에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 참고: WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458. 항체 단편은 또한, 예를 들면, 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체 단편이 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv, 및 디아바디로 구성된 군으로부터 선택된다.
(v)
이중특이적 항체
일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체 결합 아암은 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG (FcγR)에 대한 Fc 수용체, 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)의 백혈구 상에서 세포에 세포 방어 기전을 집중시키기 위하여 촉발 분자에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체 전장 항체 또는 항체 단편 (예컨대, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현에 근거하며, 여기서 두 쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Millstein 외, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 모음으로 인하여, 이러한 하이브리도마 (4혼성체(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자들의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이중 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 보통 행해지는 분자의 정확한 정제는 다소 어려워서, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차가 하기에 개시된다: WO 93/08829, 및 Traunecker 외, EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
상이한 접근에 따라, 목적 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열로 융합된다. 일부 구현예에서, 융합체는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖고, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)은, 융합체들 중 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 목적할 경우 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는, 개별 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 유기체에 공동-형질감염된다. 이것은 작제물에서 사용된 3개의 폴리펩타이드 쇄의 불균등 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우, 구현예에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 분율 조정에서 큰 융통성을 제공한다. 그러나, 균등 비율의 적어도 2개 폴리펩타이드 쇄의 발현이 고수율을 초래하는 경우, 또는 상기 비율이 특정한 유의성이 없는 경우, 한 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩타이드 쇄에 대한 암호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 접근의 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 혼성체 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암 내의 혼성체 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 오직 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄들의 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 이 접근은 WO 94/04690에서 개시된다. 이중특이적 항체 생성의 추가적인 세부사항에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참조한다: Suresh 외, Methods in Enzymology 121:210 (1986).
문헌[미국 특허 번호 5,731,168]에 기재된 또 다른 접근에 따르면, 항체 분자 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체 백분율을 최대화하기 위해 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자 계면에 있는 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 측쇄(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로서, 큰 측쇄(들)와 동일 또는 유사한 크기의 보상적 "공동"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예컨대 동종이량체보다 이형이량체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합 또는 "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이형접합체에서 항체 중 하나는 아비딘에 결합되고, 다른 것은 바이오틴에 결합될 수 있다. 상기 항체는, 예를 들어, 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화(미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료에 대하여 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되어 왔다. 이종콘주게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제 및 기술은, 다수의 가교결합 기술과 함께, 당해 기술에서 잘 알려져 있고, 그리고 미국 특허 번호 4,676,980에 기재된다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 하기 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan 외, Science 229: 81 (1985)]은 F(ab')2 단편을 생성하기 위하여 온전한 항체가 단백질 가수 분해 절단되는 절차를 기술한다. 이러한 단편은 이웃한 디티올을 안정화하고 분자간 디설파이드 형성을 방지하기 위하여, 디티올 복합화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원된다. 생성된 Fab' 단편은 이후 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 이후 메르캅토에틸아민에 의해 환원으로 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 유래한 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다. Kostelny 외, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩타이드가, 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 모노머를 형성하고, 이후 재-산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법이 또한 항체 동종이량체의 생산을 위하여 이용될 수 있다. "디아바디" 기술은 하기에 의하여 기술되며: Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), 이는 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 기전을 제공하였다. 단편은 동일 쇄 상의 두 도메인 간에 쌍을 이루기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인이 다른 하나의 단편의 상보적 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루도록 유도되어, 2개 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 참고: Gruber 외, J. Immunol. 152:5368 (1994).
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt 외, J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vi)
다가 항체
일부 구현예에서, 항체는 다가 항체이다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빨리 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는, (IgM 부류 이외의) 다가 항체(예로, 4가 항체)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함하거나 (또는 이로 구성된다). 이 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함하거나 (또는 구성된다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩타이드 쇄 (및 바람직하게는 2개의 폴리펩타이드 쇄)를 포함하며, 여기서 폴리펩타이드 쇄(들)은 둘 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있고, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 폴리펩타이드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 쇄(들)은 하기를 포함할 수 있다: VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (및 바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 선택적으로, CL 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 다중특이적 항체의 예시는 중쇄 가변 도메인 (VH)및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하나 이에 제한되지 않고, 여기서 VHVL 단위는 폴리에피토프 특이성을 갖고, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 VH VL 단위를 가짐), 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 단일 가변 도메인을 가짐), 전장 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 항체, 트리아바디, 3작용성 항체), 공유적이거나 비-공유적으로 연결된 항체 단편를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다중에피토프 특이성; 예를 들어, 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 둘 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 단일특이적이며; 예를 들어, 하나의 에피토프에만 결합하는 항체이다. 일 구현예에 따라서, 다중특이적 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 각 에피토프에 결합하는 IgG 항체이다.
(vii) 기타 항체 변형
예를 들면, 항체의 항원-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 증진하기 위해, 효과기 기능에 관해 본원에 제공된 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 내 도입되어, 이로써 상기 영역 내에 쇄간 디설파이드 결합을 형성하도록 할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸, 및 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 하기를 참고한다: Caron 외, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992). 증진된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한, 하기에 기술된 이종이중작용성 가교결합제를 사용하여 또한 제조될 수 있다: Wolff 외, Cancer Research 53:2560-2565 (1993). 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있고, 이로써 증진된 보체 매개된 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 참고: Stevenson 외, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
항체의 혈청 반감기 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 그 전체가 참조로 본원에 포함된 US 제2006/0067930호에 기재된 바와 같이 항체에 아미노산 변경이 이뤄질 수 있다.
(B)
폴리펩타이드 변이체 및 변형
본원에 기술된 항체를 포함하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변형(들)은 본원에 기술된 폴리펩타이드 (예컨대, 항체)를 정제하는 방법에 사용될 수 있다.
(i) 변이체 폴리펩타이드
"폴리펩타이드 변이체"는, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 폴리펩타이드의 전장 천연 서열, 신호 펩타이드를 결하는 폴리펩타이드 서열, 신호 펩타이드의 유무에 관계없이 폴리펩타이드의 세포외 도메인과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드, 바람직하게는, 활성 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 폴리펩타이드 변이체는, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N 또는 C-말단에서 첨가되거나, 또는 결실된 폴리펩타이드를 포함한다. 통상적으로, TAT 폴리펩타이드 변이체는 전장 천연 서열 폴리펩타이드, 신호 펩타이드를 결하는 폴리펩타이드 서열, 신호 펩타이드의 유무에 관계없이 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 선택적으로, 변이체 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드 서열과 비교하여 1 이하 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 폴리펩타이드 서열과 비교하여 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 중 어느 것 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
변이체 폴리펩타이드는 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있고, 또는 예를 들면, 전장 천연 폴리펩타이드와 비교될 때, 내부 잔기가 부재할 수 있다. 특정 변이체 폴리펩타이드는 목적 생물학적 활성을 위해 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 부재할 수 있다. 절단, 결실 및 삽입을 갖는 이들 변이체 폴리펩타이드는 임의의 수의 종래의 기술에 의해 제조될 수 있다. 목적 변이체 폴리펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또 다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 목적 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 단편을 단리하고 증폭하는 것을 포함한다. 핵산 단편의 목적 말단을 한정하는 올리고뉴클레오타이드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 이용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 천연 폴리펩타이드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지는 백 개 이상의 잔기를 함유하는 함유하는 폴리펩타이드의 길이에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
예를 들어, 상기 폴리펩타이드의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성들을 증진시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 항체 핵산에 도입하거나, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들면, 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어지며, 단 최종 작제물은 목적하는 특징, 예컨대, 항원-결합을 가져야 한다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 폴리펩타이드 (예컨대, 항체)의 번역 후 과정을 변화시킬 수 있다.
목적 활성에 부정적으로 영향을 미침이 없이 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는가를 계측하기 위한 지침은, 폴리펩타이드의 서열을 동종의 공지된 폴리펩타이드 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성의 영역에서 만들어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함에 의해 알려질 수 있다.
돌연변이유발을 위한 바람직한 위치인 폴리펩타이드 (예컨대, 항체)의 특정 잔기들 또는 영역들의 식별을 위해 유용한 방법은, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불리운다: Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹이 식별되었고 (예컨대, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu), 이를 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체함으로서 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 치환에 대한 작용 민감성을 입증하는 아미노산 위치는, 이후 치환의 부위에 대한 변이체, 또는 치환 부위에 다른 변이체를 추가로 도입함에 의해 정제된다. 따라서, 아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위가 사전결정되지만, 특히 돌연변이 특성은 사전결정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이의 수행을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 그리고 과발현된 항체 변이체가 목적 활성에 대해 선별된다.
다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기로 대체되는 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 가진다. 치환 돌연변이유발을 위한 가장 큰 관심 대상의 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 상정된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 제목하에 하기 표 1에 도시된다. 만일 상기 치환이 생물학적 활성에서 변화를 초래한다면, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명된, 또는 아미노산 클래스를 참조하여 아래 추가로 기재된 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 선별될 수 있다.
표 1
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체배좌로서, 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지함에 있어서 그들의 효과가 유의미하게 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 이들의 측쇄의 특성의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다 (참고: A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
대안적으로, 천연 발생 잔기는 하기 공통의 측쇄 특성에 기반하여 그룹으로 분할될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
항체의 적절한 형태 유지에 관여되지 않은 임의의 시스테인 잔기는, 또한 일반적으로 세린과 치환되어, 분자의 산화적 안정성을 개선하고 비정상적인 가교결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은, 특히 폴리펩타이드가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우, 항체에 부가되면 그 안정성을 개선할 수 있다.
치환형 변이체의 특정 바람직한 유형은, 모 항체 (예컨대, 인간화 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가로 개발하기 위해 선택된 수득한 변이체(들)는 이들이 생성된 모 항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은, 파아지 디스플레이를 이용하는 친화도 성숙을 수반한다. 간단하게는, 몇 개의 초가변성 영역 부위(예컨대, 6-7개 부위)가 돌연변이되어 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성한다. 이와 같이 생성된 항체 변이체는, 각각의 입자 내 팩키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서, 섬유상 파아지 입자로부터의 1가 양상으로 나타난다. 파아지-제시 변이체는 이후 본 명세서에서 개시된 바와 같은 이의 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)에 대해 선별된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역을 식별하기 위해, 항원 결합에 유의미하게 기여하는 초가변 영역 잔기들을 식별하기 위해 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 표적 간의 접촉 지점을 식별하기 위한 항원-항체 착물의 결정 구조를 분석하는 것은 이점을 가질 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본 명세서에 상세히 기재된 기법에 따른 치환 대상 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 선별 대상이 되고, 그리고 하나 이상의 관련된 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택될 수 있다.
폴리펩타이드의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는, 항체의 최초 글리코실화 패턴을 변경한다. 폴리펩타이드는 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 글리코실화될 수 있다. 이러한 글리코실화는 숙주세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩타이드의 발현 중에 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 인간의 개입에 의한 의도적인 변형일 수 있다. 변형은, 폴리펩타이드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 및/또는 폴리펩타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다.
폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. "N-연결"은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착하는 것을 지칭한다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은, 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내의 이들 트리펩타이드 서열 중 하나의 존재는, 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로스의 세린 또는 트레오닌에 대한 부착을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수도 있다.
폴리펩타이드에 글리코실화 부위의 첨가는, 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성되고, 이로써 (N-연결 글리코실화 부위에 대한) 상기-기재된 트리펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유한다. 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대해) 본래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다.
폴리펩타이드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는, 화학적으로 또는 효소적으로 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기에 대해 암호화하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩타이드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은, 다양한 엔도- 및 엑소- 글리코시다아제의 사용에 의하여 달성될 수 있다.
다른 변형은 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 글루타미닐 및 아스파르기닐 잔기의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화, N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.
(ii) 키메라성 폴리펩타이드
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는, 또 다른 이종성 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩타이드를 포함하는 키메라성 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라성 분자는 폴리펩타이드의 태그 폴리펩타이드와의 융합체를 포함하며, 상기 태그 항체는 항-태그 항체가 선택적으로 결합될 수 있는 에피토프를 제공한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩타이드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치된다. 폴리펩타이드의 이러한 에피토프-태그된 형태의 존재는, 태그 폴리펩타이드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공으로 폴리펩타이드가 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용하는 친화도 정제에 의해 쉽게 정제되도록 할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과 폴리펩타이드와의 융합을 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태는 "면역접합체"로 지칭된다.
본원에서 사용된 용어 "면역접합체(immunoadhesin)"는 이종성 폴리펩타이드의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 작용과 조합하는 항체-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역접합체는 목적 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열의 융합을 포함하고, 이는 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (즉, "이형"임) 및 면역글로불린 불변 도메인 서열 이외의 것이다. 면역접합체 분자의 접합체 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역접합체 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
Ig 융합은 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 가용성 (막관통 도메인이 결실되거나 불활성화됨) 형태의 폴리펩타이드의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 면역글로불린 융합은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.
(iii)
폴리펩타이드 콘주게이트
폴리펩타이드 제형에서 사용하기 위한 폴리펩타이드는 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 성장 억제제, 독소 (예컨대, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사능 동위원소 (즉, 방사콘주게이트)에 콘주게이트될 수 있다.
이러한 접합체의 생성에 유용한 화학치료제가 사용될 수 있다. 추가로, 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 비제한적으로 하기를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센). 각종 방사성핵종이 방사콘주게이트된 폴리펩타이드의 생산을 위해 이용 가능하다. 예시는 하기를 포함한다: 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re. 폴리펩타이드 및 세포독성제의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들면, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들면, 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들면, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들면, 톨리엔(tolyene) 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 하기에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다: Vitetta 외, Science 238: 1098 (1987). 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 폴리펩타이드로의 방사성 뉴클레오타이드의 콘주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다.
폴리펩타이드 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신 (calicheamicin), 메이탄시노이드, 트리코텐 (trichothene), 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 콘주게이트가 또한 본원에서 고려된다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테너스 세라타(Maytenus serrata)로부터 먼저 단리되었다. 그 뒤에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성한다는 것이 발견되었다. 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체가 또한 고려된다. 예를 들어, 하기에 개시된 것을 포함하는, 폴리펩타이드-메이탄시노이드 콘주게이트를 제조하기 위한 본 기술분야에 공지된 많은 연결기가 있다: 미국 특허 번호 5,208,020. 연결기는 상기 식별된 특허에 개시된 바와 같은, 디설파이드 기, 티오에테르 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다제 불안정 기, 또는 에스테라제 불안정 기를 포함하며, 디설파이드 및 티오에테르 기가 바람직하다.
링커는 결합 형태에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 종래의 커플링 기술을 이용하여 하이드록실 기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 반응은 하이드록실 기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실 기로 변형된 C-15 위치 및 하이드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 발생할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 결합은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
또 다른 관심 콘주게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 폴리펩타이드를 포함한다. 항생제의 칼리케아미신 계열은 서브피코몰 농도로 이중-가닥 DNA 절단물을 생성할 수 있다. 칼리케아미신 계열의 콘주게이트의 제조를 위해, 예컨대, 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 5,712,374. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θ1 I 을 포함한다. 항체가 콘주게이트될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항엽산인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA 둘 모두는 세포내 작용 부위를 가지며 원형질 막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 폴리펩타이드 (예컨대, 항체) 매개된 내재화를 통한 이들 제제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 개선시킨다.
본원에 기술된 폴리펩타이드에 콘주게이트될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조토신, 빈크리스틴 (vincristine) 및 5-플루오로우라실, 총칭해서 LL-E33288 복합체로 공지된 제제의 계열, 뿐만 아니라 에스페라미신 (esperamicin)을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 및 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예컨대, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이의 콘주게이트일 수 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드 (예컨대, 항체)는, 폴리펩타이드-수용체 콘주게이트가 환자에 투여되는 종양 사전-표적화에서 이용하기 위하여, 이어서 투명제(clearing agent)를 이용하여 순환으로부터 미결합된 콘주게이트의 제거를 위하여, 그리고 그 다음 세포독성제 (예를 들면, 방사성뉴클레오타이드)에 콘주게이트된 "리간드" (예를 들면, 아비딘)의 투여를 위하여, "수용체" (예컨대, 스트렙타비딘)에 콘주게이트될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 전구약물 (예컨대, 펩티딜 화학치료제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 접합될 수 있다. 면역콘주게이트의 효소 성분은 이것을 이의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환하기 위한 그와 같은 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
효소는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항-암 약물, 5-플루오로우라실로 전환시키기에 유용한 시토신 데아미나제; 펩타이드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 서몰리신, 서브틸리신, 카복시펩티다아제 및 카텝신 (예컨대 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키기에 유용한 D-알라닐카복시펩티다아제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 탄수화물-절단 효소 예컨대 β-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제; β-락탐으로 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 β-락타마아제; 및 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기, 각각을 갖는 이의 아민 질소에서 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 페니실린 아미다아제, 예컨대 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제. 대안적으로, 또한 당해 기술에서 "항체효소(abzymes)"로 공지된 효소 활성을 갖는 항체가 전구약물을 무 활성 약물로 전환하기 위해 사용될 수 있다.
(iv) 기타
폴리펩타이드의 공유 변형의 또 다른 유형은 폴리펩타이드를 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결하는 것을 포함한다. 폴리펩타이드는 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로구형체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀젼에 포집될 수 있다. 그와 같은 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)]에 개시된다.
IV. 제형 및 방법에서 사용하기 위한 폴리펩타이드의 수득
본원에 기술된 분석 방법에서 사용되는 폴리펩타이드는 재조합 방법을 포함하는 본 기술분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 하기 섹션은 이들 방법에 관한 지침을 제공한다.
(A) 폴리뉴클레오타이드
"폴리뉴클레오타이드", 또는 "핵산"은, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 폴리펩타이드 mRNA를 가지며 이를 검출가능한 수준으로 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 간편하게 수득될 수 있다. 폴리펩타이드-암호화 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지된 합성 절차 (예컨대, 자동화된 핵산 합성)에 의해 수득될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 전체 면역글로불린 분자 쇄, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 암호화할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH)뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하며, 상기중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역을 포함한다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재가 바람직하다.
상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있는 다른 폴리펩타이드는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')2 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 CH1 및 CK 또는 CL 도메인이 절제된 (전형적으로) 2가 항체 단편이다. 미니바디는 종래의 항체보다 작기 때문에 임상/진단 용도에서 더 우수한 조직 투과를 달성할 것이지만, 2가이므로, 이들은 dAb와 같은 1가 항체 단편보다 더 높은 결합 친화도를 보유할 것이다. 따라서, 문맥이 달리 지칭하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는 암호화된 폴리펩타이드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역과 비교하여 총 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
V. 예시적인 구현예
구현예 1. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중의 비이온성 계면활성제를 정량화하는 방법이 제공되고, 정량화 동안 상기 비이온성 계면활성제 및 상기 폴리펩타이드 사이의 간섭이 감소되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되며, 이동상 A는 수중 산을 포함하며, 그리고 이동상 B는 메탄올 중 산을 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 상기 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비-특이적으로 결합하는, 단계;
b) 이동상 A와 이동상 B를 포함하는 용액으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 용리시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계 a)와 비교하여 증가되는, 단계;
c) 상기 비-이온성 계면활성제 및 상기 비-특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 상기 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 c)와 비교하여 증가되는, 단계;
d) 상기 비이온성 계면활성제를 정량화시키는 단계로서, 상기 정량화 동안 상기 비이온성 계면활성제와 상기 폴리펩타이드 사이의 간섭이 감소되는, 단계.
구현예 2. 구현예 1의 일부 추가 구현예에서, 단계 a)에서의 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 10:90이다.
구현예 3. 구현예 1 또는 2의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 b)에서 약 40:60으로 증가된다.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 c)에서 약 100:0으로 증가된다.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 A가 수중 약 2%의 산을 포함한다.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B가 메탄올 중 약 2%의 산을 포함한다.
구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나의 일부 추가의 구현예에서, 산은 포름산이다.
구현예 8. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나의 일부 추가의 구현예에서, 산은 아세트산이다.
구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나의 일부 추가의 구현예에서, 상기 크로마토그래피의 유속이 약 1.25 ㎖/min이다.
구현예 10. 구현예 9의 일부 추가의 구현예에서, 단계 b)는 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 1분 후 개시되고, 그리고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 3.4분 후에 종결된다.
구현예 11. 구현예 9 또는 10의 일부 추가 구현예에서, 단계 c)는 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 3.5분 후 개시되고, 그리고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 4.6분 후에 종결된다.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이다.
구현예 13. 구현예 12의 일부 추가 구현예에서, 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물 중 비이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v)의 범위이다.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물 중 단백질 농도가 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖이다.
구현예 16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.
구현예 17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다.
구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 일부 추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다.
구현예 20. 구현예 16의 일부 추가 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함한다.
구현예 22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 모이어티를 포함한다.
구현예 23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다.
구현예 24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 함유된다.
구현예 25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다.
구현예 26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 Oasis® MAX 크로마토그래피 물질이다.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해, 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
구현예 28. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중의 비이온성 계면활성제를 정량화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계로서, 상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중 크로마토그래피 물질에 부하되고, 이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는, 단계;
b) 이동상 A와 이동상 B를 포함하는 용액으로 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 용리시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율이 단계 a)와 비교하여 증가되는, 단계;
c) 상기 비-이온성 계면활성제를 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액으로 상기 크로마토그래피 물질로부터 용리시키는 단계로서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 c)와 비교하여 증가되는, 단계;
d) 비이온성 계면활성제를 정량화하는 단계.
구현예 29. 구현예 28의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 메탄올이다.
구현예 30. 구현예 28 또는 29의 일부 추가 구현예에서, 단계 a)에서의 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 10:90이다.
구현예 31. 구현예 28 내지 30 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 b)에서 약 45:55으로 증가된다.
구현예 32. 구현예 28 내지 31 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 c)에서 약 100:0으로 증가된다.
구현예 33. 구현예 28 내지 32 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 A는 수중 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다.
구현예 34. 구현예 28 내지 33 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B는 메탄올 중 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다.
구현예 35. 구현예 28 내지 34 중 어느 하나의 일부 추가의 구현예에서, 상기 크로마토그래피의 유속이 약 1.4 ㎖/min이다.
구현예 36. 구현예 35의 일부 추가의 구현예에서, 단계 b)는 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 1분 후 개시되고, 그리고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 4.4분 후에 종결된다.
구현예 37. 구현예 35 또는 36의 일부 추가 구현예에서, 단계 c)는 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 4.5분 후 개시되고, 그리고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 약 7.6분 후에 종결된다.
구현예 38. 구현예 28 내지 37 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트이다.
구현예 39. 구현예 38의 일부 추가 구현예에서, 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다.
구현예 40. 구현예 38 또는 39의 일부 추가 구현예에서, 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v)의 범위이다.
구현예 41. 구현예 28의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B의 유기 용매는 아세토니트릴이다.
구현예 42. 구현예 41의 일부 추가 구현예에서, 단계 a)에서의 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 약 10:90이다.
구현예 43. 구현예 41 또는 42의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비율은 단계 b)에서 약 40:60으로 증가된다.
구현예 44. 구현예 41 내지 43 중 어느 하나의 일부 추가의 구현예에서, 이동상 B 대 이동상 A의 비는 단계 c)에서 100:0으로 증가된다.
구현예 45. 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 A는 수중 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다.
구현예 46. 구현예 41 내지 45 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 이동상 B는 아세토니트릴 중 약 2%의 수산화암모늄을 포함한다.
구현예 47. 구현예 41 내지 46 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴록사머이다.
구현예 48. 구현예 48의 일부 추가의 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 P188이다.
구현예 49. 구현예 48 또는 49의 일부 추가 구현예에서, 조성물 중 폴록사머의 농도는 약 0.001% 내지 1.0% (w/v)의 범위이다.
구현예 50. 구현예 28 내지 49 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물이 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함한다.
구현예 51. 구현예 50의 일부 추가 구현예에서, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 범위이다.
구현예 52. 구현예 50의 일부 추가 구현예에서, 조성물 중 메티오닌의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM 범위이다.
구현예 53. 구현예 28 내지 52 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물 중 폴리펩타이드 농도는 약 1mg/㎖ 내지 약 250mg/㎖이다.
구현예 54. 구현예 28 내지 53 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 제형은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.
구현예 55. 구현예 28 내지 54 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물은 안정화제, 완충제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.
구현예 56. 구현예 28 내지 55 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물은 피험체에게 투여하기에 적합한 약제학적 제형이다.
구현예 57. 구현예 28 내지 56 중 어느 하나의 일부 추가의 구현예에서, 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드이다.
구현예 58. 구현예 57의 일부 추가의 구현예에서, 치료적 단백질은 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편, 항체 약물 콘주게이트, THIOMAB™ 또는 THIOMAB™ 약물 콘주게이트이다.
구현예 59. 구현예 28 내지 58 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함한다.
구현예 60. 구현예 28 내지 59 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설폰산 모이어티를 포함한다.
구현예 61. 구현예 28 내지 60 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고형 지지체를 포함한다.
구현예 62. 구현예 28 내지 61 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 함유된다.
구현예 63. 구현예 28 내지 62 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질이다.
구현예 64. 구현예 28 내지 63 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 Oasis® MCX 크로마토그래피 물질이다.
구현예 65. 구현예 28 내지 64 중 어느 하나의 일부 추가 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 증발 광 산란 (ELSD)에 의해, 또는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 정량화된다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 각 특징은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 위한 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명확히 지칭되지 않는 한, 개시된 각 특징은 단지 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예이다.
본 발명의 추가의 세부사항은 하기 비-제한적인 예에 의해 예시된다. 본 명세서의 모든 참조의 개시내용은 본 명세서에 참고로 명확히 편입된다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 순전히 예시적인 것으로 의도되며, 따라서 본 발명을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 다음 실시예 및 상세한 설명은 제한이 아닌 예시의 방식에 의하여 제공된다.
실시예를 위한 재료 및 방법
하기 물질 및 방법이, 달리 지적되지 않는 한, 실시예에 사용된다.
재료
모든 mAb (A1-A20)는 무변성 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 또는 에스케리치아 콜라이 세포를 사용하여 제조되었다.
Waters Oasis® MAX 카트리지 (2.1×20mm, 30μm 입자 크기, PN# 186002052) 및 Waters Oasis® MCX 카트리지 (2.1×20mm, 30μm 입자 크기, PN# 186002051)는 Waters 사로부터 구매하였다. 폴리소르베이트 20은 시그마(P/N T2700-100ML)로부터 입수하였다. 포름산은 Fluka 사(P/N 94318-250ML-F)로부터 입수하였다. HPLC 등급 빙초산은 JT Baker 사(P/N 9515-03)로부터 입수하였다. HPLC 등급 이소프로판올 (P/N PX1834-1) 및 메탄올 (P/N MX0488-1)은 OmniSolv 사로부터 입수하였다. HPLC 등급 물은 HoneyWell 사 (Cat. 번호 365-4)]으로부터 입수하였다. 암모니아 용액, 27-31%은 Spectrum Chemicals 사(P/N AM180)로부터 입수하였다.
실시예 1. 최적화
전체 HPLC 카트리지 로트에 걸쳐 일관된 PS20 정량화를 산출하고, 그리고 단백질 간섭을 제거하기 위하여, 더욱 확고한 용액이 요구된다. 개시 시점에서, 항체 약물 콘주게이트 (ADC) 제형을 사용하여 본 발명의 방법으로 다른 분자를 평가하기 전에, 이전 방법에 대한 변형의 유효성을 평가하였다. 실험의 목적은, 단백질의 간섭을 최소화하거나 완전히 제거함으로써 다수 생성물 제형에 대한 PS20의 확고한 정량화를 허용하고, 본 발명의 검정이 이전 검정과 비교하여 PS20 정량화의 정확도 및 재생성을 개선시킨다 (다수의 카트리지 로트에 걸쳐 확고함을 포함)는 것을 입증하고, 정성화 연구를 수행하여 생성물 제형을 선택하는데 있어서의 PS20의 정확도, 정밀도, 특이성, 반복가능성 및 실험실내 정밀성(intermediate precision)을 평가하기 위한 PS 검정을 개발하는 것이다.
방법
모든 실험의 경우, 하기 ELSD 설정이 사용된다:
광원 강도 (LED)는 75%로 설정되었음
검출기 증가 (PMT)는 1로 설정되었음
HPLC 검정에서, PS20 에스테르는 카트리지에 잔류하는 반면, 다른 부형제, 단백질, 및 비에스테르화된 PS20 종은 유출 또는 세정 단계에서 용리된다. 세정 단계 후, 증발 광 산란 검출기 (ELSD)를 전환 밸브를 사용하여 인라인 배치하고, 에스테르화된 폴리소르베이트 종은 보다 높은 % 유기 상의 단계 구배에 의해 용리시킨다. 비-에스테르화된 PS20 종은 총 PS20 조성물의 약 20%를 구성한다 (Hewitt, D. 외, 2011, J. Chromatography A, 1218: 2138-2145). HPLC-ELSD 검정은, 표준의 제조에 사용된 PS20의 로트가 샘플 중 PS20에 비해 유사한 양의 PS20 에스테르를 함유하는 한, 충분한 PS20 에스테르만을 정량화한다. 표준의 유사한 PS20 에스테르 조성물은 동등한 프로토콜 (Hewitt, D. 외, 2011, J. Chromatography A, 1215:156-160)에 의하여, 또는 샘플에 사용된 로트와 표준 제조를 위해 사용된 PS20의 로트를 매칭시킴에 의하여 보장될 수 있다.
또한, 방법 0으로도 지칭되는, 본래 방법을 위한 HPLC-ELSD 조건은, Agilent 1200 HPLC 및 Varian 380 ELSD와 같았으며; 카트리지는 Waters Oasis MAX 온라인 카트리지였고; 이동상 A는 수중 2% 포름산이었고; 이동상 B는 이소프로판올 중 2% 포름산이었고; 유속은 1 ㎖/min이었고; 주입 용적은 20㎕이었다. 사용된 구배는 표 2에서 도시된다.
표 2: 방법 0 구배
원래 방법에서 굵게/밑줄로 변형된 방법 1로서 지칭되기도 한 최종 방법은 이하 요약된다. 표 3은 LC 구배를 나타내고, 표 4는 이 검정을 위한 주입의 전형적인 서열을 나타낸다. HPLC-ELSD 조건은 Agilent 1200 HPLC 및 Varian 380 ELSD과 같았고; 카트리지는 Waters Oasis MAX 온라인 카트리지였고; 이동상 A는 수중 2% 포름산 또는 수중 2% 아세트산이었고; 이동상 B는 이소프로판올 중 2% 포름산 또는 메탄올 중 2% 아세트산이었고; 유속은 1.25 ㎖/min이었고; 그리고 주입 용적은 20㎕ (PS20 농도 범위 의존적)이었다. 아세트산이 궁극적으로 최종 조건을 위해 선택되었지만, 초기에는 일부 정성화 및 견고성 작업은 이동상 중 2% 포름산을 사용하여 수행되었다.
표 3: 방법 1 구배
표 4: 전형적 시퀀스
방법 최적화
1. 초기에 시도된 조건:
방법 1 개발 과정 동안, 단백질 간섭의 영향을 최소화할 목적으로 최종 메탄올 기반 이동상이 선택되기 전에 다수의 상이한 실험 조건을 평가하였다. 이러한 실험은 표 5에 요약되어 있다.
표 5: 기타 시도된 용액의 간략한 개요 (달리 명시되지 않는 한, 이동상 중 포름산)
방법 확고성 실험
표 6 및 표 7은 다중 생성물에 대한 방법 확고성을 시험하는 데 사용되는 생성물 및 카트리지를 기재한다.
표 6: 9개의 카트리지 상에서의 방법 정확도를 비교할 경우 시험되는 생성물
표 7: 방법 확고성 시험에 사용되는 흡착제 뱃치 및 로트
1. 카트리지 상에서의 방법 확고성:
표 8은 방법 0에서 허용되는 특이성을 제공하는 하나와, 방법 0에서 허용되지 않는 특이성을 제공하는 다른 하나인, 두 개의 상이한 카트리지를 사용하여 12개의 참조 표준(표 9에 제시됨)에 대한 방법 확고성을 평가하는 데 사용된 카트리지를 기재한다. 표 8에 제공된 카트리지의 수는 표 7에 제공된 수에 상응한다.
표 8: 다중 생성물 상에서의 방법 확고성을 예증하기 위해 사용된 카트리지
표 9: 참조 표준 패널 (20㎕ 주입)
방법 정성화
방법 정성화는 선형성, 정확도, 정밀도 (실험실내 정밀성 포함) 및 특이성을 평가함으로써 완료되었다. 표 10은 실험실내 정밀성을 위하여 사용된 기기 및 카트리지를 기재한다.
표 10: 실험실 내 정밀성을 위한 조건
결과:
방법 최적화
다단계 구배 실험:
상이한 이동상의 평가 동안, 폴리소르베이트가 전형적인 단백질 제형의 다른 구성 성분으로부터 완전히 분리될 수 있었는지 여부를 계측하는 방법이 요구되었다. 이 분석을 수행하기 위해, 다단계 구배 실험이 수행되었다 (도 1). 이들 실험은 10% 유기 용매 중 2% 휘발성 산(포름산, 트리플루오로아세트산, 또는 아세트산)으로 이루어진 이동상으로 카트리지를 평형화시키고, 이동상의 유기 용매의 농도를 5%의 단계로 증가시키고, 각각의 농도에서 1분 동안 유지시켜 PS20 정량화 방법의 세정 단계를 시뮬레이션함을 수반한다. 이들 5% 단계는 98% 유기 (+2% 휘발성 산) 이동상에 도달될 때까지 반복시켰다. 1 ㎖/min의 일정한 유속을 이 방법 동안 유지시켰다. 이들 실험은 PS20 이외의 제형의 모든 구성 성분을 완전히 용리시킨 이동상 조성을 계측하기 위한 PS20 비함유 단백질의 샘플 및 PS20 에스테르 종을 용리시키기 시작한 이동상 조성을 계측하기 위한 PS20 표준 둘 모두로 수행하였다. 이들 두 개의 이동상 유기 용매 농도는 최적의 이동상 조성이 단백질 매트릭스 구성 성분 및 폴리소르베이트 에스테르를 완전히 분리함을 발견할 수 있는지를 계측하기 위해 비교하였다. 이 최적의 이동상 조성은 카트리지에 잔류될 수 있는 임의의 단백질을 제거하기 위해 분석 방법의 세정 단계 동안 사용된다. 다단계 구배가 두 가지 이유로 선형 구배보다 바람직하였다. 첫째, 선형 구배는 상기 방법의 세정 단계를 시뮬레이션하지 않고, 둘째, 선형 구배 동안 각각의 구성 성분의 용리를 일으키는 별개의 이동상 조성을 계측하는 것이 어렵다.
다단계 구배 실험은 카트리지로부터 단백질을 세정하지만 PS20 에스테르 종을 잔류시키는 최적의 메탄올 농도가 40% 내지 50%였음을 나타냈다 (도 1 및 도 2). 2% 포름산이 여전히 이동상에 존재함이 주시된다. 40% 및 50% 메탄올 세정 단계를 모두 시험하였고, 둘 모두 A1 ADC로부터 단백질 간섭을 제거하였다. 40% 메탄올 세정에 의한 PS20 피크 면적은 50% 메탄올 세정에 의한 PS20 피크보다 평균 38% 더 컸다 (n = 8). 따라서, PS20 민감성을 개선시키기 위해 40% 메탄올을 선택하였다. 50% 세정에 의한 보다 낮은 피크 면적은 단백질 세정 단계 동안 보다 덜 소수성인 PS20 에스테르의 일부가 용리되었음을 나타낼 수 있지만, 이 가능성은 더 이상 조사되지 않았다.
도 1은 전형적인 단계 구배 오버레이 (PS20 비함유 생성물 및 PS20 표준)의 예를 도시한다. 이 오버레이는 모든 단백질이 40% 내지 50% 메탄올로 용리되고, PS20 에스테르는 50% 메탄올에서 용리되기 시작한다는 것을 설명한다. HPLC와 ELSD 사이의 밸브는 검출기의 포화를 피하기 위해 단백질 샘플의 제1 분 동안 전환 모드임을 주시한다. PS20 표준에 제시된 다중 피크는 소수성이 증가하는 순서로 카트리지로부터 용리되는 상이한 폴리소르베이트 종에 기인한 것일 수 있다. 각각의 단계에서 용리되는 상이한 단백질 피크는 특성화되지 않았다. 이 오버레이는 PS20 에스테르를 잔류시키면서 카트리지로부터 단백질을 세정하기 위한 메탄올의 최적 농도를 찾는 빠른 방법을 제공한다.
다단계 구배 실험을 이소프로판올을 사용하여 반복하여 단백질 및 PS20 영역의 용리를 메탄올과 비교하였다. 도 2는 2개의 상이한 카트리지 상의 PS20-비함유 A1 ADC 및 PS20 표준에 대한 메탄올 및 이소프로판올의 상이한 다단계 용리 프로파일을 설명한다. 제1 카트리지 (추적 1)는 이전에 평가되었고; 제1 카트리지는 방법 0 (추적 1)으로 정상적으로 수행되었지만, 제2 카트리지는 최적이 아니었다 (추적 2). 이소프로판올에 의한 다단계 구배 실험은 세정 단계에서 최적의 이소프로판올 농도가 20%였음을 나타냈다. 이것은 1 내지 3.4분의 20% 이소프로판올 세정을 사용하는 방법 0과 일치한다. 그러나, 이소프로판올 세정에 의한 단백질 및 PS20 에스테르의 분리는 상이한 카트리지에 대해 일관되지 않고, 카트리지에서 카트리지로의 단백질 간섭의 가변성을 설명한다. 특정 카트리지 (예: 도 2에 사용된 카트리지)에서, 단백질의 일부가 PS20 에스테르와 동일한 이소프로판올 농도에서 용리되었다. 이러한 거동은 PS20을 이소프로판올 방법으로 정량화할 때 이들 특정 카트리지가 유의미한 양의 단백질 간섭을 나타낼 것이고, 이 효과가 실험적으로 확인되었음을 나타냈다.
도 2의 하부 패널과 대조적으로, 상부 패널은 상이한 카트리지 상의 메탄올 다단계 구배가 40% 메탄올 단계에 의해 모든 단백질을 지속적으로 용리시키고, PS20 에스테르는 50% 메탄올로 출발하여 이소프로판올 단계 구배와 비교하여 PS20 영역보다 단백질 영역의 보다 넓은 분리 윈도우(separation window)를 설명함을 입증하였다. 이 결과는 40% 메탄올 세정을 사용하면 PS20 에스테르에서 단백질을 지속적으로 분리하고, 따라서 카트리지 간의 PS20 정량화의 가변성을 감소시킨다는 것을 나타냈다.
다단계 구배 실험을 사용하여 서로 상이한 카트리지 및 이동상 조성 상에서의 PS20 및 단백질의 분리를 신속하게 평가하였다 (도 1 및 도 2).
이 접근법은 PS20 검정을 위한 세정 조건을 성공적으로 계측하였고, 상이한 카트리지 및 이동상을 사용하는 다른 분석물의 분리를 위한 세정 단계의 유효성을 평가하는 데 잠재적으로 사용될 수 있었다.
실험 설계:
2 수준 전체 계승 실험 설계 (DoE)를 사용하여 포름산을 함유하는 변형된 PS20 방법을 최적화하였다. 검사된 파라미터는 다음과 같았다:
세정 단계 동안 메탄올 농도 (40%, 50%)
세정 기간 (1.8분, 3.0분)
유속 (0.75 ㎖/min, 1.25 ㎖/min)
부하된 PS20의 질량 (4㎍, 12㎍)
"세정" 단계는 유기 농도가 일정하게 유지되어 카트리지의 임의의 잔류 단백질을 세정하는 HPLC 방법의 일부를 의미한다는 것을 주시한다. 2-수준 전체 계승 순열 이외에, 중간점 (45% 유기물 세정, 2.4분 세정 기간, 1 ㎖/min 유속, 8㎍ PS20 부하량)을 시퀀스의 초기 및 말기에 시험하였다. 이 실험은 하기 3개의 샘플에 대해 별도로 수행되었다: 수중 PS20, PS20-비함유 A1 ADC, 및 PS20-비함유 A1 ADC에 스파이킹된 PS20. PS20-비함유 A1 ADC 샘플의 경우, PS20 부하 파라미터가 적용되지 않았다.
최적화용으로 사용된 기준은 아래와 같다:
PS20의 체류 시간에서의 단백질 간섭 최소화 (PS20-비함유 A1 ADC 샘플 단독에 대하여)
단백질 및 PS20 피크 사이 해상도 최대화 (PS20 + A1 ADC 샘플의 경우)
10% 피크 높이에서의 PS20 피크 폭 최소화 (수중 PS20 샘플)
PS20 피크 면적의 최대화 (수중 PS20 샘플)
DoE의 결과는 시험된 모든 조건이 단백질 간섭을 제거했음을 나타냈다. PS20-비함유 A1 ADC를 주입할 경우 단백질 간섭은 관찰되지 않았다. 유사하게, 단백질과 PS20 피크 사이의 해상도는 모든 경우에 3보다 컸고, 여기서 해상도는 다음 방정식 (방정식 1)에 의해 산출되었다:
방정식 1: 해상도
상기 식 중, t는 각각의 피크의 체류 시간이고, W50%는 50% 높이의 피크 폭이다.
시험된 모든 조건에서 단백질 간섭 또는 해상도에 대해 영향을 미치지 않으므로, PS20 피크 면적 및 폭은 민감성 및 피크 형상에 최적화되었다. PS20 피크 면적 및 폭에 대한 유속, 메탄올 세정 농도 및 세정 시간의 요약은 도 3에 설명되어 있다. 유속을 증가시키는 것은 PS20 피크 폭을 감소시켰고, 세정 단계에서 메탄올 농도를 50%에서 40%로 감소시키는 것은 PS20 피크 면적을 38%까지 증가시켰다. 50% 메탄올 세정의 경우, 비에스테르화된 PS20 종보다 늦은 체류 시간에 세정 단계 동안 추가의 PS20가 용리되었고, 이 추가의 피크는 덜 소수성 PS20 에스테르의 조기 용리로 인한 것으로 의심된다. 가장 밀접한 발견은 세정 단계에서 MeOH 농도를 증가시킴에 따라 PS20 피크 면적이 감소하고, 유속을 증가시키는 것은 피크 폭을 감소시킨다는 것이었다.
40% 및 50% 메탄올 세정의 비교는 도 4에 설명된다. 대략 1.8 내지 3.5분으로부터 이 추가의 피크는 45% 메탄올 세정으로 제공되지 않았다. 시험된 PS20 부하물이 임의의 평가 기준에 영향을 미치지 않았음이 발견되었다. 최저 메탄올 세정 농도 (40%), 최고 유속 (1.25 ㎖/min), 및 중간점 세정 시간 (2.4분)을 방법 1의 최적화된 파라미터로서 선택하였다. 선택된 최종 조건들은 표 3에 도시된다.
방법 확고성 실험
최적의 메탄올 세정 농도가 다단계 구배 실험을 사용하여 계측되면, 방법 1 (포름산 + 메탄올)을 방법 0 (포름산 + 이소프로판올)에 대한 개선에 대해 시험하였다.
생성물 상에서의 방법 확고성
방법 1 (포름산 + 메탄올) 및 방법 0 (포름산 + 이소프로판올) 사이의 단백질 간섭의 영향을 추가로 평가하기 위해, PS20을 2개의 카트리지를 사용하여 12개의 상이한 참조 표준에서 정량화하였다. 카트리지는 하나의 카트리지 (카트리지 1)가 허용되는 것으로 간주되어 방법 0으로 정확한 결과를 산출하고, 하나의 카트리지 (카트리지 5)가 방법 0에 의한 높은 수준의 단백질 간섭으로 인해 허용되지 않는 것으로 간주되도록 선택되었다. 이 실험의 목적은 방법 1이 다중 생성물에 대해 "허용되는" 및 "허용되지 않는" 카트리지 사이의 가변성을 감소시킨 정도를 입증하는 것이었다. 각 방법을 사용하는 PS20 정량화의 조도는 각각 표 8 및 표 9의 방법에 기재된 카트리지 및 참조 표준에서 비교하였다.
각 방법에 대한 참조 표준 및 그들의 측정된 PS20 농도는 표 11에 나열되어 있다. 각 참조 표준에 대해 A의 C에 열거된 PS20 농도가 스파이킹된 샘플의 경우에서와 같은 이론값으로 처리될 수 없기 때문에 각 방법의 정확도는 산출되지 않았다. 따라서, 각 방법의 정확도는 이러한 참조 표준에 대해 평가될 수 없다.
표 11: 방법의 비교: 다양한 참조 표준에 대해 측정된 PS20 농도의 카트리지간 차이
* FA = 포름산
** 각 방법에 대한 PS20 정량화에서의 절대차 (%)는 방정식 2에 의하여 산출됨
표 11의 데이터는 이동상 중 메탄올을 사용하는 2개의 카트리지 사이의 PS20 정량화의 차이는 일관되게 5% 미만임을 나타낸다. 대조적으로, 이동상 중 이소프로판올을 사용하는 경우에 PS20 정량화의 차이는 카트리지 사이에 훨씬 더 큰 정도의 가변성을 나타낸다. 방법 0 (포름산 + 이소프로판올)은 카트리지 변형에 더 민감하다. 표 11의 데이터는 이동상 중 포름산 + 메탄올을 사용하면 카트리지가 방법 0에서 수행하는 방법에 관계없이 모든 생성물에 대해 상이한 카트리지에서 보다 일관된 PS20 정량화를 산출함을 도시한다. PS20 정량화의 절대차 (%)는 방정식 2를 사용하여 산출되었다:
방정식 2: PS20 정량화에서의 절대차 (%)
| 100*([카트리지 5 농도] - [카트리지 1 농도]) / [카트리지 1 농도] |
카트리지 상에서의 방법 확고성
방법 0 및 방법 1 (포름산 + 메탄올)을 4개의 생성물에 의한 9개의 카트리지에 대한 두 조건을 시험함으로써 비교하였다. PS20은 각 생성물의 표적 제형 농도 중 50%에서 PS20-비함유 단백질 매트릭스에 스파이킹되었다. 이 접근법은 검정이 분석 허용 기준의 증명서에 기초하여 각 생성물을 정량화하는 데 필요로 할 최저 PS20 농도를 나타냈다. 표준 및 대조군은 PS20을 물에 스파이킹하여 제조하였다. 2개의 HPLC/ELSD 시스템 (Agilent 1200/Agilent 380 및 Waters 2695/Varian 380)을 시험에 사용하였다. 시험된 생성물 및 카트리지는 각각 방법 섹션, 표 6 및 표 7에 상세히 기재된다. 시험된 카트리지는 광범위한 로트, 연령 및 과거 성능을 망라하도록 의도적으로 선택되었다.
PS20-비함유 생성물 샘플 및 PS20-스파이킹된 샘플을 시험하여 각각 PS20 검정에 의한 단백질 간섭 및 PS20 정량화의 정확도를 평가하였다. A1 ADC, A2, A3, 및 A4 샘플은 포름산 + 메탄올 및 포름산 + 이소프로판올 (방법 0) 둘 모두를 사용하여 9개 카트리지 상에서 시험하였다. 평균 회수율, 상대 표준 편차, 및 두 방법을 사용하는 모든 카트리지에 대한 범위가 표 12에 제시되어 있다.
표 12: 9개의 Waters Oasis
®
MAX 카트리지 상에서의 PS20-비함유 단백질에 스파이킹된 PS20의 회수율 및 RSD (%).
표 12는 이동상 중 메탄올을 사용하면 PS20 정량화의 정확도를 개선시키고 (평균 회수율은 100%에 가깝다), 카트리지에 대해 가변성을 감소시킨다 (%RSD는 감소된다)는 것을 설명한다. 이들 데이터는 이동상 중 이소프로판올 대신 메탄올을 사용하면 A1 ADC 및 A2 제형에서 PS20 정량화에 특히 잘 작동함을 도시한다. A4 제형에서 PS20의 편향된 과-회수율은 카트리지에 부하된 단지 1μg의 PS20(20㎕ 주입, 0.05mg/㎖ PS20 농도)에 의한 감소된 신호 대 잡음 비율에 기인할 수 있다. 증가된 PS20 부하물 (50㎕ 주입)을 R&D 방법 정성화 (포름산 + 메탄올) 동안 사용하였고, 과-회수율은 관찰되지 않았다.
A3의 과-회수율은 이동상 중 메탄올을 사용할 경우 관찰되었지만, 이는 여전히 이소프로판올 이동상보다 개선된 것이었다. 부분적으로 길칸(gylcan) 상의 시알산 기의 증가된 존재비에 기인하는 이러한 분자의 저 pI는 고정상의 양으로 하전된 4급 아민 그룹의 정전기적 인력에 의한 단백질의 보유를 야기한다고 가정된다.
추가의 방법 최적화
이동상 중 산의 선택
실험은 메탄올 기반 이동상 및 상이한 이동상 유기 산을 사용하는 단계 구배를 사용하여 수행하여 단백질 간섭을 최소화하는 것과 관련하여 상기 방법에 대한 최상의 첨가제를 계측하였다. 메탄올 단계 구배 실험은 ELSD 검출과 함께 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산을 사용하여 PS20-비함유 A1 ADC 및 PS20-비함유 A10 ADC로 수행하여 단백질 용리에 대한 산의 영향을 모니터링하였다. 수중 PS20 표준을 사용하여 PS20의 유지율을 모니터링하였다.
이동상 첨가제를 변경하면 단백질이 카트리지에 유지되는 방법에 대한 통찰력이 수득된다. 도 5, 6, 및 7은, 이동상 중 각각 트리플루오로아세트산, 포름산, 및 아세트산을 갖는, PS20 표준 및 PS20-비함유 ADC의 메탄올 다단계 구배 오버레이를 도시한다. 모든 이동상 첨가제의 경우, PS20 에스테르는 50% 메탄올에서 용리되기 시작한다. 도 5는 이동상 중 트리플루오로아세트산을 사용하는 PS20-비함유 A10 ADC 및 PS20 표준을 나타낸다. 단백질 용리는 대략 80% 메탄올에서 완료되었다. 따라서, 대부분의 단백질은 PS20 에스테르와 공동 용리되고 PS20 정량화를 간섭한다. 도 6은 이동상 중 포름산을 사용하는 PS20-비함유 A1 ADC 및 PS20 표준을 나타낸다. 단백질은 약 40% 메탄올에서 완전히 용리되어 40% 메탄올 세정이 폴리소르베이트로부터 단백질을 분리한다는 것을 나타낸다. 이 결과는 개발된 방법 1과 일치하였다. 도 7은 이동상 중 아세트산을 사용하는 PS20-비함유 A1 ADC 및 PS20 표준을 나타낸다. 이 경우에, 단백질은 15% 메탄올에 의해 완전히 용리되었다. 이 발견은 단백질이 15% 내지 50% 범위의 임의의 메탄올 세정에 의해 PS20 에스테르로부터 분리될 수 있음을 나타낸다. 이들 이동상 첨가제의 이온 쌍형성 강도는 다음과 같았다: 트리플루오로아세트산 > 포름산 > 아세트산. 상응하게, 단백질이 역상 고정상과 소수성 상호작용을 통해 결합하는 경우에 예상되는 바와 같이, 이동상 중 이온 쌍형성화제의 강도가 증가함에 따라 단백질이 보다 강하게 유지되었다.
이론에 의한 구속됨 없이, 산성 이동상의 낮은 pH는 단백질의 순 양전하를 생성한다. 양으로 하전된 단백질과 양으로 하전된 Oasis® MAX 고정상의 상호작용은 쿨롱적으로 바람직하지 않아 단백질이 고정상에 의해 잔류되지 않도록 해야 한다. 대조적으로, 이온 쌍형성 이동상 첨가제는 단백질과 상호작용하여 효과적으로 단백질이 더 소수성이도록 할 수 있다 (Xindu, G., & Regnier, F. E. Journal of Chromatography A, 296:15-30, 1984). 이 상호작용은 충분히 강한 이온 쌍형성화제 (예: TFA와 같음)와 소수성 상호작용 기전에 의해 단백질이 카트리지에 잔류하도록 한다. 이동상 중 이온 쌍형성화제의 강도를 감소시키면 후속적으로 단백질/고정상 상호작용을 감소시킬 것이다. 시험된 3개 중 가장 약한 이온 쌍형성화제로서, 이동상 중 아세트산은 카트리지 상의 단백질 보유도를 현저하게 감소시키는 것으로 나타난다. 따라서, 이동상 첨가제로서 아세트산은 시험된 다른 첨가제보다 단백질과 PS20 에스테르 간의 더 양호한 분리를 가능하게 하였다.
도 8은 이동상 첨가제로서 아세트산과 포름산 사이의 분석 방법 성능의 비교를 도시한다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 이동상 첨가제로서 포름산을 사용하는 물 주입와 비교하여 단백질 주입에 대해 기준선에서 매우 작은 증가 (약(~) 3 mV)가 관찰된다. 이 간섭은 최소로 간주되지만, 단백질 매트릭스 주입은 아세트산이 이동상의 첨가제일 경우 ELSD 기준선을 증가시키지 않는다는 것이 관찰된다. 또한, 280nm에서 흡광도는 단백질 보유 및 청소율을 관찰하기 위해 진단 목적으로 모니터링하였다. 이동상 중 아세트산을 사용할 때, 단백질은 공극 용적에서 거의 완전히 제거되는 반면, 포름산이 첨가제로서 사용될 경우 단백질은 카트리지에 약하게 보유되고, 1 내지 2분의 체류 시간에 용리된다. LC 유동은 2.4분에 ELSD로 전환되기 때문에, 포름산이 첨가제일 경우 단백질이 완전히 제거되지 않아 일부 단백질 간섭을 가능하게 할 기회가 증가된다.
아세트산 + 메탄올 용리 조건으로부터 상이한 카트리지 (로트 특정 세부 사항에 대해 표 7 참조)를 사용하는 대표적인 크로마토그램은 도 9에 제시되어 있다. 카트리지 1의 피크 형상이 전형적이지만 (추적 1), 이들 데이터는 PS20 피크 프로파일이 상이한 카트리지에서 다를 수 있음을 입증한다. 특정 카트리지, 예를 들어, 카트리지 4 (추적 2)에서, PS20 피크는 테일링하는 경향이 있고; 이러한 카트리지의 추가 사용으로, 테일링은 결국 PS20 피크 분할될 수 있다 (추적 3). 이 거동은 카트리지 2 (데이터 도시되지 않음) 및 4가 방법 개발을 통해 피크 분할을 나타낸 시험된 유일한 카트리지이기 때문에 일반적이지 않다. 다른 경우, 예를 들어, 카트리지 5 (추적 4)에서, 약한 피크 테일링이 관찰된다. 부수적으로, 메탄올 이동상으로 증가된 피크 테일링 및 피크 분할을 나타내는 카트리지는 또한 이소프로판올이 이동상으로 사용되는 경우 단백질 간섭의 증가된 수준에 적용된다. 이 발견은 증가된 피크 테일링을 나타내는 카트리지가 보다 강하게 소수성 분자를 보유한다는 것을 나타낼 수 있다. 피크 형상과 무관하게, PS20 정량화 및 통합 처리 방법은 영향을 받지 않았다.
PS20 정량화를 위한 최종 방법 1은 Oasis® MAX 카트리지 상의 포름산에 비해 단백질 및 PS20의 분리를 개선시키는 것으로 나타났기 때문에, 이동상 중 2% 아세트산을 사용하여 구현될 것이다 (도 9).
방법 정성화
세정 단계를 최적화하고 방법 확고성 실험을 수행하기 위해 단계 구배 실험을 사용한 후, 이동상 중 2% 포름산 대신 2% 아세트산을 사용하면 단백질 및 PS20 에스테르의 분리가 개선됨을 발견하였다. 따라서, 이 실시예는 포름산/메탄올 이동상 (초기 방법 개발로부터) 및 아세트산/메탄올 이동상 (최종 방법) 둘 모두로 수행된 정성화 실험을 기재한다.
검정을 정성화하는데 사용된 방법은 하기 파라미터 이외에 방법 0에서 HPLC-ELSD 검정과 일치하였다:
유속 = 1.25 ㎖/min
이동상 A = 수중 2% 포름산 또는 수중 2% 아세트산
이동상 B = 메탄올 중 2% 포름산 또는 메탄올 중 2% 아세트산
표 3의 구배가 사용되었음
주입 용적은 제형에서 PS20의 농도에 따라 조정되어 카트리지에 유사한 부하량을 유발하였다. 하기를 참고한다: 표 13.
정성화 연구는 PS20-비함유 A1 ADC, PS20-비함유 A1, PS20-비함유 A4, PS20-비함유 A5, 및 PS20-비함유 A11로 수행되었다. 공지된 양의 PS20을 각 샘플로 스파이킹하여 검정의 정확도를 계측하였다. 검정 (생성물당 사용된 첨가제에 대해 표 13 참조)은 정확도, 정밀도, 특이성, 반복가능성, 및 실험실내 정밀성에 대해 평가하였다.
정확도 및 정밀도:
PS20 (로트 MKBL2646V)을 공지된 농도(생성물 의존적; 표 13 참조)로 PS20-비함유 단백질 샘플로 스파이킹하여 검정의 정확도를 계측하였다. 이 실험은 스파이킹에 의한 단백질의 희석이 최소화되도록 고농도 PS20 모액 (25mg/㎖)을 사용하여 수행하였다. 각각의 농도에 대해, 다르게 언급되지 않는 한 PS20에 스파이킹된 샘플을 3중복(triplicate)으로 주입하였다. PS20 회수율을 사용하여 PS20 정량화의 정확도를 계측하였다. 평균 회수율의 범위를 사용하여 정밀도를 계측하였다. 명시된 범위에 대한 선형성 (표 13)도 또한 계측되었다. 표 13은 각각의 생성물에 스파이킹된 PS20의 농도를 나타낸다. 2개 범위의 DNIB0600S를 사용하여 단계 III 제형 잠금(lock) 이전에 최악의 경우 (즉, 최저) PS20 농도 (0.4mg/㎖) 및 더 높은 농도 (0.7mg/㎖)를 망라했음이 주시된다. 0.2mg/㎖ - 1mg/㎖ PS20의 범위에서 PS20을 정확하게 정량화하기 위해 ELSD 설정이 변경될 필요가 있기 때문에 2개의 별개의 범위가 사용되었다. 각각의 범위에 대해, 검출기 설정을 변경하기보다 주입 용적이 변경되었다. 제형 잠금 후, 단일 범위를 사용하여 최종 제형 (1.2mg/㎖ PS20) 및 더 높은 단백질 농도 (40mg/㎖)에 대해 또 다른 평가를 수행하였다.
표 13: 방법 정성화 동안 평가된 생성물
* 3개의 PS20 농도에서 2중복 주입
각 농도 세트의 표준은 수중 PS20로 제조되었다. 표준을 단백질 샘플 전에 중복으로 주입하였다. 시험 제품의 6번째 주입마다 물 대조군 샘플 중 PS20으로 브라케팅(bracketing)하였다. PS20 대조군은 표준 (PS20 로트 MKBJ7237V로부터)으로부터 별도로 제조되었다. 각 PS20-비함유 단백질 생성물에 스파이킹된 PS20 농도의 범위를 망라하는, 표준 농도가 선택된다.
PS20 대조군의 농도는 각 생성물의 약물 물질 제형을 위한 가능한 또는 실제 PS20 농도를 기준으로 하여 선택되었다. 표 14는 각 농도 범위에 걸쳐 분석을 위하여 사용되는 표준 및 대조군 PS20 샘플의 농도를 도시한다.
표 14: 각 생성물에 대한 표준 곡선 및 대조군에 대하여 사용된 PS20 농도
방법 1의 정확도 및 정밀도는 다중 생성물에 대해 시험하였다. 정확도에 대한 허용가능한 결과는 각각의 스파이킹된 농도에서 평균 회수율이 80% 내지 120%이다는 것을 나타내야 한다. 각 생성물에 대한 결과는 표 15에 제시되어 있다.
표 15: 평균 회수율 (%) 및 범위
표 15에 나타낸 바와 같이, 모든 농도에서 시험된 모든 생성물에 대한 평균 회수율 (%)은 허용 기준 (80% - 120%)을 충족시키고, 82.4% 내지 114.8% 범위였다. 따라서, 이 검정은 시험된 PS20 범위에서 모든 생성물에 대해 허용되는 정확도 및 정밀도를 입증하였다.
주입 용적이 다양하기 때문에, 검정 범위는 또한 (제형 중 PS20 농도에 의해서가아닌) PS20 질량으로 표현될 수 있다. 이들 결과는 1.25 (0.025μg/㎕ x 50㎕) 내지 16㎍ (1.60㎍/㎕ x 10㎕)의 PS20이 카트리지 상에 부하되어 정확하게 정량화될 수 있음을 나타냈다.
선형성
선형성은 피어슨의 상관 계수 (r) > 0.99를 계측하여 평가하였다. 이들 값은 PS20 농도의 각 범위에 대해 표 16에 제시되어 있다.
표 16: PS20 농도 범위 상에서의 피어슨의 상관 계수
피어슨 상관 계수의 모든 값은 시험된 PS20 범위에 대해 ≥0.99였다. 따라서, 선형성은 다중 생성물에 대한 이 검정에서 허용 가능하였다.
특이성.
특이성은 PS20-비함유 제형 완충제 및 PS20-비함유 생성물의 주입이 PS20 피크에 기여하지 않는다는 것을 확인함으로써 9개 생성물에 대해 계측되었다. 제형 완충제 및 PS20-비함유 단백질 샘플에 대한 주입은 2중복(duplicate)으로 수행되었다. PS20 비함유 제형 완충제 및 PS20 비함유 단백질 매트릭스의 피크 면적을 각 생성물의 표적 PS20 농도의 50%에서 표준의 반응과 비교하였다. 허용 기준은 PS20 비함유 샘플의 피크 면적이 최저 표준에서 피크 면적의 10% 이하(≤)인 경우 충족된다. PS20 영역 내 가시성인 일부 단백질 간섭이 존재할 경우, 하기 방정식이 특이성의 수치적 추산치를 유도하기 위하여 사용되었다:
방정식 3: 특이성 산출
특이성 = (PS20-비함유 단백질의 면적/PS20 사양의 50%의 면적)*100
도 10 (A1 ADC 포함)에 도시된 바와 같이, PS20-비함유 제형 완충제도, 그리고 PS20-비함유 단백질 샘플도 PS20 피크를 간섭하지 않았다. 모든 다른 생성물에 대한 특이성 값은 표 17에 제시된다. 표적 PS20 농도가 포름산 방법 정성화 실험 후 A1 ADC에 대해 선택되었기 때문에, 더 낮은 표적 PS20 농도를 사용하여 샘플의 특이성(별표로 표시됨)을 산출하였다. 낮은 표적 PS20 농도를 사용하면 높은 특이성 값을 초래하지만, 보고된 모든 값은 여전히 10% 미만이다.
표 17: 특이성
N/A: PS20-비함유 단백질 주입은 물 주입와 동일하다.
반복가능성:
20mg/㎖ PS20-비함유 A1 ADC에 스파이킹된 0.4mg/㎖ PS20 및 150mg/㎖ PS20-비함유 A14/A15에 스파이킹된 0.3mg/㎖ PS20을 함유하는 샘플을 6회 주입하였다. 이들 주입에 대한 PS20 피크 면적 및 상응하는 농도는 표 18에 제시되어 있다. 반복 주입의 면적 및 농도에 대한 %RSD는 허용되는 주입 반복가능성을 입증하였다.
표 18: 주입 반복가능성
반복 주입의 면적 및 농도에 대한 RSD (%)는 검정의 반복가능성을 예증하였다.
실험실내 정밀성:
실험실내 정밀성 (포름산 + 메탄올 단독)은 3개의 상이한 PS20 표준 및 완충제 제제를 사용하여 2명의 상이한 분석가에 의해 2개의 상이한 HPLC-ELSD 시스템 상에서 3개의 카트리지에 대해 계측하였다. 매일 각 샘플에 대해, 2회 주입의 평균은 표 19에 보고된다. 모든 주입에 대한 평균 표준 편차는 표 19의 하단에 보고된다. 주입된 샘플은 20mg/㎖ PS20-비함유 A1 ADC에 스파이킹된 0.4mg/㎖ PS20, PS20-비함유 A1에 스파이킹된 0.1mg/㎖ PS20, 및 PS20-비함유 A4에 스파이킹된 0.1mg/㎖ PS20이었다. 각 일자에 대한 조건은 방법 섹션에서 표 10에 제시되어 있다. 실험실내 정밀성은 아세트산이 방법 1의 변형제로서 최종화되기 전에 포름산을 사용하여 수행되었다. 실험실내 정밀성은 정성화의 모든 다른 파라미터가 두 변형제 사이에서 비교할 만하였고 샘플 제제가 두 조건에서 동일했기 때문에 이동상 중 아세트산으로 반복되지 않았다.
실험실내 정밀성을 시험하는 3일 동안 3개의 샘플 모두에 대한 RSD (%)는 10% 미만이었다. 이들 결과는 검정이 다양한 카트리지, 샘플 제제, HPLC-ELSD 시스템, 및 분석가에 대해 일관적이었음을 나타낸다. 2일째에 농도에 대해 약간 낮은 경향이 주시되었다.
표 19: 실험실내 정밀성 (모든 실험은 포름산으로 수행된다)
결론:
하기 변형이 새로운 버전의 방법을 개발하는 동안 ELSD 방법 0 검정에 대해 이루어졌다:
이소프로판올에서 메탄올로 전환된 이동상 B
2% 포름산에서 2% 아세트산으로 변경된 첨가제
1 내지 3.4분의 세정 단계에서의 유기물의 농도는 20% 내지 40%의 이동상 B로 전환되었음
1.00 ㎖/min에서 1.25 ㎖/min으로 변경된 유속
집합적으로, 이들 변형은 단백질 간섭 및 카트리지 대 카트리지 성능 가변성 모두를 유의미하게 감소시켰다. 이소프로판올에서 메탄올로의 이동상 B 유기물을 변화시키는 것(도 2)은, 이전 조건과 비교하여 단백질 및 PS20의 분리를 개선시켰다. 메탄올/FA 및 이소프로판올/FA 비교 실험 (표 11 및 표 12) 둘 모두의 결과는 방법 1이 PS20 정량화 및 카트리지-대-카트리지 재생성을 유의미하게 개선시켰음을 나타냈다. 포름산을 이동상 첨가제로서 아세트산 (도 8)으로 대체하는 것은, 카트리지에 대한 단백질의 보유율을 추가로 감소시켰다. 게다가, 유기 세정 단계를 20%로부터 40%로 변경하는 것은 단백질 간섭을 유의미하게 최소화하였다.
다중 생성물에 대한 이러한 변형된 검정의 정성화 결과는 이 검정이 다양한 분자 포맷, 단백질 농도 및 PS20 농도에 대해 PS20을 정량화하기에 적합하여 방법 1이 플랫폼 PS20 정량화 검정을 위한 후보임을 나타낸다는 것을 보여주었다.
실시예 2. N-아세틸 트립토판-함유 제형을 위한 HPLC-ELSD 폴리소르베이트 20 정량화 방법의 개발
상기한 PS20 방법 (방법 1)을 평가하는 과정에서, N-아세틸 트립토판 (NAT)이 제형 중 추가의 부형제로서 존재할 때 폴리소르베이트 20 (PS20)을 유의미하게 간섭한다는 것이 발견되었다. 실시예 1의 방법 1이 시험된 대부분의 제형에 대해 최소화된 단백질 간섭뿐만 아니라 카트리지에 대한 감소된 가변성을 나타냈지만, N-아세틸 트립토판은 이 방법의 조건하에 카트리지 상에 보유되고, PS20과 동일한 체류 시간에 용리되었다. 이론에 의한 구속됨 없이, NAT는 방법 1에 사용된 혼합 방식 음이온 교환 수지 (MAX) 카트리지와 상호작용하는 분자 상에 카복실레이트 그룹의 존재로 인해 카트리지 상에 보유될 수 있다.
하기에 기재된 바와 같이, 방법 1은 하기에 의해 NAT 간섭을 제거하도록 변형되었다:
1) 카트리지를 MAX 수지로부터 혼합 방식 양이온 교환 수지 (MCX)로 변경
2) 이동상 첨가제를 아세트산으로부터 수산화암모늄으로 변경
추가로, 방법 2로서 지칭되기도 하는 방법의 추가의 최적화는 유기 세정을 40%B에서 45%B로 증가시키고 세정 단계 시간 및 용리 단계 시간을 각각 +1분 및 +2분씩 증가시킴으로써 수행되었다. NAT로 공식화된 프로젝트에 대한 PS20 정량화를 허용하는 조건의 개발은 이 실시예에서 기재된다. 신규한 조건은 방법 2를 정확도, 정밀도, 선형성, 특이성, 반복가능성 및 강건성에 대해 평가함으로써 제형에서 NAT를 함유하는 3개의 생성물을 사용하여 평가하였다.
MAX 카트리지를 사용한 이전의 LC-ELSD 검정은 저 pI 분자에 의한 더 높은 단백질 간섭을 관찰하였다. 따라서, 저 pI 분자의 평가는 방법 1 및 방법 2 둘 모두에 대해 수행하여 어느 방법이 정확한 PS20 정량화에 더 적합한지를 계측하였다.
재료
HPLC/ELSD 시스템: 예컨대, Agilent 1200 HPLC - Varian 380 ELSD
폴리소르베이트 20: Sigma P/N: T2700-100ML
HPLC 등급 빙초산: JT Baker
강 암모니아 용액, 27-31%: 스펙트럼 화학물질
HPLC 등급 워터 허니웰(Water HoneyWell)
HPLC 등급 메탄올: OmniSolv
Waters Oasis® MAX 카트리지 2.1 x 20 mm, 30 μm 입자 크기
Waters Oasis® MCX 카트리지 2.1 x 20 mm, 30 μm 입자 크기 (표 20)
NAT-함유 생성물 (표 21)
표 20: 방법 2 전개 동안 사용된 MCX 카트리지
표 21: 생성물 정보
방법:
ELSD 광원 세기 (LED)를 75%로 설정하고, 검출기 증가치 (PMT)를 모든 실험에 대하여 1로 설정하였다. NAT-함유 제형과 혼화성인 검정을 제조하기 위한 방법에 대한 최종 변형의 요약은 하기와 같다:
Agilent 1200 HPLC (또는 등가물) 및 Varian 380 ELSD (또는 등가물)
카트리지: Waters Oasis® MCX 온라인 카트리지
이동상 A: 1.5%의 수중 수산화암모늄
이동상 B: 1.5%의 메탄올 중 수산화암모늄
유속: 1.40 ㎖/min
전환 밸브 타이밍: 4.00 min에서 ELSD의 유동
주입 용적: 25*㎕ (*생성물 의존적)
표 22: 변형된 PS20 방법 구배 (방법 2)
결과:
간섭의 계측
방법 개발의 초기 초점은 NAT가 이전 검정에서 관찰된 간섭의 원인이었는지를 계측하는 것이었다. 이 작업은 NAT가 함유되었거나 그것이 배제된 일련의 완충제를 연구함으로써 수행되었다(완충제 세부사항은 물질 섹션(표 21) 및 결과 섹션(표 23)에 제공됨).
표적 농도 (공칭 = 80mg/㎖)에서의 PS20-비함유 A16/A17 제형 완충제 (20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스, pH 5.5) 및 PS20-비함유 A16/A17을, 실시예 1의 방법 1을 사용하여 초기에 평가하였다. 각 샘플의 조성은 이하 제공된다:
PS20-비함유 제형 완충제 - 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스, pH 5.5.
PS20-비함유 A16/A17 샘플 - 20 mM 히스티딘-HCl, 1 mM NAT, 5 mM 메티오닌, 240 mM 수크로스, pH 5.5 중 80mg/㎖ (공칭).
도 11a는 이 평가의 ELSD 결과를 나타내고, 여기서 유의미한 간섭은 둘 모두의 샘플에 대해 PS20의 체류 시간(약(~) 4.5분)에 ELSD에서 관찰되었다. 물 (추적 1), PS20 유리 제형 완충제 (추적 2), 및 PS20-비함유 단백질 샘플 (추적 3) 주입이 제시된다. 추가로, 도 11b는 각 샘플에 대한 UV (280nm) 신호를 나타내고, 여기서 성분은 PS20의 근사치 체류 시간에 검출된다. PS20-비함유 제형이 주입되었을 때 관찰된 간섭의 크기가 대략 단백질 샘플과 동일했기 때문에, 공급원이 단백질 때문 만이 아닐 수 있다는 것이 명백해졌고, 이는 카트리지에 의해 보유된 완충제 중 부형제가 존재하였다는 가설을 도출할 수 있다.
본 발명자들은, n-아세틸 트립토판 (NAT)은 하기 근거로 도 11a 및 11b에 관찰된 바와 같이 간섭성이었다는 것을 계측하였다: 1) NAT-함유 제형이 방법 1과 함께 이전에 시험되지 않았으므로, 이전 평가와의 주요 차이점으로서 두드러졌다는 점; 2) NAT가 겉보기 pKa 4.1을 갖고 탈양성자화된 음이온 형태로 MAX 카트리지의 암모늄 양이온 수지에 잔류하게 할 수 있는 카복실레이트 기를 포함한다는 점; 3) NAT 흡광도 최대값은 280nm에 가깝고 (H. Edelhoch, Biochemistry, vol. 6, no. 7, July 1967), 그리고 280nm 흡광도가 NAT 제형 샘플과 함께 PS20 체류 시간 (약(~) 4.3 분)에서 관찰되었다는 점 (도 11b).
상기한 바와 같이 NAT가 PS20을 저해하는지를 확인하기 위해, NAT를 사용하거나 사용하지 않고 일련의 A16/A17 제형 완충제를 시험하였다. 도 12a 및 12b는 도 12a에 현시된 NAT를 함유하는 완충제 및 도 12b에 현시된 NAT를 함유하지 않는 것들을 사용한, 이러한 평가의 HPLC-ELSD 결과를 도시한다. 도 12a의 각각의 NAT-함유 완충제는 PS20의 체류 시간에 피크를 나타냈다. 반대로, NAT가 배제된 모든 완충제는 간섭 피크를 나타내지 않았다. 함께, 도 11a, 11b, 12a 및 12b에 도시된 데이터는 NAT가 Oasis® MAX 카트리지에 유지되었고, 간섭이 단백질 또는 다른 부형제에 의해 유발되었기보다는 PS20과 함께 공-용리되었음을 나타낸다.
표 23: 방법 1 및 방법 2로 시험된 완충제
NAT는 카복실레이트 기를 함유하고, 카트리지에서 발견된 수지에 음이온 교환을 통해 잔류할 수 있다. 본 발명자들은 대안적인 Oasis® 카트리지 (Oasis® MCX)를 사용하여 PS20에서 NAT를 잘 분리함을 탐색하였다. 암모늄 기반 양이온성 수지를 함유하는 Oasis® MAX 카트리지와는 달리, Oasis® MCX 카트리지는 음이온성 설파이트 수지를 함유한다. 초기에, MCX 카트리지는 방법 1에 사용된 동일한 이동상 (메탄올 + 아세트산)을 사용하여 평가하였다. 그러나, 이들 조건하에 단백질 간섭은 허용될 수 없는 수준 (데이터 도시되지 않음)으로 상승되는 것으로 밝혀졌다. Waters Oasis® 샘플 추출 방법은 MCX 수지의 플레이트 형식으로 고상 추출 절차에서 이동상 첨가제로서 수산화암모늄의 사용을 권장한다 (Waters, "Oasis Sample Extraction Products," 2011). 따라서, 이동상은 2% 아세트산을 1.5% 수산화암모늄으로 대체하여 제조업자에 의해 권장된 조건을 더 잘 모방하도록 변형되었다. 이들 방법의 변형으로, A16/A17 완충제의 상이한 유도체를 MCX 카트리지를 사용하여 평가하였고, 데이터는 도 13a 및 13b에 도시되어 있다).
방법 1로 수득된 결과와 달리, NAT를 사용하거나 사용하지 않고 PS20의 체류시간에 어떤 간섭도 관찰되지 않았고, 모든 부형제는 1분 전에 카트리지로부터 용리되었다 (도 13a 및 13b). 추가로, 50㎕의 PS20-비함유 A16/A17 단백질 (도 13a, 추적 4)이 주입된 경우 ELSD 중 PS20-영역에서 어떤 간섭도 관찰되지 않아 상기 방법이 PS20으로부터 단백질을 분리할 가능성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이동상 첨가제로서 수산화암모늄과 함께 MCX 카트리지는 NAT 함유 제형의 PS20 정량화를 평가하는 데 사용하기 위해 선택되었다.
방법 변형
상기한 바와 같이, NAT 함유 제형을 분석하기 위한 예비 조건이 확립되면, 하기 파라미터가 더욱 상세하게 시험되었다:
이동상 수산화암모늄 (%)
세정 단계에 사용된 B(%) (20-60%B를 시험)
세정 시간 (2.4분 및 3.4분) 및 주입 용적 (25 및 50㎕ 주입 용적)
유속 (0.8㎖/min 내지 1.6 ㎖/min)
용리 시간 (1.1분, 3.1분)
이동상 수산화암모늄 (%)
Waters Oasis® 샘플 추출 방법은 MCX 수지의 플레이트 형식으로 고상 추출 절차에서 이동상 첨가제로서 수산화암모늄의 사용을 권장한다 (Waters, "Oasis Sample Extraction Products," 2011). 실험은 ELSD (도 14a) 및 UV (도 14b) 둘 모두에 의한 검출로 수행하였다. PS20-비함유 A16/A17 단백질은 이동상 중 0.15, 0.29, 0.73 또는 1.5% 수산화암모늄(도 14a 및 14b, 각각 추적 1, 2, 3, 및 4)을 사용하여 카트리지로부터 단백질 및 NAT 용리 모두를 평가하는 데 사용된 샘플이었다. UV 검출기가 전환 밸브 전에 인라인으로 존재하기 때문에, PS20 이전에 용리되는 발색단을(예: NAT 및 단백질)을 갖는 분석물이 검출될 수 있다. NAT를 제거하는 능력을 평가하기 위해, A16/A17 PS20-비함유 제형 완충제를 또한 주입하였다(도 14a 및 14b, 추적 5).
카트리지 유출물이 전환 밸브를 전환시켜 2.4분에 ELSD에 도입된 경우, 약간 높은 기준선에 의해 입증된 바와 같이 이동상 중 0.15% 수산화암모늄 (도 14a, 추적 1)에 의한 약간의 간섭이 관찰되었고; UV 추적 또한 단백질 및/또는 NAT가 유출물이 ELSD에 들어가기 전에 카트리지로부터 대부분 용리되었음을 도시한다. 이들 잠재적인 간섭물 중 대부분은 공극 용적에서 용리되었다. 수산화암모늄 첨가제의 백분율이 증가함에 따라 (0.29에서 1.5%로), ELSD에 의해 관찰된 단백질 또는 NAT 간섭의 정도에는 최소한의 차이가 있었다(도 14a, 추적 2-4). 추가로, UV 추적은 시험된 수산화암모늄의 모든 수준에서 단백질 및 NAT를 충분히 제거한 방법을 나타낸다 (도 14b, 추적 2-4). PS20-비함유 단백질이 이동상 중 1.5% 수산화암모늄으로 주입된 경우 (도 14a, 추적 4), 보다 낮은 수산화암모늄 백분율이 주입된 동일한 단백질과 비교하여 PS20-영역에서 2.4분(4.0-5.5 분)에 유출물이 도입된 경우 단백질 간섭이 덜한 것으로 나타났다. PS20-비함유 제형 완충제 (도 14b 추적 5) UV 추적은 NAT가 이동상 중 1.5% 수산화암모늄으로 효율적으로 제거된다는 것을 도시한다. 따라서, 이 첨가제의 백분율은 상기 방법에 사용하기 위해 선택되었다.
280nm에서 흡광도(도 14b)는 이동상 중 0.15 내지 1.5% 수산화암모늄을 사용할 때 단백질 및 NAT가 충분히 제거되었고 이들 간섭물의 일부 테일링이 약(~) 2.5분에 존재한다는 것을 도시한다. 이 발견 때문에, 메탄올 + 수산화암모늄 방법은 검출기가 오염되는 것을 방지하고 ELSD에서 최소의 단백질 및 NAT 간섭을 보장하기 위해 2.4분보다 3.0분에 유동을 ELSD로 전환하도록 변경되었다. PS20의 용리가 약 4.5분이기 때문에, 이 변화는 그 피크에 영향을 주지 않아야 한다.
세정 단계에 사용된 B(%) (20-60% 시험됨)
이전에, NAT가 없는 제형에서 방법 1의 개발을 위해, PS20으로부터 단백질을 분리하는 세정 단계 동안 사용된 메탄올(%)은 단계 구배 접근법을 사용하여 최적화되었다. 방법 2개발에 사용된 메탄올(%)은 방법에 대한 몇 가지 주요 변화의 단백질 보유에 대한 미지의 영향으로 인해 재검토되었고; 고정상은 MCX 수지로 변경되고, 이동상 첨가제는 수산화암모늄으로 수정되었다. 이 실험에서, B(%) (메탄올 + 1.5% 수산화암모늄)의 10% (v/v) 증분으로 4개의 상이한 수준을 20 내지 60%의 농도 범위에서 시험하였다. ELSD 및 UV 검출 모두를 사용하여 각각 시험된 조건하에 단백질 용리를 모니터링하였다. 폴리소르베이트 비함유 A16/A17 샘플을 평가를 위해 사용하였고, ELSD 및 UV 데이터는 도 15a 및 15b, 각각에 제시되어 있다.
도 15b에서, 280nm 흡광도 크로마토그램은 PS2-의 체류 시간 (약(~) 4.5분)에 잘 정의된 피크를 나타내고, 15㎕의 PS20-비함유 A16/A17 단백질이 주입될 때 20%B 세정 (추적 1)을 갖는 카트리지에 단백질 및/또는 NAT 보유가 있음을 시사한다. 훨씬 더 큰 피크가 또한 단백질과 NAT의 혼합물일 가능성이 높은 공극 용적에서 관찰되었다. 잘 정의된 피크는 또한 동일한 조건에서 PS20 영역 (도 15a)에서 간섭으로서 ELSD에서 검출되었다. 세정 단계의 B(%)가 30%로 증가되면, UV 및 ELSD 추적 둘 모두에서 PS20 영역의 피크 감소로 입증된 바와 같이, NAT 및 단백질 청소율이 개선되었다 (추적 2). NAT 및 단백질은 40%B로 보다 효율적으로 제거되었지만, ELSD의 PS20-영역에는 여전히 약간의 간섭이 존재하였다 (도 15a). NAT 및 단백질은 50 및 60%B 세정(각각 추적 4 및 5)으로 가장 효율적으로 제거되었고, 최소한의 간섭이 존재한다. 세정 단계의 45%B가 상기 방법에 사용하기 위해 선택되었다. 방법 1의 이전의 개발 동안, 본 발명자들은 세정 조건으로서 50% 메탄올까지 시험했지만, 이들 조건하에서 PS20의 작은 부분이 조기에 용리될 것이라는 것이 관찰되었다(45% 메탄올에서 이 작은 피크는 관찰되지 않았다). 이들 피크는 소수성이 덜한 더 짧은 쇄 길이의 에스테르일 수 있으며, 50% 메탄올 조건은 대략적으로 에스테르화 종이 용리되는 지점이었음을 나타냈다. 이러한 이전의 관찰, 및 40%B가 단백질을 제거하기에 충분하다는 것을 보여주는 현재의 결과로 인해, 본 발명자들은 견고한 단백질 제거와 PS20 보유 사이의 절충안을 제거하기 위해 세정 단계에 대한 45%B 조건을 계측하였다. 게다가, 도 15b의 UV 데이터는 단백질이 50%B 세정 조건에서 약간 조기에 용리되었음을 도시한다.
세정 시간 (2.4분 및 3.4분) 및 주입 용적 (25 및 50㎕ 주입 용적)
PS20-영역의 간섭을 추가로 최소화하기 위해, 2.4분 및 3.4분 세정 단계를 평가하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, PS20-영역은 2.4 또는 3.4분 세정(각각 추적 3 및 추적 2) 사이에서 유사하다. 특이성이 약간 개선되었고, 더 긴 세정 시간에 명백한 부정적인 영향이 없었기 때문에, 3.4분 세정이 상기 방법에 사용하기 위해 선택되었다. 추가로, 유동은 2.4분 대신 4.0분에 ELSD로 전환되도록 선택되었다.
기준선에서 주입 용적의 영향은 또한 샘플 용적으로 50㎕에서 25㎕로 감소시켜 평가하였다 (도 16, 각각 추적 2 및 추적 1). 25㎕ 주입 추적의 기준선은 약간 더 깨끗하게 보이고, 이는 카트리지에서 제거되는 단백질과 부형제가 적기 때문에 예상된다. 궁극적으로, 주입 용적은 특이성과 관련하여 성능에 큰 영향을 미치지 않았다.
유속 (0.8㎖/min 내지 1.6 ㎖/min)
유속을 평가하여 단백질 및 NAT가 효율적으로 제거되었음을 보장하였다. 유속은 0.8 내지 1.6 ㎖/min으로 다양하였다. 도 17a 및 17b는 1.60, 1.40, 1.25, 1.00 및 0.80 ㎖/min 유속 (각각 추적 1, 2, 3, 4 및 5)을 사용하여 150mg/㎖에서 PS20-비함유 A18/A19 단백질의 25㎕ 샘플 주입을 도시한다.
가장 느린 유속, 0.8 ㎖/min (추적 5)에서, ELSD에서 피크에 의해 지시된 바와 같이 PS20 영역에서 용리되는 단백질 및 부형제가 여전히 존재하였다 (도 17a). 이 조건의 UV 추적 (도 17b)은 또한 더 높은 유속보다 더 늦게 용리되는 간섭물의 증가를 나타냈다. 유속이 1.00 ㎖/min (추적 4)으로 증가되면, 간섭은 감소되고, 유속이 1.25 ㎖/min (추적 3)으로 증가되면 거의 무시할 만하게 되었다. 유속이 1.40 및 1.60 ㎖/min (각각 추적 2 및 1)으로 증가되면, UV 추적은 대부분의 단백질 및 부형제가 더 느린 유속을 갖는 것보다 2.0분까지 더 완전히 카트리지에서 용리되고, 1.40 ㎖/min의 유속이 상기 방법에 사용하기 위해 선택되었음을 도시한다. 본 발명자들은 성능이 1.4㎖/min에서 거의 등가였고, 본 발명자들이 1.6㎖/min에서 더 높은 배압으로 인한 누출 위험을 최소화하고자 했기 때문에 1.6㎖/min으로 증가시키지 않았다.
용리 시간 (1.1분, 3.1분)
방법 1의 100%B에서 용리 단계는 1.1분 동안 유지시킨다. 샘플과 무관하게 물 블랭크를 포함하여 모든 주입에서 관찰된 약(~) 6.5분에서 용리되는 공지되지 않은 동일성 피크가 존재한다. 공지되지 않은 피크는 이동상 B (%)가 재평형 상태로 복귀된 후 용리되는 것으로 보인다. 피크가 PS20으로부터 잘 분리될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 용리 시간을 연장시켰다. 도 18은 약(~) 5.2분에 시작하여 이러한 공지되지 않은 피크가 시작할 때(추적 2) 대략 종결되는 PS20 피크의 통합을 설명한다. 이것은 정량화에 유의미하게 영향을 미치지 않지만, 미래에 이 피크로부터의 잠재적인 간섭을 방지하기 위해, 용리 단계를 3.1분(추적 1)의 유지 시간으로 증가시켜 PS20 영역의 보다 양호한 분리 및 통합을 가능하게 하였다. 도 19는 최종 파라미터를 이용한, 방법 2를 사용한, 물, 150mg/㎖ PS20-비함유 A18/A19, 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 및 A18/A19에 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20(각각 추적 1, 2, 3 및 4)의 결과를 설명한다.
방법 정성화 실험
특이성
특이성은 PS20-비함유 제형 완충제 및 PS20-비함유 생성물의 주입이 PS20-영역에서 간섭할 수 있는 임의의 피크에 기여하지 않는다는 것을 확인함으로써 계측되었고; 이들은 전형적으로 표적 PS20 농도의 50%인 최저 PS20 보정 표준과 비교하였다.
PS20-비함유 제형 완충제, PS20-비함유 단백질 및 수중 스파이킹된 0.1mg/㎖ PS20 (50% 표적)의 전형적인 크로마토그램은 도 20a-20f에 도시되어 있다. 3개의 상이한 PS20-비함유 생성물을 평가하였다. A18/A19 (도 20a 및 20b), A16/A17 (도 20c 및 20d), 및 A14/A20 (도 20e 및 20f)는 각각 150, 80, 및 150mg/㎖의 단백질 농도를 갖는다. 이들 생성물에 대한 추가의 상세함은 표 21에 제공된다. 가시적으로, 모든 생성물은, PS20-비함유 단백질 샘플이 주입되었을 경우 (도 20a, 20c, 및 20e, 추적 2), ELSD의 PS20-영역에서 약간의 간섭을 가졌다. 그러나, PS20-비함유 제형 완충제는 PS20-영역 (도 20a, 20c, 및 20e, 추적 1)에서 가시적인 간섭을 나타내지 않았으며, 간섭이 주로 단백질로부터 유래되었음을 나타낸다.
상기 방법의 허용 기준은 PS20 비함유 샘플의 피크 면적이 최저 표준에서 피크 면적의 10% 이하(≤)인 경우 충족된다. PS20 영역에서 가시적인 일부 단백질 간섭이 존재했기 때문에, 특이성은 방정식을 사용하여 계측되어야 한다. 특이성을 계측하는 데 사용되는 상이한 접근법이 있다. 이 연구의 경우, 하기 방정식을 사용하여 특이성의 수치적 추정치를 유도하였다:
방정식 1: 특이성
간섭율 (%) = (PS20-비함유 단백질의 면적/PS20 사양의 50%의 면적)*100
상기 방정식을 사용하여, 간섭 (%)를 3개의 생성물에 대해 산출하였다 (표 24). PS20-비함유 A16/A17 (80mg/㎖) (도 20c)은 수중 0.1mg/㎖ PS20 (50% 표적)과 비교할 때 7% 특이성을 갖는 것으로 계측되었다. PS20-비함유 A18/A19 (150mg/㎖) (도 20a)는 단지 4% 간섭을 가진 반면에, A14/A20 (150mg/㎖) (도 20e)은 수중 0.1mg/㎖ PS20 (50% 표적)과 비교할 때 13% 간섭을 가졌다.
모든 생성물에 대한 280nm에서의 UV 추적(도 20b, 20d, 및 20f)은 유동이 4.0분에 ELSD로 전환될 때까지 단백질 및 NAT가 효율적으로 제거되었음을 도시한다. A14/A20이 13%의 간섭을 가졌지만, 이 생성물에 대한 후속적 평가에서 반복가능성, 정확도 및 선형성은 허용 가능하였다.
표 24: 상기 3개 생성물의 특이성
정확도
검정의 정확도를 계측하기 위하여, 공지된 양의 PS20은 PS20-비함유 단백질로 스파이킹되고, 그리고 각 농도에 되한 회수율이 측정되었다 (표 25). 전형적인 검증 허용 기준은 회수율 (%)은 80 내지 120% 이내여야 한다.
PS20-비함유 A18/A19 (150mg/㎖) 및 PS20-비함유 A16/A17 (80mg/㎖)은 PS20을 0.1 내지 0.6mg/㎖의 범위에서 스파이킹하여 평가하였다. 정확도 데이터는 표 25에 요약된다. 시험된 PS20 농도에서, A16/A17 및 A18/A19의 회수 범위는 각각 94 내지 100% 및 78 내지 100%였다. 78% 회수율을 갖는 샘플은 PS20-비함유 A18/A19에 스파이킹된 0.4mg/㎖ PS20으로 발생하였다. 브라케팅 PS20 농도 (0.2 및 0.6mg/㎖)의 회수율은 명세서 이내여서 이 하나의 샘플에 대한 샘플 제제 또는 주입 오류를 시사한다. 0.4mg/㎖ 샘플이 배제되는 경우, A18/A19에 대한 회수 범위는 88 내지 100%이다.
PS20-비함유 A14/A20 (150mg/㎖)의 정확도는 PS20을 0.1 내지 0.3mg/㎖의 범위에서 스파이킹하여 평가하였다. A14/A20에 대한 PS20 회수율은 92 내지 109% 범위였다. 전반적으로, 시험된 3개의 생성물 모두에 대한 스파이킹된 회수 실험 데이터는 상기 방법이 정확하다는 것을 입증한다. 추가로, 이들 결과는 2.5㎍ (0.1㎍/㎕ * 25㎕) 내지 15㎍ (0.6㎍/㎕ * 25㎕)의 PS20이 카트리지에 부하되어 정확하게 정량화될 수 있음을 입증한다.
표 25: 정확도
선형성
선형성은 상기 3개 생성물에 대하여 시험된 범위 상에서 0.99 이상(≥)인 피어슨(Pearson) 상관관계 계수 (r)를 계측함에 의하여 평가되었다. 이들 값은 각 생성물에 대한 PS20 농도의 각 범위에 대해 표 26에 도시된다. 피어슨 상관 계수의 모든 값은 시험된 PS20 범위에 대해 0.99 초과였다. 따라서, 선형성은 상기 시험된 3개 생성물에 대한 이러한 검정에서 허용가능하였다.
표 26: 선형성: 피어슨 상관관계 계수
반복가능성
반복가능성은 A18/A19 샘플 (공칭 0.2mg/㎖ PS20)의 6개 중복체 주입 및 A16/A17 샘플 (공칭 0.2mg/㎖ PS20)의 6개 중복체 주입을 사용하고 PS20 피크 면적의 RSD (%)를 측정하여 평가하였다. 이 평가의 결과는 표 27에 표시되어 있고, 검정의 정밀도는 두 생성물에 대해 허용 가능했음을 도시한다.
표 27: A18/A19 및 A16/A17의 반복가능성
반복가능성은 또한 5개 농도의 3개 복제물을 시험하고 PS20 피크 면적의 RSD (%)를 측정함으로써 평가하였다. 이 실험은 PS20-비함유 A14/A20에 스파이킹된 0.10 내지 0.30mg/㎖ PS20으로 수행되었다. 이 평가의 결과는 표 28에 표시되어 있고, 검정의 정밀도는 A14/A20에 대해 허용가능함을 도시한다.
표 28: A14/A20의 반복가능성
방법 확고성 실험
카트리지 대 카트리지
실시예 1의 방법 1로 수행된 이전의 작업은 카트리지의 흡착제 뱃치가 동일하더라도, 카트리지는 단백질 청소율 및 특이성과 관련하여 상이한 거동을 나타낼 수 있다. 3개의 MCX 카트리지를 평가하여 카트리지 대 카트리지 가변성을 계측하였다. 이들 중, MCX 카트리지 2 및 4는 동일한 흡착제 뱃치 (0093)를 갖는 반면, 6은 상이하였다(0103) (표 20).
3개 모두의 MCX 카트리지가 수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20 및 PS20-함유 생성물로 평가되었다. 도 21 및 22는 이들 평가의 크로마토그램을 도시하고, 표 29는 결과의 요약을 나타낸다. 도 21의 추적 3 및 4, 및 도 22의 추적 3은 3개의 카트리지에 대해 주입된 물 샘플 중 0.2mg/㎖ PS20에 대한 피크 높이 및 폭의 차이를 설명한다. 가장 현저히, 피크 높이 및 면적은 카트리지마다 다양하고, 가장 큰 차이는 카트리지 2(도 21, 추적 1 및 3)와 카트리지 6(도 21, 추적 2 및 4) 사이에서 관찰되었다. 카트리지 2를 갖는 피크의 면적은 시험된 두 샘플 유형(즉, 수중 PS20 및 A18/A19 중 PS20)에서 카트리지 6을 갖는 피크 면적의 약 60%였다. 피크 면적의 차이가 샘플 유형(예: 단백질을 포함하거나 포함하지 않음)과 독립적으로 관찰되는 것을 감안할 때, 가변성은 단백질 간섭에 의해 유발될 것 같지 않다. 면적 계수가 시험된 2개의 카트리지 사이에서 매우 상이했지만, 카트리지 4와 6 사이의 차이는 더 작았고, 카트리지 4의 면적은 카트리지 6의 약 85%였다. 카트리지 2 및 4가 모두 동일한 수지 뱃치를 공유하고 또한 상이한 피크 면적을 산출하기 때문에, 카트리지 사이의 PS20 피크 면적의 가변성은 수지 뱃치에만 전적으로 의존하는 것으로 나타나지 않는다.
이 가변성은 이상적이지는 않지만, 산출된 PS20 양을 수득하기 위해 표준을 구현한 후에 동일한 칼럼에서 분석된 보정 곡선으로부터 계측된 PS20의 농도는 모든 카트리지에 대한 이론적 농도와 비교하여 정확하였다. 이들 데이터에 기초하여, ELSD 검출기의 선형 범위 내에서 반응을 잘 제공하는 PS20의 주입량을 사용하는 것이 중요할 것이다. 예를 들어, 전체 스케일 (예: 800 mV)의 80%의 최대 검출기 반응이 일반적으로 HPLC-ELSD 방법에 권장되었지만, 카트리지마다 관찰된 가변성을 감안하면, 검출기가 특정 카트리지를 위해 포화되지 않는다는 추가의 확언을 제공하기 위해 MCX 방법에 대한 이 표적 반응을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 전반적으로, 카트리지 대 카트리지 가변성은 시험된 샘플 및 카트리지에 대해 이 방법에 대해 보고된 PS20 양과 관련하여 최소였다.
표 29: 카트리지 대 카트리지 가변성
A18/A19 샘플의 100X 주입
상기한 실험이 OASIS® MCX 카트리지가 견고하고 정확하게 PS20을 정량화할 수 있음을 입증하지만, 본 발명자들은 단백질 함유 샘플을 사용하여 긴 서열을 실행함으로써 카트리지 내구성을 시험하고자 하였다. 이 방법이 처음으로 개발한 생성물 중 하나는 150mg/㎖의 매우 높은 표적 단백질 농도를 갖고, 카트리지 상의 단백질 축적으로 인해 카트리지 고장/과압을 유발할 수 있다. 전형적으로, 상기 방법을 실행할 때 압력은 약(~) 25 내지 45 bar였다. 압력이 이 범위 이상으로 증가하면, 카트리지는 단백질 및/또는 부형제가 축적될 가능성이 있고, 밀접하게 모니터링하거나 카트리지를 교체해야 한다. 카트리지가 누출되기 시작하면, 그것은 폐기하고 즉시 교체해야 한다.
카트리지 반복가능성 및 단백질 및 NAT를 일관되게 제거하는 능력은 신규한 카트리지를 사용하여 단백질 (150mg/㎖)을 100회 주입하여(서열은 표 30 참조) 평가하였다. 대조군 (n=11)은 10번째 단백질 주입마다 괄호로 묶었고, 서열이 유효한지를 보장하기 위해 분석하였다. 도 23은 대조군의 오버레이를 도시한다. 기준선의 초기(4.0-5.0분 및 8.5분 후) 및 기준선의 백-엔드에서 증가되었지만(최대 5mV), 이들 변화는 통합 또는 최종 PS20 정량화 (표 31)에 영향을 미치지 않았고, 평균 PS20 양은 0.2±0.005 (2.8% RSD)mg/㎖로 산출되었다.
표 30: 시퀀스 (모두 25㎕ 주입)
표 31: 100X 단백질 시퀀스에 사용된 대조군의 정량화
대조군이 실행 전반에 걸쳐 정성적 및 정량적으로 일관적이었기 때문에, 공칭 0.2mg/㎖ PS20을 갖는 100개의 A18/A19 샘플 (150mg/㎖)을 통합하고(도 24), 정량화하였다(도 26b, 표 32). 도 24는 PS20 영역 전, 4.0-5.0분 및 8.5분 후에 증가하는 기준선 (약(~) 5mV)과 함께 대조군과 동일한 경향을 설명한다. 카트리지의 평형에 의한 것일 수 있는 처음 20회의 주입에 대해 산출된 면적 및 양에 대해 약간 하향 경향이 존재했지만, 면적 대 주입 횟수 및 양 대 주입 횟수를 도식화하면 단백질의 정량화는 최소 편차를 보였다 (도 26a 및 26b). 궁극적으로, A18/A19 샘플의 100회 주입에 대해 정량화된 PS20의 평균 면적 및 양은 각각 18.3±0.76 (4.2%RSD) mV*분 및 0.2±0.005 (2.6% RSD)mg/㎖이었다(표 32). 375mg의 단백질이 1/100 주입로 카트리지 상에 부하되었음을 주시한다. 상기 방법은 UV 추적 (도 25b)에 묘사된 바와 같이 시퀀스 전반에 걸쳐 유출물이 4.0분 (도 25a)에 ELSD에 들어가기 전에 충분히 단백질 및 부형제를 일관되게 제거하였다.
하향 경향 때문에, 공칭 0.2mg/㎖ PS20을 갖는 A18/A19 제형 완충제의 100회 주입을 신규한 MCX 카트리지 (카트리지 5)로 평가하여 이 효과가 단백질 또는 제형 또는 둘 모두에 기인하는지를 계측하였다. 흥미롭게도, 처음 49회 주입(도 27a)에 대한 면적 계수[n=100, 평균 31.3±1.3 (4.1%RSD) mv*분]에서 유사한 하향 경향이 존재하였다. 이 거동은 정량화에 큰 영향을 미치지 않았다[n=100, 평균 0.22±0.005 (2.1%RSD)] (도 27b 및 표 32).
수중 스파이킹된 0.2mg/㎖ PS20이 또한 브랜드 신규한 카트리지 (카트리지 3)에서 평가된 경우, 이러한 하향 경향은 없었다. 이 샘플의 경우, 면적 계수 [n=100, 평균 20.7±0.3 (1.5%RSD) mv*분] (도 28a)는 정량화 [n=100, 평균 0.20±0.002 (0.9%RSD)] (도 28b, 표 32)와 함께 일관되게 유지되었다. 물 + PS20 샘플로부터의 이러한 결과는 이전에 관찰된 하향 경향 (도 26a 및 27a)이 제형 중 다른 부형제 또는 단백질의 존재와 관련되어 있음을 나타낼 수 있다. 또 다른 가능성은 그것이 사용된 특정 카트리지와 관련된 효과였고, 다른 제형 성분에 의존하지 않는다는 것이다.
표 32: 수중 스파이킹된 PS20, A18/A19 제형 완충제, A18/A19 샘플의 100X 주입의 정량화
전반적으로, 3개의 카트리지는 100회의 PS20 주입 후에 각각 효율적으로 수행할 수 있었으며, MCX 카트리지의 재생성 및 견고성이 QC 환경에서 일상적인 사용에 적합함을 설명한다. 더욱 중요하게는, 100개 단백질 주입의 흡광도 프로파일은 서열 전반에 결쳐 단백질 및 NAT 둘 모두의 유사한 청소율을 명확하게 도시한다(도 25b). PS20 정량화는 서열 전반에 걸쳐 통계적으로 일정하게 유지되었다.
3개 저 pI 생성물의 PS20 정량화 평가
3개의 상이한 저 pI 생성물, A21, A14/A15 및 A14 (표 33)를, 방법 1 (실시예 1에서 기술됨) 및 방법 2로 평가하였다. 이 평가에 사용된 카트리지는 표 34에 열거된다. 시험된 방법 성능 특성은 특이성, 정확도, 선형성 및 반복가능성이었다.
표 33. 평가된 분자
* 브라케팅 (보정 곡선) 접근 방법에 의하여 계측된 pI
** icIEF 대조군 시스템 검정에 의하여 계측된 pI
표 34. 방법 전개 동안 사용된 카트리지
특이성
3개의 분자에 대해 산출된 특이성은 표 35에 나타낸다. 상응하는 크로마토그램은 도 29a-29f에 제시된다. A21 (150mg/㎖)은, 수중 0.1mg/㎖ PS20 (50% 표적)과 비교하여, 방법 1 (메탄올 및 아세트산에 의한 Oasis® MAX)로 평가 시 16% 간섭 및 방법 2 (메탄올 및 수산화암모늄에 의한 Oasis® MCX)로 평가 시 7% 간섭을 갖는다. 이것은 단백질 간섭을 최소화하는 양이온 교환 수지(설파이트 음이온 그룹)와 저 pI 생성물의 약한 상호작용에 기인할 수 있다. A14/A15 (192mg/㎖)는 수중 0.15mg/㎖ PS20 (50% 표적)과 비교하여 방법 1로 평가될 때 3% 간섭을 갖고, 방법 2로 평가될 때 2% 간섭을 가졌다. A14 (161mg/㎖)는 수중 0.15mg/㎖ PS20 (50% 표적)과 비교하여 두 방법으로 평가될 때 약 1% 간섭을 가졌다. 이들 생성물의 특이성은 상기 방법에 의해 유의미하게 영향을 받지 않았다.
표 35. 3개의 저 pI 분자의 특이성
정확도
검정의 정확도를 계측하기 위하여, 공지된 양의 PS20은 PS20-비함유 단백질로 스파이킹되고, 그리고 각 농도에 되한 회수율이 측정되었다 (표 36). 전형적인 검증 허용 기준은 회수율%이 80 내지 120% 이내여야 한다.
PS20-비함유 A21은 PS20을 0.10 내지 0.30mg/㎖의 범위에서 스파이킹하여 평가하였다. 정확도 데이터는 표 36에 요약된다. 시험된 PS20 농도에서, 샘플이 방법 1 및 방법 2를 사용하여 분석된 경우, 회수범위는 각각 99 내지 108% 및 101 내지 110%였다. PS20-비함유 A14/A15 및 A14의 정확도는 PS20을 0.15 내지 0.45mg/㎖ 범위에서 스파이킹하여 평가하였다. A14/A15의 PS20 회수율은, 샘플이 방법 1 및 방법 2를 사용하여 분석된 경우, 각각 97 내지 101% 및 92 내지 99% 범위였다. A14의 PS20 회수율은, 샘플이 방법 1 및 방법 2를 사용하여 분석된 경우, 각각 102-108% 및 102-110% 범위였다. 전반적으로, 시험된 3개의 생성물 모두에 대한 스파이킹된 회수 실험 데이터는 상기 방법 둘 모두가 정확하다는 것을 입증하였다.
표 36. 3개의 저 pI 생성물의 회수율
3중복, 20㎕ 주입
선형성
선형성은, 방법 1 및 방법 2로 평가된 상기 3개 저 pI 생성물에 대하여 시험된 범위 상에서 0.99 이상(≥)인 피어슨(Pearson) 상관관계 계수 (r)를 계측함에 의하여 평가되었다. 이들 값은 각 생성물에 대한 PS20 농도의 각 범위에 대해 표 37에 도시된다. 피어슨 상관 계수의 모든 값은 시험된 PS20 범위에 대해 0.99 초과였다. 따라서, 선형성은 시험된 3개의 생성물에 대해 방법 1 및 방법 2에 대해 허용 가능하였다.
표 37. 3개의 저 pI 생성물의 선형성
반복가능성
반복가능성은 5개 농도의 3개 복제물을 시험하고 PS20 피크 면적의 %RSD를 측정함으로써 평가하였다. 이러한 실험을 PS20-비함유 A21에 스파이킹된 0.10-0.30mg/㎖ PS20 및 PS20-비함유 A14/A15 및 A14에 스파이킹된 0.15-0.45mg/㎖ PS20으로 수행하였다. 이 평가의 결과는 표 38에 표시되어 있고, 검정의 정밀도는 시험된 3개의 생성물 상에서의 방법 1 및 방법 2 둘 모두에 대하여 허용가능하였음을 도시한다.
표 38. 3개의 저 pI 생성물의 반복가능성
3중복, 20㎕ 주입
결론:
실시예 1의 방법 1로부터 하기 변형이 현재 ELSD 검정, 방법 2에 대해 이루어졌다:
이동상 첨가제는 2% 아세트산으로부터 1.5% 수산화암모늄으로 전환됨
1.25 ㎖/min에서 1.40 ㎖/min으로 변형된 유속
폐기물에서 ELSD로 가는 LC 유동은 2.4분에서 4.0분으로 변경됨
세정 단계에서 B%의 농도는 40%에서 45% 이동상 B로 전환됨
세정 단계에서의 유기상(organic) 시간은 1.0 내지 3.4분에서 1.0 내지 4.4분으로 전환됨
용리 단계의 시간은 3.5 내지 4.6분에서 4.5 내지 7.6분으로 변경됨
평형 단계의 시간은 4.7 내지 6.6분에서 7.7 내지 9.6분으로 변경됨
이들 변형은 NAT 및 단백질 간섭 둘 모두를 제거하였고, 최소의 카트리지 대 카트리지 정량화 가변성을 가졌다. 3개의 NAT 함유 생성물에 대한 이러한 변형된 검정의 정성화 결과는 상기 검정이 이들 제형에서 폴리소르베이트 20을 정량화하는 데 적합함을 도시하였다.
3개의 저 pI 분자를 방법 1 및 방법 2 둘 모두로 평가하였다. 허용 기준을 충족시키지 못하는 유일한 예는 A21과 함께 방법 1을 사용할 경우의 특이성에 대한 것이었다. 이 외에도, 두 방법은 3개의 저 pI 생성물 모두에 대해 정확도, 선형성 및 반복가능성 기준을 통과하였다. 이들 결과는 방법 2가 또한 PS20을 정량화할 수 있고, 비-NAT 함유 생성물에 특히 유용하다는 것을 추가로 나타낸다.
Claims (65)
- 비이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 상기 비이온성 계면활성제를 정량화하는 방법이며,
하기 단계를 포함하는 방법:
a) 상기 조성물을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계이며,
상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중 상기 크로마토그래피 물질에 부하(load)되며,
이동상 A는 수중 산(acid in water)을 포함하고, 이동상 B는 메탄올 중 산을 포함하며,
상기 폴리펩타이드는 상기 크로마토그래피 물질에 특이적 및 비-특이적으로 결합하는 것인 단계,
b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액을 사용하여, 상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 용리시키는 단계이며,
이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 단계 a)와 비교하여 증가되는 것인 단계,
c) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액을 사용하여, 상기 크로마토그래피 물질로부터 상기 비-이온성 계면활성제 및 상기 비-특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 용리시키는 단계이며,
이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 단계 b)와 비교하여 증가되는 것인 단계,
d) 상기 비이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. - 청구항 1에 있어서, 다음 중 하나 이상을 만족하는 방법:
단계 a)에서 상기 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 10:90이다;
단계 b)에서 상기 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 40:60으로 증가된다; 및
단계 c)에서 상기 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 100:0로 증가된다. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
이동상 A가 수중 1.5% 내지 2%의 산(v/v)을 포함하고/하거나,
이동상 B가 메탄올 중 1.5% 내지 2%의 산(v/v)을 포함하는 것인
방법. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 산이 포름산 또는 아세트산인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 다음 중 하나 이상을 만족하는 방법:
상기 크로마토그래피의 유속이 1.25 ㎖/min이다;
단계 b)가 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 1분 후 개시되고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 3.4분 후에 종결된다; 및
단계 c)가 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 3.5분 후 개시되고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 4.6분 후에 종결된다. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제가 폴록사머 (P188) 또는 폴리소르베이트이거나,
상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이거나, 또는
상기 조성물 중 비이온성 계면활성제의 농도는 0.001% 내지 1.0% (w/v)의 범위인
방법. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 역상의 강 음이온 교환 중합체를 포함하거나, 또는
상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 4급 아민 모이어티를 포함하는 것인
방법. - 비이온성 계면활성제 및 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중 상기 비이온성 계면활성제를 정량화하는 방법이며,
하기 단계를 포함하는 방법:
a) 상기 조성물을 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계이며,
상기 조성물이 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액 중 상기 크로마토그래피 물질에 부하되고,
이동상 A가 수중 수산화암모늄을 포함하고, 이동상 B가 유기 용매 중 수산화암모늄을 포함하는 것인 단계,
b) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액을 사용하여, 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 용리시키는 단계이며,
이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 단계 a)와 비교하여 증가되는 것인 단계,
c) 이동상 A 및 이동상 B를 포함하는 용액을 사용하여, 상기 크로마토그래피 물질로부터 상기 비-이온성 계면활성제를 용리시키는 단계이며,
이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 단계 b)와 비교하여 증가되는 것인 단계,
d) 비이온성 계면활성제를 정량화하는 단계. - 청구항 8에 있어서, 상기 이동상 B의 유기 용매가 메탄올인 방법.
- 청구항 8 또는 9에 있어서, 다음 중 하나 이상을 만족하는 방법:
단계 a)에서 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 10:90이다;
단계 b)에서 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 45:55로 증가된다; 및
단계 c)에서 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 100:0로 증가된다. - 청구항 8 또는 9에 있어서,
이동상 A가 수중 1.5% 내지 2%의 수산화암모늄(w/v)을 포함하고/하거나,
이동상 B가 메탄올 중 1.5% 내지 2%의 수산화암모늄(w/v)을 포함하는 것인
방법. - 청구항 8 또는 9에 있어서, 다음 중 하나 이상을 만족하는 방법:
상기 크로마토그래피의 유속이 1.4 ㎖/min이다;
단계 b)가 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 1분 후 개시되고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 4.4분 후에 종결된다; 및
단계 c)가 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 4.5분 후 개시되고 상기 크로마토그래피가 개시된 시점으로부터 7.6분 후에 종결된다. - 청구항 8 또는 9에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트이거나,
상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이거나, 또는
상기 조성물 중 비이온성 계면활성제의 농도가 0.001% 내지 1.0% (w/v) 범위인
방법. - 청구항 8에 있어서,
이동상 A가, 수중 또는 43% 메탄올 중 1.5% 내지 2%의 수산화암모늄(w/v)을 포함하거나,
상기 이동상 B의 유기 용매가 아세토니트릴이거나, 또는
이동상 B가 아세토니트릴 중 1.5% 내지 2%의 수산화암모늄(w/v)을 포함하는 것인
방법. - 청구항 14에 있어서, 다음 중 하나 이상을 만족하는 방법:
단계 a)에서 상기 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 10:90이다;
단계 b)에서 상기 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 40:60으로 증가된다; 및
단계 c)에서 상기 이동상 B 대 이동상 A의 부피 비율이 100:0로 증가된다. - 청구항 14 또는 15에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제가 폴록사머이거나,
상기 비이온성 계면활성제가 폴록사머 P188이거나, 또는
상기 조성물 중 비이온성 계면활성제의 농도가 0.001% 내지 1.0% (w/v) 범위인
방법. - 청구항 8, 9, 14 및 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 N-아세틸 트립토판 및/또는 메티오닌을 추가로 포함하거나; 또는
상기 조성물이 N-아세틸 트립토판을 추가로 포함하고, 조성물 중 N-아세틸 트립토판의 농도가 0.1 mM 내지 10 mM 범위이거나; 또는
상기 조성물이 메티오닌을 추가로 포함하고, 조성물 중 메티오닌의 농도가 0.1 mM 내지 100 mM 범위인
방법. - 청구항 1, 2, 8, 9, 14, 및 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중 폴리펩타이드 농도가 1mg/㎖ 내지 250mg/㎖이고/이거나,
상기 조성물이 4.5 내지 7.5의 pH를 갖는 것인
방법. - 청구항 1, 2, 8, 9, 14, 및 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 안정화제, 완충제, 및 등장화제(tonicity agent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하고/하거나,
상기 조성물이 피험체에게 투여하기 위한 약제학적 제형인
방법. - 청구항 1, 2, 8, 9, 14, 및 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 융합 단백질, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 다중특이적 항체, 당조작된 항체, 항체 단편 또는 항체 약물 콘주게이트인 방법.
- 청구항 8, 9, 14 및 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 역상의 강 양이온 교환 중합체를 포함하고/하거나,
상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 설폰산 모이어티를 포함하는 것인
방법. - 청구항 1, 2, 8, 9, 14, 및 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질 또는 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 고형 지지체를 포함하거나; 또는
상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질 또는 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 칼럼 내에 함유되는 것인
방법. - 청구항 1, 2, 8, 9, 14, 및 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 물질 또는 상기 혼합 방식 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 물질인
방법. - 청구항 1, 2, 8, 9, 14, 및 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 증발 광 산란 (Evaporative Light Scattering, ELSD), 또는 하전된 에어로졸 검출기 (Charged Aerosol Detector, CAD)를 사용하여 정량화되는 것인 방법.
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