CN115598231A - 定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中非离子表面活性剂的层析方法 - Google Patents

定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中非离子表面活性剂的层析方法 Download PDF

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CN115598231A CN202210633310.1A CN202210633310A CN115598231A CN 115598231 A CN115598231 A CN 115598231A CN 202210633310 A CN202210633310 A CN 202210633310A CN 115598231 A CN115598231 A CN 115598231A
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Abstract

本发明涉及定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中非离子表面活性剂的层析方法。具体而言，本发明提供了用于定量包含多肽和非离子表面活性剂的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中定量表现出非离子表面活性剂与所述多肽之间的降低的干扰。还提供了方法，其中组合物还包含N‑乙酰色氨酸，并且定量表现出非离子表面活性剂、所述多肽和N‑乙酰色氨酸之间降低的干扰。

Description

定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中非离子表面活 性剂的层析方法
本申请为2017年8月14日提交的发明名称为“定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中非离子表面活性剂的层析方法”的PCT申请 PCT/US2017/046725的分案申请，该PCT申请进入中国国家阶段日期为2019 年3月20日，申请号为201780057815.5。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月15日提交的美国临时专利申请号62/375,373 的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明提供了用于分析多肽制剂中聚山梨醇酯的存在的方法。
背景技术
聚山梨醇酯20(PS20)是通常用于多肽制剂中以保护产品在加工和储存期间免受物理损害的表面活性剂(Kerwin,B.,2007,J.Pharm.Sci., 97(8):2924-2935)。由于其对产品稳定性的重要性，PS20必须在每个产品的控制***中进行精确定量。PS20可以通过分光光度测定法，荧光胶束测定法或高效液相层析-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定法来定量(参见例如Kim,J.and Qiu,J.,Analytica chimica acta 806:144-151, 2014；Hewittet al.,Journal of Chromatography A,1215(1):156-160, 2008)。
蒸发光散射检测器(ELSD)测定法优选作为对照***测定，因为相对于荧光胶束测定，它不需要长的调节时间。ELSD方法还可以避免需要使用与生产中使用的标准曲线制备相同的聚山梨醇酯批。另外，荧光胶束测定易受非特异性蛋白质干扰，特别是对于疏水性蛋白质和抗体药物缀合物 (ADC)。ADC的vcMMAE接头-药物为蛋白质引入了额外的疏水性，当定量 PS20时可能导致蛋白质干扰增加。在某些情况下，通过使用HPLC-ELSD测定可以减轻这种非特异性蛋白质干扰。
尽管HPLC-ELSD测定可以降低蛋白质干扰的程度，但是这种干扰并未完全消除。蛋白质干扰问题在低聚山梨醇酯浓度和更疏水和/或浓缩蛋白质时变得特别成问题。另外，蛋白质干扰的影响很大程度上取决于所用的柱体树脂批。缓解这些问题的策略包括:a)掺加PS20以稀释蛋白质干扰而不降低PS20反应，和b)通过蛋白质沉淀从样品中除去蛋白质。
掺加方法需要用PS20储备溶液以制剂目标浓度稀释样品。该样品制备稀释了蛋白质浓度，同时保持PS20浓度大致不变。然后在数据分析期间减去掺加入样品中的PS20的量。因为ELSD响应与检测器中分析的质量之间的关系遵循幂律，PS20中的掺加不成比例地降低了蛋白质对ELSD信号的贡献。在一些情况下，掺加方法已被证明可以提高PS20定量的准确性，但在这不是一个可行的解决方案的情况下，必须使用蛋白质沉淀。虽然它有效去除蛋白质干扰，但由于过夜样品制备时间，大样品体积和样品制备的可变性，HPLC-ELSD沉淀方法并不理想。相比之下，蛋白质的去除使用相同的HPLC-ELSD条件，但没有重要的样品制备程序。所需要的是更稳健的解决方案，以消除蛋白质干扰并在所有层析条件下产生一致的PS20定量。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入。
发明内容
在一些方面，本发明提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中在定量期间非离子表面活性剂和多肽之间的干扰减少，其中所述方法包括以下步骤:a)将组合物施加到混合模式阴离子交换层析材料上，其中将组合物加样到包含流动相A和流动相B的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液,流动相B 包含酸的甲醇溶液，其中所述多肽特异性且非特异性地与层析材料结合；b) 用包含流动相A和流动相B的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱特异性结合的多肽，其中与步骤a)相比，流动相B与流动相A的比例增加；c)用包含流动相A和流动相B的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂和非特异性结合的多肽，其中与步骤c)相比，流动相B与流动相A 的比例增加；d)定量非离子表面活性剂，其中减少了定量期间非离子表面活性剂和多肽之间的干扰。在一些实施方案中，步骤a)中流动相B与流动相A的比例为约10:90。在一些实施方案中，在步骤b)中，流动相B 与流动相A的比例增加至约40:60。在一些实施方案中，在步骤c)中，流动相B与流动相A的比例增加至约100:0。在一些实施方案中，流动相A 包含约2％的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约2％酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。
在一些实施方案中，层析的流速为约1.25mL/分钟。在一些实施方案中，步骤b)在层析开始后约1分钟开始，并在层析开始后约3.4分钟结束。
在一些实施方案中，步骤c)在层析开始后约3.5分钟开始，并在层析开始后约4.6分钟结束。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆 (P188)或聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20 或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂的浓度为约0.001％至1.0％(w/v)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，制剂具有约4.5至约 7.5的pH。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体(glycoengineered antibody)，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000041
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD) 来定量非离子去污剂。
在一些方面，本发明提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物应用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含流动相A和流动相B的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵在有机溶剂中的溶液；b)用包含流动相A和流动相B的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中与步骤 a)相比，流动相B与流动相A的比例增加；c)用包含流动相A和流动相B 的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中与步骤c)相比，流动相B与流动相A的比例增加；d)定量非离子表面活性剂。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，步骤a)中流动相B 与流动相A的比例为约10:90。在一些实施方案中，在步骤b)中，流动相 B与流动相A的比例增加至约45:55。在一些实施方案中，在步骤c)中，流动相B与流动相A的比例增加至约100:0。在一些实施方案中，流动相A 包含约2％的氢氧化铵水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约2％的氢氧化铵甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约1.4mL/分钟。在一些实施方案中，步骤b)在层析开始后约1分钟开始，并在层析开始后约4.4分钟结束。在一些实施方案中，步骤c)在层析开始后约4.5分钟开始，并在层析开始后约7.6分钟结束。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20 或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度为约0.001％至1.0％(w/v)。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，步骤a)中流动相B与流动相A的比例为约10:90。在一些实施方案中，步骤b)将流动相B与流动相A的比例增加至约40:60。在一些实施方案中，步骤c)中流动相B与流动相A的比例增加至100:0。在一些实施方案中，流动相A包含约2％的氢氧化铵水溶液或43％甲醇溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约2％的氢氧化铵的乙腈溶液。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中泊洛沙姆的浓度为约0.001％至1.0％(w/v)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，制剂具有约4.5至约7.5 的pH。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物 THIOMABTM，THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000051
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射 (ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
附图说明
图1是使用增加5％甲醇的多步梯度的不含PS20的ADC和0.6mg/ml PS20标准品的叠加。洗脱溶剂含有2％甲酸。
图2显示了在不同柱体上的甲醇多步梯度实验和异丙醇分步梯度实验(均含有2％甲酸)的比较。对于每个叠加，有第一个柱体上不含PS20 的A1 ADC(迹线1)，第二个柱体上的不含PS20的A1 ADC(迹线2)和 PS20标准品(迹线3)。
图3显示了实验方法优化设计的结果。实线显示根据JMP10软件拟合数据的统计模型的方向性。限定每条实线的虚线表示与拟合相关的误差。线的斜率表示每个因素对PS20峰面积和PS20峰宽的影响。
图4显示了使用40％MeOH洗涤和50％MeOH洗涤，来自DoE方法优化的PS20方法层析图的比较。对于这些实验，流速为1.25mL/min，加样12μg PS20，洗涤持续时间为3分钟。
图5显示在流动相中使用0.2％三氟乙酸的不含PS20的10mg/ml A10 ADC和0.6mg/ml PS20标准品。
图6显示在流动相中使用2％甲酸的不含PS20的20mg/ml A1 ADC和 0.6mg/mlPS20标准品。
图7显示在流动相中使用2％乙酸的不含PS20的20mg/ml A1 ADC和 0.7mg/mlPS20标准品。
图8显示了使用以下样品的含有甲酸和乙酸的流动相之间的比较:水 (迹线1)，不含PS20的A1 ADC，20mg/mL(迹线2)和掺入A1 ADC，20mg/mL 的0.2mg/mL PS20(迹线3)。
图9显示了使用甲醇/乙酸洗脱在不同
Figure BDA0003679872070000061
MAX柱体上运行的PS20 标准品的各种图谱。典型的图谱(迹线1)，具有拖尾的峰(迹线2)，显示***的峰(迹线3)和具有轻微拖尾的峰(迹线4)。这种图谱的可变性不影响标准品，对照或蛋白质样品的定量。
图10显示MeOH/乙酸方法。典型的20μL注射水(迹线1)，不含PS20 的A1 ADC制剂缓冲液(迹线2)，不含PS20的A1 ADC(迹线3)和0.1mg/mL 的最低PS20标准品(迹线4)。
图11A和11B显示使用实施例1的方法1评估不含PS20的A16/A17。图11A显示ELSD，图11B显示UV(280nm)。使用实施例1的方法1评估水(迹线1)，不含PS20的A16/A17制剂缓冲液(迹线2)和不含PS20 的A16/A17蛋白质(迹线3)。
图12A和12B显示使用实施例1的方法的不同A16/A17缓冲液组分的 ELSD层析图。图12A显示具有NAT的缓冲液:20mM组氨酸-HCl，1mM NAT， 5mM甲硫氨酸，240mM蔗糖(迹线1)；20mM组氨酸-HCl，1mM NAT，240mM 蔗糖(迹线2)；20mM组氨酸-HCl，5mM NAT(迹线3)。图12B显示不含 NAT的缓冲液:20mM组氨酸-HCl，5mM甲硫氨酸，240mM蔗糖(迹线1)；20mM 组氨酸-HCl，25mM甲硫氨酸(迹线2)；20mM组氨酸-HCl(迹线3)。50μL 缓冲液注射。
图13A和13B显示了使用改进方法(MCX柱体和流动相中的氢氧化铵) 的不同缓冲液组分的ELSD层析图。图13A显示具有NAT的缓冲液:20mM组氨酸-HCl，1mM NAT，5mM甲硫氨酸，240mM蔗糖(迹线1)；20mM组氨酸-HCl， 1mM NAT，240mM蔗糖(迹线2)；20mM组氨酸-HCl，5mM NAT(迹线3)；和具有NAT的不含PS20的蛋白质(迹线4)。图13B显示不含NAT的缓冲液:20mM组氨酸-HCl，5mM甲硫氨酸，240mM蔗糖(迹线1)；20mM组氨酸 -HCl，25mM甲硫氨酸(迹线2)；20mM组氨酸-HCl(迹线3)。50μL注射。
图14A和14B显示在流动相中使用0.15-1.50％的氢氧化铵添加剂评估不含PS20的A16/A17蛋白质。图14A显示ELSD层析图。图14B显示UV (280nm)层析图。在流动相中具有0.15、0.29、0.73和1.5％氢氧化铵的50μL注射不含PS20的A16/A17蛋白(分别为迹线1,2,3和4)，以及具有1.5％氢氧化铵的不含PS20的A16/A17制剂缓冲液(迹线5)。
图15A和15B显示20-60％流动相B洗涤步骤的评估。图15A显示ELSD 层析图。图15B显示UV(280nm)层析图。15μL注射不含PS20的A16/A17 蛋白。20,30,40,50和60％流动相B(洗涤步骤)，分别显示为迹线1,2,3,4 和5。
图16显示通过ELSD层析评估不含PS20的A16/A17蛋白的洗涤时间和注射体积。25μL不含PS20的A16/A17样品注射:3.4分钟洗涤步骤(迹线 1)。50μL不含PS20的A16/A17样品注射:3.4分钟洗涤步骤(迹线2) 和2.4分钟洗涤步骤(迹线3)。
图17A和17B显示了对不含PS20的A18/A19的不同流速的评估。图 17A显示ELSD层析图。图17B显示UV(280nm)层析图。25μL注射不含 PS20的A18/A19(150mg/mL)，具有不同的流速:1.6,1.4,1.25,1.0和0.8 mL/min，分别对应于迹线1,2,3,4和5。
图18显示通过ELSD层析评估PS20在水中的不同洗脱时间。50μL注射0.1mg/mLPS20水溶液，3.1分钟洗脱步骤(迹线1)或1.1分钟洗脱步骤(迹线2)。
图19显示通过ELSD层析对最终化方法2的评估。25μL注射水(迹线1)，150mg/mL不含PS20的A18/A19(迹线2)，掺入水的0.2mg/mL PS20(迹线3)和掺入A18/A19的0.2mg/mLPS20(迹线4)，使用方法2 的最终化参数。
图20A-20F显示了对三种不同产品的特异性的评估。图20A(A18/A19)， 20C(A16/A17)和20E(A14/A20)显示ELSD层析图。图20B(A18/A19)， 20D(A16/A17)和20F(A14/A20)显示UV(280nm)层析图。不含PS20 的制剂(迹线1)，不含PS20的蛋白质(迹线2)和0.1mg/mLPS20的水溶液(迹线3)。
图21显示了通过ELSD层析使用掺入水中的PS20或不含PS20的 A18/A19评估柱体与柱体的可变性。柱体2,掺入不含PS20的A18/A19的 0.1mg/mL PS20(迹线1)；柱体6,掺入不含PS20的A18/A19的0.1mg/mL PS20(迹线2)；柱体2，掺入水中的0.2mg/mL PS20(迹线3)；和柱体6, 掺入水中的0.2mg/mL PS20(迹线4)。
图22显示了通过ELSD层析使用掺入水中的PS20或不含PS20的 A18/A19评估柱体与柱体的可变性。柱体4,掺入不含PS20的A18/A19的 0.2mg/mL PS20(迹线1)；柱体6，掺入不含PS20的A18/A19的0.2mg/mL PS20(迹线2)；柱体4，掺入水中的0.2mg/mL PS20(迹线3)；和柱体6,掺入水中的0.2mg/mL PS20(迹线4)。
图23显示了在单个柱体上包括100个A18/A19注射的序列中使用的对照样品的ELSD层析图。在整个序列中注射的11个对照样品的叠加。
图24显示A18/A19样品的ELSD层析图，所述样品用于包括在单个柱体上的100个A18/A19注射的序列中。在整个序列中叠加100个A18/A19 样品注射。
图25A和25B显示了来自一个序列的第1次，第50次和第100次蛋白质注射的层析图，所述序列包括在单个柱体上的100个A18/A19注射。
图26A和26B显示使用柱体4对A18/A19样品(标称0.2mg/mL PS20) 进行100次注射的定量结果。图26A显示PS20面积与注射次数。图26B 显示PS20浓度对注射次数。
图27A和27B显示使用柱体5对A18/A19制剂缓冲液(标称0.2mg/mL PS20)进行100次注射的定量结果。图27A显示PS20面积对注射次数。图 27B显示PS20浓度对注射次数。
图28A和28B显示了使用柱体3在水中掺加0.2mg/mL PS20的100次注射的定量结果。图28A显示PS20面积对注射次数。图28B显示PS20浓度对注射次数。
图29A-29F显示了使用方法1和方法2通过ELSD层析评估三种低pI 产物。图29A，29C和29E显示了方法1的层析图，分别使用A21，A14/A15 和A14。图29B，29D和29F显示了方法2的层析图，分别使用A21，A14/A15 和A14。
本发明的详细描述
本发明提供了用于定量包含多肽和非离子表面活性剂的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中定量表现出非离子表面活性剂与多肽之间的干扰降低。还提供了方法，其中组合物还包含N-乙酰色氨酸，并且定量表现出非离子表面活性剂，多肽和N-乙酰色氨酸之间的干扰降低。
I.定义
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分或毒素缀合。定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物的多肽(包括例如非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰。本文使用的术语“多肽”和“蛋白质”特别包括抗体。
“纯化的”多肽(例如，抗体或免疫黏附素)意指多肽的纯度增加，使得其以比其天然环境中和/或最初合成和/或在实验室条件下扩增时更纯的形式存在。纯度是一个相对术语，并不一定意味着绝对纯度。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断，抑制或中和天然多肽的生物活性的任何分子。以类似的方式，术语“激动剂”以最广义使用，包括模拟天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子特别包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段，天然多肽的片段或氨基酸序列变体等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触并测量通常与多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
“结合”目的抗原，例如，肿瘤相关多肽抗原靶标的多肽是以足够的亲和力结合抗原的多肽，使得该多肽可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且不与其他多肽显著交叉反应。在此类实施方案中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定，多肽与“非靶”多肽的结合程度将小于多肽与其特定靶多肽结合的约10％。
关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。例如，可以通过测定分子的结合与对照分子结合的结合相比来测量特异性结合，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与靶标例如，过量的未标记靶标相似的对照分子竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则表明特异性结合。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。术语“免疫球蛋白” (Ig)可与本文的抗体互换使用。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有不同的结构，所有这些都基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体具有两条“重”链和两条“轻”链，它们通过二硫键结合形成功能性抗体。每条重链和轻链本身包含“恒定” (C)和“可变”(V)区域。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支持并在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中起作用。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性不均匀地分布在可变结构域的110个氨基酸跨度上。相反，V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的相对不变的区段组成，所述构架区由被称为“高变区” (HVR)的极端可变的较短区域隔开，所述高变区各自为9-12个氨基酸长。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，主要采用β-片层构型，通过三个高变区连接，其形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见 Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda, Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
每个V区通常包含三个HVR，例如，三个互补决定区(“CDR”，每个包含“高变环”)和四个构架区。因此，抗体结合位点，即以实质性亲和力结合特定所需抗原所需的最小结构单元，通常将包括三个CDR，并且在其间散布至少三个，优选四个构架区以便以合适的构象保持和呈递CDR。经典的四链抗体具有抗原结合位点，其由VH和VL结构域协作定义。某些抗体，例如骆驼和鲨鱼抗体，缺少轻链并且仅依赖于由重链形成的结合位点。可以制备单结构域工程化免疫球蛋白，其中结合位点仅由重链或轻链形成，在VH和VL之间不存在协作。
术语“可变的”是指可变结构域的某些部分在抗体之间的序列差异很大，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性这一事实。然而，可变性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高保守部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，主要采用β- 片层构型，通过三个高变区连接，所述可变区形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR 紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
当在本文中使用时，术语“高变区”(HVR)是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基 (例如，在VL中约为残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，并且在VH中约为31-35B(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)) 和/或来自“高变环”的那些残基(例如VL中的残基26-32(L1)，50-52 (L2)和91-96(L3)，和VH中的26-32(H1)，52A-55(H2)和96-101 (H3)(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
“构架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)，线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体，单可变结构域抗体，微抗体，单链抗体分子；由抗体片段(例如，包括但不限于Db-Fc,taDb-Fc,taDb-CH3,(scFV)4-Fc,di-scFv,bi-scFv,或串联(二，三)-scFv)；和双特异性T细胞衔接子(BiTE))形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。 Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基。 F(ab')2抗体片段最初是作为Fab'片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以被指定为两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分配到不同的类别。存在五种主要类别的完整抗体:IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA 和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述参见Plückthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH) (VH-VL)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollingeret al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖具有多表位特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于包含重链可变结构域 (VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单元具有多表位特异性；具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体,每个VHVL单元结合不同的表位；具有两个或多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段如Fab，Fv，dsFv，scFv；双抗体；双特异性双抗体；三抗体；三功能抗体；共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”是指仅结合一个表位的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是IgG抗体，其以5μM至0.001pM，3μM至0.001pM，1μM至0.001pM， 0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位。
表述“单结构域抗体”(sdAbs)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常是指其中单个可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，单个可变结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括来自骆驼科动物(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的那些和来自人和小鼠抗体的重组方法的那些(Nature(1989)341:544-546；Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001) 26:230-235；Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；Febs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，包含在群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在单克隆抗体的生产过程中可能出现的可能变体以外，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号 4,816,567)。还可以使用例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧世界猴，例如狒狒，恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合抗体，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠，大鼠，兔或非人灵长类动物的具有所希望的特异性、亲和力和容量高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR 是人免疫球蛋白序列的那些FR，除了如上所述的FR取代之外。人源化抗体任选将还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区。有关进一步的细节，参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；和 Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
出于本文的目的，“完整抗体”是包含重和轻可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域 (VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
“裸抗体”是不与异源分子，例如细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体(如本文所定义)。
在一些实施方案中，抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列可变Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体的下调。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK) 细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别在靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页表 3。为了评估目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，例Clynes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK) 细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体激活途径通过补体***的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如多肽(例如抗体))的结合而启动。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)所述。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA (“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见
Figure BDA0003679872070000181
Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在Ravetch andKinet,Annu. Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995) 中进行了综述。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol. 24:249(1994))。
“杂质”是指与所需多肽产物不同的物质。在本发明的一些实施方案中，杂质包括多肽的电荷变体。在本发明的一些实施方案中，杂质包括抗体或抗体片段的电荷变体。在本发明的其他实施方案中，杂质包括但不限于:宿主细胞材料，例如CHOP；浸出蛋白A；核酸；所需多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分等。
如本文所用，术语“免疫黏附素”表示抗体样分子，其将异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能相结合。在结构上，免疫黏附素包含具有所需结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合，所述具有所需结合特异性的氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，是“异源的”)。免疫黏附素分子的黏附素部分通常是连续的氨基酸序列，其至少包含受体或配体的结合位点。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白获得，例如IgG-1， IgG-2，IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或 IgM。
如本文所用，“表面活性剂”是指表面活性剂，优选非离子表面活性剂。本文中的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20 和聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基-，肉豆蔻酰基-，亚油基- 或硬脂基-磺基甜菜碱；十二烷基-，肉豆蔻酰基-，亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-，肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-，椰油酰胺丙基-，亚油酰胺丙基-，肉豆蔻酰胺丙基-，棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-，棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基钠，或甲基油基-牛磺酸二钠；和 MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物(如Pluronics，PF68等)；在一个实施方案中，本文的表面活性剂是聚山梨醇酯20。在另一个实施方案中，本文的表面活性剂是泊洛沙姆188。
如本文关于层析所使用的术语“顺序”是指具有第一层析，然后是第二层析。在第一层析和第二层析之间可以包括附加步骤。
如本文关于层析所使用的术语“连续”是指具有直接连接的第一层析材料和第二层析材料或允许两种层析材料之间连续流动的一些其他机制。
“加样密度”是指与一定体积的层析材料(例如升)接触的组合物的量(例如克)。在一些实例中，加样密度以g/L表示。
如本文所用，关于种类(例如，非离子表面活性剂)的定量的术语“干扰”是指除所述种类之外的某种组分(例如，多肽)对定量的贡献。例如，含有聚山梨醇酯20和多肽的层析级分的ELSD信号将具有来自聚山梨醇酯 20和多肽的贡献，并且级分中聚山梨醇酯20的定量将具有来自多肽的干扰。
如本文所用，“基本上相同”表示值或参数未被显著效果改变。例如，如果离子强度没有显著变化，则柱出口处的层析流动相的离子强度与流动相的初始离子强度基本相同。例如，柱出口处在初始离子强度的10％，5 ％或1％内的离子强度与初始离子强度基本相同。
本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“或”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。应理解，本文描述的本发明的方面和变化包括“由......组成”和/或“基本上由......组成”方面和变型。
II.层析方法
在一些方面，本发明提供分析包含多肽和非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯20或PS20)的组合物的方法，包括使用加样缓冲液将多肽和非离子表面活性剂结合到混合模式离子交换层析材料上,并使用缓冲液从层析材料中洗脱多肽和非离子表面活性剂，使得多肽和非离子表面活性剂在不同的级分中从层析材料中洗脱。在一些实施方案中，层析方法适用于包含多种多肽(例如多肽产物)，包括具有不同pI的多肽的组合物。例如，该方法可用于分析包含非离子表面活性剂和许多不同抗体产物(例如pI 范围为6.0至9.5的抗体产物)的组合物。在其他实施方案中，层析方法包括使用通过本文描述的方法鉴定的最佳条件(例如，层析材料，缓冲液，梯度，步骤持续时间，流速，样品加样)。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，层析材料是包含能够具有以下一种或多种功能的官能团的混合模式材料:阴离子交换，阳离子交换，氢键和疏水相互作用。在一些实施方案中，混合模式材料是混合模式阴离子交换层析材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000201
MAX层析材料。在一些实施方案中，混合模式材料是混合模式阳离子交换层析材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000202
MCX层析材料。在一些实施方案中，混合模式材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式材料包含在柱或柱体中。在上述的一些实施方案中，混合模式材料是混合模式层析柱或柱体，例如混合模式阴离子交换层析柱或柱体，或混合模式阳离子交换层析柱或柱体。在一些实施方案中，混合模式材料是高效液相层析(HPLC)材料。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，离子交换材料可以使用常规层析材料或对流层析材料。常规的层析材料包括，例如，灌注材料(例如，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂)和扩散材料(例如，交联的琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂可以是
Figure BDA0003679872070000211
树脂。在一些实施方案中，交联的琼脂糖树脂可以是磺丙基-
Figure BDA0003679872070000212
Fast Flow (“SPSFF”)树脂。对流层析材料可以是膜(例如聚醚砜)或整料材料(例如交联的聚合物)。聚醚砜膜可以是Mustang。交联的聚合物整料材料可以是交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共聚-乙烯二甲基丙烯酸酯)。
在本发明任何方法的一些实施方案中，层析材料在层析柱或柱体中；例如，混合模式阳离子交换层析柱或柱体或混合模式阴离子交换层析柱或柱体。在一些实施方案中，层析柱或柱体用于液相层析。在一些实施方案中，层析柱或柱体用于高效液相层析(HPLC)。在一些实施方案中，层析柱或柱体是HPLC层析柱或柱体；例如，混合模式阳离子交换HPLC柱或柱体或混合模式阴离子交换HPLC柱或柱体。
例如，在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a) 将该组合物应用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A 包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91, 92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94, 8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约30:70至约50:50 之间(例如约32:68,34:66,36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 和48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14, 88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。
在一些实施方案中，层析法的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1, 1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20, 25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。
在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约 0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9, 2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4, 1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5, 1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如至少约 0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆(P188) 或聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂的浓度在约0.001 ％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3, 0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL (例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220, 和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4, 5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
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MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％ (例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％, 0.01％,或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B 与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂，其中非离子表面活性剂的定量包括小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％,或更低中的任何一种)来自多肽的干扰。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％ (例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98, 4:96,6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约 30:70至约50:50之间(例如约32:68,34:66,36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,和48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18, 84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约 0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％, 和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％, 1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5, 1.6,1.7,1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1 (例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4, 3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1, 0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2, 3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约 1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140, 160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6, 4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
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MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B 与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂，其中所述洗脱液包含少于约10％ (例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％, 0.01％或更少中的任一个)的组合物中总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约30:70 至约50:50之间(例如约32:68,34:66,36:64,38:62,40:60,42:58, 44:56,46:54,和48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18, 84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％, 和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％, 1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5, 1.6,1.7,1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1 (例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1, 0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5, 2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01, 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120, 140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC) 材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000281
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％, 2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,或更低的任一个)的来自多肽的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含乙酸的水溶液，流动相B包含乙酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91, 92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B 与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约30:70 至约50:50之间(例如约32:68,34:66,36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,和48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18, 84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约 0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％, 和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的乙酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％, 1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)乙酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至 2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和 2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4, 1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2, 3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤 c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09, 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5, 2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01, 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120, 140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC) 材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000301
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％, 2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b) 用包含约35:65至约45:55之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含大约在90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约40:60。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％, 2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9, 2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a) 开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3, 1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3, 3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4, 1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005, 0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100, 120,140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC) 材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000321
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％, 2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％, 2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92,10:90,12:88,14:86, 16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约30:70至约50:50之间(例如约32:68,34:66, 36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,和48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20 至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6, 96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％, 2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9, 2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a) 开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3, 3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4, 1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05, 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约 1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140, 160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6, 4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000351
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％, 0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中非离子表面活性剂的定量包括小于约10％(例如小于约 9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任何一种或更少)来自多肽的干扰。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93, 94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％, 7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92, 10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约30:70至约50:50之间(例如约32:68,34:66,36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 和48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14, 88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2, 1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25, 30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6, 0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2, 或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6, 1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05 (例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1, 1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7, 0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v) 的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5, 10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0, 6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物， THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000371
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％, 6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个) 的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92,10:90, 12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约30:70至约50:50之间(例如约32:68,34:66,36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,和 48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14, 88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2, 1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25, 30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6, 0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2, 或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6, 1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05 (例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1, 1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7, 0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v) 的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5, 10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0, 6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物， THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000391
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％, 或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含乙酸的水溶液，流动相B包含乙酸的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A 的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98, 或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％, 2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92,10:90,12:88,14:86, 16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约30:70至约50:50之间(例如约32:68,34:66, 36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,和48:52中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20 至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6, 96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％, 2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的乙酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5 ％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)乙酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25, 1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约 1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35, 40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8, 0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8, 2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5, 2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7,0.8, 0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7, 0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10, 20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0, 6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物， THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000421
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％, 或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，流动相B包含酸的甲醇溶液；b)用包含约 35:65至约45:55之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含在大约90:10到大约100:0 之间的第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约40:60。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相A 包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％, 3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，酸是甲酸。在一些实施方案中，酸是乙酸。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5 至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和 2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4, 1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2, 3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤 c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09, 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5, 2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1, 0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL 至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160, 180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0, 5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000441
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器 (CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％,或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含乙酸的水溶液，流动相B包含乙酸的甲醇溶液；b)用包含约35:65至约45:55之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含在大约90:10到大约 100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中非离子表面活性剂的定量包括小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％, 1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任何一种或更少)来自多肽的干扰。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约40:60。在一些实施方案中，第三比例为约 100:0。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c) 的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％, 0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％, 1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的乙酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5 ％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％, 和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)乙酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2, 1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25, 30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2, 或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6, 1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1, 1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如0.6,0.7, 0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v) 的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5, 10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0, 6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物， THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000461
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中所述组合物加样到在包含在大约5:95 到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含乙酸的水溶液，流动相B包含乙酸的甲醇溶液；b) 用包含约35:65至约45:55之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含在大约90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中来自步骤c) 的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％, 1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约40:60。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的乙酸的水溶液。在一些实施方案中，流动相 B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％, 3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)乙酸的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9, 1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15, 20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围) μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8, 1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2, 1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2,3或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001 ％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3, 0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL (例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4, 5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000481
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％ (例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％, 0.01％,或更低的任一个)的来自多肽的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯20的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阴离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含约10:90比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含约2％的乙酸的水溶液，流动相B包含约2％的乙酸的甲醇溶液；b)用包含约40:60 比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含在大约100:0的比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯20；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯20，在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约 9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.2,1.25,1.3,1.5,1.7,1.9, 2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，层析的流速为约1.25mL/min。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约 20μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7, 1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约1(例如至少约1.2,1.4,1.6,1.8,2,2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8, 4或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约0.5 (例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2,3 或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯20 的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约 1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140, 160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6, 4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱或柱体中。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000501
MAX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％, 0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,或更低的任一个)的来自多肽的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10 ％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％, 0.01％或更少中的任一个)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80 之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和 18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60, 42:58,44:56,46:54,48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20 至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6, 96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％, 2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈)溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7, 1.8,1.9,2,或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5,或更多中的任何一个)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约 0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5, 1,1.5,2或更多中的任何一个)分钟开始并持续至少约2(例如至少约 2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5,或更多中的任一个)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内 (例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8, 和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸(也称为N-乙酰基-DL-色氨酸)和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度为约0.1mM至约10mM (例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL 至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160, 180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0, 5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000521
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％, 或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂,其中非离子表面活性剂的定量包括小于约10％(例如小于9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％, 1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任何一种或更少)来自多肽的干扰。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92,10:90,12:88, 14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65至约55:45之间(例如约36:64, 38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,48:52,50:50,52:48,和54:46 中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12, 90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈)溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1, 和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a) 开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3, 1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4, 4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤 b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约 2(例如2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5 中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯 80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)的浓度在约0.001％至1.0％(w/v) 的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5, 1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40, 50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220, 和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4, 5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
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MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂，其中来自步骤c) 的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％, 1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92,10:90, 12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,48:52,50:50,52:48, 和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14, 88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％, 2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围) 氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈)溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9, 2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a) 开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3, 1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤 b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5 中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯 80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5, 1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约 100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40, 50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220, 和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4, 5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000581
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％, 或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d) 定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约 91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b) 中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B 与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65 至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2 中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1, 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多) 分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)的浓度在约 0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120, 140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000601
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD) 来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％, 0.05％,0.01％,或更低的任一个)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的乙腈溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d) 定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约 91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b) 中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B 与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65 至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2 中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的乙腈溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1, 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多) 分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)的浓度在约 0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120, 140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000631
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD) 来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％, 0.05％,0.01％的任一个或更低)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含在大约40:60到大约50:50之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c) 用包含大约在90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A 的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96, 97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％, 4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B 与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈) 溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9, 1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20, 25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约 0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9, 2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4, 2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2 中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6, 2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01, 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或 9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80, 100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约 7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6, 6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC) 材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000661
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％, 2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％,的任一个或更低)的多肽干扰。
当使用HPLC-ELSD条件测试制剂中含有N-乙酰色氨酸(NAT)的产物时，在PS20区域中观察到显著的干扰。因此，在某些情况下，需要备选条件来消除NAT和蛋白质相关的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂、多肽和 N-乙酰色氨酸的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％，3％， 2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94, 8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65至约55:45 之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,48:52,50:50, 52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈)溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5, 1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤 b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1, 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多) 分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。在一些实施方案中，组合物中非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)的浓度在约 0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约 0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20, 30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL (例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220, 和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4, 5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000681
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，非离子表面去污剂的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任一个或更低)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯和多肽的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含第二比例的流动相 B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c) 的洗脱液中的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95, 96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％, 5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65 至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2 中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈) 溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9, 1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20, 25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约 0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9, 2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4, 2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2 中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6, 2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内 (例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8, 和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中 N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3, 4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60, 70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5, 10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0, 6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或 THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
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MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％, 3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任一个或更低)的多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中聚山梨醇酯的定量包括小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％中的任何一种或更少)来自多肽和NAT的干扰。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％, 1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96,6:94,8:92,10:90, 12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54,48:52,50:50,52:48, 和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14, 88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％, 2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围) 氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈)溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3, 1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4, 4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤 b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约 2(例如2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5 中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯 20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约 0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约 0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约 0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20, 30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL (例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220, 和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000741
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽和少于约5 ％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约 2:98,4:96,6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56, 46:54,48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和 98:2中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的有机溶剂(例如甲醇或乙腈) 溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9, 1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20, 25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约 0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9, 2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4, 2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2 中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6, 2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约 0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约 0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80, 或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40, 60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约 4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4, 6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。
在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC) 材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000761
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％, 0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)来自多肽和NAT的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的甲醇溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相 A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d) 定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92, 93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％, 8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相 B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65 至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2 中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5, 1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤 b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1, 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多) 分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005, 0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5, 6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
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MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD) 来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约 10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％, 0.01％中的任一个或更少)来自多肽和NAT的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的乙腈溶液；b)用包含第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中第二比例大于第一比例；c)用包含第三比例的流动相B与流动相 A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯，其中第三比例大于第二比例；d) 定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92, 93,94,95,96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％, 8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相 B与流动相A的第一比例在约0:100至约20:80之间(例如约2:98,4:96, 6:94,8:92,10:90,12:88,14:86,16:84,和18:82中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第二比例在约35:65 至约55:45之间(例如约36:64,38:62,40:60,42:58,44:56,46:54, 48:52,50:50,52:48,和54:46中的任何一个，包括这些比例之间的任何范围)。在一些实施方案中，第三比例在约80:20至约100:0之间(例如约82:18,84:16,86:14,88:12,90:10,92:8,94:6,96:4,和98:2 中的任何一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的乙腈溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5, 1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤 b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1, 1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多) 分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08, 0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6, 3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05, 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或 9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约 250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180, 200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0, 5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000811
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)来自多肽和NAT的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；b)用包含在大约40:60到大约50:50之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含大约在90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95,96,97,98, 或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，其中来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％, 3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少) 组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约45:55。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％, 3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v) (例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的有机溶剂(例如，甲醇或乙腈)溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9, 1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约 0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9, 2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2 中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如2.2,2.4,2.6,2.8, 3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7, 0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2, 0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2, 0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,或 90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40, 60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约 4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4, 6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。
在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC) 材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000841
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％, 0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)来自多肽和NAT的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的甲醇溶液；b)用包含在大约40:60到大约50:50之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c) 用包含大约在90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A 的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中聚山梨醇酯的定量包括小于约10％(例如小于约9％,8％,7％, 6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任何一种或更少)来自多肽和NAT的干扰。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95, 96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B与流动相A 的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约45:55。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，流动相A包含约 0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％, 和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％, 1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和 2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4, 1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5, 5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3, 0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20 或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约 0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约 0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20, 30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL (例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4, 5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000861
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的甲醇溶液；b)用包含在大约40:60到大约50:50之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c) 用包含大约在90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A 的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％, 7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽和少于约5％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约45:55。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％, 2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的甲醇溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4, 1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约 50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40, 和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2, 3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005, 0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5, 6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120, 140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
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MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD) 来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约 10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％, 0.01％中的任一个或更少)来自多肽的干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的乙腈溶液；b)用包含在大约40:60到大约50:50之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c) 用包含大约在90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A 的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中聚山梨醇酯的定量包括小于约10％(例如小于约9％,8％,7％, 6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任何一种或更少)来自多肽和NAT的干扰。在一些实施方案中，所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合，并且至少约90％(例如至少约91,92,93,94,95, 96,97,98,或99％中的任一个)的多肽在步骤b)中洗脱。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含非特异性结合的多肽。在一些实施方案中，其中来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少) 的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约45:55。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％, 4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约 0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的乙腈溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4,1.5,1.7,1.9, 2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a) 开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3, 1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4, 4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤 b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约 2(例如2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5 中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯 20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约 0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约 0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM 中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约 0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20, 30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL (例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200,220, 和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4, 5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
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MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯、多肽和N-乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含在大约5:95到大约15:85之间的第一比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液，流动相B包含氢氧化铵的乙腈溶液；b)用包含在大约40:60到大约50:50之间的第二比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c) 用包含大约在90:10到大约100:0之间的第三比例的流动相B与流动相A 的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯；d)定量步骤c)的洗脱液中的聚山梨醇酯，其中来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％, 7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽和少于约5％(例如少于约4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，流动相B与流动相A的第一比例为约10:90。在一些实施方案中，第二比例为约45:55。在一些实施方案中，第三比例为约100:0。在一些实施方案中，流动相A包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％, 2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的氢氧化铵的水溶液。在一些实施方案中，流动相B包含约0.5％至约5％(v/v)(例如约0.75％,1％,1.5％,2％,2.5％,3％,3.5％,4％,和4.5％中的任一个，包括这些值之间的任何范围)氢氧化铵的乙腈溶液。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3,1.4, 1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约 50(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40, 和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2, 3.4,3.6,3.8,4,4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4, 3.6,3.8,4,4.5,5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005, 0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5, 6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120, 140,160,180,200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0,5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0, 7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
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MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD) 来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约 10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％, 0.01％或更低)的来自多肽干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯20、多肽和N- 乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯20的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含约10:90比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含约1.5％的氢氧化铵水溶液，流动相B包含约1.5％氢氧化铵的甲醇溶液；b)用包含在大约45:55比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含大约100:0比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯20；d)定量步骤c) 的洗脱液中的聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％, 1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3, 1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，层析的流速为约1.40mL/min。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约25μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3, 1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4, 4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤 b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约 2(例如2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5,5 中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯20 的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05, 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或 9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约 250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180, 200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0, 5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
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MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更低)的来自多肽和NAT干扰。
在一些实施方案中，提供了用于定量包含聚山梨醇酯20、多肽和N- 乙酰色氨酸的组合物中的聚山梨醇酯20的方法，其中该方法包括以下步骤:a)将该组合物施用于混合模式阳离子交换层析材料，其中组合物加样到在包含约10:90比例的流动相B与流动相A的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含约1.5％的氢氧化铵水溶液，流动相B包含约1.5％氢氧化铵的乙腈溶液；b)用包含在大约45:55比例的流动相B与流动相A的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽；c)用包含大约100:0比例的流动相B与流动相A的溶液从层析材料中洗脱聚山梨醇酯20；d)定量步骤c) 的洗脱液中的聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约10％(例如少于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％, 0.1％,0.05％,0.01％中的任一个或更少)的组合物中的总多肽。在一些实施方案中，来自步骤c)的洗脱液包含少于约5％(例如少于约4％,3％,2％, 1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％的任何一种或更少)组合物中的总NAT。在一些实施方案中，层析的流速为约0.5至2.5(例如约0.7,0.9,1.1,1.3, 1.4,1.5,1.7,1.9,2.1,和2.3中的任一个，包括这些值之间的任何范围)mL/分钟。在一些实施方案中，层析的流速为约1.40mL/min。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约1至约50(例如约1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,和45中的任一个，包括这些值之间的任何范围)μL。在一些实施方案中，施用于层析材料的组合物的体积为约25μL。在一些实施方案中，步骤b)在步骤a)开始之后至少约0.5(例如至少约0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.1,1.2,1.3, 1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.2,3.4,3.6,3.8,4, 4.5,5中的任何一个或更多)分钟。在一些实施方案中，步骤c)在步骤 b)结束后至少约0.05(例如，至少约0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,1,1.5,2中的任何一个或更多)分钟开始并持续至少约 2(例如至少约2.2,2.4,2.6,2.8,3,3.1,3.2,3.4,3.6,3.8,4,4.5, 5中的任一个或更多)分钟。在一些实施方案中，组合物中聚山梨醇酯20 的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内(例如约0.005,0.01,0.05, 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,和0.9％的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,或9mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM(例如约0.2,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 20,30,40,50,60,70,80,或90mM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL(例如约2,5,10,20,40,60,80,100,120,140,160,180, 200,220,和240mg/mL中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物的pH为约4.5至约7.5(例如约4.6,4.8,5.0, 5.2,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,7.4中的任一个，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。在一些实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070000971
MCX层析材料。在一些实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。在一些实施方案中，聚山梨醇酯的定量包含小于约10％(例如小于约9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％或更低)的来自多肽和NAT干扰。
在上述任何方法的一些实施方案中，在将多肽加入组合物之前，在包含非离子表面活性剂的组合物中定量非离子表面活性剂。在一些实施方案中，在加入多肽之前，组合物中非离子表面活性剂的浓度将更高(例如，组合物中的非离子表面活性剂在加入多肽时被稀释)。在上述任何方法的一些实施方案中，在包含非离子表面活性剂但不含多肽的组合物中定量非离子表面活性剂。这种定量可用作包含非离子表面活性剂和多肽的组合物的对照或比较物。
在上述任何方法的一些实施方案中，将待分析组合物的样品加入层析仪器(例如HPLC仪器)的自动进样器中。在一些实施方案中，自动进样器中的样品是冷藏的(例如，5±3℃)。在一些实施方案中，将包含层析材料的一个或多个柱置于层析仪器的柱室中。在一些实施方案中，可以采用温度控制特征以在分析期间将柱室温度保持在距设定点的窄范围(例如，±1℃)内。在一些实施方案中，在280nm处监测柱流出物。
在上述任何方法的一些实施方案中，待分析的组合物样品用上样缓冲液稀释至目标多肽浓度为约0.1mg/mL至约75mg/mL(例如约0.2,0.4,0.6, 0.8,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,6,7,8,9,10,12,14,16, 18,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,或70mg/mL任何一种，包括这些值之间的任何范围)。
在上述任何方法的一些实施方案中，层析仪器包括梯度泵(例如，低压四元梯度泵)，自动进样器(例如，具有温度控制能力的自动进样器)，柱室(例如，热控制柱室)，UV检测器(例如，二极管阵列UV检测器) 和蒸发光散射检测器(ELSD)。在一些实施方案中，层析仪器还包括pH 和电导率监测器(例如，PCM-3000)以实时收集pH和电导率数据。使用适当的软件(例如，JMP10)执行仪器控制，数据采集和数据分析。
在本发明的一些实施方案中，流动相的离子强度，例如，洗脱缓冲液通过流动相的电导率测量。电导率是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液将具有更高的导电率。电导率的基本测量单位是西门子 (或mho)，mho(mS/cm)，并且可以使用电导率仪测量，例如各种型号的Orion电导率仪。由于电解电导率是溶液中离子携带电流的能力，因此可以通过改变其中离子的浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐的浓度(例如氯化钠，乙酸钠或氯化钾)以获得所需的导电率。优选地，改变各种缓冲剂的盐浓度以获得所需的导电率。
在一些实施方案中，层析的流动相具有大于约0.0mS/cm,0.5mS/cm, 1.0mS/cm,1.5mS/cm,2.0mS/cm,2.5mS/cm,3.0mS/cm,3.5mS/cm, 4.0mS/cm,4.5mS/cm,5.0mS/cm,5.5mS/cm,6.0mS/cm,6.5mS/cm, 7.0mS/cm,7.5mS/cm,8.0mS/cm,8.5mS/cm,9.0mS/cm,9.5mS/cm, 10mS/cm,11mS/cm,12mS/cm,13mS/cm,14mS/cm,15mS/cm,16mS/cm, 17.0mS/cm,18.0mS/cm,19.0mS/cm,或20.0mS/cm中的任一个的初始电导率。在一些实施方案中，流动相的电导率在层析过程中增加，例如，通过离子强度梯度。在一些实施方案中，在洗脱完成时流动相的电导率大于约1.0mS/cm,1.5mS/cm,2.0mS/cm,2.5mS/cm,3.0mS/cm,3.5mS/cm,4.0mS/cm,4.5mS/cm,5.0mS/cm,5.5mS/cm,6.0mS/cm,6.5mS/cm, 7.0mS/cm,7.5mS/cm,8.0mS/cm,8.5mS/cm,9.0mS/cm,9.5mS/cm, 10mS/cm,11mS/cm,12mS/cm,13mS/cm,14mS/cm,15mS/cm,16mS/cm, 17.0mS/cm,18.0mS/cm,19.0mS/cm,或20.0mS/cm中的任何一个。在一些实施方案中，流动相的电导率通过线性梯度增加。在一些实施方案中，流动相的电导率通过包括一个或多个步骤的分步梯度增加。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将包含多肽和非离子表面活性剂的组合物以大于约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,50, 100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,2000,3000,4000, 5000,6000,7000,8000,9000,或10000μg的任何一种的多肽的量加样到层析材料上。在一些实施方案中，将组合物以大于约0.5,1,1.5,2, 2.5,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140, 或150mg/mL中任何一个的浓度加样到层析材料上。在一些实施方案中，在加样到层析材料上之前稀释组合物；例如，以1:1,1:2,1:5,1:10或大于1:10稀释。在一些实施方案中，将组合物稀释到层析的流动相中。在一些实施方案中，将组合物稀释到上样缓冲液中。
在本文所述方法的一些实施方案中，层析材料在柱或柱体中。在一些实施方案中，柱是HPLC柱或柱体。柱或柱体可具有与层析仪器兼容的任何尺寸。例如，在一些实施方案中，柱或柱体具有以下尺寸中的任何一个:2.1 x20mm,4×50mm,4×100mm,4×150mm,4×200mm,4×250 mm,或2×250mm。
III.多肽
提供多肽用于任何离子交换层析方法，其中分离条件如本文所述进行优化。在本发明的一些实施方案中，通过离子交换层析分析多肽的组合物。此类方法可用于鉴定组合物中多肽的电荷变体。在一些实施方案中，多肽是抗体或其片段。在一些实施方案中，多肽的pI为约6.0至约9.5。在一些实施方案中，多肽是pI范围为约6.0至约9.5的抗体。在一些实施方案中，通过本发明的方法提供多肽的电荷对pH曲线的拐点(IP)。在一些实施方案中，通过本发明的方法提供IP随温度变化(dIP/dT)的变化。
在一些实施方案中，多肽是治疗性多肽。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，多肽是免疫黏附素。
在一些实施方案中，所述多肽的分子量大于约5,000道尔顿，10,000 道尔顿，15,000道尔顿，25,000道尔顿，50,000道尔顿，75,000道尔顿， 100,000道尔顿，125,000道尔顿或150,000道尔顿中的任一个。多肽可具有约50,000道尔顿至200,000道尔顿或100,000道尔顿至200,000道尔顿之间的分子量。或者，用于本文的多肽可具有约120,000道尔顿或约25,000 道尔顿的分子量。
pI是等电点，并且是特定分子或表面不携带净电荷时的pH。在一些实施方案中，本发明的方法可用于多种包含多肽的组合物，其中组合物中多肽例如抗体的pI范围为约6.0至约9.5。在一些实施方案中，多肽的pI 大于约9.5；例如，约9.5至约12。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，多肽，例如，抗体的pI可少于约7；例如，约4至约7。
在本文所述任何方法的实施方案中，包含多肽和一种或多种污染物的组合物中的一种或多种污染物是多肽电荷变体。在一些实施方案中，多肽电荷变体是已经从其天然状态修饰的多肽，从而改变了多肽的电荷。在一些实施方案中，电荷变体比亲本多肽更具酸性；即，具有比亲本多肽更低的 pI。在其他实施方案中，电荷变体比亲本多肽更碱性；即具有比亲本多肽更高的pI。在一些实施方案中，多肽电荷变体是工程化的。在一些实施方案中，多肽电荷变体是天然过程的结果；例如，氧化，脱酰胺，赖氨酸残基的 C-末端加工，N-末端焦谷氨酸形成和糖化。在一些实施方案中，多肽电荷变体是糖蛋白，其中与蛋白质连接的聚糖被修饰，使得与亲本糖蛋白相比糖蛋白的电荷被改变；例如，通过添加唾液酸或其衍生物。在一些实施方案中，多肽电荷变体是抗体电荷变体。
使用本文所述方法分析的多肽通常使用重组技术产生。产生重组蛋白的方法描述于例如美国专利号5,534,615和4,816,567中，其通过引用明确并入本文。在一些实施方案中，目的蛋白质在CHO细胞中产生(参见例如WO 94/11026)。在一些实施方案中，目的多肽在大肠杆菌细胞中产生。参见，例如，美国专利号5,648,237；美国专利号5,789,199和美国专利号 5,840,523，其描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列。也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K. C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.245-254，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。当使用重组技术时，多肽可以在细胞内，周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。
可从培养基或宿主细胞裂解物中回收多肽。用于表达多肽的细胞可以通过各种物理或化学方法破坏，例如冻融循环，超声处理，机械破碎或细胞裂解剂。如果多肽在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter etal.,Bio/Technology 10: 163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的多肽的方法。简而言之，在约30分钟内在乙酸钠(pH3.5)，EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻细胞糊。可以通过离心除去细胞碎片。在多肽分泌到培养基中的情况下，通常首先使用市售的多肽浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达***的上清液。蛋白酶抑制剂如PMSF 可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
在一些实施方案中，在通过本发明的方法分析之前，已经纯化或部分纯化了包含多肽和一种或多种污染物的组合物中的多肽。例如，该方法的多肽在来自亲和层析，阳离子交换层析，阴离子交换层析，混合模式层析和疏水相互作用层析的洗脱液中。在一些实施方案中，多肽在来自蛋白A 层析的洗脱液中。
可以通过本发明的方法分析的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白，免疫黏附素，抗体，酶，激素，融合蛋白，含Fc的蛋白，免疫缀合物，细胞因子和白细胞介素。
(A)抗体
在本文所述任何方法的一些实施方案中，用于通过本文所述方法分析多肽和包含多肽的制剂的任何方法的多肽是抗体。
抗体的分子靶标包括(i)CD蛋白及其配体，例如但不限于:CD3,CD4, CD8,CD19,CD11a,CD20,CD22,CD27,CD28,CD34,CD40,CD79α(CD79a), CD79β(CD79b),CD122,和CD137；(ii)细胞因子，例如但不限于:IL-13， IL-17，IL-22和IL-33；(iii)ErbB受体家族的成员，例如EGF受体，HER2， HER3或HER4受体；(iv)细胞粘附分子如LFA-1，Mac1，p150,95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗CD11a，抗CD18或抗CD11b抗体)；(v)生长因子如VEGF；TGFβ，IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C，BR3，c-met，组织因子，β7等；(vi)免疫调节蛋白，如OX40,GITR,ICOS,PD-1,PD-L1,PD-L2,LAG3,TIM-3,和VISTA；(vii)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，例如美国专利号7,521,541中描述的那些，包括但不限于NaPi2b。
其他示例性抗体包括选自但不限于以下的那些:抗***受体抗体，抗孕酮受体抗体，抗p53抗体，抗HER-2/neu抗体，抗EGFR抗体，抗TGFβ抗体，抗OX40抗体，抗GITR抗体，抗ICOS抗体，抗CTLA-4抗体，抗PD-1 抗体，抗PD-L1抗体，抗PD-L2抗体，抗TIM-3抗体，抗VISTA抗体，抗组织蛋白酶D抗体，抗Bcl-2抗体，抗E-钙黏着蛋白抗体，抗CA125抗体，抗CA15-3抗体，抗CA19-9抗体，抗c-erbB-2抗体，抗P-糖蛋白抗体，抗CEA抗体，抗视网膜母细胞瘤蛋白抗体，抗ras癌蛋白抗体，抗Lewis X 抗体，抗Ki-67抗体，抗PCNA抗体，抗CD3抗体，抗CD4抗体，抗CD5 抗体，抗CD7抗体，抗CD8抗体，抗CD9/p24抗体，抗CD10抗体，抗CD11a 抗体，抗CD11c抗体，抗CD13抗体，抗-CD14抗体，抗CD 15抗体，抗CD19 抗体，抗CD20抗体，抗CD22抗体，抗CD23抗体，抗CD27抗体，抗CD28 抗体，抗CD30抗体，抗CD31抗体，抗CD33抗体，抗CD34抗体，抗CD35 抗体，抗CD38抗体，抗CD40抗体，抗CD41抗体，抗LCA/CD45抗体，抗 CD45RO抗体，抗CD45RA抗体，抗CD39抗体，抗CD100抗体，抗CD95/Fas 抗体，抗CD99抗体，抗CD106抗体，抗CD122抗体，抗CD137抗体，抗泛素抗体，抗CD71抗体，抗StaphA抗体，抗FcRH5抗体，抗Ly6E抗体，抗 STEAP抗体，抗FluB抗体，抗VEGF抗体，抗Ang2抗体，抗FGFR1抗体，抗KLB抗体，抗c-myc抗体，抗细胞角蛋白抗体，抗波形蛋白抗体，抗-HPV 蛋白抗体，抗κ轻链抗体，抗λ轻链抗体，抗黑素体抗体，抗***特异性抗原抗体，抗S-100抗体，抗-tau抗原抗体，抗纤维蛋白抗体，抗角蛋白抗体，抗Tn抗原抗体和MetMab。
(i)单克隆抗体
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体获自基本上同质的抗体群，即，包含在群中的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在单克隆抗体的产生过程中产生的可能的变体之外，这些变体通常以少量存在。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散或多克隆抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可以使用Kohler et al.,Nature 256:495(1975) 首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠，以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的多肽的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或 HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺乏细胞的生长。
在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是有效融合的细胞，通过选择的抗体产生细胞支持稳定的高水平抗体产生，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感。其中，在一些实施方案中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如衍生自可从Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego， California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和可从American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA获得的 SP-2或X63-Ag8-653细胞。已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol. 133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法测定，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson et al.,Anal. Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定产生具有所需特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序亚克隆所述克隆并通过标准方法培养(Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice pp.59-103(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640 培养基。另外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物的腹水肿瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如，多肽A-
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羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和力层析)适当地与培养基，腹水或血清分离。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，杂交瘤细胞用作此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA 置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，如大肠杆菌细胞，猿猴COS 细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol. 5:256-262(1993)和Pl ückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)和Marks et al.,J. Mol.Biol.222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)),以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res. 21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选方案。
还可以修饰DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或通过共价连接免疫球蛋白编码序列到非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。
通常，这种非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，其包含一个对一种抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，抗体是IgA，IgD，IgE，IgG 或IgM。在一些实施方案中，抗体是IgG单克隆抗体。
(ii)人源化抗体
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。本领域已经描述了用于人源化非人抗体的方法。在一些实施方案中，人源化抗体具有引入其中的来自非人源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter 和同事的方法进行(Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988))，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims et al.,J. Immunol.151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol. 196:901(1987))。另一种方法使用衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993))。
更重要的是，抗体被人源化，保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现该目标，在该方法的一些实施方案中，使用亲本和人源化序列的三维模型通过亲本序列和各种概念性人源化产物的分析方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。有计算机程序可以说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，例如对靶抗原的增加的亲和力。通常，高变区残基直接且最基本地参与影响抗原结合。
(iii)人抗体
在一些实施方案中，抗体是人抗体。作为人源化的替代，可以产生人抗体。例如，现在有可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完整库。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al., Nature362:255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year in Immuno. 7:33(1993)；和美国专利号5,591,669；5,589,369；和5,545,807。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553(1990))可用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中体外产生人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳多肽基因中，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择也导致选择编码展示这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模仿B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；其综述见例如，Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in StructuralBiology 3:564-571(1993)。几种V基因区段的来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾脏的V基因的小随机组合文库中分离出多种抗
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唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V 基因库，并且可以基本上按照Markset al.,J.Mol.Biol. 222:581-597(1991),或Griffith et al.,EMBO J.12:725-734(1993) 所述的技术分离针对多种抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
人体抗体也可以通过体外活化的B细胞产生(参见美国专利5,567,610 和5,229,275)。
(iv)抗体片段
在一些实施方案中，抗体是抗体片段。已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过蛋白水解消化完整抗体得到的(参见，例如，Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan etal.,Science 229:81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌中回收Fab'-SH 片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员来说是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见 WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如美国专利5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
在一些实施方案中，提供了本文描述的抗体的片段。在一些实施方案中，抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab 片段，Fab'片段，F(ab')2片段，scFv，Fv和双抗体。
(v)双特异性抗体
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合两种不同的表位。或者，双特异性抗体结合臂可以与结合白细胞上的触发分子(例如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合以便将细胞防御机制集中于细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性(Millstein et al.,Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物收率低。类似的方法公开在WO 93/08829和Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991) 中。
根据不同的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体- 抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在一些实施方案中，融合是与免疫球蛋白重链恒定域，其包含铰链，CH2和CH3区域的至少一部分。在一些实施方案中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区 (CH1)存在于至少一种融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA***单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。当在构建中使用的三条多肽链的不等比例提供最佳产率时，这在调节实施方案中三种多肽片段的相互比例方面提供了很大的灵活性。然而，当以相等比例表达至少两条多肽链导致高产率或当比例没有特别重要时，可以将两条或全部三条多肽链的编码序列***一个表达载体中。
在该方法的一些实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中具有杂合免疫球蛋白重链 -轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构有利于所需双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式。该方法在WO 94/04690中公开。关于产生双特异性抗体的进一步细节，参见，例如，Sureshet al.,Methods in Enzymology 121:210(1986)。
根据美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，可以改造一对抗体分子之间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。在一些实施方案中，界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿“空腔”。这提供了一种机制，用于增加异二聚体相对于其他不需要的终产物如同型二聚体的产率。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”(heteroconjugate)抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出此类抗体将免疫***细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373 和EP 03089)。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂以及许多交联技术是本领域熟知的，并且在美国专利号 4,676,980中公开。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可以使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan et al.,Science 229: 81(1985)描述了一种方法，其中通过蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab') 2片段。在二硫醇络合剂***存在下还原这些片段以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯 (TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物之一再转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的其它Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
还描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体。Kostelny et al.,J. Immunol.148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可用于生产抗体同型二聚体。Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的备选机制。所述片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv) 二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.,J. Immunol.152:5368(1994)。
考虑了具有多于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)。
(vi)多价抗体
在一些实施方案中，抗体是多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快地被细胞内化(和/或分解代谢)，所述细胞表达所述抗体结合的抗原。本文提供的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(不同于 IgM类)(例如，四价抗体)，其可以通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或组成为)Fc区或铰链区。在这种情况下，抗体将包含Fc区和Fc区氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含(或组成为)三至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(优选两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2) n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链。X1和X2代表氨基酸或多肽，n为0或1。例如，多肽链可包含:VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选还包含至少两个(优选四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可以例如包含约2至约8个轻链可变结构域多肽。本文考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地，还包含CL结构域。
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体。多特异性抗体的实例包括但不限于包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中 VHVL单元具有多表位特异性；具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，每个VHVL单元结合不同的表位；具有两个或多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段如Fab，Fv，dsFv， scFv；双抗体，双特异性双抗体，三抗体，三功能抗体，共价或非共价连接的抗体片段。在一些实施方案中，该抗体具有多表位特异性；例如，特异性结合相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。在一些实施方案中，抗体是单特异性的；例如，仅结合一个表位的抗体。根据一个实施方案，多特异性抗体是IgG抗体，其以5μM至0.001pM,3μM至0.001pM, 1μM至0.001pM,0.5μM至0.001pM,或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位。
(vii)其他抗体修饰
可能需要在效应子功能方面修饰本文提供的抗体，例如，以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性 (CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。或者或另外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.,Immunol. 148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体也可以使用异双功能交联剂制备，如Wolff et al.,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中所述。或者，可以改造具有双Fc区的抗体，从而可以具有增强的补体介导的裂解和ADCC能力。参见Stevenson等， Anti-Cancer Drug Design3:219-230(1989)。
为了增加抗体的血清半衰期，可以在抗体中进行氨基酸改变，如US 2006/0067930中所述，其通过引用整体并入本文。
(B)多肽变体和修饰
本文所述的多肽(包括抗体)的氨基酸序列修饰可用于纯化本文所述多肽(例如抗体)的方法中。
(i)变体多肽
“多肽变体”意指如本文所定义的多肽，优选活性多肽，其与多肽的全长天然序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性；缺乏信号肽的多肽序列；多肽的有或没有信号肽的细胞外结构域。此类多肽变体包括，例如，在全长天然氨基酸序列的N或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，TAT多肽变体将与全长天然序列多肽序列、缺少信号肽的多肽序列、多肽的有或没有信号肽的细胞外结构域具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％任一个的氨基酸序列同一性。任选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守氨基酸取代，或者与天然多肽序列相比，不超过约 2,3,4,5,6,7,8,9或10个保守氨基酸取代中的任何一个。
变体多肽可以在N-末端或C-末端截短，或者可以缺少内部残基，例如，当与全长天然多肽比较时。某些变体多肽可能缺少对所需生物活性不是必需的氨基酸残基。具有截短，缺失和***的这些变体多肽可以通过许多常规技术中的任何一种制备。期望的变体多肽可以化学合成。另一种合适的技术涉及通过聚合酶链反应(PCR)分离和扩增编码所需变体多肽的核酸片段。限定核酸片段所需末端的寡核苷酸用于PCR中的5'和3'引物。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。
氨基酸序列***包括氨基-和/或羧基-末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N-或C-末端与酶或多肽的融合，所述酶或多肽增加抗体的血清半衰期。
例如，可能需要改善多肽的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，多肽氨基酸序列内残基的缺失，和/或***和/或取代。如果最终构建体具有所需特征，则进行缺失，***和取代的任何组合以得到最终构建体。氨基酸变化也可以改变多肽(例如抗体)的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。
通过比较多肽的序列与同源已知多肽分子的序列并最小化高同源性区域中做出的氨基酸序列变化的数目，可以找到确定哪些氨基酸残基可以***，取代或缺失而不会对所需活性产生不利影响的指导。
用于鉴定作为诱变优选位置的多肽(例如抗体)的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science 244:1081-1085(1989)所述。在此，鉴定残基或靶残基组(例如带电残基，例如Arg，Asp，His，Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)代替，以影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证明对取代具有功能敏感性的氨基酸位置然后通过在取代位点或为取代位点引入进一步的或其他变体来改进。因此，尽管预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点处突变的性能，在靶密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并筛选表达的抗体变体的所需活性。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。对于取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。保守取代在下面的表1中在“保守取代”的标题下显示。如果这样的取代导致生物活性的变化，那么可以引入在表1 中称为“示例性取代”或如下文参考氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化并筛选产物。
表1
Figure BDA0003679872070001141
Figure BDA0003679872070001151
通过选择取代来实现对多肽的生物学性质的实质性修饰，所述取代在维持(a)取代区域中多肽骨架的结构(例如，片层或螺旋构象)，(b) 在靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体的效果中显著不同。氨基酸可根据其侧链性质的相似性进行分组(A.L.Lehninger, Biochemistry second ed.,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975)):
(1)非极性:Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P),Phe(F), Trp(W),Met(M)
(2)不带电的极性:Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y), Asn(N),Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D),Glu(E)
(4)碱性:Lys(K),Arg(R),His(H)
或者，可以基于共同的侧链特性将天然存在的残基分成组:
(1)疏水性:正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的:Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性:Asp，Glu；
(4)碱性:His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly，Pro；
(6)芳香族:Trp，Tyr，Phe。
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别的成员。
不参与维持抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，通常用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以向多肽中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段如Fv 片段时)。
特别优选类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示进行亲和力成熟。简而言之，突变几个高变区位点(例如，6-7位点)以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示，作为与每个颗粒内包装的M13 的基因III产物的融合物。然后如本文所公开的筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和靶标之间的接触点可能是有益的。根据本文详述的技术，此类接触残基和相邻残基是取代的候选物。一旦产生了这样的变体，就将变体组进行如本文所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步开发。
多肽的另一种氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这种糖基化可以在宿主细胞或宿主生物体中多肽表达期间天然发生，或者可以是由人为干预引起的故意修饰。改变是指缺失多肽中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加多肽中不存在的一个或多个糖基化位点。
多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺 -X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺，半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是与丝氨酸或苏氨酸连接，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，可方便地完成向多肽添加糖基化位点。也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或取代到原始抗体的序列(对于O-连接的糖基化位点)来进行改变。
除去存在于多肽上的碳水化合物部分可以通过化学或酶促方法或通过编码作为糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来完成。可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。
其他修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化， N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。
(ii)嵌合多肽
可以以形成嵌合分子的方式修饰本文所述的多肽，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合物，所述标签多肽提供抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于多肽的氨基或羧基末端。可以使用针对标签多肽的抗体检测多肽的这种表位标记形式的存在。此外，表位标签的提供使得能够使用抗标签抗体或结合表位标签的另一类型的亲和基质通过亲和纯化容易地纯化多肽。
在一个备选实施方案中，嵌合分子可包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合物。二价形式的嵌合分子称为“免疫黏附素”。
如本文所用，术语“免疫黏附素”表示抗体样分子，其组合了异源多肽的结合特异性和免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能。在结构上，免疫黏附素包含具有所需结合特异性的不同于抗体的抗原识别和结合位点的氨基酸序列(即，是“异源的”)和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物。免疫黏附素分子的粘附素部分通常是连续的氨基酸序列，其至少包含受体或配体的结合位点。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白获得，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括 IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。
Ig融合物优选包括多肽的可溶性(跨膜结构域缺失或失活)形式代替 Ig分子内的至少一个可变区的取代。在特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链，CH2和CH3，或铰链，CH1，CH2和CH3区。
(iii)多肽缀合物
用于多肽制剂的多肽可以与细胞毒性剂缀合，所述细胞毒性剂为例如化学治疗剂，生长抑制剂，毒素(例如，细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
可以使用可用于产生这种缀合物的化学治疗剂。此外，可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A 链(来自铜绿假单胞菌)，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，塑莲根毒蛋白II A链，α-帚曲毒素，油桐(Aleuritesfordii)蛋白，香石竹毒蛋白蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜苦参碱抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂，多花白树毒蛋白，mitogellin，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素和tricothecenes。多种放射性核素可用于生产放射性缀合的多肽。实例包括212Bi,131I,131In,90Y,和186Re。使用多种双功能蛋白偶联剂制备多肽和细胞毒性剂的缀合物,所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)，亚氨基四氢噻吩(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸酯HCL)，活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)，醛(如谷胱甘肽)，双叠氮基化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双重氮基衍生物(如双-(对-重氮基苯甲酰基)- 乙二胺)，二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与多肽缀合的示例性螯合剂。
本文还考虑了多肽和一种或多种小分子毒素(例如加利车霉素，美登木素生物碱，三萜烯和CC1065)以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
美登木素生物碱是有丝***抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合起作用。美登素首先从东非灌木Maytenus serrata中分离出来。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯。还考虑了合成的美登醇及其衍生物和类似物。本领域已知有许多用于制备多肽-美登木素生物碱缀合物的连接基团，包括例如美国专利号5,208,020中公开的那些。连接基团包括二硫键基团，硫醚基团，酸不稳定基团，光不稳定基团，肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，如上述专利中所公开的，优选二硫键和硫醚基团。
取决于连接的类型，接头可以在多个位置连接到美登木素生物碱分子上。例如，可以使用常规偶联技术通过与羟基反应形成酯键。反应可以在具有羟基的C-3位置，用羟基甲基修饰的C-14位置，用羟基修饰的C-15 位置和具有羟基的C-20位置发生。在优选的实施方案中，连接在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成。
另一种目的缀合物包含与一种或多种加利车霉素分子缀合的多肽。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。对于加利车霉素家族的缀合物的制备，参见，例如，美国专利号5,712,374。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1I,α2I,α3 I,N-乙酰基 -γ1 I,PSAG和θ1 I。抗体可以缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸剂。加利车霉素和QFA都具有细胞内作用位点，并且不容易穿过质膜。因此，通过多肽(例如，抗体)介导的内化作用对这些药剂的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性作用。
可以与本文描述的多肽缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU，链脲霉素，长春新碱和5-氟尿嘧啶，已知共同称为LL-E33288复合物的药剂家族，以及埃斯波霉素(esperamicins)。
在一些实施方案中，多肽可以是多肽和具有核溶解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，例如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间的缀合物。
在另一个实施方案中，多肽(例如，抗体)可以与“受体”(例如链霉抗生物素蛋白)缀合以用于肿瘤预靶向，其中多肽受体缀合物被施用于患者，然后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，多肽可以与前药活化酶缀合，所述前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗剂)转化为活性抗癌药物。免疫缀合物的酶组分包括能够以这样的方式作用于前药以便将其转化为其更具活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用的酶包括但不限于可用于将含磷酸盐的前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸酯的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶，如serratia蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含有肽的前药转化为自由药物；D- 丙氨酰羧基肽酶，其可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物切割酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，可用于将糖基化前药转化为自由药物；可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为自由药物的β-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，可用于将分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基在其胺氮衍生的药物转化成自由药物。备选地，具有酶活性的抗体，在本领域中也称为“抗体酶”，可用于将前药转化为自由活性药物。
(iv)其他
多肽的另一种共价修饰包括将多肽与多种非蛋白质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。多肽也可以包埋在微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基-甲基丙烯酸酯)微胶囊)制备的微胶囊中，包埋在胶体药物递送***(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或包埋在宏乳液中。这些技术在 Remington'sPharmaceutical Sciences,18th edition,Gennaro,A.R., Ed.,(1990)中公开。
IV.获得用于制剂和方法的多肽
可以使用本领域熟知的方法，包括重组方法，获得本文所述分析方法中使用的多肽。以下部分提供有关这些方法的指导。
(A)多核苷酸
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。
编码多肽的多核苷酸可以从任何来源获得，包括但不限于从被认为具有多肽mRNA并以可检测的水平表达其的组织制备的cDNA文库。因此，编码多肽的多核苷酸可以方便地从人组织制备的cDNA文库中获得。编码多肽的基因也可以从基因组文库中获得或通过已知的合成方法(例如，自动化核酸合成)获得。
例如，多核苷酸可以编码完整的免疫球蛋白分子链，例如轻链或重链。完整的重链不仅包括重链可变区(VH)，还包括重链恒定区(CH)，其通常包含三个恒定结构域:CH1，CH2和CH3；和“铰链”区。在某些情况下，需要存在恒定区。
可以由多核苷酸编码的其他多肽包括结合抗原的抗体片段，例如单结构域抗体(“dAb”)，Fv，scFv，Fab'和F(ab')2和“微抗体”。微抗体是(通常)切除CH1和CK或CL结构域的二价抗体片段。由于微抗体比常规抗体小，它们应该在临床/诊断用途中实现更好的组织穿透，但是它们是二价的，它们应该保持比单价抗体片段(例如dAb)更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有规定，否则本文所用的术语“抗体”不仅包括完整的抗体分子，还包括上述类型的结合抗原的抗体片段。优选地，编码多肽中存在的每个构架区相对于相应的人受体构架将包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体构架区，构架区可总共包含三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十一个，十二个，十三个，十四个或十五个氨基酸取代。
V.示例性实施方案
实施方案1.在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中在定量期间非离子表面活性剂和多肽之间的干扰减少，其中该方法包括以下步骤:
a)将组合物施加到混合模式阴离子交换层析材料中，其中将组合物加样到包含流动相A和流动相B的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，并且流动相B包含酸的甲醇溶液，其中所述多肽特异性和非特异性地与层析材料结合；
b)用包含流动相A和流动相B的溶液从混合模式阴离子交换层析材料中洗脱多肽，其中与步骤a)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
c)用包含流动相A和流动相B的溶液从所述层析材料中洗脱非离子表面活性剂和非特异性结合的多肽，其中与步骤c)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
d)定量非离子表面活性剂，其中定量期间非离子表面活性剂和多肽之间的干扰减少了。
实施方案2.在实施方案1的一些其他实施方案中，步骤a)中流动相 B与流动相A的比例为约10:90。
实施方案3.在实施方案1或2的一些其他实施方案中，在步骤b)中流动相B与流动相A的比例增加至约40:60。
实施方案4.在实施方案1-3中任一个的一些其他的实施方案中，在步骤c)中流动相B与流动相A的比例增加至约100:0。
实施方案5.在实施方案1-4中任一个的一些其他的实施方案中，流动相A包含约2％酸的水溶液。
实施方案6.在实施方案1-5中任一个的一些其他实施方案中，流动相 B包含约2％酸的甲醇溶液。
实施方案7.在实施方案1-6中任一个的一些其他实施方案中，酸是甲酸。
实施方案8.在实施方案1-6中任一个的一些其他实施方案中，酸是乙酸。
实施方案9.在实施方案1-8中任一个的一些其他实施方案中，层析的流速为约1.25mL/分钟。
实施方案10.在实施方案9的一些其他实施方案中，步骤b)在层析开始后约1分钟开始，并在层析开始后约3.4分钟结束。
实施方案11.在实施方案9或10的一些其他实施方案中，步骤c)在层析开始后约3.5分钟开始，并在层析开始后约4.6分钟结束。
实施方案12.在实施方案1-11中任一个的一些其他实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。
实施方案13.在实施方案12的一些其他实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
实施方案14.在实施方案1-13中任一个的一些其他实施方案中，组合物中非离子表面活性剂的浓度为约0.001％-1.0％(w/v)。
实施方案15.在实施方案1-14中任一个的一些其他实施方案中，组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。
实施方案16.在实施方案1-15中任一个的一些其他实施方案中，制剂具有约4.5至约7.5的pH。
实施方案17.在实施方案1-16中任一个的一些其他实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。
实施方案18.在实施方案1-17中任一个的一些其他实施方案中，所述组合物是适合施用于受试者的药物制剂。
实施方案19.在实施方案1-18中任一个的一些其他实施方案中，多肽是治疗性多肽。
实施方案20.在实施方案16的一些其他实施方案中，治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或 THIOMABTM药物缀合物。
实施方案21.在实施方案1-20中任一项的一些其他实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。
实施方案22.在实施方案1-21中任一项的一些其他实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。
实施方案23.在实施方案1-22中任一项的一些其他实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。
实施方案24.在实施方案1-23中任一个的一些其他实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料包含在柱中。
实施方案25.在实施方案1-24中任一项的一些其他实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。
实施方案26.在实施方案1-25中任一个的一些其他实施方案中，混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070001241
MAX层析材料。
实施方案27.在实施方案1-26中任一个的一些其他实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
实施方案28.在一些实施方案中，提供了用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中该方法包括以下步骤:
a)将组合物施加到混合模式阳离子交换层析材料中，其中将组合物加样到包含流动相A和流动相B的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵水溶液并且流动相B包含氢氧化铵在有机溶剂中的溶液；
b)用包含流动相A和流动相B的溶液从混合模式阳离子交换层析材料中洗脱多肽，其中与步骤a)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
c)用包含流动相A和流动相B的溶液从层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中与步骤c)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
d)定量非离子表面活性剂。
实施方案29.在实施方案28的一些其他实施方案中，流动相B的有机溶剂是甲醇。
实施方案30.在实施方案28或29的一些其他实施方案中，步骤a)中流动相B与流动相A的比例为约10:90。
实施方案31.在实施方案28-30中任一个的一些其他实施方案中，在步骤b)中，流动相B与流动相A的比例增加至约45:55。
实施方案32.在实施方案28-31中任一个的一些其他的实施方案中，在步骤c)中，流动相B与流动相A的比例增加至约100:0。
实施方案33.在实施方案28-32中任一项的一些其他实施方案中，流动相A包含约2％的氢氧化铵水溶液。
实施方案34.在实施方案28-33中任一项的一些其他实施方案中，流动相B包含约2％的氢氧化铵的甲醇溶液。
实施方案35.在实施方案28-34中任一个的一些其他实施方案中，层析的流速为约1.4mL/分钟。
实施方案36.在实施方案35的一些其他实施方案中，步骤b)在层析开始后约1分钟开始，并在层析开始后约4.4分钟结束。
实施方案37.在实施方案35或36的一些其他实施方案中，步骤c)在层析开始后约4.5分钟开始并在层析开始后约7.6分钟结束。
实施方案38.在实施方案28-37中任一项的一些其他实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。
实施方案39.在实施方案38的一些其他实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
实施方案40.在实施方案38或39的一些其他实施方案中，组合物中聚山梨醇酯的浓度为约0.001％至1.0％(w/v)。
实施方案41.在实施方案28的一些其他实施方案中，流动相B的有机溶剂是乙腈。
实施方案42.在实施方案41的一些其他实施方案中，步骤a)中流动相B与流动相A的比例为约10:90。
实施方案43.在实施方案41或42的一些其他实施方案中，步骤b)中流动相B与流动相A的比例增加至约40:60。
实施方案44.在实施方案41-43中任一个的一些其他实施方案中，步骤c)中流动相B与流动相A的比例增加至100:0。
实施方案45.在实施方案41-44中任一项的一些其他实施方案中，流动相A包含约2％的氢氧化铵水溶液。
实施方案46.在实施方案41-45中任一项的一些其他实施方案中，流动相B包含约2％的氢氧化铵的乙腈溶液。
实施方案47.在实施方案41-46中任一项的一些其他实施方案中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。
实施方案48.在实施方案48的一些其他实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。
实施方案49.在实施方案48或49的一些其他实施方案中，组合物中泊洛沙姆的浓度为约0.001％至1.0％(w/v)。
实施方案50.在实施方案28-49中任一个的一些其他实施方案中，组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。
实施方案51.在实施方案50的一些其他实施方案中，组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM。
实施方案52.在实施方案50的一些其他实施方案中，组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM。
实施方案53.在实施方案28-52中任一个的一些其他实施方案中，组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。
实施方案54.在实施方案28-53中任一项的一些其他实施方案中，制剂具有约4.5至约7.5的pH。
实施方案55.在实施方案28-54中任一个的一些其他实施方案中，组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。
实施方案56.在实施方案28-55中任一个的一些其他实施方案中，组合物是适合施用于受试者的药物制剂。
实施方案57.在实施方案28-56中任一个的一些其他实施方案中，多肽是治疗性多肽。
实施方案58.在实施方案57的一些其他实施方案中，治疗性蛋白质是多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM和THIOMABTM药物缀合物。
实施方案59.在实施方案28-58中任一项的一些其他实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。
实施方案60.在实施方案28-59中任一项的一些其他实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。
实施方案61.在实施方案28-60中任一个的一些其他实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。
实施方案62.在实施方案28-61中任一个的一些其他实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。
实施方案63.在实施方案28-62中任一个的一些其他实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。
实施方案64.在实施方案28-63中任一个的一些其他实施方案中，混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070001271
MCX层析材料。
实施方案65.在实施方案28-64中任一项的一些其他实施方案中，通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量非离子去污剂。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同，等同或类似目的的备选特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或类似特征的示例。
通过以下非限制性实施例说明本发明的进一步细节。说明书中所有参考文献的公开内容明确地通过引用并入本文。
具体实施方式
以下实施例旨在纯粹是本发明的示例，因此不应认为是以任何方式限制本发明。提供以下实施例和详细描述是为了说明而不是为了限制。
实施例的材料和方法
除非另有说明，否则以下材料和方法用于实施例。
材料
使用稳定的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或大肠杆菌细胞制备所有mAb (A1-A20)。
Waters
Figure BDA0003679872070001281
MAX柱体(2.1x20mm，30μm粒径，PN#186002052) 和Waters
Figure BDA0003679872070001282
MCX柱体(2.1x20mm，30μm粒径，PN#186002051) 购自Waters。聚山梨醇酯20得自Sigma(P/NT2700-100ML)。从Fluka(P/N 94318-250ML-F)获得甲酸。从JT Baker(P/N 9515-03)获得HPLC级冰醋酸。从OmniSolv获得HPLC级异丙醇(P/N PX1834-1)和甲醇(P/N MX0488-1)。从HoneyWell(目录号365-4)获得HPLC级水。从Spectrum Chemicals(P/N AM180)获得27-31％的氨溶液。
实施例1.优化
需要更稳健的解决方案来消除蛋白质干扰并在所有HPLC柱体批次上产生一致的PS20定量。作为起点，在用本发明的方法评估其他分子之前，使用抗体药物缀合物(ADC)制剂来评估对先前方法的修饰的有效性。该实验的目的是开发PS测定以允许通过最小化或完全去除蛋白质的干扰来跨多种产品制剂稳健定量PS20，以证明与先前测定相比，本发明的测定提高了PS20定量的准确性和再现性，包括在多批次柱体之间的稳健性，以及进行资格研究来评估PS20在选择产品制剂中的准确性，精确性，特异性，重复性和中间精密度。
方法
对于所有实验，使用以下ELSD设置:
光源强度(LED)设定为75％
检测器增益(PMT)设置为1
在HPLC测定中，PS20酯保留在柱体中，而其他赋形剂，蛋白质和非酯化的PS20种类在流穿或洗涤步骤中洗脱。在洗涤步骤之后，使用转向阀使蒸发光散射检测器(ELSD)在线(in-line)放置，并且用较高％有机相的分步梯度洗脱酯化的聚山梨醇酯种类。非酯化的PS20种类占总PS20组合物的约20％(Hewitt,D.et al.,2011,J.Chromatography A,1218:2138-2145)。HPLC-ELSD测定仅定量PS20酯，这是足够的，只要用于制备标准品的PS20批次与样品中的PS20相比含有相似量的PS20酯。标准品的类似PS20酯组成可通过等同方案(Hewitt,D.et al.,2011,J. Chromatography A,1215:156-160)或通过将用于制备标准品的PS20批次与在样品中使用的批次匹配来确保。
原始方法(也称为方法0)的HPLC-ELSD条件如下:Agilent 1200 HPLC 和Varian380 ELSD；柱体是Waters Oasis MAX在线柱体；流动相A是2％甲酸水溶液；流动相B是2％甲酸的异丙醇溶液；流速为1mL/min；注射体积为20μL。使用的梯度如表2所示。
表2:方法0梯度
Figure BDA0003679872070001291
Figure BDA0003679872070001301
下面总结了最终方法，也称为方法1，以粗体/下划线标出的原始方法的修改。表3显示了LC梯度，表4显示了该测定的典型注射顺序。
HPLC-ELSD条件如下:Agilent 1200 HPLC和Varian 380 ELSD；柱体是WatersOasis MAX在线柱体；流动相A是2％甲酸水溶液或2％乙酸水溶液；流动相B 是2％甲酸的异丙醇溶液或2％乙酸的甲醇溶液；流速为1.25mL/min；注射体积为20μL(取决于PS20浓度范围)。尽管最终选择乙酸作为最终条件，但最初在流动相中使用2％甲酸进行了一些定性和稳健的工作。
表3:方法1梯度
时间(分钟) ％流动相A ％流动相B 步骤描述
0 90 10 上样
1 60 40 洗涤
3.4 60 40 洗涤
3.5 0 100 洗脱
4.6 0 100 洗脱
4.7 90 10 平衡
6.6 90 10 平衡
表4:典型顺序
Figure BDA0003679872070001311
方法优化
1.最初尝试的条件:
在方法1开发过程中，在选择最终的基于甲醇的流动相之前评估许多不同的实验条件，目的是最小化蛋白质干扰的影响。这些实验总结在表5 中。
表5:其他尝试解决方案的简要概述(除非另有说明，否则流动相中的甲酸)
Figure BDA0003679872070001312
Figure BDA0003679872070001321
方法稳健性实验
表6和表7描述了用于测试多个产品间的方法稳健性的产品和柱体。
表6:比较九个柱体间的方法准确度时测试的产品
Figure BDA0003679872070001322
Figure BDA0003679872070001331
表7:用于方法稳健性测试的吸附剂批和批次
Figure BDA0003679872070001332
1.柱体间的方法稳健性:
表8描述了用于评估12种参考标准品(表9中所示)的方法稳健性的柱体，使用两种不同的柱体:一种在方法0中提供可接受的特异性，另一种在方法0中提供不可接受的特异性。表8中提供的柱体号对应于表7中提供的那些号。
表8:用于说明多个产品间的方法稳健性的柱体
柱体 性能 吸附剂批次 批# HPLC/ELSD***
1 可接受的 57 57333161 Agilent/Agilent
5 不可接受的 49 49321291 Agilent/Agilent
表9:参考标准组(20μL注射)
Figure BDA0003679872070001341
方法定性
通过评估线性，准确度，精密度(包括中间精密度)和特异性来完成方法定性。表10描述了用于中间精密度的仪器和柱体。
表10:中间精密度的条件
天 ***(HPLC/ELSD) 柱体号(表7) 分析人员
1 Agilent 1200/Agilent 380 1 1
2 Waters 2695/Varian 380 5 1
3 Agilent 1200/Agilent 380 7 2
结果:
方法优化
多步梯度实验:
在评估不同流动相评估期间，需要一种方法来确定聚山梨醇酯是否可以与典型蛋白质制剂的其他成分完全分离。为了进行该分析，进行了多步梯度实验(图1)。这些实验需要由在10％有机溶剂中的2％挥发性酸(甲酸，三氟乙酸或乙酸)组成的流动相平衡柱体，以5％的步长增加流动相中有机溶剂的浓度，并保持在各浓度1分钟，以模拟PS20定量方法的洗涤步骤。重复这些5％步长直至达到98％有机(+2％挥发性酸)流动相。在该方法期间保持1mL/min的恒定流速。用PS20游离蛋白样品进行这些实验，以确定完全洗脱除PS20之外的制剂的所有成分的流动相组成，以及用于测定开始洗脱PS20酯种类的流动相组成的PS20标准品水溶液。比较这两种流动相有机溶剂浓度以确定是否可以发现完全分离蛋白质基质成分和聚山梨醇酯的最佳流动相组成。在分析方法的洗涤步骤期间将使用该最佳流动相组成以除去可能保留在柱体中的任何蛋白质。由于两个原因，多步梯度比线性梯度更理想。首先，线性梯度不模拟该方法的洗涤步骤，其次，难以确定在线性梯度期间引起每种成分洗脱的离散流动相组成。
多步梯度实验显示，从柱体中洗涤蛋白质但保留PS20酯种类的最佳甲醇浓度为40％至50％之间(图1和图2)。值得注意的是，2％的甲酸仍处于流动相。测试了40％和50％甲醇洗涤步骤，并且都消除了来自A1 ADC的蛋白质干扰。具有40％甲醇洗涤的PS20峰面积比具有50％甲醇洗涤的PS20峰平均高38％(n＝8)。因此，选择40％甲醇来提高PS20的灵敏度。具有50 ％洗涤的较低峰面积可以表明在蛋白质洗涤步骤期间一些较不疏水的PS20 酯被洗脱，但是没有进一步研究这种可能性。
图1显示了典型的分步梯度叠加(不含PS20产品和PS20标准品)的实例。该叠加图显示所有蛋白质用40％-50％甲醇洗脱，PS20酯开始在50％甲醇洗脱。请注意，HPLC和ELSD之间的阀门在蛋白质样品的第一分钟内处于转向模式，以避免检测器的饱和。PS20标准品中显示的多个峰很可能归因于从柱体中洗脱的不同聚山梨醇酯种类，以增加疏水性。在每个步骤变化时洗脱的不同蛋白质峰尚未表征。这种叠加提供了一种快速方法，以找到甲醇的最佳浓度，从而在保留PS20酯的同时从柱体中洗涤蛋白质。
使用异丙醇重复多步梯度实验，以比较蛋白质和PS20区域的洗脱与甲醇。图2显示了在两种不同的柱体上，不含PS20的A1 ADC和PS20标准品的甲醇和异丙醇的不同多步洗脱曲线。先评估过第一个柱体(迹线1)；第一个柱体通常通过方法0正常进行(迹线1)，但第二个柱体不是最佳的(迹线2)。用异丙醇进行的多步梯度实验表明，洗涤步骤中的最佳异丙醇浓度为20％。这与方法0一致，方法0使用20％异丙醇洗涤1至3.4分钟。然而，蛋白质和 PS20酯与异丙醇洗涤物的分离在不同的柱体中不一致，并且说明了从柱体到柱体的蛋白质干扰的可变性。在某些柱体(例如，图2中使用的柱体)上，一部分蛋白质以与PS20酯相同的异丙醇浓度洗脱。这种行为表明，当用异丙醇方法定量PS20时，这些特定的柱体会表现出显著量的蛋白质干扰，并且这种效果在实验上得到证实。
与图2的下图相反，上图显示不同柱体上的甲醇多步梯度通过40％甲醇步骤一致地洗脱所有蛋白质，PS20酯类从50％甲醇开始，说明与异丙醇分步梯度相比，蛋白质区域与PS20区域的分离窗口比较宽。该结果表明，使用40％甲醇洗涤将始终将蛋白质与PS20酯分离，从而降低柱体之间PS20定量的可变性。
使用多步梯度实验来快速评估PS20和蛋白质在不同的柱体和流动相组合物间的分离(图1和图2)。
该方法成功地确定了PS20测定的洗涤条件，并且可以潜在地用于评估洗涤步骤用于使用不同的柱体和流动相分离其他分析物的有效性。
实验设计:
使用2级全因子实验设计(DoE)来优化含有甲酸的改良PS20方法。检查的参数如下:
洗涤步骤中的甲醇浓度(40％，50％)
洗涤时间(1.8分钟，3.0分钟)
流速(0.75mL/min，1.25mL/min)
装载的PS20的质量(4μg，12μg)
注意，“洗涤”步骤是指HPLC方法的一部分，其中有机浓度保持恒定以洗涤来自柱体的任何残留蛋白质。除了2级全因子排列之外，在顺序的开始和结束时测试中点(45％有机洗涤，2.4分钟洗涤持续时间，1mL/min流速，8μg PS20负载)。该实验分别针对三个样品运行:水中的PS20，不含 PS20的A1 ADC和掺入不含PS20的A1 ADC中的PS20。对于不含PS20的A1 ADC 样品，PS20负载参数不适用。
用于优化的标准如下:
最小化PS20保留时的蛋白质干扰(仅对于不含PS20的A1 ADC样品)
最大化蛋白质和PS20峰之间的分辨率(对于PS20+A1 ADC样品)
最小化在10％峰高时PS20峰宽(水样中的PS20)
最大化PS20峰面积(水样中的PS20)
DoE的结果显示所有测试条件消除了蛋白质干扰。注射不含PS20的A1 ADC时未观察到蛋白质干扰。类似地，发现蛋白质和PS20峰之间的分辨率对于所有情况都大于3，其中分辨率通过以下等式计算(等式1):
等式1:分辨率
Figure BDA0003679872070001381
其中t是每个峰的保留时间，W50％是50％高度处的峰宽。
因为对于所有测试条件没有观察到对蛋白质干扰或分辨率的影响，所以针对灵敏度和峰形状优化PS20峰面积和宽度。流速，甲醇洗涤浓度和洗涤时间对PS20峰面积和宽度的影响的总结在图3中示出。增加流速降低PS20 峰宽，并且在洗涤步骤中将甲醇浓度从50％降低至40％使PS20峰面积增加 38％。使用50％甲醇洗涤，在洗涤步骤中洗脱另外的PS20峰，保留时间晚于非酯化PS20种类，并且怀疑这个额外的峰是由于疏水性较弱的PS20酯的较早洗脱。最相关的发现是PS20峰面积随着洗涤阶段中MeOH浓度的增加而降低，并且增加的流速降低了峰宽。
图4中示出了40％和50％甲醇洗涤的比较。用45％甲醇洗涤不存在约 1.8-3.5分钟的额外峰。发现测试的PS20负载对任何评估标准没有影响。选择最低甲醇洗涤浓度(40％)，最高流速(1.25mL/min)和中点洗涤时间 (2.4min)作为方法1的优化参数。所选择的最终条件示于表3中。
方法稳健性实验
一旦使用多步梯度实验确定最佳甲醇洗涤浓度，测试方法1(甲酸+甲醇)相对于方法0(甲酸+异丙醇)的改进。
产品间的方法稳健性
为了进一步比较方法1(甲酸+甲醇)和方法0(甲酸+异丙醇)之间蛋白质干扰的影响，使用2个柱体在12种不同的参考标准中定量PS20。选择柱体使得一个柱体(柱体1)被认为是可接受的，使用方法0产生准确的结果，并且由于使用方法0的高水平蛋白质干扰，一个柱体(柱体5)被认为是不可接受的。该实验的目标是证明方法1减少多种产品的“可接受”和“不可接受”柱体之间的可变性的程度。使用每种方法的PS20定量的一致性分别在表8和表9中的方法中描述的柱体和参考标准上进行比较。
表11中列出了每种方法的参考标准及其测量的PS20浓度。没有计算每种方法的准确度，因为对于每个参考标准，A的C中列出的PS20浓度不能作为理论值处理，如在加标样品的情况下所做的。因此，不能为这些参考标准评估每种方法的准确性。
表11:方法的比较:各种参考标准的测量的PS20浓度中的柱体间差异
Figure BDA0003679872070001401
*FA＝甲酸
**通过等式2计算每种方法的PS20定量中的绝对％差异
表11中的数据显示，在流动相中使用甲醇的两个柱体之间PS20定量的差异始终小于5％。相比之下，在流动相中使用异丙醇时PS20定量的差异表明柱体之间的可变性程度要大得多。方法0(甲酸+异丙醇)对柱体变化更敏感。表11中的数据表明，在流动相中使用甲酸+甲醇可以对于所有产品在不同柱体中产生更一致的PS20定量，无论柱体在方法0中的表现如何。PS20 定量的绝对％差异使用等式2计算:
等式2:PS20定量的绝对％差异
|100*(柱体5浓度]-[柱体1浓度])/[柱体1浓度]|
柱体间的方法稳健性
通过用四种产品测试九个柱体间的两种条件来比较方法0和方法1(甲酸+甲醇)。将PS20以每种产品的目标制剂浓度的50％掺入不含PS20的蛋白质基质中。该方法代表了基于分析验收标准证书，测定法定量每种产品所需要的最低PS20浓度。通过将PS20掺入水中来制备标准品和对照品。使用两个HPLC/ELSD***(Agilent 1200/Agilent 380和Waters2695/Varian 380)进行测试。所测试的产品和柱体分别在方法部分，表6和表7中详细描述。经过测试的柱体经过精心挑选以涵盖广泛的批次，年龄和历史性能。
测试不含PS20产物的样品和PS20掺入样品以分别评估蛋白质对PS20测定的干扰和PS20定量的准确性。A1 ADC，A2，A3和A4样品在9个柱体上用甲酸+甲醇和甲酸+异丙醇(方法0)进行测试。表12中显示了使用这两种方法在所有柱体间的平均回收率，相对标准差和范围。
表12:在9个Waters
Figure BDA0003679872070001411
MAX柱体间掺入不含PS20的蛋白的PS20的回收率和％RSD。
Figure BDA0003679872070001412
Figure BDA0003679872070001421
表12说明在流动相中使用甲醇改善了PS20定量的准确度(平均回收率接近100％)并且降低了柱体之间的可变性(％RSD降低)。这些数据表明，在流动相中使用甲醇代替异丙醇特别适用于A1 ADC和A2制剂中的PS20定量。A4制剂中PS20的偏向过度回收可能是由于信噪比降低，在柱体中仅装载1μg的PS20(20μL注射，0.05mg/mL PS20浓度)。在R&D方法鉴定(甲酸+甲醇)期间使用增加的PS20负载(50μL注射)，并且未观察到过度回收。
当在流动相中使用甲醇时观察到A3的过度回收，然而，这仍然是对异丙醇流动相的改进。假设该分子的低pI部分地归因于其谷胱甘肽上唾液酸基团的丰度增加，所述低pI通过在固定相的带正电荷的季胺基团上的静电吸引引起蛋白质的保留。
进一步方法优化
流动相酸的选择
使用基于甲醇的流动相和不同流动相有机酸的分步梯度进行实验，以确定关于最小化蛋白质干扰的方法的最佳添加剂。使用不含PS20的A1 ADC 和不含PS20的A10 ADC，使用甲酸，乙酸或三氟乙酸用ELSD检测进行甲醇分步梯度实验，以监测酸对蛋白质洗脱的影响。PS20标准品的水溶液用于监测PS20的保留。
改变流动相添加剂可以深入了解蛋白质如何保留在柱体上。图5,6和7 分别显示了不含PS20的ADC和PS20标准品的甲醇多步梯度叠加，在流动相中分别使用三氟乙酸，甲酸和乙酸。对于所有流动相添加剂，PS20酯开始在 50％甲醇下洗脱。图5显示了在流动相中使用三氟乙酸的不含PS20的A10 ADC和PS20标准品。蛋白质洗脱在约80％甲醇下完成。因此，大部分蛋白质与PS20酯共洗脱并干扰PS20定量。图6显示了不含PS20的A1 ADC和PS20标准品，在流动相中含有甲酸。蛋白质在约40％甲醇下完全洗脱，表明40％甲醇洗涤将蛋白质与聚山梨醇酯分离。该结果与已开发的方法1一致。图7显示了不含PS20的A1 ADC和PS20标准品，在流动相中含有乙酸。在这种情况下，蛋白质被15％甲醇完全洗脱。该发现表明，蛋白质可以通过15％-50 ％范围的任何甲醇洗涤与PS20酯分离。这些流动相添加剂的离子配对强度如下:三氟乙酸>甲酸>乙酸。相应地，随着离子配对剂在流动相中的强度增加，蛋白质被更强地保留，如蛋白质通过疏水相互作用与反相固定相结合所预期的那样。
不受理论束缚，酸性流动相的低pH在蛋白质上产生净正电荷。带正电的蛋白质与带正电的
Figure BDA0003679872070001431
MAX固定相的相互作用应该是库仑不利的，导致蛋白质不被固定相保留。相反，离子配对流动相添加剂可以与蛋白质相互作用以有效地使蛋白质更加疏水(Xindu,G.,&Regnier,F.E.Journal of Chromatography A,296:15-30,1984)。这种相互作用将使蛋白质通过疏水相互作用机制与足够强的离子配对剂(例如TFA)保留在柱体中。降低流动相中离子配对剂的强度将随后降低蛋白质/固定相相互作用。作为三种测试的最弱的离子配对剂，流动相中的乙酸似乎显著降低了柱体上的蛋白质保留。因此，作为流动相添加剂的乙酸允许蛋白质和PS20酯之间比所测试的其他添加剂更好地分离。
图8显示了作为流动相添加剂的乙酸和甲酸之间的分析方法性能的比较。如图8所示，与用甲酸作为流动相添加剂的水注射相比，观察到蛋白质注射的基线非常小的增加(～3mV)。虽然这种干扰被认为是最小的，但是观察到当乙酸是流动相中的添加剂时，蛋白质基质注射不会增加ELSD基线。此外，为了诊断目的监测280nm处的吸光度，以观察蛋白质保留和清除。当在流动相中使用乙酸时，蛋白质在空体积中几乎完全被清除，而当甲酸用作添加剂时蛋白质微弱地保留在柱体上，并且在1-2分钟之间的保留时间洗脱。因为LC流在2.4分钟时被转向到ELSD中，所以当甲酸是添加剂时蛋白质不会被完全清除的可能性增加，从而允许一定的蛋白质干扰。
使用乙酸+甲醇洗脱条件的不同柱体(参见表7的批次特定细节)的代表性层析图示于图9中。尽管来自柱体1的峰形是典型的(迹线1)，但这些数据表明PS20峰曲线可以在不同的柱体间变化。在某些柱体上，例如柱体4 (迹线2)，PS20峰倾向于尾部；随着该柱体的进一步使用，拖尾最终可能成为PS20峰***(迹线3)。这种行为并不常见，因为柱体2(数据未显示) 和4是唯一测试的柱体，其在整个方法开发过程中表现出峰***。在其他情况下，例如柱体5(迹线4)，观察到轻微的峰拖尾。顺便说一下，当在流动相中使用异丙醇时，显示出增加的峰拖尾和与甲醇流动相的峰***的柱体也会受到蛋白质干扰水平的增加。该发现可能表明显示增加的峰拖尾的柱体更强地保留疏水分子。无论峰形如何，PS20定量和整合处理方法都不受影响。
用于PS20定量的最终方法1将在流动相中用2％乙酸实施，因为其相对于
Figure BDA0003679872070001441
MAX柱体上的甲酸显示改善蛋白质和PS20的分离(图9)。
方法鉴定
在使用分步梯度实验来优化洗涤步骤和进行方法稳健性实验后，发现在流动相中使用2％乙酸代替2％甲酸改善了蛋白质和PS20酯的分离。因此，该实施例描述了用甲酸/甲醇流动相(来自初始方法开发)和乙酸/甲醇流动相(最终方法)进行的鉴定实验。
用于鉴定测定法的方法与方法0中的HPLC-ELSD测定法一致，除了以下参数之外:
流速＝1.25mL/min
流动相A＝2％甲酸水溶液或2％乙酸水溶液
流动相B＝甲醇中的2％甲酸或甲醇中的2％乙酸
使用表3中的梯度。
根据制剂中PS20的浓度调节注射体积，以在柱体上产生相似的负荷。见表13。
使用不含PS20的A1 ADC，不含PS20的A1，不含PS20的A4，不含PS20的 A5和不含PS20的A11进行鉴定研究。将已知量的PS20掺入每个样品中以确定测定的准确性。评估测定(每种产品使用的添加剂参见表13)的准确度，精密度，特异性，可重复性和中间精密度。
准确度和精密度:
将PS20(Lot MKBL2646V)以已知浓度(产物依赖性；参见表13)掺入不含PS20的蛋白质样品中，以确定测定的准确度。使用高浓度PS20储备溶液(25mg/ml)进行该实验，从而使通过掺加稀释蛋白质被最小化。对于每种浓度，将掺加PS20的样品一式三份注射，除非另有说明。PS20回收率用于确定PS20定量的准确度。平均回收率范围用于确定精密度。还确定了在指定范围内的线性(表13)。表13显示掺入每种产品中的PS20的浓度。注意，在III期制剂锁定之前，使用2个范围的DNIB0600S来覆盖最坏情况(即最低)PS20浓度(0.4mg/ml)和更高浓度(0.7mg/ml)。使用两个单独的范围是因为需要改变ELSD设置以便在0.2mg/ml-1mg/ml PS20的范围内精确定量PS20。对于每个范围，改变注射体积，而不是改变检测器设置。制剂锁定后，使用单一范围对最终制剂(1.2mg/mL PS20)和更高蛋白质浓度 (40mg/mL)进行另一次评估。
表13:方法鉴定期间评估的产品
Figure BDA0003679872070001461
*在三种PS20浓度下重复注射
每组浓度的标准品由PS20水溶液制成。在蛋白质样品之前一式两份注射标准品。测试物品每第6次注射用PS20的水对照样品加括号(bracketed)。PS20对照与标准品(来自PS20 Lot MKBJ7237V)分开制备。选择标准品浓度以涵盖掺入每种不含PS20的蛋白质产物中的PS20浓度范围。
基于每种产品的药物制剂的可能或实际PS20浓度来选择PS20对照的浓度。表14显示了在每个浓度范围内用于分析的标准品和对照PS20样品的浓度。
表14:用于每种产品的标准品曲线和对照的PS20浓度
Figure BDA0003679872070001471
对多种产品测试方法1的准确度和精密度。可接受的准确度结果应表明，每个加标浓度的平均回收率为80％-120％。每种产品的结果显示在表 15中。
表15:平均回收％和范围
Figure BDA0003679872070001472
Figure BDA0003679872070001481
如表15所示，在所有浓度下，所有测试产品的平均回收率均符合接受标准(80％-120％)，范围为82.4％至114.8％。因此，该测定证明了所测试的PS20范围内所有产品的可接受的准确度和精密度。
由于注射体积变化，测定范围也可以用PS20质量(而不是制剂中的PS20 浓度)表示。这些结果表明，1.25(0.025μg/μL x 50μL)–16μg(1.60 μg/μL x 10μL)的PS20可以加样到柱体上并准确定量。
线性
通过确定Pearson相关系数(r)>0.99来评估线性。对于每种PS20浓度范围，这些值显示在表16中。
表16:PS20浓度范围内的Pearson相关系数
Figure BDA0003679872070001482
Figure BDA0003679872070001491
对于测试的PS20范围，Pearson相关系数的所有值均≥0.99。因此，在多种产品间，线性对于该测定法是可接受的。
特异性:
通过确认注射不含PS20的制剂缓冲液和不含PS20的产品将对PS20峰没有贡献，确认了9种产品的特异性。一式两份进行配制缓冲液和不含PS20 的蛋白质样品的注射。将不含PS20的配制缓冲液和不含PS20的蛋白质基质中的峰面积与在50％每种产品的目标PS20浓度下的标准品响应进行比较。如果不含PS20的样品中的峰面积≤最低标准品中峰面积的10％，则满足接受标准。当在PS20区域中可见一些蛋白质干扰时，使用以下等式得出特异性的数值估计:
等式3:特异性计算
特异性＝(不含PS20蛋白的面积/50％的PS20规格的面积)*100
如图10(使用A1 ADC)所示，不含PS20制剂缓冲液和不含PS20蛋白样品都不会干扰PS20峰。表17中给出了所有其他产品的特异性值。因为在甲酸方法鉴定实验后为A1 ADC选择了目标PS20浓度，所以使用较低的目标 PS20浓度来计算样品的特异性(用星号表示)。使用较低的目标PS20浓度将导致更高的特异性值，但报告的所有值仍然远低于10％。
表17:特异性
Figure BDA0003679872070001501
N/A:不含PS20的蛋白质注射与水注射相同。
可重复性:
将含有掺入20mg/mL不含PS20的A1 ADC中的0.4mg/mL PS20和含有掺入 150mg/mL不含PS20的A14/A15中的0.3mg/mL PS20的样品注射6次。这些注射的PS20峰面积和相应的浓度显示在表18中。重复注射的面积和浓度的％RSD 表明可接受的注射重复性。
表18:注射重复性
Figure BDA0003679872070001502
Figure BDA0003679872070001511
对于重复注射的面积和浓度的％RSD证明了测定的可重复性。
中间精密度:
在两种不同的HPLC-ELSD***上，用3种不同的PS20标准品和缓冲剂制剂，以及通过2个不同的分析人员，测定三个柱体的中间精密度(仅甲酸+ 甲醇)。对于每天的每个样品，表19中报告了2次注射的平均值。所有注射的平均值和标准差报告在表19的底部。注射的样品是掺入20mg/mL不含 PS20的A1 ADC中的0.4mg/ml PS20，掺入不含PS20的A1中的0.1mg/ml PS20，和掺入不含PS20的A4中的0.1mg/ml PS20。每天的条件显示在方法部分的表10中。在乙酸最终确定为方法1的修饰剂之前，使用甲酸进行中间精密度。在流动相中不用乙酸重复中间精密度，因为鉴定的所有其他参数在两种修饰剂之间是相当的并且因为样品制备对任一情况都相同。
在3天的测试中间精密度中的所有三个样品的％RSD小于10％。这些结果表明该测定对于各种柱体，样品制剂，HPLC-ELSD***和分析人员是一致的。注意到第2天的浓度略有下降趋势。
表19:中间精密度(用甲酸进行的所有实验)
Figure BDA0003679872070001521
结论:
在开发新版本的方法期间，对ELSD方法0测定进行了以下修改:
流动相B从异丙醇转换为甲醇
添加剂从2％甲酸变为2％乙酸
1-3.4分钟的洗涤步骤中有机物的浓度从20％转变至40％流动相B
流速从1.00mL/min变为1.25mL/min。
总的来说，这些修饰显著降低了蛋白质干扰和柱体与柱体性能的可变性。将流动相B有机物从异丙醇改变为甲醇(图2)与先前条件相比改善了蛋白质和PS20的分离。甲醇/FA和异丙醇/FA比较实验(表11和表12)的结果显示，方法1显著改善了PS20定量和柱体与柱体的再现性。用乙酸代替甲酸(图8)作为流动相添加剂进一步降低了蛋白质对柱体的保留。此外，将有机洗涤步骤从20％改为40％显著降低了蛋白质干扰。
对多种产物的该修饰测定的鉴定结果表明该测定适合于跨多种分子形式、蛋白质浓度和PS20浓度定量PS20，因此表明方法1是平台PS20定量测定的候选者。
实施例2.用于含有N-乙酰基色氨酸的制剂的HPLC-ELSD聚山梨醇酯20 定量方法的开发
在评估上述PS20方法(方法1)的过程中，发现当在制剂中作为另外的赋形剂存在时，N-乙酰色氨酸(NAT)显著干扰聚山梨醇酯20(PS20)。尽管实施例1的方法1显示出最小化的蛋白质干扰以及对于已经测试的大多数制剂而言柱体之间的可变性降低，但是在该方法的条件下N-乙酰色氨酸保留在柱体上并在与PS20相同的保留时间洗脱。不受理论束缚，由于分子上存在与方法1中使用的混合模式阴离子交换树脂(MAX)柱体相互作用的羧酸盐基团，NAT可以保留在柱体上。
如下所述，通过以下修改方法1以消除NAT干扰:
1)将柱体从MAX树脂更换为混合模式阳离子交换树脂(MCX)
2)将流动相添加剂从乙酸改为氢氧化铵。
此外，该方法的进一步优化，也称为方法2，通过将有机洗涤从40％B 增加至45％B并且将洗涤步骤时间和洗脱步骤时间分别增加+1分钟和+2分钟来进行。本实施例中描述了为使用NAT制定的项目进行运行PS20定量的条件的开发。通过评估方法2的准确性，精密度，线性，特异性，可重复性和稳健性，使用制剂中含有NAT的三种产品评估新条件。
先前使用MAX柱体的LC-ELSD测定法观察到与低pI分子较高的蛋白质干扰。因此，在方法1和方法2上进行低pI分子的评估，以确定哪种方法更适合于正确的PS20定量。
材料
HPLC/ELSD***:例如，Agilent 1200 HPLC-Varian 380 ELSD
聚山梨醇酯20:Sigma P/N:T2700-100ML
HPLC级冰醋酸:JT Baker
强氨溶液，27-31％:Spectrum Chemicals
HPLC级水HoneyWell
HPLC级甲醇:OmniSolv
Figure BDA0003679872070001531
MAX柱体2.1x20mm，粒径30μm
Figure BDA0003679872070001541
MCX柱体2.1x20mm，粒径30μm(表20)
含NAT的产品(表21)
表20:方法2开发期间使用的MCX柱体
Figure BDA0003679872070001542
表21:产品信息
Figure BDA0003679872070001543
Figure BDA0003679872070001551
方法:
对于所有实验，ELSD光源强度(LED)设定为75％并且检测器增益(PMT) 设定为1。用于使测定与含有NAT的制剂相容的方法的最终修饰的总结如下:
Agilent 1200 HPLC(或等同产品)和Varian 380 ELSD(或等同产品)
柱体:
Figure BDA0003679872070001552
MCX在线柱体
流动相A:1.5％氢氧化铵水溶液
流动相B:1.5％氢氧化铵的甲醇溶液
流速:1.40mL/min
转向阀定时:在4.00分钟流向ELSD
注射体积:25*μL(*取决于产品)
表22:改进的PS20方法梯度(方法2)
Figure BDA0003679872070001553
结果:
干扰的确定
方法开发的最初焦点是确定NAT是否是先前测定中观察到的干扰的来源。这项工作是通过研究一系列包含NAT或排除它的缓冲液(材料部分(表 21)和结果部分(表23)中提供的缓冲液细节)进行的。
在目标浓度(标称＝80mg/mL)下，不含PS20的A16/A17制剂缓冲液(20mM组氨酸-HCl，1mM NAT，5mM甲硫氨酸，240mM蔗糖，pH5.5)和不含 PS20的A16/A17，最初使用实施例1的方法1评估。每种样品的组成如下提供:
不含PS20的制剂缓冲液--20mM组氨酸-HCl，1mM NAT，5mM甲硫氨酸， 240mM蔗糖，pH5.5。
不含PS20的A16/A17样品-在20mM组氨酸-HCl，1mM NAT，5mM甲硫氨酸，240mM蔗糖，pH5.5中的80mg/mL(标称值)。
图11A显示了该评价的ELSD结果，其中在两种样品的PS20保留时间 (～4.5分钟)在ELSD中观察到显著干扰。显示了水(迹线1)，不含PS20 的制剂缓冲液(迹线2)和不含PS20的蛋白质样品(迹线3)注射。另外，图11B显示每个样品的UV(280nm)信号，其中在PS20的近似保留时间检测组分。因为注射不含PS20制剂时观察到的干扰程度与蛋白质样品大致相同，很明显，来源不能完全归因于蛋白质，并导致我们假设缓冲液中的一种赋形剂被柱体保留。
我们确定n-乙酰色氨酸(NAT)是图11A和11B中观察到的干扰物,原因如下:1)含NAT的制剂以前没有用方法1进行测试，因此这与先前的评估有很大的不同；2)NAT具有4.1的表观pKa并且具有羧酸基团，其可能使其以去质子化的阴离子形式保留在MAX柱体的铵阳离子树脂中；3)NAT吸光度最大值接近280nm(H.Edelhoch,Biochemistry,vol.6,no.7,July1967)，使用NAT制剂样品在PS20保留时间(～4.3分钟)观察到280nm吸光度(图 11B)。
为了确认NAT干扰PS20，如上所述，测试了具有或不具有NAT的一系列 A16/A17制剂缓冲液。图12A和12B显示了该评估的HPLC-ELSD结果，其中含有NAT的缓冲液在图12A中显示并且没有NAT的那些显示在图12B。图12A中的每个包含NAT的缓冲液也在PS20的保留时间显示出峰。相比之下，排除NAT 的所有缓冲液都没有表现出干扰峰。总之，图11A，11B，12A和12B中所示的数据表明NAT保留在
Figure BDA0003679872070001571
MAX柱体上，并与PS20共洗脱，而不是干扰由蛋白质或其它赋形剂引起。
表23:使用方法1和方法2测试的缓冲液
Figure BDA0003679872070001572
NAT含有羧酸基团，并且可以通过阴离子交换保留在柱体中发现的树脂中。我们探索了使用备选
Figure BDA0003679872070001573
柱体(
Figure BDA0003679872070001574
MCX)来更好地将NAT与PS20 分离。与含有铵基阳离子树脂的
Figure BDA0003679872070001575
MAX柱体不同，
Figure BDA0003679872070001576
MCX柱体含有阴离子亚硫酸盐树脂。最初，使用方法1中使用的相同流动相(甲醇+乙酸) 评估MCX柱体。然而，在这些条件下，发现蛋白质干扰升高至不可接受的水平(数据未显示)。
Figure BDA0003679872070001577
样品提取方法建议使用氢氧化铵作为MCX 树脂平板形式中的固相萃取程序中的流动相添加剂(Waters,“Oasis SampleExtraction Products,”2011)。因此，通过用1.5％氢氧化铵代替2％乙酸来改变流动相，以更好地模拟制造商推荐的条件。通过这些方法修改，使用MCX柱体评估A16/A17缓冲液的不同衍生物，并且数据显示在图 13A和13B中。
与用方法1获得的结果不同，在有或没有NAT的PS20的保留时间没有观察到干扰，并且所有赋形剂在1分钟之前从柱体中洗脱(图13A和13B)。另外，当注射50μL不含PS20的A16/A17蛋白(图13A，迹线4)时，在ELSD中的PS20区中未观察到干扰，表明该方法具有分离蛋白质与PS20的潜力。选择MCX柱体以及作为流动相添加剂的氢氧化铵用于评估含有NAT的制剂的 PS20定量。
方法修改
一旦建立了分析含NAT制剂的初步条件，如上所述，进一步详细检查了以下参数:
流动相中的氢氧化铵％
在洗涤步骤中使用的％B(测试的20-60％B)
洗涤时间(2.4分钟和3.4分钟)和注射体积(25和50μL注射体积)
流速(0.8mL/min至1.6mL/min)
洗脱时间(1.1分钟，3.1分钟)
流动相中的氢氧化铵％
Figure BDA0003679872070001581
样品提取方法建议使用氢氧化铵作为MCX树脂平板形式的固相萃取程序中的流动相添加剂(Waters,"Oasis Sample Extraction Products,"2011)。通过ELSD(图14A)和UV(图14B)检测进行实验。不含PS20的A16/A17蛋白是用于在流动相中使用0.15,0.29,0.73或1.5％氢氧化铵评估蛋白质和NAT从柱体洗脱的样品(图14A和14B，分别为迹线1,2,3 和4)。由于UV检测器在转向阀之前在线，因此可以检测在PS20之前洗脱的具有发色团的分析物(例如NAT和蛋白质)。为了评估清除NAT的能力，也注射了A16/A17不含PS20的制剂缓冲液(图14A和14B，迹线5)。
当通过切换转向阀将柱体流出物在2.4分钟引入ELSD时，在流动相中观察到0.15％氢氧化铵(图14A，迹线1)的轻微干扰，如稍高的基线所证明的；UV痕量还表明，在流出物进入ELSD之前，蛋白质和/或NAT主要从柱体中洗脱。大多数这些潜在的干扰物在空体积中洗脱。随着氢氧化铵添加剂的百分比增加(从0.29％增加到1.5％)，通过ELSD观察到的蛋白质或NAT干扰程度的差异最小(图14A，迹线2-4)。另外，UV迹线显示在所有测试的氢氧化铵水平下充分清除蛋白质和NAT的方法(图14B，迹线2-4)。当在流动相中用1.5％氢氧化铵注入不含PS20的蛋白质时(图14A，迹线4)，与注入较低氢氧化铵百分比的相同蛋白质相比，当在PS20区域中在2.4分钟引入流出物时(4.0-5.5分钟)，似乎存在较少的蛋白质干扰。不含PS20的制剂缓冲液(图14B迹线5)UV迹线显示在流动相中用1.5％氢氧化铵有效清除NAT。因此，选择该百分比的添加剂用于该方法。
280nm处的吸光度(图14B)显示，当在流动相中使用0.15-1.5％的氢氧化铵时，蛋白质和NAT被充分清除，并且在约2.5分钟时存在这些干扰物的一定拖尾。由于这一发现，改变甲醇+氢氧化铵方法以在3.0分钟而不是 2.4分钟将流量转向到ELSD，以防止检测器被污染并确保ELSD中的蛋白质和 NAT干扰最小。由于PS20的洗脱在约4.5分钟，因此这种变化不应影响该峰值。
洗涤步骤中使用的％B(测试的20-60％)
以前，为了在没有NAT的制剂中开发方法1，使用分步梯度方法优化在洗涤步骤期间分离蛋白质与PS20的所用的％甲醇。由于对该方法的几个关键变化对蛋白质保留的未知影响，重新考虑了方法2开发中使用的％甲醇；将固定相改为MCX树脂，将流动相添加剂改为氢氧化铵。在该实验中，在20-60％的浓度范围内测试了10％(v/v)增量的％B(甲醇+1.5％氢氧化铵)的四种不同水平。ELSD和UV检测均用于监测每种测试条件下的蛋白质洗脱。不含聚山梨酯的A16/A17样品用于评估，ELSD和UV数据分别如图15A 和15B所示。
在图15B中，280nm吸光度层析图在PS2-(～4.5分钟)的保留时间显示明确的峰，表明当注射15μL不含PS20的A16/A17蛋白时，在具有20％B洗涤 (迹线1)的柱上存在蛋白质和/或NAT保留。在空体积中也观察到更大的峰，其可能是蛋白质和NAT的混合物。对于相同的条件，在ELSD中也检测到明确定义的峰作为PS20区域中的干扰(图15A)。当洗涤步骤的％B增加至30％时，NAT和蛋白质清除率得到改善(迹线2)，这可由UV和ELSD迹线中PS20 区域的峰值降低所证明。用40％B更有效地清除NAT和蛋白质，但是在ELSD 中PS20区域仍然存在轻微干扰(图15A)。用50％和60％B洗涤(分别为迹线4和5)最有效地清除NAT和蛋白质，同时存在最小的干扰。选择洗涤步骤中的45％B用于该方法。在方法1的先前开发期间，我们还测试了高达50％的甲醇作为洗涤条件，但是观察到在这些条件下一小部分PS20将更早洗脱(在45％甲醇下未观察到这个小峰)。这些峰可能是较短链长的酯，其疏水性较低，并且表明50％甲醇条件大约是酯化种类将洗脱的点。由于此先前的观察结果，并且目前的结果显示40％B足以去除蛋白质，我们决定洗涤步骤的45％B条件提供稳健的蛋白质去除和PS20保留之间的折衷。此外，图 15B中的UV数据显示蛋白质在50％B洗涤条件下稍早洗脱。
洗涤时间(2.4分钟和3.4分钟)和注射体积(25和50μL注射体积)
为了进一步减少PS20区域的干扰，评估了2.4分钟和3.4分钟的洗涤步骤。如图16所示，PS20区域在2.4或3.4分钟洗涤(分别为迹线3和迹线2) 之间类似。因为特异性稍微改善并且在较长的洗涤时间没有明显的负面影响，所以选择3.4分钟的洗涤用于该方法。另外，选择流量在4.0分钟而不是2.4分钟转向到ELSD。
还通过将样品体积从50μL减少至25μL来评估注射体积对基线的影响 (分别为图16，迹线2和迹线1)。25μL注射迹线的基线看起来略微更清楚，这是预期的，因为从柱体中除去的蛋白质和赋形剂较少。最终，注射体积在特异性方面没有显著影响性能。
流速(0.8mL/min至1.6mL/min)
评估流速以确保蛋白质和NAT被有效清除。流速在0.8-1.6mL/min之间变化。图17A和17B显示使用1.60,1.40,1.25,1.00和0.80mL/min的流速以 150mg/ml注射不含PS20的A18/A19蛋白的25μL样品(分别为迹线1,2,3,4 和5)。
在最慢的流速0.8mL/min(迹线5)下，仍有蛋白质和赋形剂在PS20区域中洗脱，如ELSD中的峰所示(图17A)。该条件的UV迹线(图17B)也表现出比较高流速更晚洗脱的增加的干扰物。当流速增加到1.00mL/min(迹线4)时，干扰减少，并且一旦流速增加到1.25mL/min(迹线3)，干扰几乎可以忽略不计。当流速增加到1.40和1.60mL/min(分别为迹线2和1)时，与在较低流速下相比，UV迹线显示大部分蛋白质和赋形剂到2.0分钟时从柱体更完全地洗脱，并且选择1.40mL/min的流速用于该方法。我们没有增加到1.6mL/min，因为在1.4mL/min下性能几乎等同，并且因为由于1.6 mL/min的较高反压力，我们希望将泄漏风险最小化。
洗脱时间(1.1分钟，3.1分钟)
方法1中100％B的洗脱步骤保持1.1分钟。在每次注射时观察到～6.5分钟洗脱的未知身份的峰，与样品无关，并且包括水空白。在流动相％B返回到再平衡条件后，未知峰似乎洗脱。为了测试峰是否能够更好地与PS20分离，延长了洗脱时间。图18示出了PS20峰的积分，其在～5.2分钟开始并且大约在该未知峰开始时结束(迹线2)。尽管这不会显著影响定量，但为了防止将来来自该峰的潜在干扰，洗脱步骤增加至3.1分钟的保持时间(迹线 1)，允许更好地分离和积分PS20区域。图19示出了使用方法2用最终化的参数，水、150mg/mL不含PS20的A18/A19、掺入水的0.2mg/mL PS20、以及掺入A18/A19中的0.2mg/mL PS20的结果(分别为迹线1,2,3和4)。
方法资格实验
特异性
通过确认注射不含PS20的制剂缓冲液和不含PS20的产物对可能干扰 PS20区域的任何峰没有贡献来确定特异性；将这些与最低PS20校准标准进行比较，该标准通常为目标PS20浓度的50％。
将不含PS20的制剂缓冲液，不含PS20的蛋白质和掺入水中的0.1mg/mL PS20(50％目标)的典型层析图示于图20A-20F中。评估了三种不同的不含 PS20的产品。A18/A19(图20A和20B)，A16/A17(图20C和20D)和A14/A20 (图20E和20F)分别具有150,80和150mg/mL的蛋白质浓度。表21中提供了关于这些产物的更多细节。视觉上，当注射不含PS20的蛋白质样品时，所有产物在ELSD中的PS20区中具有一定干扰(图20A，20C和20E，迹线2)。然而，不含PS20的制剂缓冲液在PS20区域中没有显示出视觉干扰(图20A， 20C和20E，迹线1)，表明干扰主要来自蛋白质。
如果PS20游离样品中的峰面积≤最低标准中峰面积的10％，则该方法的接受标准得到满足。因为在PS20区域中可见一些蛋白质干扰，所以必须使用方程式确定特异性。有不同的方法用于确定特异性。在本研究中，使用以下方程式推导出特异性的数值估计:
方程式1:特异性
干扰(％)＝(不含PS20蛋白质的面积/50％的PS20规格的面积)*100
使用该方程式，计算三种产物的％干扰(表24)。确定与0.1mg/mL PS20 的水溶液(50％靶标)相比，不含PS20的A16/A17(80mg/mL)(图20C)具有7％的特异性。不含PS20的A18/A19(150mg/mL)(图20A)仅具有4％的干扰，而与0.1mg/mL PS20水溶液(50％靶标)相比，A14/A20(150mg/mL) (图20E)具有13％的干扰。
对于所有产品，280nm处的UV迹线(图20B，20D和20F)显示，在4.0 分钟流动被转向到ELSD中时，蛋白质和NAT被有效清除。尽管A14/A20具有 13％的干扰，但随后对该产品的评估中的重复性，准确度和线性度均可接受。
表24:三种产品的特异性
Figure BDA0003679872070001621
准确度
为了确定测定的准确度，将已知量的PS20掺入不含PS20的蛋白质中，并测定每种浓度的回收率(表25)。典型的验证接受标准要求％回收率在 80-120％之内。
通过掺入在0.1-0.6mg/mL的范围内的PS20评价不含PS20的A18/A19 (150mg/mL)和不含PS20的A16/A17(80mg/mL)。准确度数据总结在表25 中。在测试的PS20浓度下，A16/A17和A18/A19的回收率范围分别为 94-100％和78-100％。具有78％回收率的样品与掺入不含PS20的A18/A19 中的0.4mg/mL PS20一起发生。括号(bracketing)PS20浓度(0.2和0.6mg/mL)的回收率在规格范围内，表明该一个样品的样品制备或注射误差。如果排除0.4mg/mL样品，A18/A19的回收率范围为88-100％。
通过掺入在0.1-0.3mg/mL的范围内的PS20评估不含PS20的A14/A20 (150mg/mL)的准确度。A20/A20的PS20回收率为92-109％。总体而言，所有三种测试产品的加标回收实验数据表明该方法是准确的。此外，这些结果表明，可以将2.5μg(0.1μg/μL*25μL)-15μg(0.6μg/μL*25μL) 的PS20加样到柱体上并精确定量。
表25:准确度
Figure BDA0003679872070001631
Figure BDA0003679872070001641
线性度
通过在三种产品测试的范围内确定Pearson相关系数(r)≥0.99来评估线性度。对于每种产品，每种PS20浓度范围的这些值显示在表26中。对于测试的PS20范围，Pearson相关系数的所有值均大于0.99。因此，在所测试的三种产品中，该测定的线性度是可接受的。
表26:线性度:Pearson相关系数
产品 PS20浓度范围(mg/ml) Pearson相关系数(r)
A18/A19 0.1–0.6 0.9915
A16/A17 0.1–0.6 0.9999
A14/A20 0.1–0.3 0.9994
可重复性
通过六次重复注射A18/A19样品(标称0.2mg/mL PS20)和六次重复注射A16/A17样品(标称0.2mg/mL PS20)并测量PS20峰面积的％RSD来评估可重复性。该评估结果显示在表27中，并显示测定法的准确度对于两种产品均可接受。
表27:A18/A19和A16/A17的可重复性
Figure BDA0003679872070001642
Figure BDA0003679872070001651
还通过测试五个浓度的三个重复并测量PS20峰面积的％RSD来评估可重复性。该实验用掺入不含PS20的A14/A20中的0.10-0.30mg/mL PS20进行。该评估结果显示在表28中，并显示该测定的准确度对于A14/A20是可接受的。
表28:A14/A20的可重复性
Figure BDA0003679872070001652
方法稳健性实验
柱体到柱体
用实施例1的方法1完成的先前工作已经表明，即使当柱体的吸附剂批次相同时，柱体也可能在蛋白质清除和特异性方面表现出不同的行为。评估了三个MCX柱体以确定柱体与柱体的可变性。其中，MCX柱体2和4具有相同的吸附剂批次(0093)，而6是不同的(0103)(表20)。
所有三个MCX柱体均用掺入水中的0.2mg/mL PS20和含PS20的产品进行评估。图21和22显示了这些评估的层析图，表29显示了结果的总结。图21 中的迹线3和4和图22中的迹线3示出了在三个柱体中注射的水样中0.2mg/mL PS20的峰高和宽度的差异。最值得注意的是，峰高度和面积在柱体与柱体之间是可变的，在柱体2(图21的迹线1和3)和柱体6(图21的迹线2和4)之间观察到最大的差异。在测试的两种样品类型中(即PS20水溶液，在A18/A19中的PS20)，使用柱体2的峰的面积约为使用柱体6的峰面积的60％。鉴于观察到峰面积的差异独立于样品类型(例如，有或没有蛋白质)，可变性不可能由蛋白质干扰引起。虽然测试的两个柱体之间的面积计数差异很大，但柱体4和6之间的差异较小，柱体4的面积约为柱体6的85 ％。柱体之间PS20峰面积的可变性似乎不完全取决于树脂批次，因为柱体2 和4共用相同的树脂批次并且也产生不同的峰面积。
尽管这种可变性并不理想，但是一旦实施标准品以获得计算的PS20量，则从在相同柱上分析的校准曲线确定的PS20的浓度与所有柱体中的理论浓度相比是准确的。基于这些数据，重要的是利用PS20的注射量，其提供完全在ELSD检测器的线性范围内的响应。例如，对于HPLC-ELSD方法，通常建议为满量程的80％的最大检测器响应(例如，800mV)，但考虑到从柱体到柱体观察到的可变性，可能建议降低MCX方法的该目标响应以进一步保证检测器不会对某些柱体饱和。总体而言，相对于该方法对所测试的样品和柱体报告的PS20量，柱体与柱体的可变性是最小的。
表29:柱体与柱体的可变性
Figure BDA0003679872070001661
100X注射A18/A19样品
虽然上述实验证明
Figure BDA0003679872070001671
MCX柱体可以稳健而准确地定量PS20，但我们希望通过用含有蛋白质的样品运行长序列来测试柱体的耐久性。最初该方法开发的产品之一具有150mg/mL的非常高的目标蛋白质浓度，并且可能由于柱体上的蛋白质积累而导致柱体失效/过压。通常，运行该方法时压力为～25-45巴。如果压力增加超过此范围，则柱体可能积聚蛋白质和/或赋形剂，应被密切监测或更换柱体。如果柱体开始泄漏，应将其丢弃并立即更换。
通过使用新柱体注射蛋白质(150mg/mL)一百次(序列参见表30)来评估柱体可重复性和持续清除蛋白质和NAT的能力。对照(n＝11)每隔十次蛋白质注射加括号并首先进行分析以确保序列有效。图23显示了对照的叠加。虽然在基线开始时(4.0-5.0分钟，8.5分钟后)和基线后端有增加 (高达5mV)，但这些变化不影响积分或最终PS20定量(表31)，平均PS20 量计算为0.2±0.005(2.8％RSD)mg/mL。
表30:序列(所有25μL注射)
Figure BDA0003679872070001672
Figure BDA0003679872070001681
表31:100X蛋白质序列中使用的对照的定量
Figure BDA0003679872070001682
由于对照在整个运行过程中定性和定量上一致，因此整合了具有标称 0.2mg/mLPS20的100个A18/A19样品(150mg/mL)(图24)并定量(图26B，表32)。图24示出了与对照相同的趋势，在PS20区域之前，在4.0-5.0分钟和在8.5分钟之后具有增加的基线(～5mV)。绘制面积对注射次数和数量对注射次数，蛋白质的定量具有最小的偏差，尽管前20次注射的面积和数量略有下降趋势，这可能是由于柱体的平衡所致(图26A和26B)。最终，对于A18/A19样品的100次注射定量的PS20的平均面积和量分别为18.3±0.76 (4.2％RSD)mV*min和0.2±0.005(2.6％RSD)mg/mL(表32)。注意，通过第100次注射将375mg蛋白质加样到柱体上。在流出物在整个序列中4.0 分钟(图25A)进入ELSD之前，该方法一直充分清除蛋白质和赋形剂，如UV 迹线中所示(图25B)。
由于下降的趋势，使用新的MCX柱(柱体5)评估100次注射具有标称 0.2mg/mLPS20的A18/A19制剂缓冲液，以确定该效果是否由于蛋白质还是制剂或两者。有趣的是，对于前49次注射，面积计数[n＝100，平均31.3±1.3 (4.1％RSD)mv*min]存在类似的下降趋势(图27A)。该行为对定量没有主要影响[n＝100，平均值0.22±0.005(2.1％RSD)](图27B和表32)。
当在一个全新的柱体(柱体3)上评估掺入水中的0.2mg/mL PS20时，没有这种下降趋势。对于该样品，面积计数[n＝100，平均20.7±0.3(1.5 ％RSD)mv*min](图28A)保持一致，同时定量[n＝100，平均0.20±0.002 (0.9％RSD))](图28B，表32)。来自水+PS20样品的该结果可表明先前观察到的下降趋势(图26A和27A)与制剂中的其他赋形剂或蛋白质的存在有关。另一种可能性是它是与使用的特定柱体有关的效果，并且不依赖于其他制剂组分。
表32:100X注射掺入水中的PS20、A18/A19制剂缓冲液、A18/A19样品的定量
Figure BDA0003679872070001691
总体而言，三个柱体在100次PS20注射后均能够有效执行，说明MCX柱体的再现性和耐用性适合在QC环境中常规使用。更重要的是，100次蛋白质注射的吸光度曲线清楚地显示了整个序列中蛋白质和NAT的相似的清除 (图25B)。PS20定量在整个序列中保持统计学上恒定。
PS20定量评估三种低pI产品
使用方法1(在实施例1中描述)和方法2评估三种不同的低pI产物A21， A14/A15和A14(表33)。用于该评估的柱体列于表34中。测试的方法性能特征是特异性，准确度，线性和重复性。
表33.评估的分子
Figure BDA0003679872070001701
*pI由括号(校准曲线)方法确定
**pI由icIEF控制***测定法确定
表34.方法开发期间使用的柱体
Figure BDA0003679872070001702
特异性
对于三种分子计算的特异性示于表35中。相应的层析图示于图29A-29F 中。与在水中的0.1mg/mL PS20(50％靶标)相比，A21(150mg/mL)在用方法1(含有甲醇和乙酸的
Figure BDA0003679872070001711
MAX)评估时有16％的干扰，当用方法 2(具有甲醇和氢氧化铵的
Figure BDA0003679872070001712
MCX)评估时，具有7％的干扰。这可能是由于低pI产物与阳离子交换树脂(亚硫酸根阴离子基团)的较弱相互作用，使蛋白质干扰最小化。与水中的0.15mg/mL PS20(50％靶标)相比，当用方法1评估时，A14/A15(192mg/mL)具有3％的干扰，当用方法2评估时，具有2％的干扰。与水中的0.15mg/mL PS20(50％靶标)相比，当用两种方法评估时，A14(161mg/mL)具有约1％的干扰。这些产品的特异性不受该方法的显著影响。
表35.三种低pI分子的特异性
方法1 方法2
产品 特异性(％) 特异性(％)
A21 15.6 7.1
A14/A15 3.4 1.9
A14 0.8 0.6
准确度
为了确定测定法的准确度，将已知量的PS20掺入不含PS20的蛋白质中，并测定每种浓度的回收率(表36)。典型的验证接收标准要求％回收率在80-120％之内。
通过掺入在0.10-0.30mg/mL的范围内的PS20评估不含PS20的A21。准确度数据总结在表36中。在测试的PS20浓度下，当使用方法1和方法2分析样品时，回收率的范围分别为99-108％和101-110％。通过掺入在 0.15-0.45mg/mL的范围内的PS20评估不含PS20的A14/A15和A14的准确度。当使用方法1和方法2分析样品时，A14/A15的PS20回收率分别为97-101％和92-99％。当使用方法1和方法2分析样品时，A14的PS20回收率分别为 102-108％和102-110％。总体而言，来自所测试的所有三种产品的加标回收实验的数据证明两种方法都是准确的。
表36.三种低pI产物的回收率
Figure BDA0003679872070001721
Figure BDA0003679872070001731
一式三份,20μL注射
线性
通过在用方法1和方法2评估的三种低pI产物的测试范围内确定 Pearson相关系数(r)≥0.99来评估线性。对于每种产品的每种PS20浓度范围，这些值显示在表37中。对于测试的PS20范围，Pearson相关系数的所有值均大于0.99。因此，在测试的三种产品中，线性对于方法1和方法2是可接受的。
表37.三种低pI产物的线性
Figure BDA0003679872070001741
重复性
通过测试五种浓度的三个重复并测量PS20峰面积的％RSD来评估重复性。该实验用0.10-0.30mg/mL掺入不含PS20的A21的PS20和0.15-0.45mg/mL 掺入不含PS20的A14/A15和A14的PS20来进行。该评估结果显示在表38中，并显示在测试的三种产品中，测定法的精密度对于方法1和方法2都是可接受的。
表38.三种低pI产物的可重复性
Figure BDA0003679872070001761
一式三份,20μL注射
结论:
对当前ELSD测定进行以下对实施例1的方法1的修改:
方法2:
流动相添加剂从2％乙酸转换为1.5％氢氧化铵
流速从1.25mL/min变为1.40mL/min
从废物进入ELSD的LC流从2.4分钟变为4.0分钟
洗涤步骤中B％的浓度从40％转变为45％流动相B
洗涤步骤中有机物的时间从1.0-3.4分钟转换到1.0-4.4分钟
洗脱步骤的时间从3.5-4.6分钟变为4.5-7.6分钟
平衡步骤的时间从4.7-6.6分钟变为7.7-9.6分钟
这些修改消除了NAT和蛋白质干扰，并且具有最小的柱体到柱体定量可变性。对三种含NAT产物的该修改测定法的鉴定结果表明该测定法适合于定量这些制剂中的聚山梨醇酯20。
用方法1和方法2评估了三种低pI分子。当使用方法1和A21时，唯一未满足接受标准的例子是特异性。除此之外，这两种方法都通过了所有三种低pI产品的准确度，线性和重复性标准。这些结果进一步表明方法2也能够定量PS20，并且对于不含NAT的产品特别有用。
实施方案
1.一种用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中在定量期间非离子表面活性剂和多肽之间的干扰减少，其中该方法包括以下步骤:
a)将组合物施加到混合模式阴离子交换层析材料中，其中将组合物加样到包含流动相A和流动相B的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含酸的水溶液，并且流动相B包含酸的甲醇溶液，其中所述多肽特异性和非特异性地结合所述层析材料；
b)用包含流动相A和流动相B的溶液从所述混合模式阴离子交换层析材料中洗脱特异性结合的多肽，其中与步骤a)相比，流动相B与流动相A 的比例增加；
c)用包含流动相A和流动相B的溶液从所述层析材料中洗脱非离子表面活性剂和非特异性结合的多肽，其中与步骤c)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
d)定量所述非离子表面活性剂，其中定量期间非离子表面活性剂和所述多肽之间的干扰减少。
2.实施方案1的方法，其中步骤a)中流动相B与流动相A的比例为约10:90。
3.实施方案1或2的方法，其中步骤b)中流动相B与流动相A的比例增加至约40:60。
4.实施方案1-3中任一项的方法，其中步骤c)中流动相B与流动相A 的比例增加至约100:0。
5.实施方案1-4中任一项的方法，其中流动相A包含约2％的酸的水溶液。
6.实施方案1-5中任一项的方法，其中流动相B包含约2％的酸的甲醇溶液。
7.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述酸是甲酸。
8.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述酸是乙酸。
9.实施方案1-8中任一项的方法，其中层析的流速为约1.25mL/分钟。
10.实施方案9的方法，其中步骤b)在层析开始后约1分钟开始，并在层析开始后约3.4分钟结束。
11.实施方案9或10的方法，其中步骤c)在层析开始后约3.5分钟开始，并在层析开始后约4.6分钟结束。
12.实施方案1-11中任一项的方法，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。
13.实施方案12的方法，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
14.实施方案1-13中任一项的方法，其中所述组合物中非离子表面活性剂的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内。
15.实施方案1-14中任一项的方法，其中所述组合物中的蛋白质浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。
16.实施方案1-15中任一项的方法，其中所述制剂的pH为约4.5至约 7.5。
17.实施方案1-16中任一项的方法，其中所述组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。
18.实施方案1-17中任一项的方法，其中所述组合物是适合施用于受试者的药物制剂。
19.实施方案1-18中任一项的方法，其中所述多肽是治疗性多肽。
20.实施方案16的方法，其中所述治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。
21.实施方案1-20中任一项的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析材料包含反相强阴离子交换聚合物。
22.实施方案1-21中任一项的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析材料包含季胺部分。
23.实施方案1-22中任一项的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析材料包含固相支持体。
24.实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析材料包含在柱中。
25.实施方案1-24中任一项的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。
26.实施方案1-25中任一项的方法，其中所述混合模式阴离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070001791
MAX层析材料。
27.实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述非离子去污剂通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量。
28.一种用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中所述方法包括以下步骤:
a)将所述组合物施加到混合模式阳离子交换层析材料中，其中将所述组合物加样到包含流动相A和流动相B的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵的水溶液且流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；
b)用包含流动相A和流动相B的溶液从所述混合模式阳离子交换层析材料中洗脱所述多肽，其中与步骤a)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
c)用包含流动相A和流动相B的溶液从所述层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中与步骤c)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
d)定量所述非离子表面活性剂。
29.实施方案28的方法，其中流动相B的有机溶剂是甲醇。
30.实施方案28或29的方法，其中步骤a)中流动相B与流动相A的比例为约10:90。
31.实施方案28-30中任一项的方法，其中在步骤b)中流动相B与流动相A的比例增加至约45:55。
32.实施方案28-31中任一项的方法，其中在步骤c)中流动相B与流动相A的比例增加至约100:0。
33.实施方案28-32中任一项的方法，其中流动相A包含约2％的氢氧化铵水溶液。
34.实施方案28-33中任一项的方法，其中流动相B包含约2％的氢氧化铵的甲醇溶液。
35.实施方案28-34中任一项的方法，其中层析的流速为约1.4mL/分钟。
36.实施方案35的方法，其中步骤b)在层析开始后约1分钟开始，并在层析开始后约4.4分钟结束。
37.实施方案35或36的方法，其中步骤c)在层析开始后约4.5分钟开始，并在层析开始后约7.6分钟结束。
38.实施方案28-37中任一项的方法，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。
39.实施方案38的方法，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
40.实施方案38或39的方法，其中所述组合物中聚山梨醇酯的浓度在约0.001％至1.0％(w/v)的范围内。
41.实施方案28的方法，其中流动相B的有机溶剂是乙腈。
42.实施方案41的方法，其中步骤a)中流动相B与流动相A的比例为约10:90。
43.实施方案41或42的方法，其中步骤b)中流动相B与流动相A的比例增加至约40:60。
44.实施方案41-43中任一项的方法，其中步骤c)中流动相B与流动相A的比例增加至100:0。
45.实施方案41-44中任一项的方法，其中流动相A包含约2％的氢氧化铵在水中或在43％甲醇中的溶液。
46.实施方案41-45中任一项的方法，其中流动相B包含约2％氢氧化铵的乙腈溶液。
47.实施方案41-46中任一项所述的方法，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆。
48.实施方案48的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。
49.实施方案48或49的方法，其中所述组合物中泊洛沙姆的浓度在约 0.001％至1.0％(w/v)的范围内。
50.实施方案28-49中任一项的方法，其中所述组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。
51.实施方案50的方法，其中所述组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为约0.1mM至约10mM。
52.实施方案50的方法，其中所述组合物中甲硫氨酸的浓度范围为约0.1mM至约100mM。
53.实施方案28-52中任一项的方法，其中所述组合物中的多肽浓度为约1mg/mL至约250mg/mL。
54.实施方案28-53中任一项的方法，其中所述制剂具有约4.5至约 7.5的pH。
55.实施方案28-54中任一项的方法，其中所述组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。
56.实施方案28-55中任一项的方法，其中所述组合物是适合施用于受试者的药物制剂。
57.实施方案28-56中任一项的方法，其中所述多肽是治疗性多肽。
58.实施方案57的方法，其中所述治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM，THIOMABTM药物缀合物。
59.实施方案28-58中任一项的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。
60.实施方案28-59中任一项的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。
61.实施方案28-60中任一项所述的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。
62.实施方案28-61中任一项所述的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。
63.实施方案28-62中任一项的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。
64.实施方案28-63中任一项所述的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料是
Figure BDA0003679872070001821
MCX层析材料。
65.实施方案28-64中任一项所述的方法，其中所述非离子去污剂通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量。

Claims (38)

1.一种用于定量包含非离子表面活性剂和多肽的组合物中的非离子表面活性剂的方法，其中所述方法包括以下步骤:
a)将所述组合物施加到混合模式阳离子交换层析材料中，其中将所述组合物加样到包含流动相A和流动相B的溶液中的层析材料上，其中流动相A包含氢氧化铵的水溶液且流动相B包含氢氧化铵的有机溶剂溶液；
b)用包含流动相A和流动相B的溶液从所述混合模式阳离子交换层析材料中洗脱所述多肽，其中与步骤a)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
c)用包含流动相A和流动相B的溶液从所述层析材料中洗脱非离子表面活性剂，其中与步骤c)相比，流动相B与流动相A的比例增加；
d)定量所述非离子表面活性剂。
2.权利要求1的方法，其中流动相B的有机溶剂是甲醇。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)中流动相B与流动相A的比例为10:90。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在步骤b)中流动相B与流动相A的比例增加至45:55。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤c)中流动相B与流动相A的比例增加至100:0。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中流动相A包含2％的氢氧化铵水溶液。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中流动相B包含2％的氢氧化铵的甲醇溶液。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中层析的流速为1.4mL/分钟。
9.权利要求8的方法，其中步骤b)在层析开始后1分钟开始，并在层析开始后4.4分钟结束。
10.权利要求8或9的方法，其中步骤c)在层析开始后4.5分钟开始，并在层析开始后7.6分钟结束。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯。
12.权利要求11的方法，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
13.权利要求11或12的方法，其中所述组合物中聚山梨醇酯的浓度在0.001％至1.0％(w/v)的范围内。
14.权利要求1的方法，其中流动相B的有机溶剂是乙腈。
15.权利要求14的方法，其中步骤a)中流动相B与流动相A的比例为10:90。
16.权利要求14或15的方法，其中步骤b)中流动相B与流动相A的比例增加至40:60。
17.权利要求14-16中任一项的方法，其中步骤c)中流动相B与流动相A的比例增加至100:0。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中流动相A包含2％的氢氧化铵在水中或在43％甲醇中的溶液。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中流动相B包含2％氢氧化铵的乙腈溶液。
20.权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆。
21.权利要求20的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆P188。
22.权利要求20或21的方法，其中所述组合物中泊洛沙姆的浓度在0.001％至1.0％(w/v)的范围内。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述组合物还包含N-乙酰色氨酸和/或甲硫氨酸。
24.权利要求23的方法，其中所述组合物中N-乙酰色氨酸的浓度范围为0.1mM至10mM。
25.权利要求23的方法，其中所述组合物中甲硫氨酸的浓度范围为0.1mM至100mM。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述组合物中的多肽浓度为1mg/mL至250mg/mL。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述制剂具有4.5至7.5的pH。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述组合物还包含一种或多种选自稳定剂，缓冲剂和张度剂的赋形剂。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述组合物是适合施用于受试者的药物制剂。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述多肽是治疗性多肽。
31.权利要求30的方法，其中所述治疗性多肽是融合蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，糖工程化抗体，抗体片段，抗体药物缀合物，THIOMABTM，THIOMABTM药物缀合物。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含反相强阳离子交换聚合物。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含磺酸部分。
34.权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含固相支持体。
35.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料包含在柱中。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料是高效液相层析(HPLC)材料。
37.权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述混合模式阳离子交换层析材料是
Figure FDA0003679872060000031
MCX层析材料。
38.权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述非离子去污剂通过蒸发光散射(ELSD)或通过使用带电气溶胶检测器(CAD)来定量。
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