KR102613521B1 - 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents
시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 제한효소 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하기 위한 키트 및 이를 이용한 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담의 판별 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
사과(Malus × domestica Borkh.)는 주요 과일 작목 중 하나이며, 채소 및 곡물 작물에 비해 사과의 육종은 종자로부터 개화 결실되는 시기까지를 포함하여 오래 걸리며, 유전자형 조성이 잡박하여 쉽지 않다. 또한, 재배 면적 또한 상대적으로 커서 육종기간이 오래걸리기 때문에 우리나라의 사과 품종 육성은 아조변이로부터 접목 기술을 통해 변이형질의 고정을 통해 다수의 품종이 등록되었다. 아조변이로부터 육성된 과수 품종은 묘목 상태로 공급되고 있어 형태적으로는 품종 판별이 거의 불가능하다. DNA 마커에 의한 품종 판별은 나무의 가지 또는 엽이나 과실과 같은 형태적 형질의 조사없이 추출한 DNA를 이용하여 쉽고 정확하게 품종을 구분할 수 있기 때문에 유통 묘목에서 품종 혼입을 방지할 수 있고, 육종가의 권리 보호에도 매우 도움이 된다. 또한, DNA 마커는 품종의 유전적 특성을 본질적으로 반영하므로 환경의 영향을 받지 않아 표현형의 특성을 대체하고 보완하는데 활용성이 높다.
한편, 한국등록특허 제2142011호에는 '후지 사과와 이의 아조변이 품종 판별용 S-SAP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1905458호에는 '사과 품종 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별할 수 있는 분자마커를 개발하기 위해, 시나노골드와 홍담의 전장염기서열 재해독(whole genome resequencing)을 통해 다형성 염기를 분석하였고, 이 중 Myb 관련된 유전자 내 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 변이에 기반한 프라이머 세트를 제작하여 검증한 결과, 제작된 프라이머 세트 중 2개의 프라이머 세트가 시나노골드와 홍담 사과를 정확하게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 제한효소 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 사과 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 절단 산물을 확인하는 단계;를 포함하는, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종 판별용 마커는 시나노골드와 이의 아조변이 품종을 신속 정확하게 판별할 수 있어, 향후 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종의 지식재산권 보호 및 브랜드화 촉진에 기여할 수 있고, 관련 산업의 경쟁력을 확보하는데 이용할 수 있다.
도 1은 시나노골드 사과와 홍담 사과의 염기 다형성 마커를 선발하기 위한 분석 과정의 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 개발한 프라이머 세트를 이용한 시나노골드(G)와 홍담(HD) 판별 결과이다. Chromoseme 3: 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, Chromoseme 6: 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, Chromoseme 10: 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
도 2는 본 발명에서 개발한 프라이머 세트를 이용한 시나노골드(G)와 홍담(HD) 판별 결과이다. Chromoseme 3: 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, Chromoseme 6: 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, Chromoseme 10: 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 제한효소 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 시나노골드 사과는 일본 나가노현 과수시험장에서 '골든데리셔스'에 '천추'를 교배하여 1999년에 품종 등록된 사과 품종으로, 열매가 익는 시기는 9월 하순경이며 무게는 300g이고, 형태는 원형 또는 긴 원형이며 껍질은 녹황색 또는 황색이며, 과육색은 백황색이다.
본 발명에 있어서, 용어 "아조변이(bud mutation)"는 생장중의 가지 및 줄기의 생장점에 유전자 돌연변이가 일어나 둘 또는 셋의 형질이 다른 가지나 줄기가 생기는 것으로, 가지변이라고도 한다. 상기 변이한 부분만을 접붙이기나 꺾꽂이 등으로 번식시키면 모주(母株)와는 형질이 다른 개체를 수득할 수 있는데, 이때 수득한 개체를 품종 또는 계(系)라고 한다.
본 발명에 따른 시나노골드 품종의 아조변이인 홍담은 2010년 경북 상주시 소재 시나노골드 재배 과수원에서 변이지가 발생된 것을 2013년 경북 상주시 화계동 과수원에서 고접 3차 실험을 수행하여 유전성을 확인하였고, 2015년까지 검정을 통해 안정성과 균일성을 확인한 품종으로, 대조품종인 시나노골드와 대비하여 과육색이 적색에 가까운 황색인 것이 구별되는 특징 중 하나이다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)용 프라이머 세트이다.
또한, 본 발명의 키트는 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담의 판별을 더욱 효율적으로 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)"는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 다형성 PCR 산물에 대한 제한효소 처리로 생성된 다형성 단편을 의미한다. 사전에 품종 간에서 염기 서열의 차가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA를 가지는 품종과의 차이를 구별할 수 있으며 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 프라이머의 서열 길이에 따라 각 서열 내의 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에서, 상기 제한효소는 HaeⅢ, ApaI 또는 PstI일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 경우 HaeⅢ 또는 ApaI의 제한효소를 사용할 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 경우 PstI의 제한효소를 사용할 수 있다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
사과 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 절단 산물을 확인하는 단계;를 포함하는, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 사과 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기서열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 제한효소는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 경우 HaeⅢ 또는 ApaI일 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 경우 PstI일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 절단 산물을 확인하는 단계는 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 전기영동 방법은 제한효소 처리에 따른 절단 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 사과 시료의 전장염기서열 재해독(whole genome resequencing)
시나노골드 사과와 홍담 사과는 경북육묘원에서 제공하였으며, 시나노골드와 홍담 간의 다형성 염기 정보를 확인하기 위해, (주)씨더스 농업회사법인(대전, 한국)에 의뢰하여 전장염기서열 재해독(whole genome resequencing)을 수행하였다. 분석방법은 다음과 같다.
1-1. 시퀀스 전처리
Short reads의 전처리 과정은 PCR duplicate reads를 제거 후, cutadapt (M Martin. (2011) EMBnet Journal, 17:10-12)로 adaptor 서열을 제거하였다. 이후 quality trimming을 위해 SolexaQA (v.1.13) package (MP Cox et al., (2010) BMC Bioinformatics, 11:485)의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하였다. DynamicTrim은 phred score에 따라 short read의 양쪽 끝의 bad quality base를 잘라내고 양질의 cleaned read로 정제하는 과정을 수행하며, LengthSort는 DynamicTrim에서 너무 많은 base가 잘린 read를 제거하는 과정을 수행한다. DynamicTrim의 phred score ≥ 20을, LengthSort 과정은 short read length ≥ 25bp를 사용하였다.
1-2. 표준유전체와의 서열정렬
전처리 과정을 통과한 cleaned reads를 BWA (0.6.1-r104) 프로그램을 사용하여 표준유전체(reference genome) 서열에 맵핑을 수행하였다. 맵핑 과정은 표준유전체[Scientific name: Malus domestica (Malus x domestica HFTH1 Whole Genome v1.0); Data Source: Genome database for rosaceae (GDR); Estimated genome size: 708.54 Mb] 서열과 시퀀싱한 샘플 간의 raw SNPs을 검출하기 위한 선행 과정으로서 BAM format의 파일을 생성하며, 다음의 옵션 이외에는 기본 값을 사용하였다.
- maximum number of gap extensions (-e) = 50
- seed length (-l) = 30
- maximum differences in the seed (-k) = 1
- number of threads (-t) = 64
- mismatch penalty (-M) = 6
- gap open penalty (-O) = 15
- gap extension penalty (-E) = 8
1-3. raw SNPs 검색 및 공통염기배열(consensus sequence) 추출
Clean reads를 표준유전체에 맵핑하여 생성된 BAM format의 파일을 SAMtools (0.1.16) 프로그램(http://www.htslib.org/)을 사용하여 raw SNP (In/Del)을 검색하고, 공통염기배열을 추출하였다. 이때, SNP (In/Del) 검색 과정 전에 SEEDERS in-house script (Kim JE, et al., (2014) Mol. Cells, 37:36-42)를 사용하여 SNP (In/Del) 검증(validation)을 거친 후, raw SNP (In/Del) 검색을 수행하였다. 하기의 옵션 이외에는 기본 값을 사용하였다.
- minimum mapping quality for SNPs (-Q) = 30
- minimum mapping quality for gaps (-q) = 15
- minimum read depth (-d) = 3
- maximum read depth (-D) = 87
- min indel score for nearby SNP filtering (-G) = 30
- SNP within INT bp around a gap to be filtered (-w) = 15
- window size for filtering dense SNPs (-W) = 30
1-4. SNP (In/Del) 매트릭스 생성
분석대상 간의 SNP 비교분석을 수행하기 위해 샘플간 통합 SNP matrix를 작성하였다. 각 샘플을 표준유전체와 비교하여 얻은 raw SNP position을 후보로 하여 합집합의 리스트를 구축하고, 이 때, 빈 영역(non-SNP loci)은 샘플의 공통염기배열(consensus sequence)로부터 채워 넣는 과정(filling)을 거쳐 matrix를 작성하였다. 이후 샘플 간의 SNP 비교를 통해 mis-calling된 SNP (In/Del) 좌를 필터하여 final SNP matrix를 작성하고, 해당 좌를 기반으로 SNP (In/Del)을 유형 구분 기준에 따라 분류하였다.
SNP 유형 구분 기준은 다음과 같다: homozygous: read rate ≥90%, heterozygous: 40%≤ read rate ≤60%, 및 기타(Etc): 20%≤ read rate <40%, and 60%< read rate< 90% (read rate : total mapped read 수 대비 변이가 발생한 read수의 비율).
1-5. SNP의 분류
Called SNP 좌를 표준유전체의 유전자 위치정보를 기반으로 'intergenic/genic-region'으로 분류하고, genic-region은 다시 'CDS/intron region'으로 세부 분류를 수행하였다.
1-6. 샘플간 변이 탐색
SNP (In/Del) matrix를 대상으로 비교 샘플간의 염기서열을 비교하여 두 샘플간 서로 차이를 보이는 polymorphic SNP을 탐색하였으며, 기준은 하기와 같다.
- homozygous: read rate ≥100%
- heterozygous: 40%≤ read rate ≤60%
- Min. depth = 10
- Max. depth = 87
실시예 2. 시나노골드와 홍담 사과 간 다형성 SNP 변이 탐색
실시예 1을 통해 분석한 각 샘플의 raw SNP를 이용하여 총 2개 샘플간의 통합 SNP matrix를 작성하고, 필터 기준을 통과한 SNP들을 'homozygous/heterozygous/Etc.' 유형으로 구분하였다(표 1).
또한, 시나노골드(S_Gold) 사과와 홍담(Hongdam) 사과의 염기서열을 비교하여 샘플간 다형성 SNP를 탐색하였으며(표 3), 다형성 Homo SNP 만을 이용하여 Myb 관련 유전자 내 다형성 SNP를 선발하였다. Myb 유전자는 안토시아닌의 생합성을 조절하는 전사 인자(transcription factor)로 여러 식물에서 보고된 바 있다. 과육의 안토시아닌 축적 수준이 상이한 것으로 보이는 시나노골드와 홍담 사과 시료의 특성을 구분할 수 있는 다형성 분자마커를 개발하기 위해, 사과 유전체 내 존재하는 Myb 유전자 1,360개를 탐색하고 조사한 두 계통간에 변이를 보이는 부위를 탐색하였다(표 4). Myb 유전자에 존재하는 68개의 SNP는 시나노골드 및 홍담 사과를 각각 특정하는데 활용할 수 있다고 판단된다.
실시예 3. 시나노골드와 홍담 사과를 판별할 수 있는 분자마커 개발 및 검증
실시예 2를 통해 확인된 시나노골드와 홍담 사과 간 다형성 SNP 중, SNP 변이가 포함된 서열에서 약 400 내지 1,000 bp 이상의 산물이 발생하도록 conventional PCR용 프라이머를 디자인한 후, 디자인된 PCR 산물에서 시나노골드와 홍담 시료에서 제한효소 처리에 의해 서로 다른 크기의 최종 산물이 생성될 수 있도록 CAPS 프라이머 세트를 개발하였다. 선별된 CAPS 마커는 표 5와 같다.
표 5에서 Chr03_23902397 마커의 경우 891 bp의 PCR 산물을 생성하며, ApaⅠ 제한효소 처리 시 시나노골드의 산물은 절단되지 않고 홍담 시료의 산물은 273 bp 및 618 bp크기의 산물로 절단되며, HaeⅢ 제한효소 처리 시 시나노골드의 산물은 583 bp 및 308 bp 크기로 절단되고 홍담 산물은 271 bp, 312 bp 및 308 bp 크기로 절단된다. 또한, Chr06_24548335 마커의 경우 923 bp의 PCR 산물을 생성하며, PstⅠ 제한효소 처리 시 시나노골드의 산물은 절단되지 않고 홍담 산물은 439 bp 및 484 bp 크기로 절단된다. 또한, Chr10_40462537 마커의 경우 759 bp의 PCR 산물을 생성하며, HaeⅢ 제한효소 처리 시 시나노골드의 산물은 131 bp, 198 bp 및 430 bp 크기로 절단되고 홍담 산물은 47 bp, 329 bp 및 383 bp 크기로 절단된다.
선발된 CAPS 마커가 시나노골드와 홍담을 판별할 수 있는지 검증해보았다. 먼저, 사과 DNA 시료 1 ㎕, 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 ㎕(10 pmole), Xeno-2X PCR premix (지노타입, 한국) 10 ㎕ 및 증류수 7 ㎕를 혼합하여 반응물을 조성한 후, 다음의 단계를 통해 PCR을 수행하였다: 초기 변성(initial denaturation) 95℃ 10분; 변성 95℃ 1분, 결합(annealing) 58℃ 1분 및 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 5분.
그 후, 상기 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 반응시킨 후 (HaeⅢ 및 PstI 제한효소는 80℃ 20분, ApaI 제한효소는 65℃ 20분), 반응 산물을 아가로스 겔에 로딩하여 결과를 확인하였다.
분석 결과, Chr10_40462537 마커의 경우 시나노골드 사과 및 홍담 사과 모두에서 증폭산물이 확인되지 않아 마커로 사용불가함을 알 수 있었으며, Chr03_23902397 마커 및 Chr06_24548335 마커는 시나노골드와 홍담 사과를 판별할 수 있는 분자마커로 기능하는 것을 알 수 있었다(도 2).
<110> PARK, Gn Sik
<120> Molecular marker for discriminating Sinano Gold apple and its bud
mutation cultivar and use thereof
<130> PN22063
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<213> Artificial Sequence
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ctccacatcg agcttcaacg 20
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<223> primer
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aaccattctg ttttctttcg tgttggttag atttaagtcc t 101
Claims (5)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; HaeⅢ, ApaI 또는 PstI 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하기 위한 키트.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 완충액을 포함하는 것인, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하기 위한 키트.
- 사과 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 HaeⅢ, ApaI 또는 PstI 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 절단 산물을 확인하는 단계;를 포함하는, 시나노골드 사과와 이의 아조변이 품종인 홍담을 판별하는 방법. - 삭제
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