CN107345252B

CN107345252B - 用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法

Info

Publication number: CN107345252B
Application number: CN201710557210.4A
Authority: CN
Inventors: 张剑锋; 魏攀; 武明珠; 王中; 卢鹏; 金静静; 许亚龙; 李泽锋; 李锋
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2037-07-10
Also published as: CN107345252A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法，属于生物分子鉴别技术领域。本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型，根据品种间多态性SNP位点筛选获得了一套适用于鉴定烤烟秦烟96的特异性SNP标记共12个，其物理位置基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定，包含SNP位点的序列如SEQ ID NO:1～12所示。针对烤烟秦烟96的SNP位点侧翼序列，根据检测方法的不同设计相应引物，可用于烤烟秦烟96的品种鉴定。本发明基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术建立了一套烤烟秦烟96鉴定方法，检测周期短、通量高，结果准确。

Description

用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合，同时还涉及包含该引物组合的试剂盒、应用及鉴定方法，属于生物分子鉴别技术领域。

背景技术

烟草是一种重要的经济作物，是卷烟生产的主要原料。烤烟品种秦烟96由陕西省烟草研究所和中国烟草总公司青州烟草研究所以G-28为母本、净叶黄为父本杂交选育而成，于2009年3月10日通过全国烟草品种审定委员会审定。烤烟秦烟96植株呈筒形，打顶株高143.5cm，茎围10.4cm，节距6.6cm，可采叶片数21～23片；叶形椭圆，叶色绿，叶面较平，茎叶角度中，着叶均匀，腰叶长67.3cm、宽35.0cm；田间生长势强，移栽至现蕾60天左右，大田生育期为119天左右。秦烟96是近年来我国烟叶生产中重要的主栽烤烟品种，也是卷烟生产中重要的工业常用品种。

品种是优质烟叶原料生产的基础，是影响烟叶品质最主要的因素之一。根据《中华人民共和国种子法》和《烟草专卖法》，为保证烟叶生产的稳定性和可持续发展，必须选用经全国烟草品种审定委员会审(认)定的品种，严禁种植劣杂品种。此外，烟草工业生产和产品开发对特定烟叶品种也提出了严格的要求。目前，我国面临着烟草主栽品种遗传背景狭窄，形态学上相似程度高难以区分鉴别的问题。烟草品种的检测方法主要是田间种植鉴定法，但是该方法存在田间种植规模大、鉴别项目多(鉴别性状涉及株高、叶数、节距、叶长、叶宽、茎叶角度等)、周期长(跨越烟草不同生育期)、鉴别难度大(性状指标差异小)、同一性状年度间存在差异(受环境影响)等不足。烟草品种保护，种子纯度的监测，烟叶真假检测等方面，都迫切需要从分子水平上进行烟草DNA身份鉴定。

专利CN105734141A公开了一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法，包括：分别提取对照与待测烟草品种的基因组总DNA，采用最新测序技术对其进行适当深度的全基因组测序，基于烟草基因组参考序列利用生物信息学手段对它们进行序列拼接、组装与全基因组序列比较，统计二者碱基差异，计算出待测烟草品种相对于对照烟草品种的纯度百分比。该方法不受环境条件和季节影响，鉴定结果准确可靠，可从最小遗传单位单碱基变异水平上准确鉴别烟草品种的纯度，用于烟草品种亲本提纯与真伪鉴定。但是该方法操作复杂，检测成本非常高。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。与传统的分子标记相比，SNP标记具有密度高、分布范围广、分型简单等优点。随着全基因组序列鉴定技术以及自动化的SNP芯片分型技术的发展，利用大规模、高通量SNP芯片进行遗传多样性研究已经变得越来越普遍。国家烟草基因研究中心设计研制出首张烟草高密度SNP芯片(420K Tobacco SNP array)，涵盖绝大多数标签SNP位点并均匀分布整个烟草基因组，为从全基因组水平上对烟草品种进行遗传多样性研究提供了便利。采用烟草高密度SNP芯片标记技术对烟草主栽品种的遗传多样性进行分析，可以筛选获得特定主栽品种的特异性SNP分子标记，并依据该特异性SNP标记设计烟草品种鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合。

其次，本发明还提供一种烤烟秦烟96鉴定试剂盒。

再次，本发明再提供一种上述引物组合或试剂盒在烤烟秦烟96品种鉴定方面的应用。

最后，本发明还提供一种能够简单、快速、高效地鉴定烤烟秦烟96的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合，所述引物针对烤烟秦烟96的12个特异性SNP位点侧翼序列设计，具体根据检测方法的不同对应设计引物。这12个SNP标记是基于近年来我国烟草主栽品种全基因组SNP分型结果筛选出来的烤烟秦烟96独有的特异性SNP位点，其物理位置是基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定的，具***点信息如下表1所示，分别命名为FP01～FP12。包含这12个SNP位点的基因序列如SEQ IDNO:1～12所示。

表1 烤烟秦烟96的12个特异性SNP位点信息

所述检测方法可采用SNP经典检测法如PCR-RFLP、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、等位基因特异PCR(AS-PCR)法，或是采用SNPs高通量检测法如DNA测序法、基因芯片技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、Taqman探针法、SNapshot法、MassARRAY分子量阵列技术，以实现烤烟秦烟96的品种鉴定。

烤烟秦烟96鉴定试剂盒，除包含上述引物组合外，还可以包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、PCR Enzyme、SAP酶、SAP缓冲液、iPLEX缓冲液、iPLEX termination mix、iPLEXEnzyme、水等。

上述引物组合或试剂盒在烤烟秦烟96品种鉴定方面的应用。具体为：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中12个SNP位点的基因型与下表2中所示的结果完全一致，则判定该烟草样本为烤烟秦烟96。

表2 烤烟秦烟96中各SNP位点的基因型

本发明优选采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MassARRAY分子量阵列平台)，并基于Assay Design Suit(Agena)针对每个位点设计两条扩增引物和一条延伸引物，引物组合如下表3所示。

表3 基于烤烟秦烟96的特异性SNP位点设计的引物组合

烤烟秦烟96的鉴定方法，包括以下步骤：

1)SNP位点多重PCR扩增反应

以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；

2)SAP酶反应

用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；

3)单碱基延伸反应

在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；

4)基因型检测及结果判定

对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中12个SNP位点的基因型与烤烟秦烟96的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟秦烟96；烤烟秦烟96中12个SNP位点FP01～FP12的基因型依次为AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA。

步骤1)中多重PCR扩增反应为：反应体系：10×PCR缓冲液0.5μL、25mM MgCl₂ 0.4μL、25mM dNTPs 0.1μL、5U/μL PCR Enzyme 0.2μL、1μM扩增引物的混合液(等量混合)1μL、10ng/μL烟草样本基因组DNA 1μL，水补足至5μL；反应条件为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min。

步骤2)中SAP酶反应为：在PCR产物中加入1.7U/μL SAP 0.3μL和10×SAP缓冲液0.17μL，水补足至7μL；反应条件为：37℃40min，85℃5min。

步骤3)中单碱基延伸反应为：在反应产物中加入10×iPLEX缓冲液0.2μL、10×iPLEXtermination mix 0.2μL、33U/μL iPLEX Enzyme 0.041μL和1μM延伸引物的混合液(等量混合)0.94μL，水补足至9μL；反应条件为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min。

步骤4)中预处理为：在延伸产物中加入水41μL，洁净树脂15mg，混匀后进行脱盐去离子防干扰处理，离心取上清液备用。

步骤4)中SNP基因型检测为：利用MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪将上清液点到384点SpectroCHIP芯片上，将芯片置于MassARRAY Typer Workstation MA4中，用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间)质谱仪扫描芯片，得到SNP基因型检测结果。

本发明的有益效果：

本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型，根据品种间多态性SNP位点筛选获得了一套适用于鉴定烤烟秦烟96的特异性SNP标记共12个，其物理位置基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定，具***点信息见上表1，对比栽培烟草参考基因组获得12条包含SNP位点的基因序列，如SEQ IDNO:1～12所示。针对烤烟秦烟96中12个特异性SNP位点侧翼序列，根据检测方法的不同设计相应引物，可用于烤烟秦烟96的品种鉴定。本发明优选采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MassARRAY分子量阵列平台)，基于Assay Design Suit(Agena)针对每个位点设计两条扩增引物和一条延伸引物，引物组合见上表3。

本发明在烤烟秦烟96品种鉴定中，先提取待测样品基因组DNA，再按照MassARRAY***平台操作要求依次进行SNP位点多重PCR扩增、SAP酶除杂和单碱基延伸反应，封片后利用MALDI-TOF质谱仪扫描芯片得到分型结果，若检测样品中SNPA标记FP01～FP12的基因型依次为AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA，则判断该烟草样本为烤烟秦烟96。该方法操作简便，样品用量少，检测周期短，鉴定结果准确，可重复性好，检测通量高，快捷、高效、可靠，是国内外首套烤烟秦烟96品种分子检测体系，为烤烟秦烟96的鉴定技术体系提供了基础和依据，有较好的应用推广前景。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合，针对烤烟秦烟96的特异性SNP位点标记设计，包括：

1)烟草主栽品种全基因组SNP分型检测

利用420K Tobacco SNP array(Affymetrix)对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组扫描，依托国家烟草基因研究中心Gene Titan芯片平台(Affymetrix)进行样本DNA的SNP分型。烟草样品DNA经全基因组扩增后将产物随机片段化为25到125bp之间的片段，片段纯化后进行重悬浮，与420K Tobacco SNP array进行杂交，对每一个SNP通过芯片表面所发生的双色连接反应进行鉴别连接。杂交过程完成后进行严谨性洗涤以去除非特异性结合，连接反应完成后，芯片在Gene Titan多通道自动化芯片工作站上完成染色洗涤等步骤，最后进行扫描并输出结果。将芯片分析获得的数据进行处理，得到不同品种SNP分型结果。

2)烤烟秦烟96特异性SNP位点筛选

根据芯片***数据分级及推荐类型，选取Poly high resolution和Mono highresolution两种类型位点数据，过滤后得到高质量SNP分型结果，保留在所有检测品种中Call rate均为100％的位点，进一步筛选去除在任一品种中出现杂合分型的位点，最终获得在所有检测品种中纯合的SNP位点，筛选获得在烤烟秦烟96中特异性的SNP位点。由于烟草中存在大量重复序列，为避免检测引物设计中出现非特异性扩增，对SNP位点侧翼各200bp序列与参考基因组进行blast比对，筛选基因组中无高度相似序列的位点，结合SNP位点在染色体上分布情况，在存在多态性位点的染色体上挑选一个位点作为烤烟秦烟96的特异性SNP标记，筛选结果见上表1。

3)用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合设计

对筛选得到的特异性SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNP位点的上下游序列，如SEQ ID NO:1～12所示。基于Assay Design Suit(Agena)针对每个位点设计两条扩增引物和一条延伸引物，引物组合见上表3。所述引物均由华大基因合成。

基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的MassARRAY分子量阵列平台可以针对SNP位点设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有极高性价比，特别适合于对有限数量的SNP位点进行大规模分型检测。

实施例2

烤烟秦烟96鉴定试剂盒，包括：实施例1中扩增引物的混合液(1μM)5mL，10×PCR缓冲液5mL，25mM MgCl₂ 4mL，25mM dNTPs 2mL，5U/μL PCR Enzyme 2mL，1.7U/μL SAP 3mL，10×SAP缓冲液3mL，10×iPLEX缓冲液2mL，10×iPLEX termination mix 2mL，33U/μL iPLEXEnzyme 1mL，实施例1中延伸引物的混合液(1μM)5mL，水200mL。

实施例3

烤烟秦烟96的鉴定方法，包括以下步骤：

1、待测样品DNA提取

采用烟草样品的新鲜叶片组织，利用Gene Pure Neway Plant Genomic DNA Kit试剂盒(Gene Answer)提取样品基因组DNA；再用核酸蛋白测定仪NanoDrop ND-2000(Thermo Fisher Scientific)检测DNA浓度，将DNA稀释至10ng/μL备用。

2、MassARRAY检测

操作按照MassARRAY***平台(Agena)要求进行，反应利用iPLEX Gold ReagentKit试剂盒(Agena)，具体为：

1)SNP位点多重PCR扩增反应

以待测样品基因组DNA为模板，利用实施例1中扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；

反应体系为：PCR缓冲液(10×)0.5μL、MgCl₂(25mM)0.4μL、dNTPs(25mM)0.1μL、PCREnzyme(5U/μL)0.2μL、扩增引物的混合液(1μM)1μL、待测样品基因组DNA(10ng/μL)1μL，水补足至5μL；反应条件为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min。

2)SAP酶反应

用SAP酶(虾碱性磷酸酶，shrimp alka-line phosphatase)去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，在步骤1)的PCR产物中加入SAP(1.7U/μL)0.3μL、SAP缓冲液(10×)0.17μL，水补足至7μL；反应条件为：37℃40min，85℃5min，得反应产物。

3)单碱基延伸反应

使用iPLEX Reagent Kit进行延伸反应，在步骤2)的反应产物中加入iPLEX缓冲液(10×)0.2μL、iPLEX termination mix(10×)0.2μL、iPLEX Enzyme(33U/μL)0.041μL、延伸引物的混合液(1μM)0.94μL，水补足至9μL；反应条件为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min，得延伸产物。

4)基因型检测

在步骤3)的延伸产物中加入水41μL，洁净树脂15mg(96孔板)，颠倒摇匀15min进行脱盐去离子防干扰处理，3200g离心5min，取上清液备用；利用MassARRAY NanodispenserRS1000点样仪将上清液点到384点SpectroCHIP(芯片)上；将芯片置于MassARRAY TyperWorkstation MA4中，利用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间)质谱仪扫描芯片，扫描结果以Typer 4.0软件分析并导出结果。

3、检测结果比对

对获得的SNP标记检测结果进行判定，其中检测样品中12个SNP位点的检测结果与秦烟96指纹图谱结果完全一致，判定该样品为烤烟秦烟96。

本发明使用的基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的MassARRAY分子量阵列平台可以针对12个SNP位点设计12重PCR反应和基因型检测，实验设计灵活，分型结果准确性高。可以对12个SNP位点同时进行396份样本的检测，检测通量高。

试验例

以24份已知品种样品为例，采用实施例3中方法进行检测鉴定，验证该方法的特异性，检测结果见下表4。表中参与检测的样品1～24依次为：烤烟K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、云烟85、云烟87、云烟97、云烟100、NC95、龙江911、龙江981、秦烟96、毕纳1号、南江3号，香料烟云香巴斯玛1号、云香2号、Basma，白肋烟鄂烟1号、鄂烟3号、VAM、Burley-21，雪茄烟Beinhart-1000、Havana-10、Florida-301。参与检测的样品中，烤烟K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、云烟85、云烟87、云烟97、云烟100、龙江911、龙江981、秦烟96、毕纳1号、南江3号，香料烟云香巴斯玛1号、云香2号，白肋烟鄂烟1号、鄂烟3号，均为近年来我国烟叶生产中推广使用的主栽品种。

表4 24份已知品种样品检测结果

由表4可知，24份样品中只有样品12的SNP位点检测结果与秦烟96的指纹图谱结果完全一致，说明该检测方法对烤烟秦烟96具有特异性。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法

<170> PatentIn version 3.5

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP01位点的基因序列（N为G或A）

<222> (1)..(201)

<400> 1

TGATACTCAC CAACAGTATT CTGAAGACTC TTTAAACCCT GAAATTAACC CCCTTAATAT 60

CTCCTTAATA AACAATATTA GTTGTATGGA TGAAGATAAA NATCCACGAC ACCTGTCCCA 120

CAACAACTCA TTAGATGCAC AAATGGCCAA TGAAGTAAAA CACTTGCCTA GCACTCTCAA 180

TACCCCAAAT CCTATTAAAA T 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP02位点的基因序列（N为G或T）

<222> (1)..(201)

<400> 2

GCCCCCAACA AGTAGTGACG CCATGTCCTT AGGCAGTGGA CTACGATCGT CATTTCCTTC 60

TCCTGGACAG TATAACGCCT CTTGTCGTTA TTCAACTTTC NACTCTTGAA TGCTATAGGA 120

TGACCCTCTT GCATCAGTAT GCCTTATATA GCAAAATCAG ACGCATTGGT CTGAACTTCA 180

AAAACTTTAG AGAAATCAGG C 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP03位点的基因序列（N为A或C）

<222> (1)..(201)

<400> 3

GCTCGAAAAT CGACGCCCTT ACTCCGGAAT TCGCCCGAGC TTGATATGTG GATACCCTTC 60

GATCGAGATG TCATTGTCTT GGTCAGTCTT TATGACTGAG NATCGATTTT GACTATACAC 120

AAACATAATA GTGTAAAAGA AGTGTCACGA CCCAAAATCT CACCTATCGT GATGACATCT 180

ATCTCAATAC TAGGCAAGCC G 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP04位点的基因序列（N为A或G）

<222> (1)..(201)

<400> 4

CGTTACCTCC TTCACTCTCA CTCATATATT CATGATCCTC ACCCTTACTT TCAGAAACCT 60

CCTCTTCTTC ACTCTGATTT TCTTCTTCTG TAGAATCATT NGCATGTTCA TCTGTCTTAT 120

CCTCTGTATC ACTCTCCTTC TCATCTCCAA ATACTCCCTC ATTCTCACTC TTTTCTTCTT 180

CATTGGGTAT GTTTTAAAAA T 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP05位点的基因序列（N为C或T）

<222> (1)..(201)

<400> 5

AATTGTGATT AGGTGGCATC CATTTTTGCC CCTTTATGTG CTGCTCCTAA GAGAGAGGCA 60

CTTAGAGCGA TGAGTGATGT AGAGTTGTCA CAGAGTATTT NCGGCATGGC TCTACGGGTG 120

TATGCCTCTC TTTTCTTTTT GTCGTTAAAT CTGTTTTACT ATTCTTAGCC CATTATTTTG 180

TTTTGACTTT GTTTTTCATA T 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP06位点的基因序列（N为A或C）

<222> (1)..(201)

<400> 6

GACAAAACCT CTTAATATGA CCCAAATCTC CACACTCGAA GCAACCTCTC CCAGCAAATG 60

GCGAGGGGGA CTGAAGGGAC CCCTGAGCTC CAGGATAACC NCTAGAAGAA CTGGGCGCAG 120

ATGTACCCTG AACTGATGGT GCCTGAGTCA AACTCTAAGC TAGAAGGGCT CTGAGAGATG 180

AGTGGCCCTA ATATGATCTG T 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP07位点的基因序列（N为G或A）

<222> (1)..(201)

<400> 7

CTTGCATCTA GGGTTCATCT CCTTCCTATT CTTGGCTATT CCAGTGTGAT TTCATGAGAA 60

ATCATTCTAT ATTTGTTATG ATCCTTGGGA TTTTAGACAG NCCTCTTCAT CTATATATGG 120

GTTCTTTCAA AACCTTAATT TCTTTTCTAT ACCTCCTAGA TCTGTACAGA TCTAGGACGA 180

TTTGAGTTTG TTTCTTGAAT G 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP08位点的基因序列（N为C或T）

<222> (1)..(201)

<400> 8

TCTTGGTATT CTCTGATAGA TCCGAAGAAC CCGAAGAGAA AGGGTCAGCC GACTACCACC 60

GTAGGCTAGT CTGATGAGCC TTCGGTGTTA GCTGCAGAGT NAGTAGATAT GCCCTCCACC 120

TCAGTAGATC CTTCTGCCAT TGCAGTTGCC ATGCCTCCAC CTTCAGCCGC AGTTCCTCCC 180

TCCTTGGCTT TGAAGCCGAT G 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP09位点的基因序列（N为C或T）

<222> (1)..(201)

<400> 9

CGATCCTGAA TCAATTTAAC CTTTTCCAAA GCATCCTGAA CTAAGTCTGT ACCCAATAGC 60

CTAGCCTCGC TCGGCTCGAG CCAACCACTA GAAACCGGCA NCGCCTACCT TACCAAGCCT 120

CATAGGTACC ATATGAATGC TCGACTGATA ATTGTTGTTG TAAGCAAACT CCGCAAGTGG 180

AAAGAACTGA TCCCAAGCAC C 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP10位点的基因序列（N为C或T）

<222> (1)..(201)

<400> 10

TGGCGGCTTA CATTCAATAT TTTCAAGCAC GTGATAATTG AAGGAAATAG AAATATACAA 60

TTGTCCAACA ACATACCCAT TATATTCTCA TACTTAAGAT NTGAAGAGAG TAGTGTGTAC 120

GCAGAACTTA CCCCTACCTA GTGAAGGTTG AGAGATTGTT TTCAATAATT TAAAGGGCAG 180

CCTGGTGCAC TAAACTCCCG C 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP11位点的基因序列（N为C或T）

<222> (1)..(201)

<400> 11

GTATACGTGG GGGCTGAGTA GTCTGTGGAG GTACACCTTT CCTGAGTCTG GGGAAATCCC 60

TCACCATATG ATGAGTGTCA CCACACTCAA AATAAGCCCT NGGAGGACGT GGATGCAGGA 120

ACTGGCTCGG AACTGATCGT TGAAAGCACC CCGTGCAGAA GGTGCATTAC ATAGTGGCAG 180

TGCATAATGA GGAACTTGAG G 201

<211> 201

<212> DNA

<213> 序列

<221> 包含FP12位点的基因序列（N为G或A）

<222> (1)..(201)

<400> 12

CCCTTCTCAA ACCCCATATG TGAAATTATA CTGAGTTTTT TTTATTGTTG TTGTTATTGT 60

GTTTATTTTC TAGGAATCTG ATACTGTTCT TACTATTACA NATATAGATT TAGTTGAAGT 120

AGTTAAGTAG TTATGATGTA GAGGGTATTT AAGTAAATAG TAGATTGGTT AGTTTAGGCA 180

GTTAAAATAG TATTAATACA C 201

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP01-F

<222> (1)..(30)

<400> 13

ACGTTGGATG AAACCCTGAA ATTAACCCCC 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP01-R

<222> (1)..(30)

<400> 14

ACGTTGGATG ATGAGTTGTT GTGGGACAGG 30

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP01-E

<222> (1)..(16)

<400> 15

GACAGGTGTC GTGGAT 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP02-F

<222> (1)..(30)

<400> 16

ACGTTGGATG GGACAGTATA ACGCCTCTTG 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP02-R

<222> (1)..(30)

<400> 17

ACGTTGGATG CATACTGATG CAAGAGGGTC 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP02-E

<222> (1)..(21)

<400> 18

TCTTGTCGTT ATTCAACTTT C 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP03-F

<222> (1)..(30)

<400> 19

ACGTTGGATG TGTCATTGTC TTGGTCAGTC 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP03-R

<222> (1)..(30)

<400> 20

ACGTTGGATG AGGTGAGATT TTGGGTCGTG 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP03-E

<222> (1)..(22)

<400> 21

CGGGTCAGTC TTTATGACTG AG 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP04-F

<222> (1)..(30)

<400> 22

ACGTTGGATG ACCTCCTCTT CTTCACTCTG 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP04-R

<222> (1)..(30)

<400> 23

ACGTTGGATG GAAGGAGAGT GATACAGAGG 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP04-E

<222> (1)..(19)

<400> 24

ATAAGACAGA TGAACATGC 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP05-F

<222> (1)..(30)

<400> 25

ACGTTGGATG GAGCGATGAG TGATGTAGAG 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP05-R

<222> (1)..(30)

<400> 26

ACGTTGGATG GAAAAGAGAG GCATACACCC 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP05-E

<222> (1)..(23)

<400> 27

TGTAGAGTTG TCACAGAGTA TTT 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP06-F

<222> (1)..(30)

<400> 28

ACGTTGGATG AACCTCTCCC AGCAAATGGC 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP06-R

<222> (1)..(30)

<400> 29

ACGTTGGATG TCAGTTCAGG GTACATCTGC 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP06-E

<222> (1)..(19)

<400> 30

ACTGAGCTCC AGGATAACC 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP07-F

<222> (1)..(29)

<400> 31

ACGTTGGATG GTTATGATCC TTGGGATTT 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP07-R

<222> (1)..(30)

<400> 32

ACGTTGGATG ATCTGTACAG ATCTAGGAGG 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP07-E

<222> (1)..(21)

<400> 33

ACCCATATAT AGATGAAGAG G 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP08-F

<222> (1)..(30)

<400> 34

ACGTTGGATG TGATGAGCCT TCGGTGTTAG 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP08-R

<222> (1)..(30)

<400> 35

ACGTTGGATG GCAATGGCAG AAGGATCTAC 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP08-E

<222> (1)..(18)

<400> 36

CGGTGTTAGC TGCAGAGT 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP09-F

<222> (1)..(30)

<400> 37

ACGTTGGATG TCTGTACCCA ATAGCCTAGC 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP09-R

<222> (1)..(30)

<400> 38

ACGTTGGATG ATGGTACCTA TGAGGCTTGG 30

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP09-E

<222> (1)..(15)

<400> 39

CACTAGAAAC CGGCA 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP10-F

<222> (1)..(31)

<400> 40

ACGTTGGATG CAATTGTCCA ACAACATACC C 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP10-R

<222> (1)..(30)

<400> 41

ACGTTGGATG GGTAAGTTCT GCGTACACAC 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP10-E

<222> (1)..(25)

<400> 42

CCCATTATAT TCTCATACTT AAGAT 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP11-F

<222> (1)..(30)

<400> 43

ACGTTGGATG ACCATATGAT GAGTGTCACC 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP11-R

<222> (1)..(30)

<400> 44

ACGTTGGATG TTCAACGATC AGTTCCGAGC 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP11-E

<222> (1)..(18)

<400> 45

ACACTCAAAA TAAGCCCT 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP12-F

<222> (1)..(30)

<400> 46

ACGTTGGATG CTAGGAATCT GATACTGTTC 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP12-R

<222> (1)..(30)

<400> 47

ACGTTGGATG ACCCTCTACA TCATAACTAC 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物FP12-E

<222> (1)..(23)

<400> 48

CTGATACTGT TCTTACTATT ACA 23

Claims

1.用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合，其特征在于：所述引物针对烤烟秦烟96的12个特异性SNP位点侧翼序列设计，包含这12个SNP位点的基因序列如SEQ ID NO:1~12所示, 所述基因序列SEQ ID NO:1~12的N依次为A、T、C、G、T、C、A、T、T、T、T、A。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述12个特异性SNP位点的引物序列如SEQ ID NO:13~48所示。

3.包含如权利要求1或2所述引物组合的烤烟秦烟96鉴定试剂盒。

4.如权利要求1或2所述引物组合、权利要求3所述试剂盒在烤烟秦烟96品种鉴定方面的应用，其特征在于：包括：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中12个SNP位点的基因型与烤烟秦烟96的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟秦烟96；烤烟秦烟96中12个SNP位点的基因型依次为AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA。

5.采用如权利要求2所述引物组合鉴定烤烟秦烟96的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）SNP位点多重PCR扩增反应

2）SAP酶反应

用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；

3）单碱基延伸反应

4）基因型检测及结果判定

对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中12个SNP位点的基因型与烤烟秦烟96的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟秦烟96；烤烟秦烟96中12个SNP位点的基因型依次为AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1）中多重PCR扩增反应为：反应体系：10×PCR 缓冲液0.5μL、25mM MgCl₂ 0.4μL、25mM dNTPs 0.1μL、5U/μL PCR Enzyme 0.2μL、1μM扩增引物的混合液1μL、10ng/μL烟草样本基因组DNA 1μL，水补足至5μL；反应条件为：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s、80℃ 5s、5个循环，40个循环；72℃ 3min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2）中SAP酶反应为：在PCR产物中加入1.7U/μL SAP 0.3μL和10×SAP 缓冲液0.17μL，水补足至7μL；反应条件为：37℃ 40min，85℃ 5min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3）中单碱基延伸反应为：在反应产物中加入10×iPLEX缓冲液0.2μL、10×iPLEX termination mix 0.2μL、33U/μL iPLEXEnzyme 0.041μL和1μM延伸引物的混合液0.94μL，水补足至9μL；反应条件为：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s、80℃ 5s、5个循环，40个循环；72℃ 3min。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤4）中预处理为：在延伸产物中加入水41μL，洁净树脂15mg，混匀后进行脱盐去离子处理，离心取上清液备用；将上清液点样到芯片上，用MALDI-TOF质谱仪扫描芯片，得到SNP基因型检测结果。