CN112218526A - 用于单倍体胚基因分型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用分子测定对单倍体胚进行基因分型的新型方法。例如，提供了用于基因分型的定量方法。所提供的方法还包括提供多个单倍体籽粒；通过区分所述籽粒的单倍体胚的基因型与所述胚乳基因型来确定其单倍体胚的基因型；选择具有所需基因型的籽粒；以及从所选籽粒产生双单倍体植物。

Description

用于单倍体胚基因分型的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年4月27日提交的美国临时申请号62/663,713的优先权权益，该临时申请的公开内容据此以引用的方式整体并入。

序列表的并入

名称为“MONS433WO_ST25.txt”的文件中所含的序列表以电子方式一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表为1KB(在MS-Windows中测量)并且创建于2019年4月25日。

技术领域

本发明涉及植物育种和分子生物学领域。更具体地，本发明提供了用于单倍体胚基因分型和产生所需基因型的双单倍体植物的方法。

背景技术

在植物育种程序中使用双单倍体(DH)允许在极少的世代中从所需亲本中创建新的近交群体。在玉米中，单倍体是通过与单倍体诱导物(HI)杂交产生的。大多数后代籽粒是包含二倍体胚的那些，但产生了一部分具有单倍体胚的籽粒。用化学物质处理单倍体幼苗以使其染色体数目加倍，生长并自花授粉，以产生二倍体籽粒。二倍体籽粒代表通过DH工艺衍生的新株系。虽然已开发出区分和分选单倍体与二倍体籽粒的方法，但是产生双单倍体植物仍是费力且昂贵的过程。此外，并非所有单倍体籽粒都将具有所需基因型。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种获得具有选定基因型的双单倍体植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多个单倍体籽粒；b)确定所述籽粒的单倍体胚的基因型，其中所述确定包括区分单倍体胚的基因型与包含单倍体胚的籽粒的胚乳基因型；c)选择具有所需基因型的籽粒；以及d)从所选籽粒产生双单倍体植物。在一些实施方案中，确定基因型包括量化存在于标记基因座处的给定单倍体籽粒的胚乳中的等位基因，以确定存在于所述胚乳中的等位基因比率。在其他实施方案中，所述单倍体籽粒的母本和父本中的一个或两个为F₁杂交种。在一些实施方案中，量化存在于标记基因座处的给定单倍体籽粒的胚乳中的等位基因包括确定以较高比率存在于所述标记基因座处的等位基因。在其他实施方案中，确定基因型包括量化存在于两个或更多个标记基因座处的等位基因。在甚至其他实施方案中，量化包括确定以较高比率存在于所述标记基因座处的等位基因。

在一些方面，本文所公开的方法还包括推断存在于与单倍体胚和/或胚乳的基因型相关的一个或多个标记处的一个或多个等位基因。

在另一个方面，本发明提供了一种获得具有选定基因型的双单倍体植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多个单倍体籽粒；b)确定所述籽粒的单倍体胚的基因型，其中所述确定包括区分单倍体胚的基因型与包含单倍体胚的籽粒的胚乳基因型；c)选择具有所需基因型的籽粒；以及d)从所选籽粒产生双单倍体植物；其中所述确定包括在胚乳中检测单倍体籽粒中等位基因的存在或不存在。在一些实施方案中，等位基因的DNA序列存在于单倍体籽粒的原始亲本中，而不存在于单倍体籽粒的单倍体诱导物亲本中。在另一个实施方案中，其中所述等位基因序列在原始亲本中是多态的。在另一个实施方案中，所述确定包括在胚乳中检测所述至少一个等位基因序列的存在，其中等位基因序列是多等位基因多态性。在一些实施方案中，多等位基因多态性选自由以下组成的组：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的***或缺失(InDel)、和DNA序列的简单序列重复(SSR)。在其他实施方案中，多等位基因多态性包括微单倍型。

在另一个方面，本发明提供了一种获得具有选定基因型的双单倍体植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多个单倍体籽粒；b)确定所述籽粒的单倍体胚的基因型，其中所述确定包括区分单倍体胚的基因型与包含单倍体胚的籽粒的胚乳基因型；c)选择具有所需基因型的籽粒；以及d)从所选籽粒产生双单倍体植物；其中所述确定包括在所述胚乳中检测存在于单倍体籽粒中的至少一种单倍型。

在又一个方面，本发明提供了一种获得具有选定基因型的双单倍体植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供多个单倍体籽粒；b)确定所述籽粒的单倍体胚的基因型，其中所述确定包括区分单倍体胚的基因型与包含单倍体胚的籽粒的胚乳基因型；c)选择具有所需基因型的籽粒；以及d)从所选籽粒产生双单倍体植物；其中所述确定包括识别存在于所述胚乳中的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述识别包括等位基因量化测定。在其他实施方案中，等位基因量化测定是定量聚合酶链反应(PCR)。在另一个实施方案中，所述方法还包括将所述核苷酸序列与存在于单倍体籽粒的一个或两个亲本中的基因组序列进行比较。

在一些方面，本文所公开的方法包括提供多个单倍体籽粒，其中所述多个单倍体籽粒包含至少50个、至少250个、至少500个或至少1000个单倍体籽粒。

附图说明

图1：示出了双单倍体(DH)工作流程中的步骤示意图以及加倍之前进行基因分型时工作流程如何变化。

图2A和图2B：示出了正常(二倍体)和单倍体籽粒以及各自存在的染色体比率的图。图2A示出了在玉蜀黍中形成雌配子的典型过程。二倍体细胞(2n)经历减数***，从而形成1n细胞(1)。然后该细胞进一步***以形成含有几个细胞的雌配子体(2)，这些细胞包括***(EC)和中央细胞(CC)。在CC中，存在两个核，所以CC具有两组染色体，而其他细胞(包括EC)具有一组染色体。每个花粉粒中存在两个***细胞(3)。一个***将与EC结合，而另一个***将与CC结合。因为CC中已存在两个核，所以添加***核会形成组合核，每个染色体有三个拷贝，表示为“3n”(4)。CC***形成胚乳，所述胚乳具有2:1母系与父系的染色体比率，而胚具有1:1母系与父系比率。图2B示出了形成单倍体籽粒的过程。在单倍体籽粒中，形成具有典型的2:1母系与父系比率的胚乳。在使用stock 6衍生单倍体诱导物(1)产生的单倍体籽粒中，只有母系染色体存在于胚中。使用基于ig1的单倍体诱导物(2)，回收具有典型2:1母系与父系比率，但在胚中只具有父系染色体的胚乳的籽粒。在ig1单倍体籽粒中，细胞质(线粒体和质体)来自母体。

图3：示出了针对不同情况的一群个体进行测定以确定单倍体诱导杂交中单倍体胚的基因型的Endpoint TaqMan散点图。在所有例示的情况中，TaqMan测定被设计成检测FAM(a1)中的一个等位基因和VIC(a2)中的另一个等位基因。每个测定的个体在散点图上的位置对应于每种颜色(FAM和VIC)的强度。情况#1说明当给定标记的同一等位基因的原始亲本和单倍体诱导物均为纯合时，来自所有测试胚乳的信号将形成单个簇。全部为a1(顶部)或全部为a2(底部)。情况#2显示出对于给定标记的两个等位基因，原始亲本或单倍体诱导物中任一者，但不是两者都是杂合子的情况。在此情况下，来自所测试的胚乳群体的信号将形成两个簇。可通过识别来自该个体的数据点属于哪个簇来确定单倍体胚的基因型。情况#3显示当给定标记的原始亲本和单倍体诱导物均为杂合子时，来自那些亲本的单倍体籽粒分离群体的胚乳的信号将形成四个簇。可通过识别来自该个体的数据点属于哪个簇来确定单倍体胚的基因型。

图4：示出了对来自单倍体籽粒群体的胚乳组织的DNA进行TaqMan测定所产生的三个散点图。在第一种情况下，已知SNP标记“标记01”对于原始具有等位基因“A”和“T”，而在HI中只有“A”等位基因。基于每个个体所属的簇，可将胚乳中的等位基因量化为3:0(“AAA”)或2:1(“TTA”)，并确定单倍体胚的基因型(“A”或“T”)。在第二种情况下，已知SNP标记“标记02”具有两个等位基因“C”和“T”。当对来自单倍体籽粒群体的胚乳的DNA进行TaqMan测定时，数据点形成单个簇。通过纳入具有已知等位基因比率的对照样品，有可能确定所有个体只具有存在于胚乳中的“C”等位基因，并因此在生成数据的所有情况下，此标记的单倍体胚基因型为“C”。在一些样品中，所述测定产生非常低的信号，并且被评为“失败”。在第三种情况下，SNP标记“标记03”在原始和HI中都是“G”和“T”等位基因的杂合子。来自单倍体籽粒的胚乳组织的DNA的TaqMan数据点形成四个簇。对应于顶部两个簇中的数据点的单倍体籽粒在单倍体胚中具有“T”等位基因，而对应于底部两个簇的单倍体籽粒具有“G”等位基因。

图5：示出了使用扩增子测序进行等位基因量化的图解。从两个单倍体籽粒的胚乳中提取的DNA扩增出含有具有两个潜在等位基因“T”(SEQ ID NO:1)和“C”(SEQ ID NO:2)的SNP标记的基因组序列。对所扩增的DNA片段进行测序，并为每次测序读段评估SNP等位基因。在样品A中，22个测序读段含有“T”等位基因，且11个测序读段含有“C”等位基因。“T”和“C”等位基因以约2:1比率存在，指示“T”等位基因来自母体。因为胚和胚乳都含有来自原始的相同等位基因，所以单倍体胚也具有“T”等位基因。在样品B中，32个读段具有“C”等位基因，且1个读段具有“T”等位基因。因为几乎所有读段都具有“C”等位基因，所以胚乳及由此的单倍体胚具有“C”等位基因。“T”读段可能是由于测序错误或在收获组织并从胚乳或其他过程中提取DNA时引入的少量DNA污染引起的。

图6：示出了序列变异和基因组结构变异如何导致可用于单倍体籽粒的基因分型的标记缺失的图解。

图7：示出了存在于一个而不是两个原始亲本中的序列可如何用作单倍体籽粒的基因分型的显性标记的图解。在此图解中，原始中的两个同源染色体区段含有不同的等位基因。等位基因的不同之处在于分别只在“A”或“B”等位基因中存在特定序列。在HI中，在同源染色体区段上存在两个另外的等位基因-一个等位基因“D”含有不存在于其他等位基因上的特定序列。HI中的其他等位基因缺少在其他三个等位基因上存在的各种等位基因特异性序列。

图8：示出了确定胚基因型的微单倍型检测的图解。在此实例中，存在4个微单倍型，其中两个位置处各自的核苷酸不同，第一位置处为“A”且第二位置处为“T”(SEQ ID NO:1)；第一位置处为“A”且第二位置处为“C”(SEQ ID NO:2)；第一位置处为“G”且第二位置处为“C”(SEQ ID NO:3)；或第一位置处为“G”且第二位置处为“T”(SEQ ID NO:4)。

图9：示出了使用多色TaqMan样测定区分微单倍型的图解。在此实例中，原始在给定基因组位置处含有两个微单倍型或等位基因，一个来自其各自的亲本，其中每个微单倍型在两个位置处各自具有不同的核苷酸。HI具有其他两个SNP组合，总共四个不同的微单倍型：(1)PCR引物(F引物和R引物)以及两对探针用于TaqMan测定。两对探针对应于两个SNP位置，并且每个探针为不同的颜色；(2)用反应中存在的探针进行PCR反应；(3)在PCR反应期间，探针与互补SNP杂交(a)，并且在链延伸期间被水解以激活荧光(b)至(c)。

图10：示出了通过低覆盖度测序进行基因分型时要使用的步骤的示意图。

具体实施方式

双单倍体(DH)植物向植物育种者提供了一种有价值的工具，特别是对于产生近交系。由于基本上立即产生纯合株系，因此节省了大量时间，从而无需进行多代常规近交。具体说来，因为DH植物是完全纯合的，所以它们非常适合于定量遗传学研究。对于育种者，DH群体在QTL定位、细胞质转化和性状渗入方面特别有用。此外，在对用于植物育种程序的纯合株系的测定和评估方面存在价值。所有遗传变异都在育种杂交的后代之间，从而提高了选择增益。

然而，DH产生过程效率低，并且可能是劳动密集型的。虽然双单倍体植物可在自然界中自发出现，但这种情况极为罕见。大多数研究和育种应用都依赖于DH产生的人工方法。初始步骤涉及植物的单倍体化，这导致产生包含单倍体种子的群体。非纯合株系与诱导物亲本杂交，导致产生二倍体和单倍体籽粒。具有单倍体胚但正常的三倍体胚乳的籽粒进入第二阶段。从群体中选择单倍体籽粒后，所选籽粒经历染色体加倍以产生双单倍体籽粒。细胞谱系中的自发染色体加倍将导致产生正常配子或从单倍体细胞谱系产生未减数的配子。可使用诸如秋水仙碱的化合物来提高二倍体化的速率。秋水仙碱与微管蛋白结合并防止其聚合成微管，从而在中期阻止有丝***，可用于增加二倍体化(即染色体数目加倍)的速率。这些嵌合植物自花授粉以产生二倍体(双单倍体)种子。培养此DH种子，并随后对其进行评估并将其用于杂交种测交生产中。

即使已经开发试图增加DH产生频率的方法，包括用秋水仙碱处理，但用于产生DH种子的工艺通常效率低下。突出的问题包括配子活力降低，造成供DH植物生成的自花授粉减少以及育种应用中的DH种子产率不足。此外，虽然已在获得大量单倍体籽粒的能力方面取得了进步，但倍增过程仍然缓慢且相对昂贵。通过允许在单倍体籽粒阶段进行选择，本发明的方法代表了显着的进步，使得只有所需单倍体籽粒的选择和再生能够进入加倍步骤，而无需丢弃大量具有非所需基因型的再生植物(图1)。

本发明代表了重大进步，因为其提供用于确定单倍体胚的遗传标记的基因型而不用分析胚组织的方法，从而允许有效产生具有所需的预定基因型的双单倍体(DH)植物。因此，本发明通过在单倍体籽粒阶段选择所需基因型来显著提高DH育种程序的效率，从而消除对于高成本地产生和测试大量具有未知基因型的DH植物的需要。通过消除对于再生由于具有非所需基因型而将被丢弃的大量DH植物的需要，可将资源更有效地导向具有所需基因型的植物的开发。这允许减少识别及产生具有所需表型的植物所需的田间和实验室资源，并提高在给定资源投资下评估数量大得多的具有所需基因型的植物的能力。

在大多数植物基因分型方法中，用于确定基因型的组织含有与植物的其余部分相同的遗传物质(种子籽粒除外)。在雌性生殖结构中，大孢子***若干次以形成胚珠。因为所有胚珠的核都来源于大孢子，所以它们在遗传上是相同的。细胞中的一个被称为中央细胞，其含有两个相同的核。受精后，此细胞将变成胚乳，而***将成为胚。在二倍体籽粒中，中央细胞和***各自含有相同的遗传物质；因此，可使用来自胚乳的组织直接确定二倍体胚的基因型(图2A)。然而，通过评估胚乳来确定单倍体籽粒的胚的基因型需要除了适合二倍体籽粒或植物组织的步骤以外的另外的步骤。在单倍体和二倍体籽粒两者中，胚乳组织为三倍体，其中两个染色体组来源于雌配子，且一个染色体组来源于雄配子。二倍体胚含有一个来源于雌配子的染色体组和一个来源于雄配子的染色体组；然而，单倍体胚仅含有来自非单倍体诱导物配子的染色体，所述非单倍体诱导物配子通常是母系配子(图2B)。在胚乳中，来源于母本的两个染色体组与单倍体胚中的染色体组相同。因此，对单倍体胚的标记进行基因分型等同于识别同一单倍体籽粒的胚乳中的标记的雌性等位基因。可通过对胚乳的三重等位基因的基因型进行评分(FF/M，其中F和M是标记的等位基因，并且/表示来源于母本和父本的两个单独的染色体)或通过利用胚乳2:1的雌性对雄性等位基因比率来确定胚乳中标记的雌性等位基因。如果确定了胚乳的基因型(例如，AA/T，其中A和T为等位基因)，则单倍体胚具有的等位基因是A，并且胚乳从父本得到的等位基因是T。本文所提供的方法使得本领域技术人员能够使用从包含单倍体胚的籽粒获得的胚乳组织可靠地确定单倍体胚的基因型。此外，所述方法还可确定胚乳从其父本得到的等位基因。

在特定的实施方案中，本发明所提供的方法包括使用高通量的非破坏性种子取样来获得胚乳组织用于基因分型。此取样方法允许快速鉴定包含优选或选定基因型的种子，使得仅需选择并发展优选或目标种子，从而节省温室和/或田间地块上的资源。已描述用于种子的高通量的非破坏性取样的设备和方法。例如，美国专利申请公布20060048247；美国专利申请公布20060048248；美国专利申请公布20060042527；美国专利申请公布20060046244；美国专利申请公布20060046264；美国临时申请62/523,072和美国专利申请公布20070204366(其各自以引用的方式整体并入本文)公开了用于种子的自动取样的设备和***以及对种子进行取样、测试和散装的方法。

在一些实施方案中，确定与单倍体籽粒的母本和父本相关的基因型。在玉米中，存在至少两种商业上使用的单倍体诱导(HI)***。第一种是基于用作父本的单倍体诱导株系。此***的诱导株系来源于称为“stock 6”的原始株系。最近显示，这些株系在磷脂酶基因MTL1中含有突变。使用这些株系得到的单倍体籽粒在胚乳中含有来自雌性植物(母本)和HI株系(父本)的染色体，但在单倍体籽粒胚中仅含有来自雌性的染色体。第二HI***是基于单倍体诱导物作为母本。来自受关注株系的花粉与雌性HI株系杂交，所述HI株系含有Ig1基因的突变。所得到的一小部分籽粒将具有单倍体胚，其中大多数单倍体胚仅含有来自父本的染色体(少数籽粒具有的单倍体胚仅含有来自母体的染色体)。本领域技术人员将能够利用本文所提供的方法对由任一HI***所产生的单倍体籽粒进行基因分型。

在本发明的一个方面，单倍体胚的基因分型包括测定一种或多种遗传标记。“标记”、“遗传标记”、“分子标记”、“标记核酸”和“标记基因座”是指在个体具有和/或跨不同个体的两个染色体之间的基因组位置处呈多态的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白质)。标记可来源于基因组核苷酸序列或所表达的核苷酸序列(例如，来自剪接RNA、cDNA等)、或来源于所编码的多肽，并且可通过一个或多个特定的变体序列来表示。“标记探针”是可用于识别标记等位基因的存在的核酸序列或分子，例如，与标记基因座序列互补的核酸探针。或者，在一些方面，标记探针是指可检测标记基因座上特定等位基因的存在的任何类型的探针。“标记基因座”可用于追踪连锁基因座的分离，所述连锁基因座是例如编码或有助于表型性状表达的连锁基因座。例如，标记基因座可用于监测在被遗传上或物理上连接到标记基因座的基因座(诸如定量性状基因座(QTL))处的等位基因的分离。因此，“标记等位基因”或“标记基因座的等位基因”是在对于标记基因座呈多态的群体中的标记基因座处发现的多个多态核苷酸序列中的一个。

“标记”还指的是与基因组序列互补的核酸序列，诸如用作探针的核酸。可通过本领域充分确立的方法来检测与群体成员之间的遗传多态性相对应的标记。这些方法包括，例如，基于PCR的序列特异性扩增方法、单核苷酸多态性(SNP)的检测、限制性片段长度多态性(RFLP)的检测、同工酶标记的检测、等位基因特异性杂交(ASH)的多核苷酸多态性的检测、植物基因组的扩增可变序列的检测、自我维持序列复制的检测、简单序列重复(SSR)的检测或扩增片段长度多态性(AFLP)的检测。已知充分确立的方法还用于检测所表达的序列标签(EST)以及来源于EST序列和随机扩增的多态性DNA(RAPD)的SSR标记。

根据多核苷酸的长度和/或序列将遗传标记彼此(并且与任何特定标记的多个等位基因)相区分。大量的玉米分子标记是本领域中已知的，并且可以从各种来源(诸如MaizeGDB互联网资源)发布或获得。通常，在后代中分离的任何差异遗传的多态性状(包括核酸多态性)都是潜在的遗传标记。

通常，大多数分子标记依赖于核酸的一种或多种特性来确定其基因型。在本文中，核酸分析方法包括但不限于基于PCR的检测方法、微阵列方法、基于质谱的方法和/或核酸测序方法。在一些方面，本发明的方法利用核酸扩增方法来对一个或多个标记基因座进行检测/基因分型。具体地，此类方法提高跨多态性位点或包括位于其远端或近端的位点和序列的多核苷酸的浓度。此类扩增的分子可易于通过凝胶电泳、荧光检测方法或其他手段来检测。在核酸扩增的情形下，“扩增”是指产生所选核酸(或其转录形式)的另外拷贝的任何过程。典型的扩增方法包括各种基于聚合酶的复制方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法诸如连接酶链反应(LCR)和基于RNA聚合酶的扩增(例如，通过转录)方法。在一些实施方案中，使用基于扩增的标记技术，其中将引物或扩增引物对与从第一单倍体籽粒分离的基因组核酸混合，且其中引物或引物对与标记基因座的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用植物基因组核酸作为模板通过DNA聚合酶引发DNA聚合。引物或引物对在具有DNA聚合酶和模板基因组核酸的DNA聚合反应中延伸以产生至少一个扩增子。“扩增子”是扩增的核酸，例如，由通过任何可用的扩增方法(例如，PCR、LCR、转录等)扩增模板核酸而产生的核酸。关于使用这些和其他扩增方法的详情可见于多种标准教科书中的任一本。许多可用的生物学教科书也对PCR和相关的扩增方法进行了广泛讨论，且本领域技术人员将理解，基本上任何RNA均可使用逆转录酶和聚合酶转化为适用于限制性消化、PCR扩增和测序的双链DNA。

标记基因分型并不总是需要扩增(例如，也可使用Southern印迹和RFLP检测)。也可例如通过进行实时扩增反应来在扩增/检测方法中省略单独的检测探针，所述实时扩增反应通过在掺入产物中、将标记的核苷酸掺入扩增子后对相关的扩增引物进行修饰来检测产物的形成，或通过监测与未扩增的前体相比(例如，通过荧光偏振)，扩增子的分子旋转特性的变化来检测产物的形成。

“基因组核酸”是在序列上对应于细胞中可遗传的核酸的核酸。常见的实例包括核基因组DNA及其扩增子。在一些情况下，基因组核酸不同于剪接的RNA或相应的cDNA，因为剪接的RNA或cDNA例如通过剪接机构被加工以除去内含子。基因组核酸任选地包含非转录(例如，染色体结构序列、启动子区、增强子区等)和/或非翻译序列(例如内含子)，而剪接的RNA/cDNA通常不具有非转录序列或内含子。所用的基因组核酸样品包括但不限于直接从植物或种子分离的基因组核酸、克隆的基因组核酸或扩增的基因组核酸。“模板核酸”是在扩增反应(例如，基于聚合酶的扩增反应诸如PCR、连接酶介导的扩增反应诸如LCR、转录反应等)中用作模板的核酸。模板核酸可为基因组起源的，或替代地，可来源于表达序列，例如cDNA或EST。

微阵列也可用于多态性检测，其中寡核苷酸探针组以重叠的方式组装以表示单个序列，使得靶序列在一个点处的差异将造成部分探针杂交。在任何一个微阵列上，预期将存在多个靶序列，其可表示基因和/或非编码区，其中每个靶序列由一系列重叠寡核苷酸而不是单个探针表示。这个平台提供对多种多态性的高通量筛选。单特征多态性(SFP)是由寡核苷酸阵列中的单个探针检测到的多态性，其中特征是阵列中的探针。通过基于微阵列的方法检测靶序列是本领域中已知的。

用于检测多态性(诸如SNP和DNA序列的***或缺失(InDel))的其他方法包括单碱基延伸(SBE)方法。SBE方法的实例是本领域中已知的。SBE方法是基于与多态性相邻的核苷酸引物的延伸，以便在引物延伸时掺入可检测的核苷酸残基。在某些方面，SBE方法使用四个合成的寡核苷酸。两个寡核苷酸用作PCR引物并且与基因组DNA的基因座序列互补，所述基因组DNA的基因座侧接含有待分析的多态性的区域。扩增含有多态性的基因组区域后，将PCR产物与第三和第四寡核苷酸(称为延伸引物)混合，所述第三和第四寡核苷酸被设计成在DNA聚合酶和两个差异标记的双脱氧核苷三磷酸存在下与邻近多态性的扩增DNA杂交。如果模板上存在多态性，则可将标记的双脱氧核苷三磷酸中的一个以单碱基链延伸的方式添加到引物中。然后，通过确定将两个差异标记中的哪个添加到延伸引物中来推断存在的等位基因。纯合样品将造成仅掺入两个标记碱基中的一个，且因此将仅检测到两个标记中的一个。杂合样品具有两个存在的等位基因，并因此将两个标记直接掺入(延伸引物的不同分子中)，并因此将检测到两个标记。

在一些实施方案中，可通过其中寡核苷酸探针的5’荧光报告染料和3’淬灭染料共价连接到探针的5’和3’端的方法来进行等位基因量化。当探针完整时，例如通过Forster型能量转移，报告染料与淬灭染料的接近导致报告染料荧光受到抑制。在PCR期间，正向引物和反向引物与侧接多态性的靶DNA的特异性序列杂交，而杂交探针与扩增的PCR产物内的含多态性的序列杂交。在随后的PCR循环中，具有5’->3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶裂解探针并将报告染料与淬灭染料分离，造成报告物荧光的增加。适于执行本文所述的方法的多种试剂可商购获得，例如购自Applied Biosystems(Foster City,CA)的TaqMan^TM以及购自诸如Biosearch Technologies(Novato,CA)的多个专业供应商。

在一些实施方案中，可使用核酸测序技术对受关注的一个或多个标记基因座直接测序。用于核酸测序的方法是本领域中已知的，并且包括由以下公司提供的技术：454LifeSciences(Branford,CT)、Agencourt Bioscience(Beverly,MA)、Applied Biosystems(Foster City,CA)、LI-COR Biosciences(Lincoln,NE)、NimbleGen Systems(Madison,WI)、Illumina(San Diego,CA)和VisiGen Biotechnologies(Houston,TX)。此类核酸测序技术包括诸如以下的格式：平行珠阵列、连接法测序、毛细管电泳、电子微芯片、“生物芯片”、微阵列、平行微芯片和单分子阵列。

在替代的实施方案中，计算机方法可用于检测受关注的一个或多个标记基因座。例如，可将包含受关注的标记基因座的核酸序列存储在计算机中。可使用由例如在如BLAST这样的现成程序中或甚至是简单的文字处理器中提供的适当的核酸搜索算法来识别所需的标记基因座序列或其同源物。

可在本公开的上下文中使用任何上述标记类型来确定单倍体胚的基因型。

可定量利用胚乳的2:1雌性与雄性等位基因比率来确定胚乳的雌性和/或雄性等位基因，并且各种统计和数据挖掘方法(包括但不限于基于似然度、贝叶斯、机器学习以及基于人工神经元网络的方法)均可用于此目的。一种特定的方法是使用所有可用数据(包括但不限于所研究标记的信息、系谱以及父母和祖先的基因型)来估计所有可能的分阶段胚乳基因型(例如，AA/A、AA/T、TT/A和TT/T，其中A和T表示标记的两个等位基因)的概率。如果作为特定等位基因的归一化似然度高于预定阈值，则可对胚乳的雌性和/或雄性等位基因进行评分。实际上，通常包括一些质量控制措施并对一些误差项(包括但不限于分析中的测序)进行建模。常见的质量控制措施包括但不限于验证籽粒是单倍体籽粒，并且其列出的亲本是单倍体籽粒的正确亲本。

多个相关的(尤其是连锁的)标记的信息可联合用于确定胚乳的雌性和/或雄性等位基因。可用于此目的的不同类型的标记包括但不限于SNP和InDel标记。在一些情况下，可联合评估数据不足以基于其自身数据来调用基因型的多个标记，以确定其基因型。可联合评估个体在不同标记处的不同数据类型(例如，个体在标记1处具有AA基因型并且在标记2处具有G等位基因的五个序列读段)以确定其基因型。在许多情况下，可根据连锁标记的基因型和/或相关个体的基因型推算标记的基因型。同样，不同的统计和数据挖掘方法(包括但不限于基于似然度、贝叶斯、机器学习以及基于人工神经元网络的方法)可用于执行这些联合分析。

在本发明的一个方面，单倍体胚的基因分型包括针对没有用分子方法直接评估的标记确定在单倍体胚中存在的特定等位基因。在此情况下，使用本文所提供的各种方法识别所需标记亚组的等位基因，所述方法包括不使用等位基因比率的方法。使用一种或多种基于遗传连锁原理的数学或逻辑方法来从亚组中确定剩余的所需标记。这些方法中的一些称为推算或推断。

在一些实施方案中，确定来自原始的两个可能的同源多态基因组区域或单倍型中的哪一个存在于单倍体中是通过针对所述基因组区域或单倍型中的一个或多个诊断标记识别单倍体中存在哪个等位基因来完成的。一旦确定了单倍体中的特定区域或单倍型，就可推断出存在于该特定区域或单倍型中的其他标记的等位基因。

从胚乳DNA对单倍体籽粒进行全基因组测序(WGS)可产生对应于若干标记的一个或多个序列，所述标记在来自原始的两个可能的同源多态基因组区域或单倍型之间呈多态。在以低覆盖度进行WGS的情况下，在受关注的基因组区域或单倍型之间呈多态的许多标记将不存在序列覆盖。对于具有序列覆盖度的标记，数量或读段可为几个或只有一个并且覆盖度较低，测序错误的似然度较高。通过将来自多态性基因组区域或单倍型内的多个标记的读段与原始进行比较，可能确定胚乳中存在来自原始的哪个特定的多态性基因组区域或单倍型。在进行此确定时，还应考虑来自HI的DNA的存在。例如，与可能来自原始中的一个区域或来自HI中的同源区域的序列相比，与原始明确相关的序列可被认为是更有力的证据。

本领域技术人员将理解，可使用适当数量的标记来推断或推算单倍体的所有或部分基因组，所述标记可使用本文所提供的方法和参考基因组直接确定。单倍体的推断或推算的基因组的完整度和准确度取决于以下两方面：1)关于原始、原始系谱中的株系或参考基因组的足够的基因组信息的可用性，以及2)针对用于推断或推算的标记的确定的数量、分布和准确性。

定义

“等位基因”是指遗传序列的一种或多种替代形式；等位基因的长度可小至1个核苷酸碱基。它也可以指不存在序列。例如，第一等位基因可出现在一个染色体上，而第二等位基因出现在第二染色体的同源位置上，例如，如对于杂合个体的不同染色体所出现的，或在群体中不同纯合或杂合个体之间所出现的。有利的等位基因是赋予或有助于农学上所需表型的在特定基因座处的等位基因，或替代地，是允许识别可从育种程序或种植中除去的易感植物的等位基因。标记的有利等位基因是与有利表型分离的标记等位基因，或替代地，与易感植物表型分离的标记等位基因，因此提供了识别易病植物的益处。染色***点或区段的有利等位基因形式是包括核苷酸序列的染色***点或区段，所述核苷酸序列有助于物理上位于染色体间隔上的一个或多个遗传基因座处的优良农艺性能。“等位基因频率”是指等位基因在个体内、株系内或株系群体内的基因座处存在的频率(比例或百分比)。例如，对于等位基因“A”，基因型“AA”、“Aa”或“aa”的二倍体个体具有的等位基因频率分别为1.0、0.5或0.0。可通过对来自株系的个体样品的等位基因频率取平均值来估算该株系中的等位基因频率。类似地，可通过对构成群体的株系的等位基因频率取平均值来计算株系群体中的等位基因频率。对于具有有限数量的个体或株系的群体，等位基因频率可表示为含有等位基因的个体或株系(或任何其他指定分组)的计数。当等位基因与性状连锁并且当等位基因的存在指示所需性状或性状形式将出现在包含等位基因的植物中时，等位基因与所述性状正相关。当等位基因与性状连锁并且当等位基因的存在指示所需性状或性状形式将不出现在包含等位基因的植物中时，等位基因与所述性状负相关。

“杂交的”或“杂交”意指通过受精(例如细胞、胚、种子或植物)产生后代，并且包括植物之间的杂交(有性)和自体受精(自交)。

“遗传元件”或“基因”是指具有功能意义的DNA可遗传序列，即基因组序列。术语“基因”也可用于指代例如由基因组序列编码的cDNA和/或mRNA，以及指代该基因组序列。

“基因型”是在一个或多个遗传基因座处的个体(或一群个体)的遗传构成，与可观察到的性状(表型)相对比。基因型是由个体从其亲本处继承的一个或多个已知基因座的一个或多个等位基因定义。术语基因型可用于指代个体在单个基因座处、多个基因座处的遗传构成，或更一般地，术语基因型可用于指代个体在其基因组中所有基因的遗传组成，或其整个基因组成。术语“表型”或“表型性状”或“性状”是指生物体的一个或多个性状。表型可用肉眼观察到，或通过本领域已知的任何其他评估手段观察到，例如显微镜检查、生化分析、基因组分析、对特定疾病抗性的测定等。在一些情况下，表型由单个基因或遗传基因座直接控制，即“单一基因性状”。在其他情况下，表型是几种基因表达及其与环境相互作用的结果。

“单倍体诱导物(HI)”是指当用于遗传杂交中时诱导单倍体胚形成的品种或个体。“HI杂交”是指将来自HI的配子(即***、卵和中央细胞)与非HI株系的配子结合以产生籽粒的行为。在玉米中，HI株系通常来源于两个来源，即Stock 6和ig1。在Stock 6衍生物的情况下，HI被用作HI杂交中的雄性，以产生具有单倍体胚的籽粒，其中基因组仅包含来自卵而不是来自***的遗传物质。在这些单倍体籽粒中，胚乳基因组包含正常二倍体籽粒中所见的母系和父系染色体的典型组合。此典型组合包括来自母体的两组染色体(与在卵中所见的那些相同)和来自***的一组染色体。在ig1 HI的情况下，可回收含有具有来自***而不是来自卵的染色体的胚的籽粒。在这些单倍体籽粒中，胚含有来自母体的叶绿体和线粒体以及来自父体的染色体。与Stock 6衍生物一样，胚乳含有正常二倍体籽粒中所见的母系和父系染色体的典型组合。已描述或可开发其他HI。报道了另一HI株系，其中通过表达修饰的CenH3基因实现单倍体诱导作用。在其他植物中，HI已经通过修饰其他基因产生，并且这些方法可应用于玉米。此外，据报道，通过在杂交期间将油施用于穗上来诱导单倍体。在此情况下，HI可为标准玉米株系，如果不施用油，则不会以有用的速率产生单倍体籽粒。当用于商业应用时，HI通常是两个HI株系之间的杂交种。在这些情况下可使用杂交种HI，因为杂交种比近交系表现出更多的农艺上有价值的特性，包括更旺盛的生长和更丰富的花粉产生。“HI亲本”可指的是用作配子来源(通常是花粉)以产生单倍体籽粒的HI株系，或杂交以形成杂交种HI株系的两个HI株系中的一个。

“基因座”是基因组序列上通常由参考点找到的位置；例如，作为基因、或基因或非基因区的一部分的短DNA序列。本发明的基因座包含群体中一种或多种多态性；即，在一些个体中存在替代等位基因。

“单倍型”是由位于染色体间隔中的标记的等位基因的组合定义，其允许将间隔与同源间隔区分开。为单倍型定义的染色体间隔的大小是参考给定群体确定的，并且旨在提供一种实用的方法来对群体中不同的同源染色体区段进行分类。例如，如果考虑到较大且遗传多样性的群体，则单倍型可包含较短的遗传距离(几厘摩至小于一厘摩)，而在较小的群体中，单倍型的遗传长度可能更长，从而使得对于给定染色体区段，不同单倍型变体的数量可管控。如本文所用，“微单倍型”是指两个或更多个标记的等位基因的组合，这些标记彼此足够接近，从而可使用单分子测定诸如对DNA分子测序或进行TaqMan样测定来对其进行检测。

“原始”是指用于与HI杂交产生单倍体籽粒的原始植物。单倍体籽粒将含有具有从原始株系继承的基因组而不是HI基因组的胚。在一些实施方案中，将两个高性能株系杂交以形成杂交种，然后将杂交种与HI杂交。在此实施方案中，所述杂交种是HI杂交中的“原始”或“原始亲本”。在用Stock 6衍生物进行的HI杂交中，原始是雌性植物。在用基于ig1的诱导物进行的HI杂交中，原始植物被用作花粉来源并与ig1杂交。

如本文所用，术语“多个”是指多于一个。因此，“多个个体”是指至少两个个体。在一些实施方案中，术语多个是指整体的一半以上。例如，在一些实施方案中，“多个群体”是指该群体成员的一半以上。

如本文所用，“多态性”意指在一个或多个个体的群体中的一个或多个基因座处的核酸序列的一种或多种变异的存在。变异可包括但不限于一个或多个碱基改变、一个或多个核苷酸的***、重复或一个或多个核苷酸的缺失。多态性基因座可小至一个碱基对。将第一个鉴定的等位基因形式任意指定为参考形式，并且将其他等位基因形式指定为替代或变异等位基因。在所选群体中最频繁出现的等位基因形式有时被称为野生型形式。二倍体生物对于等位基因形式可以是纯合的或杂合的。二对等位基因或双等位基因多态性具有两种形式。三等位基因多态性具有三种形式。多等位基因多态性具有两种或更多种形式。多态性可能是由于核酸复制中的随机过程、通过突变、作为移动基因组元件的结果、拷贝数变异以及减数***过程期间诸如不等交换、基因组重复以及染色体断裂和融合而引起的。变异通常可在群体中见到或可以较低的频率存在，前者在一般植物育种中具有更大的效用，而后者可能与罕见但重要的表型变异有关。有用的多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列的***或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性和标签SNP。遗传标记、基因、DNA衍生序列、单倍型、RNA衍生序列、启动子、基因的5’非翻译区、基因的3’非翻译区、微RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式可包含多态性。此外，前述拷贝数的存在、不存在或变异可包含多态性。多态性标记或位点是发生变异的基因座。多等位标记可包括具有三个或更多个可能的等位基因的SNP或Indel。

如本文所用，“量化等位基因”是指确定个体中给定基因座处两个不同等位基因的比率。这可以通过执行TaqMan反应和分析来自分离群体的数据散点图、扩增子测序和计数每个等位基因的读取次数、dPCR、qPCR、Invader、阵列结合强度或其他方法来完成。为了识别来自母体的胚乳中给定标记的等位基因，对于给定标记，预期有约2:1的母系与父系比率。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术表示由本发明人发现的且在本发明实践中发挥良好作用的技术。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。更具体地，显而易见的是，在化学上和生理学上都相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的是，所有这种类似的替代和修改被认为处于由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

实施例1：单倍体胚基因分型的定量测定的开发

通常在单倍体籽粒的胚乳中存在2:1的母系DNA与父系DNA比率。在大多数情况下，母本是非单倍体诱导物(HI)植物，且因此为胚乳和单倍体胚贡献了遗传物质。因此，父本通常是HI植物，且仅为胚乳贡献了遗传物质。检测等位基因比率的基因分型方法可用于识别哪个亲本贡献了给定的等位基因。由于HI株系是父系贡献者(在“stock 6”衍生的HI株系的情况下)，以较高比率存在于胚乳中的等位基因来自母系基因组，并将存在于胚中。在母系对于给定等位基因是纯合的情况下，该等位基因将存在于单倍体胚中。

终点TaqMan测定被设计成使用上述原理来确定来自群体的几个个体中的单个标记处的等位基因比率。对于单个标记处的给定等位基因对(a1和a2)，在胚乳中存在四个可能的a1:a2比率：3:0、2:1、1:2和0:3。因为母体贡献了两个等位基因拷贝，所以母系等位基因的比率将为2:1(如果母体和父体贡献不同的等位基因)或3:0(如果母体和父体贡献相同的等位基因)。终点TaqMan测定产生两种颜色的荧光，并且颜色的强度与所测试样品中的标记比率成比例。测定是对来自群体中的几个个体进行的，并且绘制了对应于两个等位基因的荧光强度-一个等位基因的荧光强度在X轴上，而另一个在Y轴上。对应于不同等位基因组合的点形成可彼此区分的簇。基于将给定个体的测定分组的簇，可确定等位基因比率(及由此所测定标记处的胚乳的基因型)(图3)。为标记01、标记02和标记03的标记设计的测定结果示于图4中。通过检测单个标记的等位基因比率所进行的基因分型可使用本领域普通技术人员已知的任何定量方法来完成，所述定量方法包括但不限于qPCR、Invader、数字PCR(dPCR)和纳米孔检测。

可对定量基因分型方法进行复用，以确定多个标记的等位基因比率。进行多重扩增子测序以证明扩增子可被量化和比较，从而确定等位基因比率。对于扩增子测序，使用AmpliSeq多重扩增子测序方法生成约1300个扩增子。设计了1300个PCR引物的池以扩增SNP。提取来自单倍体籽粒胚乳的DNA，并将其用于与SNP特异性引物进行的PCR反应中。处理PCR产物后对扩增子进行测序，所述处理包括除去引物二聚体和添加样品条形码。通过条形码序列识别对应于每个样品的扩增子。为了帮助分析测序数据，开发了使用扩增子计数比率来确定母系贡献的标记等位基因的算法。确定每个标记的两个SNP变体的计数。如果两个SNP变体的比率为约2:1，则结论是单倍体胚具有更丰富的SNP变体(图5)。算法可应用于使用本领域已知的其他方法产生的扩增子，所述方法包括但不限于Roche HeatSeq(MIP)、Affymetrix的Eureka方法、Illumina的TruSeq方法、来自IDT的rhPCR、MegaPCR和iGenomX的靶向文库制备方法。

微阵列也可用作高度复用的定量基因分型测定。Infinium阵列方法收集组中的每个标记的荧光强度。对于每个标记，使用不同的颜色来检测每个等位基因，并且检测到的荧光强度与相应的等位基因的拷贝数成比例。使用相对荧光强度测量来确定标记对于一个或另一个等位基因是纯合的还是杂合的。通过确定在检测到两个等位基因均存在的情况下，哪个等位基因以较高拷贝数存在来将该方法应用于单倍体籽粒。使用两个非HI株系进行单倍体诱导杂交，其中亲本是43.5％血统相同的和65.3％血统相同的。两种情况下的HI株系为INA116/INA124。通过表型筛选识别单倍体籽粒。然后对籽粒进行取样，并且确定来自每个原始的两个籽粒的胚乳基因型。使籽粒发芽，并且从发芽的单倍体植物中获取叶片组织并对其进行基因分型，使得可评估用于确定来自胚乳的单倍体基因型的方法的准确性。包括来自杂交种个体的对照样品，其中DNA取自二倍体叶片组织。在对照样品中，多态性情况的等位基因频率为1:1。通过将在二倍体组织中呈杂合的标记的相对荧光强度与来自单倍体籽粒的相同标记的相对荧光强度进行比较，可确定哪个等位基因以两个拷贝而不是一个拷贝存在。

实施例2：基于在祖细胞中观察到的变异来确定单倍体胚基因型的标记测定的开发

已知玉米株系之间存在大量变异-包括许多序列的存在或不存在。可将两个原始祖细胞之间以及原始祖细胞中的基因座和单倍体诱导物中的基因座之间存在变异的基因座用作标记。在这些情况下，可使用适当的测定区分给定基因座的所有变体，并且可通过如本文所述测定胚乳来确定存在于单倍体胚中的标记。

一个实例是使用包含在原始中存在的多态性序列(即具有***等位基因)以及在单倍体诱导物中不存在的两种变体(即具有缺失纯合子)的基因座(图6)，以确定单倍体胚的基因型(表1)。在图6中，给出的基因座包含其中中间SNP标记(“T”/”G”)在原始中具有多态性的序列。可识别包含缺少序列的基因座变体的HI，并将其用于产生具有原始的单倍体籽粒。可针对标记对由HI产生的单倍体籽粒的胚乳进行评估，并且在胚乳中检测到的等位基因将在单倍体胚中。例如，TaqMan测定可被设计成检测“T”或“G”等位基因。因为胚乳中存在的HI染色体中缺失序列，所以TaqMan测定中使用的引物仅从原始扩增序列。缺少受关注的特定标记的HI株系可通过找到缺少标记序列的株系并执行回交或其他性状转换杂交策略来产生，以将缺少标记的区域移至HI背景中。替代地，可应用基因编辑或突变方法以去除或改变存在于HI中的标记序列。可生成缺少与受关注的标记相对应的大量基因组序列的HI株系。可使用此株系对单倍体籽粒进行基因分型，而无需量化等位基因。

表1.使用胚乳和祖细胞数据对单倍体胚的基因分型^1,2,3

¹T、G表示***等位基因中的多态性的两个等位基因

²D，缺失等位基因

³未知，信息丢失

表1中示出了联合使用祖细胞和胚乳数据来确定单倍体胚的基因型的实例。在此情形下，标记具有三个等位基因：T、G和D缺失，这是多等位标记的特例。缺失可以是不可观察的(例如，整个扩增子在缺失区段内)，也可以是可观察的(例如，引物被设计成产生在缺失的两侧包括大体上长的序列的扩增子)。

另一个实例涉及在小的基因组区段中的三个特定序列(图7)。在此情形下，原始和诱导物的四个祖细胞含有四种不同的微单倍型。可将此多态性视为标记的不同类型，这取决于用于检测这些微单倍型的测定。如果设计三个探针来检测这三个特定序列，则它们将成为邻近的三个显性标记。如果区段含有所有三个特定序列，则它将成为具有总共四个等位基因的一个标记。同样，可设计两到三个SNP标记来区分这四个微单倍型：这两个或三个标记的等位基因组合将自然形成微单倍型，并用于对胚乳和单倍体胚进行基因分型。在每种情况下，联合使用祖细胞和胚乳将实现单倍体胚的更有效的基因分型。

另一个实例是使用仅在原始的一个祖细胞中见到而在单倍体诱导物的祖细胞中不存在的序列作为显性标记。在胚乳组织中检测到原始祖细胞特异性标记指示，存在来自各个祖细胞的特定基因组区域或存在样品污染。最佳地，选择显性标记，使得可针对每个受关注的遗传区域来分析标记对，所述标记来自每个原始祖细胞(图7)。通过将HI株系杂交到由两个原始亲本组成的杂交种雌性上来产生并分选单倍体籽粒后，将对籽粒中两个亲本特异性序列的存在进行分析。在下表2中，给出评估三个样品的胚乳DNA存在或不存在等位基因特异性序列的假设结果。在样品1中，在胚乳中检测到第一特定序列，指示胚乳和单倍体胚都将具有特定序列1(SS1)。在样品2中，在胚乳中检测到第二特定序列，指示胚乳和单倍体胚都将具有特定序列2(SS2)。在胚乳中还检测到第三特定序列，但是因为来自诱导物的染色体不存在于单倍体胚中，所以单倍体胚将仅存在特定序列2(SS2)。在样品3中，检测到特定序列3(SS3)。由于特定序列3(SS3)来自HI，所以它将不存在于单倍体胚中。在此情况下，此数据不允许确定单倍体胚的基因型。

表2.潜在结果和结果的相应解释¹

¹SS表示特定序列

已在玉米株系中识别了三等位基因和四等位基因SNP(具有已知存在于变体核苷酸位置处的三个和四个等位基因的基因座)，并且还可将其用作标记。基于序列的方法可直接测量多等位基因SNP处的核苷酸，以确定胚乳的基因型。借助原始祖细胞和/或诱导物祖细胞的基因型，可有效地确定单倍体胚基因型。

可使用基于PCR的测定(诸如TaqMan、rhAmp-SNP、KASP和分子信标)完成在此类SNP基因座处的单倍体胚的基因分型。在设计此类测定时，原始祖细胞中存在的两个SNP等位基因的探针是确定单倍体胚基因型的唯一必要手段。然而，如果需要的话，可包括第三(或第四)探针以检测单倍体诱导物等位基因。替代地，可使用标记的靶向测序来检测胚乳组织中存在的SNP等位基因。

微单倍型也可用作标记。可将此类标记变体明确地识别为来自原始祖细胞或单倍体诱导物祖细胞中的一个，只要标记变体的各种组合在潜在的祖细胞株系中是不同的。包含微单倍型的单独变体的遗传变异可包括SNP、InDel、SSR或其他遗传变异。可通过本领域已知的测序方法或通过本文所述的方法来完成对微单倍型变体的检测。在使用杂交种HI亲本产生单倍体籽粒的情况下，HI亲本的两个祖细胞的微单倍型等位基因可彼此不同或相同，但它们必须与两个原始祖细胞不同。

进行扩增子测序以证明使用微单倍型等位基因作为单倍体胚基因分型的标记。设计了PCR引物池来检测主要由SNP和少量InDel组成的遗传标记。从单倍体籽粒中提取DNA，并将其用作多重PCR反应中的模板。对所得扩增子进行测序和分析，以使用等位基因频率比确定胚乳的基因型(描述于实施例1中)。为了证明使用微单倍型将来自HI株系的等位基因与来自原始亲本的等位基因相区分的潜力，分析了序列数据以识别扩增子中存在另外的SNP、InDel或其他变异的情况。存在于扩增子中的另外的序列变体允许进一步区分在HI株系与原始亲本之间相同的SNP等位基因(图8)。

可使用除测序以外的分子测定来完成对微单体型的检测。例如，如果包含微单倍型的SNP足够靠近，则可使用本文所述的方法设计和利用区分微单倍型的多色测定。在此情况下，单个引物对可用于扩增受关注的等位基因，如在典型的TaqMan反应中，但也可在反应中包括两个探针对而不是单个探针对，如SNP TaqMan测定中典型的情况。四个探针中的每个都可用不同的染料标记，使得在扩增后，通过各自的荧光色检测每个SNP的存在。使用两个探针对和四种颜色来检测构成微单倍型的SNP。图9示出了两个原始的微单倍型等位基因是“C,C”和“T,A”且HI中存在的微单倍型等位基因是“C,A”和“T,C”的一个实例。在微单倍型中，第一SNP为C或T，并分别用蓝色(B)和黄色(Y)检测，而第二SNP为C或A，并分别用绿色(G)和红色(R)检测。下表3示出了胚乳中存在的两个母系和两个父系等位基因的4种可能组合(样品1至4)以及用四个探针检测得到的颜色组合。使用独特的颜色组合检测所有四个等位基因组合。

表3.贡献等位基因的组合和相应的颜色组合

替代地，可设计引物对，以区别仅在HI亲本中存在的SNP、InDel或其他变异，从而将扩增限制为仅另一附近SNP的原始等位基因。例如，可设计引物，使得错配将出现在例如HI株系中存在但不在原始中的SNP处的寡核苷酸的3’端处或附近。还可设计包含用于第一SNP的等位基因特异性引物和用于第二SNP的探针的引物对，仅当第一和第二SNP都是由引物和探针指定的变体时，才允许对信号进行扩增和检测。这将允许检测到作为两个原始微单倍型中的一个的一部分的SNP，而不受来自HI株系的SNP的干扰。还可设计包含用于检测通用探针的等位基因特异性引物和序列的引物对。替代地，可将通用探针序列添加到正向和反向引物两者中。

实施例3：确定单倍体胚基因型的比较测定的开发

当使用F₁杂交种原始来创建单倍体籽粒时，单倍体中的每个染色体仅以杂交状态经历一次减数***。在每次减数***中，每个染色体臂仅预期有0、1或几次交换，所以大多数等位基因变体处于与亲本中的一个匹配的区块中。因此，相邻的标记可提供另外的信息，从而允许弄清不明确的基因分型情况。如果考虑给定遗传或基因组区域的几个标记，则可以基于胚乳样品中检测到的单倍型，确定F₁杂交种的哪个亲本在单倍体胚中贡献了该区域。

检测固定标记组的方法可用于确定单倍体胚的基因型。为了利用遗传连锁信息，在对任何给定标记进行基因型确定时考虑区域的高密度标记组，所述确定是通过将观察到的标记组合与潜在的标记组合进行比较以确定区域的原始亲本和/或通过使用窗口定义区域并根据与每个亲本匹配的标记数目得出分数进行的。已知原始和单倍体诱导物亲本的标记有助于确定单倍体的基因型。存在最多四种不同的单倍型，每个分别来自原始亲本和单倍体诱导物亲本，其中在单倍体籽粒的胚乳中可存在最多两种-总共最多四种可能的不同单倍型组合。如果两个HI亲本对于给定遗传区域具有相同的单倍型，则HI株系中存在单个单倍型。在此情况下，可能只有两种不同的单倍型组合。可确定给定标记组中所有潜在单倍型组合的预期标记调用。然后通过将观察到的标记调用与潜在标记调用情况进行比较来确定存在于单倍体胚中的单倍型。如果HI株系的标记事先未知，则可通过检查来自HI株系(或如果使用杂交种HI株系，则来自两个近交HI株系)的组织来确定所述标记。如果仅在已知原始亲本的基因型的情况下评估单倍体籽粒群体，则可以通过评估群体的基因分型调用来确定存在于HI亲本中的单倍型。如果确定标记在单倍体胚乳中是纯合的，则观察到的等位基因存在于单倍体胚中。对于在单倍体胚乳中呈纯合的标记，无需了解HI株系的基因分型结果来进行确定。通过评估多个标记，可在给定区域中观察到足够量的标记呈纯合的，以确定区域来自哪个原始亲本。然后可推算该区域中剩余的标记。

检测随机标记组的低覆盖度全基因组测序方法也可用于对单倍体胚进行基因分型(图10)。为了优化利用由单倍体籽粒生成的序列信息，应提供亲本的参考基因组。在许多情况下，亲本的基因组不会被完全测序和组装。在那些情况下，可通过使用本领域已知的方法进行基因分型并从具有基因组序列的相关株系的基因组中进行推算来近似确定亲本参考基因组。替代地，可对亲本株系进行测序以产生基因组信息。在将对来自原始的许多后代进行基因分型的情况下，来自个体后代株系的序列数据可被合并或一起考虑并分析以确定亲本株系的基因组。即使在对亲本基因组进行基因分型并从已知株系推算的情况下，来自个体后代株系的序列数据也可被合并或一起考虑，以确认或完善亲本株系的推算基因组。此外，可通过考虑后代的序列信息来检测或验证存在于亲本株系中的从头变异。通过比较映射到亲本基因组中的给定区域的测序读段的数目，测序数据可用于确定基因组区域来自哪个亲本。通过量化每个区域中的读段数目，可生成分数。在一个区域的得分显著高于另一个区域的情况下，推测个体中的区域来自得分较高的亲本基因组，并且来自亲本基因组的已知标记信息被分配给后代。评分方法可赋予基因组中不同品质或独特性的序列不同的权重。使用本文所述的方法，可存在多达四个不同的亲本基因组进行比较。由于许多读段将来自HI株系，因此在生成分数时必须考虑HI基因组。这可以通过排除读段或改变对与HI株系和原始基因组匹配的序列的分数的相对影响来完成。

长分子测序方法也可用于对单倍体胚进行基因分型。因为长的DNA读段可能包括许多物理连接的序列多态性，所以很可能可以明确确定分子来自潜在亲本基因组中的一个。此外，如果在DNA分子测序期间检测到的等位基因在离散点从一个亲本切换到另一个亲本，则对长分子上遗传变异的评估将允许检测交换。在长分子中，可评估除SNP和小的InDel以外的遗传变异，并将其用于确定分子原始的亲本。例如，重复DNA序列的数目和排列可能是给定亲本的诊断，但此信息不易从许多小序列中获得。同样，在适当情形下，SNP、InDel或重复序列中的其他小变化也可用于识别基因组区域的来源。例如，重复序列的变体可存在于数百个基因组位置，但该特定变体在特定位置处的存在可使其分化。此外，非常长的读段可用于检测和使用结构变异(诸如重复拷贝数)来确定基因型。较短的长读段可用于检测微单倍型。

实施例4：使用来自连锁标记的数据对单倍体胚进行基因分型的定量测定

连锁标记倾向于从亲本一起传递给后代。因此，与亲本中不存在的单体型相比，在后代中更可能观察到连锁标记的亲本单体型。对于两个连锁标记以及许多连锁标记都是如此。此外，可使用标记之间的连锁关系对此过程进行定量建模，这可以通过连锁图来表示。

诸如多重扩增子测序的定量基因分型方法可用于通过基于胚乳的预期比率2:1评估多个扩增子序列读段的观察数据来确定胚乳的雌性和/或雄性等位基因。在验证的系谱信息下，亲本基因型将极大地有助于确定胚乳具有的雌性和/或雄性等位基因。例如，如果两个亲本都具有基因型AA，则后代胚乳通常具有基因型AA/A。通常将需要更多的扩增子序列读段来确定具有基因型AT(AT)的雌性(雄性)亲本的胚乳，而不是具有基因型AT(TT)的雌性(雄性)亲本的胚乳的雌性和/或雄性等位基因。只有当母本是杂合时，胚乳的雌性等位基因才可用于追踪从母本到单倍体籽粒的传递。

样品在标记处具有一些但不足以确定胚乳的雌性和/或雄性等位基因的数据并不罕见。连锁标记上的信息可有助于确定受关注的标记的胚乳基因型。

表4.胚乳的亲本基因型和序列读段^1,2,3

¹标记1与标记2之间的重组分数等于0.005(即标记1与标记2之间的距离等于约0.5cM(厘摩))

²标记1和标记2都具有等位基因A和T，并且X/Y表示具有分别来自其母本和父本的等位基因X和Y的分阶段基因型

³AxTy表示具有在标记位置处分别具有核苷酸A和T的x和y序列读段

对于表4中描述的实例，常规的单标记分析并不生成对于单倍体胚基因型有用的信息。在标记1处，通常认为A3T0的读段数据(即在标记位置分别具有核苷酸A和T的3和0读段)不足以调用单倍体胚等位基因。在标记2处，单倍体胚等位基因预期为A，这与序列读段的数据一致。然而，标记2处的单倍体胚等位基因在追踪基因组从原始到单倍体胚的传递方面没有信息。

如果联合评估标记1和标记2的数据，则可提取有关标记1与标记2之间的基因组区域的传递及其从原始到单倍体胚附近的有用信息。显然，胚乳从其HI近交系得到标记2处的T等位基因(即父系等位基因)。当标记1与标记2之间不存在重组时，胚乳从其HI近交系中得到标记1处的父系等位基因(即T)。由于标记1和标记2紧密相连，因此标记1与标记2之间发生重组事件的概率很低(0.5％)。如果标记1与标记2之间没有发生重组事件，则等位基因A的读段3来自胚乳的母本(即原始)，或是由于过程中的噪音(诸如一个或多个突变或测序错误)引起的。鉴于一些预先指定的过程错误，可估计标记1处单倍体等位基因为A或T的似然度。假设过程噪音相对较低，可将与单倍体等位基因相同的标记1的胚乳雌性等位基因确定为A。

邻域标记信息的使用可延伸到位于标记两侧的多个标记，并且评估中可使用不同类型的标记，包括但不限于SNP和InDel。在一些情况下，可联合评估数据不足以基于其自身数据来调用基因型的多个标记，以确定其基因型。更一般地，在连锁不平衡中被定义为在给定群体中具有等位基因的非随机关联的标记可用于此目的。而且，不同的统计和数据挖掘方法包括但不限于基于似然度、贝叶斯、机器学习和基于人工神经元网络的方法。

实施例5：用于确定单倍体胚基因型的非定量基因分型方法

在此实施例中，单倍体籽粒是从两个不同原始处获得，但在每种情况下，它们都是从使用杂交种诱导物株系的单倍体诱导杂交产生的F1杂交种株系中收获的。先前已确定了用于产生单倍体诱导株系的两个单倍体诱导亲本的基因型和用于产生被单倍体诱导株系杂交的F1个体的亲本的基因型。

将来自每个来源的单倍体玉米籽粒在低浓度漂白剂溶液中浸泡几小时，然后用水冲洗。使用剃须刀除去一小块胚乳籽粒组织，小心不要损伤胚。除去果皮组织后，从一小块胚乳籽粒切片中提取DNA。将剩余的籽粒置于凝胶垫上，用土壤覆盖并放置在生长室中大约6天。幼苗一旦出苗，便立即收获叶切片并提取DNA。

使用玉蜀黍Infinium^R阵列对单倍体叶组织和胚乳切片进行基因分型。仅考虑已知的SNP标记并将其分类为针对一个或另一个等位基因呈纯合的、杂合的或缺失的。

进行了两次实验，最终结果相似。在每种情况下，所评估的SNP标记的总数相似(a.24,614个SNP标记；和b.24,484个SNP标记)。下表5和表6总结了结果，该结果揭示来源于胚乳与单倍体幼苗的基因型之间的高度对应性。

表5.胚乳与单倍体幼苗基因型之间的对应性，情况#1

表6.胚乳与单倍体幼苗基因型之间的对应性，情况#2

Claims (19)

1.一种获得具有选定基因型的双单倍体植物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供多个单倍体籽粒；

b)确定所述籽粒的单倍体胚的基因型，其中所述确定包括区分所述单倍体胚的基因型与包含所述单倍体胚的籽粒的胚乳基因型；

c)选择具有所需基因型的籽粒；以及

d)从所选籽粒产生双单倍体植物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述确定基因型包括量化存在于标记基因座处的给定单倍体籽粒的胚乳中的等位基因，以确定存在于所述胚乳中的等位基因比率。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述单倍体籽粒的母本和父本中的一个或两个为F₁杂交种。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述量化包括确定以较高比率存在于所述标记基因座处的等位基因。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述确定包括量化存在于两个或更多个标记基因座处的等位基因。

6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括推断存在于与权利要求1的所述基因型相关的一个或多个标记处的一个或多个等位基因。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述量化包括确定以较高比率存在于所述标记基因座处的等位基因。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述确定包括在所述胚乳中检测所述单倍体籽粒中等位基因的存在或不存在。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述等位基因的DNA序列存在于单倍体籽粒的原始亲本中，并且不存在于所述单倍体籽粒的所述单倍体诱导物亲本中。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述等位基因序列在原始亲本中是多态的。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述确定包括在所述胚乳中检测所述至少一个等位基因序列的存在，其中所述等位基因序列是多等位基因多态性。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述多等位基因多态性选自由以下组成的组：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的***或缺失(InDel)、和DNA序列的简单序列重复(SSR)。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述多等位基因多态性包括微单倍型。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述确定包括在所述胚乳中检测存在于所述单倍体籽粒中的至少一种单倍型。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述确定包括识别存在于所述胚乳中的核苷酸序列。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述识别包括等位基因量化测定。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述等位基因量化测定是定量聚合酶链反应(PCR)。

18.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括将所述核苷酸序列与存在于所述单倍体籽粒的一个或两个亲本中的基因组序列进行比较。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述多个单倍体籽粒包含至少50个、至少250个、至少500个或至少1000个单倍体籽粒。

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