KR102551410B1 - 개변된 항체 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명자들은 T세포 표면에 발현되고 있는 분자 및 다른 면역세포 표면에 발현되고 있는 분자에 대해 결합 활성을 갖지만 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 제작하는 것에 성공하였다. 본 발명에 의해 T세포와 다른 면역세포가 가교된 경우에 일어날 수 있는 부작용을 회피하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능해져 의약품으로서 적합한 항원 결합 분자가 제공된다.

Description

개변된 항체 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자{Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region}
본 발명은 상이한 2개의 항원(제1 항원 및 제2 항원)에 결합할 수 있으나, 양항원에 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역과 이들 항원과는 다른 제3 항원에 결합하는 항체 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자, 그 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물 및 그들의 제조방법을 제공한다.
항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고, 부작용이 적은 것으로부터 의약품으로서 주목받고 있다(Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078(비특허문헌 1) 및 Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396(비특허문헌 2)). 항체는 항원에 결합하는 작용, 아고니스트 작용이나 안타고니스트 작용뿐 아니라, ADCC(Antibody Dependent Cytotoxicity：항체 의존성 상해활성), ADCP(Antibody Dependent Cell phagocytosis：항체 의존성 세포 식세포 작용), CDC(보체 의존성 세포상해활성) 등의 이펙터 세포에 의한 세포상해활성(이펙터 기능이라고도 함)을 유도한다. 특히 IgG1 서브클래스의 항체가 이펙터 기능을 암세포에 대해 나타내기 때문에 암영역에서 다수의 항체 의약품이 개발되고 있다.
항체가 ADCC, ADCP, CDC를 발현하기 위해서는 항체의 Fc영역과 NK세포나 마크로파지 등의 이펙터 세포에 존재하는 항체 수용체(FcγR) 및 각종 보체 성분이 결합하는 것이 필수이다. 인간의 경우, FcγR의 단백질 패밀리로서 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 아이소폼이 보고되어 있고, 각각의 알로타입도 보고되어 있다(Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65(비특허문헌 3)). 이들 아이소폼 중 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa는 세포 내 도메인에 ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)이라고 불리는 도메인을 가져 활성화 시그널을 전달한다. 반면에 FcγRIIb만이 세포 내 도메인에 ITIM(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif)이라고 불리는 도메인을 가져 억제 시그널을 전달한다. 어떤 FcγR도 면역 복합체 등에 의해 가교(cross-linking)됨으로써 시그널을 전달하는 것이 알려져 있다(Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47(비특허문헌 4)). 실제로 항체가 암세포에 이펙터 기능을 발휘할 때는 암세포 막 상에 복수개 결합하고 있는 항체의 Fc영역에서 이펙터 세포막 상의 FcγR이 클러스터가 되어 이펙터 세포에서 활성화 시그널이 전달된다. 그 결과 살세포 효과가 발휘되나, 이때 FcγR의 가교는 암세포 근방에 존재하는 이펙터 세포로 제한되는 것으로부터 면역의 활성화는 암세포 국소에서만 일어나는 것을 나타내고 있다. (Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81(비특허문헌 5))
천연형의 면역글로불린은 가변영역에서 항원과 결합하고, 불변영역에서 FcγR, FcRn, FcαR, FcεR 등의 수용체나 보체와 결합한다. IgG의 Fc영역에서 상호작용하는 결합 분자 중 하나인 FcRn은 항체의 중쇄 각각에 1 분자씩 결합하기 때문에 IgG형의 항체 1 분자에 대해 2 분자의 FcRn이 결합하는 것이 보고되어 있다. 그러나, FcRn 등과는 다르게 FcγR은 항체의 힌지영역 및 CH2 도메인에서 상호작용 하여 IgG형의 항체 1 분자에 대해 1 분자만 결합한다(J. Bio. Chem., (20001) 276, 16469-16477). 또한 FcγR과 항체의 Fc영역의 결합에는 항체의 힌지영역 및 CH2 도메인 내의 몇 가지의 아미노산 잔기 및 CH2 도메인에 결합되어 있는 EU 넘버링 297번째인 Asn에 부가되는 당쇄가 중요한 것이 나타내어져 있다(Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110(비특허문헌 6), Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104(비특허문헌 7), Immunol. (1995) 86, 319-324(비특허문헌 8)). 이 결합 개소를 중심으로 지금까지 여러 FcγR 결합 특성을 갖는 Fc영역의 변이체가 연구되어 활성화 FcγR에 대한 보다 높은 결합 활성을 갖는 Fc영역 변이체가 얻어져 있다(WO2000/042072(특허문헌 1), WO2006/019447(특허문헌 2)). 예를 들면 Lazar 등은 인간 IgG1의 EU 넘버링 239번째인 Ser, 330번째인 Ala, 332번째인 Ile를 각각 Asn, Leu, Glu로 치환함으로써 인간 FcγRIIIa(V158)에 대한 인간 IgG1의 결합 활성을 약 370배까지 증가시키는 것에 성공하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010(비특허문헌 9), WO2006/019447(특허문헌 2)). 이 개변체는 야생형과 비교하여 FcγRIIIa와 FcγIIb에 대한 결합 활성의 비(A/I비)가 약 9배가 되어 있다. 또한 시나카와(Shinkawa) 등은 EU 넘버링 297번째인 Asn에 부가되는 당쇄의 푸코오스를 결손시킴으로써 FcγRIIIa에 대한 결합 활성을 약 100배까지 증가시키는 것에 성공하였다(J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473(비특허문헌 10)). 이들 방법으로 천연형 인간 IgG1과 비교하여 인간 IgG1의 ADCC 활성을 대폭으로 향상시키는 것이 가능하다.
통상의 천연형의 IgG형 항체는 그의 가변영역(Fab)에 의해 한 에피토프를 인식하여 결합하는 것으로부터 1개의 항원에만 결합할 수 있다. 반면에, 암이나 염증에 있어서는 다종류의 단백질이 관여하는 것이 알려져 있어 단백질끼리가 크로스토크하여 있는 경우가 있다. 예를 들면 면역질환의 경우, 몇 가지의 염증성 사이토카인(TNF, IL1이나 IL6)이 관여하고 있는 것이 알려져 있다(Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10(비특허문헌 11)). 또한 암에 있어서 약제내성을 획득하는 메커니즘의 하나로서 다른 수용체가 활성화하는 것이 알려져 있다(Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51(비특허문헌 12)). 이러한 경우 1개의 에피토프를 인식하는 통상의 항체로는 복수의 단백질을 저해할 수 없다.
복수의 타겟을 저해하는 분자로서 1 분자로 2 종류 이상의 항원과 결합하는 항체(이중특이성 항체라고 함)가 연구되고 있다. 천연형의 IgG형 항체를 개량함으로써 상이한 2개의 항원(제1 항원과 제2 항원)으로의 결합 활성을 부여하는 것이 가능하다(MAbs. (2012) Mar 1, 4(2) ). 그렇기 때문에 2 종류 이상의 항원을 1개의 분자로 중화하는 작용뿐 아니라, 세포상해활성을 갖는 세포와 암세포를 가교함으로써 항종양 활성을 높이는 작용이 있다. 지금까지 이중특이성 항체의 분자형으로서 항체의 N말단이나 C말단에 항원 결합 부위를 부가한 분자(DVD-Ig나 scFv-IgG)나 항체의 2개의 Fab영역이 상이한 서열을 갖는 분자(공통 L쇄 이중특이성 항체 및 하이브리드 하이브리도마), 1개의 Fab영역이 2개의 항원을 인식하는 분자(Two-in-one IgG), CH3영역의 루프 부위를 새로운 항원 결합 부위로 한 분자(Fcab)가 보고되어 있다(Nat. Rev. (2010), 10, 301-316(비특허문헌 13), Peds(2010), 23(4), 289-297(비특허문헌 14)). 어떤 이중특이성 항체도 Fc영역에서 FcγR과 상호작용하는 것으로부터 항체의 이펙터 기능은 보존되고 있다. 따라서, 이중특이성 항체가 인식하는 어떤 항원에 대해서도 FcγR과 동시에 결합하여 항원을 발현하고 있는 세포에 대해 ADCC 활성을 나타낸다.
이중특이성 항체가 인식하는 항원이 모두 암에 특이적으로 발현되고 있는 항원이라면, 어느 항원에 결합해도 암세포에 대해 세포상해활성을 나타내기 때문에 하나의 항원을 인식하는 통상의 항체 의약품보다도 효율적인 항암 효과를 기대할 수 있다. 그러나, 이중특이성 항체가 인식하는 항원 중 어느 하나의 항원이라도 정상조직에 발현하고 있는 경우나 면역세포에 발현하는 세포인 경우 FcγR과의 가교에 의해 정상조직의 상해나 사이토카인의 방출이 일어난다(J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3) , 1246-52(비특허문헌 15)). 그 결과 강한 부작용을 유도하게 된다.
예를 들면 T세포에 발현하고 있는 단백질과 암세포에 발현하고 있는 단백질(암항원)을 인식하는 이중특이성 항체로서 카투막소맙(Catumaxomab)이 알려져 있다. 카투막소맙은 2개의 Fab에서 각각 암항원(EpCAM)과 T세포에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 결합한다. 카투막소맙은 암항원과 CD3ε이 동시에 결합함으로써 T세포에 의한 세포상해활성을 유도하고, 암항원과 FcγR이 동시에 결합함으로써 NK세포나 마크로파지 등의 항원 제시 세포에 의한 세포상해활성을 유도한다. 2개의 세포상해활성을 이용함으로써 카투막소맙은 복강 내 투여로 악성 복수증에서 높은 치료 효과가 나타나 유럽에서 승인되어 있다(Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67(비특허문헌 16)). 또한 카투막소맙 투여로 암세포에 대해 반응하는 항체가 출현한 예가 보고되어 획득면역이 유도되는 것이 명확해졌다(Future Oncol. (2012) Jan 8(1) , 73-85(비특허문헌 17)). 이 결과로부터 T세포에 의한 세포상해활성과 함께 FcγR을 매개로 한 NK세포나 마크로파지 등의 세포에 의한 작용의 양자를 갖는 항체(특히 3작용성 항체라고 부름)는 강한 항종양 효과와 획득면역 유도를 기대할 수 있기 때문에 주목받고 있다.
그러나, 3작용성 항체(trifunctional antibodies)는 암항원이 존재하지 않는 경우라도 CD3ε과 FcγR이 동시에 결합하기 때문에 암세포가 존재하지 않는 환경에서도 CD3ε을 발현하고 있는 T세포와 FcγR을 발현하고 있는 세포가 가교되어 각종 사이토카인이 대량으로 생산된다. 이러한 암항원 비의존적인 각종 사이토카인의 생산 유도로 3작용성 항체의 투여는 현재 복강 내에 한정되어 있어(Cancer Treat Rev. 2010 Oct 36(6), 458-67(비특허문헌 16)), 심각한 사이토카인 스톰과 유사한 부작용으로 전신 투여는 매우 곤란하다(Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep;56(9):1397-406(비특허문헌 18)).
또한 종래 기술의 이중특이성 항체의 경우, 첫번째 항원인 암항원(EpCAM)과 두번째 항원인 CD3ε의 양쪽 항원이 FcγR과 동시에 결합할 수 있기 때문에 FcγR과 두번째 항원인 CD3ε의 동시 결합에 의한 이러한 부작용을 회피하는 것은 분자 구조적으로 불가능하다.
근래, FcγR에 대한 결합 활성을 저감시킨 Fc영역을 사용함으로써 부작용을 회피하면서 T세포에 의한 세포상해활성을 일으키는 개량형 항체가 제공되고 있다(WO2012/073985).
그렇지만, 이러한 항체라도 분자 구조적으로 암항원에 결합하면서 CD3ε과 FcγR의 2개의 면역 수용체에 작용하는 것은 불가능하다.
지금까지 부작용을 회피하면서 암항원 특이적으로 T세포에 의한 세포상해활성과 T세포 이외의 세포에 의한 세포상해활성의 양쪽을 작용시킬 수 있는 항체는 알려져 있지 않다.
WO2000/042072 WO2006/019447
Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3) , 389-396 Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65 Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47 Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81 Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110 Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104 Immunol. (1995) 86, 319-324 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010 J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473 Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10 Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51 Nat. Rev. (2010), 10, 301-316 Peds(2010), 23(4), 289-297 J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3) , 1246-52 Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67 Future Oncol. (2012) Jan 8(1) , 73-85 Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep;56(9):1397-406
본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 과제는 하나의 가변영역이 상이한 2개의 항원(제1 항원과 제2 항원)에 대해 결합 활성을 갖지만 이들 항원에 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역과 이들 항원과는 다른 항원(제3 항원)에 결합하는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자, 그 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물 및 그 항원 결합 분자의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다. 그 결과 본 발명자들은 하나의 가변영역이 상이한 2개의 항원(제1 항원과 제2 항원)에 대해 결합 활성을 갖지만 이들 항원에 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역과 이들 항원과는 다른 항원(제3 항원)에 결합하는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 제작하여, 당해 항원 결합 분자의 3개의 상이한 항원에 대한 결합 활성을 이용함으로써 항원 결합 분자에 의해 생기는 활성을 증강시키는 것에 성공하였다. 또한 지금까지의 다중특이성 항원 결합 분자를 의약품으로서 이용한 경우에 부작용의 원인이 되는 것으로 생각되는, 상이한 세포 상에서 발현되고 있는 항원과 결합함으로써 생기는 당해 상이한 세포 간의 가교(cross-linking)를 회피하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 제작하는 것에 성공하였다.
보다 구체적으로는 본 발명은 아래에 관한 것이다.
〔1〕제1 항원 및 그 제1 항원과는 다른 제2 항원에 결합할 수 있으나 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역, 및
그 제1 항원 및 제2 항원과는 다른 제3 항원에 결합하는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자.
〔2〕제1 항원 및 그 제1 항원과는 다른 제2 항원에 결합할 수 있으나 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않도록 중쇄 가변영역의 아미노산이 개변된 항체 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자.
〔3〕제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역이 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역인, 〔1〕또는〔2〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔4〕추가로 항체의 Fc영역을 포함하는, 〔1〕내지〔3〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔5〕Fc영역의 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역과 비교하여 저하되어 있는 Fc영역인, 〔4〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔6〕다중특이성 항체인, 〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔7〕제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있는 항체 가변영역이 하나 이상의 아미노산의 개변이 도입되어 있는 가변영역인, 〔1〕내지〔6〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔8〕상기 개변이 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 삽입인, 〔7〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔9〕상기 개변이 제1 항원에 결합하는 가변영역의 아미노산 서열 일부의 제2 항원에 결합하는 아미노산 서열로의 치환, 또는 제1 항원에 결합하는 가변영역의 아미노산 서열로의 제2 항원에 결합하는 아미노산 서열의 삽입인, 〔7〕또는〔8〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔10〕삽입되는 아미노산의 수가 1~25개인, 〔8〕또는〔9〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔11〕개변되는 아미노산이 항체 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 또는 FR3영역의 아미노산인, 〔7〕내지〔10〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔12〕개변되는 아미노산이 루프영역의 아미노산인, 〔7〕내지〔11〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔13〕개변되는 아미노산이 항체의 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74 및 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56 및 89~97로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산인, 〔7〕내지〔11〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔14〕제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 하나가 T세포 표면에 특이적으로 발현되고 있는 분자이고, 다른쪽 항원이 T세포 또는 다른 면역세포 표면에 발현되고 있는 분자인, 〔1〕내지〔13〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔15〕제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 하나가 CD3이고, 다른쪽 항원이 FcγR, TLR, 렉틴, IgA, 면역 체크포인트 분자, TNF 슈퍼패밀리 분자, TNFR 슈퍼패밀리 분자 또는 NK 수용체 분자인, 〔14〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔16〕제3 항원이 암조직 특이적으로 발현되고 있는 분자인, 〔14〕또는〔15〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔17〕〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
〔18〕〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 공정(ⅰ)~(ⅳ)를 포함하는 방법：
(ⅰ) 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역의 하나 이상의 아미노산이 개변된 항원 결합 분자로서, 그 개변된 가변영역의 아미노산 중 하나 이상이 서로 다른 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자의 라이브러리를 제작하는 공정,
(ⅱ) 제작된 라이브러리 중에서, 제1 항원 및 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖지만 그 제1 항원 및 제2 항원과 동시에는 결합하지 않는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(ⅲ) 공정(ⅱ)에서 선택된 항원 결합 분자의 상기 가변영역을 코드하는 핵산 및/또는 제3 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 가변영역을 코드하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 배양하여, 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 그 제1 항원과 제2 항원이 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역 및/또는 제3 항원에 결합하는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 발현시키는 공정, 및
(ⅳ) 상기 숙주세포 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정.
〔19〕공정(ⅱ)에서 선택하는 항원 결합 분자에 포함되는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역이 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역인, 〔18〕에 기재된 제조방법.
〔20〕공정(ⅲ)에서 배양하는 숙주세포가 항체의 Fc영역을 코드하는 핵산을 추가로 포함하는, 〔18〕또는〔19〕에 기재된 제조방법.
〔21〕Fc영역의 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역과 비교하여 저하되어 있는 Fc영역인, 〔20〕에 기재된 제조방법.
〔22〕제조하는 항원 결합 분자가 다중특이성 항체인, 〔18〕내지〔21〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔23〕공정(ⅰ)에 있어서의 가변영역의 하나 이상의 개변된 아미노산이 치환 또는 삽입된 아미노산인, 〔18〕내지〔22〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔24〕삽입된 아미노산의 수가 1~25개인, 〔23〕에 기재된 제조방법.
〔25〕개변이 항체 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 또는 FR3영역의 아미노산의 개변인, 〔18〕내지〔24〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔26〕개변이 루프영역의 아미노산의 개변인, 〔18〕내지〔25〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔27〕개변이 항체의 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74 및 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56 및 89~97로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 개변인, 〔18〕내지〔25〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔28〕제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 하나가 T세포 표면에 특이적으로 발현되고 있는 분자이고, 다른쪽 항원이 T세포 또는 다른 면역세포 표면에 발현되고 있는 분자인, 〔18〕내지〔27〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔29〕제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 하나가 CD3이고, 다른쪽 항원이 FcγR, TLR, IgA, 렉틴, 면역 체크포인트 분자, TNF 슈퍼패밀리 분자, TNFR 슈퍼패밀리 분자 또는 NK 수용체 분자인, 〔28〕에 기재된 제조방법.
〔30〕제3 항원이 암조직 특이적으로 발현되고 있는 분자인, 〔28〕또는〔29〕에 기재된 제조방법.
〔31〕〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 투여하는 공정을 포함하는, 암 치료방법.
〔32〕암 치료에 있어서 사용하기 위한, 〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔33〕암 치료제 제조에 있어서의 〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자의 사용.
〔34〕〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 사용하는 공정을 포함하는, 암 치료제를 제조하기 위한 프로세스.
〔35〕상기에 기재된 1 또는 복수의 태양을 임의로 조합한 것도, 당업자의 기술상식을 토대로 기술적으로 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게는 당연히 이해될 것이다.
도 1은 제1 항원과 제2 항원에 결합하나 동시에는 결합하지 않는 항체의 개념도이다.
도 2는 2개의 항원에 동시 결합하지 않기 때문에 가교를 일으키지 않는 항체의 개념 도면이다.
도 3은 2개의 항원에 동시 결합해도 2개의 세포를 동시에 결합하지 않는 항체의 개념 도면이다.
도 4는 암세포와 제1 수용체를 발현하고 있는 T세포를 가교하는 항체의 개념 도면이다.
도 5는 암세포와 제2 수용체를 발현하고 있는 세포를 가교하는 항체의 개념 도면이다.
도 6은 암세포와 면역세포를 가교하나 면역세포끼리를 가교하지 않는 항체의 개념 도면이다.
도 7은 CE115의 CD3ε에 대한 세포 ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 EGFR_ERY22_CE115의 분자형을 나타내는 도면이다.
도 9는 EGFR_ERY22_CE115의 TDCC 결과(SK-pca13a)를 나타내는 그래프이다.
도 10은 인간화 CE115의 CD3ε에 대한 결합성을 나타내는 그래프이다.
도 11은 RGD 삽입 CE115의 인테그린으로의 결합을 검출하는 ECL-ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 RGD 삽입 CE115의 CD3ε으로의 결합을 검출하는 ECL-ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 RGD 삽입 CE115의 인테그린 및 CD3ε으로의 동시 결합을 검출하는 ECL-ELSIA의 결과를 나타내는 그래프이다. 동시 결합하는 개변체에 대한 결과를 나타낸다.
도 14는 RGD 삽입 CE115의 동시 결합 ECL-ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다. 동시 결합하지 않는 개변체에 대한 결과를 나타낸다.
도 15는 TLR2 결합 펩티드 삽입 CE115의 TLR2로의 결합을 검출하는 ECL-ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 TLR2 결합 펩티드 삽입 CE115의 CD3ε으로의 결합을 검출하는 ECL-ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 TLR2 결합 펩티드 삽입 CE115의 TLR2 및 CD3로의 동시 결합을 검출하는 ECL-ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 결합량의 비가 0.8 미만인 항체의 센서그램의 예를 나타내는 도면이다. 세로축은 RU값(리스폰스), 가로축은 시간이다.
도 19는 파지가 제시한 Fab 도메인과 CD3ε, IL6R의 결합을 나타내는 도면이다.
도 20은 파지가 제시한 Fab 도메인과 CD3ε, 인간 IgA(hIgA)의 결합을 나타내는 도면이다. NC는 항원을 고상화하고 있지 않은 플레이트로의 결합을 나타내고 있다.
도 21은 IgG화된 클론의 CD3ε, 인간 IgA(hIgA)의 결합을 나타내는 도면이다.
도 22는 IgG화된 클론과 인간 IgA의 결합이 CD3ε에 의해 저해되어 당해 클론이 인간 IgA(hIgA) 및 CD3ε과 동시에는 결합할 수 없는 것을 나타내는 도면이다.
도 23은 파지가 제시한 Fab 도메인과 CD3ε, 인간 CD154의 결합을 나타내는 도면이다. NC는 항원을 고상화하고 있지 않은 플레이트로의 결합을 나타내고 있다.
도 24는 IgG화된 클론의 CD3ε, 인간 CD154의 결합을 나타내는 도면이다.
도 25는 IgG화된 클론과 인간 CD154의 결합이 CD3ε에 의해 저해되어 당해 클론이 인간 CD154 및 CD3ε과 동시에는 결합할 수 없는 것을 나타내는 도면이다.
본 발명에서 「항체 가변영역」은 통상 4개의 프레임워크 영역(FR)과 그 사이에 끼워진 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region；CDR)으로 구성되는 영역을 의미하며, 항원의 일부 또는 전부에 결합하는 활성을 갖는 한, 그의 부분 서열도 포함된다. 특히 항체 경쇄 가변영역(VL)과 항체 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 영역이 바람직하다. 본 발명의 항체 가변영역은 임의의 서열이어도 되고 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 및 이들 비인간 항체를 인간화한 인간화 항체 및 인간 항체 등 어떠한 유래의 항체 가변영역이어도 된다. 「인간화 항체」란 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭하여지는 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR에 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한 그의 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조).
본 발명의 「항체 가변영역」이 「제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는다」는 것은, 본 발명의 항체 가변영역이 제1 항원에 결합되어 있는 상태에서는 제2 항원과는 결합하지 못하고, 반대로 당해 가변영역이 제2 항원에 결합되어 있는 상태에서는 제1 항원과는 결합할 수 없는 것을 의미한다. 여기서 「제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는다」는 것에는, 제1 항원이 발현하고 있는 세포와 제2 항원이 발현하고 있는 세포의 2개의 세포를 가교하지 않거나 각각 다른 세포에 발현하고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에 결합하지 않는 것도 포함된다. 또한 제1 항원과 제2 항원이 가용형 단백질과 같이 세포막 상에 발현하고 있지 않거나 또는 양쪽이 동일 세포 상에 존재하는 경우에는 제1 항원과 제2 항원 양쪽에 동시에 결합할 수 있으나, 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 경우에는 동시에는 결합할 수 없는 경우도 포함된다. 이러한 항체 가변영역으로서는 당해 기능을 가지고 있는 한 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 IgG형 항체 가변영역의 일부 아미노산을 목적하는 항원에 결합하도록 개변한 가변영역을 들 수 있다. 개변되는 아미노산으로서는, 예를 들면 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역 중 아미노산 개변으로 당해 항원으로의 결합을 상실시키지 않는 아미노산이 선택된다.
여기서 「상이한 세포 상에서 발현」이란 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있으면 되고, 이러한 세포의 조합으로서는, 예를 들면 T세포와 다른 T세포와 같이 동일 종류의 세포여도 되고, T세포와 NK세포와 같이 상이한 종류의 세포여도 된다.
본 발명의 아미노산 개변은 단독으로 사용해도 되고 복수 조합하여 사용해도 된다.
복수 조합하여 사용하는 경우 조합하는 수는 특별히 한정되지 않고, 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내에서 적절히 설정할 수 있으며, 예를 들면 2개 이상 30개 이하, 바람직하게는 2개 이상 25개 이하, 2개 이상 22개 이하, 2개 이상 20개 이하, 2개 이상 15개 이하, 2개 이상 10개 이하, 2개 이상 5개 이하, 2개 이상 3개 이하이다.
복수 조합하는 경우 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에만 당해 아미노산 개변을 가해도 되고, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역 양쪽에 적절히 배분하여 가해도 된다.
개변되는 아미노산 잔기는 그의 항원 결합 활성이 유지되는 한, 가변영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 개변이 허용된다. 가변영역의 아미노산을 개변하는 경우 특별히 한정되지 않으나, 개변 전의 항체의 결합 활성이 유지되어 있는 것이 바람직하고, 예를 들면 개변 전과 비교하여 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 100% 이상의 결합 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한 아미노산 개변으로 결합 활성이 상승해 있어도 되며, 예를 들면 결합 활성이 개변 전과 비교하여 2배, 5배, 10배 등이 되어 있어도 된다.
아미노산 개변을 위한 바람직한 영역으로서는 가변영역 중의 용매에 노출되어 있는 영역 및 루프영역을 들 수 있다. 그 중에서도 CDR1, CDR2, CDR3, FR3영역, 루프영역이 바람직하다. 구체적으로는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74, 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56, 89~97이 바람직하고, H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31, 52a~61, 71~74, 97~101, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 51~56, 89~96이 보다 바람직하다. 또한 아미노산 개변 시에 항원과의 결합 활성을 상승시키는 아미노산을 함께 도입해도 된다.
또한 본 발명에서 「루프영역」이란, 면역글로불린의 β배럴 구조의 유지에 관여하지 않는 잔기가 존재하는 영역을 의미한다.
본 발명에서 아미노산의 개변이란 치환, 결실, 부가, 삽입 또는 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합을 의미한다. 본 발명에서는 아미노산의 개변은 아미노산의 변이로 바꿔 말하는 것이 가능하며, 같은 의미로 사용된다.
아미노산 잔기를 치환하는 경우에는 다른 아미노산 잔기로 치한함으로써, 예를 들면 다음의 (a)~(c)와 같은 점에 대해서 개변하는 것을 목적으로 한다. (a) 시트 구조 또는 나선 구조의 영역에서의 폴리펩티드의 백본 구조；(b) 표적 부위에서의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기.
아미노산 잔기는 일반 측쇄의 특성을 토대로 아래의 그룹으로 분류된다： (1) 소수성： 노르류신(norleucine), met, ala, val, leu, ile； (2) 중성 친수성： cys, ser, thr, asn, gln； (3) 산성： asp, glu； (4) 염기성： his, lys, arg； (5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기： gly, pro； 및 (6) 방향족성： trp, tyr, phe.
이들 각 그룹 내에서의 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환으로 불리는 한편, 타그룹 간에서의 아미노산 잔기의 치환은 비보존적 치환으로 불린다.
본 발명에서의 치환은 보존적 치환이어도 되고 비보존적 치환이어도 되며, 또한 보존적 치환과 비보존적 치환의 조합이어도 된다.
또한 아미노산 잔기에 개변을 가하는 것에는, 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역 중 아미노산 개변으로 당해 항원으로의 결합을 상실시키지 않는 아미노산을 랜덤으로 개변한 것 중에서 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 동시에는 결합할 수 없는 가변영역을 선택하거나, 사전에 목적하는 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있는 것이 알려져 있는 펩티드를 전술한 영역에 삽입하는 개변도 포함된다. 사전에 목적하는 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있는 것이 알려져 있는 펩티드로는, 예를 들면 표 1에 나타낸 펩티드를 들 수 있다.
Figure 112016054179704-pct00001
본 발명의 일태양으로서, 제1 항원 및 그 제1 항원과는 다른 제2 항원에 결합할 수 있으나 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않도록 중쇄 가변영역의 아미노산이 개변된 항체 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자가 제공된다. 예를 들면 전술한 아미노산 개변(치환, 결실, 부가, 삽입 또는 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합)을 중쇄 가변영역에 도입함으로써, 제1 항원 및 그 제1 항원과는 다른 제2 항원에 결합할 수 있으나 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역을 제작할 수 있다. 아미노산 개변을 도입하는 위치는 중쇄 가변영역이 바람직하고, 보다 바람직한 영역으로서는 가변영역 중의 용매에 노출되어 있는 영역 및 루프영역을 들 수 있다. 그 중에서도 CDR1, CDR2, CDR3, FR3영역, 루프영역이 바람직하다. 구체적으로는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74, 95~102가 바람직하고, H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31, 52a~61, 71~74, 97~101이 보다 바람직하다. 또한 아미노산 개변 시에 항원과의 결합 활성을 상승시키는 아미노산을 함께 도입해도 된다.
본 발명의 항체 가변영역에는 전술한 개변에 더하여 공지의 개변이 조합되어 있어도 된다. 예를 들면 가변영역의 N말단 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다. 따라서, 본 발명의 항체는 그 중쇄의 N말단이 글루타민인 경우에는 그것이 피로글루타민산으로 수식된 가변영역을 포함한다.
또한 예를 들면 이들 항체 가변영역에 대해 항원으로의 결합, 약물동태, 안정성, 항원성을 개선하기 위해 추가로 아미노산 개변이 도입된 것이어도 된다. 본 발명의 항체 가변영역을 항원에 대해 pH 의존적인 결합성을 갖는 개변을 가함으로써 항원에 대해 반복 결합하는 것이 가능해도 된다(WO/2009/125825).
또한 예를 들면 이들 항체의 제3 항원에 결합하는 가변영역에 대해 표적 조직 특이적인 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 아미노산 개변을 가하는 것도 가능하다(WO2013/180200).
또한 예를 들면 가변영역의 개변은 결합 활성의 상승, 특이성의 개선, pI의 저하, 항원에 대한 결합에 pH 의존적인 성질의 부여, 결합 열안정성의 개선, 용해성의 개선, 화학수식에 대한 안정성, 당쇄에 유래하는 이질성(heterogeneity)의 개선, 면역원성을 저하시키는 것을 인실리코(in silico) 예측을 사용하여 동정하거나 인비트로(in vitro)의 T세포를 사용한 어세이로 동정한 T세포 에피토프의 회피, 또는 조절 T세포(regulatory T cell)를 활성화하는 T세포 에피토프의 도입 등을 목적으로 한 개변도 실시될 수 있다(mAbs 3:243-247, 2011).
본 발명의 항체 가변영역이 「제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있는」지 여부는 공지의 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
예를 들면 전기화학발광법(ECL법)으로 측정할 수 있다(BMC Research Notes 2011, 4:281 ).
구체적으로는, 예를 들면 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자의 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있는 영역, 예를 들면 Fab영역으로 이루어지는 저분자화된 항체 또는 1가성 항체(통상의 항체가 갖는 2개의 Fab영역 중 1개가 없는 항체)에 sulfo-tag(Ru착체)로 표지된 제1 항원 또는 제2 항원을 혼합하여 스트렙트아비딘 고상화 플레이트 상에 첨가한다. 이때, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자는 플레이트 상의 스트렙트아비딘에 결합된다. Sulfo-tag를 발광시키고 Sector Imager 600, 2400(MSD) 등을 이용하여 그의 발광 시그널을 검출함으로써 제1 항원 또는 제2 항원과 피험 항원 결합 분자의 전술한 영역의 결합을 확인할 수 있다.
또한 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting), ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 비아코어법 등으로 측정하는 것도 가능하다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
구체적으로는, 예를 들면 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 상호작용 해석 기기인 비아코어(Biacore)(GE Healthcare)를 사용하여 측정할 수 있다. 비아코어는 Biacore T100, T200, X100, A100, 4000, 3000, 2000, 1000, C 등 어느 기종도 포함된다. 센서칩에는 CM7, CM5, CM4, CM3, C1, SA, NTA, L1, HPA，Au 칩 등의 비아코어용 센서칩 모두 사용할 수 있다. 센서칩 상에 아민 커플링, 디설피드 커플링, 알데히드 커플링 등의 커플링 방법으로 본 발명의 항원 결합 분자를 보족하는 Protein A, Protein G, Protein L, 항인간 IgG 항체, 항인간 IgG-Fab, 항인간 L쇄 항체, 항인간 Fc 항체, 항원 단백질, 항원 펩티드 등의 보족용 단백질을 고정화한다. 거기에 제1 항원 또는 제2 항원을 애널라이트로서 주입하고 상호작용을 측정하여 센서그램을 취득한다. 이때 제1 항원 또는 제2 항원의 농도는 측정하는 샘플인 KD 등의 상호작용 강도에 맞춰 수 μM 내지 수 pM의 범위에서 실시할 수 있다.
또한 항원 결합 분자가 아닌 제1 항원 또는 제2 항원을 센서칩 상에 고정화하고 거기에 평가하고자 하는 항체 샘플을 상호작용시키는 것도 가능하다. 상호작용의 센서그램에서 산출한 해리상수(KD) 값 또는 항원 결합 분자 샘플을 작용시키기 전후의 센서그램의 증가 정도로부터 본 발명의 항원 결합 분자의 항체 가변영역이 제1 항원 또는 제2 항원에 대한 결합 활성을 가지고 있는지 여부를 판단할 수 있다.
ALPHA 스크린은 도너(Donor)와 억셉터(Acceptor)의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 억셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 시그널이 검출된다. 레이저로 여기된 도너 비드 내의 감광제(photosensitizer)는 주변의 산소를 여기 상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변에 확산되어 근접하고 있는 억셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광 반응을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 억셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용 하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 억셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고 센서칩의 뒤쪽으로부터 금박막과 유리의 경계면에서 전반사하도록 빛을 비추면 반사광의 일부에 반사 강도가 저하된 부분(SPR 시그널)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 주입하여 리간드와 애널라이트가 결합하면 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화로 SPR 시그널의 위치가 시프트한다(반대로 결합이 해리되면 시그널의 위치는 되돌아간다). 비아코어 시스템은 상기의 시프트하는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량변화를 세로축에 취하여 질량의 시간변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램으로부터 센서칩 표면에 보족된 리간드에 대한 애널라이트의 결합량(애널라이트를 상호작용시킨 전후에서의 센서그램 상에서의 리스폰스의 변화량)이 요구된다. 단, 결합량은 리간드의 양에도 의존하기 때문에 비교할 때에는 리간드의 양을 본질적으로 같은 양으로 했다고 간주할 수 있는 조건하에서 비교할 필요가 있다. 또한 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 친화성(KD)이 구해진다. BIACORE법에서는 저해측정법도 적합하게 사용된다. 저해측정법의 예는 Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되어 있다.
본 발명의 항원 결합 분자가 「제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는」지 여부는 제1 항원 및 제2 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있는 것을 확인한 다음, 당해 결합 활성을 갖는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자에 대해 사전에 제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 한쪽을 결합시킨 후에 나머지 한쪽에 대해 결합 활성을 갖는지 여부를 전술한 방법을 사용하여 측정함으로써 확인할 수 있다.
또한 ELISA 플레이트 또는 센서칩에 고정된 제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 한쪽으로의 항원 결합 분자의 결합이 다른쪽을 용액 중에 첨가함으로써 저해되는지 여부를 측정함으로써 확인하는 것도 가능하다.
구체적으로는, 예를 들면 ECL법을 사용하는 경우 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자에 sulfo-tag(Ru착체)로 표지된 제1 항원과 표지되어 있지 않은 제2 항원을 준비한다. 피험 항원 결합 분자가 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 경우, 표지되어 있지 않은 제2 항원 비존재하에서는 피험 항원 결합 분자와 제1 항원의 혼합물을 스트렙트아비딘 고상화 플레이트 상에 첨가하여 Sulfo-tag를 발광시키면 그의 발광 시그널이 검출되나, 제2 항원의 존재하에서는 발광 시그널이 감소한다. 이 발광 시그널의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 활성이 결정될 수 있다.
또한 ALPHA 스크린의 경우 경합하는 제2 항원의 비존재하에서는 피험 항원 결합 분자와 제1 항원은 상호작용하여 520-620 ㎚의 시그널을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 제2 항원은 피험 항원 결합 분자와 제1 항원 간의 상호작용과 경합한다. 경합 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 활성이 결정될 수 있다. 폴리펩티드를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. 제1 항원을 GST로 태그화하는 방법으로서는 제1 항원을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터를 보유한 세포 등에서 발현시켜 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적합하게 해석된다. 이때, 제2 항원을 태그화하고 제1 항원을 태그화하지 않는 것도 동일하게 해석이 가능하다.
또한 형광 공명 에너지 이동(FRET; Fluorescence Resonance Energy Transfer)을 이용한 방법을 사용하는 것도 가능하다. FRET란 근접한 2개의 형광분자 사이에서 여기 에너지가 전자의 공명에 의해 직접 이동하는 현상이다. FRET가 일어나면 도너(여기상태에 있는 형광분자)의 여기 에너지가 억셉터(도너의 근방에 있는 다른 하나의 형광분자)로 이동하기 때문에, 도너로부터 방사되는 형광이 소실(정확하게는 형광 수명이 단축)되고, 대신에 억셉터로부터 형광이 방사된다. 이 현상을 이용하여 듀얼-Fab(dual-Fab)인지 여부를 해석할 수 있다. 예를 들면 형광 도너를 도입한 제1 항원과 형광 억셉터를 도입한 제2 항원이 피험 항원 결합 분자에 동시에 결합하면 도너의 형광은 소실되고 억셉터로부터 형광이 방사되기 때문에 형광 파장의 변화가 일어난다. 이러한 항체는 듀얼-Fab는 아니라고 판단된다. 한편, 제1 항원, 제2 항원, 피험 항원 결합 분자를 혼합했을 때, 제1 항원에 결합시킨 형광 도너의 형광 파장의 변화가 일어나지 않으면 이 피험 항원 결합 분자는 듀얼-Fab라고 할 수 있다.
또한 예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자가 도너 비드 상의 스트렙트아비딘에 결합되고, 억셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)로 태그화된 제1 항원이 결합된다. 경합하는 제2 항원의 비존재하에서는 피험 항원 결합 분자와 제1 항원은 상호작용하여 520-620 ㎚의 시그널을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 제2 항원은 피험 항원 결합 분자와 제1 항원 간의 상호작용과 경합한다. 경합 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 활성이 결정될 수 있다. 폴리펩티드를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. 제1 항원을 GST로 태그화하는 방법으로서는, 제1 항원을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터를 보유한 세포 등에서 발현시켜 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적합하게 해석된다.
또한 태그화는 GST뿐 아니라 히스티딘 태그, MBP, CBP, Flag 태그, HA 태그, V5 태그, c-myc 태그 등의 어떠한 태그여도 되며 한정되지 않는다. 또한 피험 항원 결합 분자의 도너 비드로의 결합에 대해서는 비오틴 스트렙트아비딘 반응을 이용한 결합에 한하면 된다. 특히 피험 항원 결합 분자가 Fc를 포함하는 경우는 도너 비드 상의 Protein A, Protein G 등의 Fc 인식 단백질을 매개로 피험 항원 결합 분자를 결합시키는 방법을 생각할 수 있다.
또한 제1 항원과 제2 항원이 가용형 단백질과 같이 세포막 상에 발현되고 있지 않은 경우 또는 양쪽이 동일 세포 상에 존재하는 경우에는, 제1 항원과 제2 항원 양쪽에 동시에 결합할 수 있으나 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 경우에는 동시에는 결합할 수 없는 경우에 대해서도 공지의 방법을 사용함으로써 측정할 수 있다.
구체적으로는 제1 항원과 제2 항원에 대한 동시 결합을 검출하는 ECL-ELISA에서 양성이 된 경우에도 각각 제1 항원을 발현하는 세포와 제2 항원을 발현하는 세포 및 피험 항원 결합 분자를 혼합한 경우에, 이들 3자가 동시에 결합하지 않는다면 상이한 세포 상에 발현되고 있는 경우에는 동시에는 결합할 수 없는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들면 세포를 사용한 ECL-ELISA법으로 측정하는 것이 가능하다. 사전에 제1 항원을 발현하는 세포를 플레이트에 고상화하여 피험 항원 결합 분자를 결합시킨 후에 제2 항원을 발현하는 세포를 첨가한다. 제2 항원을 발현하는 세포에만 발현하는 다른 항원에 대한 sulfo-tag 표지 항체를 사용하여 검출함으로써 2개의 세포 상에 발현하는 2개의 항원과 동시에 결합되어 있는 경우는 시그널이 관측되고, 동시에 결합하지 않는 경우는 시그널이 관측되지 않는다.
또는 알파스크린법(ALPHAScreen method)으로 측정하는 것이 가능하다. 도너 비드를 결합한 제1 항원을 발현하는 세포, 억셉터 비드를 결합한 제2 항원을 발현하는 세포 및 피험 항원 결합 분자를 혼합했을 때, 2개의 세포 상에 발현되는 2개의 항원과 동시에 결합되어 있는 경우는 시그널이 관측되고, 동시에 결합하지 않는 경우는 시그널이 관측되지 않는다.
또는 Octet을 사용한 상호작용 해석법으로 측정하는 것이 가능하다. 먼저 처음으로, 펩티드 태그를 부가한 제1 항원을 발현하는 세포를 펩티드 태그를 인식하는 바이오센서에 결합시킨다. 제2 항원을 발현하는 세포와 피험 항원 결합 분자를 넣은 웰에서 상호작용 해석을 행했을 때, 2개의 세포 상에 발현되는 2개의 항원과 동시에 결합되어 있는 경우는 피험 항원 결합 분자와 제2 항원을 발현하는 세포가 바이오센서에 결합함으로써 큰 파장 시프트가 관측되고, 동시에 결합하지 않는 경우는 피험 항원 결합 분자만이 바이오센서에 결합하기 때문에 작은 파장 시프트가 관측된다.
또는 결합 활성이 아닌 생물 활성에 의한 측정도 가능하다. 예를 들면 제1 항원을 발현하는 세포, 제2 항원을 발현하는 세포 및 피험 항원 결합 분자를 혼합배양한 경우에, 2개의 세포 상에 발현되는 2개의 항원과 동시에 결합되어 있는 경우는 피험 항원 결합 분자를 매개로 서로 활성화되기 때문에 각각의 항원 하류의 인산화가 증가하는 등의 활성화 시그널의 변화를 검출할 수 있다. 또는 활성화의 결과로서 사이토카인의 생산이 유도되기 때문에 사이토카인의 생산량을 측정함으로써 2개의 세포에 동시에 결합하는지 여부를 판단할 수 있다.
본 발명에서 「Fc영역」은 항체 분자 중의 힌지부 또는 그의 일부, CH2, CH3 도메인으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 영역을 말한다. IgG 클래스의 Fc영역은 EU 넘버링(본 명세서에서는 EU INDEX라고도 불림)으로, 예를 들면 226번째인 시스테인부터 C말단 또는 230번째인 프롤린부터 C말단까지를 의미하나 이에 한정되지 않는다. Fc영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에 프로테인 A 칼럼 또는 프로테인 G 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적합하게 취득할 수 있다. 이러한 단백질 분해 효소로는 pH 등의 효소의 반응조건을 적절하게 설정함으로써 제한적으로 Fab나 F(ab')2를 생성시키도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지는 않고, 예를 들면 펩신이나 파파인 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서의 「항원 결합 분자」란 본 발명의 「항체 가변영역」을 포함하는 분자라면 특별히 한정되지 않으며, 추가로 5 아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드나 단백질이 포함되어 있어도 된다. 생물 유래의 펩티드나 단백질에 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드여도 된다. 또한 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등의 어느 것이어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 들 수 있다.
본 발명의 「Fc영역」으로서, 예를 들면 천연형 IgG 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 여기서 천연형 IgG란 천연으로 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 면역글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그것으로부터 자연스럽게 생성되는 변이체 등도 포함된다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 항체 불변영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는 EU 넘버링 356-358번째 아미노산 서열이 DEL이어도 EEM이어도 된다.
항체의 Fc영역으로서는, 예를 들면 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 타입의 Fc영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 Fc영역은 예를 들면 천연형 인간 IgG 항체 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 본 발명의 Fc영역으로서 예를 들면 천연형 IgG의 불변영역, 구체적으로는 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 불변영역(서열번호：1), 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：2), 천연형 인간 IgG3를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：3), 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：4) 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 천연형 IgG의 불변영역에는 그것으로부터 자연스럽게 생성되는 변이체 등도 포함된다.
본 발명의 Fc영역으로서는 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc영역이 바람직하다. 여기서 Fcγ 수용체(본 명세서에서는 FcγR 또는 Fcγ 리셉터라고 기재하는 경우가 있음)란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 Fc영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하며, 실질적으로 Fcγ 리셉터 유전자에 코드되는 단백질 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우, 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형)을 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)； 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16) 및 어떠한 미발견 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이 유래의 것이 포함되나 이들에 한정되지 않고 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2) 및 어떠한 미발견 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적절한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다.
FcγR에는 ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)을 갖는 활성형 리셉터와 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)을 갖는 억제형 리셉터가 존재한다. FcγR은 FcγRI, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 활성형 FcγR과 FcγRIIb의 억제형 FcγR로 분류된다.
FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 NM_000566.3 및 NP_000557.1로, FcγRIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC020823.1 및 AAH20823.1로, FcγRIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC146678.1 및 AAI46679.1로, FcγRIIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC033678.1 및 AAH33678.1로, 또한 FcγRIIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC128562.1 및 AAI28563.1로 기재되어 있다(RefSeq 등록번호). 또한 FcγRIIa에는 FcγRIIa의 131번째 아미노산이 히스티딘(H형) 또는 아르기닌(R형)으로 치환된 2 종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990). 또한 FcγRIIb에는 FcγRIIb의 232번째 아미노산이 이소류신(I형) 또는 트레오닌(T형)으로 치환된 2 종류의 유전자 다형이 존재한다(Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)). 또한 FcγRIIIa에는 FcγRIIIa의 158번째 아미노산이 발린(V형) 또는 페닐알라닌(F형)으로 치환된 2 종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)). 또한 FcγRIIIb에는 NA1형, NA2형의 2 종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)).
Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는지 여부는 FACS, ELISA 포맷, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등 주지의 방법으로 확인할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은 도너와 억셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 억셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 시그널이 검출된다. 레이저로 여기된 도너 비드 내의 감광제는 주변의 산소를 여기상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변에 확산되어 근접하고 있는 억셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광 반응을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 억셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 억셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 항원 결합 분자가 결합되고, 억셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 변이 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자의 비존재하에서는 야생형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 ㎚의 시그널을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 변이 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자는 야생형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체 등의 항원 결합 분자를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는 Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터를 보유한 세포 등에서 발현시켜 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적합하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 뒤쪽으로부터 금박막과 유리의 경계면에서 전반사 하도록 빛을 비추면, 반사광의 일부에 반사강도가 저하된 부분(SPR 시그널)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 주입하여 리간드와 애널라이트가 결합하면 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화로 SPR 시그널의 위치가 시프트한다(반대로 결합이 해리되면 시그널의 위치는 되돌아간다). 비아코어 시스템은 상기의 시프트하는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축으로 취하여 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 친화성(KD)이 구해진다. BIACORE법에서는 저해측정법도 적합하게 사용된다. 저해측정법의 예는 Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되어 있다.
본 명세서에서 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있다는 것은, 예를 들면 상기의 해석방법을 토대로 대조로 하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성과 비교하여 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.
대조로 하는 항원 결합 분자로서는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：1(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N말단에 A 부가), 서열번호：2(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N말단에 A 부가), 서열번호：3(RefSeq 등록번호 CAA27268.1의 N말단에 A 부가), 서열번호：4(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N말단에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입 항체의 Fc영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자를 피검 물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써 당해 변이체가 갖는 변이에 의한 Fcγ 수용체로의 결합 활성에 대한 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 것이 검증된 Fc영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자가 적절히 제작된다.
이러한 변이체의 예로서는 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산인 231A-238S의 결실(WO 2009/011941), C226S, C229S, P238S, (C220S)(J.Rheumatol (2007) 34, 11), C226S, C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990) 1(1), 47-54), C226S, C229S, E233P, L234V, L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192) 등의 변이체가 공지이다.
즉, 특정 아이소타입 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산；220번 위치, 226번 위치, 229번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 325번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치가 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. Fc영역의 기원인 항체의 아이소타입으로서는 특별히 한정되지 않고 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 적절히 이용될 수 있으나, 천연형 인간 IgG1 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 적합하게 이용된다.
예를 들면 IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)；
(a) L234F, L235E, P331S,
(b) C226S, C229S, P238S,
(c) C226S, C229S,
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A
가 실시되어 있는 Fc영역 또는 231번 위치부터 238번 위치의 아미노산 서열이 결실된 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한 IgG2 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)；
(e) H268Q, V309L, A330S, P331S
(f) V234A
(g) G237A
(h) V234A, G237A
(i) A235E, G237A
(j) V234A, A235E, G237A
가 실시되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한 IgG3 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)；
(k) F241A
(l) D265A
(m) V264A
가 실시되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한 IgG4 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1 문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타냄)；
(n) L235A, G237A, E318A
(o) L235E
(p) F234A, L235A
가 실시되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
그 외의 바람직한 예로서 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산；233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 331번 위치가 대응하는 IgG2 또는 IgG4에서 그 EU 넘버링이 대응하는 아미노산으로 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 들 수 있다.
그 외의 바람직한 예로서 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나 또는 그 이상의 아미노산；234번 위치, 235번 위치, 297번 위치가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 234번 위치, 235번 위치, 297번 위치 중 어느 하나 또는 그 이상의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
그 외의 바람직한 예로서 IgG1 항체의 Fc영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산；265번 위치가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 265번 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
또한 본 발명의 「항원 결합 분자」의 바람직한 태양의 하나로서, 본 발명의 항체 가변영역을 포함하는 다중특이성 항체를 들 수 있다.
다중특이성 항체의 회합화에는 항체 H쇄의 제2 불변영역(CH2) 또는 H쇄의 제3 불변영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않은 H쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에서 H쇄의 다른 불변영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에서의 EU 넘버링 356번째의 잔기, EU 넘버링 439번째의 잔기, EU 넘버링 357번째의 잔기, EU 넘버링 370번째의 잔기, EU 넘버링 399번째의 잔기, EU 넘버링 409번째의 잔기에 상대하는 영역을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 2종의 H쇄 CH3영역을 포함하는 항체에 있어서는 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조(組)로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체로 하는 것이 가능하다； (1) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기, (2) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기, (3) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기.
또한 상기 제1 H쇄 CH3영역과는 다른 제2 H쇄 CH3영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 상기 제1 H쇄 CH3영역에서 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체로 하는 것이 가능하다.
상기 (1)~(3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 회합했을 때에 서로 접근하여 있다. 당업자라면 목적하는 H쇄 CH3영역 또는 H쇄 불변영역에 대해서, 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등으로 상기 (1)~(3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있어, 적절하게 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는 예를 들면 아래의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다；
(a) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서 「동종의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 중 1개 이상의 아미노산 잔기가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에 나머지 아미노산 잔기가 다른 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는 제1 H쇄 CH3영역과 제2 H쇄 CH3영역이 디설피드 결합으로 가교되어 있어도 된다.
본 발명에서 개변에 제공하는 아미노산 잔기로서는 전술한 항체 가변영역 또는 항체 불변영역의 아미노산 잔기로 한정되지 않는다. 당업자라면 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체(heteromultimer)에 대해서, 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등으로 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있어, 회합을 제어하도록 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 다중특이성 항체의 회합화에는 추가로 다른 공지 기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 상대하는 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole; 공극)로 치환하여 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 함으로써 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
이에 더하여, 본 발명의 다중특이성 항체의 형성에는 추가로 다른 공지 기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄의 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 strand-exchange engineered domain CH3를 사용함으로써 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합화를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 일으킬 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지 기술을 사용해도 효율적으로 목적의 다중특이성 항체를 형성시킬 수 있다.
그 외에도 다중특이성 항체의 형성에는 WO2011/028952에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 항체 제작기술, WO2008/119353이나 WO2011/131746에 기재된 따로따로 조제한 단일클론 항체끼리를 사용하여 이중특이성 항체를 제작하는 기술(Fab Arm Exchange), WO2012/058768이나 WO2013/063702에 기재된 항체 중쇄의 CH3 간의 회합을 제어하는 기술, WO2012/023053에 기재된 2 종류의 경쇄와 1종류의 중쇄로 구성되는 이중특이성 항체를 제작하는 기술, Christoph 등(Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))에 기재된 1개의 H쇄와 1개의 L쇄로 이루어지는 항체의 편쇄를 각각 발현하는 2개의 박테리아 세포주를 이용한 이중특이성 항체를 제작하는 기술 등을 사용하는 것도 가능하다. 또한 상기의 회합기술 외에, 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 경쇄 및 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 경쇄를, 각각 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 중쇄 및 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 중쇄에 회합시키는 이종(異種) 경쇄의 회합기술로서 알려져 있는 CrossMab 기술(Scaefer 등(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (2011) 108, 11187-11192))도 본 발명이 제공하는 다중특이성 또는 다중파라토픽 항원 결합 분자를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 따로따로 조제한 단일클론 항체끼리를 사용하여 이중특이성 항체를 제작하는 기술로서, 중쇄 CH3영역에 존재하는 특정 아미노산을 치환한 단일클론 항체를 환원 상황하에 둠으로써, 항체의 헤테로화를 촉진하여 목적하는 이중특이성 항체를 얻는 방법을 들 수 있다. 당해 방법에서의 바람직한 아미노산 치환 부위로서는, 예를 들면 CH3영역에서의 EU 넘버링 392번째의 잔기, EU 넘버링 397번째의 잔기를 들 수 있다. 또한 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체를 이용하여 이중특이성 항체를 제작하는 것도 가능하다； (1) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기, (2) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기, (3) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기. 또한 상기 제1 H쇄 CH3영역과는 다른 제2 H쇄 CH3영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 상기 제1 H쇄 CH3영역에서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체를 이용하여 이중특이성 항체를 제작하는 것도 가능하다.
또한 효율적으로 목적의 다중특이성 항체를 형성시킬 수 없는 경우라도 생산된 항체 중에서 목적의 다중특이성 항체를 분리, 정제함으로써도 본 발명의 다중특이성 항체를 얻는 것이 가능하다. 예를 들면 2 종류의 H쇄의 가변영역에 아미노산 치환을 도입하여 등전점의 차를 부여함으로써, 2 종류의 호모체와 목적의 헤테로 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 또한 헤테로체를 정제하는 방법으로서 지금까지 프로테인 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로테인 A에 결합하지 않는 랫트 IgG2b의 H쇄로 이루어지는 헤테로 이량화 항체를 프로테인 A를 사용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431, WO95033844). 또한 IgG와 Protein A의 결합 부위인 EU 넘버링 435번째 및 436번째 아미노산 잔기를 Tyr, His 등의 Protein A로의 결합력이 상이한 아미노산으로 치환한 H쇄를 사용함으로써 각 H쇄와 Protein A의 상호작용을 변화시켜, Protein A 칼럼을 사용함으로써 헤테로 이량화 항체만을 효율적으로 정제하는 것도 가능하다.
이들 기술을 복수, 예를 들면 2개 이상 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 또한 이들 기술은 회합시키고자 하는 2개의 H쇄에 적절히 따로따로 적용시키는 것도 가능하다. 또한 본 발명의 항원 결합 분자는 상기 개변이 가해진 것을 베이스로 하여 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 분자를 별도 제작한 것이어도 된다.
아미노산 서열의 개변은 당분야에 있어서 공지의 여러 방법으로 행할 수 있다. 이들 방법으로는 다음의 것에 한정되는 것은 아니나, 부위 특이적 변이 유도법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492), PCR 변이법, 카세트 변이법 등의 방법으로 행할 수 있다.
또한 본 발명의 「항원 결합 분자」는 단일의 폴리펩티드 사슬 내에 본 발명의 「항체 가변영역」을 형성하는 중쇄 및 경쇄의 양쪽을 포함하나, 불변영역을 결여하고 있는 항체 단편이어도 된다. 이러한 항체 단편으로서는 예를 들면 디아바디(diabody；Db), 단일 사슬 항체, sc(Fab')2여도 된다.
Db는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다이머(Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404，097호, W093/11161호 등)로, 각각의 폴리펩티드 사슬은 같은 사슬 중에서 L쇄 가변영역(VL) 및 H쇄 가변영역(VH)이 서로 결합할 수 없는 정도로 짧은, 예를 들면 5잔기 정도의 링커로 결합되어 있다.
동일 폴리펩티드 사슬 상에 코드되는 VL과 VH는 그 사이의 링커가 짧기 때문에 단일 사슬 가변영역 프래그먼트를 형성하지 못하여, 이량체화함으로써 2개의 항원 결합 부위를 형성한다.
단일 사슬 항체로서는 예를 들면 sc(Fv)2를 들 수 있다. sc(Fv)2는 2개의 VL과 2개의 VH의 4개의 가변영역이 펩티드 링커 등의 링커로 연결되어 한개의 사슬을 구성하는 단일 사슬 항체이다(J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189). 이 2개의 VH와 VL은 상이한 단일클론 항체로부터 유래하는 것도 있을 수 있다. 예를 들면 Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374에 개시되는 동일 항원 중에 존재하는 2 종류의 에피토프를 인식하는 이중특이성(bispecific sc(Fv)2)도 적합하게 들 수 있다. sc(Fv)2는 당업자에게 공지의 방법으로 제작될 수 있다. 예를 들면 scFv를 펩티드 링커 등의 링커로 연결함으로써 제작될 수 있다.
본 명세서에서의 sc(Fv)2를 구성하는 항원 결합 도메인의 구성으로서는 2개의 VH 및 2개의 VL이 단일 사슬 폴리펩티드의 N말단 측을 기점으로 VH, VL, VH, VL([VH]링커 [VL]링커 [VH]링커 [VL])의 순으로 나열되어 있는 것을 특징으로 하는 항체를 들 수 있으나, 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특별히 상기의 구성에 한정되지 않고, 어떠한 순서로 나열되어 있어도 된다. 예를 들면 아래와 같은 순서의 구성도 들 수 있다.
[VL] 링커 [VH] 링커 [VH] 링커 [VL]
[VH] 링커 [VL] 링커 [VL] 링커 [VH]
[VH] 링커 [VH] 링커 [VL] 링커 [VL]
[VL] 링커 [VL] 링커 [VH] 링커 [VH]
[VL] 링커 [VH] 링커 [VL] 링커 [VH]
sc(Fv)2의 분자형태에 대해서는 WO2006/132352에서도 상세하게 기재되어 있어, 당업자라면 이들 기재를 토대로 본 명세서에서 개시되는 항원 결합 분자의 제작을 위해 적절히 목적하는 sc(Fv)2를 제작하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자는 PEG 등의 캐리어 고분자나 항암제 등의 유기 화합물을 콘쥬게이트해도 된다. 또한 당쇄 부가 서열을 삽입하여 당쇄가 목적하는 효과를 얻는 것을 목적으로 적합하게 부가될 수 있다.
항체 가변영역을 결합하는 링커로서는 유전자 공학으로 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커 또는 합성 화합물 링커(예를 들면 Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 참조)에 개시되는 링커 등을 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하나, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않으나, 통상 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이며, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다. sc(Fv)2에 3개의 펩티드 링커가 포함되는 경우에는 모두 같은 길이의 펩티드 링커를 사용해도 되고, 상이한 길이의 펩티드 링커를 사용해도 된다.
예를 들면 펩티드 링커의 경우：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：5)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호：6)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：8)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：9)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：10)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：11)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：12)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：8))n
[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다. 단, 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 화합물 링커(화학가교제)는 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜 비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜 비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜주석산염(DST), 디설포숙신이미딜주석산염(설포-DST), 비스[2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는 통상 3개의 링커가 필요해지나, 모두 같은 링커를 사용해도 되고 상이한 링커를 사용해도 된다.
F(ab')2는 2개의 경쇄 및 사슬 간의 디설피드 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부분의 불변영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 폴리펩티드 회합체를 구성하는 F(ab')2는 목적하는 항원 결합 도메인을 갖는 전장 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에 Fc 단편을 프로테인 A 칼럼에 흡착시켜 제거함으로써 적합하게 취득할 수 있다. 이러한 단백질 분해 효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절하게 설정함으로써 제한적으로 F(ab')2를 생성하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지는 않고, 예를 들면 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자에는 전술한 아미노산의 개변에 더하여 추가로 부가적인 개변을 포함할 수 있다. 부가적인 개변은 예를 들면 아미노산의 치환, 결실 또는 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합으로부터 선택할 수 있다.
예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자에는 추가로 당해 분자의 목적으로 하는 기능에 실질적인 변화를 주지 않는 범위에서 임의로 개변을 가할 수 있다. 예를 들면 이러한 변이는 아미노산 잔기의 보존적 치환으로 행할 수 있다. 또한 본 발명의 항원 결합 분자의 목적으로 하는 기능에 변화를 주는 개변이라도, 당해 기능의 변화가 본 발명의 목적의 범위 내라면 이러한 개변도 행할 수 있다.
본 발명에서의 아미노산 서열의 개변에는 번역 후 수식도 포함된다. 구체적인 번역 후 수식으로서, 당쇄의 부가 또는 결손을 나타낼 수 있다. 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자가 IgG1형의 불변영역을 갖는 경우에 있어서 EU 넘버링의 297번째 아미노산 잔기는 당쇄로 수식된 것일 수 있다. 수식되는 당쇄 구조는 한정되지 않는다. 일반적으로 진핵세포에서 발현되는 항체는 불변영역에 당쇄 수식을 포함한다. 따라서, 아래와 같은 세포에서 발현되는 항체는 통상 어떠한 당쇄로 수식된다.
·포유동물의 항체 생산 세포
·항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 진핵세포
여기에 나타낸 진핵세포에는 효모나 동물세포가 포함된다. 예를 들면 CHO세포나 HEK293H세포는 항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환 하기 위한 대표적인 동물세포이다. 한편, 당해 위치에 당쇄 수식이 없는 것도 본 발명의 항체에 포함된다. 불변영역이 당쇄로 수식되어 있지 않은 항체는 항체를 코드하는 유전자를 대장균 등의 원핵세포에서 발현시켜 얻을 수 있다.
본 발명에서 부가적인 개변으로서는 보다 구체적으로는, 예를 들면 Fc영역의 당쇄에 시알산을 부가한 것이어도 된다(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.).
또한 본 발명의 항원 결합 분자가 Fc영역 부분을 갖는 경우 예를 들면 FcRn에 대한 결합 활성을 향상시키는 아미노산 치환(J Immunol. 2006 Jan 1;176(1) :346-56, J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24., Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69., Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2) :157-9., WO/2006/019447, WO/2006/053301, WO/2009/086320), 항체의 이질성이나 안정성을 향상시키기 위한 아미노산 치환((WO/2009/041613))을 가해도 된다.
또한 본 발명에서의 「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함), 다중클론 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 다중특이성 항체(예를 들면 이중특이성 항체), 키메라 항체, 인간화 항체 등 어떠한 항체도 포함된다.
본 발명의 항체는 항원의 종류, 항체의 유래 등은 한정되지 않고, 어떠한 항체여도 된다. 항체의 유래로서는 특별히 한정되지 않으나, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체 등을 들 수 있다.
항체를 제작하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으나, 예를 들면 단일클론 항체의 경우 하이브리도마법(Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)), 재조합 방법(미국 특허 제4,816,567호)으로 제조해도 된다. 또한 파지 항체 라이브러리로부터 단리해도 된다(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)). 또한 단일의 B세포 클론으로부터 단리해도 된다(N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011)).
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭하여진다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 공지이다. 구체적으로는 마우스 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다.
3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 항체 가변영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 불변영역을 코드하는 DNA를 인프레임 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간화 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 그 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 다음에 그 재조합 세포를 배양하고, 그 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 그 인간화 항체가 그 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP 239400, 국제공개 WO1996/002576 참고).
필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다.
인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여, DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝으로 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 다음, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C영역의 서열과 인프레임 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같이 적합한 발현세포 중에 도입하여, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
본 발명의 항체를 구성하는 가변영역은 임의의 항원을 인식하는 가변영역일 수 있다.
본 명세서에서 「항원」은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원이어도 된다. 항원의 예로는 17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 아데노신 수용체(A1 Adenosine Receptor), A33, ACE, ACE-2, 액티빈(Activin), 액티빈 A(Activin A), 액티빈 AB(Activin AB), 액티빈 B(Activin B), 액티빈 C(Activin C), 액티빈 RIA(Activin RIA), 액티빈 RIA ALK-2(Activin RIA ALK-2), 액티빈 RIB ALK-4(Activin RIB ALK-4), 액티빈 RIIA(Activin RIIA), 액티빈 RIIB(Activin RIIB), ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 어드레신(Addressins), 아디포넥틴(adiponectin), ADP 리보실 시클라아제-1(ADP ribosyl cyclase-1), aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알레르겐(allergen), 알파1-항키모트립신(alpha1-antichemotrypsin), 알파1-항트립신(alpha1-antitrypsin), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), alpha-V/beta-1 안타고니스트(antagonist), 아미닌(aminin), 아밀린(amylin), 아밀로이드 베타(amyloid beta), 아밀로이드 면역글로불린 중쇄 가변영역과 아밀로이드 면역글로불린 경쇄 가변영역(amyloid immunoglobulin heavy chain variable region. amyloid immunoglobulin light chain variable region), 안드로겐(Androgen), ANG, 안지오텐시노겐(angiotensinogen), 안지오포이에틴 리간드-2(Angiopoietin ligand-2), anti-Id, 안티트롬빈Ⅲ(antithrombinⅢ), 탄저병(Anthrax), APAF-1, APE, APJ, apo A1, 아포 세럼 아밀로이드 A(apo serum amyloid A), Apo-SAA, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민(Artemin), ASPARTIC, 심방 나트륨 이뇨 인자(Atrial natriuretic factor), 심방 나트륨 이뇨 펩티드(Atrial natriuretic peptide), 심방 나트륨 이뇨 펩티드 A(atrial natriuretic peptides A), 심방 나트륨 이뇨 펩티드 B(atrial natriuretic peptides B), 심방 나트륨 이뇨 펩티드 C(atrial natriuretic peptides C), av/b3 인테그린(av/b3 integrin), Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, 탄저 방어 항원(Bacillus anthracis protective antigen), Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, BcI, BCMA, BDNF, b-ECGF, 베타-2-마이크로글로불린(beta-2-microglobulin), 베타락타마제(betalactamase), bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, B-림프구 자극인자(B-lymphocyte Stimulator;BIyS), BMP, BMP-2 (BMP-2a), BMP-3 (Osteogenin), BMP-4 (BMP-2b), BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMPs, BOK, 봄베신(Bombesin), 뼈 유래 신경 영양 인자(Bone-derived neurotrophic factor), 소 성장 호르몬(bovine growth hormone), BPDE, BPDE-DNA, BRK-2, BTC, B-림프구 세포 부착 분자(B-lymphocyte cell adhesion molecule), C10, C1-억제제(C1-inhibitor), C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a (complement 5a), CA125, CAD-8, 카드헤린-3(Cadherin-3), 칼시토닌(Calcitonin), cAMP, 탄산탈수효소-IX(Carbonic anhydrase-IX), 암 배아성 항원(carcinoembryonic antigen;CEA), 암종 관련 항원(carcinoma-associated antigen), 카디오트로핀-1(Cardiotrophin-1), 카텝신 A(Cathepsin A), 카텝신 B(Cathepsin B), 카텝신 C(Cathepsin C)/DPPI, 카텝신 D(Cathepsin D), 카텝신 E(Cathepsin E), 카텝신 H(Cathepsin H), 카텝신 L(Cathepsin L), 카텝신 O(Cathepsin O), 카텝신 S(Cathepsin S), 카텝신 V(Cathepsin V), 카텝신 X/Z/P(Cathepsin X/Z/P), CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/에오탁신(CCL11/Eotaxin), CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-alpha, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/Eotaxin-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxin-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M1P-1-alpha, CCL3Ll/LD-78-beta, CCL4/MIP-l-beta, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-gamma, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 proteins), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, CGRP 수용체(CGRP receptor), CINC, CKb8-1, 클라우딘18(Claudin18), CLC, 클로스트리디움 보툴리눔 독소(Clostridium botulinum toxin), 클로스트리디움 디피실 독소(Clostridium difficile toxin), 클로스트리디움 퍼프린젠스 독소(Clostridium perfringens toxin), c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, 보체 인자 3(complement factor 3;C3), 보체 인자 D(complement factor D), 코르티코스테로이드 결합 글로불린(corticosteroid-binding globulin), 콜로니 자극 인자-1 수용체(Colony stimulating factor-1 receptor), COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/프랙탈카인(CX3CL1/Fractalkine), CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-alpha, CXCL10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-l-alpha/beta, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/렁카인. CXCL16(CXCL15/Lungkine. CXCL16), CXCL16, CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gamma, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig, CXCLlO/IP-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 시스타틴 C(cystatin C), 사이토케라틴 종양 관련 항원(cytokeratin tumor-associated antigen), DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 붕괴 촉진 인자(Decay accelerating factor), 델타-유사 프로테인 리간드 4(Delta-like protein ligand 4), des(1-3)-IGF-1 (brain IGF-1), Dhh, DHICA 옥시다아제(DHICA oxidase), 딕코프-1(Dickkopf-1), 디곡신(digoxin), 디펩티딜 펩티다아제 IV(Dipeptidyl peptidase IV), DKl, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EGF 유사 도메인 함유 단백질 7(EGF like domain containing protein 7), 엘라스타아제(Elastase), 엘라스틴(elastin), EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, 엔도시알린(Endosialin), 엔도텔린 수용체(endothelin receptor), 엔도톡신(endotoxin), 엔케팔리나아제(Enkephalinase), eNOS, Eot, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2(Eotaxin-2), 에오탁시니(eotaxini), EpCAM, 에프린(Ephrin) B2/Eph B4, Eph a2 티로신 키나아제 수용체(Eph a2 tyrosine kinase receptor), 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor;EGFR), ErbB2 수용체, ErbB3 티로신 키나아제 수용체(ErbB3 tyrosine kinase receptor), ERCC, EREG, 에리스로포이에틴(erythropoietin;EPO), 에리스로포이에틴 수용체(Erythropoietin receptor), E-셀렉틴(E-selectin), ET-1, 엑소더스-2(Exodus-2), RSV F 단백질(F protein of RSV), F10, F11, F12, F13, F5, F9, Ia 인자, IX 인자, Xa 인자, VII 인자, VIII 인자, VIIIc 인자, Fas, FcalphaR, FcepsilonRI, FcgammaIIb, FcgammaRI, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIa, FcgammaRIIIb, FcRn, FEN-1, 페리틴(Ferritin), FGF, FGF-19, FGF-2, FGF-2 receptor, FGF-3, FGF-8, FGF-acidic, FGF-basic, FGFR, FGFR-3, Fibrin, 섬유아세포 활성 단백질(fibroblast activation protein;FAP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor), 섬유아세포 성장 인자-10(fibroblast growth factor-10), 피브로넥틴(fibronectin), FL, FLIP, Flt-3, FLT3 리간드(FLT3 ligand), 엽산 수용체(Folate receptor), 난포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone;FSH), 프랙탈카인(Fractalkine)(CX3C), 유리 중쇄(free heavy chain), 유리 경쇄(free light chain), FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, G-CSF 수용체, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15 (MIC-1), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14/CDMP-1), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP-12/CDMP-3), GDF-8 (Myostatin), GDF-9, GDNF, 겔솔린(Gelsolin), GFAP, GF-CSF, GFR-alpha1, GFR-alpha2, GFR-alpha3, GF-β1, gH 엔벨로프 당단백질(gH envelope glycoprotein), GITR, 글루카곤(Glucagon), 글루카곤 수용체(Glucagon receptor), 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체(Glucagon-like peptide 1 receptor), Glut 4, 글루탐산 카르복시펩티다아제 II(Glutamate carboxypeptidase II), 당단백질 호르몬 수용체(glycoprotein hormone receptors), 당단백질 IIb/IIIa(glycoprotein IIb/IIIa;GP IIb/IIIa), 글리피칸-3(Glypican-3), GM-CSF, GM-CSF 수용체(GM-CSF receptor), gp130, gp140, gp72, 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte-CSF;G-CSF), GRO/MGSA, 성장 호르몬 방출 인자(Growth hormone releasing factor), GRO-β, GRO-γ, H. pylori, Hapten (NP-cap or NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, HCMV gB 엔벨로프 당단백질(HCMV gB envelope glycoprotein), HCMV UL, 조혈 성장 인자(Hemopoietic growth factor;HGF), Hep B gp120, 헤파라나제(heparanase), 헤파린 보조 인자 II(heparin cofactor II), 간 성장 인자(hepatic growth factor), 탄저균 방어 항원(Bacillus anthracis protective antigen), C형 간염 바이러스 E2 당단백질(Hepatitis C virus E2 glycoprotein), E형 간염(Hepatitis E), 헵시딘(Hepcidin), Her1, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스 gB 당단백질(herpes simplex virus (HSV) gB glycoprotein), HGF, HGFA, 고분자량 흑생종 연관 항원(High molecular weight melanoma-associated antigen;HMW-MAA), GP120과 같은 HIV 엔벨로프 단백질(HIV envelope proteins such as GP120), HIV MIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, HSV gD 당단백질(HSV gD glycoprotein), 인간 심장 마이오신(human cardiac myosin), 인간 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus;HCMV), 인간 성장 호르몬(human growth hormone;hGH), 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 인간 조직형 플라스미노겐 활성인자(human tissue-type plasminogen activator;t-PA), 헌팅틴(Huntingtin), HVEM, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IgA, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질(IGF binding proteins), IGF-1, IGF-1 R, IGF-2, IGFBP, IGFR, IL, IL-1, IL-10, IL-10 수용체, IL-11, IL-11 수용체, IL-12, IL-12 수용체, IL-13, IL-13 수용체, IL-15, IL-15 수용체, IL-16, IL-16 수용체, IL-17, IL-17 수용체, IL-18 (IGIF), IL-18 수용체, IL-1alpha, IL-1beta, IL-1 수용체, IL-2, IL-2 수용체, IL-20, IL-20 수용체, IL-21, IL-21 수용체, IL-23, IL-23 수용체, IL-2 수용체, IL-3, IL-3 수용체, IL-31, IL-31 수용체, IL-3 수용체, IL-4, IL-4 수용체, IL-5, IL-5 수용체, IL-6, IL-6 수용체, IL-7, IL-7 수용체, IL-8, IL-8 수용체, IL-9, IL-9 수용체, 면역글로불린 면역 복합체(immunoglobulin immune complex), 면역글로불린(immunoglobulins), INF-alpha, INF-alpha 수용체, INF-beta, INF-beta 수용체, INF-gamma, INF-gamma 수용체, IFN type-I, IFN type-I 수용체, 인플루엔자(influenza), 인히빈(inhibin), 인히빈 α(Inhibin α), 인히빈 β(Inhibin β), iNOS, 인슐린(insulin), 인슐린 A-사슬(Insulin A-chain), 인슐린 B-사슬(Insulin B-chain), 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like growth factor 1), 인슐린 유사 성장 인자 2(insulin-like growth factor 2), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(insulin-like growth factor binding proteins), 인테그린(integrin), 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파4/베타1, 인테그린 알파-V/베타-3, 인테그린 알파-V/베타-6, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파5/베타1, 인테그린 알파5/베타3, 인테그린 알파5/베타6, 인테그린 알파σ (alphaV), 인테그린 알파θ, integrin beta1, 인테그린 베타2, 인테그린 베타3(GPIIb-IIIa), IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인(kalliklein), 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, 칼리스타틴(kallistatin), KC, KDR, 케라티노사이트 성장 인자(Keratinocyte Growth Factor;KGF), 케라티노사이트 성장 인자-2(Keratinocyte Growth Factor-2;KGF-2), KGF, 살해 면역글로불린 유사 수용체(killer immunoglobulin-like receptor), 키트 리간드(kit ligand;KL), 키트 티로신 키나아제(Kit tyrosine kinase), 라미닌 5(laminin 5), LAMP, LAPP (Amylin, islet-amyloid polypeptide), LAP (TGF-1), 잠복기 관련 펩티드(latency associated peptide), 잠재성 TGF-1(Latent TGF-1), 잠재성 TGF-1 bp1(Latent TGF-1 bp1), LBP, LDGF, LDL, LDL 수용체, LECT2, 레프티(Lefty), 렙틴(Leptin), 황체 형성 호르몬(leutinizing hormone;LH), 루이스-Y 항원(Lewis-Y antigen), 루이스-Y 관련 항원(Lewis-Y related antigen), LFA-1, LFA-3, LFA-3 수용체, Lfo, LIF, LIGHT, 지질단백질(lipoproteins), LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴(L-Selectin), LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 계면활성제(Lung surfactant), 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone), 림포택틴(Lymphotactin), 림포톡신 베타 수용체(Lymphotoxin Beta Receptor), 라이소스핑고리피드 수용체(Lysosphingolipid receptor), Mac-1, 마크로파지-CSF(macrophage-CSF;M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, 마스핀(maspin), MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I (MCAF), M-CSF, MDC, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), 멕신(megsin), Mer, MET 티로신 키나아제 수용체 패밀리(MET tyrosine kinase receptor family), 메탈로프로테아제(METALLOPROTEASES), 막 당단백질 OX2(Membrane glycoprotein OX2), 메소텔린(Mesothelin), MGDF 수용체, MGMT, MHC (HLA-DR), 미생물 단백질(microbial protein), MIF, MIG, MIP, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, 단핵구 유인 단백질(monocyte attractant protein), 단핵구 콜로니 억제 인자(monocyte colony inhibitory factor), 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드(mouse gonadotropin-associated peptide), MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, 뮤신 (Mud), 물러관 억제 물질(Muellerian-inhibiting substance), Mug, MuSK, 미엘린 관련 당단백질(Myelin associated glycoprotein), 골수계 전구세포 억제 인자-1(myeloid progenitor inhibitor factor-1;MPIF-I), NAIP, Nanobody, NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-카드헤린(N-Cadherin), NCAM, 네프릴리신(Neprilysin), 신경세포 접착 분자(Neural cell adhesion molecule), 뉴로세르핀(neuroserpin), 신경 성장 인자(Neuronal growth factor;NGF), 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3), 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-6, 뉴로필린 1(Neuropilin 1), 뉴투린(Neurturin), NGF-beta, NGFR, NKG20, N-메티오닐 인간 성장 호르몬(N-methionyl human growth hormone), nNOS, NO, Nogo-A, Nogo 수용체, C형 간염 바이러스로부터의 비구조 단백질 3형(non-structural protein type 3 (NS3) from the hepatitis C virus), NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, 온코스타틴 M(Oncostatin M), OP-2, OPG, OPN, OSM, OSM 수용체, 골유도 인자(osteoinductive factors), 오스테오폰틴(osteopontin), OX40L, OX40R, 산화 LDL(oxidized LDL), p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린(P-Cadherin), PCNA, PCSK9, PDGF, PDGF 수용체, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, 태반 성장 인자(Placenta growth factor), 태반 알칼리 포스파타아제(placental alkaline phosphatase;PLAP), 태반 젖샘자극호르몬(placental lactogen), 플라스미노겐 활성 억제제-1(plasminogen activator inhibitor-1), 혈소판 성장 인자(platelet-growth factor), plgR, PLP, 크기가 다른 다당쇄(poly glycol chains of different size)(e.g. PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, 프리칼리크레인(prekallikrein), 프리온 단백질(prion protein), 프로칼시토닌(procalcitonin), 계획된 세포 소멸 단백질 1(Programmed cell death protein 1), 프로인슐린(proinsulin), 프로락틴(prolactin), 프로단백질 전환효소 PC9(Proprotein convertase PC9), 프로릴랙신(prorelaxin), 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen;PSMA), Protein A, Protein C, Protein D, Protein S, Protein Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(P-selectin glycoprotein ligand-1), R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, 릴랙신(relaxin), 릴랙신 A-사슬(Relaxin A-chain), 릴랙신 B-사슬(Relaxin B-chain), 레닌(renin), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus;RSV) F, Ret, 레티큘론 4(reticulon 4), 류머티즘 인자(Rheumatoid factors), RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, 스클레로스틴(Sclerostin), SDF-1, SDF1α, SDF1β, SERINE, 혈청 아밀로이드 P(Serum Amyloid P), 혈청 알부민(Serum albumin), sFRP-3, Shh, 시가 유사 독소 II(Shiga like toxin II), SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, 스핑고신 1-포스페이트 수용체 1(sphingosine 1-phosphate receptor 1), 포도상구균성 리포테이코산(Staphylococcal lipoteichoic acid), Stat, STEAP, STEAP-II, 줄기 세포 인자(stem cell factor;SCF), 스트렙토키나아제(streptokinase), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 신데칸-1(syndecan-1), TACE, TACI, TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARC, TB, TCA-3, T-세포 수용체 alpha/beta, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, 테나신(Tenascin), TERT, 고환성 PLAP 유사 알칼리포스파타아제(testicular PLAP-like alkaline phosphatase), TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta Rl (ALK-5), TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, TGF-I, 트롬빈(Thrombin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin;TPO), 흉선 기질상 림포포이에틴 수용체(Thymic stromal lymphoprotein receptor), 흉선 CK-1(Thymus Ck-1), 갑상샘 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone;TSH), 티록신(thyroxine), 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin), Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자(Tissue Factor), 조직 인자 단백질분해효소 억제제(tissue factor protease inhibitor), 조직 인자 단백질(tissue factor protein), TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNF-alpha, TNF-beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFc R), TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 Ligand/TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK Ligand ODF/OPG Ligand), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 Ligand/DR3 Ligand), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM Ligand/LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR Ligand AITR Ligand/TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFc /p33), TNFSF4 (OX40 Ligand gp34/TXGP1), TNFSF5 (CD40 Ligand CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6 (Fas Ligand Apo-1 Ligand/APT1 Ligand), TNFSF7 (CD27 Ligand CD70), TNFSF8 (CD30 Ligand CD153), TNFSF9 (4-1 BB Ligand CD137 Ligand), TNF-α, TNF-β, TNIL-I, toxic metabolite, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), TGF-alpha 및 TGF-beta와 같은 형질전환 성장 인자(transforming growth factors;TGF), 막관통 당단백질 NMB(Transmembrane glycoprotein NMB), 트랜스티레틴(Transthyretin), TRF, Trk, TROP-2, 영양세포 당단백질(Trophoblast glycoprotein), TSG, TSLP, 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor;TNF), 종양 관련 항원 CA 125(tumor-associated antigen CA 125), 루이스 Y 관련 탄수화물 발현 종양 관련 항원(tumor-associated antigen expressing Lewis Y related carbohydrate), TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 유로키나제(Urokinase), VAP-1, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor;VEGF), 바스핀(vaspin), VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카드헤린(VE-Cadherin), VE-카드헤린-2, VEFGR-1 (flt-1), VEFGR-2, VEGF 수용체 (VEGFR), VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원(Viral antigens), VitB12 수용체, 비트로넥틴 수용체(Vitronectin receptor), VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor;vWF), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-l-beta, XCLl/림포택틴(XCLl/Lymphotactin), XCR1, XEDAR, XIAP, XPD 등을 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 항체의 2개의 가변영역 중 상이한 2개의 항원에 결합할 수 있으나 이들 항원에 동시에는 결합할 수 없는 가변영역이 결합하는 「제1 항원」과 「제2 항원」으로서는, 예를 들면 면역세포 표면분자(예를 들면 T세포 표면분자, NK세포 표면분자, 수상세포 표면분자, B세포 표면분자, NKT세포 표면분자, MDSC세포 표면분자, 마크로파지류 표면분자), 종양세포, 종양의 혈관, 간질 세포(stromal cells) 등에 발현되나, 정상조직에서도 발현되고 있는 항원(인테그린, Tissue factor, VEGFR, PDGFR, EGFR, IGFR, MET 케모카인 수용체, 헤파란 황산프로테오글리칸, CD44, 피브로넥틴, DR5, TNFRSF 등)이 바람직하고, 「제1 항원」과 「제2 항원」의 조합으로서는 제1 항원과 제2 항원 중 어느 한쪽이 예를 들면 T세포 상에 특이적으로 발현되고 있는 분자이고, 다른 한쪽의 항원이 T세포 또는 다른 면역세포 표면에 발현되고 있는 분자인 것이 바람직하다. 다른 태양으로서, 「제1 항원」과 「제2 항원」의 조합으로서는 제1 항원과 제2 항원 중 어느 한쪽이 예를 들면 T세포 상에 특이적으로 발현되고 있는 분자이고, 다른 한쪽의 항원이 면역세포 상에서 발현되고 있는 앞서 선택한 항원과는 다른 분자인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 T세포 상에 특이적으로 발현되고 있는 분자로서는 CD3, T세포 수용체를 들 수 있다. 특히 CD3인 것이 바람직하다. 본 발명의 항원 결합 분자가 결합하는 CD3의 부위로서는, 예를 들면 인간 CD3의 경우 인간 CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄 서열에 존재하는 에피토프라면 어느 에피토프에 결합하는 것이어도 된다. 특히 인간 CD3 복합체의 ε쇄의 세포 외영역에 존재하는 에피토프가 바람직하다. CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄의 구조는 그의 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호：83(NM_000073.2), 85(NM_000732.4) 및 87(NM_000733.3)에, 그의 폴리펩티드 서열이 서열번호：84(NP_000064.1), 86(NP_000723.1) 및 88(NP_000724.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다). 또한 다른 한쪽의 항원으로서는 Fcγ 수용체, TLR, 렉틴, IgA, 면역 체크포인트 분자, TNF 슈퍼패밀리 분자, TNFR 슈퍼패밀리 분자, NK 수용체 분자를 들 수 있다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 항체의 2개의 가변영역 중 다른 한쪽의 가변영역이 결합하는 앞의 「제1 항원」과 「제2 항원」과는 다른 「제3 항원」으로서는 예를 들면 종양세포에 특이적인 항원이 바람직하고, 세포의 악성화에 수반하여 발현하는 항원 외에, 세포가 암화됐을 때 세포표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 포함된다. 구체적으로는, 예를 들면 ALK 수용체(플레이오트로핀 수용체), 플레이오트로핀, KS 1/4 췌장암항원, 난소암항원(CA125), 전립선산 인산, 전립선 특이적 항원(PSA), 흑색종 관련 항원 p97, 흑색종 항원 gp75, 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA), 전립선 특이적 막 항원, 암성 배 항원(CEA), 다형 상피 뮤신 항원, 인간 유지방구 항원, CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 및 LEA 등의 결장 직장 종양 관련 항원, 버킷 림프종 항원-38.13, CD19, 인간 B림프종 항원-CD20, CD33, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2 및 강글리오시드 GM3 등의 흑색종 특이적 항원, 종양 특이적 이식형 세포표면 항원(TSTA), T 항원, DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 엔벨로프 항원 등의 바이러스에 의해 유도되는 종양 항원, 결장의 CEA, 5T4 암 태아 영양막 당단백질(oncofetal trophoblastic glycoprotein) 및 방광 종양 암 태아 항원 등의 암 태아 항원 α-페토프로테인, 인간 폐암항원 L6 및 L20 등의 분화 항원, 섬유육종의 항원, 인간 백혈병 T세포 항원-Gp37, 신생 당단백질, 스핑고 지질, EGFR(상피 증식인자 수용체) 등의 유방암항원, NY-BR-16, NY-BR-16 및 HER2 항원(p185HER2), 다형 상피 뮤신(PEM), 악성 인간 림프구 항원-APO-1, 태아 적혈구에 확인되는 I 항원 등의 분화 항원, 성인 적혈구에 확인되는 초기 내배엽 I 항원, 이식 전의 배, 위암에 확인되는 I(Ma), 유선상피에 확인되는 M18, M39, 골수세포에 확인되는 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 결장 직장 암에 확인되는 D156-22, TRA-1-85(혈액군 H), 정소 및 난소암에 확인되는 SCP-1, 결장암에 확인되는 C14, 폐암에 확인되는 F3, 위암에 확인되는 AH6, Y 합텐, 배성 암세포에 확인되는 Ley, TL5(혈액군 A), A431세포에 확인되는 EGF 수용체, 췌장암에 확인되는 E1 시리즈(혈액군 B), 배성 암세포에 확인되는 FC10.2, 위암 항원, 선암에 확인되는 CO-514(혈액군 Lea), 선암에 확인되는 NS-10, CO-43(혈액군 Leb), A431세포의 EGF 수용체에 확인되는 G49, 결장암에 확인되는 MH2(혈액군 ALeb/Ley), 결장암에 확인되는 19.9, 위암 뮤신, 골수세포에 확인되는 T5A7, 흑색종에 확인되는 R24, 배성 암세포에 확인되는 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 및 M1:22:25:8 및 4~8세포 단계의 배에 확인되는 SSEA-3 및 SSEA-4, 피하 T세포 림프종 항원, MART-1 항원, 시알릴 Tn(STn) 항원, 결장암항원 NY-CO-45, 폐암항원 NY-LU-12 변이체A, 선암항원 ART1, 종양 수반성 관련 뇌-정소암항원(암 신경 항원 MA2, 종양 수반성 신경 항원), 신경암 복부 항원2(NOVA2), 혈액세포암항원 유전자 520, 종양 관련 항원 CO-029, 종양 관련 항원 MAGE-C1(암/정소 항원 CT7), MAGE-B1(MAGE-XP 항원), MAGE-B2(DAM6), MAGE-2, MAGE-4a, MAGE-4b 및 MAGE-X2, 암-정소 항원(NY-EOS-1), YKL-40 및 상기 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 또는 이들에 대해 수식된 구조 등(상기의 수식 인산기나 당쇄 등), EpCAM, EREG, CA19-9, CA15-3, 시알릴 SSEA-1(SLX), HER2, PSMA, CEA, CLEC12A 등을 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자는 당업자에게 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면 항체는 아래의 방법으로 제작할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단리된 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들 발현계는 모두 본 발명의 항원 결합 분자를 단리하는데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적절히 사용될 수 있다. 구체적으로는 동물세포로는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포：CHO(Chinese hamster ovary cell line), COS(Monkey kidney cell line), 골수종세포(Sp2/O, NS0 등), BHK (baby hamster kidney cell line), HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad) 5 DNA), PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes), Hela, Vero 등(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))
(2) 양서류세포：아프리카발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
또한 항체는 대장균(mAbs 2012 Mar-Apr; 4(2): 217-225.)이나 효모(WO2000023579)로도 제작할 수 있다. 대장균으로 제작한 항체는 당쇄가 부가되어 있지 않다. 한편, 효모로 제작한 항체는 당쇄가 부가된다.
항체의 중쇄를 코드하는 DNA로서 가변영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA 및 항체의 경쇄를 코드하는 DNA를 발현시킨다. 가변영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 DNA는, 예를 들면 어떤 항원에 대해 공지의 방법을 사용하여 제작된 항체 가변영역을 코드하는 DNA를 취득하여, 그 영역 중의 특정 아미노산을 코드하는 코돈이 목적의 다른 아미노산을 코드하도록 적절히 치환을 도입함으로써 얻을 수 있다.
또한 사전에 어떤 항원에 대해 공지의 방법을 사용하여 제작된 항체 가변영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 코드하는 DNA를 설계하여 그 DNA를 화학적으로 합성함으로써, 가변영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA를 얻는 것도 가능하다. 아미노산의 치환 부위, 치환의 종류로는 특별히 한정되는 것은 아니다. 아미노산 개변을 위한 바람직한 영역으로서는 가변영역 중의 용매에 노출되어 있는 영역 및 루프영역을 들 수 있다. 그 중에서도 CDR1, CDR2, CDR3, FR3영역, 루프영역이 바람직하다. 구체적으로는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74, 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56, 89~97이 바람직하고, H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31, 52a~61, 71~74, 97~101, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 51~56, 89~96이 보다 바람직하다.
또한 아미노산 개변은 치환에 제한되지 않고 결실, 부가, 삽입 또는 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합이어도 된다.
또한 가변영역 중에서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA는 부분 DNA로 나눠서 제조할 수 있다. 부분 DNA의 조합으로서는, 예를 들면 가변영역을 코드하는 DNA와 불변영역을 코드하는 DNA 또는 Fab영역을 코드하는 DNA와 Fc영역을 코드하는 DNA 등을 들 수 있으나, 이들 조합에 한정되는 것은 아니다. 경쇄를 코드하는 DNA도 또한 동일하게 부분 DNA로 나눠서 제조할 수 있다.
상기 DNA를 발현시키는 방법으로서는 아래의 방법을 들 수 있다. 예를 들면 중쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 중쇄 불변영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 중쇄 발현 벡터를 구축한다. 동일하게 경쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 경쇄 불변영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 경쇄 발현 벡터를 구축한다. 이들 중쇄, 경쇄의 유전자를 단일 벡터에 삽입하는 것도 가능하다.
목적으로 하는 항체를 코드하는 DNA를 발현 벡터에 삽입할 때, 발현 제어영역 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킨다. 그 때에는 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.
벡터의 예로는 M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한 cDNA의 서브클로닝, 절단을 목적으로 한 경우 상기 벡터 외에 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로는 예를 들면 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함됨), araB 프로모터(Better 등, Science (1988) 240, 1041-1043, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함됨) 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로는 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사 제조), 「QIAexpress system」(QIAGEN사 제조), pEGFP 또는 pET(이 경우 숙주는 T7 RNA 폴리메라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직함) 등을 들 수 있다.
또한 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열로는 대장균의 페리플라즘에 생산시키는 경우 pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함됨)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은 예를 들면 리포펙틴법, 인산칼슘법, DEAE-Dextran법을 사용하여 행할 수 있다.
대장균 발현 벡터 외에, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 벡터로는 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pcDNA3(Invitrogen사 제조)나 pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함됨), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.
CHO세포, COS세포, NIH3T3세포, HEK293세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함됨), MMTV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함됨), CAG 프로모터(Gene. (1991) 108, 193, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함됨), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하며, 형질전환세포를 선발하기 위한 유전자(예를 들면 약제(네오마이신, G418 등)로 판별 할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로는 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다. 또한 유전자 카피 수를 늘릴 목적으로 EBNA1 단백질을 공발현시키는 경우도 있으나, 이 경우 복제 개시점 OriP를 갖는 벡터를 사용한다. (Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2) :197-203., Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7.)
또한 유전자를 안정적으로 발현시키고 또한 세포 내에서의 유전자 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는 핵산 합성경로를 결손한 CHO세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉사트(MTX)로 증폭시키는 방법을 들 수 있으며, 또한 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는 SV40 T 항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는 또한 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(BPV) 등 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한 숙주세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해 발현 벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 트랜스페라제(APH) 유전자, 티미딘키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스페라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
항체의 회수는 예를 들면 형질전환한 세포를 배양한 다음, 분자 형질전환한 세포의 세포 내 또는 배양액으로부터 분리함으로써 행할 수 있다. 항체의 분리, 정제에는 원심분리, 황산암모늄 분획, 염석, 한외 여과, C1q, FcRn, 프로테인 A, 프로테인 G 칼럼, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법을 적절히 조합하여 행할 수 있다.
다중특이성 항체의 효율적인 제작방법으로서 Knobs-into-holes 기술(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)이나 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술(WO2006/106905) 등의 전술한 기술을 적용할 수 있다.
또한 본 발명은 상이한 2개의 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있는 항체 가변영역으로서, 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역(제1 가변영역) 및 그 제1 항원 및 제2 항원과는 다른 제3 항원에 결합하는 가변영역(제2 가변영역)을 포함하는 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 그 제1 가변영역의 아미노산 서열이 다양한 항원 결합 분자 라이브러리를 제작하는 공정을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다：
(ⅰ) 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역의 하나 이상의 아미노산이 개변된 항원 결합 분자로서, 그 개변된 가변영역의 아미노산 중 하나 이상이 서로 다른 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자의 라이브러리를 제작하는 공정,
(ⅱ) 제작된 라이브러리 중에서, 제1 항원 및 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖지만 당해 제1 항원 및 제2 항원과 동시에는 결합하지 않는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(ⅲ) 공정(ⅱ)에서 선택된 항원 결합 분자의 상기 가변영역을 코드하는 핵산과 제3 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 가변영역을 코드하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 배양하여, 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 그 제1 항원과 제2 항원이 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역 및 제3 항원에 결합하는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 발현시키는 공정, 및
(ⅳ) 상기 숙주세포 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정.
또한 본 제조방법에서는 공정(ⅱ)가 아래의 선택 공정이어도 된다：
(ⅴ) 제작된 라이브러리 중에서, 제1 항원 및 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖지만 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
상기 공정(ⅰ)에서 사용되는 항원 결합 분자는 항체 가변영역을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않고, Fv, Fab, Fab' 등의 항체 단편이어도 되고 Fc영역을 포함하는 항체여도 된다.
개변되는 아미노산으로서는, 예를 들면 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역 중 아미노산 개변에 의해 당해 항원으로의 결합을 상실시키지 않는 아미노산이 선택된다.
본 발명의 아미노산 개변은 단독으로 사용해도 되고 복수 조합하여 사용해도 된다.
복수 조합하여 사용하는 경우 조합하는 수는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 2개 이상 30개 이하, 바람직하게는 2개 이상 25개 이하, 2개 이상 22개 이하, 2개 이상 20개 이하, 2개 이상 15개 이하, 2개 이상 10개 이하, 2개 이상 5개 이하, 2개 이상 3개 이하이다.
복수 조합하는 경우 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에만 당해 아미노산 개변을 가해도 되고, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역 양쪽에 적절히 배분하여 가해도 된다.
아미노산 개변을 위한 바람직한 영역으로서는 가변영역 중의 용매에 노출되어 있는 영역 및 루프영역을 들 수 있다. 그 중에서도 CDR1, CDR2, CDR3, FR3영역, 루프영역이 바람직하다. 구체적으로는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74, 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56, 89~97이 바람직하고, H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31, 52a~61, 71~74, 97~101, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 51~56, 89~96이 보다 바람직하다.
또한 아미노산 잔기에 개변을 가하는 것에는 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역 중 전술한 영역의 아미노산을 랜덤으로 개변하거나 또는 사전에 목적하는 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있는 것이 알려져 있는 펩티드를 전술한 영역에 삽입하는 것도 포함된다. 이와 같이 하여 개변이 가해진 항원 결합 분자 중에서 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 이들 항원에 동시에는 결합할 수 없는 가변영역을 선택함으로써, 본 발명의 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 사전에 목적하는 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있는 것이 알려져 있는 펩티드의 예로는 전술한 표 1에 나타낸 펩티드를 들 수 있다.
제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 이들 항원에 동시에는 결합할 수 없는 가변영역인지 여부, 또한 제1 항원과 제2 항원 중 어느 한쪽이 세포 상에 존재하고 다른쪽이 단독으로 존재하는 경우, 양쪽이 단독으로 존재하는 경우, 또는 양쪽이 동일 세포 상에 존재하는 경우에는 제1 항원과 제2 항원 양쪽에 동시에 결합할 수 있으나, 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 경우에는 동시에는 결합할 수 없는 가변영역인지 여부는 전술한 방법에 따라 동일하게 확인할 수 있다.
또한 본 발명은 상이한 2개의 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있는 항체 가변영역으로서, 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역(제1 가변영역)을 포함하는 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 그 제1 가변영역의 아미노산 서열이 다양한 항원 결합 분자 라이브러리를 제작하는 공정을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
이러한 항원 결합 분자의 제조방법으로서 예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다：
(ⅰ) 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역의 하나 이상의 아미노산이 개변된 항원 결합 분자로서, 그 개변된 가변영역의 아미노산 중 하나 이상이 서로 다른 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자의 라이브러리를 제작하는 공정,
(ⅱ) 제작된 라이브러리 중에서, 제1 항원 및 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖지만 당해 제1 항원 및 제2 항원과 동시에는 결합하지 않는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(ⅲ) 공정(ⅱ)에서 선택된 항원 결합 분자의 상기 가변영역을 코드하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 배양하여, 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 그 제1 항원과 제2 항원이 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 발현시키는 공정, 및
(ⅳ) 상기 숙주세포 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정.
또한 상기 아미노산 개변을 위한 바람직한 영역으로서는 중쇄 가변영역을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 가변영역 중의 용매에 노출되어 있는 영역 및 루프영역을 들 수 있다. 그 중에서도 CDR1, CDR2, CDR3, FR3영역, 루프영역이 바람직하다. 구체적으로는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74, 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56, 89~97이 바람직하고, H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31, 52a~61, 71~74, 97~101, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 51~56, 89~96이 보다 바람직하다.
또한 본 제조방법에서는 상기 공정(ⅱ)가 아래의 선택 공정이어도 된다：
(ⅴ) 제작된 라이브러리 중에서, 제1 항원 및 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖지만 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
상기 공정(ⅰ)에서 사용되는 항원 결합 분자는 항체 가변영역을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않고 Fv, Fab, Fab' 등의 항체 단편이어도 되고 Fc영역을 포함하는 항체여도 된다.
개변되는 아미노산으로서는, 예를 들면 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역 중 아미노산 개변에 의해 당해 항원으로의 결합을 상실시키지 않는 아미노산이 선택된다.
본 발명의 아미노산 개변은 단독으로 사용해도 되고 복수 조합하여 사용해도 된다.
복수 조합하여 사용하는 경우 조합하는 수는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 2개 이상 30개 이하, 바람직하게는 2개 이상 25개 이하, 2개 이상 22개 이하, 2개 이상 20개 이하, 2개 이상 15개 이하, 2개 이상 10개 이하, 2개 이상 5개 이하, 2개 이상 3개 이하이다.
복수 조합하는 경우 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 어느 한쪽에만 당해 아미노산 개변을 가해도 되고, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역 양쪽에 적절히 배분하여 가해도 된다.
또한 아미노산 잔기에 개변을 가하는 것에는 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역 중 전술한 영역의 아미노산을 랜덤으로 개변하거나 또는 사전에 목적하는 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있는 것이 알려져 있는 펩티드를 전술한 영역에 삽입하는 것도 포함된다. 이와 같이 하여 개변이 가해진 항원 결합 분자 중에서 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 이들 항원에 동시에는 결합할 수 없는 가변영역을 선택함으로써, 본 발명의 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 사전에 목적하는 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있는 것이 알려져 있는 펩티드의 예로는 전술한 표 1에 나타낸 펩티드를 들 수 있다.
제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 이들 항원에 동시에는 결합할 수 없는 가변영역인지 여부, 또한 제1 항원과 제2 항원 중 어느 한쪽이 세포 상에 존재하고 다른쪽이 단독으로 존재하는 경우, 양쪽이 단독으로 존재하는 경우, 또는 양쪽이 동일 세포 상에 존재하는 경우에는 제1 항원과 제2 항원 양쪽에 동시에 결합할 수 있으나, 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 경우에는 동시에는 결합할 수 없는 가변영역인지 여부는 전술한 방법에 따라 동일하게 확인할 수 있다.
또한 당해 제조방법으로 제조되는 항원 결합 분자도 본 발명에 포함된다.
본 방법으로 도입되는 아미노산 개변의 종류나 범위는 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 라이브러리의 비한정의 일태양으로서, 제1 항원으로서 CD3(인간 CD3인 경우 인간 CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄)를 선택하여 CD3와 임의의 제2 항원에 결합하는 항원 결합 분자로 이루어지는 라이브러리를 들 수 있다.
본 명세서에서 「라이브러리」란 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드, 또는 이들 서열을 코드하는 핵산, 폴리뉴클레오티드를 말한다. 라이브러리 중에 포함되는 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드의 서열은 단일 서열이 아닌 서로 서열이 다른 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
본 발명에서의 하나의 실시형태에서는 본 발명의 항원 결합 분자와 이종(異種) 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드가 제작될 수 있다. 어떤 실시형태에서는 융합 폴리펩티드는 바이러스 외피 단백질 예를 들면 pIII, pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, pVI 및 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 외피 단백질의 적어도 일부와 융합될 수 있다.
어떤 실시형태에서는 본 발명의 항원 결합 분자는 ScFv, Fab 단편, F(ab)2 또는 F(ab')2일 수 있기 때문에, 다른 하나의 실시형태에서는 이들 항원 결합 분자와 이종 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드로서 서로 서열이 다른 복수의 융합 폴리펩티드로 주로 이루어지는 라이브러리가 제공된다. 구체적으로는 이들 항원 결합 분자와 바이러스 외피 단백질 예를 들면 pIII, pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, pVI 및 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 외피 단백질의 적어도 일부와 융합된 융합 폴리펩티드로서 서로 서열이 다른 복수의 융합 폴리펩티드로 주로 이루어지는 라이브러리가 제공된다. 본 발명의 항원 결합 분자는 추가로 이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 어떤 실시형태에서는 상기 이량체화 도메인은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변영역과 바이러스 외피 단백질의 적어도 일부 사이에 존재할 수 있다. 이 이량체화 도메인에는 이량체화 서열의 적어도 1개 및/또는 1개 또는 복수의 시스테인 잔기를 포함하는 서열이 포함될 수 있다. 이 이량체화 도메인은 바람직하게는 중쇄 가변영역 또는 불변영역의 C말단과 연결될 수 있다. 이량체화 도메인은 상기 항체 가변영역이 바이러스의 외피 단백질 성분과의 융합 폴리펩티드 성분으로서 제작되어 있는(이량체화 도메인의 뒤에 앰버 종지 코돈을 갖지 않는)지 여부에 따라, 또는 상기 항체 가변영역이 주로 바이러스 외피 단백질 성분을 포함하지 않고 제작되어 있는(예를 들면 이량체화 도메인의 뒤에 앰버 종지 코돈을 갖는)지 여부에 따라 여러 구조를 취하는 것이 가능하다. 상기 항체 가변영역이 주로 바이러스의 외피 단백질 성분과의 융합 폴리펩티드로서 제작될 때는 1개 또는 복수의 디설피드 결합 및/또는 단일의 이량체화 서열에 의해 2가 제시가 초래된다.
본 명세서에서는 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 분자라고 하는 기재에서의 「서로 서열이 다른」이라는 용어는 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 상호 다름을 의미한다. 즉, 라이브러리 중에서의 서로 다른 서열의 수는 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론의 수가 반영되어 「라이브러리 사이즈」로 지칭되는 경우도 있다. 통상의 파지 디스플레이 라이브러리에서는 106 내지 1012이고, 리보솜 디스플레이법 등의 공지의 기술을 적용함으로써 라이브러리 사이즈를 1014까지 확대하는 것이 가능하다. 그렇지만 파지 라이브러리의 패닝 선택 시에 사용되는 파지 입자의 실제 수는 통상 라이브러리 사이즈보다도 10 내지 10,000배 크다. 이 과잉 배수는 「라이브러리 당량수」라고도 불리나, 같은 아미노산 서열을 갖는 개개의 클론이 10 내지 10,000 존재할 수 있는 것을 나타낸다. 따라서 본 발명에서의 「서로 서열이 다른」이라는 용어는 라이브러리 당량수가 제외된 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 서로 다른 것, 보다 구체적으로는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자가 106 내지 1014 분자, 바람직하게는 107 내지 1012 분자, 더욱 바람직하게는 108 내지 1011 분자, 특히 바람직하게는 108 내지 1010 분자 존재하는 것을 의미한다.
또한 본 발명의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에서의 「~로 주로 이루어지는」이라는 용어는 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론의 수 중, 제1 및/또는 제2 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 다른 항원 결합 분자의 수가 반영된다. 구체적으로는 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 104 분자 존재하는 것이 바람직하다. 또한 보다 바람직하게는 본 발명은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 105 분자 존재하는 라이브러리를 제공한다. 더욱 바람직하게는 본 발명은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 106 분자 존재하는 라이브러리를 제공한다. 특히 바람직하게는 본 발명은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 107 분자 존재하는 라이브러리를 제공한다. 또한 바람직하게는 본 발명은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 108 분자 존재하는 라이브러리를 제공한다. 다른 표현으로는, 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론의 수 중, 제1 및/또는 제2 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 다른 항원 결합 분자의 비율로서도 적합하게 표현될 수 있다. 구체적으로는 본 발명은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론 수의 0.1% 내지 80%, 바람직하게는 0.5% 내지 60%, 보다 바람직하게는 1% 내지 40%, 더욱 바람직하게는 2% 내지 20%, 특히 바람직하게는 4% 내지 10% 포함되는 라이브러리를 제공한다. 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터의 경우도 상기와 같이 분자의 수나 분자 전체에서의 비율로 표현될 수 있다. 또한 바이러스의 경우도 상기와 같이 바이러스 개체의 수나 개체 전체에서의 비율로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 「파지 디스플레이」는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들면 섬유상 파지의 입자 표면에서 외피 단백질의 적어도 일부와 융합한 단백질로서 제시하는 방법이다. 파지 디스플레이의 유용함은 랜덤화 단백질 변이체의 큰 라이브러리로부터 대상 항원과 고친화성으로 결합하는 서열을 신속하게, 효율적으로 선별할 수 있는 것에 있다. 파지 상의 펩티드 및 단백질 라이브러리의 제시는 수백만의 폴리펩티드를 특이적 결합 특성에 관하여 스크리닝하기 위해 이용되어 왔다. 다가 파지 디스플레이방법은 섬유상 파지의 유전자III 또는 유전자VIII과의 융합을 통해 작은 랜덤 펩티드 및 소단백질을 제시하기 위해 이용되어 왔다(Wells 및 Lowman(Curr.Opin.Struct.Biol. (1992) 3, 355-362)과 그 중의 인용문헌). 1가의 파지 디스플레이에서는 단백질 또는 펩티드의 라이브러리가 유전자III 또는 그의 일부에 융합되어 파지 입자가 융합 단백질의 1개 또는 0개의 카피를 제시하도록 야생형 유전자III 단백질 존재하에서 저레벨로 발현된다. 결합 활성 효과(avidity effect)는 다가의 파지와 비교하여 저하되어 있기 때문에 선별은 내재성의 리간드 친화성을 토대로 하고 있어 파지미드 벡터가 사용되나, 이 벡터는 DNA 조작을 단순화한다(Lowman 및 Wells, Methods：A Companion to Methods in Enzymology (1991) 3, 205-216).
「파지미드」는 세균의 복제 기점, 예를 들면 ColE1 및 박테리오파지의 유전자 간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드에는 어떠한 공지의 박테리오파지, 예를 들면 섬유상 박테리오파지 및 람다형 박테리오파지의 것도 적절히 사용될 수 있다. 플라스미드는 통상 항생물질 내성의 선택 마커도 포함한다. 이들 벡터에 클로닝된 DNA 단편은 플라스미드로서 증식할 수 있다. 이들 벡터가 도입된 세포가 파지 입자 생산을 위해 필요한 모든 유전자를 구비하고 있을 때, 플라스미드의 복제양식은 롤링 서클 복제로 변화하여 플라스미드 DNA의 1개 사슬의 복제와 패키지 파지 입자를 생성한다. 파지미드는 감염성 또는 비감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어는 이종 폴리펩티드가 파지 입자의 표면에서 제시되도록 유전자 융합으로서 이 이종 폴리펩티드의 유전자와 결합한 파지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 파지미드를 포함한다.
용어 「파지 벡터」는 이종 유전자를 포함하고 있어 복제할 수 있는 박테리오파지의 이중 가닥 복제형을 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제 및 파지 입자 형성을 가능하게 하는 파지 복제 기점을 갖는다. 파지는 바람직하게는 섬유상 박테리오파지, 예를 들면 M13, f1, fd, Pf3 파지 또는 그의 유도체, 또는 람다형 파지, 예를 들면 람다, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, 기타 또는 그의 유도체이다.
「올리고뉴클레오티드」는 공지의 방법(예를 들면 고상 수법, 예를 들면 EP266032에 기재되어 있는 수법을 이용한 인산트리에스테르, 아인산염 또는 포스포라미다이트 화학, 또는 Froeshler 등(Nucl.Acids.Res. (1986) 14, 5399-5407)에 기재되어 있는 데옥시뉴클레오시드 H-포스폰산염 중간체를 통한 방법)으로 화학적으로 합성되는 짧은 단일 또는 이중 가닥의 폴리데옥시뉴클레오티드이다. 다른 방법으로는 아래에 기재된 폴리메라아제 연쇄반응 및 다른 오토프라이머법 및 고체 담체 상의 올리고뉴클레오티드 합성이 포함된다. 이들 방법 모두는 Engels 등(Agnew.Chem.Int.Ed.Engl. (1989) 28, 716-734)에 기재되어 있다. 유전자의 모든 핵산 서열이 공지라면, 또는 암호 가닥(coding strand)과 상보적인 핵산 서열을 이용할 수 있다면 이들 방법이 사용된다. 또는 대상 아미노산 서열이 공지라면, 각 아미노산 잔기의 공지로 바람직한 코드 잔기를 사용하여 가능한 핵산 서열이 적절히 추측될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드겔 또는 분자 사이징 칼럼으로 또는 침전법으로 정제할 수 있다.
용어 「융합 단백질」 및 「융합 폴리펩티드」란 공유결합으로 서로 결합된 2개의 부분을 갖는 폴리펩티드를 말하며, 각 부분은 상이한 특성을 갖는 폴리펩티드이다. 이 특성은 예를 들면 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo) 활성 등의 생물학적 성질일 수 있다. 또한 이 특성은 단일의 화학적 또는 물리적 성질, 예를 들면 대상 항원과의 결합, 반응의 촉매 등일 수도 있다. 이 2개의 부분은 단일의 펩티드 결합으로 직접 또는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하고 있는 펩티드 링커를 매개로 결합될 수 있다. 통상 이 2개의 부분과 링커는 같은 해독틀(reading frame) 중에 존재한다. 바람직하게는 폴리펩티드의 2개의 부분은 이종(heterologous) 또는 상이한 폴리펩티드로부터 얻어진다.
용어 「외피 단백질」은 단백질 중 적어도 그의 일부가 바이러스 입자의 표면에 존재하는 것을 말한다. 기능 상의 관점에서는 외피 단백질은 숙주세포에서의 바이러스 구축 과정에서 바이러스 입자와 결합하는 임의의 단백질로, 바이러스가 다른 숙주세포에 감염하기까지 그것과 결합한 그대로이다. 외피 단백질은 주요한 외피 단백질일 수 있고, 소수 외피 단백질(minor coat protein)일 수도 있다. 소수 외피 단백질은 통상 바이러스의 캡시드에 존재하는 외피 단백질로, 바람직하게는 1 비리온에 대하여 적어도 약 5개, 보다 바람직하게는 적어도 약 7개, 보다 바람직하게는 적어도 약 10개나 그 이상의 단백질의 카피가 존재한다. 주요한 외피 단백질은 1 비리온에 대하여 수십, 수백 또는 수천의 카피가 존재할 수 있다. 주요한 외피 단백질의 예로는 섬유상 파지의 p8 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 라이브러리를 제작하는 방법은 아래의 6개가 예시된다.
1. 제1 항원에 결합하는 항원 결합 분자에 제2 항원에 결합하는 펩티드(이 용어는 폴리펩티드 및 단백질을 포함하도록 하여 사용됨)를 삽입하는 방법
2. 항원 결합 분자 중의 루프를 길게 개변(연장)할 수 있는 위치에 여러 아미노산이 출현하는 라이브러리를 제작하여 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자를 라이브러리로부터 항원으로의 결합 활성을 지표로 취득하는 방법
3. 사전에 제1 항원에 대해 결합하는 것이 알려져 있는 항원 결합 분자로부터 부위 특이적 변이법으로 제작한 항체를 사용하여 제1 항원과의 결합 활성을 유지하는 아미노산을 동정하고, 동정된 아미노산이 출현하는 라이브러리로부터 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자를 항원으로의 결합 활성을 지표로 취득하는 방법
4. 3의 방법에 있어서 또한 항원 결합 분자 중의 루프를 길게 개변(연장)할 수 있는 위치에 여러 아미노산이 출현하는 항체 라이브러리를 제작하여 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자를 라이브러리로부터 항원으로의 결합 활성을 지표로 취득하는 방법
5. 1, 2, 3 또는 4의 방법에 있어서 당쇄 부가 서열(예를 들면 NxS, NxT, x는 P 이외의 아미노산)이 출현하도록 개변하여 당쇄 수용체가 인식하는 당쇄를 부가시키는 방법(예를 들면 하이만노오스형 당쇄를 부가하여 하이만노오스 수용체가 인식한다. 하이만노오스형 당쇄는 항체 발현 시에 키푸넨신(kifunensine)을 첨가함으로써 얻어지는 것이 알려져 있다(MAbs. 2012 Jul-Aug;4(4):475-87)).
6. 1, 2, 3 또는 4의 방법에 있어서 루프 부위나 각종 아미노산으로 개변하는 것이 가능했던 부위에 Cys, Lys 또는 비천연 아미노산을 삽입 또는 치환하여 제2 항원에 결합하는 도메인을 공유결합으로 부가하는 방법(Antibody drug conjugate로 대표되는 방법으로, Cys, Lys 또는 비천연 아미노산으로 공유결합으로 결합시키는 방법(mAbs 6:1, 34-45; January/February 2014, WO2009/134891A2, Bioconjug Chem. 2014 Feb 19;25(2) :351-61))
또한 상기에 예시된 6개의 라이브러리 제작방법에 있어서 항원 결합 분자 중의 아미노산을 치환하는 개소 또는 항원 결합 분자 중에 펩티드를 삽입하는 개소는 항원 결합 분자의 Fab 또는 가변영역 부분이 바람직하다. 바람직한 영역으로서는 가변영역 중의 용매에 노출되어 있는 영역 및 루프영역을 들 수 있다. 그 중에서도 CDR1, CDR2, CDR3, FR3영역, 루프영역이 바람직하다. 구체적으로는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74, 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56, 89~97이 바람직하고, H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31, 52a~61, 71~74, 97~101, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 51~56, 89~96이 보다 바람직하다.
상기 방법 1에 기재된 제1 항원에 결합하는 항원 결합 분자에 제2 항원에 결합하는 펩티드를 삽입하는 방법의 일태양으로서 Angew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5;52(32):8295-8에 예시되어 있는 바와 같이 G-CSF를 삽입하는 방법도 들 수 있다. 다른 일태양으로서 삽입되는 펩티드는 펩티드를 제시한 라이브러리로부터 취득 가능하나, 또한 천연으로 존재하는 단백질의 전체 또는 그의 일부를 이용하는 것도 가능하다.
제1 항원인 CD3(인간 CD3인 경우 인간 CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄)와의 결합 활성을 유지하는 아미노산을 동정하기 위해서는, 예를 들면 항원 결합에 관여할 것으로 생각되는 부위의 아미노산 개변을 행하여 1 아미노산 개변 항체를 제작해서 판단할 수 있다. 1 아미노산 개변 항체의 CD3 결합 평가에는 당업자에게 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있으나，예를 들면 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting), ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등으로 측정할 수 있다.
CD3와의 결합 활성을 유지하는 아미노산을 동정하는 데는 개변 전의 항체에 대해 예를 들면 각종 개변체의 결합량의 비의 결과를 사용할 수 있다. 즉, 개변 전의 항체의 결합량을 X, 1 아미노산 개변체의 결합량을 Y로 했을 때의 Z(결합량의 비)=Y/X의 값을 사용할 수 있다. Z(결합량의 비)가 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.9 이상, 바람직하게는 0.8 이상일 때 개변 전의 항체에 대해 결합을 유지하고 있다고 생각할 수 있다. 이들 결합을 유지하고 있는 아미노산이 출현하도록 항체 라이브러리를 제작할 수 있다.
ECM(Extracellular matrix；세포 외 매트릭스)은 세포 외의 구성성분 중 하나이며, 생체 내에 여러 부위에 존재하고 있다. 그렇기 때문에 ECM에 강하게 결합하는 항체는 혈중동태가 나빠지는(반감기가 짧아지는) 것이 알려져 있다(WO2012093704A1). 이에 항체 라이브러리에서 출현하는 아미노산에 대해서도 ECM 결합이 증강되지 않는 아미노산을 선택하는 것이 바람직하다.
ECM 결합이 증강되지 않는 아미노산을 선택하는 데는 예를 들면 참고 실시예 2의 방법에 따라 ECM 결합을 평가하여, 각 개변체의 ECM 결합값(ECL response；ECL 반응값)을 MRA(H쇄 서열번호：57, L쇄 서열번호：58)의 항체 ECM 결합값으로 나눈 값을 사용할 수 있다. 당해 값은 복수 개변에 의한 ECM 결합 증강의 효과를 고려하여 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배까지를 유효값으로 채용할 수 있으나, 바람직하게는 10배까지를 유효값으로 라이브러리에 채용할 수 있다. 이와 같이 선택된 아미노산이 출현하도록 항체 라이브러리를 제작할 수 있다.
또한 이에 한정되는 것은 아니나, CDR3로의 펩티드 삽입이 6 아미노산인 경우에 CDR3의 신장된 루프 내에 양전하를 측쇄에 갖는 아미노산이 많이 포함되면 ECM으로의 결합이 증강되는 것으로부터, 루프 내에 3개 이상의 양전하를 측쇄에 갖는 아미노산이 출현하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 라이브러리는 라이브러리의 다양성을 증강시키기 위해 가변영역에 펩티드를 삽입할 수 있다. 펩티드 삽입을 위한 바람직한 영역으로서는 가변영역 중의 용매에 노출되어 있는 영역 및 루프영역을 들 수 있다. 그 중에서도 CDR1, CDR2, CDR3, FR3영역, 루프영역이 바람직하다. 구체적으로는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31~35, 50~65, 71~74, 95~102, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 50~56, 89~97이 바람직하고, H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 31, 52a~61, 71~74, 97~101, L쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 24~34, 51~56, 89~96이 보다 바람직하다. 더욱 바람직하게는 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 99-100의 영역이다. 또한 아미노산 개변 시에 항원과의 결합 활성을 상승시키는 아미노산을 함께 도입해도 된다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 삽입되는 펩티드의 길이는 1~3 아미노산, 4~6 아미노산, 7~9 아미노산, 10~12 아미노산, 13~15 아미노산, 15~20 아미노산, 21-25 아미노산을 들 수 있으나, 바람직하게는 1~3 아미노산, 4~6 아미노산, 7~9 아미노산이다.
라이브러리의 다양성을 증강시키기 위한 펩티드의 삽입 개소와 길이의 검토는 펩티드를 삽입한 분자를 제작하여 당해 분자의 CD3 결합을 평가함으로써 실시할 수 있다. 평가에는 당업자에게 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있으나，예를 들면 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting), ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등으로 측정할 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서, CD3와 제2 항원에 결합하는 항체 취득을 위한 항체 라이브러리는 아래와 같이 디자인할 수 있다.
스텝 1：CD3 결합능이 유지되어 있는 아미노산을 선택(CD3 결합량이 미개변 항체의 80% 이상인 것)
예를 들면 스텝 1에서 선택된 아미노산이 출현하도록 CD3와 제2 항원에 결합하는 항체 취득을 위한 라이브러리를 제작할 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서, CD3와 제2 항원에 결합하는 항체 취득을 위한 항체 라이브러리는 아래와 같이 디자인할 수 있다.
스텝 1：CD3 결합능이 유지되어 있는 아미노산을 선택(CD3 결합량이 미개변 항체의 80% 이상인 것)
스텝 2：H쇄 CDR3의 99-100(Kabat numbering) 사이에 아미노산을 삽입
예를 들면 스텝 1에 더하여 스텝 2에서 CDR3영역에 아미노산을 삽입함으로써 라이브러리의 다양성을 증강시킨 CD3와 제2 항원에 결합하는 항체 취득을 위한 라이브러리를 제작할 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 CD3와 제2 항원에 결합하는 항체 취득을 위한 항체 라이브러리는 아래와 같이 디자인할 수 있다.
스텝 1：CD3 결합능이 유지되어 있는 아미노산을 선택(CD3 결합량이 미개변 항체의 80% 이상인 것)
스텝 2：ECM 결합이 개변 전 보다도 MRA와 비교하여 10배 이내인 아미노산을 선택
스텝 3：H쇄 CDR3의 99-100(Kabat numbering) 사이에 아미노산 삽입
예를 들면 스텝 1 및 3에 더하여 스텝 2를 추가함으로써 라이브러리에서 출현하는 아미노산에 대해서도 ECM 결합이 증강되지 않는 아미노산을 선택할 수 있으나, 이 수법에 한정되는 것은 아니다. 또한 스텝 2를 거치지 않는 라이브러리 설계라도 라이브러리로부터 취득된 항원 결합 분자에 대해 ECM 결합을 측정하여 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 CD3(CD3ε) 결합 항체의 주형 서열(template sequence)로서 VH영역 CE115HA000(서열번호：52)을 사용한 경우, 라이브러리 디자인에 이용되는 아미노산으로서는 중쇄 가변영역에 포함되는 Kabat 넘버링 11번 위치, 31번 위치, 52a 위치, 52b 위치, 52c 위치, 53번 위치, 54번 위치, 56번 위치, 57번 위치, 61번 위치, 72번 위치, 78번 위치, 98번 위치, 99번 위치, 100번 위치, 100a 위치, 100b 위치, 100c 위치, 100d 위치, 100e 위치, 100f 위치, 100g 위치, 101번 위치 중 어느 하나 이상의 아미노산 등이 예시될 수 있다.
VH영역 CE115HA000(서열번호：52)에 V11L/L78I의 아미노산 개변을 가한 상기 라이브러리가 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 VH영역 CE115HA000(서열번호：52)에 V11L/D72A/L78I/D101Q의 아미노산 개변을 가한 상기 라이브러리가 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서, CD3(CD3ε) 결합 항체의 주형 서열로서 VL영역 GLS3000(서열번호：53)을 사용한 경우, 라이브러리 디자인에 이용되는 아미노산으로서는 경쇄 가변영역에 포함되는 Kabat 넘버링 24번 위치, 25번 위치, 26번 위치, 27번 위치, 27a 위치, 27b 위치, 27c 위치, 27e 위치, 30번 위치, 31번 위치, 33번 위치, 34번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 56번 위치, 74번 위치, 77번 위치, 89번 위치, 90번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치, 96번 위치, 107번 위치 중 어느 하나 이상의 아미노산 등이 예시될 수 있다.
본 발명에서의 라이브러리를 설계한다(디자인한다)는 것은, 예를 들면 NNK나 TRIM 라이브러리 등(Gonzalez-Munoz A et al. MAbs 2012, Lee CV et al. J Mol Biol. 2004, Knappik A. et al. J Mol Biol. 2000, Tiller T et al. MAbs 2013)의 공지의 라이브러리 기술을 이용하여, 특정 부위의 아미노산이 목적하는 아미노산으로 개변되어 있는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 포함하는 라이브러리를 설계하는 것이 포함되나, 특별히 이 태양에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 「1 또는 복수의 아미노산」이란 특별히 아미노산의 수를 한정받는 것이 아니라, 2 종류 이상의 아미노산, 5 종류 이상의 아미노산, 10 종류 이상의 아미노산, 15 종류 이상의 아미노산 또는 20 종류의 아미노산이어도 된다.
융합 폴리펩티드의 제시에 관하여 항원 결합 분자의 가변영역의 융합 폴리펩티드는 세포, 바이러스 또는 파지미드 입자의 표면에서 여러 태양으로 제시될 수 있다. 이들 태양에는 단일 사슬 Fv 단편(scFv), F(ab) 단편 및 이들 단편의 다가 형태가 포함된다. 다가 형태는 바람직하게는 ScFv, Fab 또는 F(ab')의 이량체이고, 이들은 본 명세서에서는 (ScFv)2, F(ab)2 및 F(ab')2로 각각 지칭된다. 다가 형태의 제시가 선호되는 이유 중 하나는 다가 형태의 제시로 통상은 저친화성인 클론의 동정이 가능해지는 점 또는 선택과정에서 희귀한 클론의 보다 효율적인 선택을 가능하게 하는 복수의 항원 결합 부위를 갖는 점이라고 생각된다.
박테리오파지의 표면에서 항체 단편을 포함하고 있는 융합 폴리펩티드를 제시시키는 방법은 당기술분야에서 공지이며, 예를 들면 WO1992001047 및 본 명세서에 기재되어 있다. 이 외에도 WO1992020791, WO1993006213, WO1993011236 및 1993019172에서는 관련된 방법이 기재되어 있어, 당업자는 이들 방법을 적절히 사용하는 것이 가능하다. 다른 공지 문헌(H.R.Hoogenboom & G.Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-388, WO1993006213 및 WO1993011236)에서는 파지 표면에서 제시된 여러 항원에 대한, 인공적으로 재배치된 가변영역 유전자 레퍼토리에 의한 항체의 동정이 나타내어져 있다.
scFv의 태양에서의 제시를 위해 벡터가 구축되는 경우, 항원 결합 분자의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 코드하고 있는 핵산 서열이 이 벡터에 포함된다. 일반적으로는 항원 결합 분자의 중쇄 가변영역을 코드하는 핵산 서열은 바이러스 외피 단백질 구성성분에 융합된다. 항원 결합 분자의 경쇄 가변영역을 코드하고 있는 핵산 서열은 펩티드 링커를 코드하고 있는 핵산 서열에 의해 항원 결합 분자의 중쇄 가변영역에 연결된다. 펩티드 링커는 일반적으로 약 5개 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 임의로 예를 들면 정제 또는 검출에 도움되는 표지를 코드하고 있는 다른 서열이 항원 결합 분자의 경쇄 가변영역 또는 항원 결합 분자의 중쇄 가변영역의 어느 한쪽 또는 양쪽을 코드하고 있는 핵산 서열의 3'말단에 융합될 수 있다.
F(ab)의 태양에서의 제시를 위해 벡터가 구축되는 경우, 항원 결합 분자의 가변영역 및 항원 결합 분자의 불변영역을 코드하는 핵산 서열이 이 벡터에 포함된다. 경쇄 가변영역을 코드하는 핵산은 경쇄 불변영역을 코드하는 핵산 서열에 융합된다. 항원 결합 분자의 중쇄 가변영역을 코드하는 핵산 서열은 중쇄 불변 CH1영역을 코드하는 핵산 서열에 융합된다. 일반적으로는 중쇄 가변영역 및 불변영역을 코드하고 있는 핵산 서열은 바이러스 외피 단백질의 전부 또는 일부를 코드하고 있는 핵산 서열에 융합된다. 중쇄 가변영역 및 불변영역은 바람직하게는 바이러스 외피 단백질의 적어도 일부의 융합체로서 발현되고, 경쇄 가변영역 및 불변영역은 중쇄 바이러스 코트 융합 단백질과는 따로따로 발현된다. 중쇄 및 경쇄는 서로 결합하나, 그의 결합은 공유결합일 수도 있고 비공유결합일 수도 있다. 임의로 예를 들면 정제 또는 검출에 도움되는 폴리펩티드 표지를 코드하고 있는 다른 서열이 항원 결합 분자의 경쇄 불변영역을 코드하고 있는 핵산 서열의 3'말단 또는 항원 결합 분자의 중쇄 불변영역을 코드하고 있는 핵산 서열의 3'말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 융합될 수 있다.
숙주세포로의 벡터의 도입에 관하여 상기와 같이 구축된 벡터는 증폭 및/또는 발현을 위해 숙주세포에 도입된다. 벡터는 전기천공법, 인산칼슘 침전 등을 포함하는 공지의 형질전환법으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 벡터가 바이러스와 같은 감염성 입자인 경우 벡터 자체가 숙주세포에 침입한다. 융합 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 복제 가능한 발현 벡터에 의한 숙주세포의 트랜스펙션 및 공지의 수법에 의한 파지 입자의 생산에 의해 융합 단백질이 파지 입자의 표면에 제시된다.
복제 가능한 발현 벡터는 여러 방법을 사용하여 숙주세포에 도입될 수 있다. 비한정의 일실시태양에서는 벡터는 WO2000106717에 기재되어 있는 바와 같이 전기천공법을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 세포는 표준의 배양액 중에서 임의로 약 6 내지 48시간(또는 600 ㎚에서의 OD가 0.6 내지 0.8이 될 때까지) 37℃에서 배양한 다음에 배양액을 원심분리함으로써(예를 들면 데칸테이션에 의해) 배양상청이 취출된다. 정제의 초기단계에서는 바람직하게는 완충액(예를 들면 1.0 mM의 HEPES(pH 7.4)) 중에 세포 펠릿이 재현탁된다. 다음으로 재차 원심분리에 의해 현탁액으로부터 상청이 취출된다. 얻어진 세포 펠릿은 예를 들면 5-20% V/V로 희석된 글리세린에 재현탁된다. 재차 원심분리에 의해 현탁액으로부터 상청을 제거함으로써 세포 펠릿이 얻어진다. 당해 세포 펠릿을 물 또는 희석된 글리세린 중에 재현탁함으로써 얻어진 현탁액의 균체농도의 측정값을 토대로 최종적인 균체농도가 물 또는 희석된 글리세린을 사용하여 목적하는 농도로 조정된다.
예를 들면 바람직한 수용세포로서 전기천공법 응답능이 있는 대장균주 SS320(Sidhu 등 (Methods Enzymol. (2000) 328, 333-363))을 들 수 있다. 대장균주 SS320은 임성 에피솜(fertility episome)(F'플라스미드) 또는 XL1-BLUE를 MC1061세포에 이전하는데 충분한 조건하에서 MC1061세포를 XL1-BLUE세포와 교접시켜 조제되었다. ATCC(10801 University Boulevard, Manassas, Virginia)에 기탁된 대장균주 SS320에 대해 기탁번호 98795가 부여되어 있다. 이 균주에서의 파지 복제를 가능하게 하는 어떠한 F' 에피솜도 본 발명에서 사용될 수 있다. 적절한 에피솜은 ATCC에 기탁되어 있는 주로부터 입수 가능하고 또는 시판품도 입수 가능하다(TG1, CJ236, CSH18, DHF', ER2738, JM101, JM103, JM105, JM107, JM109, JM110, KS1000, XL1-BLUE, 71-18 등).
전기천공법에서 보다 높은 DNA농도(약 10배)를 사용하면 형질전환률이 향상되어 숙주세포로 형질전환되는 DNA의 양이 증가한다. 높은 균체농도의 사용도 효율을 높인다(약 10배). 이전된 DNA 양의 증가로 보다 큰 다양성을 가지며, 서열이 다른 독립 클론의 수가 큰 라이브러리가 제작될 수 있다. 형질전환세포는 통상 항생물질을 포함하는 배지 상의 증식 여부에 의해 선택된다.
또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 상기 핵산은 DNA, RNA 등 어떠한 형태여도 된다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 종류는 벡터가 도입되는 숙주세포에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 전술한 벡터를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 숙주세포는 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 전술한 숙주세포를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 항원 결합 분자에 더하여 의약적으로 허용 가능한 담체를 도입하여 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 용액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 구체적으로는 경질무수규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스 칼슘, 카르멜로오스 나트륨, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐아세탈 디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 파마자유 60, 백당, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 담체로서 들 수 있다. 이들 제제에서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 외 보조제를 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트80(TM), HCO-50과 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질알코올과 병용해도 된다. 또한 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다. 투여는 바람직하게는 비경구 투여이며, 구체적으로는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등으로 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
또한 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회에 대하여 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎ 내지 1,000 ㎎의 범위에서 선택할 수 있다. 또는 예를 들면 환자당 0.001 내지 100,000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있으나, 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다.
또한 본 발명은 본 발명의 항원 결합 분자를 투여하는 공정을 포함하는 암 치료방법, 암 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 항원 결합 분자, 암 치료제 제조에서의 본 발명의 항원 결합 분자의 사용, 및 본 발명의 항원 결합 분자를 사용하는 공정을 포함하는 암 치료제를 제조하기 위한 프로세스를 제공한다.
또한 본 명세서에서 사용되고 있는 아미노산의 3 문자 표기와 1 문자 표기의 반응은 아래와 같다. 알라닌：Ala：A 아르기닌：Arg：R 아스파라긴：Asn：N 아스파라긴산：Asp：D 시스테인：Cys：C 글루타민：Gln：Q 글루타민산：Glu：E 글리신：Gly：G 히스티딘：His：H 이소류신：Ile：I 류신：Leu：L 리신：Lys：K 메티오닌：Met：M 페닐알라닌：Phe：F 프롤린：Pro：P 세린：Ser：S 트레오닌：Thr：T 트립토판：Trp：W 티로신：Tyr：Y 발린：Val：V
본 명세서에 기재된 1 또는 복수의 태양을 임의로 조합한 것도 당업자의 기술상식을 토대로 기술적으로 모순되지 않는 한 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게는 당연히 이해된다.
또한 본 명세서에서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 아래의 실시예로 추가로 예시되나, 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
〔실시예 1〕CD3(제1 항원) 및 다른 항원(제2 항원)에 결합하여 상이한 세포 상의 CD3(제1 항원) 및 당해 다른 항원(제2 항원)에 동시에는 결합하지 않는 개변 면역글로불린 가변(Fab)영역의 컨셉트
면역글로불린이 2분자 이상의 활성형 FcγR에 동시에 결합하거나 또는 다른 항원과 활성형 FcγR에 동시에 결합함으로써 활성화 FcγR의 가교반응이 일어나면 FcγR의 ITAM 시그널이 전달되어 면역세포의 활성화가 일어날 가능성이 생각된다. IgG형의 항체 1 분자는 상기와 같이 1 분자의 FcγR에만 결합할 수 있기 때문에 항원 존재하에서만 2분자 이상의 활성형 FcγR이 가교되어 면역세포의 활성화가 일어난다.
또한 IgG형의 항체가 가변영역(Fab)에서 항원과 결합한 경우 동시에 Fc영역에서 1 분자의 FcγR에 결합하는 것이 가능한 것으로부터 당해 항원이 발현되고 있는 세포와 FcγR 발현세포 간의 가교가 일어난다. 항원이 발현되고 있는 세포에 따라서는 항원과 FcγR의 가교가 바람직하지 않은 경우도 존재한다. 구체적으로는, 예를 들면 항원이 CD3인 경우, T세포가 FcγR 발현세포와 가교함으로써 사이토카인 릴리스 등의 면역 활성화가 일어나는 경우이다(J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3) , 1246-52). 이러한 경우는 Fc영역에 개변을 도입함으로써 FcγR에 대한 결합 활성을 없애 항원과 FcγR의 가교반응을 막는 것이 가능하다(Advanced Drug Delivery Reviews (2006) 58, 640- 656). 마찬가지로 IgG형 항체의 항원이 CD40, OX40, CD27 등의 TNFR 슈퍼패밀리 분자, CD3와 TLR2, 4, 8, 9 등의 TLR 등인 경우도, FcγR을 매개로 가교가 일어나면 전신에서 면역의 활성화가 생기기 때문에 다른 세포에 발현되는 이들 분자에 동시에 결합하는 것은 바람직하지 않다.
한편, 지금까지의 다중특이성 항체는 복수의 항원에 동시에 결합하나 항원의 조합에 따라서는 복수의 항원에 동시에 결합하는 것이 바람직하지 않은 경우도 존재한다. 예를 들면 접착분자로서 알려져 있는 인테그린 αvβ3는 많은 암세포 및 종양 주변의 혈관에 발현되고 있는 것으로부터 종양을 타겟팅하는 표적 분자로서 유용(R. Haubner, PLoS Med., 2,e70(2005))하나, 반면에 여러 정상세포에도 발현되고 있는 것이 알려져 있다(Thromb Haemost. 1998 Nov;80(5):726-34.). 따라서, 다중특이성 항체가 CD3와 인테그린 αvβ3 양쪽에 동시에 결합해버리면 정상세포가 T세포에 의한 강력한 세포상해활성으로 상해되어버릴 가능성이 생각된다.
여기서 이러한 바람직하지 않은 가교반응을 제어하는 방법으로서 1개의 가변(Fab)영역에 있어서 그의 일부분에서 제1 항원에 결합하고, 이 결합에 관여하지 않는 당해 가변(Fab)영역의 다른 부분에서 제2 항원에 결합하는 가변영역(Dual Binding Fab)이 생각되었다(도 1). 이때, 도 1에 나타내는 바와 같이 1개의 가변(Fab)영역 중 근접한 2개의 부분이 각각의 항원으로의 결합에 필수인 경우, 제1 항원이 결합하면 제2 항원의 결합이 저해되고 마찬가지로 제2 항원이 결합하면 제1 항원의 결합이 저해된다. 따라서, 이러한 듀얼 바인딩 Fab의 성질을 갖는 개량 항체는 제1 항원 및 제2 항원에 동시에는 결합할 수 없기 때문에 제1 항원과 제2 항원의 가교반응은 일어나지 않는다고 생각되었다(도 2). 또한 제1 항원과 제2 항원이 가용형 단백질과 같이 세포막 상에 발현되고 있지 않거나 또는 양쪽이 동일 세포 상에 존재하는 경우에는 제1 항원과 제2 항원 양쪽에 동시에 결합할 수 있으나, 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 경우에는 동시에는 결합하지 않고, 2개의 세포를 가교하지 않는 경우도 듀얼 바인딩 Fab라고 생각된다(도 3). 한편, 다른 한쪽의 가변(Fab)영역과 결합하는 항원(제3 항원)은 제1 항원과 가교반응이 일어나며(도 4), 또한 제2 항원과도 가교반응이 일어난다고 생각된다(도 5). 당해 항체 불변영역으로는 FcγR에 결합하는 Fc영역을 사용하는 것도 가능하며, FcγR에 대한 결합 활성을 저감시킨 Fc영역을 사용하는 것도 가능하다.
이러한 듀얼 바인딩 Fab의 성질을 이용하면, 예를 들면 항체를 매개로 T세포를 방향변경(redirection)시킴으로써 암항원을 발현하고 있는 암세포를 상해시키는 기술에 추가로 암조직 중 인테그린으로의 타겟 기능을 부여함으로써 보다 암 특이성을 높이는 것이 가능해진다.
즉, 가변(Fab)영역을 개량하여 듀얼 바인딩 Fab로 함으로써, 아래의 성질을 부여할 수 있다면, 도 1에 나타내는 바와 같은 작용을 갖는 항체를 창제하는 것이 가능하다.
1. 제1 항원에 대한 결합 활성을 갖는다
2. 제2 항원에 대한 결합 활성을 갖는다
3. 제1 항원 및 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는다
또한 「제1 항원 및 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는」 것에는, 제1 항원이 발현되고 있는 세포와 제2 항원이 발현되고 있는 세포 2개의 세포를 가교하지 않거나 각각 별도의 세포에 발현되고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에 결합하지 않는 것, 또한 제1 항원과 제2 항원이 가용형 단백질과 같이 세포막 상에 발현되고 있지 않거나 또는 양쪽이 동일 세포 상에 존재하는 경우에는 제1 항원과 제2 항원 양쪽에 동시에 결합할 수 있으나, 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 경우에는 동시에는 결합할 수 없는 경우도 포함된다.
마찬가지로 가변(Fab)영역을 개량하여 듀얼 바인딩 Fab로 함으로써 아래의 성질을 부여할 수 있다면, 예를 들면 도 6에 나타내는 바와 같은 작용을 갖는 항체를 창제하는 것이 가능하다.
1. T세포 상의 제1 항원에 대한 결합 활성을 갖는다
2. 항원 제시 세포 상의 제2 항원에 대한 결합 활성을 갖는다
3. 제1 항원 및 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는다
〔실시예 2〕항인간, 게잡이원숭이 CD3ε 항체 CE115의 제작
(2-1) 인간 CD3, 게잡이원숭이 CD3 발현세포 면역 랫트를 사용한 하이브리도마의 제작
SD 랫트(암컷, 면역 개시 시 6주령, 일본 찰스·리버)에 인간 CD3εγ 또는 게잡이원숭이 CD3εγ발현 Ba/F3세포를 아래와 같이 면역하였다. 최초 면역 시를 0일째라고 하면, 0일째에 프로인트 완전 애쥬번트(Difco)와 함께 5×107개의 인간 CD3εγ발현 Ba/F3세포를 복강 내 투여하였다. 14일째에 프로인트 불완전 애쥬번트(Difco)와 함께 5×107개의 게잡이원숭이 CD3εγ발현 Ba/F3세포를 복강 내 투여한 다음, 1주 간격으로 4회 5×107개의 인간 또는 게잡이원숭이 CD3εγ발현 Ba/F3세포를 번갈아 복강 내 투여하였다. CD3εγ의 최종 투여 일주일 후에(49일째), 부스트로서 인간 CD3εγ발현 Ba/F3세포를 정맥 내 투여하고, 그 3일 후에 랫트의 비장세포와 마우스 골수종세포 SP2/0를 PEG1500(Roche Diagnostics)을 사용한 통상의 방법에 따라 세포 융합하였다. 융합세포, 즉 하이브리도마는 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(이하 10% FBS/RPMI1640으로 칭함)에서 배양하였다.
융합 다음날에 (1) 융합세포를 반유동배지(StemCells)에 현탁하여 하이브리도마의 선택배양을 행함과 동시에 하이브리도마의 콜로니화를 실시하였다.
융합 후 9일째 또는 10일째에 하이브리도마의 콜로니를 픽업하여 HAT 선택배지(10% FBS/RPMI1640, 2 vol% HAT 50x concentrate(다이닛폰 제약), 5 vol% BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))가 들어 있는 96-웰 플레이트에 1 웰당 1 콜로니를 파종하였다. 3~4일 배양 후, 각 웰의 배양상청을 회수하여 배양상청 중의 랫트 IgG 농도를 측정하였다. 랫트 IgG를 확인할 수 있었던 배양상청에 대해서 인간 CD3εγ발현 Ba/F3세포 또는 인간 CD3εγ를 발현하지 않는 Ba/F3를 부착시킨 cell-ELISA로 인간 CD3εγ에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 클론을 선발하였다(도 7). 또한 게잡이원숭이 CD3εγ발현 Ba/F3세포를 부착시킨 cell-ELISA를 행함으로써 원숭이 CD3εγ에 대한 교차성도 평가하였다(도 7).
(2-2) 항인간, 원숭이 CD3ε 키메라 항체의 제작
하이브리도마세포로부터 RNeasy Mini Kits(QIAGEN)를 사용하여 토탈 RNA를 추출하고 SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)로 cDNA를 합성하였다. 제작한 cDNA를 사용하여, PCR로 항체 가변영역 유전자를 클로닝 벡터에 삽입하였다. 각 DNA 단편의 염기서열은 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)로 첨부 설명서 기재의 방법에 따라 결정하였다. CE115 H쇄 가변영역(서열번호：13) 및 CE115 L쇄 가변영역(서열번호：14)의 CDR, FR의 결정은 Kabat 넘버링에 따라 행하였다.
상기 랫트 항체 H쇄 가변영역과 인간 항체 IgG1쇄 불변영역을 결합한 키메라 항체 H쇄 및 상기 랫트 항체 L쇄 가변영역과 인간 항체 Kappa쇄 불변영역을 결합한 키메라 항체 L쇄 유전자를 동물세포 발현 벡터에 삽입하였다. 제작한 발현 벡터를 사용하여 CE115 키메라 항체의 발현 및 정제를 행하였다(참고 실시예 1).
(2-3) EGFR_ERY22_CE115의 제작
다음으로, 암항원(EGFR)에 대한 IgG를 기본 골격으로 하여 한쪽의 Fab를 CD3ε에 대한 결합 도메인으로 치환한 형태의 분자를 제작하였다. 이때, 기본 골격으로 하는 IgG의 Fc로서는 전술한 경우와 같이 FcgR(Fcγ 수용체)로의 결합성이 감약된 사일런트형 Fc를 사용하였다. EGFR에 대한 결합 도메인으로서 세툭시맵(Cetuximab)의 가변영역인 어떤 Cetuximab-VH(서열번호：15), Cetuximab-VL(서열번호：16)을 사용하였다. 항체 H쇄 불변영역으로서 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d, G1d에 D356K 및 H435R의 변이를 도입한 A5 및 G1d에 K439E의 변이를 도입한 B3를 사용하여 각각 Cetuximab-VH와 조합한 Cetuximab-VH-G1d(서열번호：17), Cetuximab-VH-A5(서열번호：18), Cetuximab-VH-B3(서열번호：19)를 참고 실시예 1의 방법에 따라서 조제하였다. 또한 항체 H쇄 불변영역의 명칭을 H1으로 한 경우 가변영역에 Cetuximab-VH를 갖는 항체의 H쇄에 대응하는 서열은 Cetuximab-VH-H1과 같이 나타내었다.
여기서, 아미노산의 개변을 나타내는 경우에는 D356K와 같이 나타내었다. 최초 알파벳(D356K의 D에 해당)은 개변 전의 아미노산 잔기를 1 문자 표기로 나타낸 경우의 알파벳을 의미하고, 그에 이어지는 숫자(D356K의 356에 해당)는 그 개변 개소의 EU 넘버링을 의미하며, 최종 알파벳(D356K의 K에 해당)은 개변 후의 아미노산 잔기를 1 문자 표기로 나타낸 경우의 알파벳을 의미한다.
EGFR에 대한 Fab의 VH 도메인과 VL 도메인을 치환한 EGFR_ERY22_CE115(도 8)를 제작하였다. 즉, 상기한 방법과 같은 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법으로 EGFR ERY22_Hk(서열번호：20), EGFR ERY22_L(서열번호：21), CE115_ERY22_Hh(서열번호：22), CE115_ERY22_L(서열번호：23)을 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
아래에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F세포에 도입되어 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
·목적 분자：EGFR_ERY22_CE115
·발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：EGFR _ERY22_Hk, EGFR_ERY22_L, CE115_ERY22_Hh, CE115_ERY22_L
(2-4) EGFR_ERY22_CE115의 정제
얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 한외여과로 농축된 다음, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고 용출액의 단량체 분획만을 회수함으로써 정제된 각 목적 분자가 얻어졌다.
(2-5) 인간 말초혈 단핵구를 사용한 세포상해활성의 측정
(2-5-1) 인간 말초혈 단핵구(PBMC：Peripheral Blood Mononuclear Cell) 용액의 조제
1,000 단위/mL의 헤파린 용액(노보·헤파린 주사 5천 단위，노보·노르디스크사)을 사전에 100 μL 주입한 주사기를 사용하여 건강한 정상인 자원봉사자(성인)에게서 말초혈 50 mL가 채취되었다. PBS(-)로 2배 희석한 후에 4 등분된 말초혈이 15 mL의 Ficoll-Paque PLUS를 사전에 주입하여 원심조작이 행하여진 Leucosep 림프구 분리관(Cat. No. 227290, Greiner bio-one사)에 첨가되었다. 당해 분리관의 원심분리(2,150 rpm, 10분간, 실온) 후 단핵구 분획층이 분취되었다. 10% FBS를 포함하는 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(SIGMA사, 이하 10% FBS/D-MEM)로 단핵구 분획의 세포를 1회 세정한 다음, 당해 세포를 그의 세포밀도가 4×106 cells/mL가 되도록 10% FBS/D-MEM을 사용하여 조제하였다. 이와 같이 조제한 세포용액을 인간 PBMC 용액으로서 이후의 시험에 사용하였다.
(2-5-2) 세포상해활성의 측정
세포상해활성은 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저(로슈·다이아그노스틱스사)를 사용한 세포 증식 억제율로 평가하였다. 표적세포에는 SK-HEP-1 세포주에 인간 EGFR을 강제 발현시켜 수립한 SK-pca13a 세포주를 사용하였다. SK-pca13a를 디쉬로부터 박리하여 1×104 cells/well이 되도록 E-Plate 96 플레이트(로슈·다이아그노스틱스사)에 100 μL/well로 뿌리고 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저를 사용하여 생세포의 측정을 개시하였다. 다음날 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저로부터 플레이트를 취출하여 당해 플레이트에 각 농도(0.004, 0.04, 0.4, 4 nM)로 조제한 각 항체 50 μL를 첨가하였다. 실온에서 15분간 반응시킨 후에 (2-5-1)에서 조제한 인간 PBMC 용액 50 μL(2×105 cells/well)를 첨가하여 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저에 당해 플레이트를 재세팅함으로써 생세포의 측정을 개시하였다. 반응은 5% 탄산가스, 37℃ 조건하에서 행하여 인간 PBMC 첨가 72시간 후의 Cell Index 값으로부터 하기식에 의해 세포 증식 억제율(%)을 구하였다. 또한 계산에 사용한 Cell Index 값에는 항체 첨가 직전의 Cell Index 값이 1이 되도록 정규화(normalization)한 후의 수치를 사용하였다.
세포 증식 억제율(%)=(A-B)×100/(A-1)
A는 항체를 첨가하지 않은 웰에서의 Cell Index 값의 평균값(표적세포와 인간 PBMC만), B는 각 웰에서의 Cell Index 값의 평균값을 나타낸다. 시험은 3회 행하였다.
인간 혈액으로부터 조제한 PBMC를 이펙터 세포로 하여 CE115를 사용한 EGFR_ERY22_CE115의 세포상해활성을 측정한 결과 매우 강한 활성이 확인되었다(도 9).
〔실시예 3〕CD3 및 인간 인테그린 αvβ3에 결합하나 동시에는 결합하지 않는 항체의 제작
도 1~6에 나타낸 바와 같이 듀얼 바인딩(Dual binding) Fab란 가변(Fab)영역에서 CD3(제1 항원)와 목적의 항원(제2 항원)에 결합하나 CD3(제1 항원) 및 목적의 항원(제2 항원)에 동시에는 결합하지 않는 분자이다. 제2 항원과 결합하기 위해 CD3(제1 항원)에 결합하는 항체의 Fab영역에 아미노산 개변을 도입하는 경우 통상 2개의 H쇄 또는 L쇄 양쪽에 아미노산 개변이 도입된다. 그러나 양쪽 H쇄 또는 L쇄에 개변이 도입되면 항체의 2개의 Fab가 각각 2개의 항원에 결합함으로써 2개의 Fab와 CD3(제1 항원) 및 목적의 항원(제2 항원)에 동시에 결합하여 가교될 가능성이 있다. 따라서 항체의 하나의 Fab는 제3 항원에 결합하거나 또는 아무것에도 결합하지 않는 Fab로 하고, 다른 하나의 Fab를 듀얼 바인딩 Fab로 하여 CD3(제1 항원) 및 목적의 항원(제2 항원)의 가교반응은 일어나지 않도록 한다.
(3-1) CD3 및 인간 인테그린 αvβ3에 결합하나 동시에는 결합하지 않는 항체의 제작
접착분자로서 알려져 있는 인테그린 αvβ3는 많은 암세포 및 종양 주변의 혈관에 발현되고 있는 것으로부터 종양을 타겟팅하는 표적 분자로서 유용하나, 반면에 여러 정상세포에도 발현되고 있는 것이 알려져 있다(Thromb Haemost. 1998 Nov;80(5):726-34.). 따라서, CD3와 인테그린 αvβ3가 동시에 결합해버리면 정상세포가 T세포에 의한 강력한 세포상해활성으로 상해되어버릴 가능성이 생각되었다. 이에 CD3와 인테그린 αvβ3가 동시에는 결합하지 않는 분자를 제작할 수 있으면, 정상세포에 상해를 주지 않고 인테그린 αvβ3를 발현하는 종양세포에 항EGFR 항체 분자를 타겟팅할 수 있다고 생각되었다. 즉, 한쪽의 가변영역(Fab)에서 EGFR에 결합하고, 다른 가변영역에서 제1 항원인 CD3에 결합, 또한 제2 항원인 인테그린 αvβ3에 결합하며 CD3 및 인테그린 αvβ3에 동시에는 결합하지 않는 듀얼 바인딩 Fab 분자의 취득을 검토하였다.
「인테그린 αvβ3가 존재하지 않는 조건에서 CD3와 Fab영역이 결합하고 CD3가 존재하지 않는 조건에서 인테그린 αvβ3와 Fab영역이 결합하는 분자로서, CD3에 결합한 분자는 인테그린 αvβ3에 결합하지 않는 분자, 또는 인테그린 αvβ3와 결합한 분자는 CD3에 결합하지 않는 분자」인 것을 나타낼 수 있다면 목적으로 하는 듀얼 바인딩 Fab의 특성(즉, CD3 및 제2 항원에 결합할 수 있으며 CD3 및 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는)을 갖는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 창제하는 것이 가능했다고 할 수 있다.
(3-2) 인테그린 α vβ3와 결합하는 Fab 영역을 갖는 항체의 취득
듀얼 바인딩 Fab 분자를 취득하는 방법으로서 라이브러리를 이용하는 방법과 단백질에 대해 결합 활성을 갖는 것이 알려져 있는 펩티드를 삽입하는 방법이 생각되었다. 인테그린 αvβ3에 대해 결합 활성을 갖는 펩티드로서 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩티드가 알려져 있다. 여기서, 한쪽의 Fab를 EGFR 결합 도메인으로 하고, 다른 한쪽의 Fab를 CD3 결합 도메인 및 인테그린 αvβ3 결합 도메인으로 하는 헤테로 이량화 항체로서, CD3ε에 결합하는 항체인 CE115(중쇄 가변영역 서열번호：13, 경쇄 가변영역 서열번호：14)의 중쇄의 루프부분에 RGD 펩티드를 삽입한 헤테로 이량화 항체를 참고 실시예 1에 따라 제작하였다. 즉, EGFR ERY22_Hk(서열번호：20), EGFR ERY22_L(서열번호：21) 및 CE115_ERY22_L(서열번호：23)을 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드와 함께 아래 중 어느 하나를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터를 제작하였다：
·CE115_2 ERY22_Hh(서열번호：24, Kabat 넘버링 52b-53을 각각 K 및 N으로 치환),
·CE115_4 ERY22_Hh(서열번호：25, Kabat 넘버링 52b-54를 각각 S 및 N으로 치환),
·CE115_9 ERY22_Hh(서열번호：26, Kabat 넘버링 52a-52b 사이에 RGD를 삽입),
·CE115_10 ERY22_Hh(서열번호：27, Kabat 넘버링 52b-52c 사이에 RGD를 삽입),
·CE115_12 ERY22_Hh(서열번호：28, Kabat 넘버링 72-73 사이에 RGD를 삽입),
·CE115_17 ERY22_Hh(서열번호：29, Kabat 넘버링 52b-52c를 각각 K 및 S로치환),
·CE115_47 ERY22_Hh(서열번호：30, Kabat 넘버링 98-99 사이에 RGD를 삽입),
·CE115_48 ERY22_Hh(서열번호：31, Kabat 넘버링 99-100 사이에 RGD를 삽입),
·CE115_49 ERY22_Hh(서열번호：32, Kabat 넘버링 100-100a 사이에 RGD에 삽입).
또한 대조로서 J. Biotech, 155, 193-202, 2011에 보고되어 있는 항체의 CH3영역에 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩티드가 삽입된 항체(EH240-Kn125 /EH240-Hl076/L73； 서열번호 33/34/35)를 참고 실시예 1에 따라 제작하였다. CH3영역을 매개로 인테그린 αvβ3와 결합하는 이 분자는 CD3와 인테그린 αvβ3에 동시에 결합할 수 있다고 생각된다.
(3-3) 인테그린 α vβ3와 항체의 결합 확인
Fab영역에 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩티드가 삽입된 분자가 인테그린 αvβ3와 결합하는지 여부를 전기화학발광법(ECL법)으로 판정하였다. 구체적으로는 0.1% BSA 및 0.1 g/L 염화칼슘 및 0.1 g/L 염화마그네슘을 포함하는 TBS 용액(희석(+) 용액으로 표기함)으로 희석한 비오틴-항인간 IgG Ab(Southern biotech)와, 5 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL로 조제된 항체 용액과, sulfo-tag를 부가한 인테그린 αvβ3(R&D Systems)를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 25 μL씩 첨가하여 혼합한 다음, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA 및 0.1 g/L 염화칼슘 및 0.1 g/L 염화마그네슘을 포함하는 TBS 용액(블로킹(+) 용액으로 표기함)을 스트렙트아비딘 플레이트(streptavidin plate)(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, 0.1 g/L 염화칼슘 및 0.1 g/L 염화마그네슘을 포함하는 TBS 용액(TBS(+) 용액으로 표기함) 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 75 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여 비오틴-항인간 IgG Ab를 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBS(+) 용액으로 3회 세정하고 READ 버퍼(MSD)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 11에 나타낸다. 모체 항체(parent antibody)인 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 인테그린 αvβ3에 대해 전혀 결합 활성을 나타내지 않았던 것에 대해 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_2 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_9 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_12 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_17 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_48 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 모두 인테그린 αvβ3와의 결합이 관찰되었다.
(3-4) CD3 ( CD3 ε)와 항체의 결합 확인
다음으로, 전 항에서 제작한 인테그린 αvβ3와 Fab영역에서 결합하는 항체가 CD3에 대한 결합 활성을 유지하고 있는지 ECL법으로 판정하였다. 구체적으로는 0.1% BSA를 포함하는 TBS 용액(희석(-) 용액으로 표기함)으로 희석한 비오틴-항인간 IgG Ab(Southern biotech)와, 5 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL로 조제된 항체 용액과, sulfo-tag를 부가한 CD3ε 호모 이량체 단백질을 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 25 μL씩 첨가하여 혼합한 다음, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA를 포함하는 TBS 용액(블로킹(-) 용액으로 표기함)을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, TBS 용액 (-)용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 75 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여 비오틴-항인간 IgG Ab를 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBS(-) 용액으로 3회 세정하고 READ 버퍼(MSD)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 12에 나타낸다. 모체 항체인 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L에 더하여 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_2 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_9 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_12 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_17 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_48 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 모두 CD3와의 결합이 관찰되었다.
(3-5) ECL 법에 의한 인테그린 α vβ3와 CD3가 동시에 Fab 영역에 결합하지 않는 것의 확인
전 항까지의 결과로부터 인테그린 αvβ3에 대해 결합 활성을 가지며 또한 CD3에 대해 결합 활성을 갖는 분자가 얻어졌다. 다음으로, 전 항까지 제작된 Fab영역이 CD3(CD3ε) 및 인테그린 αvβ3와 동시에 결합하는지 판정하였다.
Fab영역에 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩티드를 삽입한 분자가 인테그린 αvβ3와 CD3에 동시에 결합하는 경우 항체 용액에 인테그린 αvβ3와 비오틴 부가한 CD3를 첨가하면 양쪽 항원에 결합하는 것으로부터 ECL법으로 검출할 수 있다. 구체적으로는 희석(+) 용액으로 희석한 비오틴을 부가한 인간 CD3ε 호모 이량체 단백질과, 10 ㎍/mL 또는 5 ㎍/mL로 조제된 항체 용액과, sulfo-tag를 부가한 인테그린 αvβ3(R&D Systems)를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 25 μL씩 첨가하여 혼합한 다음, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 블로킹(+) 용액을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, 0.1 g/L 염화칼슘 및 0.1 g/L 염화마그네슘을 포함하는 TBS(+) 용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 75 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여 비오틴-항인간 IgG Ab를 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBS(+) 용액으로 3회 세정하고 READ 버퍼(MSD)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 13, 도 14에 나타낸다. Fab영역에 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩티드가 삽입된 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_2 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_12 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_17 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 인테그린 αvβ3와 CD3에 동시에 결합함으로써 ECL 측정에서 강한 시그널이 검출되었다. 반면에, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_9 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L과 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_48 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L에서는 그의 시그널은 약한 것이었다(도 13). 또한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 모두 ECL 측정에서 거의 시그널이 검출되지 않았다(도 14). 즉, 이들 항체는 CD3와 결합하면 인테그린 αvβ3와 결합하지 않는 것이 시사되었다.
(3-6) ECL 법에 의한 인테그린 α vβ3와 CD3가 동시에 Fab 영역에 결합하지 않는 것의 고찰
이상의 결과로부터, 1개의 Fab로 CD3(CD3ε), 인테그린 αvβ3에 각각 결합하며 또한 CD3(CD3ε) 및 인테그린 αvβ3에 동시에는 결합하지 않는 듀얼 바인딩 Fab 분자의 특성을 갖는 항체를 창제할 수 있었다. 본 실시예에서는 제1 항원인 CD3에 결합하는 가변영역을 갖는 항체에 대해 당해 가변영역에 제2 항원인 인테그린 αvβ3에 결합하는 RGD 펩티드를 Fab에 삽입함으로써 제2 항원에 대한 결합 활성을 부여하며 또한 CD3와 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 분자를 취득할 수 있었다. 같은 방법으로 WO2006036834에 예시되어 있는 단백질에 대해 결합 활성을 갖는 펩티드를 Fab 중의 루프에 삽입함으로써 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 취득할 수 있다. 그 외에, 단백질에 대해 결합 활성을 나타내는 펩티드는 당업자에게 공지의 방법을 사용하여 펩티드 라이브러리를 제작하여 목적하는 활성을 갖는 펩티드를 선택함으로써 취득할 수 있다(Pasqualini R., Nature, 1996, 380 (6572) :364-6). 또한 실시예 5에서 기재한 바와 같은 Fab 중의 루프를 길게 개변한(연장한) 항원 결합 분자의 라이브러리를 사용함으로써 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 창제하는 것이 가능하다고 생각된다. 제1 항원에 대한 가변영역은 당업자 공지의 여러 방법으로 취득하는 것이 가능한 것으로부터, 이러한 라이브러리를 사용함으로써 임의의 제1 항원과 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 가지며 또한 그 제1 항원 및 그 제2 항원에 동시에는 결합할 수 없는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 창제하는 것이 가능하다고 할 수 있다.
이상의 결과로부터, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 CD3 및 인테그린 αvβ3에 결합하고, CD3와 인테그린 αvβ3에 동시에는 결합하지 않는 것이 나타내어졌다. 즉 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 듀얼 바인딩 Fab를 갖는 분자로, 이러한 분자를 창제 가능한 것이 명확해졌다.
〔실시예 4〕CD3 및 인간 톨 유사 수용체 2(toll-like receptor 2;TLR2)에 결합하나 동시에는 결합하지 않는 항체의 제작
(4-1) CD3 및 인간 TLR2에 결합하나 동시에는 결합하지 않는 항체의 제작
패턴 인식 수용체로서 알려져 있는 TLR2는 주로 마크로파지, 수상세포나 B세포 등의 면역세포에 발현되고 있어 면역세포를 활성화하는 표적 분자로서 유용하다. 또한 TLR2는 상피세포나 내피세포 등 면역세포 이외의 정상세포에도 발현되고 있는 것이 알려져 있다. 암항원과 CD3를 동시에 결합함으로써 종양 환경 중에 CD3를 발현하는 T세포가 리크루트되어 T세포에 의해 암세포가 상해되나, 암항원과 TLR2가 동시에 결합함으로써 종양 환경 중에 TLR2를 발현하는 면역세포도 리크루트되어 활성화할 수 있는 것이 생각되었다. T세포에 의해 상해된 암세포를 TLR2에 의해 리크루트된 면역세포가 포섭하여 항원을 프로세싱하고 HLA에 제시함으로써 T세포를 할성화할 수 있기 때문에 T세포를 보다 강력하게 활성화할 수 있는 동시에 획득 면역도 유도할 수 있는 가능성이 있다. 그러나, CD3와 TLR2가 동시에 결합해버리면 면역세포 및 정상세포가 T세포에 의한 강력한 세포상해활성으로 상해되어버릴 가능성이 생각되었다. 이에 CD3와 TLR2가 동시에는 결합하지 않는 분자를 제작할 수 있으면 TLR2를 발현하는 면역세포 및 정상세포에 상해를 주지 않고 이들 세포를 리크루트할 수 있다고 생각되었다. 즉, 한쪽의 가변영역(Fab)에서 EGFR에 결합하고 다른 가변영역에서 제1 항원인 CD3에 결합하며, 또한 제2 항원인 TLR2에 결합하며 CD3 및 TLR2에 동시에는 결합하지 않는 듀얼 바인딩 Fab 분자의 취득을 검토하였다.
「TLR2가 존재하지 않는 조건에서 CD3와 Fab영역이 결합하고 CD3가 존재하지 않는 조건에서 TLR2와 Fab영역이 결합하는 분자로서, CD3에 결합한 분자는 TLR2에 결합하지 않는 분자 또는 TLR2와 결합한 분자는 CD3에 결합하지 않는 분자」인 것을 나타낼 수 있다면, 목적으로 하는 듀얼 바인딩 Fab의 특성(즉, CD3 및 제2 항원에 결합할 수 있으며 CD3 및 제2 항원에 동시에는 결합하지 않음)을 갖는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 창제하는 것이 가능했다고 할 수 있다.
(4-2) TLR2 와 결합하는 Fab 영역을 갖는 항체의 취득
인간 TLR2에 대해 결합 활성을 갖는 펩티드로서 RWGYHLRDRKYKGVRSHKGVPR 펩티드(서열번호：36)가 알려져 있다. 여기서, 한쪽의 Fab를 EGFR 결합 도메인으로 하고, 다른 한쪽의 Fab를 CD3 결합 도메인 및 TLR2 결합 도메인으로 하는 헤테로 이량화 항체로서, CD3ε에 결합하는 항체인 CE115(중쇄 가변영역 서열번호：13, 경쇄 가변영역 서열번호：14)의 중쇄의 루프부분에 TRL2 결합 펩티드를 삽입한 헤테로 이량화 항체를 참고 실시예 1에 따라 제작하였다. 즉, EGFR ERY22_Hk(서열번호：20), EGFR ERY22_L(서열번호：21) 및 CE115_ERY22_L(서열번호：23)을 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드와 함께 아래 중 어느 하나를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터를 제작하였다：
·CE115_DU21 ERY22_Hh(서열번호：37, Kabat 넘버링 52b-52c 사이에 TRL2 결합 펩티드를 삽입),
·CE115_DU22 ERY22_Hh(서열번호：38, Kabat 넘버링 52b-52c 사이에 TRL2 결합 펩티드를 삽입),
·CE115_DU26 ERY22_Hh(서열번호：39, Kabat 넘버링 72-73 사이에 TRL2 결합 펩티드를 삽입),
·CE115_DU27 ERY22_Hh(서열번호：40, Kabat 넘버링 72-73 사이에 TRL2 결합 펩티드 삽입).
또한 대조로서 TLR2 결합 펩티드를 CH3영역 C말단에 부가한 항체(CE115_ ERY22_DU42_Hh, 서열번호：41) 및 TLR2 결합 펩티드 양쪽 말단에 Cys 잔기를 갖는 펩티드를 CH3영역 C말단에 부가한 항체(CE115_ ERY22_DU43_Hh, 서열번호：42)를 참고 실시예 1에 따라 제작하였다. CH3영역을 매개로 TLR2와 결합하는 이 분자는 CD3와 TLR2에 동시에 결합하는 것이 가능하다고 생각된다.
(4-3) TLR2 와 항체의 결합 확인
Fab영역에 TLR2 결합 펩티드가 삽입된 분자가 TLR2와 결합하는지 여부를 전기화학발광법(ECL법)으로 판정하였다. 구체적으로는 0.1% BSA를 포함하는 TBS 용액(희석(-) 용액으로 표기함)으로 희석한 비오틴-항인간 IgG Ab(Southern biotech)와, 5 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL로 조제된 항체 용액과, sulfo-tag를 부가한 TLR2(abnova)를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 25 μL씩 첨가하여 혼합한 다음, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA를 포함하는 TBS 용액(블로킹(-) 용액으로 표기함)을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, TBS(-) 용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 75 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여 비오틴-항인간 IgG Ab를 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBS(-) 용액으로 3회 세정하고 READ 버퍼(MSD)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 15에 나타낸다. 모체 항체인 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 TLR2에 대해 전혀 결합 활성을 나타내지 않았던 것에 대해 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 모두 TLR2와의 결합이 관찰되었다.
(4-4) CD3 ( CD3 ε)와 항체의 결합 확인
다음으로, 전 항에서 제작한 TLR2와 Fab영역에서 결합하는 항체가 CD3(CD3ε)에 대한 결합 활성을 유지하고 있는지 ECL법으로 판정하였다. 구체적으로는 0.1% BSA를 포함하는 TBS 용액(희석(-) 용액으로 표기함)으로 희석한 비오틴-항인간 IgG Ab(Southern biotech)와, 5 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL로 조제된 항체 용액과, sulfo-tag를 부가한 CD3ε 호모 이량체 단백질을 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 25 μL씩 첨가하여 혼합한 다음, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA를 포함하는 TBS 용액(블로킹(-) 용액으로 표기함)을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, TBS 용액 (-)용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 75 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여 비오틴-항인간 IgG Ab를 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBS(-) 용액으로 3회 세정하고 READ 버퍼(MSD)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 16에 나타낸다. 모체 항체인 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L에 더하여 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 모두 CD3와의 결합이 관찰되었다.
(4-5) ECL 법에 의한 TLR2 와 CD3 가 동시에 Fab 영역에 결합하지 않는 것의 확인
전 항까지의 결과로부터, TLR2에 대해 결합 활성을 가지며 또한 CD3에 대해 결합 활성을 갖는 분자가 얻어졌다. 다음으로, 전 항까지 제작된 Fab영역이 CD3 및 TLR2와 동시에 결합하는지 판정하였다.
Fab영역에 TLR2 결합 펩티드를 삽입한 분자가 TLR2와 CD3에 동시에 결합하는 경우, 항체 용액에 TLR2와 비오틴 부가한 CD3를 첨가하면 양쪽 항원에 결합하는 것으로부터 ECL법으로 검출할 수 있다. 구체적으로는 희석(-) 용액으로 희석한 비오틴을 부가한 인간 CD3ε 호모 이량체 단백질과, 10 ㎍/mL 또는 5 ㎍/mL로 조제된 항체 용액과, sulfo-tag를 부가한 TLR2(R&D Systems)를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 25 μL씩 첨가하여 혼합한 다음, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 블로킹(-) 용액을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, 0.1 g/L 염화칼슘 및 0.1 g/L 염화마그네슘을 포함하는 TBS(-) 용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 75 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 인큐베이트하여 비오틴-항인간 IgG Ab를 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBS(-) 용액으로 3회 세정하고 READ 버퍼(MSD)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 17에 나타낸다. CH3영역에 TLR2 결합 펩티드를 부가한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU42 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU43 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 TLR2와 CD3에 동시에 결합함으로써 ECL 측정에서 강한 시그널이 검출되었다. 반면에 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 모두 ECL 측정에서 거의 시그널이 검출되지 않았다. 즉, 이들 항체는 CD3와 결합하면 TLR2와 결합하지 않는 것이 시사되었다.
(4-6) ECL 법에 의한 TLR2 와 CD3 가 동시에 Fab 영역에 결합하지 않는 것의 고찰
이상의 결과로부터, 1개의 Fab로 CD3, TLR2에 각각 결합하며 CD3 및 TLR2에 동시에는 결합하지 않는 듀얼 바인딩 Fab 분자의 특성을 갖는 항체를 창제하는 것이 가능하였다. 본 실시예에서는 제1 항원인 CD3에 결합하는 가변영역을 갖는 항체에 대해 당해 가변영역에 제2 항원인 TLR2에 결합하는 RWGYHLRDRKYKGVRSHKGVPR 펩티드를 Fab에 삽입함으로써, 제2 항원에 대한 결합 활성을 부여하며 CD3와 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 분자를 취득하는 가능하였다. 같은 방법으로 WO2006036834에 예시되어 있는 바와 같은 단백질에 대해 결합 활성을 갖는 펩티드를 Fab 중의 루프에 삽입함으로써, 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 취득할 수 있다. 그 외에, 단백질에 대해 결합 활성을 나타내는 펩티드는 당업자에게 공지의 방법을 사용하여 펩티드 라이브러리를 제작하여 목적하는 활성을 갖는 펩티드를 선택함으로써 취득할 수 있다(Pasqualini R., Nature, 1996, 380 (6572) :364-6)). 또한 실시예 5에서 기재한 바와 같은 Fab 중의 루프를 길게 개변한(연장한) 항원 결합 분자의 라이브러리를 사용함으로써 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 창제하는 것이 가능하다고 생각된다. 제1 항원에 대한 가변영역은 당업자 공지의 여러 방법으로 취득하는 것이 가능한 것으로부터, 이러한 라이브러리를 사용함으로써 임의의 제1 항원과 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 가지며, 그 제1 항원 및 그 제2 항원에 동시에는 결합할 수 없는 듀얼 바인딩 Fab 분자를 창제하는 것이 가능하다고 할 수 있다.
이상의 결과로부터 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 CD3 및 TLR2에 결합하고 CD3와 TLR2에 동시에는 결합하지 않는 것이 나타내어졌다. 즉 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L, EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L은 듀얼 바인딩 Fab를 갖는 분자로, 이러한 분자를 창제하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
〔실시예 5〕CD3 및 제2 항원에 결합하는 항체의 제작을 위한 항체 개변
(5-1) 제2 항원에 결합할 수 있는 펩티드의 삽입 개소와 길이의 검토
한쪽의 가변영역(Fab)에서 암항원에 결합하고 다른 한쪽의 가변영역에서 제1 항원인 CD3에 결합, 또한 제2 항원에 결합하며 CD3 및 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 듀얼 바인딩 Fab 분자의 취득을 검토하였다. 한쪽의 Fab를 EGFR 결합 도메인으로 하고, 다른 한쪽의 Fab를 CD3 결합 도메인으로 하는 헤테로 이량화 항체로서, CD3ε에 결합하는 항체인 CE115의 중쇄의 루프부분에 GGS 펩티드를 삽입한 헤테로 이량화 항체를 참고 실시예 1에 따라 제작하였다.
즉, CDR2 중의 K52B와 S52c 사이에 GGS를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE31 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：((서열번호：20/21/43/23), GGSGGS 펩티드(서열번호：90)를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE32 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L((서열번호：20/21/44/23), GGSGGSGGS 펩티드(서열번호：91)를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE33 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：((서열번호：20/21/45/23)을 제작하였다. 이와 같이 프레임워크 3 중의 루프 형상의 개소인 D72와 D73 사이에 GGS를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE34 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：((서열번호：20/21/46/23), GGSGGS 펩티드(서열번호：90)를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE35 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L((서열번호：20/21/47/23), GGSGGSGGS 펩티드(서열번호：91)를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE36 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：((서열번호：20/21/48/23)을 제작하였다. 또한 CDR3 중의 A99와 Y100 사이에 GGS를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE37 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：((서열번호：20/21/49/23), GGSGGS 펩티드를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE38 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L((서열번호：20/21/50/23), GGSGGSGGS 펩티드를 삽입한 EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE39 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：((서열번호：20/21/51/23)을 제작하였다.
(5-2) GGS 펩티드를 삽입한 CE115 항체의 CD3ε으로의 결합 확인
제작한 각종 항체가 CD3ε으로의 결합성을 유지하고 있는지 여부를 Biacore T100으로 확인하였다. CM5 칩에 스트렙트아비딘을 매개로 비오틴화 CD3ε에피토프펩티드를 결합시켜 제작한 항체를 애널라이트로서 주입하고 결합 친화성을 해석하였다.
그 결과를 표 2에 나타낸다. CE35, CE36, CE37, CE38, CE39의 CD3ε으로의 결합 친화성은 모체 항체인 CE115와 동등하였다. 이것으로부터, 이들 루프 중에는 제2 항원에 결합하는 펩티드의 삽입이 가능한 것이 나타내어졌다. 또한 GGSGGSGGS를 삽입한 CE36이나 CE39에서도 결합 친화성이 저하되지 않은 것으로부터 이들 개소에서는 적어도 9 아미노산까지의 펩티드 삽입은 CD3ε으로의 결합성에 영향을 미치지 않는 것이 나타내어졌다.
Figure 112016054179704-pct00002
즉, 이러한 펩티드 삽입 CE115를 사용하여 제2 항원에 대해 결합하는 항체를 취득함으로써 CD3와 제2 항원에 결합할 수 있으나 동시에는 결합하지 않는 항체를 제작할 수 있는 것이 나타내어졌다.
여기서 삽입 또는 치환되는 펩티드의 아미노산 서열을 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1985) 82, 488-492))이나 중복 연장 PCR(Overlap extension PCR) 등의 공지의 방법에 따라 랜덤으로 개변하고 전술한 방법에 따라 각 개변체의 결합 활성 등을 비교하여, 아미노산 서열을 개변해도 목적의 활성을 나타내는 것이 가능한 삽입, 치환 개소나 그 아미노산의 종류, 길이를 결정함으로써 라이브러리를 제작할 수 있다.
〔실시예 6〕CD3 및 제2 항원에 결합하는 항체의 취득을 위한 라이브러리 디자인
(6-1) CD3 및 제2 항원에 결합하는 항체의 취득을 위한 항체 라이브러리에 대해서(듀얼 Fab 라이브러리라고도 부름)
제1 항원으로서 CD3(CD3ε)를 선택하여 CD3(CD3ε)와 임의의 제2 항원에 결합하는 항체를 취득하는 방법으로서 아래의 6가지가 예시된다.
1. 제1 항원에 결합하는 Fab 도메인에 제2 항원에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 삽입하는 방법(실시예 3과 4에서 나타난 펩티드 삽입 이외에도 Angew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5;52(32):8295-8에 예시되는 바와 같이 G-CSF를 삽입하는 방법이 있다.) 결합하는 펩티드나 폴리펩티드는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제시한 라이브러리로부터 취득 가능하나, 또한 천연으로 존재하는 단백질의 전체 또는 그의 일부를 이용하는 것이 가능하다.
2. 실시예 5에서 나타난 바와 같이 Fab 중의 루프를 길게 개변(연장)할 수 있는 위치에 여러 아미노산이 출현하는 항체 라이브러리를 제작하여 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 Fab를 항체 라이브러리로부터 항원으로의 결합 활성을 지표로 취득하는 방법
3. 사전에 CD3에 대해 결합하는 것이 알려져 있는 Fab 도메인으로부터 부위 특이적 변이법으로 제작한 항체를 사용하여 CD3와의 결합 활성을 유지하는 아미노산을 동정하고, 동정된 아미노산이 출현하는 항체 라이브러리로부터 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 Fab를 항체 라이브러리로부터 항원으로의 결합 활성을 지표로 취득하는 방법
4. 3의 방법에 있어서 추가로 Fab 중의 루프를 길게 개변(연장)할 수 있는 위치에 여러 아미노산이 출현하는 항체 라이브러리를 제작하여 임의의 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖는 Fab를 항체 라이브러리로부터 항원으로의 결합 활성을 지표로 취득하는 방법
5. 1, 2, 3, 4의 방법에 있어서 당쇄 부가 서열(예를 들면 NxS, NxT, x는 P 이외의 아미노산)이 출현하도록 개변하여 당쇄 수용체가 인식하는 당쇄를 부가시키는 방법(예를 들면 하이만노오스형 당쇄를 부가하여 하이만노오스 수용체가 인식한다. 하이만노오스형 당쇄는 항체 발현 시에 키푸넨신을 첨가함으로써 얻어지는 것이 알려져 있다(MAbs. 2012 Jul-Aug;4(4):475-87))
6. 1, 2, 3, 4의 방법에 있어서 루프 부위나 각종 아미노산으로 개변하는 것이 가능했던 부위에 Cys, Lys 또는 비천연 아미노산을 삽입 또는 치환하여, 제2 항원에 결합하는 도메인(폴리펩티드나 당쇄, TLR 아고니스트로 대표되는 핵산)을 공유결합으로 부가하는 방법(Antibody drug conjugate로 대표되는 방법으로, Cys, Lys 또는 비천연 아미노산으로 공유결합으로 결합시키는 방법, mAbs 6:1, 34-45; January/February 2014, WO2009/134891A2, Bioconjug Chem. 2014 Feb 19;25(2) :351-61에 기재되어 있음)
상기의 방법을 사용하여 제1 항원과 제2 항원에 결합하고 서로 동시에 결합하지 않는 듀얼 바인딩 Fab가 얻어지고, 임의의 제3 항원과 결합하는 도메인(다른 한쪽의 가변영역이라고 부르며, 실시예 1에 기재되어 있음)과는 당업자 공지의 방법, 예를 들면 공통 L쇄, Cross mab, Fab arm exchange법으로 조합할 수 있다.
(6-2) 부위 특이적 변이법을 사용한 CD3(CD3ε) 결합 항체의 1 아미노산 개변 항체의 제작
CD3(CD3ε) 결합 항체의 주형 서열로서 VH영역은 CE115HA000(서열번호：52), VL영역은 GLS3000(서열번호：53)이 선정되었다. 각각, 항원 결합에 관여한다고 생각되는 부위에 참고 실시예 1에 따라 아미노산 개변을 행하였다. 또한 H쇄의 불변영역은 pE22Hh(천연 IgG1의 CH1 이후의 서열에 L234A, L235A, N297A, D356C, T366S, L368A, Y407V의 개변을 가하여 C말단의 GK 서열을 결실시켜 DYKDDDDK 서열(서열번호：89)을 부가한 서열, 서열번호：54)로 하고 L쇄 불변영역은 Kappa쇄(서열번호：55)를 사용하였다. 개변을 행한 부위는 표 3에 나타내어져 있다. CD3(CD3ε) 결합 활성 평가를 위해 1 아미노산 개변 항체는 One arm 항체(천연형의 IgG 중 한쪽의 Fab 도메인을 결손하고 있는 항체)로서 취득하였다. 구체적으로는 H쇄 개변의 경우는 개변된 H쇄가 불변영역 pE22Hh와 연결된 것과 Kn010G3(천연형 IgG1의 216번째 이후의 아미노산 서열에 C220S, Y349C, T366W, H435R의 개변을 가한 것, 서열번호：56)와 kappa쇄가 3'측에 연결된 GLS3000을 사용하고, L쇄 개변의 경우는 개변된 L쇄의 3'측에 Kappa쇄가 연결된 서열과 H쇄로서 3'측에 pE22Hh가 연결된 CE115HA000과 Kn010G3를 사용하여 FreeStyle293세포에서 발현·정제하였다(참고 실시예 1의 방법을 사용하였다).
Figure 112016054179704-pct00003
(6-3) 1 아미노산 개변 항체의 CD3 결합 평가
(6-2)에서 구축 및 발현 정제된 1 아미노산 개변체는 Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 평가되었다. Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 CD3ε 호모 이량체 단백질을 적당량 고정화한 다음, 애널라이트로서 적절한 농도의 항체를 주입하여 센서칩 상의 CD3ε 호모 이량체 단백질과 상호작용시켰다. 그 다음, 10 mmol/L Glycine-HCl(pH 1.5)을 주입하여 센서칩을 재생하였다. 측정은 25℃에서 행하고, 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하였다. 측정한 결과를, 결합량과 측정에서 얻어진 센서그램에 대해 single-cycle kinetics model(1:1 binding RI=0)을 사용하여 해리상수 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하였다.
(6-3-1) H쇄의 개변
개변 전의 항체인 CE115HA000에 대해 각종 H쇄 개변체의 결합량의 비의 결과를 표 4에 나타낸다. 즉, CE115HA000을 포함하는 항체의 결합량을 X, H쇄 1 아미노산 개변체의 결합량을 Y로 했을 때의 Z(결합량의 비)=Y/X의 값이다. 이때, 도 18에 나타내는 바와 같이 Z가 0.8 미만인 경우에는 센서그램으로부터 결합량이 매우 적은 것이 확인되어, 정확하게 해리상수 KD(M)를 산출하지 못할 가능성이 시사되었다. 다음으로, CE115HA000에 대해 각종 H쇄 개변체의 해리상수 KD(M)의 비(=CE115HA000의 KD값/개변체의 KD값)를 표 5에 나타낸다.
표 4에 나타난 Z가 0.8 이상인 경우에는 개변 전의 항체인 CE115HA000에 대해 결합을 유지하고 있다고 생각되는 것으로부터, 이들 아미노산이 출현하도록 디자인된 항체 라이브러리가 듀얼 Fab 라이브러리가 될 수 있다.
Figure 112016054179704-pct00004
Figure 112016054179704-pct00005
(6-3-2) L쇄의 개변
개변 전의 항체인 GLS3000에 대해 각종 L쇄 개변체의 결합량의 비의 결과를 표 6에 나타낸다. 즉, GLS3000을 포함하는 항체의 결합량을 X, L쇄 1 아미노산 개변체의 결합량을 Y로 했을 때의 Z(결합량의 비)=Y/X의 값이다. 이때, 도 18에 나타내는 바와 같이 Z가 0.8 미만인 경우에는 센서그램으로부터 결합량이 매우 적은 것이 확인되어, 정확하게 해리상수 KD(M)를 산출하지 못할 가능성이 시사되었다. 다음으로, GLS3000에 대해 각종 L쇄 개변체의 해리상수 KD(M)의 비를 표 7에 나타낸다.
표 6에 나타난 Z가 0.8 이상인 경우에는 개변 전의 항체인 GLS3000에 대해 결합을 유지하고 있다고 생각되는 것으로부터, 이들 아미노산이 출현하도록 디자인된 항체 라이브러리가 듀얼 Fab 라이브러리가 될 수 있다.
Figure 112016054179704-pct00006
Figure 112016054179704-pct00007
(6-4) 1 아미노산 개변 항체의 ECM(Extracellular matrix；세포 외 매트릭스) 결합 평가
ECM(Extracellular matrix；세포 외 매트릭스)은 세포 외의 구성성분 중 하나로, 생체 내의 여러 부위에 존재하고 있다. 그렇기 때문에 ECM에 강하게 결합하는 항체는 혈중동태가 악화되는(반감기가 짧아짐) 것이 알려져 있다(WO2012093704A1). 이에, 항체 라이브러리에서 출현하는 아미노산에 대해서도 ECM 결합이 증강되지 않는 아미노산을 선택하는 것이 바람직하다.
각 H쇄 또는 L쇄 개변체는 (6-2)에 나타난 방법으로 항체가 취득되었다. 다음으로 참고 실시예 2의 방법에 따라 ECM 결합이 평가되었다. 각 개변체의 ECM 결합값(ECL response；ECL 반응값)을 동일 플레이트 내 또는 동일 실시일의 MRA(H쇄 서열번호：57, L쇄 서열번호：58)의 항체 ECM 결합값으로 나눈 값을 표 8(H쇄), 표 9(L쇄)에 나타낸다. 표 8 및 9에 나타난 바와 같이 몇 개의 개변에서는 ECM 결합을 증강시키는 경향이 확인되었다.
표 8(H쇄), 표 9(L쇄)에 나타난 값 중, 복수 개변에 의한 ECM 결합 증강의 효과를 고려하여 10배까지를 유효값으로 듀얼 Fab 라이브러리에 채용하였다.
Figure 112016054179704-pct00008
Figure 112016054179704-pct00009
(6-5) 라이브러리의 다양성 증강을 위한 펩티드의 삽입 개소와 길이의 검토
실시예 5에서 각 개소에서 GGS 서열을 사용하여 CD3(CD3ε)로의 결합을 상실하지 않고 펩티드를 삽입할 수 있는 것이 나타내어졌다. 듀얼 Fab 라이브러리에서도 루프 연장이 가능해지면 보다 다종류의 분자가 포함되는(다양성이 크다고도 표현하는) 라이브러리가 되어 다양한 제2 항원에 결합하는 Fab 도메인의 취득이 가능해진다고 생각되었다. 이에, 펩티드 삽입에 수반하여 결합 활성이 저하되는 것이 예상되었기 때문에 CE115HA000 서열에 CD3ε으로의 결합 활성이 높아지도록 V11L/D72A/L78I/D101Q 개변을 가하여 pE22Hh를 연결한 서열에 실시예 5와 동일하게 GGS 링커를 삽입한 분자를 제작하여 CD3 결합을 평가하였다. GGS 서열은 Kabat 넘버링 99-100 사이에 삽입되었다. 항체 분자는 One arm 항체로서 발현되었다. 구체적으로는 GGS 링커를 포함하는 전술한 H쇄와 Kn010G3(서열번호：56)와 L쇄로서 GLS3000(서열번호：53)과 Kappa 서열(서열번호：55)을 연결한 서열을 채용하여 참고 실시예 1에 따라 발현 정제가 행하여졌다.
(6-6) GGS 펩티드를 삽입한 CE115 항체의 CD3로의 결합 확인
GGS 펩티드를 삽입한 개변 항체의 CD3ε으로의 결합은 실시예 6에 기재된 방법으로 비아코어를 사용하여 실시되었다. 그 결과 표 10에 나타내는 바와 같이 루프 부위로의 GGS 링커의 삽입이 가능한 것이 명확해졌다. 특히 항원 결합에 중요한 H쇄 CDR3영역에 GGS 링커를 삽입하는 것이 가능하여 3, 6, 9 아미노산 중 어느 삽입으로도 CD3ε으로의 결합이 유지되었다. 본 검토에서는 GGS 링커를 사용하여 검토했으나, GGS가 아닌 각종 아미노산이 출현하는 항체 라이브러리여도 된다고 생각된다.
Figure 112016054179704-pct00010
(6-7) NNS 염기를 사용한 H쇄 CDR3로의 라이브러리 삽입의 검토
(6-6)에서는 GGS 링커를 사용해서 3, 6, 9 아미노산의 삽입이 가능하여 3, 6, 9 아미노산을 삽입한 라이브러리를 제작하여 통상의 파지 디스플레이법으로 대표되는 항체 취득법을 사용하면 제2 항원에 결합하는 항체를 취득하는 것이 가능하다고 생각되었다. 이에, CDR3로의 삽입이 6 아미노산인 경우에 NNS 염기(각종 아미노산이 출현함)를 사용하여 6 아미노산을 삽입하는 부위에 여러 아미노산이 출현해도 CD3와의 결합을 유지하는지 검토하였다. 결합 활성의 저하가 예상된 것으로부터 CE115HA000 보다도 CD3ε 결합 활성이 높은 CE115HA340 서열(서열번호：59)의 CDR3 중의 99-100(Kabat numbering) 사이에 6 아미노산이 삽입되도록 NNS 염기를 사용하여 프라이머가 설계되었다. 항체 분자는 One arm 항체로서 발현되었다. 구체적으로는 전술한 개변을 포함하는 전술한 H쇄와 Kn010G3(서열번호：56)와 L쇄로서 GLS3000(서열번호：53)과 Kappa 서열(서열번호：55)을 연결한 서열을 채용하여 참고 실시예 1에 따라 발현 정제가 행하여졌다. 취득된 개변 항체는 (6-3)에 기재된 방법으로 결합이 평가되었다. 그 결과를 표 11에 나타낸다. 아미노산을 연장한 부위에 각종 아미노산이 출현한 경우에도 CD3(CD3ε)로의 결합성이 유지되는 것이 명확해졌다. 또한 비특이적 결합이 증강되는지 여부를 참고 실시예 2에 나타난 방법으로 평가한 결과를 표 12에 나타낸다. 그 결과 CDR3의 신장된 루프 내에 양전하를 측쇄에 갖는 아미노산이 많이 포함되면 ECM으로의 결합이 증강되는 것으로부터, 루프 내에 3개 이상의 양전하를 측쇄에 갖는 아미노산이 출현하지 않는 것이 요망되었다.
Figure 112016054179704-pct00011
Figure 112016054179704-pct00012
(6-7) 듀얼 Fab 라이브러리의 디자인 및 구축
실시예 6에 기재된 검토로부터 CD3와 제2 항원에 결합하는 항체 취득을 위한 항체 라이브러리(듀얼 Fab 라이브러리)는 아래와 같이 디자인되었다.
스텝 1：CD3(CD3ε) 결합능이 유지되어 있는 아미노산(CD3 결합량이 CE115HA000의 80% 이상인 것)을 선택
스텝 2：ECM 결합이 개변 전 보다도 MRA와 비교하여 10배 이내인 아미노산을 선택
스텝 3：H쇄 CDR3의 99-100(Kabat numbering) 사이에 6 아미노산을 삽입함
또한 스텝 1만으로도 Fab의 항원 결합 부위가 다양화되기 때문에 제2 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 동정하는 라이브러리가 될 수 있다. 또한 스텝 1과 3만으로도 Fab의 항원 결합 부위가 다양화되기 때문에 제2 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 동정하는 라이브러리가 될 수 있다. 스텝 2를 거치지 않는 라이브러리 설계라도 취득된 분자에 대해 ECM 결합을 측정하여 평가할 수 있다.
이상으로부터 듀얼 Fab 라이브러리의 H쇄는 CE115HA000의 FR(프레임워크)에 V11L/L78I 변이를 가한 서열에 CDR로서 표 13에 나타나는 바와 같이 다양화되고, L쇄는 GLS3000의 CDR을 표 14에 나타내는 바와 같이 다양화하였다. 이들 항체 라이브러리 단편은 당업자 공지의 DNA 합성방법으로 당해 라이브러리 단편을 합성할 수 있다. 듀얼 Fab 라이브러리로서 (1) H쇄를 표 13에 나타낸 바와 같이 다양화되고, L쇄는 원래의 서열 GLS3000 또는 실시예 6에 기재되어 있는 CD3ε 결합을 증강시킨 L쇄에 고정한 라이브러리, (2) H쇄를 원래의 서열(CE115HA000) 또는 실시예 6에 기재되어 있는 CD3ε 결합을 증강시킨 H쇄에 고정하고, L쇄를 표 14에 나타낸 바와 같이 다양화한 라이브러리, (3) H쇄를 표 13에 나타낸 바와 같이 다양화되고, L쇄를 표 14에 나타낸 바와 같이 다양화한 라이브러리를 만들 수 있다. H쇄는 CE115HA000의 FR(프레임워크)에 V11L/L78I 변이를 가한 서열에 CDR로서 표 13에 나타나는 바와 같이 다양화한 라이브러리 서열을 DNA 2.0의 DNA 합성회사에 위탁하여 항체 라이브러리 단편(DNA 단편)을 취득하였다. 취득한 항체 라이브러리 단편은 PCR법으로 증폭되어 파지 디스플레이용 파지미드에 삽입되었다. 이때, L쇄로서는 GLS3000을 선택하였다. 또한 구축된 파지 디스플레이용 파지미드는 대장균에 전기천공법으로 도입되어 항체 라이브러리 단편을 보유하는 대장균이 제작되었다.
Figure 112016054179704-pct00013
Figure 112016054179704-pct00014
〔실시예 7〕듀얼 Fab 라이브러리로부터의 CD3 및 제2 항원(IL6R)에 결합하는 Fab 도메인의 취득
(7-1) 인간 IL6R에 결합하는 Fab 도메인의 취득
실시예 6에서 설계 및 구축된 듀얼 Fab 라이브러리로부터 인간 IL6R에 대해 결합하는 Fab 도메인(항체 단편)을 동정하였다. 항원으로서 비오틴 표지된 인간 IL6R을 사용하여 인간 IL6R에 대해 결합능을 갖는 항체 단편의 농축을 행하였다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행하여졌다. 파지 생산이 행하여진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로, 파지 라이브러리액에 최종 농도 4% BSA가 되도록 BSA가 첨가되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2) , 61-9). 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(NeutrAvidin coated beads)(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Streptavidin coated beads)(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.
구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBST(0.1% Tween20을 함유하는 TBS, TBS는 TaKaRa사 제조)로 3회 세정된 다음, 1 mL의 TBS로 추가로 2회 세정되었다. 그 다음, 0.5 mL의 1 ㎎/mL 트립신이 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 다음, 즉각 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.5)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜ × 225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로, 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다. 이 사이클을 패닝이라고 부르고, 복수회 반복하였다. 또한 2번째 이후의 패닝에서는 40 pmol의 비오틴 표지 항원이 사용되었다. 또한 4회째 패닝에서는 CD3로의 결합성을 지표로 파지의 농축이 행하여졌다. 구체적으로는 조제한 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 CD3ε 펩티드 항원(아미노산 서열 서열번호：60)을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 0.1% Tween20 함유 TBS와 TBS로 세정되었다. 0.5 mL의 1 ㎎/mL 트립신이 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 다음, 즉각 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지용액이 회수되었다. 트립신 처리된 파지용액으로부터 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜ × 225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로, 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다.
또한 하나의 대장균에 대해 복수의 파지가 감염되는 것을 방지하기 위해, 5회째의 패닝으로 회수된 파지를 감염시킨 대장균으로부터 조제한 파지 라이브러리액에 대해서 재차 100,000배 희석한 파지액을 대장균에 감염시켜 싱글 콜로니를 얻었다.
(7-2) 파지가 제시한 Fab 도메인과 CD3 또는 IL6R의 결합(파지 ELISA법)
상기의 방법으로 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)으로 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 최종 농도 4% BSA가 되도록 BSA가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원(비오틴화 CD3ε 펩티드 또는 비오틴화 인간 IL6R)을 포함하는 100 μL의 PBS로 4℃에서 하룻밤 또는 실온에서 1시간 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 다음, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 4% BSA-TBS로 블로킹되었다. 4% BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 각 웰을 TBST로 세정 후, 최종 농도 4%의 BSA로 한 TBS로 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 1시간 인큐베이트하였다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 다음, 450 ㎚의 흡광도로 당해 발색이 측정되었다. 그 결과를 도 19에 나타낸다. #50 및 #62 클론은 CD3ε 및 인간 IL6R에 대해 결합성을 갖는 것이 나타내어졌다. 즉, 듀얼 Fab 라이브러리를 사용함으로써 제2 항원(실시예 7에서는 인간 IL6R)에 대해 결합성을 나타내는 클론을 선택할 수 있었다. 또한 평가 수를 늘려서 결합성을 나타내는 클론을 선정하고 IgG화(클론이 갖는 VH 및 VL 서열을 인간 H쇄 또는 L쇄 불변영역과 각각 연결)하여 CD3ε과 제2 항원(인간 IL6R)으로의 결합성을 평가할 수 있다. 또한 CD3ε과 제2 항원(인간 IL6R)이 동시에 결합하는지 여부를 실시예 3이나 4에 기재된 방법이나 경합법으로 조사할 수 있다. 경합법은 예를 들면 CD3ε으로의 결합이 항체 단독일 때 보다도 제2 항원이 존재하는 경우에 저감됨으로써 동시에 결합하지 않는 것이 나타난다.
〔실시예 8〕듀얼 Fab 라이브러리로부터의 CD3 및 제2 항원(인간 IgA)에 결합하는 Fab 도메인의 취득
(8-1) 인간 IgA에 결합하는 Fab 도메인의 취득
IgA는 체내에 풍부하게 존재하는 항체의 아이소타입으로, 장이나 점막면에서의 생체방어에 관여하는 분자로서 알려져 있으며, FcαR(Fc alpha Receptor)에 결합하는 것이 알려져 있다(J. Pathol. 208: 270 -282, 2006).
실시예 6에서 설계 및 구축된 Dual Fab 라이브러리로부터 인간 IgA에 대해 결합하는 Fab 도메인(항체 단편)을 동정하였다. 항원으로서 비오틴 표지된 인간 IgA(참고 실시예 3에 기재되어 있다.)를 사용하여 인간 IgA에 대해 결합능을 갖는 항체 단편의 농축을 행하였다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행하여졌다. 파지 생산이 행하여진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로, 파지 라이브러리액에 최종 농도 4% BSA가 되도록 BSA가 첨가되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2) , 61-9). 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.
구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBST(0.1% Tween20을 함유하는 TBS, TBS는 TaKaRa사 제조)로 3회 세정된 다음, 1 mL의 TBS로 추가로 2회 세정되었다. 그 다음, 0.5 mL의 1 ㎎/mL 트립신이 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 다음, 즉각 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.5)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜ × 225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로, 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다. 이 사이클을 패닝이라고 부르고, 4회 반복하였다. 또한 2번째 이후의 패닝에서는 인간 IgA는 40 pmol로 하였다.
(8-2) 파지가 제시한 Fab 도메인과 CD3 또는 인간 IgA의 결합
상기의 방법으로 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)으로 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 최종 농도 4% BSA가 되도록 BSA가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원(비오틴 표지 CD3ε 펩티드 또는 비오틴 표지 인간 IgA, 참고 실시예 3)을 포함하는 100 μL의 PBS로 4℃에서 하룻밤 또는 실온에서 1시간 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 다음, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 0.1×TBS/150 mM NaCl/0.02% 탈지분유로 블로킹되었다. 0.1×TBS/150 mM NaCl/0.02% 탈지분유가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지가 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 각 웰을 0.1×TBS/150 mM NaCl/0.01% Tween20으로 세정 후, 0.1×TBS/150 mM NaCl/0.01% Tween20으로 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 1시간 인큐베이트하였다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가로 정지된 다음, 450 ㎚의 흡광도로 당해 발색이 측정되었다. 그 결과를 도 20에 나타낸다. 도 20에 나타내는 바와 같이 CD3 및 인간 IgA에 결합하는 클론이 존재하는 것이 나타나, 듀얼 Fab 라이브러리를 사용함으로써 제2 항원(실시예 8에서는 인간 IgA)에 대해 결합성을 나타내는 클론을 선택할 수 있었다.
(8-3) 취득한 Fab 도메인을 갖는 IgG의 CD3 또는 인간 IgA의 결합
(8-2)에서 CD3와 인간 IgA에 결합하는 것이 나타난 클론에 대해 그의 서열을 갖는 대장균으로부터 듀얼 Fab 라이브러리의 H쇄에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 PCR법으로 VH 단편을 증폭하였다. 증폭한 VH 단편은 참고 실시예 1의 방법으로 pE22Hh가 삽입된 동물세포 발현용 플라스미드에 삽입되어 실시예 6(6-2)과 동일하게 One arm 항체로서 발현·정제되었다. 클론명과 H쇄 서열의 서열번호는 표 15에 나타내어져 있다. 즉, 표 15에 나타난 H쇄와 Kn010G3(서열번호：56)와 L쇄로서 GLS3000(서열번호：53)과 Kappa 서열(서열번호：55)을 연결한 서열을 채용하여 참고 실시예 1에 따라 발현 정제가 행하여졌다.
Figure 112016054179704-pct00015
취득된 Fab영역을 갖는 항체 분자가 CD3ε, 인간 IgA와 결합하는지 여부를 전기화학발광법(ECL법)으로 판정하였다. 구체적으로는 TBST 용액(TaKaRa사 제조 TBS에 0.1% Tween20을 첨가한 것)으로 희석한 비오틴 표지 CD3ε 펩티드(실시예 7에 기재) 또는 비오틴 표지 인간 IgA(참고 실시예 3)와, 2 ㎍/mL로 조제된 항체 용액과, sulfo-tag를 부가한 항인간 IgG 항체(Invitrogen #628400)를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 25 μL씩 첨가하여 혼합한 다음, 차광하면서 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA를 포함하는 TBST 용액(블로킹 용액으로 표기함)을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, TBS(-) 용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 50 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이트하여 비오틴화 항원―항체―검출용 sulfo-tag 항체의 복합체 용액을 비오틴화 항원을 매개로 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBST 용액으로 3회 세정하고 4xREAD 버퍼(MSD)를 물로 2배 희석한 용액을 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 21에 나타낸다. 파지 ELISA로 결합이 확인된 클론으로부터 일부 아미노산 변이를 포함하는 것을 포함하여 IgG화한 결과, 파지 ELISA로 결합이 확인된 서열은 IgG가 되어도 CD3ε 및 인간 IgA와 결합하는 것이 나타내어졌다.
이 결과로부터, 듀얼 Fab 라이브러리로부터 제2 항원과 결합하는 항체가 취득 가능하며, 통상 파지 라이브러리를 사용한 패닝에서는 Fab 도메인뿐이나 Fc영역을 포함하는 IgG가 되어도 결합이 확인되는 클론의 농축이 가능한 것이 나타내어졌다. 따라서, 듀얼 Fab 라이브러리는 CD3와의 결합능을 유지하면서 제2 항원과의 결합능을 갖는 Fab 도메인을 취득할 수 있는 라이브러리라고 할 수 있었다.
(8-4) 취득한 Fab 도메인을 갖는 IgG의 CD3(CD3ε) 및 인간 IgA와의 동시 결합의 평가
(8-3)에서 듀얼 Fab 라이브러리로부터 얻어진 클론이 IgG가 되어도 결합을 갖는 것이 나타내어졌다. 다음으로, 얻어진 IgG가 CD3(CD3ε) 및 인간 IgA와 동시에 결합하는지를 경합법(전기화학발광법(ECL법))으로 판정하였다. CD3(CD3ε) 및 인간 IgA와 동시에 결합하는 경우는 IgA와 결합되어 있는 항체에 CD3(CD3ε)을 첨가하여도 ECL 시그널은 변화하지 않으나, 동시 결합할 수 없는 경우에는 CD3(CD3ε)를 첨가하면 일부의 항체가 CD3(CD3ε)와 결합하여 ECL 시그널이 저하될 것이다.
구체적으로는 TBST 용액으로 희석한 비오틴화 인간 IgA 25 μL와, 1 ㎍/mL로 조제된 항체 용액 12.5 μL와, TBST 또는 경합시키기 위한 CD3ε 호모 이량체 단백질(9.4 pmol/μL) 12.5 μL와, sulfo-tag를 부가한 항인간 IgG 항체(Invitrogen #628400) 25 μL를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 첨가하여 혼합한 다음, 차광하면서 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA를 포함하는 TBST 용액(블로킹 용액으로 표기함. TBST 용액은 TaKaRa사 제조의 TBS에 0.1% Tween20을 첨가한 것)을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, TBST 용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 50 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이트하여 비오틴화 항원―항체―검출용 sulfo-tag 항체의 복합체 용액을 비오틴화 항원을 매개로 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBST 용액으로 3회 세정하고 4xREAD 버퍼(MSD)를 물로 2배로 희석한 용액을 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 22에 나타낸다. 경합시키기 위한 CD3ε 호모 이량체 단백질을 첨가한 경우, TBST를 첨가한 경우와 비교하여 ECL 시그널의 저하가 확인되었다. 이 결과로부터, 본 검토에서 발견된 CD3와 인간 IgA에 결합하는 분자는 CD3에 결합하면 인간 IgA에 결합할 수 없는 듀얼 Fab 분자인 것이 나타내어졌다. 이 결과로부터, 듀얼 Fab 라이브러리로부터 제2 항원과의 결합능을 갖는 항체가 취득 가능하며, 그 중에 CD3와 결합하면 제2 항원과 결합할 수 없다(또는 제2 항원과 결합하면 CD3와 결합할 수 없다)고 하는 복수종의 항원과 동시에는 결합할 수 없는 듀얼 Fab 분자의 취득이 가능한 것이 나타내어졌다.
당업자라면 (8-2)에서 파지를 사용한 결합 활성 평가로부터 결합 분자가 발견된다면, 평가 수를 많게 함으로써 결합 분자의 서열의 다양성을 늘릴 수 있는 것이 자명하기 때문에, 이상으로부터 듀얼 Fab 라이브러리는 CD3에 대한 결합능을 유지하면서 제2 항원과의 결합능을 갖는 Fab 도메인을 취득할 수 있는 라이브러리라고 할 수 있다. 또한 본 실시예에서는 H쇄만을 다양화시킨 듀얼 Fab 라이브러리를 사용하였으나, 통상 라이브러리 사이즈(다양성이라고도 부르며, 라이브러리 중에 다양한 서열이 포함되는 것을 의미함)가 큰 쪽이 보다 더 항원 결합 분자를 취득할 수 있기 때문에, L쇄도 다양화시킨 듀얼 Fab 라이브러리도 본 실시예에서 나타난 것과 마찬가지로 듀얼 Fab 분자 취득에 사용할 수 있다.
실시예 8에 나타난 바와 같이 듀얼 Fab 분자를 만들 수 있다면 제3 항원에 결합하는 Fab나 항원 결합 도메인을 당업자 공지의 방법, 예를 들면 하이브리도마법이나 항체 라이브러리로부터의 결합 항체(또는 결합 도메인)의 선발방법을 사용하여 동정하는 것이 가능하며, 동정된 제3 항원에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들면 Fab)과 듀얼 Fab 분자의 Fab 도메인을 갖는 항체는 당업자 공지의 다중특이성 항체의 제작방법, 예를 들면 L쇄를 공통화하여 2개의 H쇄가 상이한 항체를 만드는 방법(Fc영역의 각 도메인의 계면을 제어하는 기술), Cross Mab법, Fab Arm Exchange법으로 다중특이성 항체를 취득할 수 있다. 즉, 듀얼 Fab 분자를 동정할 수 있으면, 당업자 공지의 방법으로 제3 항원에 결합하는 Fab와 실시예 8에서 나타난 제1과 제2 항원에 결합하는 듀얼 Fab를 조합하여 목적하는 다중특이성 항체를 취득할 수 있다.
(8-5) CD3/인간 IgA 듀얼 Fab 분자에 대해서
실시예 8에서 CD3ε 및 인간 IgA에 결합하여 CD3ε과 인간 IgA가 동시에 결합하지 않는 듀얼 Fab 분자가 얻어지는 것이 나타내어졌다. 또한 제3 항원과 결합하는 항원 결합 도메인을 부가하는 것도 당업자 공지의 방법으로 실시 가능하다.
근래, 암항원의 하나인 EGFR에 결합하도록 개변된 IgA 분자가 EGFR을 발현하고 있는 암세포에 세포사를 유도하는 것이 나타났다(J Immunol 2007; 179:2936-2943). 이 메커니즘으로서 IgA의 수용체인 FcαR이 다형핵 세포(Polymorphonuclear cell)에 발현되고 있어 암세포에 자식작용(autophagy)을 유도하는 것이 보고되었다(J Immunol 2011; 187:726-732). 본 실시예에서 CD3와 IgA에 결합하는 듀얼 Fab 분자를 구축할 수 있는 것이 명확해졌으나, IgA를 매개로 FcαR과 결합하는 분자를 당업자 공지의 방법(예를 들면 ELISA나 ECL법)으로 탐색하면 FcαR을 매개로 한 항종양 효과를 기대할 수 있다. 즉, 본 듀얼 Fab는 임의의 제3 항원이 발현하고 있는 세포에 CD3ε과의 결합으로 T세포에 의한 세포상해활성과 IgA의 결합을 매개로 FcαR이 발현되고 있는 세포에 의한 세포상해활성 양쪽을 유도하는 것이 가능하여 강한 세포상해활성을 기대할 수 있다.
〔실시예 9〕듀얼 Fab 라이브러리로부터의 CD3 및 제2 항원(인간 CD154)에 결합하는 Fab 도메인의 취득
(9-1) 인간 CD154에 결합하는 Fab 도메인의 취득
실시예 6에서 설계 및 구축된 듀얼 Fab 라이브러리로부터 인간 CD154에 대해 결합하는 Fab 도메인(항체 단편)을 동정하였다. 항원으로서 비오틴 표지된 인간 CD154를 사용하여 인간 CD154에 대해 결합능을 갖는 항체 단편의 농축을 행하였다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행하여졌다. 파지 생산이 행하여진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로, 파지 라이브러리액에 최종 농도 4% BSA가 되도록 BSA가 첨가되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법이 참조 되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2) , 61-9). 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.
구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBST(0.1% Tween20을 함유하는 TBS, TBS는 TaKaRa사 제조)로 3회 세정된 다음, 1 mL의 TBS로 추가로 2회 세정되었다. 그 다음, 0.5 mL의 1 ㎎/mL 트립신이 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 다음, 즉각 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.5)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜ × 225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로, 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다. 이 사이클을 패닝이라고 부르고, 5회 반복하였다. 또한 2번째 이후의 패닝에서는 인간 CD154는 40 pmol로 하였다.
(9-2) 파지가 제시한 Fab 도메인과 CD3 또는 인간 CD154의 결합
상기의 방법으로 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)으로 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 최종 농도 4% BSA가 되도록 BSA가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원(비오틴 표지 CD3ε 펩티드, 비오틴 표지 CD154)을 포함하는 100 μL의 PBS로 4℃에서 하룻밤 또는 실온에서 1시간 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 다음, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 0.1×TBS/150 mM NaCl/0.02% 탈지분유로 블로킹되었다. 0.1×TBS/150 mM NaCl /0.02% 탈지분유가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 각 웰을 0.1×TBS/150 mM NaCl/0.01% Tween20으로 세정 후, 0.1×TBS/150 mM NaCl/0.01% Tween20으로 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하여 1시간 인큐베이트하였다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가로 정지된 다음, 450 ㎚의 흡광도로 당해 발색이 측정되었다. 그 결과를 도 23에 나타낸다. 도 23에 나타내는 바와 같이 CD3 및 CD154에 결합하는 클론이 존재하는 것이 나타나, 듀얼 Fab 라이브러리를 사용함으로써 제2 항원(실시예 9에서는 인간 CD154)에 대해 결합성을 나타내는 클론을 선택할 수 있었다. 또한 실시예 7，8，9에서 나타낸 바와 같이 상이한 3개의 항원에 대해 결합 Fab 도메인을 취득할 수 있는 것으로부터, 듀얼 Fab 라이브러리가 제2 항원과 결합하는 분자를 취득하기 위한 라이브러리로서 기능하는 것이 나타내어졌다.
(9-3) 취득한 Fab 도메인을 갖는 IgG의 CD3 또는 인간 CD154와의 결합
(9-2)에서 CD3와 인간 CD154에 결합하는 것이 나타난 클론에 대해 그의 서열을 갖는 대장균으로부터 듀얼 Fab 라이브러리의 H쇄에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 PCR로 VH 단편을 증폭하였다. 증폭한 VH 단편은 참고 실시예 1의 방법으로 pE22Hh가 삽입된 동물세포 발현용 플라스미드에 삽입되어, 실시예 6(6-2)과 같이 One arm 항체로서 발현·정제되었다. 취득된 서열명과 H쇄 서열의 서열번호는 표 16에 기재되어 있다. 구체적으로는 표 16에 기재되어 있는 H쇄와 Kn010G3(서열번호：56)와 L쇄로서 GLS3000(서열번호：53)과 Kappa 서열(서열번호：55)을 연결한 서열을 채용하여 참고 실시예 1에 따라 발현 정제가 행하여졌다.
Figure 112016054179704-pct00016
(9-2)에서 CD3와 인간 CD154에 결합하는 것이 파지 ELISA법에서 나타난 Fab영역을 갖는 항체 분자가 CD3, 인간 CD154와 결합하는지 여부를 전기화학발광법(ECL법)으로 판정하였다. 구체적으로는 TBST 용액으로 희석한 비오틴화 CD3 또는 비오틴화 인간 CD154 25 μL와, 2 ㎍/mL로 조제된 항체 용액 25 μL와, sulfo-tag를 부가한 항인간 IgG 항체(Invitrogen #628400) 25 μL를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 첨가하여 혼합한 다음, 차광하면서 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA를 포함하는 TBST 용액(블로킹 용액으로 표기함. TBST 용액은 TaKaRa사 제조의 TBS에 0.1% Tween20을 첨가한 것)을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, TBST 용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 50 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이트하여 비오틴화 항원―항체―검출용 sulfo-tag 항체의 복합체 용액을 비오틴화 항원을 매개로 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBST 용액으로 3회 세정하고 4ｘREAD 버퍼(MSD)를 물로 2배로 희석한 용액을 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 24에 나타낸다. 파지 ELISA로 결합이 확인된 클론으로부터 일부 아미노산 변이를 포함하는 것을 포함하여 IgG화한 결과, 파지 ELISA로 결합이 확인된 서열은 IgG가 되어도 CD3ε 및 인간 CD154와 결합하는 것이 나타내어졌다.
이 결과로부터, 듀얼 Fab 라이브러리로부터 제2 항원과 결합하는 항체가 취득 가능하며, 통상 파지 라이브러리를 사용한 패닝에서는 Fab 도메인뿐이나 Fc영역을 포함하는 IgG가 되어도 결합이 확인되는 클론의 농축이 인간 IgA뿐 아니라 인간 CD154여도 가능한 것이 나타내어졌다. 따라서, 듀얼 Fab 라이브러리는 CD3와 결합능을 유지하면서 제2 항원과의 결합능을 갖는 Fab 도메인을 취득할 수 있는 라이브러리라고 할 수 있다.
(9-4) 취득한 Fab 도메인을 갖는 IgG의 CD3ε 및 인간 CD154와의 동시 결합의 평가
(9-3)에서 듀얼 Fab 라이브러리로부터 얻어진 클론이 IgG가 되어도 결합을 갖는 것이 나타내어졌다. 다음으로, 얻어진 IgG가 CD3 및 인간 CD154와 동시에 결합하는지를 경합법(전기화학발광법(ECL법))으로 판정하였다. CD3 및 인간 CD154와 동시에 결합하는 경우는 CD154와 결합되어 있는 항체에 CD3를 첨가해도 ECL 시그널은 변화하지 않으나, 동시 결합할 수 없는 경우에는 CD3를 첨가하면 일부의 항체가 CD3와 결합하여 ECL 시그널이 저하될 것이다.
구체적으로는 TBST 용액으로 희석한 비오틴화 인간 CD154 25 μL와, 1 ㎍/mL로 조제된 항체 용액 12.5 μL와, TBST 또는 경합시키기 위한 CD3ε 호모 이량체 단백질(9.4 pmol/μL) 12.5 μL와, sulfo-tag를 부가한 항인간 IgG 항체(Invitrogen #628400) 25 μL를 Nunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well round plates(Nunc)의 각 웰에 첨가하여 혼합한 다음, 차광하면서 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하여 항체 항원 복합체를 형성시켰다. 0.5% BSA를 포함하는 TBST 용액(블로킹 용액으로 표기함. TBST 용액은 TaKaRa사 제조의 TBS에 0.1% Tween20을 첨가한 것)을 스트렙트아비딘 플레이트(MSD) 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 실온에서 1시간 이상 인큐베이트하였다. 블로킹 용액을 제거한 다음, TBST 용액 250 μL로 3회 세정하였다. 항체 항원 복합체 용액을 50 μL씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이트하여 비오틴화 항원―항체―검출용 sulfo-tag 항체의 복합체 용액을 비오틴화 항원을 매개로 스트렙트아비딘 플레이트에 결합시켰다. 항체 항원 복합체 용액을 제거한 다음, TBST 용액으로 3회 세정하고 4xREAD 버퍼(MSD)를 물로 2배로 희석한 용액을 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 25에 나타낸다. 경합시키기 위한 CD3ε 호모 이량체 단백질을 첨가한 경우, TBST를 첨가한 경우와 비교하여 ECL 시그널의 저하가 확인되었다. 이 결과로부터, 본 검토에서 발견된 CD3ε과 인간 CD154에 결합하는 분자는 CD3에 결합하면 인간 CD154에 결합할 수 없는 듀얼 Fab 분자인 것이 나타내어졌다. 이 결과로부터, 듀얼 Fab 라이브러리로부터 제2 항원과 결합하는 항체가 취득 가능하며, 그 중에 CD3와 결합하면 제2 항원과 결합할 수 없다(또는 제2 항원과 결합하면 CD3와 결합할 수 없다)고 하는 복수종의 항원과 동시에는 결합할 수 없는 듀얼 Fab 분자의 취득이 가능한 것이 나타내어졌다.
당업자라면 (9-2)에서 파지를 사용한 결합 활성 평가로부터 결합 분자가 발견된다면, 평가 수를 많게 함으로써 결합 분자의 서열의 다양성을 늘릴 수 있는 것이 자명하기 때문에, 이상으로부터 듀얼 Fab 라이브러리는 CD3와의 결합능을 유지하면서 제2 항원과의 결합능을 갖는 Fab 도메인을 취득할 수 있는 라이브러리라고 할 수 있다. 또한 본 실시예에서는 H쇄만을 다양화시킨 듀얼 Fab 라이브러리를 사용하였으나, 통상 라이브러리 사이즈(다양성이라고도 부르며, 라이브러리 중에 다양한 서열이 포함되는 것을 의미함)가 큰 쪽이 보다 더 항원 결합 분자를 취득할 수 있기 때문에, L쇄도 다양화시킨 듀얼 Fab 라이브러리도 본 실시예에서 나타난 것과 마찬가지로 듀얼 Fab 분자 취득에 사용할 수 있다.
실시예 9에 나타난 것과 같이 듀얼 Fab 분자를 만들 수 있다면 제3 항원에 결합하는 Fab나 항원 결합 도메인을 당업자 공지의 방법, 예를 들면 하이브리도마법이나 항체 라이브러리로부터의 결합 항체나 항원 결합 도메인의 선발방법을 사용하여 동정하는 것이 가능하며, 동정된 제3 항원에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들면 Fab)과 듀얼 Fab 분자의 Fab 도메인을 갖는 항체는 당업자 공지의 다중특이성 항체의 제작방법, 예를 들면 L쇄를 공통화하여 2개의 H쇄가 상이한 항체를 만드는 방법(Fc영역의 각 도메인의 계면을 제어하는 기술), Cross Mab법, Fab Arm Exchange법으로 다중특이성 항체를 취득할 수 있다. 즉, 듀얼 Fab 분자를 동정할 수 있다면, 당업자 공지의 방법으로 제3 항원에 결합하는 Fab와 실시예 9에서 나타난 제1과 제2 항원에 결합하는 듀얼 Fab를 조합하여 목적하는 다중특이성 항체를 취득할 수 있다. 이상의 실시예로부터 다종류의 항원에 대해 듀얼 Fab 라이브러리를 적응함으로써 CD3ε과 제2 항원에 결합하는 분자를 취득할 수 있는 것이 나타나고, 또한 실시예 8과 9에서 제1 항원(CD3ε) 및 제2 항원에 결합하나 제1 항원과 제2 항원이 동시에 결합하지 않는 분자를 취득할 수 있는 것이 명확해졌다. 전술한 바와 같이 제3 항원에 결합하는 Fab를 동정하는 것은 당업자 공지의 방법으로 가능한 것으로부터 듀얼 Fab 라이브러리를 사용함으로써 실시예 1에 기재한 목적하는 항체를 얻을 수 있다.
(9-5) CD3/인간 CD154 듀얼 Fab 분자에 대해서
실시예 9에서 CD3ε 및 인간 CD154에 결합하며 CD3ε과 인간 CD154가 동시에 결합하지 않는 듀얼 Fab 분자가 얻어지는 것이 나타내어졌다. 또한 제3 항원과 결합하는 항원 결합 도메인을 부가하는 것도 당업자 공지의 방법으로 실시 가능하다.
근래, CD154의 수용체인 CD40의 아고니스트 항체가 암항원 반응성 T세포를 이입하는 방법에서 항종양 활성을 증강시키는 것이 나타났다(J Immunother. 2012 Apr;35(3) :276-82.). 본 실시예에서 CD3와 CD154에 결합하는 듀얼 Fab 분자를 구축할 수 있는 것이 명확해졌으나, CD154를 매개로 CD40에 대해 아고니스트 활성을 나타내는 항체를 선정하면 CD40을 매개로 한 항종양 효과를 기대할 수 있다. 즉, 본 듀얼 Fab는 임의의 제3 항원이 발현되고 있는 세포에 CD3ε과의 결합으로 T세포에 의한 세포상해활성과 CD154와의 결합을 매개로 CD40의 아고니스트 시그널에 의한 항종양 효과의 증강을 기대할 수 있다.
〔참고 실시예〕
〔참고 실시예 1〕항체의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현과 정제
아미노산 치환의 도입은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene), PCR 또는 In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA) 등을 사용해서 당업자 공지의 방법으로 행하여 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen) 또는 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 항체의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE 헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체농도는 분광광도계를 사용하여 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 항체농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
〔참고 실시예 2〕항체의 ECM(Extracellular matrix, 세포 외 매트릭스) 결합 평가
항체의 ECM(Extracellular matrix)으로의 결합 평가는 WO2012093704A1을 참고로 아래의 순서로 실시되었다. ECM phenol red free(BD Matrigel #356237)를 TBS로 2 ㎎/mL로 희석하여 얼음 위에서 냉각한 ECL 측정용 플레이트(L15XB-3, MSD high bind)의 각 웰의 정중앙에 5 μL 적하하였다. 그 다음, 플레이트 실(plate seal)로 뚜껑을 덮어 4℃에서 하룻밤 정치하였다. ECM을 고상화한 플레이트를 실온으로 되돌려 ECL 블로킹 버퍼(PBS에 0.5% BSA 및 0.05% Tween20을 첨가한 것) 150 μL를 각 웰에 첨가하여 실온에서 정치 2시간 이상 또는 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 다음으로, PBS-T(PBS에 0.05% Tween20을 첨가한 것)를 사용하여 항체 샘플을 9 ㎍/mL로 희석하였다. 2차 항체를 ECLDB(PBS에 0.1% BSA 및 0.01% Tween20을 첨가한 것)로 2 ㎍/mL로 희석하여 ECLDB가 10 μL씩 각 웰에 분주되어 있는 둥근 바닥 플레이트에 항체 용액 20 μL, 2차 항체 용액 30 μL를 첨가하여 차광하 실온에서 1시간 교반하였다. ECL 블로킹 버퍼가 들어 있는 ECM 플레이트로부터 ECL 블로킹 버퍼를 전도 제거하고, 이 플레이트에 전술한 항체·2차 항체의 혼합용액을 50 μL씩 첨가하였다. 그 다음 차광하 실온에서 1시간 정치하였다. 샘플을 전도 제거 후, READ 버퍼(MSD)를 각 웰에 150 μL씩 첨가하여 Sector Imager 2400(MSD)으로 sulfo-tag의 발광 시그널을 검출하였다.
〔참고 실시예 3〕인간 IgA의 조제
인간 IgA로서 천연으로 존재하는 인간 IgA 서열 중 Fc 부분을 사용하였다(인간 IgA-Fc). 인간 IgA-Fc의 C말단에 비오틴을 부가하기 위해 비오틴 리가아제에 의해 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열번호：79)을 코드하는 유전자 단편을 링커를 매개로 연결시켰다. 인간 IgA-Fc와 AviTag 서열이 연결된 단백질(서열번호：80)을 코드하는 유전자 단편을 동물세포 발현용 벡터에 삽입하고, 구축된 플라스미드 벡터를 293Fectin(Invitrogen)을 사용하여 FreeStyle293세포 (Invitrogen)에 도입하였다. 이때 EBNA1(서열번호：81)을 발현하는 유전자 및 비오틴 리가아제(BirA, 서열번호：82)를 발현하는 유전자를 동시에 도입하고, 추가로 인간 IgA-Fc를 비오틴 표지할 목적으로 비오틴을 첨가하였다. 전술한 순서에 따라 유전자가 도입된 세포를 37℃, 8% CO2에서 6일간 배양하여 목적의 단백질을 배양상청 중에 분비시켰다.
목적의 인간 IgA-Fc를 포함하는 세포배양액을 0.22 ㎛ 바틀탑 필터로 여과하여 배양상청을 얻었다. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4로 평형화된 HiTrap Q HP(GE 헬스케어)에 같은 용액으로 희석된 배양상청을 사용하여 NaCl의 농도 구배로 목적의 인간 IgA-Fc를 용출시켰다. 다음으로, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 평형화된 SoftLink Avidin 칼럼(Promega)에 같은 용액로 희석된 상기 HiTrap Q HP 용출액을 사용하여 5 mM 비오틴, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 목적의 인간 IgA-Fc를 용출시켰다. 그 다음, Superdex200(GE 헬스케어)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 목적 외의 불순물인 회합체를 제거하여, 버퍼가 20 mM Histidine-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0으로 치환된 정제 인간 IgA-Fc를 얻었다.
본 발명에 의해 항원 결합 분자에 의해 생기는 활성을 증강시키는 것이 가능해짐과 동시에 부작용의 원인이 되는 것으로 생각되는 상이한 세포 상에서 발현되고 있는 항원으로의 결합으로 생성되는 당해 상이한 세포 간의 가교를 회피하는 것이 가능해져 의약품으로서 적합한 폴리펩티드가 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTIGEN BINDING MOLECULES COMPRISING MODIFIED ANTIBODY VARIABLE REGIONS <130> C1-A1309P <150> JP 2013-232803 <151> 2013-11-11 <160> 93 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 3 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 4 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 6 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 8 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 9 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 10 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 11 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 12 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Ser Leu Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Thr Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Ala Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Asn 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Glu Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Val Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Ile Gln Lys Pro Ser Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 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peptide sequence <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Gln Ser Gln Tyr Ala Asn Tyr Tyr Ala Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Gln Ser Thr Ser Tyr Ser Phe Tyr Gln 100 105 110 Gly Gly Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 140 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 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Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg 355 360 365 Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro 370 375 380 Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro 385 390 395 400 Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu 405 410 415 Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly 420 425 430 Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 435 440 445 Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp 450 455 460 Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn 465 470 475 480 Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg 485 490 495 Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 500 505 510 Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile 515 520 525 Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala 530 535 540 Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys 545 550 555 560 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Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly 115 120 125 Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala 130 135 140 Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val 145 150 155 160 Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp 165 170 175 Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr 180 185 190 Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn 195 200 205 Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile 210 215 220 Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala 225 230 235 240 Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu 245 250 255 Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile 260 265 270 Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile 275 280 285 Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly 290 295 300 Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu 305 310 315 320 Lys <210> 83 <211> 549 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 atggaacagg ggaagggcct ggctgtcctc atcctggcta tcattcttct tcaaggtact 60 ttggcccagt caatcaaagg aaaccacttg gttaaggtgt atgactatca agaagatggt 120 tcggtacttc tgacttgtga tgcagaagcc aaaaatatca catggtttaa agatgggaag 180 atgatcggct tcctaactga agataaaaaa aaatggaatc tgggaagtaa tgccaaggac 240 cctcgaggga tgtatcagtg taaaggatca cagaacaagt caaaaccact ccaagtgtat 300 tacagaatgt gtcagaactg cattgaacta aatgcagcca ccatatctgg ctttctcttt 360 gctgaaatcg tcagcatttt cgtccttgct gttggggtct acttcattgc tggacaggat 420 ggagttcgcc agtcgagagc ttcagacaag cagactctgt tgcccaatga ccagctctac 480 cagcccctca aggatcgaga agatgaccag tacagccacc ttcaaggaaa ccagttgagg 540 aggaattga 549 <210> 84 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu 1 5 10 15 Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys 20 25 30 Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp 65 70 75 80 Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro 85 90 95 Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala 100 105 110 Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val 115 120 125 Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr 145 150 155 160 Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly 165 170 175 Asn Gln Leu Arg Arg Asn 180 <210> 85 <211> 516 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 atggaacata gcacgtttct ctctggcctg gtactggcta cccttctctc gcaagtgagc 60 cccttcaaga tacctataga ggaacttgag gacagagtgt ttgtgaattg caataccagc 120 atcacatggg tagagggaac ggtgggaaca ctgctctcag acattacaag actggacctg 180 ggaaaacgca tcctggaccc acgaggaata tataggtgta atgggacaga tatatacaag 240 gacaaagaat ctaccgtgca agttcattat cgaatgtgcc agagctgtgt ggagctggat 300 ccagccaccg tggctggcat cattgtcact gatgtcattg ccactctgct ccttgctttg 360 ggagtcttct gctttgctgg acatgagact ggaaggctgt ctggggctgc cgacacacaa 420 gctctgttga ggaatgacca ggtctatcag cccctccgag atcgagatga tgctcagtac 480 agccaccttg gaggaaactg ggctcggaac aagtga 516 <210> 86 <211> 171 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys 85 90 95 Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105 110 Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120 125 Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys 165 170 <210> 87 <211> 624 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 atgcagtcgg gcactcactg gagagttctg ggcctctgcc tcttatcagt tggcgtttgg 60 gggcaagatg gtaatgaaga aatgggtggt attacacaga caccatataa agtctccatc 120 tctggaacca cagtaatatt gacatgccct cagtatcctg gatctgaaat actatggcaa 180 cacaatgata aaaacatagg cggtgatgag gatgataaaa acataggcag tgatgaggat 240 cacctgtcac tgaaggaatt ttcagaattg gagcaaagtg gttattatgt ctgctacccc 300 agaggaagca aaccagaaga tgcgaacttt tatctctacc tgagggcaag agtgtgtgag 360 aactgcatgg agatggatgt gatgtcggtg gccacaattg tcatagtgga catctgcatc 420 actgggggct tgctgctgct ggtttactac tggagcaaga atagaaaggc caaggccaag 480 cctgtgacac gaggagcggg tgctggcggc aggcaaaggg gacaaaacaa ggagaggcca 540 ccacctgttc ccaacccaga ctatgagccc atccggaaag gccagcggga cctgtattct 600 ggcctgaatc agagacgcat ctga 624 <210> 88 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 89 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 90 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 91 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 92 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 93 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (30)

  1. 제1 항원 및 그 제1 항원과는 다른 제2 항원에 결합할 수 있으나 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역, 및
    그 제1 항원 및 제2 항원과는 다른 제3 항원에 결합하는 가변영역
    을 포함하고,
    제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 하나가 CD3이고, 다른쪽 항원이 FcγR, TLR, 렉틴, IgA, 면역 체크포인트 분자, TNF 슈퍼패밀리 분자, TNFR 슈퍼패밀리 분자 또는 NK 수용체 분자이고,
    상기 항체 가변영역이 하나 이상의 아미노산의 개변을 갖고 있고, 상기 개변되는 아미노산이 루프영역, 또는 항체 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 또는 FR3영역의 아미노산이고,
    상기 하나 이상의 아미노산의 개변이 서열번호:13, 서열번호:52, 개변된 서열번호:52 또는 개변된 서열번호:13에 도입되어 있고,
    상기 개변이 제1 항원에 결합하는 가변영역의 아미노산 서열로의 제2 항원에 결합하는 아미노산 서열의 삽입이고,
    삽입되는 아미노산의 수가 1~25개이며,
    상기 개변되는 아미노산이 항체의 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 52a-52c, 72-73, 및 99-100으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산인 항원 결합 분자.
  2. 제1 항원 및 그 제1 항원과는 다른 제2 항원에 결합할 수 있으나 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않도록 중쇄 가변영역의 아미노산이 개변된 항체 가변영역을 포함하고,
    제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 하나가 CD3이고, 다른쪽 항원이 T세포 또는 다른 면역세포 표면에 발현되고 있는 비-CD3 분자이고,
    상기 항체 가변영역이 서열번호:13, 서열번호:52, 개변된 서열번호:52 또는 개변된 서열번호:13의 아미노산 서열의 H쇄 가변영역을 포함하고,
    상기 개변되는 아미노산이 항체 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 또는 FR3영역의 아미노산이고,
    상기 개변이 제1 항원에 결합하는 가변영역의 아미노산 서열로의 제2 항원에 결합하는 아미노산 서열의 삽입이고,
    상기 개변되는 아미노산이 항체의 H쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 52a-52c, 72-73, 및 99-100으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이며,
    삽입되는 아미노산의 수가 1~25개인 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역이 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역인 항원 결합 분자.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    추가로 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    Fc영역의 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역과 비교하여 저하되어 있는 Fc영역인 항원 결합 분자.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    다중특이성 항체인 항원 결합 분자.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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  15. 삭제
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제3 항원이 암조직 특이적으로 발현되고 있는 분자인 항원 결합 분자.
  17. 삭제
  18. 제1항 또는 제2항에 기재된 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 공정(i)~(iv)를 포함하고：
    (i) 제1 항원 또는 제2 항원에 결합하는 항체 가변영역의 하나 이상의 아미노산이 개변된 항원 결합 분자로서, 그 개변된 가변영역의 아미노산 중 하나 이상이 서로 다른 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자의 라이브러리를 제작하는 공정,
    (ii) 제작된 라이브러리 중에서, 제1 항원 및 제2 항원에 대해 결합 활성을 갖지만 그 제1 항원 및 제2 항원과 동시에는 결합하지 않는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
    (iii) 공정(ii)에서 선택된 항원 결합 분자의 상기 가변영역을 코드하는 핵산 및/또는 제3 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 가변영역을 코드하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 배양하여, 제1 항원과 제2 항원에 결합할 수 있으나 그 제1 항원과 제2 항원이 동시에는 결합하지 않는 항체 가변영역 및/또는 제3 항원에 결합하는 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자를 발현시키는 공정, 및
    (iv) 상기 숙주세포 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정,
    제1 항원 또는 제2 항원 중 어느 하나가 CD3이고, 다른쪽 항원이 T세포 또는 다른 면역세포 표면에 발현되고 있는 비-CD3 분자인 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    공정(ii)에서 선택하는 항원 결합 분자에 포함되는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역이 각각 다른 세포 상에서 발현되고 있는 제1 항원과 제2 항원에 동시에는 결합하지 않는 가변영역인 제조방법.
  20. 제18항에 있어서,
    제18항의 제조방법으로 제조되는 항원 결합 분자가 항체의 Fc영역을 추가로 포함하는 제조방법.
  21. 제20항에 있어서,
    Fc영역의 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG1 항체의 Fc영역과 비교하여 저하되어 있는 Fc영역인 제조방법.
  22. 제18항에 있어서,
    제조하는 항원 결합 분자가 다중특이성 항체인 제조방법.
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  30. 제18항에 있어서,
    제3 항원이 암조직 특이적으로 발현되고 있는 분자인 제조방법.
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