KR102542359B1 - 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역화된 갈색거저리 유충에서 분리된 친환경적이고 항균활성이 우수한 항균 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 식품을 부패시키고, 품질을 저하시키는 부패세균과 진균을 포함하는 유해 미생물에 대하여 우수한 생육 억제 효과를 가지며, 열, pH 및 염도에 대해 우수한 안정성을 나타낸다.

Description

면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법{An Antimicrobial Composition Comprising Immunized Tenebrio molitor Larvae Extract and Menufacturing Method thereof}

본 발명은 면역화된 갈색거저리 유충에서 분리된 친환경적이고 항균활성이 우수한 항균 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

식품의 보존은 아주 오래 전부터 연구해 온 문제이다. 인류역사상 식품을 보존하기 위해 가장 처음 개발된 방법으로는 말리거나 훈제하거나 소금에 절이는 방법 등이 이용되어 왔다. 그러다 1810년에 통조림 방법이 개발되었으며, 이후 온도조절이 가능한 냉장고와 냉동기가 개발되어 식품보존에 큰 발전이 이뤄졌다. 이외에 식품을 보존하기 위한 방법으로 식품에 직접 첨가하는 식품 보존제가 개발되었다. 식품보존제는 부패세균의 발육을 억제시키는 방부제와 곰팡이의 발육을 억제시키는 방미제(防黴劑)가 있다. 어느 것이나 식품 중의 미생물에 작용하여 보존효과를 나타내나, 이는 곧 어느 정도 독성이 있다는 뜻이므로, 법으로 대상식품과 사용량에 대하여 엄격히 규제되고 있는 실정이다.

그러나, 빵, 육가공품, 과자, 통조림, 라면, 컵라면 등의 대부분의 가공식품에는 방부제, 향미제, 발색제, 보존제, 화학조미료 등이 포함되어있다. 이런 합성첨가물들은 사람이나 가축 모두의 건강을 해치는 요인이 된다. 그 이유는 화학첨가물이 체내에 섭취되면 50∼80%는 호흡기나 배설기관으로 배출되지만, 나머지 대부분은 몸에 축적되어 알레르기, 당뇨, 칼슘으로 인한 발육불량, 골다공증, 골연화증, 천식, 곱사병, 불면증, 가슴 두근거림, 노이로제, 관절통, 동맥경화, 고혈압 등의 여러 가지 병을 유발시킬 뿐만 아니라 발암의 원인이 되기 때문이다.

화학방부제들은 인체 안정성에 관한 많은 문제점을 야기하므로, 인체 안전성 측면을 고려하면 자연의 생물로부터 추출하여 얻은 천연 방부제가 사용되는 것이 바람직하다. 지금까지 미생물 오염과 생장을 억제하는 천연 방부제로서 편백나무 추출물인 히노키티올(hinokitiol), 목련 추출물인 메그노놀(megnonol), 자몽종자 추출물인 DF-100 등이 개발되어 있으나 그 규모는 합성 보존제의 17%에 불과하여 수요를 충족시키지 못하고 있다.

따라서 상술한 문제점을 해결함과 동시에 인체안정성과 방부 및 방미 효과가 우수하고 경제성이 뛰어난 식품 보존제의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 공개특허공보 제10-2020-0084258호

따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 유해 미생물에 대한 항균효과가 우수하고, 열, pH 및 염도에 대한 안정성이 뛰어난 항균 조성물 및 이를 포함하는 식품 보존제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항균 조성물을 대량 생산하기 위한 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 추출물은 면역화된 갈색거저리 유충 분말을 10 내지 30%(v/v) 약산으로 추출한 것일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 항균용 조성물을 포함하는 식품 보존제를 제공한다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 하기 단계를 포함하는 항균 조성물의 제조방법을 제공한다.

a) 갈색거저리 유충의 체강에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 주입하는 단계;

b) 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)이 주입된 갈색거저리 유충을 10 내지 15시간 동안 방치하여 면역반응을 유도하는 단계; 및

c) 약산 용액을 사용하여 상기 면역화된 갈색거저리 유충으로부터 추출물을 얻는 단계.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 c) 추출단계는, 상기 면역화된 갈색거저리 유충 분말을 10 내지 30%(v/v) 약산 용액으로, 30 내지 60 시간동안 침지하는 것일 수 있다.

본 발명의 여러 구현예에 따르면, 식품을 부패시키고, 품질을 저하시키는 부패세균과 진균을 포함하는 유해 미생물에 대하여 우수한 생육 억제 효과를 가지며, 열, pH 및 염도에 대해 우수한 안정성을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 항균 조성물은 식용 가능한 유산균과 유충을 활용하여 제조됨으로써, 인체에 안정하면서도 우수한 방부 또는 방미 효과를 갖는 식품 보존제로 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 항균 조성물을 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 갈색거저리 유충에 주입하고, 다양한 면역유도기간(6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간)에 따라, 아타신(attacin)(a), 디펜신(defencin)(b), 테네신(tenecin)(c) 및 콜레옵테리신(coleoptericin)(d) 발현수준을 측정한 그래프이다.
도 3a는 다양한 추출방법으로 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(증류수)에 대한 항균활성 분석 결과이다.
도 3b는 다양한 추출방법으로 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(에탄올)에 대한 항균활성 분석 결과이다.
도 3c는 다양한 추출방법으로 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(20%(v/v) 아세트산 용액)에 대한 항균활성 분석 결과이다.
도 4는 대장균(Escherichia coli), 식중독균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이다.
도 5는 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이다.
도 6은 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이다.
도 7은 황국균(Aspergillus oryzae)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 유산균으로 면역유도된 갈색거저리 유충의 추출물을 포함하는 항균 조성물에 관한 것으로, 보다 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 갈색거저리(Tenebrio molitor)는 거저리과에 속하는 곤충을 지칭하며, 상기 갈색거저리는 알, 유충, 번데기, 성충의 생활사를 가지며, 본 발명의 항균 조성물은 갈색거저리 유충을 사용하였다.

상기 갈색거저리 유충(Tenebrio molitor Larvae)은 널리 알려진 식용 곤충 중 하나로, '밀웜(mealworm)' 또는 '고소애'라고도 하며, 한국을 포함하여 전세계적으로 많은 국가에서 식품 재료로 사용할 수 있도록 허가되어 있다.

본 발명에서 "유효성분"은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에서 "면역화(immunization)"는 표적 항원 또는 에피토프(epitope)에 대한 면역 반응(항체 또는 이펙터 CTL과 같은 세포성 면역을 포함)을 상승시키는 능력을 부여하는 과정을 의미할 수 있다. 상기 면역화는 능동 면역 반응을 제공함으로써 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 증가시킬 수 있다.

상기 면역화는 완벽한 면역성을 의미하는 것은 아니며, 기준선보다 상대적으로 큰 정도의 면역 반응을 의미한다. 예컨대, 상기 면역화에 의해 표적 항원에 대한 세포성 또는 체액성 면역반응이 증가 또는 발생한다면 표적 항원에 대해 면역화된 것으로 평가될 수 있다.

상기 면역화는 특정 대상체에 대해 항원을 투입하여 면역 반응을 야기시키는 방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 표준 근육 내 또는 피부 내 주사, 경피 입자 전달, 흡입, 국소, 경구, 비강 내 또는 점막 모드의 투여에 의해 대상체에 직접적으로 도입될 수 있다.

구체적으로, 상기 갈색거저리 유충은 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.) 균주와 같은 유산균의 도입에 의해 면역화될 수 있고, 바람직하게 상기 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.

상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) KACC 15357일 수 있고, 구체적인 학명은 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)인 것일 수 있다. 상기 락토바실러스 플란타럼은 1×10⁸ CFU/ml 내지 1×10¹² CFU/ml의 농도로 갈색거저리 유충의 체강에 주입되어, 갈색거저리 유충의 면역화를 유도할 수 있다. 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)의 접종농도가 상기 범위미만일 경우, 갈색거저리 유충으로부터 충분한 면역반응을 유도할 수 없다는 문제가 있고, 상기 범위를 초과할 경우에는 갈색거저리 유충의 성장에 오히려 악영향을 미칠 수 있다.

상기 갈색거저리 유충에 유산균을 주입한 후, 면역화 유도기간은 10 내지 15 시간동안 수행되는 것이 바람직한데, 상기 면역화 유도기간이 10 시간 미만이거나 15시간을 초과하면 면역화 반응을 통해 항균 펩타이드가 충분히 생성되지 못한다는 문제가 발생할 수 있다.

상기 추출물은 면역화된 갈색거저리 유충 분말을 10 내지 30%(v/v) 약산 용액으로 추출한 것일 수 있는데, 10 내지 30%(v/v) 약산 용액이 아닌 다른 용매로 추출한 경우에는 항균활성을 나타내지 못하는 문제가 있다. 바람직하게, 상기 약산 용액은 추출용매로 사용되는 약산 용액이라면 특별히 제한되지 않으나, 가장 바람직하게는 아세트산 용액일 수 있다.

상기 추출물의 가장 우수한 항균활성을 얻기 위해서는, 면역화된 갈색거저리 유충 분말을 10 내지 30%(v/v) 아세트산 수용액에서 30 내지 60시간동안, 35 내지 55 시간동안, 40 내지 50 시간동안 침지하는 과정을 통해 추출된 것일 수 있다. 본 발명에서 아세트산 수용액은 빙초산을 희석하여 사용하였다.

상기 추출물은 아타신(attacin), 디펜신(defencin), 테네신(tenecin) 및 콜레옵테리신(coleoptericin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항균 펩타이드를 포함할 수 있는데, 특히, 본 발명의 추출물은 아타신(attacin), 디펜신(defencin), 테네신(tenecin) 및 콜레옵테리신(coleoptericin)을 모두 포함하고 있음을 확인하였다.

본 발명에서 "항균"은 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이, 효모 등과 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다. 이러한 항균효과는 부패세균의 발육을 억제하는 방부효과와 곰팡이의 발육을 억제시키는 방미효과를 포괄할 수 있다.

상기 미생물은 육안으로는 용이하게 식별되지 않은 현미경적으로 작은 유기체 혹은 단위체(unit)를 의미하고, 사람 또는 포유 동물 등 특히 다른 유기체 내부에서 건강에 유해한 현상 또는 질환을 야기하는 세균, 곰팡이, 효모 등을 포함할 수 있다.

상기 미생물은 부패세균뿐만 아니라 진균을 포괄할 수 있고, 특히 장류의 발효과정에서 식품 안정을 좌우하는 유해 미생물인 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아플라톡신을 생산하는 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)와 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균을 포함할 수 있다.

이러한 측면에서, 유충의 종류와 주입되는 균주의 종류에 따라 발현되는 항균 펩타이드가 다르고, 추출방법과 조건에 따라 유용성분의 종류가 달라지게된다. 당연하게, 상기 유용성분에 따라 효과(항균활성의 대상균주) 역시 달라지므로, 본 발명의 항균효과를 갖도록 하기 위해서는 상술한 조건을 모두 만족하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 추출물은 식품의 유해 미생물에 대한 우수한 항균 활성을 나타내므로 독성이 없는 안정한 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 40 내지 100 ℃에서 열 안정성을 가지고, 높은 pH와 염농도에서 안정성을 가지므로 항균 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

상술한 측면에서, 상기 추출물은 식품의 보존이나 장류의 발효 또는 보관 과정에 속하는 온도, pH 및 염농도 범위에서 유해 미생물에 대한 높은 항균활성을 유지할 수 있으므로, 유해 미생물에 대한 높은 항균활성과 식품에 적용시에 요구되는 안정성 모두를 가지는 것으로 현저하게 우수한 효과를 가질 수 있다.

상기 항균 조성물은 조성물 총 중량에 대하여, 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물 유효성분을 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량% 포함할 수 있으며, 상기 항균 조성물의 사용방법 및 사용 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다.

상기 항균 조성물은 유해 미생물, 구체적으로는 유해 미생물에 대한 항균 활성을 갖는 것이고, 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 해산물을 포함한 식품, 화장품 또는 의약에 적용되어 바실러스 속, 아스페르길루스 속 또는 스트렙토코쿠스 속의 유해 미생물에 의한 제품의 부패를 억제하거나 예방할 수 있으며, 상기 항균 활성을 나타내는 물질인 항균 펩타이드는 단백분해효소에 의해 분해 또는 실활될 것이므로, 상기 항균 조성물을 상기 항균 조성물이 적용 가능한 식품, 화장품 또는 의약에 활용할 경우에도 상기 항균 활성을 나타내는 물질에 의해 2차적인 문제가 발생되지 아니한다는 장점이 있다.

상기 항균 조성물은 상기 유효성분 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.

상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.

상기 항균 조성물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물을 유효성분으로 포함하는 것으로, 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학 조성물로도 활용될 수 있는데, 구체적으로 식품, 화장품, 피부 외용제, 의약품 및 의약 부외품 등의 항균 대상물에 첨가하는 방식으로 적용할 수 있으며, 또한 식기, 주방기기, 미용기기, 의료기기 등의 기계나 기구를 본 발명의 조성물 혹은 이의 희석액에 침지하거나, 이들 기계가 기구의 표면에 본 발명의 조성물 혹은 이의 희석액을 분무하는 방식으로 적용할 수 있다.

상기 항균 조성물이 식품 조성물로 활용될 경우, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등 모든 형태의 식품 조성물을 포함할 수 있다. 상기 유형의 식품 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 식품 조성물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물을 유효성분으로 포함하므로 유해 미생물의 증식이 효과적으로 억제되어 식품의 보존성이 현저히 개선될 수 있다.

상기 식품 조성물은 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다.

상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조 및 가공될 수 있다.

또한, 상기 항균 조성물이 약학 조성물로 활용되면, 상기 약학 조성물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물을 유효성분으로 포함하므로 유해 미생물 특히, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) 및 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus) 등에 대해 억제 활성이 우수하다. 상기 유해 미생물은 식중독(food poisoning)과 관련된 미생물로, 이에 대한 항균 효과를 갖기 때문에 약학 조성물로 활용하여 유해 미생물에 의해 유발될 수 있는 미생물 감염질환을 예방, 개선 및 치료하기 위한 의약품에 포함시킬 수 있다.

또한, 상기 항균에 대해서는 전술한 바와 같으며, 그에 따라 항균을 목적으로 하는 약학 조성물에 포함될 수 있으며, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) 및 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)와 같은 식중독(food poisoning) 유발과 관련된 미생물 감염질환의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다.

상기 약학 조성물은 통상적인 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양이 대상체에 투여될 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 상기 항균 조성물이 사료 조성물로 활용되면, 상기 사료 조성물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물을 유효성분으로 포함하므로 유해 미생물 특히, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) 및 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus) 등에 대한 유해 미생물의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고 보존성이 현저히 개선될 수 있다.

상기 사료는 가축의 생육에 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질이다. 상기 동물은 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배성 및 호흡기관이 분화되어 있는 생물로서, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 사료 조성물은 곡물, 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료, 당분 또는 유제품을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 곡물은 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀일 수 있고, 상기 식물성 단백질 사료는 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 할 수 있으며, 상기 동물성 단백질 사료는 혈분, 육분, 골분 및 생선분일 수 있고, 상기 당분 또는 유제품은 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분일 수 있다.

상기 사료 조성물은 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성창 촉진제 또는 질병 예방제와 같은 성분을 더욱 포함할 수 있다.

또한, 상기 사료 조성물은 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질로 제조될 수 있으며 메쉬로 공급되거나 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 저장을 위해 펠렛화, 팽창화 또는 압출 공정을 거칠 수 있으며, 저장의 용이성을 위해 건조되어 유통될 수도 있다.

또한, 본 발명의 항균 조성물은 식품 보존제로도 사용할 수 있다. 특히 모든 구성 성분이 자극이 낮은 식용가능한 원료이므로 사람, 반려동물 및 가축의 식품 보존을 위한 보존제로도 사용될 수 있다. 상기 보존제는 방부용 조성물일 수 있다.

상기 식품 보존제는 세균, 곰팡이 및 효모 둥의 유해 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여, 유해 미생물에 의해 감염되거나 부패될 수 있는 보존대상의 변질, 산패 또는 부패를 방지하고 보존대상의 상태를 유지하기 위하여 사용되는 물질을 의미한다. 바람직하게 식품뿐만 아니라, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 사용될 수 있다.

이러한 측면에서, 상기 보존제는 식품 방부제, 사료 방부제, 화장품 방부제 또는 의약 방부제일 수 있다. 상기 식품 방부제, 사료 방부제, 화장품 보존제 또는 의약 방부제는 식품이나 사료, 화장품 또는 의약의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 각 성분 이외에도 본 발명 조성물의 항균력을 낮추지 않는 한 다른 소재가 더 추가될 수 있다. 이때 추가되는 소재는 바람직하게는 식품이나 식품첨가물에 사용될 수 있는 소재가 좋다.

본 발명의 조성물은 상기 각 성분의 용해 또는 분산을 위해 용매를 포함할 수 있다. 이때 용매는 주정이나 물, 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 조성물은 약학적, 식품학적 또는 화장품학적으로 허용되는 다양한 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명은 또한 상기와 같은 본 발명의 조성물의 유효성분으로 사용되는 성분의 작용효과를 바탕으로, 이를 항균 대상물에 배합하여 상기 항균 대상물의 미생물 오염을 방지하거나 살균하는 방법을 제공한다. 이때 두 성분의 배합 농도는 상기에서 제시된 농도로 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 면역화된 갈색거저리 유충의 추출물을 항균 대상물에 배합할 때, 믹서 혹은 호모게나이저 등을 사용하여 항균 대상물이 균일하게 분포하도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 식품 보존제는 항균력에 의해 위해 미생물의 번식을 억제하여, 첨가된 식품에 식품 보존 효과 및 위해 미생물에 의한 감염 질환을 예방 또는 개선하기 위한 효과를 발휘하는 용도라면, 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한되지 않는다. 상기 식품 보존제를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

상기 식품 보존제는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품 보존제에 포함되는 유효 성분의 첨가량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 상기 식품 보존제의 유효성분 함량은 전체 식품 보존제 중량 대비 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량%일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 항균 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

a) 갈색거저리 유충의 체강에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 주입하는 단계;

b) 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)이 주입된 갈색거저리 유충을 10 내지 15시간 동안 방치하여 면역반응을 유도하는 단계; 및

c) 약산 용액을 사용하여 상기 면역화된 갈색거저리 유충으로부터 추출물을 얻는 단계.

도 1을 참고하여 항균 조성물의 제조방법을 구체적으로 설명하기로 한다. 우선, a) 갈색거저리 유충의 체강에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)를 주입하여, 갈색거저리 유충의 면역반응을 유도할 수 있다. 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) KACC 15357일 수 있고, 구체적인 학명은 락토바실러스 플란타룸 서브스피시스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)인 것일 수 있다. 상기 락토바실러스 플란타럼은 1×10⁸ CFU/ml 내지 1×10¹² CFU/ml의 농도로 갈색거저리 유충의 체강에 주입되어, 갈색거저리 유충의 면역화를 유도할 수 있다. 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)의 접종농도가 상기 범위미만일 경우, 갈색거저리 유충으로부터 충분한 면역반응을 유도할 수 없다는 문제가 있고, 상기 범위를 초과할 경우에는 갈색거저리 유충의 성장에 오히려 악영향을 미칠 수 있다.

다음, b) 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)이 주입된 갈색거저리 유충을 10 내지 15시간 동안 방치하여 면역반응을 유도한다. 이때, 면역반응시간은 10 내지 15시간 수행되는 것이 바람직한데, 상기 면역반응시간이 10 시간 미만이거나 15시간을 초과하면 면역화 반응을 통해 항균 펩타이드가 충분히 생성되지 못한다는 문제가 발생할 수 있다.

상기 b) 단계와 c) 단계 사이에는, b') 액화질소로 급속동결하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 이를 통해 유산균이 주입된 갈색거저리 유충으로부터 아타신(attacin), 디펜신(defencin), 테네신(tenecin) 및 콜레옵테리신(coleoptericin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항균 펩타이드와 같은 유용 성분들의 손실없이 다량 함유된 추출물을 제조할 수 있다.

최종적으로, c) 약산 용액을 사용하여 상기 면역화된 갈색거저리 유충으로부터 추출물을 얻는다. 상기 약산 용액은 추출에 사용가능한 약산 용액이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 아세트산 용액일 수 있다.

바람직하게, 상기 c) 추출단계는, 상기 면역화된 갈색거저리 유충 분말에 10 내지 30%(v/v) 약산 용액을 혼합하여, 30 내지 60 시간동안 침지하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 면역화된 갈색거저리 유충 분말을 기준으로 1 내지 10 배 부피비의 10 내지 30%(v/v) 약산 용액을 첨가하여 추출되는 것일 수 있다. 10 내지 30%(v/v) 약산 용액이 아닌 다른 용매로 추출한 경우에는 항균활성을 나타내지 못하는 문제가 있다.

추출방법은 냉침, 초음파 추출 또는 가열 추출방법이 모두 가능하고 특별히 이에 제한되지 않으나, 30 내지 60시간동안, 35 내지 55 시간동안, 40 내지 50 시간동안 침지되어 추출되는 것이 바람직하다.

상기 추출물의 가장 우수한 항균활성을 얻기 위해서는, 면역화된 갈색거저리 유충 분말을 10 내지 30%(v/v) 아세트산 수용액에서 40 내지 50 시간동안 침지하는 과정을 통해 추출된 것일 수 있다.

상기 c) 단계 후에, d) 상기 c) 단계로부터 얻은 추출물 원심분리하고, 상등액을 회수하여 여과 및 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 추출물을 정제하여 불술물을 제거할 수 있고, 상기 정제과정은 통상의 방법이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 필터를 통한 여과공정일 수 있다. 상기 농축은 통상의 농축방법이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리를 통해 농축시킨 후 건조하여 사용할 수 있다. 상기 건조는 동결, 분무 등 건조과정을 통해 수행될 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실시예 1. 면역화된 갈색거저리 유충 추출물

갈색거저리 유충(Tenebrio molitor larvae, TML)(종령 유충)의 체강에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 1×10¹⁰ CFU 농도로 주입하고, 12시간동안 면역반응시켰다. 면역반응이 유도된 갈색거저리 유충을 액체질소를 이용하여 급속동결한 후, 분쇄하였다. 분쇄된 면역화된 갈색거저리 유충 분말을 20%(v/v) 아세트산 용액(glacial acetic acid)에 48시간동안 침지한 후 4,500 rpm, 4 ℃에서 30분간 원심분리 하였다. 상층액만을 회수하고, 0.45 um 실린지필터로 여과하여 진공농축원심분리기에서 9 내지 24시간 동안 농축한 후 20%(v/v) 아세트산 용액(glacial acetic acid)에 희석하여, 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 제조하였다.

실험예 1. 갈색거저리 유충의 체내 다양한 항균 펩타이드 과량 발현을 위한 최적 유도 조건

갈색거저리 유충(Tenebrio molitor larvae, TML)는 식품공전에 등록된 식용가능한 곤충이다. 상기 갈색거저리 유충에서 항균 추출물을 제조하기 이전에, 이로부터 다양한 항균 펩타이드(Antimicrobial peptide, AMP)가 최대로 발현되는 시간을 확인하고자 하였다.

우선, 갈색거저리 유충의 체강에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 1×10¹⁰ CFU 농도로 주입하고, 다양한 면역반응시간(6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간)으로 사육하였다. 상기 다양한 시간으로 면역반응이 유도된 갈색거저리 유충으로부터 각각 체액을 추출한 후, 아타신(attacin), 디펜신(defencin), 테네신(tenecin) 및 콜레옵테리신(coleoptericin)로 이루어진 4종의 항균 펩타이드의 전사체 발현양상을 qRT-PCR을 통하여 확인하였다.

qRT-PCR 분석을 위해, 면역유도기간별 유충의 체액으로부터 총 mRNA를 추출하여 유전자 특이적 프라이머 세트(표 1)로 하기와 같이 qRT-PCR 분석을 수행하여 면역유도기간별 아타신(attacin), 디펜신(defencin), 테네신(tenecin) 및 콜레옵테리신(coleoptericin)의 발현량을 측정하였다. 구체적으로 72-well Rotor가 장착된 Rotor-Gene-Q(Qiagen, 미국)를 이용하여 수행하였다. 모든 샘플은 5 ㎕의 SYBR GreenTM master mix(Elpis-biotech, 한국), 3 ㎕의 cDNA 및 2.5 μM의 유전자-특이 프라이머 세트(표 1)를 혼합하여 하기와 같이 RT-PCR를 수행하였다; 94 ℃에서 10초, 62 ℃에서 10초 및 72 ℃에서 10초의 40회 반복하였다.

구분		시퀀스(5‘-3’)
attacin	forward	서열번호 1 : 5’-GAAACGAAATGGAAGGTGGA-3’
	reverse	서열번호 2 : 5’-TGCTTCGGCAGACAATACAG-3’
defencin	forward	서열번호 3 : 5’-AAATCGAACAAGGCCAAACAC-3’
	reverse	서열번호 4 :5’-GCAAATGCAGACCCTCTTTC-3’
tenecin	forward	서열번호 5 :5’-CAGCTGAAGAAATCGAACAAGG-3’
	reverse	서열번호 6 :5’-CAGACCCTCTTTCCGTTACAGT-3’
coleoptericin	forward	서열번호 7 :5’-GGACAGAATGGTGGATGGTC-3’
	reverse	서열번호 8 : 5’-CTCCAACATTCCAGGTAGGC-3’

도 2는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 갈색거저리 유충에 주입하고, 다양한 면역유도기간(6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간)에 따라, 아타신(attacin)(a), 디펜신(defencin)(b), 테네신(tenecin)(c) 및 콜레옵테리신(coleoptericin)(d) 발현수준을 측정한 그래프이다.

도 2에 나타난 바와 같이, 주입 12시간부터 높은 수준으로 발현되어 이후 점차 감소하였다. 이를 통해 10 내지 30 시간동안 항균 펩타이드가 발현되며, 10 내지 15시간에서 모든 항균 펩타이드의 발현이 최대임을 확인하였다. 특히 면역유도기간이 12시간일 때 가장 발현이 높았으므로, 이후 실험은 면역유도기간을 12시간으로 설정하였다.

실험예 2. 면역화된 갈색거저리 유충으로부터 최적 추출 조건

갈색거저리 유충(Tenebrio molitor larvae, TML)의 체강에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 1×10¹⁰ CFU 농도로 주입하고, 12시간동안 면역반응시켰다. 면역반응이 유도된 갈색거저리 유충을 다양한 용매와 다양한 방법으로 제조하여 추출물을 얻은 후, 항균활성 측정을 위한 시료로 사용하였다.

증류수(distilled water, D.W), 에탄올(ethanol, EtOH) 및 20%(v/v) 아세트산 용액(glacial acetic acid, 20%(v/v) AcOH)의 3가지 추출용매와, 20분 동안 끓이거나(Boil), 48시간 침지하거나(Soak), 초음파로 파쇄하는(Sonication) 3가지 추출방법을 조합하여 총 9가지 추출조건으로 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 각각 제조하였다.

각 추출물의 항균효능은 inhibition zone assay을 통해 확인하였다. 항균활성 실험에 사용된 균주는 식품공전 중 장류제조시 유해균으로 분류하고 있는 대장균(Escherichia coli)을 사용하였다. 대장균은 최적 배양조건에서 키운 후, Luria-Bertani broth 등 최적액체배지에서 8시간정도 배양하여 배양액의 탁도를 O.D 600 = 1.25가 되도록 맞춘 후 inhibition zone assay를 실시하였다. 대장균의 배양액 0.1 ㎕를 nutrient agar 배지 등 최적배지에 골고루 도말하였고, 추출물의 농도는 500 ㎍/disc 또는 1000 ㎍/disc를 사용하였다. 멸균한 paper disc(Whatman chromatography paper, 6 ㎜ diameter)는 무균상태에서 시료를 흡수ㅇ건조시킨 뒤 사용하였고, 대장균의 배양온도에서 24시간 배양하여 disc 주위에 생성된 clear zone(㎝)의 직경으로 각 추출물의 항균활성을 측정하였으며, 실험은 3회 반복하였다. 음성대조군으로 해당 추출용매만을 사용하였다.

도 3a는 다양한 추출방법으로 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(증류수)에 대한 항균활성 분석 결과이고, 도 3b는 다양한 추출방법으로 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(에탄올)에 대한 항균활성 분석 결과이며, 도 3c는 다양한 추출방법으로 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(20%(v/v) 아세트산 용액)에 대한 항균활성 분석 결과이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(증류수), 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(에탄올)은 추출방법에 상관없이 모두 항균활성을 보이지 않았다. 이에 반해 면역화된 갈색거저리 유충 추출물(20%(v/v) 아세트산 용액)은 농도 의존적으로 항균활성이 증가함을 확인하였다. 면역화된 갈색거저리 유충으로부터 20%(v/v) 아세트산 용액을 사용하여 추출물을 제조할 경우, 48 시간동안 침지하는 것이 가장 뚜렷한 클리어존을 나타내는 것으로 확인된 바, 본 발명의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 20%(v/v) 아세트산 용액을 사용하여 48시간 침지하여 제조된 것이 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 3. 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석

실험예 1 및 실험예 2를 통해 최적화된 조건으로 제조된 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물이 유익균과 유해균에 선택적 항균활성을 갖는지 분석하고자 하였다.

항균활성 실험에 사용된 균주는 식품공전 중 장류제조시 유해균으로 분류하고 있는 대장균(Escherichia coli), 식중독균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 사용하였다. 실험예 2와 동일하게 inhibition zone assay으로 항균활성을 분석하였다. 음성대조군으로부터 20%(v/v) 아세트산 용액을 사용하였고, 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 농도는 500 ㎍/disc 또는 1000 ㎍/disc를 사용하였다.

유익균으로는 인체 장내에 서식하는 유산균인 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 사용하였다. 이에 대한 항균활성을 방사선 확산분석법(radial diffusion assay, RDA)으로 검정하였다. RDA 분석을 위하여 멸균된 RDA용 underlay gel(9 mM sodium phosphate, 1 mM sodium citrate, pH7.4, 1% low electroendosmosis agarose, 0.03% TSB)에 전배양된 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)(Macfarland turvidity No 0.5)를 혼합하여 100 mm 사각플레이트에 부어 굳혔다. Underlay gel에 지름 3.5 mm의 구멍을 내어 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 500 ㎍/10 ㎕ 또는 1000 ㎍/10 ㎕ 농도로 각각의 구멍에 넣었고, 항균 펩타이드가 확산되도록 37 ℃에서 3시간 배양한 후, 그 위에 RDA용 overlay gel(6% TSB, 1% low electroendosmosis agarose)을 부어 굳힌 다음 37 ℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 clear zone의 크기를 측정하여 항균 활성을 비교하였다. 음성대조군으로부터 20%(v/v) 아세트산 용액을 사용하였다.

도 4는 대장균(Escherichia coli), 식중독균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 음성대조군으로 사용한 20%(v/v) 아세트산 용액보다 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물이 유해균에 대한 우수한 저해활성을 갖고 있음을 확인하였다. 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 농도의존적으로 유해균에 대한 항균활성이 점차 증가하였다.

도 5는 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 유익균에 대해서는 저해활성(항균활성)을 갖지 않는 것으로 확인되었다.

실험예 4. 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 유해진균 및 유익진균에 대한 항균활성 분석

실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 이용하여 진균중 아플라톡신을 생성하는 유해진균 2종(Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus)과 메주제조에 사용하는 유익진균인 황국균(Aspergillus oryzae)에 대한 항균활성을 실험예 2와 동일하게 inhibition zone assay로 검정하였다. 음성대조군으로는 20%(v/v) 아세트산 용액을 사용하였다.

도 6은 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이고, 도 7은 황국균(Aspergillus oryzae)에 대한 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성 분석 결과이다.

도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 아플라톡신을 생성하는 유해진균 2종, 유익진균 1종에 대해서 모두 항균활성을 갖는 것으로 확인되었다. 즉 실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 진균에 대한 우수한 항균활성을 갖고 있음을 알 수 있다.

실험예 5. 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 최소저해농도 검정

실시예 1로부터 제조된 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 이용하여 식품공전 중 장류제조시 유해균으로 분류하고 있는 대장균(Escherichia coli), 식중독균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 최소저해활성(mininal inhibitory concentration, M.I.C)을 측정하였다.

각각의 균주들을 액체 배지에서 37 ℃, 150 rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 배양액의 2%를 새로운 액체배지에 첨가한 후, 동일조건하에서 4×10⁶ cfu/㎖ 농도가 되도록 2 차 배양하였다. 96-well microplate의 각 well에 90 ㎕의 세균 배양액(1×10⁵ cfu/㎖)을 분주한 후, 단계적으로 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 각 well당 다양한 농도로 첨가하였다. 이후, 37 ℃에서 18시간 동안 배양한 다음 분광 광도계(600 ㎚)에서 흡광도를 측정하여 MIC를 측정하여 표 2에 나타내었다.

유해균명	추출물 농도
	80 ㎍	90 ㎍	100 ㎍
E. coli	1.152	0.208	0.044
B. cereus	0.646	0.267	0.042
S. aureus	1.103	0.164	0.041

표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 유해균 3종에 대한 최소저해활성은 1×10⁵ CFU/100 ㎍인 것으로 확인되었다.

실험예 6. 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 안정성 분석

1) 열 안정성 분석

온도에 따른 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성을 측정하였다. 구체적으로 가열온도와 시간에 따른 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 최소저해활성농도의 변화를 실험예 5와 동일하게 수행하여 측정하였다. 가열온도와 시간조건과 이에 따른 결과를 표 3에 나타내었다.

가열조건	추출물 농도
	80 ㎍	90 ㎍	100 ㎍
40 ℃, 36 hr	1.148	0.195	0.051
40 ℃, 48 hr	1.195	0.210	0.043
40 ℃, 72 hr	1.145	0.187	0.041
100 ℃, 5 sec	1.200	0.174	0.038
100 ℃, 10 sec	1.317	0.147	0.038
100 ℃, 15 sec	1.166	0.121	0.042

표 3에 나타난 바와 같이, 가열온도와 시간에 따른 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 최소저해활성농도는 변화가 관찰되지 않음을 확인하였다. 즉 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성은 40 ℃이상에서 장기간 안정적으로 유지됨을 알 수 있다.

2) pH 안정성 분석

pH 조건에 따른 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성을 측정하였다. 본 발명의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 장류에도 활용가능하므로, 시중에 판매되고 있는 고추장과 간장의 pH 범위안에서 안정적으로 활성을 나타내는지 확인하고자 하였다. 고추장의 pH는 5.04 ± 0.07이고, 간장의 pH는 4.74 ± 0.09이므로, 이를 기준으로 pH 조건을 pH 4 내지 6으로 설정하였다.

pH	추출물 농도
	80 ㎍	90 ㎍	100 ㎍
4	1.138	0.217	0.040
5	1.097	0.225	0.041
6	1.126	0.237	0.036

표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 pH 변화에 따라 최소저해활성농도가 변화하지 않으므로, pH에 대한 안정성을 가지고 있음을 알 수 있다.

3) 염분 안정성 분석

다양한 염농도 조건에서의 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물의 항균활성을 측정하였다. 본 발명의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 장류에도 활용가능하므로, 시중에 판매되고 있는 고추장과 간장의 염분 범위에서 안정적으로 활성을 나타내는지 확인하고자 하였다. 고추장과 간장의 염분을 Mohr법으로 측정한 결과, 고추장의 염분은 6.96 ± 0.30%, 간장의 염분은 19.33 ± 1.68%이므로, 이를 기준으로 염분 범위를 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20% 및 25%로 설정하였다.

염분(%)	추출물 농도
	80 ㎍	90 ㎍	100 ㎍
5	4	1.138	0.217
7.5	5	1.097	0.225
10	6	1.126	0.237
15	0.710	0.244	0.042
20	0.823	0.243	0.041
25	0.748	0.242	0.042

표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 다양한 염농도 변화에 따라 최소저해활성농도가 변화하지 않으므로, 고함량의 염분 농도 조건에 대한 안정성을 가지고 있음을 알 수 있다.

<110> UNIVERSAL FARM-s MEAL Co., Ltd. INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION OF SEJONG UNIVERSITY <120> An Antimicrobial Composition Comprising Immunized Tenebrio molitor Larvae Extract and Menufacturing Method thereof} <130> HPC9417 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward sequence of attacin <400> 1 gaaacgaaat ggaaggtgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse sequence of attacin <400> 2 tgcttcggca gacaatacag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward sequence of defencin <400> 3 aaatcgaaca aggccaaaca c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse sequence of defencin <400> 4 gcaaatgcag accctctttc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward sequence of tenecin <400> 5 cagctgaaga aatcgaacaa gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse sequence of tenecin <400> 6 cagaccctct ttccgttaca gt 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward sequence of coleoptericin <400> 7 ggacagaatg gtggatggtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse sequence of coleoptericin <400> 8 ctccaacatt ccaggtaggc 20

Claims (4)

1. 면역화된 갈색거저리 유충 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물로,
   상기 면역화된 갈색거저리 유충 추출물은 갈색거저리 유충의 체내에 1×10⁸ CFU/ml 내지 1×10¹² CFU/ml의 농도로 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)를 처리하고, 10 내지 15 시간동안 면역화한 후, 액화질소로 급속동결하여 분쇄한 분말을 20%(v/v) 아세트산 수용액으로 추출한 것을 특징으로 하며,
   고온, 고염도 및 높은 pH 조건에서 안정적인 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
2. 삭제
3. a) 갈색거저리 유충의 체강에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 1×10⁸ CFU/ml 내지 1×10¹² CFU/ml의 농도로 주입하는 단계;
   b) 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)이 주입된 갈색거저리 유충을 10 내지 15시간 동안 방치하여 면역반응을 유도하는 단계; 및
   c) 상기 b) 단계에서 얻은 면역화된 갈색거저리 유충을 액화질소로 급속동결하고, 20%(v/v) 아세트산 수용액에 침지하여 상기 면역화된 갈색거저리 유충으로부터 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 고온, 고염도 및 높은 pH 조건에서 안정적인 항균활성을 갖는 항균 조성물의 제조방법.
4. 삭제

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