KR102524247B1 - p40-EBI3의 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛이 링커에 의해 연결되어 형성된 신규한 복합체에 관한 것으로, 우수한 항염증 효과 및 면역조절 효과를 가지고 있다.

Description

p40-EBI3의 복합체 및 이의 용도{p40-EBI3 COMPLEX AND USES THEREOF}

본 발명은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛이 링커에 의해 연결되어 형성된 복합체, 이를 인코딩하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 벡터 및 이들의 면역 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

사이토카인의 IL-12 패밀리는 IL-12, IL-23, IL-27 및 IL-35로서 염증 질환의 중요한 조절자일뿐만 아니라 T 세포 의존 면역을 중재한다. 이들 각각은 독립적으로 발현이 조절되는 두 개의 서브유닛으로 구성된 이종이량체 복합체 형태이다. IL-12는 p35와 p40의 두 폴리펩티드 서브유닛이 이황화 결합에 의해 연결되어 이루어진 이종이량체 단백질 형태로서, 이중에서 p40 서브유닛은 동종이량체 및 단량체로서 존재할 수 있으며 IL-12 기능의 안타고니스트로서 작용할 수 있다. IL-23은 p40과 p19로 이루어진 이종이량체이고, IL-27은 EBI3 (Epstein-Barr virus-induced gene 3)와 p28로 구성된 이종이량체이다. IL-35는 가장 최근에 확인된 사이토카인 멤버로서 p35와 EBI3로 이루어졌다.

EBI3 (Epstein-Barr virus-induced gene 3)는 IL-27 서브유닛 베타 (IL-27β)로도 불리는, EBI3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서 IL-12의 p40 서브유닛과 관련된 헤마토포이에틴 수용체 패밀리의 맴버이며 글리코프로테인에 의해 분비된다. EBI3는 IL-27 및 IL-35의 서브유닛으로서 존재하며, 여러 서브유닛과의 이종이량체 형태의 복합체 형성이 연구되고 있다.

미국공개특허 제2007/0299026호

본 발명의 목적은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛이 링커에 의해 연결되어 형성된 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체를 인코딩하는 유전자 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체 정량분석을 위한 표준 단백질 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체 검출 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체 정량 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛이 링커에 의해 연결되어 형성된 복합체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 복합체는 서열번호 2, 4, 6 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 복합체는 서열번호 1, 3, 5, 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 링커는 본 분야에서 일반적으로 아미노산을 연결시키기 위해 사용되는 링커라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 적합한 아미노산 서열, 예를 들어, 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 예컨대 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 링커의 일 예로서 gly-ser 링커를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 복합체는 면역글로불린 모이어티, 예를 들어, Fc 단편을 추가 포함할 수 있다. 상기 Fc 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgD의 단편일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 면역글로불린 모이어티는 EBI3 서브유닛에 연결된 것일 수 있다. 상기 면역글로불린 모이어티를 추가 포함하는 복합체는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 7 또는 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.

또한 본 발명은 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체 또는 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛-면역글로불린 모이어티의 복합체를 인코딩하는 서열번호 1, 3, 5, 7, 8, 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체 또는 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛-면역글로불린 모이어티의 복합체를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 본 발명에 따른 상기 복합체를 포함하는 벡터를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 면역 질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 강직성 척추염 (Ankylosing Spondylitis), 자가면역성 뇌척수염 (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 피부경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 염증성 장 질환 (Inflammatory Bowel Dieseses) 및 이식편대숙주질환 (Graft-versus-Host Disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 복합체를 포함하는 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체 정량분석을 위한 표준 단백질 복합체를 제공한다.

또한 본 발명은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체 검출 키트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단백질 수준에서 측정하는 제제는, 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.

아울러 본 발명은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체를 정량 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체는 신규한 사이토카인 면역복합체로서, 종래의 이종이량체 형태의 사이토카인에 비해 높은 항염증 효과를 나타내고, 우수한 면역조절 기능을 가지고 있어 면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 (a) 자연 형태 및 (b) 최적화 형태의 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1) 및 (c) p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)를 코딩하는 DNA 벡터의 개략도이다.
도 2a 및 2b는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 자연 형태의 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체를 인코딩하는 염기서열 (서열번호 1) 및 이의 아미노산 서열 (서열번호 2)이다.
도 3a 및 3b는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 최적화 형태의 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)를 인코딩하는 염기서열 (서열번호 3) 및 이의 아미노산 서열(서열번호 4)이다.
도 4a 및 4b는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 최적화 형태의 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt2)를 인코딩하는 염기서열 (서열번호 5) 및 이의 아미노산 서열 (서열번호 6)이다.
도 5a, 5b 및 5c는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 최적화 형태의 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)를 인코딩하는 염기서열 (a 및 b) (서열번호 7 및 8) 및 이의 아미노산 서열 (c) (서열번호 9)이다.
도 6a, 6b 및 6c는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 최적화 형태의 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 단편 복합체를 인코딩하는 염기서열 (a 및 b)(서열번호 10 및 11) 및 이의 아미노산 서열 (c) (서열번호 12)이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 DC 세포에서 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체의 생성 여부를 확인하는 ELISA 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 자연 형태의 형질전환 벡터를 제작하여 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체의 과발현 여부를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 자연 형태의 형질전환 벡터를 제작하여 자가면역 관절염 동물 모델에서 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체의 질환 억제 능력을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)에 의한 자가면역 관절염의 arthritis score 및 incidence를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)에 의한 자가 항체 억제 능력을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 관절염 동물 모델의 관절의 H&E 염색 결과 이미지 및 사이토카인 발현을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 관절염 동물 모델의 관절의 사프라닌 O 염색 결과 이미지 및 사이토카인 발현을 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스 구축을 위한 벡터의 구조 (a) 및 이의 과발현 여부 (b 및 c)를 확인한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스에서의 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체(opt1)의 과발현 마우스에서의 BM 세포에서의 파골 세포 분화 억제 조절 효과를 확인한 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스에서의 관절염 억제 효과를 확인한 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스에서의 T helper 세포의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스에서의 이식거부질환 (GvHD) 조절 효과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스에서의 자가면역성 뇌척수염 (EAE) 조절 효과를 나타낸 것이다.
도 21a는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스에서의 염증성 장 질환 (IBD) 조절 효과를 나타낸 것이다.
도 21b는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체 (opt1)의 과발현 마우스에서의 체중 변화 및 장 길이를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 자가면역 관절염 동물 모델에서 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 arthritis score 및 incidence를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 자가면역 관절염 동물 모델에서 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 자가 항체 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 자가면역 관절염 동물 모델에서 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 T 세포의 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 자가면역 관절염 동물 모델에서 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 관절 파괴 정도를 대조군과 비교한 것이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 자가면역 관절염 동물 모델에서 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)가 염증성사이토카인, 관절파괴인자 및 신생혈관생성인자의 발현에 미치는 영향을 대조군과 비교한 것이다.
도 27a 및 27b는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2) 단백질의 발현을 확인한 결과 (a) 및 발현된 단백질의 mass spectrum 분석 결과 (b)를 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 조절 T 세포 분화에 대한 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)의 활성 효과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)의 파골 세포 분화 억제 조절 효과를 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)에 의한 arthritis score 및 incidence를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)의 자가 항체 억제 능력을 나타낸 그래프이다.
도 35는 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)의 T 세포의 증식 억제 능력을 나타낸 그래프이다.
도 36은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)가 관절 파괴 정도에 미치는 영향을 나타낸 관절의 염색 결과 이미지이다.
도 37은 본 발명의 일 실시예에 있어서, p40 서브유닛-EBI3 서브유닛/Fc 단편 복합체 (opt2)가 염증성 사이토카인, 관절파괴인자 및 신생혈관생성인자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 IHC 결과 이미지이다.
도 38은 마우스 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 마우스 p40-EBI3-FC 복합체 ELISA 키트의 표준물질로 이용할 수 있는지를 확인하기 위해 수행한 Sandwich ELISA 분석 과정을 나타낸 도이다.
도 39는 마우스 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 마우스 p40-EBI3-FC 복합체 ELISA 키트의 표준물질로 이용할 수 있는지를 Sandwich ELISA 분석 방법으로 확인한 도이다.
도 40은 본 발명의 일 구현예에 따른 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체 (opt)를 코딩하는 인간 벡터의 개략도이다.
도 41은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 인간 p40-EBI3 복합체 벡터를 제작하여 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛 복합체의 Hek293 세포에서의 과발현 여부를 확인한 결과이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 전체에서 사용되는 용어 “p40 서브유닛”은 IL-12의 서브유닛 베타 (IL-12β)를 의미하는 것으로, IL-12와 IL-23의 공동 서브유닛이다.

본 발명의 명세서에서 전체에서 사용되는 용어 “EBI3 (Epstein-Barr virus induced gene 3) 서브유닛”은 인간에서 EBI3 유전자에 의해 인코딩되는 IL-27의 서브유닛 베타 (IL-27β)를 의미하는 것이다.

본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 용어 “Fc 단편” 또는 “Fc”는 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 1 (CH1), 중쇄 불변 영역 2 (CH2), 중쇄 불변 영역 3 (CH3)을 포함하는 단백질을 의미한다. Fc 단편은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛이 링커에 의해 연결되어 형성된 복합체를 제공하며, 구체적으로는 서열번호 2, 4, 6 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 아미노산 서열을 갖는 복합체일 수 있다. 상기 복합체는 예를 들어, 서열번호 1, 3, 5, 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩 될 수 있다.

구체적으로, 상기 복합체는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 복합체일 수 있다 (도 2a 및 2b). 또는 상기 복합체는 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 복합체일 수 있다 (도 3a 및 3b). 또는 상기 복합체는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 복합체일 수 있다 (도 4a 및 4b). 또는 상기 복합체는 서열번호 10 또는 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 복합체일 수 있다 (도 6a 내지 6c).

상기 p40 서브유닛과 EBI3 서브유닛을 연결하는 링커는 본 분야에서 일반적으로 사용되는 링커라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 gly-ser 링커일 수 있다.

또한, 상기 복합체는 생체 내 수송을 원활히 하기 위해 면역글로불린 모이어티를 추가 포함할 수 있다. 상기 면역글로불린 모이어티는 본 분야에서 일반적으로 사용하는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgD의 단편과 같은 Fc 단편일 수 있다. 상기 면역글로불린 모이어티는 EBI3 서브유닛에 연결된 것일 수 있다. 상기 면역글로불린 모이어티를 추가 포함하는 복합체는 서열번호 7 또는 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다 (도 5a, 5b 및 5c).

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

상기 벡터는 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체 또는 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛-면역글로불린 모이어티의 복합체를 인코딩하는 서열번호 1, 3, 5, 7, 8, 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 예를 들어, 도 1a, 1b 및 도 40에 도시된 바와 같이 구성될 수 있으며, 상기 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛-면역글로불린 모이어티의 복합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 예를 들어, 도 1c에 도시된 바와 같이 구성될 수 있다.

본 발명의 용어 "벡터 (vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미하는 것으로, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, p3xFLAG, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pcDNA3.1, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ- Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40, CMV 등)를 통상적인 방법으로 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, HEK293, NIH3T3, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 벡터의 숙주 세포 내로의 운반 (도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 형질전환된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체 또는 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛-면역글로불린 모이어티의 복합체를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 본 발명에 따른 상기 p40 서브유닛-EBI3 서브유닛의 복합체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 면역 질환은 자가면역질환 또는 염증 질환일 수 있으며, 예를 들어, 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 강직성 척추염 (Ankylosing Spondylitis), 자가면역성 뇌척수염 (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 피부경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 염증성 장 질환 (Inflammatory Bowel Dieseses) 및 이식편대숙주질환 (Graft-versus-Host Disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 골관절염과 같은 면역질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 자가면역질환 또는 염증 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴;

(2) 자가면역질환 또는 염증 질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함;

(3) 자가면역질환 또는 염증 질환을 경감시킴;

(4) 자가면역질환 또는 염증 질환의 재발을 예방함; 및

(5) 자가면역질환 또는 염증 질환의 증상을 완화함 (palliating)

본 발명에 조성물은 약학적으로 유효한 양의 복합체, 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역질환 또는 염증 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 조성물의 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 자가면역질환 또는 염증 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 10³ ~1 x 10¹² 세포/kg 이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 복합체를 포함하는 p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체 정량분석을 위한 표준 단백질 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 복합체를 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체 검출 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서 본 발명의 복합체를 단백질 수준에서 측정하는 제제는, 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)일 수 있다.

본 발명의 키트에서 본 발명의 복합체를 단백질 수준에서 측정하는 방법은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으며, 샌드위치 ELISA인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기에서 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 p40 서브유닛 및/또는 EBI3 서브유닛에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 복합체를 표준 단백질 복합체로서 포함하는, p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛 복합체를 정량하기 위한 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

실시예 1 : 생체내 자연 복합체의 확인

본 발명에 따른 복합체가 생체내에 자연적으로 존재하는지를 확인하였다.

자연적으로 존재하는 p40-EBI3 복합체를 확인하기 위하여 일반적으로 존재하는 IL-12 family 사이토카인인 IL-12, IL-23, IL-27 사이토카인이 DC, APC에서 발현되는 사실에 가정하여 DC 세포 (CD11c⁺ cell)를 분리하여 자극하고 3일간 배양한 후 상층액에서 p40-EBI3의 ELISA를 측정하였다.

우선 비장세포를 5% RPMI를 사용하여 티징 슬라이드로 갈아준 후, 1300rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하여 sup (supernatant)을 제거하였다. 그런 다음 ACK buffer를 첨가하여 RBC를 제거 후, 1300rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하여 sup을 제거하고, 세포를 다시 잘 풀어준 후 MACs buffer를 첨가하고 스트레이너로 걸러준 후 세포를 계수하였다. 다시 1300rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리한 후 sup을 제거하고 1 x 10⁷ 당 10ul로 CD11c bead를 부착시켰다. 분리된 세포를 24 well plate에 1 x 10⁶/㎖로 세포 seeding 한 후 LPS 100 ng/㎖ + IFN-γ 25 ng/㎖, zymosan 5 ㎍/㎖ 및 con A 5 ㎍/㎖의 자극조건으로 자극하여 3일간 배양하였다.

EBI3 capture를 깔고 p40로 detection하여 ELISA를 확인한 결과 LPS + IFN-γ, zymosan, conA와 같은 자극 조건에서 p40-EBI3 complex가 발현되었으며, 이 결과는 자연적으로 p40-EBI3 복합체가 발현된다는 것을 나타내는 것이다 (도 7).

제조예 1 : p40-EBI3 복합체의 제조

p40-Linker (3xGGGGS)-EBI3 형태의 복합체를 자연 형태로 cDNA (서열번호 1)를 제작한 뒤 수득된 cDNA를 5’HindⅢ 와 3’NotⅠ제한 효소로 자른 뒤 같은 제한 효소로 자른 발현 벡터인 p3xFLAG-CMV-10 벡터에 ligation한 후 형질전환하여 콜로니를 얻어 클론을 선택하였다. 선별된 클론은 벡터를 분리해 얻은 DNA를 얻어 시퀀싱을 하였으며, 시퀀싱 결과에서 100% 일치한 클론으로 과발현 확인실험을 진행하였다.

HEK293 세포에 과발현 벡터를 제조하여 트랜스펙션을 진행하였다. 트랜스펙션 다음날 배지를 교체한 후 2일 뒤 상층액을 수확하였으며, 그 상층액으로 ELISA를 시행하여 과발현을 확인했을 때 월등히 높은 p40-EBI3 복합체를 확인하였다 (도 8). 이 복합체는 자연적인 서열을 갖는 복합체 (nature)로서, 서열번호 2에 표시된 아미노산 서열을 가지며 (도 2b), 서열번호 1에 표시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다 (도 2a).

최적의 복합체 (opt1) 형태를 제조하기 위해, 상기 p40-Linker (3xGGGGS)-EBI3 형태의 복합체를 genscript에서 최적화하였다. 수득된 cDNA를 HindIII, XbaI로 자른 뒤 같은 enzyme site로 자른 발현 벡터인 p3xFLAG-CMV-10 벡터에 ligation 한 후 형질전환하여 콜로니를 얻어 클론을 선택하였다. 선별된 클론은 벡터를 분리해 얻은 DNA를 시퀀싱하여 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열을 가짐을 확인하였다 (도 3a). DNA 서열을 확인한 클론은 Hek293 세포에 형질도입한 뒤 3일 후 세포에서 단백질을 추출하고 이 단백질로 웨스턴 블롯을 진행하여 발현 확인된 최종 클론을 선택하였다.

실시예 2 : 자가면역 관절염 동물 모델에서의 효과

p40-EBI3 복합체의 in vivo 내 효력을 평가하고자 정상 DBA1/J 마우스에 관절염을 유도하고 제조예 1에서와 같이 제조된 자연 형태 (nature) 및 최적 형태 (OPT1)의 p40-EBI3 복합체 DNA 벡터를 주입하여 관절염 억제 효력을 평가하였다. 대조군으로 mock 벡터를 주입하였다. E. coli로 배양한 벡터를 prep하여 사용하였으며 endotoxin에 대한 효과를 없애기 위하여 endotoxin-free kit을 사용하였다.

마우스에게 관절염을 유도하고 1주일 후부터 실험이 종료되는 시점까지 주 1회, 회당 100 ㎍의 벡터를 주입하였다. 첫 번째 벡터 주입은 마우스 꼬리의 정맥투여 (IV:intravenous)로 벡터 100 ㎍을 투여하였으며, 두 번째 벡터 주입은 마우스 뒷다리 (오른쪽)의 근육 부위의 털을 제거한 후 인슐린 주사기로 벡터 100 ㎍을 근육투여 (IM:intramuscular)한 뒤 eletroporator로 transfer하였다. 세 번째 벡터 주입은 두 번째 벡터 주입방법과 동일하며 전 주에 벡터가 주입된 마우스 뒷다리 오른쪽의 반대쪽 다리에 주입하였다. 첫 번째부터 세 번째 벡터 주입 방법까지 1세트로 3주간 실험이 진행되며 동물실험이 종료되기 전까지 위의 방법을 반복하였다.

실험 종료 후 DBA1/J 마우스의 관절염 스코어는 다음과 같이 점수를 매겼다.

0점

뒷발 : 홍반이 없으며 육안적으로 정상마우스 발과 차이가 없을 때 외관을 봐도 뼈의 모양이 깨끗하게 정상적으로 확인됨.

앞발 : 홍반이 없고, 정상 마우스 발과 차이가 없음

1점

뒷발 : 발가락 하나가 부었을 때 / 혹은 발바닥에 붓기 없이 확연한 홍반이 있을 경우/혹은 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 경미하게 부었을 경우.

앞발 : 발가락 하나가 부었을 때 / 혹은 발바닥에 붓기 없이 확연한 홍반이 있을 경우.

2점

뒷발 : (홍반동반) 발가락 두 개가 부었을 때 / 발가락 1~2개가 부었거나 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 살짝 둥글게 부었을 경우.

앞발 : (홍반동반) 발가락이 두 개가 부었을 때 / 발가락 1~2개가 부었거나 발목이 부었을 경우.

3점

뒷발 : (홍반동반) 발가락이 1~4개가 부었거나 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 전체적으로 부었을 때 / 종골의 모양이 거의 드러나지 않고 발등 발바닥 발뒤꿈치 발목까지 모두 부어서 염증성 부종으로 살짝 통통해 보임.

앞발 : (홍반동반) 발가락이 1~4개가 부었거나 발목부위에 염증성 조직의 증가로 발목이 두꺼워져 있음.

4점

뒷발 : 홍반이 거의 발전체 / 발가락 3개 이상 부었고 발이 전체적으로 부었고 홍반과 부종이 굉장히 심해지고 전체적으로 통통해짐.

앞발 : 홍반이 거의 발전체 / 발가락이 3개 이상 부었고 발목과 발이 전체적으로 부어서 움직임이 부자연스러워짐.

Incidence 평가는 마우스의 한발이 부었을 경우 25%로 네발이 모두 부었을 경우 100%로 평가하였다. 한 군당 최소 5마리의 마우스를 평가하여 평균을 냈다.

관절염 억제 효과

도 9는 자연 형태의 p40-EBI3 복합체 (nature) DNA 벡터에 의한 자가면역 관절염 동물 모델에서의 arthritis score 평가 결과를 나타낸 것으로, 대조에 비해 개선된 관절염 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 도 10은 최적 형태의 p40-EBI3 복합체 (opt1) DNA 벡터에 의한 자가면역 관절염 동물 모델에서의 arthritis score 및 incidence 평가 결과를 나타낸 것으로, 대조에 비해 관절염 억제 효과가 우수하고 관절염 발병율 또한 감소되었음을 확인할 수 있었다.

자가항체 억제 능력

p40-EBI3 복합체가 B 세포에서 발현되는 자가 항체의 생성을 억제 시켰는지, 평가하고자 p40-EBI3 complex가 주입된 마우스로부터 혈청을 분리한 후 type II collagen (CII)의 발현을 ELISA법을 이용하여 측정하였다.

도 11은 최적 형태의 p40-EBI3 복합체 (opt1)에 의한 자가항체 억제 능력을 나타낸 것으로, 대조군에 비해 항원 특이적 IgG의 발현을 현저하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.

관절 파괴 정도에 미치는 영향

p40-EBI3 복합체 (opt1) 처리에 따른 관절염 개선 정도를 분석하기 위하여 자가면역 관절염 마우스 동물 모델의 관절의 손상 정도를 조직학적 기법을 통해 검사하였다. 각 마우스의 뒷발을 10% 포르말린에 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 뒤 파라핀으로 블럭을 제조하였고 이로부터 관절 절편 (7um)를 얻어 헤마톡실린 (Hematoxylin)과 에오신 (Eosin) (H&E)으로 관절절편을 염색하고, 연골 파괴 정도를 확인하기 위하여 사프라닌 O (Safranin O) 염색을 하였다.

도 12는 H&E 염색 결과 및 IL-17, IL-1β 및 TNFα 발현을 나타낸 것으로, 대조군에 비해 관절파괴 정도가 경미하고, IL-17, IL-1β 및 TNFα 발현이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 도 13은 사프라닌 O 염색 결과 및 RANKL, HIF-1α 및 VEGF의 발현을 나타낸 것으로, 대조군에 비해 연골손상 정도가 경미하고, RANKL, HIF-1α 및 VEGF의 발현이 현저히 감소함을 알 수 있었다.

실시예 3: p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스에서의 효과

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스의 제작

pcDNA3.1⁺3xHA 벡터를 5‘ HindⅢ와 3’XbaⅠ으로 자른 뒤, 5‘ HindⅢ와 3’XbaⅠ으로 자른 p40-Linker-EBI3 를 ligation하였다. E. coli에 형질전환한 뒤 발생한 클론을 시퀀싱하여 insert가 제대로 들어간 클론을 선택하였다. 그런 다음, NIH3T3 세포에 트랜스펙션한 뒤 수득한 protein lysate에서 HA, p40, EBI3의 과발현을 확인하였다. 과발현이 가장 많이 된 클론을 선택하여 ES 세포에 트랜스펙션한 뒤 microinjection을 시행하여 C57BL/6 계통의 마우스로 과발현 마우스를 제작하였다. 그 결과 얻은 F0을 통해 얻은 F1에서 transgene을 확인하고 세대를 유지하였다. 과발현 벡터의 구조는 도 14a에 기재된 바와 같으며, 과발현 마우스를 제작하여 동물화 시킨 F0을 통해 얻은 F1에서 genotyping을 실시하여 transgene을 확인하였다 (Tg) (도 14b). genotyping에서 transgene을 확인한 마우스의 비장에서 단백질 발현을 확인하고자 WB을 진행하였으며, 과발현 마우스는 HA-tag가 된 모델이기 때문에 HA로 확인할 결과 p40-EBI3 complex를 확인하여 과발현을 확인하였다 (도 14c).

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스 내 p40-EBI3 복합체의 확인

과발현마우스에서 p40-EBI3 복합체가 실제로 과발현되고 있는지 확인하기 위해 공초점 현미경으로 HA-tag를 확인하였다. 과발현마우스는 HA-tag가 된 모델이기 때문에 HA로 확인한 결과 대조군인 C57BL/6 대비 HA 즉, p40-EBI3 복합체가 과발현 되어있음을 확인할 수 있었다 (도 15).

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스의 파골세포 분화 억제 조절

p40-EBI3 complex 과발현 마우스와 정상마우스의 골수를 분리하여 얻은 monocyte 계열의 세포를 M-CSF로 파골세포전구세포로 분화시킨 뒤 recombinant RANKL을 M-CSF와 함께 자극하여 얻은 파골세포에서 TRAP 양성세포들의 수와 파골 세포 분화 마커들의 RNA 발현 수준을 비교하였다.

그 결과 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, p40-EBI3 과발현 마우스에서 얻은 세포는 TRAP 양성세포들 수 (도 16의 상부) 및 파골 세포 분화 마커들의 RNA 발현 수준 (도 16의 하부)이 감소하여 파골세포로 분화가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다.

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스의 자가면역 관절염의 제어

p40-EBI3 complex 과발현 마우스의 in vivo 내 효력을 평가하기 위해 정상 C57BL/6와 과발현 마우스에 관절염을 유도하고 관절염 억제 효력을 평가하였다. 도 17 (a) 및 (b)에서 볼 수 있는 바와 같이, p40-EBI3 복합체 과발현 마우스는 대조군보다 관절염 억제 효과가 뛰어났으며, 관절염 발병율 또한 현저히 억제되었다.

관절염을 유도한지 4주된 마우스에서 얻은 혈청에서 IgG의 수준을 측정하였을 때 과발현 마우스의 경우 항체 생성이 감소하였다 (도 17의 (c)). 따라서 p40-EBI3 복합체가 많은 환경에서는 과도한 면역 반응 시 항체의 생성을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

관절염 유도 후 4주째의 마우스의 혈청에서 항체의 생성 감소를 확인하였는데 실제로 항체를 생성하는 B세포를 조절하는지 확인하고자 각 마우스에서 비장세포를 얻어서 B 세포를 확인하였다. 그 결과 도 17의 (d) 내지 (f)에서 볼 수 있는 바와 같이, p40-EBI3 복합체 과발현 마우스에서 항체생성에 중요한 GC B 세포 (B220⁺GL7⁺)가 감소하고, 항체를 생성하는 plasma B 세포 (B220^-CD138⁺)세포가 현저하게 감소되었음을 확인하였다.

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스에서의 T helper 세포의 발현 변화

T helper 세포의 분포를 확인하기 위하여 관절염 유도 후 마우스의 비장에서 세포를 분리한 뒤 FACs로 T helper 세포를 분석하였다. 그 결과 IFN-γ, IL-4, IL-17이 약간 감소하였고 Treg 세포는 약간 증가함을 확인하였다 (도 18).

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스에서의 이식거부질환의 제어

이식거부질환과 같은 면역 거부반응에 의한 질환에 있어서 p40-EBI3 복합체 과발현 마우스의 in vivo 내 효력을 평가하기 위해, p40-EBI3 복합체 과발현 마우스 세포를 이식한 후 이식편대숙주질환의 생존률을 측정하였다. 이를 위해 우선 이식편대숙주질환 (Graft-versus-Host Disease; GvHD) 모델을 제작하였는데, 수여자로써 BALB/c (H-2k/d) 마우스를 사용하고, 공여자로써 C57BL/6 (H-2kb) (질병 대조군) 또는 p40-EBI3 복합체 과발현 마우스 (H-2kb)를 사용하여, 골수이식 당일 날 호스트에 골수 박멸형 전 처치로 전신방사선조사 (Total body irradiation; TBI)을 800cGy 조사하고, 두 가지 공여마우스에서 분리 한 골수 세포 (5x10⁶)와 비장세포 (1x10⁷)를 꼬리 정맥에 주사하여 골수이식을 수행하였다. 그 결과 시간이 경과할수록 질병 대조군은 40일 이후 20% 이상의 마우스가 폐사한 반면, p40-EBI3 복합체 과발현 마우스의 세포를 이식받은 마우스는 70% 이상이 생존하고 있음이 관찰되었다 (도 19).

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스에서의 자가면역성 뇌척수염 (EAE)의 제어

정상 C57BL/6와 p40-EBI3 Tg 마우스에 MOG 펩타이드와 pertussis 톡신을 주입하여 뇌척수염을 유도하였다. 그런 다음 뇌척수염이 유도된 마우스의 임상적 증상에 따라 질환 정도를 평가하였다. 그 결과 p40-EBI3 Tg 마우스에서 뇌척수염 대조군 대비 질환이 20% 가량 감소된 것을 확인할 수 있었다 (도 20).

p40-EBI3 복합체 (opt1) 과발현 마우스에서의 염증성 장 질환의 제어

C57BL/6와 p40-EBI3 Tg 마우스에 DSS (Dextran Sodium Sulfate)를 주입하여 자가면역성 염증 장 질환을 유도하였고, 이때 감소되는 무게를 측정하였다. IBD대조군 대비 p40-EBI3 Tg 마우스군에서 몸무게의 감소가 20% 정도 덜 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 21b). 또한, 생존 정도를 평가하였을 때, p40-EBI3 Tg 군에서 IBD 대조군 대비 생존이 20% 이상 높은 것을 관찰할 수 있었다 (도 21a). DSS를 2.5%로 주고 자가면역성 염증성 장 질환을 약한 염증으로 유발했을 때도 p40-EBI3 과발현 마우스 군에서 몸무게가 덜 감소하였으며, 장 길이도 짧아지지 않음을 알 수 있었다 (도 21b).

제조예 2 : p40-EBI3-FC 복합체 (opt2)의 제조

HindⅢ와 NotⅠ으로 자른 링커 (3xGGGGS)-EBI3 단편을 과발현 벡터에 ligation하고 얻은 콜로니에서 다시 과벡터를 얻어 Hindlll로 자른 뒤 Hindlll로 자른 p40 단편을 ligation하였다. 수득된 콜로니에서 다시 벡터를 얻어 NotⅠ으로 자른 뒤 NotⅠ으로 자른 IgG-Fc 단편을 ligation하였다. 발현벡터 (도 1c)에 형질전환하여 콜로니를 얻어 벡터를 분리하여 얻은 DNA와 E. coli를 glycerol stock으로 보관하였다. 선별된 클론을 시퀀싱하여 서열번호 7 또는 8로 표시되는 유전자 서열을 갖는 DNA 서열을 확인하였다. 선택된 클론을 NIH3T3 세포에 형질도입한 뒤 3일 후 세포에서 단백질을 추출하고 이 단백질로 웨스턴 블롯을 진행하고 과발현이 확인된 클론을 선택하였다.

실시예 4 : p40-EBI3-FC 복합체 (opt2)의 자가면역 관절염 억제 효능

p40-EBI3-FC 복합체의 in vivo내 효력을 평가하고자 정상 DBA1/J 마우스에 관절염을 유도하고 제조예 2에서와 같이 제조된 p40-EBI3-FC 복합체 DNA 벡터를 주입하여 관절염 억제 효력을 실시예 2에 기재된 방법과 같이 평가하였다. 대조군으로 mock-Fc 벡터를 주입하였다.

관절염 억제 효과

도 22는 최적 형태의 p40-EBI3-FC 복합체 DNA 벡터에 의한 자가면역 관절염 동물 모델에서의 arthritis score 및 incidence 평가 결과를 나타낸 것으로, 대조에 비해 관절염 억제 효과가 뛰어났으며, 관절염 발병율 또한 20% 대로 억제한 것을 확인할 수 있었다.

자가항체 억제 능력

p40-EBI3-FC 복합체가 B 세포에서 발현되는 자가 항체의 생성을 억제시켰는지 평가하고자 p40-EBI3-FC 복합체 벡터가 주입된 마우스로부터 혈청을 분리한 후 type II collagen (CII)의 발현을 ELISA 법을 이용하여 측정하였다.

도 23은 p40-EBI3-FC 복합체에 의한 자가항체 억제 능력을 나타낸 것으로, 대조군에 비해 항원 특이적 IgG의 발현을 현저하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.

T 세포의 증식 억제 효과

T 세포 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 p40-EBI3-FC 복합체 벡터를 주입한 자가면역 관절염 마우스의 비장에서 세포를 분리하여 분리된 세포를 3일 동안 anti-CD3로 자극한 뒤 3H-thymidine 동위원소를 처리하여 증식 활성 정도를 평가하였다. 그 결과 p40-EBI3-FC 복합체 벡터가 삽입된 마우스의 경우 T 세포 증식이 대조군에 비해 확연히 감소하였음을 확인할 수 있었다 (도 24).

관절 파괴 정도에 미치는 영향

p40-EBI3-FC 복합체 벡터처리에 따른 관절염 개선 정도를 분석하기 위하여 관절염 마우스 동물 모델의 관절의 손상 정도를 조직학적 기법을 통해 검사하였다. 각 마우스의 뒷발을 10% 포르말린에 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 뒤 파라핀으로 블럭을 제조하였고 이로부터 관절 절편 (7 ㎛)를 얻어 헤마톡실린과 에오신으로 관절절편을 염색하였다. 또한 연골 파괴 정도를 확인하기 위하여 톨로이딘 블루와 사프라닌 O 염색을 하였다. 골파괴의 주범인 파골세포의 분화정도를 확인하기 위하여 TRAP도 염색도 실시하였다. 그 결과 도 25에서 볼 수 있는 바와 같이, p40-EBI3-FC 복합체를 주입한 마우스에서는 골파괴, 연골손상, 파골세포분화가 확연히 감소하여 p40-EBI3-FC가 관절파괴를 줄일 수 있음을 확인하였다.

염증성사이토카인, 관절파괴인자 및 신생혈관생성인자의 발현에 미치는 영향

p40-EBI3-FC 복합체가 염증성사이토카인, 관절파괴인자, 신생혈관생성인자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, p40-EBI3-FC 복합체 벡터를 주입한 관절염 마우스 동물모델의 관절에서 염증성 사이토카인, 관절파괴인자, 신생혈관생성인자의 발현을 IHC로 확인하였다. 그 결과 도 26에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군에서는 모두 과발현되어 있으며 p40-EBI3-FC 복합체 벡터를 삽입한 마우스의 경우 발현이 없는 것으로 확인할 수 있었다. 따라서 p40-EBI3-FC 복합체가 관절파괴 및 관절염 유도에 주된 역할을 하는 인자들의 발현을 억제시킴으로써 관절염의 촉진, 활성을 억제하는 것으로 확인되었다.

제조예 3: p40-EBI3-FC 복합체 (opt2) 단백질의 제조

p40-EBI3-FC 복합체 발현 세포 라인의 구축과 발현 세포의 선택

CHO-DG44 세포에 서열번호 7 또는 8로 표시되는 유전자 서열을 갖는 p40-EBI3-FC DNA vector를 형질도입하였다. 6시간 후 10% dialyzed FBS αMEM를 바꿔주고, 세포가 95% 이상 자라면 계대 배양을 진행하였다. 그런 다음 96 well plate에 단일 세포가 들어가도록 세포를 희석하고 플레이팅 하였다. 이들 세포를 배양한 후 배양액으로부터 p40-EBI3-FC 복합체를 높게 발현하는 세포를 선택해서 150mm dish로 옮겨 배양하였다. 배양 후 MTX를 농도 별로 처리하여, 살아남은 세포만을 선택하고 p40-EBI3-FC의 발현이 높은 세포들만 선택하여, p40-EBI3-FC 단백질을 선별하였다.

p40-EBI3-FC 복합체 단백질 정제

p40-EBI3-FC 발현이 높은 세포주를 CHO-DG44 세포 전용 배지로 3일 동안 배양한 후 배지를 수득하였다. HiTrap protein A HP column을 이용하여, 세포로부터 얻은 배지를 column 안에 넣어 주고 펌핑한 후 binding buffer를 흘려 주며, 마지막에 elute buffer를 넣고 펌핑하였다.

정제한 p40-EBI3-FC 복합체의 발현 확인

western blot 방법을 이용하였으며, anti-mouse IgG-Fc를 사용하여 정제된 p40-EBI3-FC 단백질을 확인하였다. 정제된 p40-EBI3-FC 의 농도에 따라 그 발현이 확인되었다 (도 27a).

정제한 p40-EBI3-FC 단백질을 SDS 전기영동 후 commassie blue 로 염색 한 뒤 gel을 잘라 제노마인(주)로 보내어 PMF (peptide mass fingerprinting)후 절단된 peptide들의 mass spectrum 분석을 위해 Ettan MALDI-ToF로 LC-MS/MS 시행하였다. 그 결과 EBI3, p40, Fc가 확인되어 단백질 발현이 정확함을 알 수 있었다 (도 27b).

정제한 p40-EBI3-FC 복합체의 endotoxin 측정

정제한 p40-EBI3-FC의 endotoxin 포함 여부를 측정하였다. LAL 측정법으로 endotoxin을 측정하였을 때 정제한 Protein 1 ㎍에서 0.15 EU/㎖ 이 특정되었고 이는 정상의 0.4 EU/㎖보다도 낮으며 < 1.0 EU/㎖ 이하인 시판 재조합 단백질의 endotoxin level보다도 낮았다.

실시예 5 : p40-EBI3-FC 복합체 (opt2) 단백질에 의한 염증성 사이토카인 억제

T 세포 및 non T 세포에서의 염증성 사이토카인의 억제

p40-EBI3-FC를 과발현 시킨 CHO-DG44 cell의 3일 배양한 배지를 HiTrap protein A HP column으로 정제한 후, 제조예 3의 정제된 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 처리하여 CD4 T 세포와 non T 세포에서 실험을 수행하였다. p40-EBI3-FC 복합체 단백질의 효과를 검증하고자 EBI3 서브유닛이 포함된 IL-27과 IL-12에 포함된 p40 서브유닛 그리고 IL-12의 2개의 p40 사슬로 이루어진 이황화로 결합된 동종이량체인 p80를 대조군으로 사용하였다.

도 28은 CD4 T 세포에서 p40-EBI3-FC 복합체 단백질의 IL-17 및 IFN-γ의 억제 효과를 나타낸 것이고, 도 29는 non T 세포에서 p40-EBI3-FC 복합체 단백질의 IL-6 및 TNF-α의 억제 효과를 나타낸 것이다. CD4 T 세포에서 면역 반응 활성 조건으로 anti-CD3 0.5 ㎍/㎖ 자극하여 실험을 한 결과 anti-CD3 단독 대비 p40-EBI3-FC 단백질 처리 조건에서 IL-17 및 IFN-γ가 감소함을 보여주었으며 대조군과 비교했을 때도 효과가 있음을 보여주었으며, 같은 방법으로 non T 세포에서 면역 반응 활성 조건으로 LPS를 자극하여 실험을 한 결과 LPS 단독 대비 IL-6 및 TNF-α의 억제 효과를 나타냈다.

비장세포에서의 염증성 사이토카인의 억제

DBA1/J 정상 마우스의 비장에서 세포를 분리한 후 LPS 100 ng/㎖ 의 농도로 처리하고, 이때 제조예 3에서와 같이 제조한 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 0.01, 0.1, 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 LPS에 의해서 발현되는 염증성 사이토카인의 억제 효과를 관찰하였다. 도 30에서 볼 수 있는 바와 같이 p40-EBI3-FC 복합체 단백질은 농도 의존적으로 염증성 사이토카인의 발현을 억제하였으며, 특히 IL-6, IL-17 염증성 사이토카인의 발현을 현저하게 억제시켰다.

실시예 6 : p40-EBI3-FC 복합체 (opt2) 단백질에 의한 Th17-Treg 세포 활성 조절

조절 T 세포 분화에 p40-EBI3-FC의 효력을 평가하기 위해 각 T helper 세포로 분화시키는 조건 하 (표 1)에 p40-EBI3-FC 1 ㎍/㎖의 농도로 함께 처리하였다.

그런 다음 각 T helper의 분화는 억제되고 이와 동시에 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포의 발현을 증가시키는지를 관찰하였다.

도 31에서 볼 수 있는 바와 같이, p40-EBI3-FC 복합체 단백질은 Treg 분화 조건에서 Foxp3를 발현하는 세포를 현저하게 증가시켰으며, 특히 Th17 세포 분화 조건에서 Foxp3를 발현하는 세포의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 병인 세포가 분화되는 환경에서 p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 그 병인 세포의 분화를 억제하고, Foxp3를 발현하는 세포로 분화시킬 수 있는 것으로 추측된다.

또한 Th17 세포 분화 조건에서 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 처리한 세포에서 IL-17를 생성하고 있는 세포가 의미 있게 감소하였고 오히려 Treg으로의 분화가 촉진됨을 확인할 수 있었다. 따라서 p40-EBI3-FC 복합체 단백질은 병인세포는 감소시키고 면역조절세포는 증가시키는 기능을 할 수 있다.

실시예 7 : p40-EBI3-FC 복합체 (opt2) 단백질에 의한 파골 세포 분화 제어

자가면역 관절염과 같은 자가면역 질환에서 파골 세포의 분화는 병인 반응의 한 과정이므로, p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 파골 세포의 분화를 억제할 수 있는 효력이 있는지를 평가하였다. 자가면역 관절염 동물 모델로부터 골수를 분리하여, 파골 세포를 유도하였으며, 이때 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 처리하여, 파골 세포의 분화 정도를 확인하였다. 도 32에서 볼 수 있는 바와 같이, 파골 세포의 분화는 p40-EBI3-FC 복합체 단백질의 농도 의존적으로 억제되었으며, 100 ng/㎖의 농도에서는 파골 세포의 분화가 현저하게 억제되었다. 이러한 결과는 p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 염증성 사이토카인의 발현뿐만 아니라 자가면역 관절염 동물 모델의 파골 세포 분화의 병인 반응을 조절할 수 있음을 확인시켜주는 것이다. 또한 파골 세포의 분화 마커인 TRAP과 활성 전사 인자 NFATc1의 유전자 또한 p40-EBI3-FC 복합체 단백질에 의해 농도 의존적으로 현저하게 억제되었다 (도 32).

실시예 8 : p40-EBI3-FC 복합체 (opt2) 단백질에 의한 자가면역 관절염의 제어

p40-EBI3-FC 복합체 단백질에 의한 자가면역 관절염의 억제

p40-EBI3-FC 복합체 단백질의 in vivo 내 효력을 평가하고자 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 관절염 유도 시 주입하였다. 그 결과 도 33에서 볼 수 있는 바와 같이 p40-EBI3-FC 복합체 단백질은 관절염 억제 효과를 보였으며 이는 생체 내에서 p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 효과적으로 작용할 수 있음을 보여주는 결과이다. 질환 발병율 또한 현저하게 억제된 것을 확인할 수 있었다.

p40-EBI3-FC 복합체 단백질에 의한 자가항체 억제

p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 B 세포에서 발현되는 자가 항체의 생성을 억제시키는지를 평가하기 위해, p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 주입된 마우스로부터 혈청을 분리하고, type II collagen (CII)의 발현을 ELISA법을 이용하여 측정하였다. 도 34에서 볼 수 있는 바와 같이 p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 항원 특이적 IgG의 발현을 현저하게 억제시킴을 확인하였다.

p40-EBI3-FC 복합체 단백질에 의한 T 세포 증식 억제

T 세포 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 주입한 자가면역 관절염 마우스의 비장에서 세포를 분리하여 분리된 세포를 3일 동안 anti-CD3로 자극한 뒤 3H-thymidine 동위원소를 처리하여 증식 활성 정도를 평가하였다. 도 35에서 볼 수 있는 바와 같이, p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 T 세포의 증식 분화를 억제시킴을 확인할 수 있었다.

p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 관절 파괴 정도에 미치는 영향

p40-EBI3-FC 복합체 단백질 처리에 따른 관절염 개선 정도를 분석하기 위하여, 관절염 마우스 동물 모델에 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 주입한 후 관절의 손상 정도를 조직학적 기법을 통해 검사하였다. 각 마우스의 뒷발을 10% 포르말린에 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 뒤 파라핀으로 블럭을 제조하였고 이로부터 관절 절편 (7 ㎛)를 얻어 헤마톡실린과 에오신으로 관절절편을 염색하였다. 또한 연골 파괴 정도를 확인하기 위하여 톨로이딘 블루와 사프라닌 O 염색을 하였다. 골파괴의 주범인 파골세포의 분화정도를 확인하기 위하여 TRAP 염색도 실시하였다. 그 결과 도 36에서 볼 수 있는 바와 같이, p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 주입한 마우스에서는 골파괴, 연골손상, 파골세포분화가 확연히 감소하여 p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 관절파괴를 줄일 수 있음을 알 수 있었다.

p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 염증성 사이토카인, 관절파괴인자, 신생혈관생성인자의 발현에 미치는 영향

p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 염증성 사이토카인, 관절파괴인자, 신생혈관생성인자의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 관절염 마우스 동물모델에 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 주입한 후, 관절에서 염증성 사이토카인, 관절파괴인자, 신생혈관생성인자의 발현을 IHC로 확인하였다. 그 결과 도 37에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군에서는 모두 과발현된 반면, p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 주입한 마우스의 경우 발현이 없는 것으로 확인되었다. 따라서 p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 관절파괴 및 관절염 유도에 주된 역할을 하는 인자들의 발현을 억제시킴으로써 관절염의 촉진, 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9 : 마우스 p40-EBI3 복합체 단백질 정량 시스템 확립

마우스 p40-EBI3 복합체를 정량할 수 있는 ELISA 시스템을 수립하기 위하여, 상기 제조예 3에서 제조한 마우스 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 마우스 p40-EBI3-FC 복합체 ELISA 키트의 표준물질로 이용할 수 있는지 확인하고자 도 38과 같은 방법으로 Sandwich ELISA 방법을 수행하였다. 이때, capture 항체로 EBI3 항체를 이용하고 detection 항체로 p40 항체를 이용하였다. 구체적으로, 코팅 버퍼에 capture EBI3 AB (200ng 내지 20ug)를 녹여 96-웰 플레이트에 50ul씩 넣어 2시간 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척하였고, 블로킹 버퍼를 200ul 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척하였고, 표준물질로 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을, 시료를 50ul씩 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척하였고, Detection p40 AB (20ng 내지 2ug)를 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척하고, AP(Alkaline phosphatase)를 1:2000으로 희석하여 50ul씩 넣고 2시간 동안 상온 반응시키거나, HRP(horseradish peroxidase)를 1:40으로 희석하여 50ul씩 넣고 빛을 차단 하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척한 뒤, 상기에서 AP를 이용한 경우에는 DEA 중의 PNPP 버퍼를 50ul씩 넣고 발색시켰으며, 상기에서 HRP를 이용한 경우에는 TMB를 50ul 넣은 후 발색을 확인하고 정지 용액(stop solution)을 50ul 넣어 반응을 정지시켰다. 그 후, AP를 이용한 경우에는 405nm에서, HRP를 이용한 경우에는 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기와 같이 표준물질 5ng/ml을 start point로 ½ 희석하여 실험 진행한 결과, R^² 값이 1에 가까운 0.995가 나왔으므로 (도 39), 본 발명에서 제조한 p40-EBI3-FC 복합체 단백질이 p40-EBI3 복합체를 정량할 수 있는 표준물질이 될 수 있음을 확인할 수 있었다.

제조예 4 : 인간 p40-EBI3 복합체의 제조

최적의 인간 p40-EBI3 복합체 형태를 제조하기 위해, p40-Linker (3xGGGGS)-EBI3 형태의 복합체를 genscript에서 최적화하였다. 수득된 cDNA를 HindIII, XbaI로 자른 뒤 같은 enzyme site로 자른 발현 벡터인 p3xFLAG-CMV-10 벡터에 ligation 한 후 형질전환하여 콜로니를 얻어 클론을 선택하였다. 선별된 클론은 벡터를 분리해 얻은 DNA를 시퀀싱하여 최종 클론을 확보하였다. DNA 서열을 확인한 클론은 Hek293 세포에 형질도입한 뒤 3일 후 세포에서 단백질을 추출하고 이 단백질로 western blot을 진행하여 발현 확인된 최종 클론을 선택하였다.

Hek293 세포에 과발현 벡터를 제조하여 트랜스펙션을 진행하였다. 트랜스펙션 다음날 배지를 교체한 후 2일 뒤 상층액을 수확하였으며, 그 상층액으로 ELISA를 시행하여 과발현을 확인했을 때 월등히 높은 p40-EBI3 복합체를 확인하였다 (도 41). 제조된 인간 p40-EBI3 복합체를 인코딩하는 염기서열은 서열번호 10 및 11에 기재된 염기서열을 가지며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 12의 서열을 갖는다(도 6a 내지 6c).

실시예 10 : 인간 p40-EBI3 복합체 단백질 정량 시스템 확립

인간 p40-EBI3 복합체를 정량할 수 있는 ELISA 시스템을 수립하기 위하여, 상기 제조예 4에서 제조한 인간 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을 인간 p40-EBI3-FC 복합체 ELISA 키트의 표준물질로 이용할 수 있는지 확인하고자 도 38과 같은 방법으로 Sandwich ELISA 방법을 수행하였다. 이때, capture 항체로 EBI3 항체를 이용하고 detection 항체로 p40 항체를 이용하였다. 구체적으로, 코팅 버퍼에 capture EBI3 AB (200ng 내지 20ug)를 녹여 96-웰 플레이트에 50ul씩 넣어 2시간 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척하였고, 블로킹 버퍼를 200ul 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼300ul로 3회 세척하였고, 표준물질로 p40-EBI3-FC 복합체 단백질을, 시료를 50ul씩 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척하였고, Detection p40 AB (20ng 내지 2ug)를 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척하고, AP(Alkaline phosphatase)를 1:2000으로 희석하여 50ul씩 넣고 2시간 동안 상온 반응시키거나, 혹은 HRP(horseradish peroxidase)를 1:40으로 희석하여 50ul씩 넣고 빛을 차단 하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후 워싱 버퍼 300ul로 3회 세척한 뒤, 상기에서 AP를 이용한 경우에는 DEA 중의 PNPP 버퍼를 50ul씩 넣고 발색시켰으며, 상기에서 HRP를 이용한 경우에는 TMB를 50ul 넣은 후 발색을 확인하고 정지 용액(stop solution)을 50ul 넣어 반응을 정지시켰다. 그 후, AP를 이용한 경우에는 405nm에서, HRP를 이용한 경우에는 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CATHOLIC INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> p40-EBI3 composite and use thereof <130> PN1609-323 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1763 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p40-EBi3 complex <400> 1 aagcttgaat tcatgtgtcc tcagaagcta accatctcct ggtttgccat cgttttgctg 60 gtgtctccac tcatggccat gtgggagctg gagaaagacg tttatgttgt agaggtggac 120 tggactcccg atgcccctgg agaaacagtg aacctcacct gtgacacgcc tgaagaagat 180 gacatcacct ggacctcaga ccagagacat ggagtcatag gctctggaaa gaccctgacc 240 atcactgtca aagagtttct agatgctggc cagtacacct gccacaaagg aggcgagact 300 ctgagccact cacatctgct gctccacaag aaggaaaatg gaatttggtc cactgaaatt 360 ttaaaaaatt tcaaaaacaa gactttcctg aagtgtgaag caccaaatta ctccggacgg 420 ttcacgtgct catggctggt gcaaagaaac atggacttga agttcaacat caagagcagt 480 agcagttccc ctgactctcg ggcagtgaca tgtggaatgg cgtctctgtc tgcagagaag 540 gtcacactgg accaaaggga ctatgagaag tattcagtgt cctgccagga ggatgtcacc 600 tgcccaactg ccgaggagac cctgcccatt gaactggcgt tggaagcacg gcagcagaat 660 aaatatgaga actacagcac cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc agacccgccc 720 aagaacttgc agatgaagcc tttgaagaac tcacaggtgg aggtcagctg ggagtaccct 780 gactcctgga gcactcccca ttcctacttc tccctcaagt tctttgttcg aatccagcgc 840 aagaaagaaa agatgaagga gacagaggag gggtgtaacc agaaaggtgc gttcctcgta 900 gagaagacat ctaccgaagt ccaatgcaaa ggcgggaatg tctgcgtgca agctcaggat 960 cgctattaca attcctcatg cagcaagtgg gcatgtgttc cctgcagggt ccgatccggc 1020 ggcggcggct ctggcggcgg cggctctggc ggcggcggct ctatgtccaa gctgctcttc 1080 ctgtcacttg ccctctgggc cagccgctcc cctggttaca ctgaaacagc tctcgtggct 1140 ctaagccagc ccagagtgca atgccatgct tctcggtatc ccgtggccgt ggactgctcc 1200 tggactcctc tccaggctcc caactccacc agatccacgt ccttcattgc cacttacagg 1260 ctcggtgtgg ccacccagca gcagagccag ccctgcctac aacggagccc ccaggcctcc 1320 cgatgcacca tccccgacgt gcacctgttc tccacggtgc cctacatgct aaatgtcact 1380 gcagtgcacc caggcggcgc cagcagcagc ctcctagcct ttgtggctga gcgaatcatc 1440 aagccggacc ctccggaagg cgtgcgcctg cgcacagcgg gacagcgcct gcaggtgctc 1500 tggcatcccc ctgcttcctg gcccttcccg gacatcttct ctctcaagta ccgactccgc 1560 taccggcgcc gaggagcctc tcacttccgc caggtgggac ccattgaagc cacgactttc 1620 accctcagga actcgaaacc ccatgccaag tattgcatcc aggtgtcagc tcaggacctc 1680 acagattatg ggaaaccaag tgactggagc ctccctgggc aagtagaaag tgcaccccat 1740 aagccctgac tcgaggcggc cgc 1763 <210> 2 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p40-EBi3 complex <400> 2 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 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cagctacttc agcctgaagt tctttgtgag aatccagaga 840 aagaaggaga agatgaagga gaccgaggag ggctgcaacc agaagggcgc cttcctggtg 900 gagaagacca gcaccgaggt gcagtgcaag ggcggcaacg tgtgcgtgca ggcccaggac 960 agatactaca acagcagctg cagcaagtgg gcctgcgtgc cctgcagagt gagaagcaag 1020 cttggaggcg gaggttctgg tggaggcgga agtggcggag gaggttctac agagaccgct 1080 ctggtggccc tgagccagcc cagagtgcag tgccacgcca gcagataccc cgtggccgtg 1140 gactgcagtt ggacacccct gcaggctccc aacagcacca gaagcaccag cttcatcgct 1200 acctacagac tgggagtggc tacccagcaa cagagccagc cctgcctgca gagaagcccc 1260 caggccagca gatgcaccat ccccgacgtg cacctgttca gcaccgtgcc ctacatgctg 1320 aacgtgaccg ccgtgcaccc cggaggtgcc agctccagcc tgctggcctt cgtggccgag 1380 agaatcatca agcccgaccc tcccgagggc gtgagactga gaaccgccgg acagagactg 1440 caggtgctgt ggcacccacc cgccagttgg cccttccccg acatcttcag cctgaagtac 1500 agactgagat acagacggag aggagccagc cacttcagac aggtgggacc catcgaggcc 1560 acaaccttca ccctgagaaa cagcaagccc cacgccaagt actgcatcca ggtgagcgcc 1620 caggacctga ccgactacgg caagcccagc gactggagcc tgcccggaca ggtggagagc 1680 gcccctcaca aggcggccgc ggacaagaag atcgtgccca gagactgcgg ctgcaagccc 1740 tgcatctgca ccgtgcccga ggtgagcagc gtgttcatct tccctcccaa gcccaaggac 1800 gtgctgacca tcaccctgac ccccaaggtg acctgcgtgg tggtggacat cagcaaggac 1860 gaccccgagg tgcagttcag ctggttcgtg gacgacgtgg aggtgcacac cgcccagacc 1920 aagcccagag aggagcagtt caacagcacc ttcagaagcg tgagcgagct gcccatcatg 1980 caccaggact ggctgaacgg caaggagttc aagtgcagag tgaacagcgc tgccttcccc 2040 gctcccatcg agaagaccat cagcaagacc aagggcagac ccaaggcccc ccaggtgtac 2100 accatccccc ctcccaagga gcagatggcc aaggacaagg tgagcctgac ctgcatgatc 2160 accgacttct ttcccgagga catcaccgtg gagtggcagt ggaacggcca gcccgccgag 2220 aactacaaga acacccagcc catcatggac accgacggca gctacttcgt gtacagcaag 2280 ctgaacgtgc agaagagcaa ctgggaggcc ggcaacacct tcacctgcag cgtgctgcac 2340 gagggcctgc acaaccacca caccgagaag agcctgagcc acagccccgg caagtgatcc 2400 caggcggccg c 2411 <210> 9 <211> 794 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p40-EBi3-Fc complex <400> 9 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Leu 325 330 335 Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 340 345 350 Thr Glu Thr Ala Leu Val Ala Leu Ser Gln Pro Arg Val Gln Cys His 355 360 365 Ala Ser Arg Tyr Pro Val Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr Pro Leu Gln 370 375 380 Ala Pro Asn Ser Thr Arg Ser Thr Ser Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu 385 390 395 400 Gly Val Ala Thr Gln Gln Gln Ser Gln Pro Cys Leu Gln Arg Ser Pro 405 410 415 Gln Ala Ser Arg Cys Thr Ile Pro Asp Val His Leu Phe Ser Thr Val 420 425 430 Pro Tyr Met Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Gly Gly Ala Ser Ser 435 440 445 Ser Leu Leu Ala Phe Val Ala Glu Arg Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro 450 455 460 Glu Gly Val Arg Leu Arg Thr Ala Gly Gln Arg Leu Gln Val Leu Trp 465 470 475 480 His Pro Pro Ala Ser Trp Pro Phe Pro Asp Ile Phe Ser Leu Lys Tyr 485 490 495 Arg Leu Arg Tyr Arg Arg Arg Gly Ala Ser His Phe Arg Gln Val Gly 500 505 510 Pro Ile Glu Ala Thr Thr Phe Thr Leu Arg Asn Ser Lys Pro His Ala 515 520 525 Lys Tyr Cys Ile Gln Val Ser Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly Lys 530 535 540 Pro Ser Asp Trp Ser Leu Pro Gly Gln Val Glu Ser Ala Pro His Lys 545 550 555 560 Ala Ala Ala Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 565 570 575 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 580 585 590 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 595 600 605 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 610 615 620 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu 625 630 635 640 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 645 650 655 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 660 665 670 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 675 680 685 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 690 695 700 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 705 710 715 720 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 725 730 735 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 740 745 750 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 755 760 765 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 770 775 780 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 785 790 <210> 10 <211> 1716 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human p40-EBi3 complex <400> 10 atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60 gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120 gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180 accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240 gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300 ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360 aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420 acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480 ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540 agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600 gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660 gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720 ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780 acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840 agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900 cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960 gaatgggcat ctgtgccctg cagtggaggc ggaggttctg gtggaggcgg aagtggcgga 1020 ggaggttcta tgaccccgca gcttctcctg gcccttgtcc tctgggccag ctgcccgccc 1080 tgcagtggaa ggaaagggcc cccagcagct ctgacactgc cccgggtgca atgccgagcc 1140 tctcggtacc cgatcgccgt ggattgctcc tggaccctgc cgcctgctcc aaactccacc 1200 agccccgtgt ccttcattgc cacgtacagg ctcggcatgg ctgcccgggg ccacagctgg 1260 ccctgcctgc agcagacgcc aacgtccacc agctgcacca tcacggatgt ccagctgttc 1320 tccatggctc cctacgtgct caatgtcacc gccgtccacc cctggggctc cagcagcagc 1380 ttcgtgcctt tcataacaga gcacatcatc aagcccgacc ctccagaagg cgtgcgccta 1440 agccccctcg ctgagcgcca gctacaggtg cagtgggagc ctcccgggtc ctggcccttc 1500 ccagagatct tctcactgaa gtactggatc cgttacaagc gtcagggagc tgcgcgcttc 1560 caccgggtgg ggcccattga agccacgtcc ttcatcctca gggctgtgcg gccccgagcc 1620 aggtactacg tccaagtggc ggctcaggac ctcacagact acggggaact gagtgactgg 1680 agtctccccg ccactgccac aatgagcctg ggcaag 1716 <210> 11 <211> 1788 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human p40-EBi3 complex <400> 11 atgtgccatc agcagctcgt catttcctgg ttcagcctgg tgttcctcgc aagtccactg 60 gtcgctattt gggagctcaa gaaagacgtg tacgtggtcg agctggactg gtatccagat 120 gcccccgggg aaatggtggt cctgacttgc gacacccctg aggaagatgg tatcacatgg 180 actctggacc agagctccga agtgctcggc tccggaaaga ccctgacaat tcaggtcaaa 240 gagttcgggg atgctggcca gtacacatgt cacaagggcg gagaagtgct gagccactcc 300 ctgctcctgc tccataagaa agaggacggc atctggtcca cagacattct caaggatcag 360 aaagagccaa agaacaaaac tttcctgcga tgcgaagcca agaattactc tggaaggttt 420 acctgttggt ggctcaccac aatctcaaca gacctgactt tcagcgtgaa gtctagtcgc 480 gggtcatctg atccacaggg agtcacatgt ggagcagcta ctctgagcgc cgagagggtg 540 agaggcgaca acaaggagta cgaatatagc gtcgagtgcc aggaagattc cgcttgtccc 600 gcagccgagg aatccctccc tatcgaggtc atggtggacg cagtgcacaa gctgaaatac 660 gaaaactaca catcctcttt ctttattcgc gacatcatta agcctgatcc ccctaaaaac 720 ctccagctga agccactgaa aaattccagg caggtcgagg tgtcttggga atacccagat 780 acctggagca caccccatag ctatttctcc ctgacctttt gcgtccaggt gcagggcaag 840 agtaaacgcg agaagaaaga ccgagtgttc actgataaga cctccgccac agtcatctgt 900 cggaaaaacg catctattag tgtgagagcc caggaccggt actatagttc aagctggtcc 960 gagtgggctt ctgtgccttg tagtgaattc gggggtggcg gatccggagg tggaggatct 1020 ggaggtggag gatccatgac cccacagctg ctcctggctc tcgtgctgtg ggcatcttgc 1080 ccaccctgta gtggccgcaa gggacctcca gctgcactca cactgccccg agtgcagtgc 1140 agggctagta gataccctat cgcagtcgat tgttcatgga ctctgccccc tgcacccaac 1200 tcaaccagcc ccgtgagctt catcgccaca tataggctgg ggatggccgc tagaggtcac 1260 agctggcctt gcctgcagca gactccaacc tccacatctt gtactatcac cgacgtgcag 1320 ctcttttcta tggcccccta cgtcctgaat gtgactgctg tccacccatg gggctcctct 1380 agttcattcg tgccctttat taccgagcat atcattaagc ctgatccacc cgaaggcgtg 1440 cggctcagcc ctctggctga gagacagctg caggtccagt gggaacctcc aggatcatgg 1500 ccattccccg aaatctttag cctgaagtac tggattcggt ataaaagaca gggagcagca 1560 agattccaca gggtgggacc aatcgaggcc acatccttta ttctgagggc cgtgcggcca 1620 cgcgctcgat actatgtcca ggtggctgca caggacctga ctgattacgg ggagctctct 1680 gactggagtc tgccagccac agctactatg tctctcggga agcagggtct cgaggaaccc 1740 aagagttgcg ataaaaccca tacatgcccc ccttgtcctg ccccagaa 1788 <210> 12 <211> 572 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human p40-EBi3 complex <400> 12 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 325 330 335 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Thr Pro Gln Leu Leu Leu Ala Leu 340 345 350 Val Leu Trp Ala Ser Cys Pro Pro Cys Ser Gly Arg Lys Gly Pro Pro 355 360 365 Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro 370 375 380 Ile Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr 385 390 395 400 Ser Pro Val Ser Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg 405 410 415 Gly His Ser Trp Pro Cys Leu Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys 420 425 430 Thr Ile Thr Asp Val Gln Leu Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn 435 440 445 Val Thr Ala Val His Pro Trp Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe 450 455 460 Ile Thr Glu His Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu 465 470 475 480 Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly 485 490 495 Ser Trp Pro Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr 500 505 510 Lys Arg Gln Gly Ala Ala Arg Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala 515 520 525 Thr Ser Phe Ile Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val 530 535 540 Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp 545 550 555 560 Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly Lys 565 570

Claims (20)

1. p40 서브유닛 및 EBI3 서브유닛이 링커에 의해 연결되어 형성된 복합체로서,
   상기 복합체는 B 세포에서 발현되는 자가 항체의 생성을 억제하고,
   염증성 사이토카인인 IL-17, IL-1β, TNFα, IFN-γ 발현 감소시키고,
   관절파괴인자인 RANKL, HIF-1α 및 VEGF의 발현 감소시키고,
   엔도톡신(endotoxin)을 감소시키며, Treg 세포는 증가시키는
   이종이량체인 것인, 복합체로서,
   상기 복합체는, 면역글로불린 모이어티를 포함하며,
   상기 면역글로불린 모이어티를 포함하는 복합체는, 서열번호 7 또는 8로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 복합체.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 면역글로불린 모이어티는 Fc 단편인 것인 복합체.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 면역글로불린 모이어티는 EBI3 서브유닛에 연결된 것인 복합체.
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열번호 7 또는 8의 유전자 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
10. 제 9 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
11. 제 10 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
12. 제 1 항의 복합체를 포함하는 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
13. 삭제
14. 제 10 항의 벡터를 포함하는 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제

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