JP6749235B2 - Ｇｌｐ−１ｒに特異的に結合する抗体およびそのｇｌｐ−１との融合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、抗体の技術分野に関し、特に、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体およびそのＧＬＰ−１との融合タンパク質に関する。

２型糖尿病の典型的な症状は次の３つの側面を含む：１）末梢のインスリン抵抗性、主にインスリンに対する骨格および筋肉の感受性が低下し、これらの組織へのグルコースの輸送が影響を受ける（非特許文献１、非特許文献２）、２）過度の肝臓グルコース産生、インスリンの反応性に対する肝細胞の調節の低下（非特許文献１、非特許文献３）およびグルカゴンの過度の分泌（非特許文献４）、３）ランゲルハンス島β細胞失調、疾患の初期に、β細胞の増殖およびインスリン分泌量の増加により、血糖に対するインスリン抵抗性の影響が代償的に補われる（非特許文献５）が、時間の経過およびインスリン抵抗性の程度の増加に伴い、β細胞が疲弊し、それに伴いインスリン分泌が低下し、２型糖尿病に至る（非特許文献６、非特許文献７）。

グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、３０個のアミノ酸を含むペプチドである。ＧＬＰ−１は、グルコースの取り込みに反応して、腸内のＬ細胞から分泌される（非特許文献８、非特許文献９）。刺激による分泌の後、ＧＬＰ−１が膵臓のＧＬＰ−１Ｒ（グルカゴン様ペプチド−１受容体）と結合し、下流のアデニル酸シクラーゼシグナル伝達経路を活性化し、インスリンの合成および分泌を促進する。ＧＬＰ−１の分泌は、さらに胃排出を減少させ、これにより食物の消化後に循環系に入るグルコースの量を減少させる（非特許文献１０）。マウスならびに１型および２型糖尿病患者において、ＧＬＰ−１は、インスリンの分泌を増加させ、血糖値を低下させた（非特許文献１１、非特許文献１２）。ある研究では、ＧＬＰ−１は、さらに膵β細胞のアポトーシスを抑制し、その増殖を促進することが示されている（非特許文献１３、非特許文献１４）。臨床では、ＧＬＰ−１による糖尿病患者の治療の実現可能性および効果がすでに実証されており（非特許文献１５）、ＧＬＰ−１およびその誘導体を使用して糖尿病を治療する方法を記載した特許もすでにある（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、ＧＬＰ−１のインビボでの半減期は短く、治療効果は良好でない。

米国特許第５，８９９，８８３号明細書 米国特許第６，９８９，１４８号明細書 国際公開第００／１６７９７号パンフレット 国際公開第９８／０８５３１号パンフレット 国際公開第９８／１９６９８号パンフレット 米国特許第６，００６，７５３号明細書 国際公開第９９／６４０６０号パンフレット 国際公開第００／０７６１７号パンフレット

Ｋａｈｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｆｉｎｅ，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ（１９９３）７：９２−１０５ Ｗｅｙｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９９）１０４：７８７−７９４ Ｌａｍら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．（２００９）１１：３７５−３７８ Ｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｏｒｃｉ，Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．（１９７７）１３７：４８２−４９１ Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．（２０００）１１：３７５−３７８ ＤｅＦｒｏｎｚｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（１９８８）３７：６６７−６８７ Ｋａｈｎら、Ｊ Ｎｕｔｒ．（２００１）１３１：３５４Ｓ−３６０Ｓ Ｏｒｓｋｏｖら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ （１９９４）４３：５３５−５３９ Ｄｒｕｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：３４３１−３４３８ Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎら、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．（１９９３）３８：６６５−６７３ Ｎａｕｃｋら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（１９９７）１０５：１８７−１９５ Ｔｏｄｄら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９７）２７：５３３−５３６ Ｐｅｒｆｅｔｔｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０００）１４１：４６００−４６０５ Ｈｕｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００３）１４４：１４４４−１４５５ Ｓａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｇａｒｂｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．（２０１３）２０：８７−９７

本発明の目的の１つは、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体を提供することである。

本発明の第２の目的は、ＧＬＰ−１のインビボでの半減期を延長させ、ＧＬＰ−１の生物学的活性を保つことが可能な、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体がＧＬＰ−１と形成する融合タンパク質を提供することである。また、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体により形成される融合タンパク質は、抗体により提供される分子標的性を有する。さらに抗体の免疫原性も他の融合パートナータンパク質より低い。

上記技術的課題を解決するため、本発明では以下の技術的解決策を提供する。
以下のa、ｂ及びｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．配列番号４６〜配列番号５３、またはこの配列との差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ３配列、好ましくは、配列番号４６〜配列番号５３、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ３配列、より好ましくは、配列番号４６〜配列番号５３、またはこの配列との差が合計で１個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｂ．配列番号２０〜配列番号２７、またはこの配列との差が合計で４個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ３配列、好ましくは、配列番号２０〜配列番号２７、またはこの配列との差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ３配列、より好ましくは、配列番号２０〜配列番号２７、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ３配列、さらに好ましくは、配列番号２０〜配列番号２７、またはこの配列との差が合計で１個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ３配列、
及び
ｃ．（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列。

好ましくは、前記抗体は、以下のa、ｂ、ｃおよびｄのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体である：
ａ．配列番号２８〜配列番号３７、またはこの配列との差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ１配列、好ましくは、配列番号２８〜配列番号３７、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ１配列、より好ましくは、配列番号２８〜配列番号３７、またはこの配列との差が合計で１個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｂ．配列番号３８〜配列番号４５、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ２配列、好ましくは、配列番号３８〜配列番号４５、またはこの配列との差が合計で１個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ２配列、
ｃ．配列番号６〜配列番号１２、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ１配列、好ましくは、配列番号６〜配列番号１２、またはこの配列との差が合計で１個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ１配列、
ｄ．配列番号１３〜配列番号１９、またはこの配列との差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ２配列、好ましくは、配列番号１３〜配列番号１９、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ２配列、より好ましくは、配列番号１３〜配列番号１９、またはこの配列との差が合計で１個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ２配列。

以下のa、ｂおよびｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．以下のｉ、ｉｉおよびｉｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号２８〜配列番号３７のうちの１つの軽鎖ＣＤＲ１配列；
ｉｉ．配列番号３８〜配列番号４５のうちの１つの軽鎖ＣＤＲ２配列；
ｉｉｉ．配列番号４６〜配列番号５３のうちの１つの軽鎖ＣＤＲ３配列；
ｂ．以下のｉ、ｉｉおよびｉｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、重鎖可変領域：
ｉ．配列番号６〜配列番号１２のうちの１つの重鎖ＣＤＲ１配列；
ｉｉ．配列番号１３〜配列番号１９のうちの１つの重鎖ＣＤＲ２配列；
ｉｉｉ．配列番号２０〜配列番号２７のうちの１つの重鎖ＣＤＲ３配列；
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列。

以下のa、ｂおよびｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．以下のｉおよびｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列；
ｉｉ．配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列；
ｂ．以下のｉおよびｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、重鎖可変領域：
ｉ．配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列；
ｉｉ．配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列；
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列。

好ましくは、前記抗体は、さらに以下のa、ｂおよびｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体である：
ａ．配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５のいずれかを含む、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列；
ｂ．配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９のいずれかを含む、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列；
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列。

好ましくは、前記（ｃ）における（ａ）の軽鎖可変領域配列と（ｂ）の重鎖可変領域配列の組み合わせが、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３のいずれかから選択される。

好ましくは、前記抗体は、
ａ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｂ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｃ．配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｅ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｆ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｇ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｈ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列
のいずれか１つをさらに含むことを特徴とする、前記抗体である。

好ましくは、前記抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、１本鎖抗体、２本鎖抗体、３本鎖抗体、４本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ｆａ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体から選択される。

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２７のうちの１つのアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１と、本発明の抗体とを含む、ＧＬＰ−１融合タンパク質。

好ましくは、ＧＬＰ−１が、Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’、Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｃ’またはＮ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１_ｒ−Ｃ’
（式中、Ｌは、ＬＫ１〜ＬＫ３のアミノ酸配列：配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２から選択されるいずれかの、全長の、部分的なまたは反復したアミノ酸配列を含むペプチドリンカー配列であり、
Ｒ１は、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列であり、
Ｒ１_ｒは、ＧＬＰ−１の逆方向アミノ酸配列であり、
Ｒ２は、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列であり、
Ｃ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のヒドロキシル残基末端を表し、
Ｎ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のアミノ残基末端を表す）
の結合方式により本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖と融合される。

本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

本発明のポリヌクレオチドを含むベクター。

本発明のベクターを含む宿主細胞。

医薬的に許容される担体と混合された本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質を含むことを特徴とする医薬組成物。

インスリン非依存型糖尿病の予防または治療に用いる医薬品を製造する、本発明の抗体またはＧＬＰ−１融合タンパク質を含むか、またはそれに基づく医薬組成物の使用。

グルカゴン様ペプチド−１を用いて２型糖尿患者の血糖値を調節および制御する方法においてＧＬＰ−１Ｒが果たす重要な作用、およびＧＬＰ−１Ｒの治療の著しい特徴が、インスリン分泌を刺激するが低血糖に関連する危険を伴わないという能力であることを考慮する。本発明は、ＧＬＰ−１をＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体と融合し、ＧＬＰ−１のインビボでの半減期を延長させ、ＧＬＰ−１の分子生物学的活性を保つ。また、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体により形成される融合タンパク質は、抗体により提供される分子標的性を有し、かつ抗体の免疫原性も他の融合パートナータンパク質より低い。

本発明の有益な効果は、次の通りである：ＧＬＰ−１をＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体と融合し、ＧＬＰ−１のインビボでの半減期を延長させ、ＧＬＰ−１の分子生物学的活性を保つ。また、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体により形成される融合タンパク質は、抗体により提供される分子標的性を有し、かつ抗体の免疫原性も他の融合パートナータンパク質より低い。

発明の詳細
本発明は、ＧＬＰ−１がインビボにおいてジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって迅速に除去されるが有効性が不十分である欠点について、ＧＬＰ−１Ｒの抗体を用いてそれと融合させることにより、その半減期および生物学的活性を増強する。融合に用いられる抗体は、ＧＬＰ−１と受容体の結合を阻害しない前提の下で、ＧＬＰ−１Ｒの生物学的活性を特異的に認識し、その受容体との高親和力および安定性により、受容体周囲におけるＧＬＰ−１の局所的な濃度を持効的に増加させ、受容体と結合する作用時間および効力を大幅に増加させることができる。また、抗体との融合により、ＧＬＰ−１がＤＰＰ−ＩＶによって認識または捕獲される立体障害を増加させ、インビボでの除去率を減少させ、ＧＬＰ−１の作用時間を増加させる。文献の報告によれば、ＧＬＰ−１ＲのＮ末端細胞外領域およびその膜貫通領域の部分的咬合状態の解放は、ＧＬＰ−１がＧＬＰ−１Ｒとの結合箇所に入り、その生物活性を行使する重要なステップである。本発明に記載の抗体とＧＬＰ−１Ｒの結合は、受容体のＮ末端細胞外領域にかなり関連し、その受容体との結合は、前記咬合状態の解放に役立ち、ＧＬＰ−１の進入に有利である。そのため、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１Ｒに対する抗体と融合した後に、その半減期および親和力価を増加させ、さらに強い生物学的活性を有するようになり、ＧＬＰ−１療法よりもさらに優れた重要な刷新である。さらに重要なことは、本発明で用いる部分抗体自体が、ＧＬＰ−１が存在する状況の下で、ＧＬＰ−１によるＧＬＰ−１Ｒの活性化を増強する生物学的特性を有することである。以上のいくつかの理由により、本発明に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質は、ＧＬＰ−１よりも有効なＧＬＰ−１Ｒ活性化薬である。

融合タンパク質の長期間の繰り返し投与により抗原性が誘発され得ることは、一般的な懸念である。GLP-1融合タンパク質療法の場合、患者が糖尿病であると診断されると、患者はこの疾患の治療を一生受けることとなるため、これは特に懸念となる。また、免疫グロブリンのFc部分に、不要なエフェクター機能が残され、Fc融合タンパク質療法が懸念となる可能性がある。コンピュータ支援による免疫グロブリンの三次元構造の予測ならびに抗体の配列の最適化およびヒト化によって、同定された特定のGLP-1融合タンパク質はエフェクター機能を有さず、従って繰り返しおよび長期的に投与した後にも免疫反応を誘導するリスクが低下する。本発明において考察されるGLP-1部分のアミノ酸は、好ましくは、グリシンおよびセリンを豊富に含むペプチドリンカーにより抗体の軽鎖および重鎖と融合される。比較的小さい側鎖を有するため、グリシンおよびセリンはペプチドリンカーの配列に相当な柔軟性を与え、GLP-1と抗体の対応する位置の間の剛性を減少させ、従ってGLP-1は自由にGLP-1Rと相互作用できるようにする。また、ペプチドリンカーの存在は、GLP-1と抗体を隔離し、そのために2つのドメインの相互作用を回避する。不要な免疫原性が融合タンパク質に導入されないようにするために、グリシンおよびセリンが交互に現れて過度の繰り返しを回避する。しかしながら、ペプチドリンカーは、融合タンパク質のインビボでの免疫原性を不可避に増加させ、ペプチドリンカーの長さを構造の柔軟性および免疫原性のバランスをとるように選択することは、非常に重要である。従って、本発明は、融合のための長さが異なる3つのペプチドリンカーを提供する。同時に、本発明では融合のためにペプチドリンカーを使用することにより、GLP-1を抗体と連結する異なる方法を提供する。形成されるＧＬＰ−１融合タンパク質の形式は、次のものを含む。
１）Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’の方式で結合されたＧＬＰ−１および軽鎖を有する融合タンパク質、
２）Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｃ’の方式で結合されたＧＬＰ−１および軽鎖を有する融合タンパク質、
３）Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１_ｒ−Ｃ’の方式で結合されたＧＬＰ−１および軽鎖を有する融合タンパク質、
４）Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’の方式で結合されたＧＬＰ−１および重鎖を有する融合タンパク質、
５）１）および４）を同時に有する融合タンパク質、
６）２）および４）を同時に有する融合タンパク質、
７）３）および４）を同時に有する融合タンパク質。

本発明において、ＧＬＰ−１をコードするＤＮＡと前記抗体の全長／可変領域／フラグメント軽鎖または全長／可変領域／全長重鎖ＤＮＡは、ペプチドリンカー配列をコードするＤＮＡにより、融合軽鎖または融合重鎖ＤＮＡを形成するとともに、軽鎖ＤＮＡの５’末端は、さらにシグナルペプチドをコードするＤＮＡを導入して遺伝子を形成し、この遺伝子を基礎に変異／野生型のＧＬＰ−１および抗体配列を結合することができる。本発明は、遺伝子合成の方法によりＧＬＰ−１の配列を得て、ＰＣＲの方法によりペプチドリンカーおよび抗体軽鎖または重鎖ＤＮＡと結合させる。ＧＬＰ−１Ｒの抗体軽鎖または重鎖可変領域配列は、特定のハイブリドーマ細胞からＰＣＲの方法によって取得し、続いて特定の抗体亜型の定常領域ＤＮＡと結合させる。野生型抗体亜型の定常領域ＤＮＡは、特定のライブラリーからクローニングして得られ、配列最適化の基礎として使用することができる。ここでいう融合タンパク質の発現に用いる遺伝子は、クローニングの方式によって発現ベクターに入れられ、融合タンパク質の生成および発現に用いられる。発現プロセスにおいて、軽鎖および重鎖の発現ベクターを合わせた後、その遺伝子を有するＤＮＡを宿主細胞にコトランスフェクションまたは形質転換する。プロモーターを最適化適応によって誘導する。形質転換体または所望の配列を増幅するための遺伝子を適切な培地中、適切なｐＨ、温度において培養する。ＤＮＡは通常、一般に用いられるＣａＰＯ_４、エレクトロポレーションおよびＰＥＩなどの方法で導入する。

ここでいうベクターにおける核酸の発現に適した適切な宿主細胞には、高等真核細胞などがあり、発現用の哺乳動物宿主細胞株の実例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）およびヒト胎児腎臓細胞（懸濁培養したＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３細胞株）があり、軽鎖Ｎ末端に位置するシグナルペプチドが、哺乳動物宿主細胞株からの組換え融合タンパク質の分泌を指示する。発現およびクローニングに用いるベクター上に、融合タンパク質をコードする核酸を統合する能力を有する細胞を選別するために用いる、ベクターを宿主細胞において常に複製させることが可能な選択マーカーを有し、かつ融合タンパク質コード配列と有効に結合し、ｍＲＮＡ合成を指示するプロモーターを有する。そのうちの１つの実例は、抗生物質抵抗性ならびにＢ型肝炎ウイルスおよびサルウイルスプロモーター（ＳＶ４０）を有するベクターを用いて、融合タンパク質を安定して発現するＣＨＯ宿主細胞を選択することである。

本発明は、宿主細胞系が融合タンパク質を発現した後、アフィニティークロマトグラフィーの方法を用いて、細胞培養上澄に分泌した部分を精製する。本発明における実例は、プロテインＧのアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、全長抗体と融合した融合タンパク質を捕捉し、次いで低ｐＨでクロマトグラフィーカラムから溶出した後、収集する。穏やかな溶出条件は、タンパク質の変性の防止に役立つ。

１種または２種以上の賦形剤を用いて、本発明の融合タンパク質を調製してもよい。本発明の融合タンパク質は、許容可能な安定性を提供し、および投与（例えば非経口投与）に好適なｐＨに調節された医薬用の緩衝液と組み合わせてもよい。任意選択的に、１種または２種以上の医薬用の抗微生物剤を付加してもよい。ｍ−クレゾールおよびフェノールが、好ましい医薬用抗微生物剤である。１種または２種以上の医薬用塩溶液を付加し、イオン強度または張力を調節してもよい。１種または２種以上の賦形剤を付加し、製剤の等張性をさらに調節してもよい。グリセリンは、等張性調節賦形剤の実例である。「医薬用」とは、ヒトまたはその他動物への投与に適しているため、毒性成分または望ましくない汚染物を含有せず、かつ活性化合物の活性に干渉しないことを意味する。

溶液製剤または適切な希釈剤を用いて再構成可能な凍結乾燥粉末で本発明の融合タンパク質を調製してもよい。凍結乾燥剤形は、融合タンパク質が安定する製剤タイプの１つであり、再構成製品の予期される使用貯蔵期間内にｐＨを保つ緩衝能力を有するか、または有さない。ここで考察される融合タンパク質を含む溶液は、凍結乾燥前に、好ましくは等張であり、これを再構成させた後に、等張溶液を形成することができる。

本発明の融合タンパク質の医薬用塩の形式は、本発明の範囲内にある。酸付加塩の形成に常用される酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、および、例えばｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸である。好ましい酸付加塩は、例えば塩酸および臭化水素酸などの無機酸で形成された塩である。

塩基付加塩は、例えばアンモニウム、塩基またはアルカリ土類金属水酸化物などの無機塩基由来の塩、炭酸塩、炭酸水素塩などを含む。本発明の塩溶液の調製に有用なこれらの塩基は、そのため、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどを含む。

本発明の融合タンパク質は、生物学的活性を有する。生物学的活性とは、この融合タンパク質がインビボで結合し、ＧＬＰ−１Ｒを活性化してストレス応答を刺激する能力をいう。応答は、インスリンの分泌の上昇、グルカゴン分泌の抑制、食欲の抑制、体重の減少、満腹の誘導、アポトーシスの抑制、膵β細胞増殖および膵β細胞分化の誘導を含むが、これらに限定されない。代表的なＧＬＰ−１融合タンパク質について、インビトロおよびインビボ活性を測定した。先ず、ステップ４（図１）は、この融合タンパク質とＧＬＰ−１Ｒの相互作用の蛍光検出データを提供する。次いで、ステップ５は、この融合タンパク質とヒトＧＬＰ−１Ｒの相互作用後に、活性化させたインビトロ活性の試験を提供する。実験において、ヒトＧＬＰ−１Ｒを過剰発現するＣＨＯ細胞を用いた。これらの細胞において、ＧＬＰ−１Ｒの活性化によってアデニル酸シクラーゼの活性化が引き起こされ、この酵素の活性化は、またｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を誘導する。ステップ１２（図２）は、レポーター遺伝子がルシフェラーゼであるデータを提供する。インビトロの実験データは、融合タンパク質がＧＬＰ−１Ｒを結合し活性化することができ、インビトロの結果は天然のＧＬＰ−１−Ｇｌｙ８（７−３７）ＯＨよりも有効であることを共同で表している。ステップ１３（図３）は、本発明の融合タンパク質のいずれかを腹腔内投与した１６時間後のマウスの血糖値の変化データを提供する。ステップ１３のマウスにおいて生成されたインビボデータは、この融合タンパク質が活性を有し、かつ天然のＧＬＰ−１よりも長い半減期を有することを示した。

通常の技能を有する内科医が有効であることをすでに知っている任意の経路でこれらの融合タンパク質を投与することができる。末梢非経口投与は、こうした方法に属す。医学文献において、通常、非経口投与は、無菌注射器または例えばシリンジポンプなどのその他の機械装置によって体に剤形を注射することと理解されている。末梢非経口経路は、経静脈、筋肉内、皮下および腹腔内の投与経路を含んでもよい。

本発明の融合タンパク質は、経口、直腸、経鼻または下気道の経路で投与してもよく、これらは非経口以外の経路である。これらの非経口以外の経路のうち、下気道経路および経口経路が好ましい。

本発明の融合タンパク質は、様々な疾患および疾病の治療に用いることができる。本発明の融合タンパク質は、主に、ＧＬＰ−１Ｒに作用することによりその生物学的作用を発揮する。そのため、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質を用いて、ＧＬＰ−１Ｒ刺激に対して、またはＧＬＰ−１化合物の投与に対して応答のある疾患および／または疾病の被験者を治療することができる。これらの被験者を、「ＧＬＰ−１化合物治療が必要」または「ＧＬＰ−１Ｒ刺激が必要」な被験者という。インスリン非依存型糖尿病、インスリン依存型糖尿病、脳卒中（特許文献３を参照）、心筋梗塞（特許文献４を参照）、肥満（特許文献５を参照）、手術後異化変化（特許文献６を参照）、機能性胃腸症および過敏性腸症候群（特許文献７を参照）を有する被験者を含む。例えば、インスリン非依存型糖尿病に発展する危険のある被験者（特許文献８を参照）など、ＧＬＰ−１化合物での予防的治療が要求される被験者も含む。耐糖能異常または空腹時血糖異常の被験者、体重が被験者の身長および体液に対して正常体重を約２５％超える被験者、膵臓の一部を切除した被験者、両親のいずれかまたは両方がインスリン非依存型糖尿病である被験者、妊娠糖尿病になったことのある被験者および急性または慢性膵炎になったことのある被験者は、いずれもインスリン非依存型糖尿病に発展するリスクがある。本特許に記載される融合タンパクの有効量は、ＧＬＰ−１受容体刺激が必要な被験者に投与するときの、所望の治療および／または予防効果が得られ、許容できない副作用がない用量である。「所望の治療効果」は、次の１つまたは２つ以上を含む：疾患または疾病に関連する症状の改善、疾患または疾病に関連する症状の発症の遅延、治療していない場合に比べた寿命の延長、治療していない場合に比べたクオリティー・オブ・ライフの向上。糖尿病を治療するＧＬＰ−１融合タンパク質の「有効量」は、治療していない場合に比べ、血糖値をよりよく制御することができ、これにより糖尿病の合併症（例えば、網膜症、神経障害または腎症）の発作の遅延をもたらす量である。糖尿病を予防するＧＬＰ−１融合タンパク質の「有効量」は、治療していない場合に比べ、血糖値上昇の発症を遅延させる量であり、前記発症は、例えばスルホニルウレア系、チアゾリジンジオン、インスリンおよび／またはビグアニド系などの血糖降下薬治療を必要とする。患者の血糖値を有効に正常化する融合タンパク質の用量は、多くの要素によって決まり、被験者の性別、体重および年齢、血糖調節異常の重篤性、投与経路および生物学的利用能を含むが、これらに限定されない。融合タンパク質の薬物動態プロファイル、効力および剤形。用量は、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができ、好ましくは、０．０５〜０．５ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましくは、週１回または２回、本発明の融合タンパク質を投与する。治療する疾患によって決まり、この融合タンパク質を、例えば週３回以上など、より頻繁に投与する必要がある可能性がある。

（図面の簡単な説明）
組換え発現させたGLP-1融合タンパク質（GLP-1(A8G)-LK-L13H13）の、チャイニーズハムスター卵巣細胞株において安定発現されたヒトGLP-1R（hGLP-1R）との特異的結合（*と示された実線ピーク）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株自体（点線ピーク）と対比して示すフローサイトメトリー（FACS）である。 レポーター遺伝子アッセイによる、チャイニーズハムスター卵巣細胞株で安定発現されたhGLP-1Rを活性化するGLP-1野生型（円形）およびGLP-1(A8G)-LK-L13H13（三角形）の用量反応曲線を示す。 マウス（ＩＣＲ）耐糖能試験の結果であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を５μｇ／匹（四角形）および１５μｇ／匹（三角形）、単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した１６時間後の、絶食状態のマウスの耐糖能を示す。 マウス（Ｃ５７ＢＬ）耐糖能試験の結果であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を１５μｇ／匹（三角形）、単回腹腔内（ｉ．ｐ）注射した４０時間後の、絶食状態のマウスの耐糖能を示す。 ２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）血糖値時間曲線であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を１０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で（逆三角形）、２型糖尿病マウスに単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後の、マウス血糖値変化を反映する。 ２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）日摂食量時間曲線であり、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３を１０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で（逆三角形）、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、融合タンパク質の注射の３日前から注射後５日目までの期間内の２型糖尿病マウスのマウス日摂食量の変化を反映する。図６および図５は、並行して行った２つの実験の結果である。

（発明の具体的な実施態様）
次に、具体的な実施例によって、図面と合わせ、本発明の技術手法についてさらに具体的に説明する。

本発明において、特に指定がない場合、用いられる原料および設備などは、いずれも市販されているものであるか、または当該技術分野で常用されているものである。下記の実施例における方法は、特別な説明がない場合、いずれも当該技術分野の通常の方法である。

ステップ１：免疫用抗原細胞安定株の作製
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ（−）細胞を６ウェルプレートに移し、２４時間培養した後、ｈＧＬＰ−１Ｒ遺伝子（ヌクレオチド配列は配列番号１１３を参照、アミノ酸配列は配列番号１１４を参照）を含むｐＹＳプラスミドをトランスフェクションする。トランスフェクションの前に培養液を交換し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が推奨するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクション条件に基づきトランスフェクションを行う。トランスフェクションの４８時間後に、培養培地を１０ｎＭのＭＴＸを含有する完全培地に交換する。約２週間にわたり３日ごとに液を換えると、安定成長したクローンが現れる。分散した細胞コロニーをプレートから剥離し、収集する。細胞が約５０％のコンフルエンスに成長するまで待ち、漸増濃度のＭＴＸ（ＭＴＸの濃度が１０μＭになるまで）を圧選択のために加える。作製した安定細胞株について、それぞれＦＡＣＳ検出を行い、抗ｈＧＬＰ−１Ｒの抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて圧選択後の細胞クローンを同定する。１０μＭのＭＴＸによる選別後の選択されたＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１Ｒ細胞膜上でｈＧＬＰ−１Ｒが大量に発現する。最後に、サブクローニングを経て、ｈＧＬＰ−１Ｒ高発現細胞安定株６株を同定する。

ステップ２：抗体の調製
フロイントアジュバント中で乳化したＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１Ｒ全細胞を、２×１０^６個の細胞／匹の用量で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）に皮下注射する。２週間後に、不完全フロイントアジュバント乳化免疫原を用いて、マウスの免疫を増強し、この後、週１回増強する。尾の末尾を切断する方式によって採血し、血清を遠心分離して回収し、ＦＡＣＳ解析を行って血清力価を測定する。適切な抗体価に達したときに、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させ、無菌状態で脾臓細胞を得る。成長状態が対数増殖期にあるＳＰ２／０細胞を収集し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。沈殿を無血清培養培地で再懸濁し、再度遠心分離−再懸濁し、計数を行う。脾臓細胞およびＳＰ２／０細胞をＳＰ２／０細胞：脾臓細胞≧１：１の比で混合し、「洗浄−遠心分離」を計３回行う。最後の１回の遠心分離後の沈殿を分離し（３７℃まで予熱した）、ＰＥＧ−１３５０ １ｍＬを一滴ずつ加え（３０秒以内に滴下を完了する）、１分間ピペッティングで混合した後（３７℃まで予熱した）、無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３０ｍＬをゆっくりと加え、ＰＥＧの融合作用を終了させる。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞沈殿を再懸濁し、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、メトトレキサートおよびチミジン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｉｎｄ）を付加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を融合培養培地として加える。各ウェルに１００μlの体積中の脾臓細胞２００００個およびフィーダー層細胞５０００個を９６ウェルプレート中に播く。融合したハイブリドーマ細胞およびフィーダー層細胞をともに９６ウェルプレートの中で培養し、ＨＡＴ選別を行い、融合していない細胞を除去する。１０日後に、培養プレート中のハイブリドーマ細胞上澄を収集し、ＥＬＩＳＡ検出を行う。

ステップ３：全細胞ＥＬＩＳＡ選別
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１ＲのｈＧＬＰ−１Ｒを過剰発現した細胞およびｈＧＬＰ−１Ｒを発現していないＣＨＯ−ＤＨＦＲ（−）細胞を別々に９６ウェルプレートに移し、９０％のコンフルエンスまで成長させる。培養培地上澄を除去し、接着した細胞をＰＢＳで２回洗い、１００％のメタノール１００μｌを加え、４℃で１０分間細胞を固定する。新しく調製した０．６％のＨ_２Ｏ_２−ＰＢＳ １００μｌをさらに加え、室温で２０分間インキュベートし、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳ−１％のＢＳＡ溶液でブロッキングした後、ハイブリドーマ上澄を加え、４℃で９０分間インキュベートする。複数回洗浄した後、５０００倍に希釈したＧｘＭ−ＨＲＰ−Ｆｃ二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で０．５時間インキュベートする。５回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢ発色基質１００μｌを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、２ＭのＨ_２ＳＯ_４ を加えて反応を終了し、ＯＤ４５０値を読み取る。陽性対照は、免疫マウスの血清とし、陰性対照は細胞培養上澄とする。抗ｈＧＬＰ−１Ｒ抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選別し、クローニングを行い、ｈＧＬＰ−１Ｒに対する分泌を安定化することができる細胞株を得る。最後に、ハイブリドーマが分泌した抗体上澄をＦＡＣＳ解析により検証を行う。

ステップ４：陽性ハイブリドーマ細胞上澄フロー分析（ＦＡＣＳ）
１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを使用して、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１Ｒ細胞１０^５個を剥離して収集し、１．５ｍｌのＥＰチューブにとる。遠心分離後に上澄を捨て、陰性対照試料は、フロー式サンプルローディングバッファー（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ）で再懸濁する。陽性対照については抗体上澄２００μｌを加え、細胞を再懸濁して室温でインキュベートし、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上澄を捨て、フロー式サンプルローディングバッファーで１回洗い、さらに遠心分離する。細胞を再懸濁し、各ウェルに、１：５０で希釈したＦＩＴＣマーカーのヒツジ抗マウス蛍光抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）２００μｌを加え、室温で光を避けて３０分間インキュベートする。遠心分離し、上澄を捨て、さらにフロー式サンプルローディングバッファーで細胞を洗い、再度遠心分離し、最後に解析のためにフロー式サンプルローディングバッファーで再懸濁する。ハイブリドーマ上澄およびＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＧＬＰ−１Ｒ細胞は、特異的結合を有し、灰色のピークと点線のピークは陰性対照であり、ハイブリドーマ上澄が対応する実線ピーク（^＊で記されている）は著しく右に寄っている（図１）。

ステップ５：抗体遺伝子のクローニングおよびサブクローニング
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集する。ＱＩＡＧＥＮのｍＲＮＡ抽出キットの操作手順書に基づき、ハイブリドーマのｍＲＮＡを抽出する。次いで、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。逆転写プライマーは、マウスの軽、重鎖定常領域の特異性プライマーであり、重鎖逆転写プライマーは（５’−ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ−３’）（配列番号１１５）であり、軽鎖逆転写プライマーは（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）（配列番号１１６）および（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）（配列番号１１７）である。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、２５℃で５分間、５０℃で６０分間、７０℃で１５分間である。逆転写したｃＤＮＡを、０．１ｍＭのＴＥで５００μｌまで希釈し、限外ろ過遠心管（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５）の中に加え、２０００ｇで１０分間遠心分離する。ろ液を捨て、さらに０．１ｍＭのＴＥ ５００μｌを加え、２０００ｇで１０分間遠心分離する。ろ液を捨て、調製チューブを新しい遠心チューブの中に逆さに置き、２０００ｇで１０分間遠心分離し、精製したｃＤＮＡを得る。精製したｃＤＮＡ １０μｌをテンプレートとする。５×テーリングバッファー（ｔａｉｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）４μｌ、ｄＡＴＰ（１ｍＭ）４μｌおよび１０Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた後、均一に混ぜ、３７℃で５分間インキュベートした後、６５℃で５分間インキュベートする。ポリＡテールを加えたｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲを行って抗体の軽、重鎖可変領域遺伝子を増幅する。上流プライマーは、いずれもＯｌｉｇｏｄＴであり、重鎖下流プライマーは、（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号１１８）および（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号１１９）であり、軽鎖下流プライマーは、（５’−ＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ−３’）（配列番号１２０）である。ＰＣＲ反応条件は以下の通りである：９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル；７２℃で７分間。ＰＣＲ生成物をＰＭＤ １８−Ｔベクターに結合した後、シークエンシングを行う。シークエンシングで得られた抗体軽鎖および重鎖可変領域配列は、付録の配列表を参照。

すでにシークエンシングして得られた抗体のＤＮＡ配列に基づきＰＣＲプライマーを設計し、これにより完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチドならびに可変ドメインおよびマウスＩｇＧ１定常領域を、発現ベクターｐＴＭ５と結合する。

ステップ６：懸濁ＨＥＫ２９３宿主細胞株における抗ＧＬＰ−１Ｒ抗体の一過性発現
懸濁ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ発現細胞株をスピナーフラスコに接種し、３７℃で２４時間の回転培養の後、細胞はトランスフェクションの準備が整う。トランスフェクションのプロセスにおいて、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクション試薬とし、ＤＮＡとの混合物を、細胞培養に加える。ＰＥＩとＤＮＡの混合の好ましい配合比は、１：１から５：１である。細胞は、ＰＥＩとＤＮＡの混合物を受けた後、３７℃の回転培養を９６時間以上継続する。抗原結合タンパクが発現し、その間に、０．５％のトリプトンを、発現に必要なアミノ酸源として細胞培養に加え、最後に細胞上澄を収集し、抗原結合タンパク質の精製分離に用いる。

ステップ７：抗体ヒト化および最適化
先ず、選別されたマウス抗体軽、重鎖可変領域配列を、ＮＣＢＩのオンライン抗体可変領域配列アラインメントツールＩｇ Ｂｌａｓｔを用いて相同性を有する抗体と整列させ、ヒト化用に選択した抗体可変領域配列と相同のヒト化抗体生殖細胞系列遺伝子配列（Ｉｇ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を検索し、ＣＤＲ配列を除き、相同性が最も高いヒト化遺伝子配列をテンプレートとして使用してＣＤＲグラフティングを行い、ヒト化抗体可変領域配列を得て、ヒト化抗体軽、重鎖の遺伝子を合成する。配列に基づきＰＣＲプライマーを設計し、合成配列の５’末端および３’末端に適切な制限酵素切断部位を導入する。ヒト化抗体可変領域をＰＣＲ増幅後に、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常領域配列と結合させた後、完全な組換えヒト化抗体配列を得る。組換え抗体は、ステップ６に基づき発現を行い、ステップ４におけるＦＡＣＳ解析により、ＧＬＰ−１Ｒに対する親和力を検証する。ＧＬＰ−１Ｒに対する親和力を残したヒト化抗体候補の群から、親和力の最も優れたものを選び出し、部位特異的変異導入により、可変領域配列をさらに改造し、ＧＬＰ−１Ｒに対する親和力をさらに向上させる。

ステップ８：ＧＬＰ−１ヒト化融合タンパク質の遺伝子クローニングとサブクローニング
最適化したヒト化抗体を、軽鎖のＮ末端およびＣ末端においてＧＬＰ−１またはその誘導体配列と融合し、ＧＬＰ−１融合タンパク質を形成させ、両者の配列は、ペプチドリンカー配列（ＬＫ）を架橋として結合する。シグナルペプチド−ＧＬＰ−１−ペプチドリンカーのヌクレオチド配列は、金斯瑞生物科技有限公司が合成する。合成遺伝子をテンプレートとして使用し、「シグナルペプチド−ＧＬＰ１−リンカー」部分の配列をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ上流プライマーは（５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号１２１）であり、ＰＣＲ下流プライマーは（５’−ＡＧＡＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号１２２）である。ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル；７２℃で７分間である。また、ヒト化抗体のヌクレオチド配列をテンプレートとして使用し、融合タンパク質配列の抗体部分の配列を増幅させる。

ＰＣＲ上流プライマーは、（５’−ＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号１２３）であり、ＰＣＲ下流プライマーは、（５’−ＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ−３’）（配列番号１２４）である。ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル；７２℃で７分間である。次いで、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）によって、融合タンパク質核酸配列の「シグナルペプチド−ＧＬＰ−１−ペプチドリンカー」部分を抗体部分と結合し、プライマー両端にＮｈｅ１およびＮｏｔ１の２つの制限酵素部位を導入し、これにより、完全な融合タンパク質配列を発現ベクターｐＴＭ５と結合させる。オーバーラップＰＣＲの上流プライマーは、（５’−ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号１２５）であり、下流プライマーは、（５’−ＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ−３’）（配列番号１２６）である。ＰＣＲ反応条件は以下の通りである：９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル；７２℃で７分間。ＰＣＲ生成物をＰＴＭ５ベクターに結合した後、シークエンシングにより確認する。

ステップ９：懸濁ＨＥＫ２９３宿主細胞株におけるＧＬＰ−１融合タンパク質の一過性発現
ＨＥＫ２９３懸濁細胞をスピナーフラスコの中に接種し、トランスフェクションの前に培養培地を換える。融合タンパク質軽／重鎖遺伝子を含むベクターを、ＤＮＡ総量０．５〜１．５μｇ／ｍｌの濃度で、１．５〜７．５μｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合し、１５〜２５分間静置した後、混合物を細胞培養培地に加える。２４時間後に、細胞培養培地に０．５〜１％のトリプトンＮ１を加える。５〜１０日間培養した後に分泌されたＧＬＰ−１融合タンパク質を含む上澄を収集する。

ステップ１０：懸濁ＣＨＯ宿主細胞株におけるＧＬＰ−１融合タンパク質の安定発現
懸濁ＣＨＯ細胞を６ウェルプレートに接種し、ステップ１におけるトランスフェクション条件で、融合タンパク質の発現ベクターをトランスフェクションする。４８時間後に、３００ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン（重鎖）および６ｍｇ／ｍｌのピューロマイシン（軽鎖）を加え、共同選別を行う。大量のアポトーシスが現れた後（死亡率＞９０％）、抗生物質濃度を徐々に下げ、余剰細胞を回復させ、培養増殖のためにスピナーフラスコに移し、次いで上澄中の抗体の発現を確認する。その後の培地において、半分の抗生物質濃度を保ち、細胞のＧＬＰ−１融合タンパク質を安定発現させる。

ステップ１１：ＧＬＰ−１融合タンパク質の細胞培養上澄からの精製および調製
細胞培養を遠心分離してその中の細胞を除去し、その上澄をプロテインＧ共役アフィニティークロマトグラフィーカラムを通す。およそｐＨ２．５〜３．５の溶出液で、発現したＧＬＰ−１融合タンパク質にクロマトグラフィーカラムから溶出する。溶出チューブの中の中和緩衝液で、溶出液の低ｐＨ値を速やかに中和する。溶出後に収集したタンパク質溶液をＰＢＳに対して透析する。

ステップ１２：レポーター遺伝子実験でのＧＬＰ−１融合タンパク質のインビトロでのＧＬＰ−１Ｒの活性化機能の検出（図２を参照）
各ウェルに２００００個の、共発現ｈＧＬＰ１Ｒ−ＣＲＥ−ルシフェラーゼのＣＨＯ−ＤＨＦＲ（−）細胞を９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で一晩培養する。次の日に、培地上澄を除去する。無血清培地で細胞表面を２回洗浄し、残液も同様に除去し、さらに抗体またはＧＬＰ−１の希釈および精製のために１００μｌの無血清培地を加え、３７℃で４時間インキュベートする。刺激の終了後、ＰｒｏｍｅｇａのＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ化学発光基質１００μｌを加える。最後に、細胞溶解物を白色９６ウェルプレートに移し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートリーダーで相対発光強度を読み取る。

ステップ１３：マウス（ＩＣＲ）絶食状態での耐糖能試験
マウスの静脈内耐糖能を測定し、本特許に開示されたＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））の効果を評価する。マウスを４群設け、各群に少なくとも３から５匹のマウスを含める。Ｉ群は対照群であり、同体積ＰＢＳの腹腔内注射を受ける。ＩＩ群は、１５μｇ／匹の単回腹腔内注射を受ける。ＩＩＩ群は、５μｇ／匹の単回腹腔内注射を受ける。注射後に、マウスに６〜１６時間の絶食処置を行い、絶食の完了後、マウス血液試料を取り、その基礎血糖値を測定する。次いで、マウスに濃度１．５ｇ／ｋｇのグルコース胃ゾンデ経口投与を受けさせる。胃ゾンデ経口投与の後、１５分、３０分、６０分、および９０分後にその血液試料を採取し、血糖値を測定する（図３を参照）。

ステップ１４：耐糖能試験によるＧＬＰ−１融合タンパク質のマウス（Ｃ５７ＢＬ）体内持効性（４０時間）の検出
マウスの静脈内耐糖能を測定し、本特許に開示されたＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））の持効性を評価する。マウスを２群設け、各群は少なくとも３から５匹のマウスを含む。Ｉ群は対照群であり、同体積ＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＩＩ群は、１５μｇ／匹の単回腹腔内注射を受けた。注射の２４時間後に、マウスに１６時間の絶食処置を行い、絶食の完了後、マウス血液試料を取り、その基礎血糖値を測定する。次いで、マウスに濃度１．５ｇ／ｋｇのグルコース胃ゾンデ経口投与を受けさせた。胃ゾンデ経口投与の後、１５分、３０分、６０分、および９０分後にその血液試料を採取し、血糖値を測定する（図４を参照）。

ステップ１５：ＧＬＰ−１融合タンパク質による２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）の血糖値低下への持効性研究（７２時間）
異なる時点で２型糖尿病マウスの血糖値を測定し、本特許に開示されたＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））による２型糖尿病マウス体内でのその血糖値低下の持効性を評価する。マウスを２群設け、各群に少なくとも６匹のマウスを含む。注射開始前に、マウス血液試料を取り、その基礎血糖値を測定する。その後、Ｉ群（対照群）は、同体積ＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＩＩ群は１０ｎｍｏｌ／ｋｇ濃度のＧＬＰ−１融合タンパク質の単回腹腔内注射を受けた。注射後１、４、６、２４、４８、７２時間後に、それぞれその血液試料を採取し、両群のマウスの血糖値を測定する（図５を参照）。

ステップ１６：ＧＬＰ−１融合タンパク質による２型糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）の日摂食量減少への持効性研究（１２０時間）
２型糖尿病マウスの摂食量の変化を測定し、本特許に開示されたＧＬＰ−１融合タンパク質（好ましくは、抗体ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）−ＬＫ−Ｌ１３Ｈ１３））による２型糖尿病マウスの摂食レベル低下の持効性を評価する。このステップおよびステップ１５は、同じロットのマウスで同時に行った。マウスを２群設け、各群に少なくとも６匹のマウスを含む。ステップ１５の注射の３日前から注射の５日（１２０時間）後まで、毎朝同じ時間に各群のマウスの日摂食量を秤量した（図６を参照）。

以上に記載の実施例は、本発明の好ましい方式に過ぎず、本発明に対していかなる形式の限定を行うものでもなく、特許請求の範囲に記載の技術手法を超えない前提の下で、さらに他の変更および修正がある。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
以下のa、ｂおよびｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．配列番号４６〜配列番号５３、またはこの配列との差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｂ．配列番号２０〜配列番号２７、またはこの配列との差が合計で４個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ３配列、及び
ｃ．（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列。
（構成２）
以下のa、ｂ、ｃおよびｄのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、構成１記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．配列番号２８〜配列番号３７、またはこの配列との差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｂ．配列番号３８〜配列番号４５、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＬ１〜Ｌ１３軽鎖ＣＤＲ２配列、
ｃ．配列番号６〜配列番号１２、またはこの配列との差が合計で２個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ１配列、
ｄ．配列番号１３〜配列番号１９、またはこの配列との差が合計で３個以下のアミノ酸が付加、置換および／または欠失された配列からなるＨ１〜Ｈ１３重鎖ＣＤＲ２配列。
（構成３）
以下のa、ｂおよびｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．以下のｉ、ｉｉおよびｉｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号２８〜配列番号３７のうちの１つの軽鎖ＣＤＲ１配列；
ｉｉ．配列番号３８〜配列番号４５のうちの１つの軽鎖ＣＤＲ２配列；
ｉｉｉ．配列番号４６〜配列番号５３のうちの１つの軽鎖ＣＤＲ３配列；
ｂ．以下のｉ、ｉｉおよびｉｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、重鎖可変領域：
ｉ．配列番号６〜配列番号１２のうちの１つの重鎖ＣＤＲ１配列；
ｉｉ．配列番号１３〜配列番号１９のうちの１つの重鎖ＣＤＲ２配列；
ｉｉｉ．配列番号２０〜配列番号２７のうちの１つの重鎖ＣＤＲ３配列；
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列。
（構成４）
以下のa、ｂおよびｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．以下のｉおよびｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列；
ｉｉ．配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列；
ｂ．以下のｉおよびｉｉのうちの少なくとも１つの配列を含む、重鎖可変領域：
ｉ．配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列；
ｉｉ．配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含む、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列；
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列。
（構成５）
さらに以下のa、ｂおよびｃのうちの１つを含むアミノ酸配列を含むことを特徴とする、構成４記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体：
ａ．配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５のいずれかを含む、Ｌ１〜Ｌ１３の軽鎖可変領域配列；
ｂ．配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９のいずれかを含む、Ｈ１〜Ｈ１３の重鎖可変領域配列；
ｃ．（ａ）の軽鎖可変領域配列および（ｂ）の重鎖可変領域配列。
（構成６）
前記（ｃ）における（ａ）の軽鎖可変領域配列と（ｂ）の重鎖可変領域配列の組み合わせが、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３のいずれかから選択されることを特徴とする、構成５に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
（構成７）
ａ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｂ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
ｃ．配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｅ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｆ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｇ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
ｈ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列
のいずれか１つをさらに含むことを特徴とする、構成６に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
（構成８）
マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、１本鎖抗体、２本鎖抗体、３本鎖抗体、４本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ｆａ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体から選択されることを特徴とする、構成１または３または４に記載のＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合可能な抗体。
（構成９）
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２７のうちの１つのアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１と、構成１または３または４に記載の抗体とを含むことを特徴とする、ＧＬＰ−１融合タンパク質。
（構成１０）
ＧＬＰ−１が、Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’、Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｃ’またはＮ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１ _ｒ −Ｃ’
（式中、Ｌは、ＬＫ１〜ＬＫ３のアミノ酸配列：配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２から選択されるいずれかの、全長の、部分的なまたは反復したアミノ酸配列を含むペプチドリンカー配列であり、
Ｒ１は、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列であり、
Ｒ１ _ｒ は、ＧＬＰ−１の逆方向アミノ酸配列であり、
Ｒ２は、構成１または３または４に記載の抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列であり、
Ｃ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のヒドロキシル残基末端を表し、
Ｎ’は、ＧＬＰ−１融合タンパク質ポリペプチド鎖のアミノ残基末端を表す）
の結合方式により構成１または３または４に記載の抗体の軽鎖および／または重鎖と融合されることを特徴とする、構成９に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質。
（構成１１）
構成９に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
（構成１２）
構成１１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
（構成１３）
構成１２に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
（構成１４）
医薬的に許容される担体と混合された構成９に記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含むことを特徴とする医薬組成物。
（構成１５）
インスリン非依存型糖尿病の予防または治療に用いる医薬品を製造する構成１４に記載の医薬組成物の使用。

Claims (17)

1. 配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
   配列番号４５の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；
   配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
   配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
   配列番号１９の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；及び
   配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
   を含む、ＧＬＰ−１Ｒと特異的に結合する抗体。
2. 配列番号１０１の軽鎖可変領域配列；及び配列番号７５の重鎖可変領域配列を含む、請求項１記載の抗体。
3. 配列番号１００のポリヌクレオチド配列でコードされた軽鎖可変領域配列；及び配列番号７４のポリヌクレオチド配列でコードされた重鎖可変領域配列を含む、請求項２記載の抗体。
4. 配列番号１０５の軽鎖可変領域配列；及び配列番号７９の重鎖可変領域配列を含む、請求項１記載の抗体。
5. 配列番号１０４のポリヌクレオチド配列でコードされた軽鎖可変領域配列；及び配列番号７８のポリヌクレオチド配列でコードされた重鎖可変領域配列を含む、請求項４記載の抗体。
6. ａ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
   ｂ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列、
   ｃ．配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
   ｄ．配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、
   ｅ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
   ｆ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０８の重鎖定常領域アミノ酸配列、
   ｇ．配列番号１０６の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列、並びに
   ｈ．配列番号１０７の軽鎖定常領域アミノ酸配列および配列番号１０９の重鎖定常領域アミノ酸配列
   から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
7. マウス又はヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
8. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号１２７から選択されるアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１と、請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体とを含む、ＧＬＰ−１融合タンパク質。
9. 前記ＧＬＰ−１が、前記抗体の軽鎖および／または重鎖と、Ｎ’−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｃ’、Ｎ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｃ’またはＮ’−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１_ｒ−Ｃ’
   （式中、Ｌは、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーであり、
   Ｒ１は、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列であり、
   Ｒ１_ｒは、ＧＬＰ−１の逆方向アミノ酸配列であり、
   Ｒ２は、該抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列であり、
   Ｃ’は、該ＧＬＰ−１融合タンパク質のカルボキシ残基末端を表し、かつ
   Ｎ’は、該ＧＬＰ−１融合タンパク質のアミノ残基末端を表す）
   の形態で融合されている、請求項８記載のＧＬＰ−１融合タンパク質。
10. 請求項８記載のＧＬＰ−１融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
11. 請求項１０記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
12. 請求項１１記載のベクターを含む、宿主細胞。
13. 請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体、又は請求項８又は９記載のＧＬＰ−１融合タンパク質を含む、医薬組成物。
14. インスリン非依存型糖尿病の予防または治療における使用のための、請求項８又は９記載のＧＬＰ−１融合タンパク質、又は請求項１３記載の医薬組成物。
15. 肥満の予防または治療における使用のための、請求項８又は９記載のＧＬＰ−１融合タンパク質、又は請求項１３記載の医薬組成物。
16. 過体重の予防または治療における使用のための、請求項８又は９記載のＧＬＰ−１融合タンパク質、又は請求項１３記載の医薬組成物。
17. ＧＬＰ−１Ｒ刺激に応答する疾患の予防または治療における使用のための、請求項８又は９記載のＧＬＰ−１融合タンパク質、又は請求項１３記載の医薬組成物。

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