KR102522067B1

KR102522067B1 - 무-세포 메틸화된 dna의 포획 방법 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102522067B1
Application number: KR1020217023549A
Authority: KR
Inventors: 드 까르발로 다니엘 디니즈; 슈 이 센; 라자트 싱하니아
Original assignee: 유니버시티 헬스 네트워크; 시나이 헬스 시스템
Priority date: 2016-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2023-04-13
Also published as: CN109415763A; JP7434215B2; JP6979554B2; JP2019521315A; US20220119796A1; JP2021168657A; US11078475B2; KR20210095962A; WO2017190215A1; US11560558B2; EP3452615A4; CA3022606A1; US20230287384A1; EP3452615A1; US20190144848A1; KR20230054746A; US20220073902A1; JP2024054242A; KR102359767B1; KR20190003987A

Abstract

무-세포 메틸화된 DNA의 후속 시퀀싱이 가능하도록 샘플을 라이브러리 준비에 적용하는 단계; 제1양의 필러 DNA(filler DNA)를 샘플에 첨가하는 단계로서, 상기 필러 DNA의 적어도 일부가 메틸화된 것인 단계; 샘플을 변성하는 단계; 및 메틸화된 폴리뉴클레오티드에 선택적인 결합제를 사용하여 무-세포 메틸화된 DNA를 포획하는 단계를 포함하는, 100ng 미만의 무-세포 DNA를 가지는 샘플에서 무-세포 메틸화된 DNA 를 포획하는 방법이 본원에 기술된다.

Description

무-세포 메틸화된 DNA의 포획 방법 및 이의 이용 {METHODS OF CAPTURING CELL-FREE METHYLATED DNA AND USES OF SAME}

관련 출원의 참조

본 출원은 2016년 5월 3일에 출원된 미국 가출원번호 62/331,070에 대해 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

기술 분야

본 발명은 무-세포 DNA 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 무-세포 메틸화된 DNA의 포획(capturing) 방법 및 이용에 관한 것이다.

DNA 메틸화(DNA methylation)는 DNA의 공유 변형(covalent modification)으로 염색질 구조에서 중요한 역할을 하는 안정한 유전자 조절 메커니즘이다. 인간에서, DNA 메틸화는 CpG 디뉴클레오티드의 사이토신 잔기에서 주로 일어난다. 다른 디뉴클레오티드와는 달리, CpG 는 게놈 전체에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않고, 대신 CpG 섬이라고 불리는 CpG-풍부 DNA 영역에 집중되어 있다. DNA 메틸화는 두 가지 주요 메커니즘에 의해 유전자 발현 억제를 유발할 수 있다: 1) 히스톤 탈아세틸화효소(histone deacetylase, HDAC)를 모집할 수 있는, 메틸-결합 도메인 단백질을 모집, 및 2) c-MYC 와 같은 전사 인자(transcription factor, TF)의 결합 부위로의 접근을 차단(1).

일반적으로, 게놈 내 대부분의 CpG 부위들이 메틸화되는 반면, 대부분의 CpG 섬들은 정상적인 발달 동안 및 분화된 조직에서 메틸화되지 않은 상태로 남아있다(1). 이러한 사실에도 불구하고, 정상 1차 조직에서 DNA 메틸화의 조직-특이적 패턴을 확인하는 것이 가능하다(2). 또한, 악성 변환 과정 동안, 전반적인 DNA 저메틸화, 및 CpG 섬에서 국소적인 고메틸화가 빈번하게 관찰된다(1). 사실, DNA 메틸화 패턴은 암환자를 다른 많은 종류의 암들 중 교모세포종(3), 뇌실막세포종(4), 대장암(5), 유방암(6,7)에서 진단적 가치를 가지는 임상적 의미 있는 하위집단으로 계층화하는데 사용되어 왔다.

DNA 메틸화는 이의 안정성 및 정상적인 분화와 암과 같은 질환들에서의 역할로 인하여, 종양 특성 및 표현형 상태를 나타내는데 사용될 수 있는 좋은 바이오마커이고, 따라서 개인맞춤 의료에서 높은 잠재력을 가진다. 많은 종류의 샘플이 DNA 메틸화 맵핑 및 바이오마커 발굴에 적절하며, 이들은 특히 신선한 및 FFPE 종양 조직, 혈액 세포, 소변, 타액, 대변을 포함한다(8). 보다 최근에는, 바이오마커로서 순환 무-세포 DNA (circulating cell-free DNA, cfDNA)의 사용이 탄력을 받고 있으며, 특히 암 (체세포 돌연변이)(9), 이식편(공여자 대 수여자 DNA)(10) 및 임신(태아 대 모체 DNA)(11, 12)과 같은 유전자 구분이 존재하는 상황에서 더욱 그렇다. 바이오마커로서 cfDNA 의 DNA 메틸화 맵을 사용하면 최소한의 침습적 방식으로 발생 조직을 확인하고 암 환자를 계층화할 수 있기 때문에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 또한, 면역반응 모니터링, 신경퇴행성 질환 또는 심근경색증 등 유전적 특성이 존재하지 않는 상황에서, cfDNA에서 후생유전적 변이들이 검출될 수 있는 경우에는 cfDNA를 바이오마커로 사용할 수 있다.

또한, 게놈 범위의 cfDNA의 DNA 메틸화 맵핑을 사용하면 질환의 방사선학적 증거가 없는 초기-단계 암을 가진 환자에서 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)를 검출하는 데 있어 중요한 민감도 문제를 극복할 수 있다. 기존 ctDNA 검출 방법은 시퀀싱 돌연변이를 기반으로 하며 종양 및 정상 순환 cfDNA 를 구별하기 위해 사용가능한 재발성 돌연변이의 수가 제한되어 있어 제한된 민감도를 가진다(13, 14). 반면, 게놈 범위의 DNA 메틸화 맵핑은 정상적인 순환 무-세포DNA(cfDNA)와 순환 종양 DNA(ctDNA)를 구별하는데 사용될 수 있는 수많은 후생유전적 변형들을 이용한다. 예를 들어, 뇌실막세포종과 같은 일부 종양 유형들은 유의적인 재발성 체세포 돌연변이 없이 광범위한 DNA 메틸화 변이를 가질 수 있다(4).

또한, Cancer Genome Atlas (TCGA)의 팬-암 데이터(pan-cancer data)는 사실상 모든 종양 유형에서 종양과 정상 조직 간의 많은 수의 DMR을 나타낸다(15). 따라서, 이러한 연구결과들은 ctDNA 로부터 암-특이적 DNA 메틸화 변이를 성공적으로 찾아낸 분석법이 낮은 시퀀싱-관련 비용으로 악성 질환을 검출, 분류 및 모니터링하는 매우 민감한 수단이 될 수 있다는 점을 강조하였다.

그러나, cfDNA 에서 DNA 메틸화의 게놈 범위 맵핑은 이용가능한 DNA의 양이 적고 cfDNA 가 200bp 이하의 길이로 단편화된다는 사실로 인하여 매우 어려운 과제이다(16). 따라서 적어도 50-100ng 의 DNA(17) 또는 RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)가 필요하며 비-단편화된 DNA가 필요한 기존 MeDIP-seq를 수행하는 것이 불가능하다(18). cfDNA 에서 DNA 메틸화 맵핑의 또다른 문제는 정상 cfDNA 내에서 관심있는 DNA의 양이 적다는 것이다(19). 따라서 적은 양의 DNA 를 충분한 깊이로 포획하는 비용이 매우 비싸기 때문에 WGBS 를 수행하는 것은 비현실적이다. 반면, 메틸화가 일어나기 쉬운 CpG-풍부 특징들을 선택적으로 강화하는 방법은 리드(read) 당 이용가능한 유용한 정보의 양을 최대화하고 비용을 줄이며 DNA 손실을 줄일 수 있다.

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하나의 양태에 따라, 무-세포 메틸화된 DNA의 후속 시퀀싱이 가능하도록 샘플을 라이브러리 준비에 적용하는 단계; 제1양의 필러 DNA(filler DNA)를 샘플에 첨가하는 단계로서, 상기 필러 DNA의 적어도 일부가 메틸화된 것인 단계; 샘플을 변성하는 단계; 및 메틸화된 폴리뉴클레오티드에 선택적인 결합제를 사용하여 무-세포 메틸화된 DNA를 포획하는 단계를 포함하는, 100ng 미만의 무-세포 DNA를 가지는 샘플에서 무-세포 메틸화된 DNA 를 포획하는 방법이 제공된다.

본 발명자들은 0.001% 내지 10%의 ctDNA 의 상이한 비율로 혼합물을 생물정보학적으로 시뮬레이션하였다 (도 1A, 열 측면). 본 발명자들은 또한 ctDNA가 정상적인 cfDNA와 비교하여 1, 10, 100, 1000, or 10000 DMR(차별화된 메틸화 영역: Differentially Methylated Region)을 가지는 시나리오를 시뮬레이션하였다(도 1A, 행 측면). 그 다음 각 유전자좌(10X, 100X, 1000X, 및 10000X)에서 다양한 시퀀싱 깊이(sequencing depth)로 리드(read) 샘플링하였다(도 1A, x-축). 본 발명자들은 암 ctDNA 의 양이 적고 얕은 커버리지(shallow coverage)인 경우에도 DMR 의 수가 증가함에 따라 적어도 1개의 암-특이적 사건을 검출할 확률이 증가하는 것을 발견하였다(도 1A).

이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 무-세포 DNA 를 사용하여 게놈 범위 DNA 메틸화 맵핑을 수행하기 위하여 cfMeDIP-seq (cell-free Methylated DNA Immunoprecipitation and high-throughput sequencing: 무-세포 메틸화된 DNA 면역침전 및 고속대량 시퀀싱)이라는 새로운 방법을 개발하였다. 본원에 기재된 cfMeDIP-seq 방법은 100 ng의 입력 DNA(input DNA)까지 견고한 기존의 저 입력 MeDIP-seq 프로토콜(17)을 수정하여 개발되었다. 그러나, 대부분의 혈장 시료들은 100ng 미만의 DNA를 산출한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 출발 DNA의 양을 100ng 까지 인위적으로 부풀리기 위하여 외인성 λ DNA(필러 DNA)를 어댑터-연결된 cfDNA 라이브러리에 첨가하였다(도 2). 이것은 항체에 의한 비-특이적 결합의 양을 최소화하고 또한 플라스틱웨어에 대한 결합으로 인해 손실된 DNA 의 양을 최소화한다. 필러 DNA는 어댑터-연결된 cfDNA 라이브러리와 크기가 유사한 앰플리콘들로 이루어졌으며, 비메틸화된 및 상이한 메틸화 수준으로 시험관내(in vitro) 메틸화된 DNA 로 구성되었다(도 9 및 도 10). 이 필러 DNA의 첨가는 다른 환자들이 다른 양의 cfDNA 를 생산하므로 입력 DNA 의 양을 100ng 로 정규화할 수 있어 역시 실용적이다. 이렇게 하면 다운스트림 프로토콜이, 이용가능한 cfDNA 의 양에 관계없이 모든 샘플에 대해 정확히 동일하게 유지된다.

하나의 양태에 따라, 다음 단계를 포함하는, 100ng 미만의 무-세포 DNA를 가지는 샘플에서 무-세포 메틸화된 DNA 를 포획하는 방법이 제공된다.

a. 무-세포 메틸화된 DNA의 후속 시퀀싱이 가능하도록 샘플을 라이브러리 준비에 적용하는 단계;

b. 제1양의 필러 DNA(filler DNA)를 샘플에 첨가하는 단계로서, 상기 필러 DNA의 적어도 일부가 메틸화된 것인 단계;

c. 샘플을 변성하는 단계; 및

d. 메틸화된 폴리뉴클레오티드에 선택적인 결합제(binder)를 사용하여 무-세포 메틸화된 DNA를 포획하는 단계.

일부 구체예에서, 이 방법은 포획된 무-세포 메틸화된 DNA를 증폭한 다음 시퀀싱하는 단계를 더욱 포함한다.

다양한 시퀀싱 기법들, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 이 당업자에게 공지되어 있다. 고속대량 시퀀싱(high-throughput sequencing)으로도 알려진 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS) 기법들도 역시 이용가능하며, 이는 Illumina (Solexa) 시퀀싱, Roche 454 시퀀싱, Ion torrent: Proton / PGM 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱 과 같은 다양한 시퀀싱 기법들을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 시퀀싱은 숏 리드 시퀀싱(short read sequencing)에 최적화되어 있다.

무-세포 메틸화된 DNA(Cell-free methylated DNA)는 혈류 내 자유롭게 순환하는 DNA를 말하며 DNA의 다양한 알려진 영역들에서 메틸화된다. 샘플, 예를 들어 혈장 샘플을 취하여 무-세포 메틸화된 DNA를 분석할 수 있다.

본원에서 사용된, "라이브러리 준비(library preparation)"란 DNA의 후속 시퀀싱을 허용하기 위해 무-세포 DNA 에 수행되는 리스트 엔드-리페어(end-repair), A-테일링(A-tailing), 어댑터 연결, 또는 기타 임의의 준비를 포함한다.

본원에서 사용된, "필러 DNA(filler DNA)" 는 비암호화(noncoding) DNA 일 수 있고 또는 앰플리콘(amplicon)으로 이루어질 수 있다.

DNA 샘플들은, 예를 들어 충분한 열을 가하여, 변성될 수 있다.

일부 구체예에서, 샘플들은 50ng 미만의 무-세포 DNA를 가진다.

일부 구체예에서, 제1양의 필러 DNA(filler DNA)는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 메틸화된 필러 DNA를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제1양의 필러 DNA는 약 50%의 메틸화된 필러 DNA를 포함한다.

일부 구체예에서, 제1양의 필러 DNA는 20ng 내지 100ng이다. 바람직한 구체예에서, 30 ng 내지 100 ng의 필러 DNA이다. 보다 바람직한 구체예에서, 50 ng 내지 100 ng 의 필러 DNA이다. 샘플로부터의 무-세포 DNA 및 제1 양의 필러 DNA 가 함께 조합되었을 때, 50ng 이상의 총 DNA, 바람직하게는 100ng 이상의 총 DNA 를 포함한다.

일부 구체예에서, 필러 DNA는 50 bp 내지 800 bp 길이이다. 바람직한 구체예에서, 100 bp 내지 600 bp 길이이다. 보다 바람직한 구체예에서, 200 bp 내지 600 bp 길이이다.

필러 DNA 는 이중 가닥이다. 예를 들어, 필러 DNA는 정크 DNA(junk DNA)일 수 있다. 필러 DNA는 또한 내인성 또는 외인성 DNA일 수 있다. 예를 들어, 필러 DNA 는 비-인간 DNA이고, 바람직한 구체예에서, λ DNA이다. 본원에서 사용된, "λ DNA"는 엔테로박테리아 파지(Enterobacteria phage) λ DNA 를 말한다. 일부 구체예에서, 필러 DNA는 인간 DNA와 정렬이 없다(no alignment).

일부 구체예에서, 결합제(binder)는 메틸-CpG-결합 도메인을 포함하는 단백질이다. 이러한 하나의 예시적인 단백질이 MBD2 단백질이다. 본원에서 사용된, "메틸-CpG-결합 도메인(Methyl-CpG-binding domain, MBD)"은 하나 이상의 대칭적으로 메틸화된 CpG를 포함하는 DNA 에 결합하며 약 70 잔기 길이인 단백질 및 효소의 일정 영역을 말한다. MeCP2, MBD1, MBD2, MBD4 및 BAZ2의 MBD 가 DNA 에 대한 결합을 매개하며, MeCP2, MBD1 및 MBD2의 경우, 메틸화된 CpG 에 우선적이다. 인간 단백질 MECP2, MBD1, MBD2, MBD3, 및 MBD4는 각각의 메틸-CpG-결합 도메인(MBD)의 존재에 의해 관련된 핵 단백질(nuclear protein) 패밀리를 포함한다. 이들 단백질 각각은, MBD3를 제외하고는, 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합할 수 있다.

다른 구체예에서, 결합제는 항체이고 무-세포 메틸화된 DNA의 포획은 항체를 사용한 무-세포 메틸화된 DNA를 면역침전하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 "면역침전(immunoprecipitation)"은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 용액으로부터 항원(예, 폴리펩타이드 및 뉴클레오티드)을 침전시키는 기법을 말한다. 이 과정은 샘플에서 특정 단백질 또는 DNA 를 분리하고 농축하는데 사용될 수 있고 그 과정의 특정 시점에서 항체가 고체 기질에 결합(coupling)되어야 한다. 고체 기질은, 예를 들어, 마그네틱 비드와 같은 비드를 포함한다. 다른 종류의 비드와 고체 기질들이 당업계 공지되어 있다.

하나의 예시적인 항체는 5-MeC 항체이다. 면역침전 과정을 위해, 일부 구체예에서, 0.05 ㎍ 이상의 항체가 샘플에 첨가되고; 보다 바람직한 구체예에서, 0.16㎍ 이상의 항체가 샘플에 첨가된다. 면역침전 반응을 확인하기 위해, 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 단계 (b) 이후에 제2 양의 대조군 DNA 를 샘플에 첨가하는 단계를 더욱 포함한다.

또다른 예시적인 항체는 5-하이드록시메틸 사이토신 항체이다.

다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 무-세포 메틸화된 DNA 의 포획을 확인하기 위하여 단계 (b) 뒤에 제2 양의 대조군 DNA 를 샘플에 첨가하는 단계를 더욱 포함한다.

본원에서 사용된, "대조군"은 양성 및 음성 대조군 둘 다를 포함하거나, 적어도 양성 대조군을 포함할 수 있다.

추가적인 양태에 따라, 샘플 내 DNA 메틸화 프로파일을 측정하기 위한 본원에 기술된 방법의 사용이 제공된다.

추가적인 양태에 따라, DNA 메틸화 프로파일을 종양 조직의 공지된 메틸화 프로파일과 관련지음으로써 샘플 내 암 세포로부터 무 세포 DNA의 존재를 확인하기 위한 본 발명에 기술된 방법의 사용이 제공된다.

추가적인 양태에 따라, DNA 메틸화 프로파일을 특정 조직의 공지된 메틸화 프로파일과 관련지음으로써 샘플 내 무-세포 DNA의 발생 조직을 확인하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 DNA 메틸화 프로파일의 사용이 제공된다.

일부 구체예에서, 상기 사용은 샘플 내 무-세포 DNA 내 암 세포의 발생 조직을 확인하기 위한 본원에 기술된 사용을 더욱 포함한다.

추가적인 양태에 따라, 면역 치료를 모니터링 하기 위해 본원에 기술된 사용이 제공된다.

추가적인 양태에 따라, 자가면역 질환을 진단하기 위한 본원에 기술된 사용이 제공된다.

추가적인 양태에 따라, 샘플이 취해진 개체에서 세포 턴오버(cell turnover)를 결정하기 위한 본원에 기술된 사용이 제공된다.

본 발명의 구체예들이 아래 발명의 설명 및 첨부된 도면들을 참고함으로써 가장 잘 이해될 수 있다. 도면은 다음과 같다:
도 1은 cfDNA의 메틸롬 분석이 적은 양의 입력(input) DNA 를 검출하고 농축하는데 매우 민감한 접근법임을 보여준다. A) ctDNA 의 농도(열), 조사 대상 DMR의 수(행), 및 시퀀싱 깊이(x-축)의 함수로서 하나 이상의 후성변이(epimutation)를 검출할 확률의 컴퓨터 시뮬레이션. B) 혈장 cfDNA 를 모방하기 위해 단편화된 HCT116 세포주로부터 1 내지 100 ng의 입력(input) DNA에 대한 DNA 메틸화 신호 간의 게놈 범위 Pearson 상관관계. C) ENCODE (ENCSR000DFS) 에서 수득된 HCT116 (Green Tracks) 플러스 RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) HCT116 데이터 및 GEO (GSM1465024)에서 수득된 WGBS (Whole-Genome Bisulfite Sequencing) HCT116 데이터로부터 입력(input) DNA의 다양한 농도로부터 cfMeDIP-seq로부터 수득된 DNA 메틸화 프로파일. 히트 맵 (RRBS 트랙)의 경우 노란색은 메틸화를 의미하고 파란색은 비메틸화를 의미하고 회색은 커버리지 없음(no coverage)을 나타냄. D-E) 다발성 골수종(MM) 세포주 MM1.S로의 CRC 세포주 HCT116의 연속 희석. 순수한 HCT116 DNA (100 % CRC), 순수한 MM1.S DNA (100 % MM) 및 MM DNA로 희석된 10 %, 1 %, 0.1 %, 0.01 % 및 0.001 % CRC DNA에서 cfMeDIP-seq을 수행하였다. 모든 DNA는 플라스미드 cfDNA를 모방하기 위해 단편화되었다. DMR의 관찰된 수와 예상된(D) 수의 DMR 간 및 이들 DMR 내의 DNA 메틸화 신호 (RPKM 내)(E)들 간의 거의 완벽한 선형 상관 관계 (r2 = 0.99, p <0.0001)를 관찰하였다. F) 동일한 희석 시리즈에서 알려진 체세포 돌연변이는 울트라-딥 (> 10,000X) 표적화된 시퀀싱, 상기 백그라운드 시퀀서 및 폴리머라제 오류율에 의해서만 1/100 allele fraction에서 검출가능했다. CRC 세포주의 각 돌연변이 부위에서의 삽입/결실 또는 각 염기를 포함하는 리드의 fraction을 나타낸다. G) 두 명의 대장암 환자에서 환자-유래 이종 이식편 (patient-derived xenograft, PDX)을 보유한 마우스의 혈장에서 전체 cfDNA (인간 + 마우스)의 백분율로서 ctDNA (인간)의 빈도.
도 2는 cfMeDIP-seq 프로토콜의 대표적이 도식을 나타낸다.
도 3은 시퀀싱 포화 분석(sequencing saturation analysis) 및 품질 관리(quality control)를 나타낸다. A) 이 도면은 혈장 cfDNA를 모방하기 위해 단편화된 HCT116 DNA로부터 각 입력 농도에 대한 각 복제물로부터 cfMeDIP-seq data를 분석한 Bioconductor package MEDIPS 로부터의 포화 분석 결과를 나타낸다. B) 프로토콜은 HCT116 세포주의 4 가지 출발 DNA 농도 (100, 10, 5 및 1ng)의 두 개의 복제물에서 실험되었다. 반응의 특이성은 메틸화된 및 비메틸화된 스파이크-인된(spiked-in) A. thaliana DNA를 사용하여 계산하였다. 폴드-인리치먼트(fold-enrichment) 비율은 단편화된 HCT116 DNA의 게놈 영역을 사용하여 계산하였다(메틸화된 고환-특이적 H2B, TSH2B0 및 비메틸화된 인간 DNA 영역(GAPDH 프로모터)에 대한 프로모터). 수평 점선은 폴드-인리치먼트 역치 25를 나타낸다. 오차 막대는 ± 1 s.e.m. 을 나타낸다. C) 시퀀싱된 샘플에서 CpG Enrichment Score가 입력 대조군에 비하여 면역침전된 샘플의 게놈 영역 내 CpG 의 강력한 농축을 보여준다. CpG Enrichment Score는 영역들의 CpG의 상대적 빈도를 인간 게놈의 CpG의 상대적 빈도로 나눔으로써 획득하였다. 오차 막대는 ± 1 s.e.m. 을 나타낸다.
도 4는 연속 희석으로부터 cfMeDIP-seq의 품질 제어를 나타낸다. A) MM DNA (MM1.S) 로 희석된 CRC DNA (HCT116)의 대표적인 도식. B) 메틸화된 및 비메틸화된 스파이크-인된 A. thaliana DNA를 사용하여 각 희석액의 반응 특이도를 계산하였다. C) 시퀀싱된 샘플들의 CpG Enrichment Score 가 면역침전된 샘플로부터 게놈 영역 내 CpG의 강한 농축을 나타낸다. CpG Enrichment Score는 영역들의 CpG의 상대적 빈도를 인간 게놈의 CpG의 상대적 빈도로 나눔으로써 획득하였다. D) 이 도면은 각 희석 지점으로부터 포화 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 cfMeDIP-seq 방법이 췌장 선암 환자로부터 수득된 순환 cfDNA 사의 수천개의 차별화된 메틸화 영역을 확인할 수 있음을 보여준다. A) 실험 설계. B) cfMeDIP-seq를 사용한 췌장암(사례들, n=24) 대 건강한 공여자(대조군, n=24)로부터의 순환 cfDNA 의 볼케이노 플롯. 붉은 점은 다중 실험에 대한 연관성 후 유의성에 도달한 윈도우를 나타낸다. C) 건강한 공여자 및 췌장 암 환자의 혈장 DNA 에서 확인된 38,085 DMRs의 히트맵. 계층적 군집 분석(Hierarchical clustering) 방법: Ward. D) 혈장에서 확인된 DMR(케이스 대 대조군) 및 원발성 종양 조직에서 확인된 암-특이적 DMC(일차 종양 대 정상 조직) 사이에 예상된 중복 빈도 대 관찰된 중복 빈도를 추산하기 위한 순열 분석(Permutation analysis). 박스-플롯은 중첩에 대한 영 분포(null distribution)를 나타낸다. 다이아몬드는 순환 cfDNA로부터 DNA 메틸화 및 원발성 종양 조직 간의 실험적으로 관찰된 중복 수를 나타낸다. 붉은 다이아몬드는 관찰된 중복 수가 우연히 예측된 것보다 유의적으로 많음을 의미한다. 녹색 다이아몬드는 관찰된 중복 수가 우연히 예측된 것보다 유의적으로 적음을 의미하고, 파란색 다이아몬드는 유의성 없음을 나타낸다. 본 발명자들은 네 가지 가능한 중복을 계산하였다: 원발성 종양 조직에서 과메틸화 및 순환 cfDNA에서 과메틸화 (농축됨, P-value: 6.4 x 10^-22); 원발성 종양 조직에서 과메틸화 및 순환 cfDNA에서 저메틸화 (감소됨, P-value: 9.43 x 10^-17); 원발성 종양 조직에서 저메틸화 및 순환 cfDNA에서 저메틸화 (농축됨, P-value: 1.88 x 10^-283); 원발성 종양 조직에서 저메틸화 및 순환 cfDNA에서 과메틸화 (P-value: 0.105). E) 혈장에서 확인된 DMR (케이스 대 대조군) 사이에 및 원발성 종양 조직에서 확인된 암-특이적 DMC (원발성 종양 대 정상 PBMCs) 사이에 예상된 중복 빈도 대 관찰된 중복 빈도를 추산하기 위한 순열 분석(Permutation analysis).
도 6은 췌장 선암 환자(케이스) 및 건강한 공여자(대조군)의 순환 cfDNA 로부터 cfMeDIP-seq에 대한 품질 관리를 보여준다. A-B) 각 케이스(A) 및 각 대조군(B) 샘플에 대한 반응의 특이도가 메틸화된 및 비메틸화된 스파이크-인된 A. thaliana DNA를 사용하여 계산되었다. 폴드 인리치먼트 비율은 이용가능한 DNA의 매우 제한된 양으로 인하여 계산되지 않았다. C-D) 시퀀싱된 샘플들의 CpG Enrichment Score가 면역침전될 샘플들의 게놈 영역 내 CpG 의 강한 농축(enrichment)을 나타낸다.
도 7의 A)는 상위 100만개의 가장 다양한 게놈 범위 윈도우를 사용하여 초기 단계의 췌장 선암 환자 및 건강한 공여자로부터의 48 혈장 cfDNA 메틸화에 대한 PCA. 각 윈도우에서, MAD (Mean Absolute Deviation) 메트릭을 사용하여 변동성(variability)을 계산하였는데, 이는 데이터의 중앙값에서 절대 편차의 중앙값을 반환하는 강력한 측정으로, 여기서 데이터는 주어진 윈도우에 대해 48 개 모든 샘플의 RPKM 값이다. PC1 대 PC2 (왼쪽) 및 PC1 대 PC3 (오른쪽)을 나타내었다. B) 각 주요 구성요소에 대한 분산(variance)의 비율(%). C) RRBS를 사용한 종양 대 췌장 선암 환자의 정상 LCM 조직의 볼케이노 플롯. 확인된 DMCs (Differentially Methylated CpGs)의 총 수를 열거하였다. 붉은 점은 다중 실험에 대한 연관성 후 유의성에 도달한 윈도우를 나타낸며 절대 메틸화 차이(absolute delta beta) > 0.25 를 가진다. D) 각 중첩되는 윈도우에 대해 DNA 메틸화 차이의 유의성을 보여주는 산포도(Scatter-plot). X-축은 RRBS 데이터로부터 원발성 췌장 선암 종양 대 정상 조직에 대한 log10 q 값을 나타낸다. 만약 영역이 종양 내 과메틸화된 경우, 유의성은 양성 스케일로 나타내었다. 저메틸화된 영역은 음성 스케일 상에 나타내었다. Y 축은 cfMeDIP-seq 데이터로부터 원발성 췌장 선암 환자 대 건강한 공여자로부터의 혈장 cfDNA 메틸화에 대한 log10 q 값을 나타낸다. 파란색 점은 둘 다에서 유의적인 것이다. 붉은 선은 추세선을 나타낸다. E) 각 중첩되는 윈도우에 대해 DNA 메틸화 차이를 보여주는 산포도(Scatter-plot). X-축은 RRBS 데이터로부터 원발성 췌장 선암 종양 대 정상 조직에 대한 DNA 메틸화 차이를 나타낸다. Y 축은 cfMeDIP-seq 데이터로부터 원발성 췌장 선암 환자 대 건강한 공여자로부터의 혈장 cfDNA 메틸화에 대한 DNA 메틸화 차이를 나타낸다. 파란색 선은 추세선을 나타낸다. F) RRBS를 사용한, LCM 췌장 선암 조직 대 정상 PBMC 에 대한 볼케이노 플롯. 확인된 DMCs (Differentially Methylated CpGs)의 총 수를 열거하였다. 붉은 점은 다중 실험에 대한 연관성 후 유의성에 도달한 윈도우를 나타낸며 절대 메틸화 차이(absolute delta beta) > 0.25 를 가진다. G) 각 중첩되는 윈도우에 대해 DNA 메틸화 차이의 유의성을 보여주는 산포도. X-축은 RRBS 데이터로부터 원발성 췌장 선암 종양 대 정상 PBMC에 대한 log10 q 값을 나타낸다. 만약 영역이 종양 내 과메틸화된 경우, 유의성은 양성 스케일로 나타내었다. 저메틸화된 영역은 음성 스케일 상에 나타내었다. Y 축은 cfMeDIP-seq 데이터로부터 췌장 선암 환자 대 건강한 공여자로부터의 혈장 cfDNA 메틸화에 대한 log10 q 값을 나타낸다. 파란색 점은 둘 다에서 유의적인 것이다. 붉은 선은 추세선을 나타낸다. H) 각 중첩되는 윈도우에 대해 DNA 메틸화 차이를 보여주는 산포도. X-축은 RRBS 데이터로부터 원발성 췌장 선암 종양 대 정상 PBMC에 대한 DNA 메틸화 차이를 나타낸다. Y 축은 cfMeDIP-seq 데이터로부터 췌장 선암 환자 대 건강한 공여자로부터의 혈장 cfDNA 메틸화에 대한 DNA 메틸화 차이를 나타낸다.
도 8은 전사 인자(TF) 풋프린트를 확인하고 기원 조직에서 활성 전사 네트워크를 추론하기 위한 순환 cfDNA 메틸화 프로파일을 나타낸다. A) 다중 인간 조직들에서 건강한 공여자(대조군에서 저메틸화된 풋프린트)로부터 cfDNA 내 저메틸화된 영역 내 모티프가 풍부한(software HOMER(20)을 사용함) 모든 TF 들의 발현 프로파일. 발현 데이터는 Genotype-Tissue Expression (GTEx) project(21)에서 획득하였다. 조혈계에서 우선적으로 발현하는 몇몇 TF 가 확인되었다(PU.1, Fli1, STAT5B, KLF1). B) 대조군에서 저메틸화된 모티프를 가지는 모든 TF 의 발현 프로파일 대 전체 혈액에서 33 TF 의 1,000 랜덤 세트의 발현 프로파일. C) 췌장 선암 환자(사례에서 저메틸화된 풋프린트)로부터의 cfDNA 내 저메틸화된 영역 내 모티프가 풍부한 모든 TF 들(n=85) 의 발현 프로파일. 몇몇 췌장-특이적 또는 췌장암-연관 TF 들이 확인되었다. 또한, 췌장암의 분자적 아형을 드라이브하는 홀마크(hallmark) TF도 확인되었다. D) 사례들(n=85) 에서 저메틸화된 모티프를 가지는 모든 TF들의 발현 프로파일 대 정상 췌장에서 85 TF 의 1,000 랜덤 세트의 발현 프로파일(GTEx data). E) 사례들(n=85) 에서 저메틸화된 모티프를 가지는 모든 TF들의 발현 프로파일 대 췌장 선암 조직에서 85 TF 의 1,000 랜덤 세트의 발현 프로파일(TCGA data).
도 9는 면역침전 전, 10ng, 5ng and 1ng 의 출발 무-암 세포 DNA 양 (n=3)을, 각각 90ng, 95ng 및 99ng 필러 DNA 와 조합하거나 필러 DNA가 없이 사용하여 cfMeDIP-seq를 한 후 스파이크-인된 비메틸화된 A. thaliana DNA의 회수율(%)을 나타낸다. 필러 DNA 는 면역침전 전 최종 양을 100ng 으로 증가시키기 위하여 조성물 내에서 인위적으로 메틸화된 % 내지 존재하는 비메틸화된 람다 DNA %로 다양하게 사용된다. 스파이크-인된 비메틸화 DNA의 회수율(%)은 바람직하게는 <1.0%로, 회수율이 낮을수록 반응의 민감도(%)가 높아진다.
도 10은 면역침전 전, 10ng, 5ng and 1ng 의 출발 무-암 세포 DNA 양 (n=3)을, 각각 90ng, 95ng 및 99ng 필러 DNA 와 조합하거나 필러 DNA가 없이 사용하여 cfMeDIP-seq를 한 후 스파이크-인된 메틸화된 A. thaliana DNA의 회수율(%)을 나타낸다. 필러 DNA 는 면역침전 전 최종 양을 100ng 으로 증가시키기 위하여 조성물 내에서 인위적으로 메틸화된 % 내지 존재하는 비메틸화된 람다 DNA %로 다양하게 사용된다. 스파이크-인된 메틸화된 DNA의 최대 회수율(%)은 바람직하게 20%이다.

하기 실시예들은 본 발명의 다양한 양태들에 대한 설명이며, 본원에 기재된 발명의 광범위한 양태들을 제한하지 않는다.

실시예

방법

공여자 모집 및 샘플 입수

췌장 선암(Pancreatic adenocarcinoma, PDAC) 환자 샘플을 대학 건강 네트워크 바이오뱅크(University Health Network BioBank)로부터 수득하였다; 건강한 대조군을 캐나다 토론토의 마운트 사이나 병원의 가족 의료 센터를 통해 모집하였다. 환자의 동의 하에 수집된 모든 샘플들은 캐나다 대학 건강 네트워크 및 마운트 사이나 병원의 연구 윤리위원회의 기관 승인을 얻어 획득하였다.

표본 처리-정제된 종양 및 정상 세포

일차 PDAC 샘플의 경우, 절제 직후 표본(specimen)을 처리하고 대표적인 절편을 사용하여 진단을 확인하였다. 신선한 액체 질소-동결 조직 샘플의 레이저 캡쳐 미세 절제술 (Laser capture microdissection, LCM)은 Leica LMD 7000 장비에서 수행하였다. 간단히 말해, 증기-상 액체 질소에 유지된 동결 조직을 OCT 절단 매체에 끼우고 냉동조직절편기(cryotome)에서 8μm 두께의 절편으로 절단하였다. 절편을 PEN 막 슬라이드(Leica)에 올려놓고 헤마톡실린으로 가볍게 염색하여 종양 부위를 현미경으로 확인하였다. LCM은 핵산 분해를 최소화하기 위해 절편을 절단 한 같은 날에 수행하였다.

미세절제된 종양 세포는 무균의, RNAse가 없는 마이크로원심분리기 튜브의 캡 안으로 중력에 의해 수집되었다. 약 150,000-200,000 종양 세포를 DNA 샘플로 수집하고 추후 처리할 때까지 -80℃에서 보관하였다. LCM은 충분한 양의 정제된 종양 세포를 수집하는데 일반적으로 사례 당 1-2 일이 소요되었다. Qiagen 세포 용해 버퍼를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 일치하는 정상의, 조직학적으로 검토된 참조 조직은 유리 슬라이드 상에서 염색되지 않은 동결된 절편을 적절한 DNA 추출 버퍼 안으로 스크래핑함으로써, 각 환자에 대해 동결된 십이지장이나 위 점막으로부터 수집하였다.

표본 처리- cfDNA

EDTA 및 ACD 혈장 샘플은 바이오뱅크 및 캐나다 토론토의 마운트 사이나 병원(MSH)의 가족 의료 센터로부터 획득하였다. 모든 샘플들은 사용할 때까지 -80℃ 에서 또는 증기 상 액체 질소에 보관하였다. QIAamp 순환 핵산 키트(Qiagen)를 사용하여 0.5-3.5ml의 혈장에서 무-세포 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 사용 전에 Qubit을 통해 정량화하였다.

표본 처리-PDX cfDNA

대학 건강 네트워크의 연구 윤리위원회에서 승인한 대학 건강 네트워크 바이오뱅크의 환자 동의로 획득한 인간 대장암 종양 조직을 콜라게나제 A를 사용하여 단일 세포로 분해하였다. 단일 세포를 4-6 주령의 NOD/SCID 수컷 마우스에 피하 주사하였다, 마우스를 CO₂ 흡입에 의해 안락사하고 심장 구멍에 의해 혈액을 수집하여 EDTA 튜브에 저장하였다. 수집된 혈액 샘플로부터 혈장을 분리하고 -80 ℃에서 보관하였다. QIAamp 순환 핵산 키트 (Qiagen)을 사용하여 0.3-0.7ml의 혈장에서 무-세포 DNA를 추출하였다. 모든 동물 실험은 대학 건강 네트워크의 동물관리위원회가 승인한 윤리 규정을 준수하여 수행하였다.

RRBS

LCM-풍부 종양에서 추출한 게놈 DNA, 및 무-세포 DNA를 획득한 동일한 환자에서 얻은 정상 샘플은, Gu et al., 201118의 프로토콜을 약간 수정하여 RRBS를 수행하였다. 간단히 말하면, Qubit을 통해 측정된 10 ng의 게놈 DNA를 제한 효소 MspI를 사용하여 분해한 다음 엔드-리페어(end-repair), A-테일링(A-tailing), 및 Illumina TruSeq 메틸화된 어댑터에 대한 어댑터 연결(adapter ligation)에 적용하였다. 제조된 라이브러리를 Zymo EZ DNA 메틸화 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 바이설페이트 변환을 수행한 후, 160 bp-300 bp의 단편에 대한 겔 크기 선택을 수행하였다. 각 정제된 라이브러리를 증폭시키기위한 최적의 사이클 횟수는 qPCR을 사용하여 결정한 후, 샘플을 KAPA HiFi Uracil + Mastermix(Kapa Biosystems)를 사용하여 증폭시키고 AMPure 비드(Beckman Coulter)로 정제하였다. 최종 라이브러리는 BioAnalyzer 분석을 위해 제출하고 Illumina HiSeq 2000의 UHN Princess Margaret Genomic Center에서 시퀀싱하였다.

외인성 엔테로박테리아 파지 λ PCR 산물의 제조

엔테로박테리아 파지(Enterobacteria phage) λ DNA (ThermoFischer Scientific) 을 표 1의 프라이머를 사용하여 증폭하여, 6개의 상이한 PCR 앰플리콘 산물들을 생성하였다. PCR 반응은 KAPA HiFi Hotstart ReadyMix를 사용하여 다음의 조건에서 수행하였다: 95℃에서 3분간 효소 활성화; 98℃에서 20초, 60℃에서 15초, 72℃ 에서 30초 30 사이클 및 72℃에서 1분간 최종 신장. PCR 앰플리콘들을 QIAQuick PCR purification kit (Qiagen)로 정제하고 겔 상에서 크기 및 증폭을 확인하였다. CpG 메틸트랜스퍼라아제(M.SssI) (ThermoFischer Scientific)를 사용하여 1CpG, 5CpG, 10CpG, 15CpG 및 20CpGL의 앰플리콘들을 메틸화시키고 QIAQuick PCR 정제 키트로 정제 하였다. PCR 앰플리콘들의 메틸화를 제한 효소 HpyCH4IV (New England Biolabs Canada)를 사용하여 시험하고 메틸화를 보장하기 위해 겔에서 작동시켰다. 비메틸화된 (20CpGS) 및 메틸화된 (1CpG, 5CpG, 10CpG, 15CpG, 20CpGL) 앰플리콘들의 DNA 농도를 피코그린을 사용하여 측정한 후 50 % 메틸화된 및 50 % 비 메틸화된 λ PCR 산물과 풀링(pooling)하였다.

cfMeDIP-seq

cfMeDIP-seq 프로토콜의 개략적 도식을 도 2에 나타내었다. cfMeDIP 이전에, DNA 샘플은 Kapa Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems)를 사용하여 라이브러리 준비에 적용하였다. 제조업체 프로토콜을 따르되 약간의 수정을 가하였다. 간단히 말하면, 목적 DNA를 0.2 mL PCR 튜브에 첨가하고 엔드-리페어 및 A-테일링을 수행 하였다. 어댑터 연결은 NEBNext 어댑터(New England Biolabs의 Illumina 키트에 대한 NEBNext Multiplex Oligos)를 사용하여 최종 농도 0.181 μM로 20℃ 에서 20 분간 배양하고 AMPure XP 비드로 정제하였다. 용출된 라이브러리를 USER 효소 (New England Biolabs Canada)를 사용하여 분해한 후, MeDIP 이전에 Qiagen MinElute PCR 정제 키트로 정제하였다.

준비된 라이브러리를 풀링된 메틸화/비메틸화 λ PCR 산물과 합쳐 최종 DNA 량을 100 ng로 하고, 일부 수정사항과 함께 Taiwo et al. 201217 의 프로토콜을 사용하여 MeDIP에 적용하였다. MeDIP의 경우, 일부 수정사항과 함께 제조자의 프로토콜에 따라 Diagenode MagMeDIP 키트 (Cat # C02010021)를 사용하였다. 0.3 ng의 메틸화된 대조군 및 0.3 ng의 비메틸화된 A. thaliana DNA 대조군, 필러 DNA (DNA [cfDNA + 필러 + 대조군들]의 총량을 100 ng으로 완성하기 위함) 및 버퍼를 어댑터 연결된 DNA를 포함하는 PCR 튜브에 첨가한 후, 샘플들을 95℃에서 10 분 동안 가열 한 다음, 즉시 10 분 동안 얼음물 배쓰에 두었다. 각 샘플을 2 개의 0.2 mL PCR 튜브로 나누었다: 하나는 10 % 입력(input) 대조군 용이고, 다른 하나는 면역침전 대상 샘플 용이다. MagMeDIP 키트의 포함된 5-mC 단클론항체 33D3 (Cat # C15200081)을 1:15로 희석한 후 희석 항체 혼합물을 생성하고 샘플에 첨가하였다. 4℃에서 17 시간 동안 배양하기 전에 세척된 자성 비드 (제조자의 지침서에 따름)를 또한 첨가하였다. 샘플을 Diagenode iPure Kit를 사용하여 정제하고 50 μl의 버퍼 C에서 용출하였다. 반응(QC1)의 성공을 스파이크-인된(spiked-in) A. thaliana DNA의 존재를 검출하기 위한 qPCR을 통해 확인하였는데, 이는 다음 단계로 진행하기 전에, 비메틸화된 스파이크-인된(spiked-in) DNA의 % 회수율 <1 % 및 반응의 % 특이성> 99 % (1- [스파이크-인된 메틸화된 대조군 DNA의 회수에 대한 스파이크-인된 비메틸화 대조군 DNA의 회수]로 계산)을 확인시켜 준다. qPCR을 사용하여 각 라이브러리를 증폭하기 위한 최적의 사이클 수를 결정한 후, KAPA HiFi Hotstart Mastermix 를 이용하여 샘플을 증폭하고 NEBNext multiplex oligos를 최종 농도 0.3 μM 에 첨가하였다. 라이브러리를 증폭하는 데 사용된 PCR 설정은 다음과 같다: 95 ℃에서 3 분간 활성화, 98℃에서 20 초, 65℃에서 15 초, 72℃에서 30 초로 미리 결정된 사이클, 및 72℃에서 1 분간 최종 연장. 증폭된 라이브러리를 MinElute PCR 정제 컬럼을 사용하여 정제한 다음 3 % Nusieve GTG 아가로스 겔로 겔 크기를 선택하여 어댑터 이량체를 제거하였다. 시퀀싱을 위해 제출하기 전에, 무세포 DNA를 모방하도록 잘라낸 HCT116 세포(ATCC로부터 수득한 세포주로, 마이코플라즈마 없음)로부터 생성된 MeDIP-seq 및 cfMeDIP-seq 라이브러리에 대해, 메틸화된 인간 DNA 영역(고환-특이적 H2B, TSH2B) 및 비메틸화된 인간 DNA 영역(GAPDH 프로모터)의 폴드-인리치먼트(fold-enrichment)를 결정하였다. 최종 라이브러리는 BioAnalyzer 분석을 위해 제출하고 Illumina HiSeq 2000의 UHN Princess Margaret Genomic Center에서 시퀀싱하였다.

필러 DNA 에서 메틸화의 차이 비율(%)

cfMeDIP-seq는 다음과 같이 프로토콜의 필러 구성요소에서 비메틸화된 람다 DNA에 대한 메틸화된 DNA의 차이% 를 사용하여 수행되었다:

도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 면역침전 전 최종 양을 100ng 로 증가시키는데 사용된 필러 DNA(람다 DNA)는, 비메틸화된 DNA의 최소한의 회수를 가지기 위하여, 바람직하게는 그 조성물 내에 인공적으로 메틸화된 DNA (100% -15%)를 가져야 하는 하며(도 9), 메틸화된 DNA의 회수 측면에서 우수한 수율을 유지하여야 한다(도 10). 100 % 비메틸화된 필러 DNA가 존재하거나 필러 DNA가 존재하지 않는 샘플에서, 메틸화된 DNA의 회수율은 실제로 더 높지만, 비메틸화된 DNA의 회수율(%) 또한 높다. 이는 필러 DNA의 추가적인 메틸화된 DNA가 반응에 존재하는 과량의 항체를 차지하도록 도와, 샘플에서 발견되는 비메틸화된 DNA에 대한 비특이적 결합의 양을 최소화 함을 나타낸다. 다른 무-세포 DNA 샘플을 사용하는 경우 항체의 양을 최적화하는 것이 매우 경제적이거나 실현가능하지 않다는 점을 고려하면, 샘플 전체에 걸쳐 메틸화된 DNA가 얼마나 존재하는지 알 수 없고 이는 샘플 대 샘플로 크게 다를 수 있기 때문에, 이 필러 DNA는 상이한 시작 양들을 정규화하고 그것으로부터 좋은 메틸화 데이터를 회수하면서 다른 무-세포 DNA 샘플들이 동일한 방식으로 처리되도록 돕는다(즉, 동일한 양의 항체 사용).

점 돌연변이 검출을 위한 울트라-딥 표적화된 시퀀싱(Ultra-deep targeted sequencing)

본 발명자들은 QIAgen 순환 핵산 키트를 사용하여 Princess Margaret Cancer Centr의 초기 임상 시험에 등록하기 전에 일치하는 생성된 종양 조직 분자적 프로파일링 데이터가 있는 환자의 혈장(4-5x 10mL EDTA 혈액 튜브) 20mL에서 무-세포 DNA를 분리하였다. PureGene Gentra 키트를 사용하여 세포주 (CRC 및 MM 세포주의 희석)에서 DNA를 추출하고, Covaris 초음파 분쇄기를 사용하여 ~180bp로 단편화하고, 무-세포 DNA의 단편 크기를 모방하기 위해 Ampure beads를 사용하여 더 큰 크기의 단편을 제외하였다. NEXTflex-96 DNA 바코드 어댑터 (Bio Scientific, Austin, TX) 어댑터를 사용하는 KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA)을 사용하여 83 ng의 단편화된 DNA로부터 DNA 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. 알려진 돌연변이를 함유하는 DNA 단편을 분리하기 위해, Illumina TruSeq Amplicon Cancer Panel을 사용하여 임상 시험실에서 테스트 한 48 개 유전자의 돌연변이 핫 스폿을 표적화하는 바이오티닐화된 DNA 포획 프로브(xGen Lockdown Custom Probes Mini Pool, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)를 설계하였다. 바코드 라이브러리를 풀링한 다음 제조자의 지침(IDT xGEN Lockdown 프로토콜 버전 2.1)에 따라 사용자 하이브리드 포획 라이브러리(custom hybrid capture library)에 적용하였다. 이 단편들은 Illumina HiSeq 2000 장비를 사용하여> 10,000X 리드 커버리지(read coverage)로 시퀀싱되었다. 결과물인 리드(read)는 bwa-mem를 사용하여 졍렬되었고 돌연변이는 samtools 및 muTect 버전 1.1.4를 사용하여 검출되었다.

시퀀싱 깊이(sequencing depth)에 의한 검출 확률 및 종양-특이적 특징의 수 간의 모델링 관계

본 발명자들은 암 특이적 메틸화된 DMR의 비율이 0.001 %, 0.01 %, 0.1 %, 1 % 및 10 %로 설정되고 각각 1, 10, 100, 1000 및 10000 개의 독립 DMR로 구성된 145,000 개의 시뮬레이션된 게놈을 만들었다. 본 발명자들은 이러한 오리지널 혼합물로부터 14,500 개의 배수 게놈(diploid genome) (100ng의 DNA를 나타냄)을 샘플링하고, 그 깊이에서 시퀀싱 커버리지를 나타내기 위해 유전자좌 당 10, 100, 1000 및 10000 리드를 더 샘플링하였다. 이 과정은 커버리지, abunDNAce, 및 특징의 수의 각 조합에 대해 100 번 반복되었다. 본 발명자들은 파라미터들의 각 조합에 대해 1 DMR 이상의 성공적인 검출 빈도를 예측하였고 확률 곡선(도 1A)을 작성하여 시퀀싱 깊이에서 성공적인 검출 조건의 확률에 대한 특징의 수의 영향을 시각적으로 평가하였다.

췌장암 환자 및 건강한 공여자의 cfDNA 로부터 차별적으로 메틸화된 영역의 계산과 시각화

24 명의 췌장암 환자(PC) 환자 24 명과 건강한 공여자 24 명의 cfDNA 샘플들 간의 차별적으로 메틸화된 영역(DMR: Differential Methylated Region)은 MEDIPS R 패키지 25를 사용하여 계산하였다. 각 샘플에 대해 MEDIPS R 객체를 생성하기 위해 (인간 게놈 hg19에 대한) BAM 정렬 파일을 사용하였다. 다음으로, DMR은 t- 테스트를 사용하여 두 세트의 샘플로부터의 RPKM을 비교함으로써 계산하였다. t- 테스트의 원시(raw) p 값은 Benjamini-Hochberg 절차를 사용하여 조정하였다. 그런 다음, DMR을 조정된 p 값이 0.1 미만인 모든 윈도우로 정의하였다. 총 38,085 개의 DMR이 발견되었다: 췌장암 환자에서 6,651 과메틸화(Hyper)와 31,544 저메틸화(Hypor). 이러한 DMR들로부터 계측된 RPKM 값을 히트맵(heatmap)으로 표시하였다 (도 5C). 이 히트맵은 거리 함수 "유클리드(euclidean)"와, 열-단위(column-wise) 클러스터링을 위한 클러스터링 함수 "와드(ward)" 및 행-단위(row-wise) 클러스터링을 위한 "평균"으로 만들어졌다.

24개의 췌장암 조직과 5개의 정상 PBMC의 RRBS 샘플 비교

RRBS로 프로파일링된 5개의 정상 PBMC 샘플을 GEO (Accession ID GSE89473하에 모든 대조군 샘플)로부터 다운로드하여 그들의 메틸화 프로파일을 24개의 췌장암 조직 RRBS 샘플의 프로파일과 비교하였다. 다운로드 된 베드(bed) 파일은 R methylKit 패키지 26로 분석되고 처리되었다. 이 다섯 가지 샘플은 다음으로 24명의 췌장암 환자들의 유사하게 처리된 RRBS 샘플과 비교되었다. 24개의 PC 샘플 중 적어도 18개와 5개의 PBMC 샘플 중 4개에 존재하는 CpG를 추출하기 위해 사용자 지정 기능을 사용하였고, 상염색체의 CpG 만 유지되어, 1,806,808 CpG의 백그라운드 세트(Background set)를 생성하였다. 이로부터 Benjamini-Hochberg의 보정 된 p 값 <0.01및 Delta Beta> 0.25의 기준을 사용하여 DMC를 얻었으며, 134,021 DMC는 PBMC와 비교하여 췌장암에서 과메틸화(Hyper)로 확인되었다. 유사하게, 동일한 q 값 컷오프와 델타 베타 <-0.25를 사용하여, 본 발명자들은 179,662 개의 저메틸화(Hypo) DMC를 획득하였다. 총 313,683 DMC는 대응 볼케이노 플롯(도 7F)에서 빨간색 점으로 표시하였으며, q 값의 음수 log10이 델타 베타에 대해 플롯되었다 (음수 log10 q-값 = 2에서의 수평선은 DMC를 호출하기위한 q-값 컷오프을 나타내고, 점선으로 표시된 수직선은 델타 베타 컷오프를 나타냄).

원발성 종양 대 정상 PBMC 에서, 및 췌장암 환자 및 건강한 공여자의 cfDNA에서의 차별적 메틸화 신호의 중첩 여부 평가

순열 분석(Permutation analysis)은 혈장에서 확인된 DMR(우리의 cfMeDIP-seq 프로토콜을 따른 순환 cfDNA 포함)과 원발성 종양 조직에서 확인된 암-특이적 DMC (RRBS 포함) 사이에 예상된 중복 빈도 대 관찰된 중복 빈도를 비교하기 위해 수행되었다. 본 발명자들은 네 가지 가능한 사례를 조사하였다: 하이퍼 DMR과 중첩되는 하이퍼 DMC, 하이포 DMR과 중첩되는 하이퍼 DMC, 하이포 DMR 과 중첩되는 하이포 DMC, 하이퍼 DMR 과 중첩되는 하이포 DMC. 각각의 경우에 하이퍼 또는 하이포 DMC가 하이퍼 또는 하이포 DMR과 중첩되어 "생물학적 교차점(biological intersection)"의 수를 얻었다; 그런 다음 DMC의 각 세트는 1,806,808 CpGs의 백그라운드 세트에서 1000 번 무작위로 섞여서 DMR의 각 세트와 다시 중첩되었다. 이러한 무작위 및 생물학적 교차점은 Z- 점수를 사용하여 동일한 척도로 배치되었고 각각 박스플롯 및 다이아몬드로 표시되었다(도 5E). 이 플롯에서 점선으로 표시된 수평선은 Bonferroni 조정에서 파생된 q 값인 0.05와 관련된 컷오프 Z 점수를 나타낸다.

24개의 췌장암 조직과 24개의 정상 조직의 RRBS 샘플 비교 & 이들 조직들에서 및 췌장암 환자와 건강한 공여자의 cfDNA에서의 차별적인 메틸화 신호의 중첩 여부 평가

5개의 정상 PBMC 샘플과 비교된 24개의 PC 샘플도 각각 동일한 환자의 24개의 정상 조직과 비교하였다. 동일한 방법론을 사용하여 백그라운드 세트 (763,874 CpGs)와 PC의 DMC 하이퍼 & 하이포 (각각 34,013 & 11,160)를 계산하여 동일한 방식으로 볼케이노 플롯 (도 7C) 및 박스플롯 (도 5D)을 구축하였다.

24개 PC 및 24개 건강한 cfDNA 샘플들 대한 PCA 플롯

본 발명자들은 상위 100만개의 가장 다양한 게놈 범위 윈도우를 사용하여 24개의 PC 및 24개의 건강한 cfDNA 샘플에서 PCA로 무감독 클러스터링(unsupervised clustering) 분석을 수행하였다(도 7A-B). 각 윈도우에 대해, MAD (Mean Absolute Deviation) 메트릭을 사용하여 변동성(variability)을 계산하였다. 이는 데이터의 중앙값에서 절대 편차의 중앙값을 반환하는 강력한 측정으로, 여기서 데이터는 주어진 윈도우에 대해 48 개 샘플의 RPKM 값이다.

24개의 PC 및 24개의 건강한 cfDNA 샘플에서 저메틸화된 모티프와 관련된 TF의 GTEx 발현 프로파일을 이용한 히트맵

RNA-Seq 데이터는 모든 인간 유전자에 대한 조직에 의한 중간 RPKM의 형태로 GTEx 데이터베이스에서 얻었다(https://gtexportal.org/home/datasets 에서 GTEx_Analysis_v6p_RNA-seq_RNA-SeQCv1.1.8_gene_median_rpkm.gct.gz 파일에서 입수함). 관심있는 TF는 이들의 유전자명과 일치하고, 모든 조직에 걸쳐 조정된 각 TF의 중간 RPKM으로 히트맵을 구성하였다(도 8A, 8C). 거리 함수 "맨하탄(manhattan)"과 클러스터링 함수 "평균(average)"이 행-단위 및 열-단위 클러스터링에 사용되었다.

24개의 PC 및 24개의 건강한 cfDNA 샘플에서 저메틸화된 모티프와 관련된 TF의 GTEx 발현 프로파일을 이용한 바이올린 플롯

사례들 대 대조군에서 저메틸화된 영역에서 유의적으로 풍부한 모티프를 검출한 TF가 췌장암 샘플에서 유의하게 상향조절되었는지를 추정하기 위하여, ssGSEA 점수를 갖는 무작위 테스트를 검정 통계량(test statistic)으로 사용했다. 각 표본에 대해 본 발명자들은 저메틸화된 모티프와 유의적으로 관련이 있는 것으로 밝혀진 85 TF,및 85 TF의 1,000 무작위 세트를 사용하여 점수를 계산하였다(모든 인간 TF의 리스트는 http://www.tfcheckpoint.org/data/의 TFCheckpoint_download_180515.txt 파일에서 획득함); TCGA에 대한 178 명의 췌장 선암 환자의 발현 수준을 사용 하였다.

이들 점수의 분포는 연관된 바이올린 플롯에서 볼 수 있다(도 8E).

Wilcoxon 's Rank Sum 테스트를 사용하여 무작위 분포 대 관찰 분포를 비교하여 p 값 <2.2e-16을 얻었다.

정상 췌장을 포함한 GTEx 데이터에서도 동일한 분석을 수행하였다 (도 8D). 전체 혈액을 가진 GTEx 데이터에서 건강한 공여자의 혈장 cfDNA에서 저메틸화된 풋프린트로서 모티프가 확인된 TF(n = 33)에 대해서도 분석을 반복하였다(도 8B).

결과/고찰

cfDNA 메틸화 맵핑에 적합한 게놈 범위 방법

본원에 기재된 cfMeDIP-seq 방법은 100ng의 입력(input) DNA까지 견고한 기존의 저 입력 MeDIP-seq 프로토콜(17)을 수정하여 개발되었다. 그러나 대부분의 혈장 샘플들은 100 ng 미만의 DNA를 산출한다. 이 과제를 극복하기 위해, 본 발명자들은 우리는 시작 DNA의 양을 인위적으로 100 ng까지 부풀리기 위하여 외인성 λ DNA (필러 DNA)를 어댑터 연결 cDNA 라이브러리에 첨가하였다(도 2). 이것은 항체에 의한 비-특이적 결합의 양을 최소화하고 또한 플라스틱웨어에 대한 결합으로 인해 손실된 DNA 의 양을 최소화한다. 필러 DNA는 어댑터-연결된 cfDNA 라이브러리와 크기가 유사한 앰플리콘들로 이루어졌으며, 비메틸화된 및 상이한 메틸화 수준으로 시험관내(in vitro) 메틸화된 DNA 로 구성되었다. 이 필러 DNA의 첨가는 다른 환자들이 다른 양의 cfDNA 를 생산하므로 입력 DNA 의 양을 100ng 로 정상화할 수 있어 역시 실용적이다. 이렇게 하면 다운스트림 프로토콜이, 이용가능한 cfDNA 의 양에 관계없이 모든 샘플에 대해 정확히 동일하게 유지된다.

본 발명자들은 먼저 인간 대장암 세포주 HCT116의 DNA를 사용하여 cfDNA에서 관찰 된 것과 유사한 단편 크기로 절단하여 cfMeDIP-seq 프로토콜을 검증하였다. HCT116은 공공 DNA 메틸화 데이터의 이용가능성 때문에 선택하였다. 본 발명자들은 100 ng의 전단 세포주(sheared cell line) DNA를 사용하는 골드 스탠다드 MeDIP-seq 프로토콜(17) 및 10 ng, 5 ng 및 1 ng의 동일한 전단 세포주 DNA를 사용하는 cfMeDIP-seq 프로토콜을 동시에 수행하였다. 이것은 두 번의 생물학적 반복실험으로 수행되었다. 모든 조건에서, 본 발명자들은 반응의 99 % 이상 특이성 (1- [스파이크-인된 메틸화된 대조군 DNA의 회수에 대한 스파이크-인된 비메틸화 대조군 DNA의 회수]), 및 비메틸화된 영역에 대한 알려진 메틸화된 영역의 매우 높은 농도를 얻었다(각각 GAPDH 및 TSH2B0) (도 3B).

라이브러리는 라이브러리 당 약 3,000 만 - 7,000만 리드에서(표 2) 포화 상태로 시퀀싱되었다 (도 3A). 원시 리드(raw read)는 인간 게놈과 λ 게놈 둘 다에 정렬되었고, λ 게놈에 대한 정렬이 사실상 발견되지 않았다(표 3A 및 표 3B). 따라서, 필러 DNA로서 외인성 λDNA를 첨가하여도 시퀀싱 데이터의 생성을 방해하지 않았다. 마지막으로, 본 발명자들은 면역 침전 단계(25)에 대한 품질 제어 수단으로 CpG Enrichment Score를 계산하였다. 모든 라이브러리는 CpG에 대해 유사한 농축을 보인 반면, 입력 대조군(input control)은 예상대로 농축을 보이지 않아(도 3C), 매우 낮은 입력 (1ng)에서도 우리의 면역 침전을 확인하였다.

서로 다른 입력(input) DNA 수준을 비교한 게놈 범위 상관 관계 추정은, 임의의 두 가지 생물학적 복제물 사이의 Pearson 상관 관계가 0.94 이상으로, MeDIP-seq (100 ng) 및 cfMeDIP-seq (10, 5 및 1 ng) 방법 모두 매우 견고하다는 것을 보여준다 (도 1B). 또한 이 분석은 5 및 10 ng의 입력 DNA에서 cfMeDIP-seq가, 100 ng의 전통적인 MeDIP-seq 에서 얻은 메틸화 프로파일을 견고하게 재작성 할 수 있음을 입증한다(Pairwise Pearson 상관 관계가 0.9 이상)(도 1B). 1 ng의 입력 DNA에서 cfMeDIP-seq의 성능은 100 ng에서 MeDIP-seq와 비교하여 감소하지만, 여전히 피어슨 상관 관계는 > 0.7으로 높다(도 1B). 또한 본 발명자들은 cfMeDIP-seq 프로토콜이 골드 스탠다드RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) 및 WGBS (Whole-Genome Bisulfite Sequencing)를 사용하여 HCT116의 DNA 메틸화 프로파일을 반복 함을 관찰하였다(도 1C). 전체적으로, 본원의 데이터는 cfMeDIP-seq이, 순환 cfDNA와 같이 단편화된 저 입력 DNA 물질의 게놈 범위 메틸화 맵핑을 위한 강력한 프로토콜임을 시사한다.

cfMeDIP-seq는 종양-유래 ctDNA 검출에 대한 높은 민감도를 나타낸다.

cfMeDIP-seq 프로토콜의 민감도를 평가하기 위해, 본 발명자들은 다발성 골수종(Multiple Myeloma, MM) MM1.S 세포주 DNA에 대장암(Colorectal Cancer, CRC) HCT116 세포주 DNA를 연속 희석하였는데, 두 세포주 모두 cfDNA 크기를 모방하도록 절단되었다. 본 발명자들은 100 %, 10 %, 1 %, 0.1 %, 0.01 %, 0.001 %에서 0 %로 CRC DNA를 희석하고 각각의 희석액에서 cfMeDIP-seq를 수행했다(도 4A-D). 본 발명자들은 동일한 샘플에서 3개 점 돌연변이를 검출하기 위해 울트라-딥(10,000X 중앙 커버리지) 표적화된 시퀀싱을 수행하였다. 5 % FDR(False Discovery rate) 임계 값을 사용하여 각각의 CRC 희석 지점 대 순수한 MM DNA 에서 확인된 DMR의 관측된 수는, 0.001% 희석까지 감소된 희석 인자(도 1D)에 기반하여 예측된 DMR 수와 함께 거의 완벽하게 선형이었다 (r2 = 0.99, p <0.0001). 또한, 이들 DMR 내의 DNA 메틸화 신호는 관찰된 신호 대 예상된 신호 사이에 거의 완벽한 선형성을 나타낸다 (r2 = 0.99, p <0.0001)(도 1E). 이에 비해, 1 % 희석을 넘어서, 울트라-딥 표적화된 시퀀싱은 PCR 또는 시퀀싱 오류로 인해 CRC-특이적 변이체 및 가짜(spurious) 변이체를 신뢰성있게 구별 할 수 없었다(도 1F). 따라서 cfMeDIP-seq은, 표준 프로토콜을 사용한 울트라-딥 표적화된 시퀀싱에 의한 변이 검출 성능을 뛰어넘는, 암-유래 DNA의 검출에 탁월한 민감도를 나타낸다.

암 DNA는 CpG-풍부 지역에서 빈번하게 과메틸화된다(1). cfMeDIP-seq은 메틸화된 CpG-풍부 서열을 특이적으로 표적화하기 때문에, 본 발명자들은 ctDNA가 면역침전 과정 중에 우선적으로 농축될 것이라는 가설을 세웠다. 이것을 테스트하기 위해 두 명의 대장암 환자에서 환자 유래 이종 이식편 (patient-derived xenograft, PDX)을 생성하고 마우스 혈장을 수집하였다. 종양-유래 인간 cfDNA는 입력 샘플의 전체 cfDNA 풀 내에서 1 % 미만의 빈도로 존재하고, 면역침전 후에는 2 배 더 큰 abunDNAce로 존재하였다(도 1G). 이러한 결과는 ctDNA의 바이어스된 시퀀싱을 통해, cfMeDIP 절차가 ctDNA 검출 민감도를 더 증가시킬 수 있음을 시사한다.

혈장 cfDNA의 메틸롬(methylome) 분석은 건강한 공여자에서 초기 단계의 췌장 선암 환자를 구별한다.

본 발명자들은, 혈장 cfDNA의 메틸롬 분석이 초기 암에서 ctDNA를 검출하는데 사용될 수 있는지 조사하고자 하였다. 본 발명자들은, 24 명의 초기 췌장암 환자(사례) 및 24 명의 연령 및 성별이 일치하는 건강한 공여자(대조군)의 수술 전 혈장에서 메틸롬 분석을 수행하였다 (표 4A, 4B 및 5). 각 환자마다 높은 종양 순도와 정상 조직 샘플을 가진 레이저 캡처 미세절제술 (LCM) 종양 샘플을 검사하였다. cfMeDIP-seq는 종양 및 정상 조직에서 순환 cfDNA 및 RRBS에 대해 수행하였다(도 5A 및 도 6, 표 6A 및 6B). 다중 테스트를 위해 t-test와 Benjamini-Hochberg 보정을 사용하여, 사례 및 대조군 cfDNA 간에 38,085 DMR (p <0.01, q <0.1)을 얻었다(도 5B-C).

환자와 대조군 간의 cfDNA 메틸화 프로파일의 차이가 ctDNA의 존재로 인한 것인지를 평가하기 위해, 외과적 절제술 후 동일한 환자에서 얻은, 원발 종양 및 정상 조직의 DNA 메틸화 패턴을 RRBS를 사용하여 맵핑하였다. 본 발명자들은 종양 (n = 24) 대 정상 조직 (n = 24) 사이에서 45,173 개의 차별화된 메틸화 CpG (DMC)를 확인하였다 (도 7A-C).

오리지널 종양의 메틸화 프로파일을 재현함에 있어서 cfDNA 메틸화 프로파일의 유용성은, 종양에서의 DMC와 cfDNA에서의 DMR 의 조합(둘 다에서 과메틸화된, 둘 다에서 저메틸화된, 하나에서 과메틸화되고 나머지 하나에서 저메틸화된)을 검사하여 백그라운드에 대한 농도를 테스트하였다. 본 발명자들은 종양-특이적 과메틸화 부위가 cfDNA 저메틸화된 DMR에서는 잘 나타나지 않은 반면, cfDNA에서 concorDNAt 방향에서 종양-특이적 과메틸화된 및 저메틸화된 부위에 대한 유의적 농축을 관찰하였다 (도 5D). 실제로, 종양 내의 주어진 영역에 대한 DNA 메틸화 상태와 혈장 cfDNA의 메틸화 프로파일 사이에는 상관 관계가 있다 (도 7D-E).

마지막으로, 암 환자의 혈장 cfDNA 분자의 대부분이, 특히 초기 단계에서, 비-종양에서 유래되어 혈액 세포로부터 방출되기 쉽기 때문에(14), 본 발명자들은 정상적인 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대한 췌장 선암 종양 조직 간의 DNA 메틸화 차이를 평가하였다. 본 발명자들은 종양(n = 24) 대 PBMC(n = 5) 사이에 313,683 개의 DMCs를 확인했다(도 7F). 본 발명자들은 종양-특이적 과메틸화된 부위가 cfDNA 저메틸화된 DMR 에서는 잘 나타나지 않은 반면, cfDNA에서 concorDNAt 방향에서 종양 -특이적 과메틸화된 및 저메틸화된 부위에 대한 유의적 농축을 관찰하였다 (도 5E). 다시 말하지만, 종양의 주어진 영역에 대한 DNA 메틸화 상태와 혈장 cfDNA의 메틸화 프로파일 사이에는 상관 관계가 있다 (그림 7G-H).

종합적으로, 이러한 결과는 사례들 및 대조군들 간의 순환 cfDNA 메틸화 프로파일의 차이가, 주로 순환계의 종양-유래 DNA의 존재로 인한 것임을 시사한다(도 5D-E 및 도 7C-H).

혈장 cfDNA 메틸롬은 종양-관련 활성 전사 인자 네트워크의 추론을 가능하게 한다

사례와 대조군 간의 DMR이 종양-유래 DMR에 대해 매우 풍부했기 때문에(도 5D-E), 본 발명자들은 cfDNA 메틸롬이 종양-특이적 또는 조직-관련 활성 전사 인자와 관련된 모티프에 대한 농축을 나타낼 것이라는 가설을 세웠다. 이러한 cfDNA 메틸롬은 이러한 DNA 분자의 기원 조직에서 활성 전사 네트워크를 추론하는 데 사용될 수 있다. 활성 전사 네트워크를 추론하기 위해, 본 발명자들은 TF의 대다수가 표적 서열의 DNA- 메틸화 상태에 기반하여 다양한 결합을 나타내는 것처럼(28), cfDNA의 DMR이 전사 인자 (TF) 풋프린트에 대한 농축을 밝힐 수 있는지 조사했다. 잠재적인 TF 풋프린트를 밝혀내기 위해, 건강한 공여자(도 8A) 및 췌장암 환자(도 8C)에 대해 각각 저메틸화된 DMR(20)에 대해 HOMER 소프트웨어(20)을 사용하여 모티프 분석을 수행하였다.

본 발명자들은 췌장 선암 사례와 비교하여 건강한 공여자에서 저메틸화된 풋프린트로서 33개 모티프를 확인하였고, 건강한 공여자와 비교하여 췌장 선암 케이스에서 저메틸화된 풋프린트로서 85개 모티프를 확인하였다.

건간한 공여자에서 저매틸화된 풋프린트로 확인된 33개 모티프 중에서, 본 발명자들은 PU.1, Fli1, STAT5B, 및 KLF1을 포함하는, 조혈 계통에서 우선적으로 발현하는 여러 TF들을 확인하였다(도 8A-B).

유사하게, 췌장 선암 사례에서 저매틸화된 풋프린트로 확인된 85개 모티프 중에서, 본 발명자들은 RBPJL, PTF1a, Onecut1 (HNF6) 및 NR5A2를 포함하는, 췌장에서 우선적으로 발현하는 여러 TF들을 확인하였다(도 8C-D). 췌장 선암 환자에서 저메틸화 풋프린트로 확인된 TF 모티프들 역시 TCGA로부터 췌장 선암 환자에서 빈번하게 과발현되었다(도 8E). 또한, 본 발명자들은 이전에 췌장암의 각 분자적 아형의 드라이버로서 확인된 TF에 해당하는 췌장 선암 사례에서(24) 몇 개의 저메틸화 풋프린트를 확인할 수 있었다. 여기에는 c-MYC및 HIF1a (Squamous subtype drivers), NR5A2, MAFA, RBPJL, NEUROD1 (ADEX drivers) 및 최종적으로 FOXA2 및 HNF4A (pancreatic progenitor subtype)가 포함된다.

결론적으로, 이러한 결과들은 순환 cfDNA의 메틸롬 분석이 차별적으로 메틸화된 TF 풋프린트를 기반으로 종양 내에서 활성 전사 네트워크를 추론하고 건강한 공여자와 암 환자 간의 면역 세포 집단의 시스템적 변화를 잠재적으로 확인하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.

여기서 본 발명자들은 순환 무-세포 DNA와 같이, 매우 낮은 입력과 단편화된 DNA에 적합한 게놈 단위 DNA 메틸화 방법을 제시한다. 본 발명자들은 cfMeDIP-seq이 낮은 수준의 입력 DNA에서 매우 견고하며 라이브러리를 신속하게 생성 할 수 있음을 보여주었다. 더욱이 본원의 방법은 메틸화된 DNA의 농축에 의존하기 때문에, 라이브러리를 포화 상태로 시퀀싱하기 위해 라이브러리 당 약 3천만 내지 7천만의 리드만이 필요하므로, 전체 게놈 시퀀싱이 불필요하며 관련 비용이 현저하게 절감된다. 상대적으로 적은 비용과 더불어 신속한 처리 시간으로 인해 cfMeDIP-seq를 임상 설정으로 신속하게 변환할 수 있다.

더욱이, cfMeDIP-seq는 게놈 정보가 아니라 후성 유전에 의존하기 때문에, 광범위한 비-악성 질환에서 비-침습적으로 조직 손상을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 감염에 대한 면역 반응이나 암 면역 요법 후에 모니터링하는데 사용될 수 있다. 심근 경색 후 순환계의 심장 DNA 또는 신경 퇴행성 질환의 초기 단계 동안 뇌 DNA 를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.

마지막으로, 종양학의 측면에서, 여러 암 유형은 임상적으로 구분되는 하위 그룹을 가지고 있는 것으로 나타났다. 이러한 하위 그룹은 다른 많은 암 유형 중에서도 교모세포종(3), 뇌실막세포종(4), 대장암(5), 유방암(6,7) 및 췌장암(24)에서 진단적 가치가 있는 상이한 DNA 메틸화 프로파일에 의해 계층화될 수 있다. 최근 데이터는 췌장암 환자가 몇가지 가지 메커니즘에 의해 유도된 4 개의 하위 그룹으로 계층화 될 수 있다고 제안한다(24): 편평 세포, 췌장 전구 세포, 면역 원성 및 비정상적으로 분화된 내분비 외분비 (aberrantly differentiated endocrine exocrine, ADEX). 췌장암 환자의 순환 cfDNA 메틸롬에서, 본 발명자들은 이들 아형을 유도하는 TF로부터 저메틸화된 풋프린트를 확인할 수 있었다. 예를 들어, 본 발명자들은 편평세포 아형에 풍부한 두 경로인, MYC와 HIF1 알파 (Hypoxia-inducible factor 1-alpha)를 확인하였다(24). 본 발명자들은 또한, 전구세포 아형에서 풍부한 두 개의 TF인, HNF4A와 FOXA2를 확인할 수 있었다(24). 마지막으로 본 발명자들은 ADEX 아형에서 풍부한 세 가지 TF 인, NR5A2, RBPJL 및 MAFA를 확인할 수 있었다(24). 이것은 cfMeDIP-seq가 최소한의 침습적 접근법을 사용하여 암 환자를 계층화하는 바이오마커로 사용될 수 있음을 시사한다.

본 발명은 특정 구체예에 대하여 설명되었다. 본 발명의 사상 및 범위를 유지하는 내에서 변형 및 변화가 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백 할 것이다. 본 명세서에 개시된 특정 구체예는, 청구항에 의해서만 결정되어야 하는 보호 범위를 제한하지 않는다. 본원에 개시된 모든 공개 문헌과 참고 문헌은 그 전체가 참조로서 본 발명에 포함된다.

표

표 1: Taiwo et al., 2012로부터의 엔테로박테리아 파지 λ PCR 산물을 생성하는데 사용된 PCR 프라이머

명칭	정방향 프라이머	역방향 프라이머
1CpG	GAGGTGATAAAATTAACTGC	GGCTCTACCATATCTCCTA
5CpG	CATGTCCAGAGCTCATTC	GTTTAAAATCACTAGGCGA
10CpG	CTGACCATTTCCATCATTC	GTAACTAAACAGGAGCCG
15CpG	ATGTATCCATTGAGCATTGCC	CACGAATCAGCGGTAAAGGT
20CpGL	GAGATATGGTAGAGCCGCAGA	TTTCAGCAGCTACAGTCAGAATTT
20CpGS	CGATGGGTTAATTCGCTCGTTGTGG	GCACAACGGAAAGAGCACTG

표 2: 인간 Hg19 게놈 및 λ 게놈에 대해 cfDNA를 모방하기 위해 절단된 HCT116 세포주 DNA의 다양한 농도를 사용하여 준비된 시퀀싱된 MeDIP-seq 및 cfMeDIP-seq 라이브러리의 리드 수 및 맵핑 효율. 100 ng 미만의 시작 농도의 경우, MeDIP 전에 샘플을 외인성 λ DNA로 채워 시작 양을 인위적으로 100 ng로 증가시켰다.

샘플	원시 리드의 # (# of Raw reads)	인간 게놈(H19)에 대해 정렬된 리드의 # (# of Aligned reads to human genome (Hg19))	인간 게놈(H19)에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to human genome (Hg19))	λ 게놈에 대해 정렬된 리드의 # (# of Aligned reads to λ genome)	λ 게놈에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to λ genome)
입력(Input)	74,504,053	71,343,168	95.76	12	0.00
100 ng 복제물 1	55,396,238	50,472,273	91.11	0	0.00
100 ng복제물 2	66,569,209	60,770,277	91.29	1	0.00
10 ng 복제물 1	70,054,607	64,020,441	91.39	0	0.00
10 ng 복제물 2	58,297,539	53,308,777	91.44	0	0.00
5 ng 복제물 1	65,845,430	60,540,743	91.94	1	0.00
5 ng 복제물 2	64,750,879	59,358,412	91.67	0	0.00
1 ng 복제물 1	35,102,361	32,258,451	91.90	0	0.00
1 ng 복제물 2	33,881,118	31,194,711	92.07	0	0.00

표 3a: 췌장암 환자의 cfDNA를 사용하여 준비된 시퀀싱된 cfMeDIP-seq 라이브러리의 인간 Hg19 게놈 및 λ 게놈에 대한 리드 수 및 맵핑 효율성

사례	원시 리드의 # (# of Raw reads)	정령된 리드의 # (# of Aligned Reads)	인간 게놈(H19)에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to human genome (Hg19))	λ 게놈에 대해 정렬된 리드의 # (# of Aligned reads to λ genome)	λ 게놈에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to λ genome)
1	49,970,366	46,120,982	92.30	1	0.00
2	55,642,277	50,829,279	91.35	0	0.00
3	48,034,998	43,973,048	91.54	0	0.00
4	56,274,788	51,456,978	91.44	0	0.00
5	50,999,157	46,608,023	91.39	1	0.00
6	55,127,192	50,906,050	92.34	0	0.00
7	53,955,550	49,028,646	90.87	0	0.00
8	55,482,420	51,194,364	92.27	1	0.00
9	57,626,914	53,446,965	92.75	0	0.00
10	58,397,946	53,904,793	92.31	0	0.00
11	59,048,723	54,529,214	92.35	0	0.00
12	54,514,051	49,619,174	91.02	1	0.00
13	70,758,028	63,842,005	90.23	0	0.00
14	60,317,171	55,124,638	91.39	0	0.00
15	45,187,670	41,341,336	91.49	0	0.00
16	50,755,880	46,309,615	91.24	2	0.00
17	51,582,370	47,256,012	91.61	1	0.00
18	52,081,710	47,763,766	91.71	0	0.00
19	53,845,426	48,602,035	90.26	0	0.00
20	48,133,619	43,658,379	90.70	0	0.00
21	54,237,903	49,286,048	90.87	0	0.00
22	58,627,625	53,654,439	91.52	1	0.00
23	52,748,183	49,179,765	93.23	0	0.00
24	60,072,026	55,046,660	91.63	0	0.00

표 3b: 건강한 공여자의 cfDNA를 사용하여 준비된 시퀀싱된 cfMeDIP-seq 라이브러리의 인간의 Hg19 게놈과 λ 게놈에 대한 리드 수 및 맵핑 효율성

대조군	원시 리드의 # (# of Raw reads)	정령된 리드의 # (# of Aligned Reads)	인간 게놈(H19)에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to human genome (Hg19))	λ 게놈에 대해 정렬된 리드의 # (# of Aligned reads to λ genome)	λ 게놈에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to λ genome)
1	44,162,563	40,184,943	90.99	1	0.00
2	33,350,539	30,585,488	91.71	0	0.00
3	43,937,337	40,160,512	91.40	0	0.00
4	44,292,409	40,182,945	90.72	0	0.00
5	54,732,283	50,135,420	91.60	0	0.00
6	52,576,198	48,139,158	91.56	0	0.00
7	47,619,930	42,684,336	89.64	0	0.00
8	51,213,827	46,529,314	90.85	0	0.00
9	48,935,317	44,487,195	90.91	1	0.00
10	56,055,796	51,971,671	92.71	0	0.00
11	54,769,256	50,075,252	91.43	0	0.00
12	50,625,023	45,869,378	90.61	1	0.00
13	51,015,277	46,252,402	90.66	0	0.00
14	58,266,281	53,191,317	91.29	1	0.00
15	55,663,935	50,447,271	90.63	0	0.00
16	44,004,381	39,533,012	89.84	1	0.00
17	55,459,971	50,786,298	91.57	0	0.00
18	52,610,463	48,293,244	91.79	0	0.00
19	46,806,153	42,677,554	91.18	0	0.00
20	63,267,324	57,692,667	91.19	0	0.00
21	51,213,236	46,637,533	91.07	0	0.00
22	54,380,628	49,267,997	90.60	0	0.00
23	44,608,650	40,685,531	91.21	0	0.00
24	52,118,117	47,734,519	91.59	0	0.00

표 4a : 췌장암 환자들의 성별 및 나이

사례	성별 (1 = 남성, 2 = 여성)	연령 범위
1	1	70<75
2	2	65<70
3	1	50<55
4	1	65<70
5	2	60<65
6	2	80<85
7	1	60<65
8	2	70<75
9	2	60<65
10	1	50<55
11	1	70<75
12	2	50<55
13	1	60<65
14	2	75<80
15	2	55<60
16	2	80<85
17	1	55<60
18	2	55<60
19	2	65<70
20	2	60<65
21	1	65<70
22	1	65<70
23	2	<50
24	1	65<70

표 4b: 건강한 공여자들의 성별 및 나이

사례	성별 (1 = 남성, 2 = 여성)	연령 범위
1	1	60<65
2	2	55<60
3	1	70<75
4	1	85+
5	2	80<85
6	2	<50
7	1	80<85
8	2	60<65
9	2	85+
10	1	60<65
11	1	70<75
12	2	55<60
13	1	50<55
14	2	70<75
15	2	70<75
16	2	80<85
17	1	50<55
18	2	70<75
19	2	70<75
20	2	70<75
21	1	75<80
22	1	<50
23	2	60<65
24	1	80<85

표 5: 췌장 선암 사례 샘플의 병리학

병리학적 병기	사례 수
I-II	23
III-IV	1

표 6a: 췌장암 환자의 높은 종양 순도를 가진 레이저-캡처 미세절제-풍부(LCM) 종양 샘플을 사용하여 준비된 시퀀싱된 RRBS 라이브러리의 리드 수, 맵핑 효율, 바이설파이트 변환 효율 및 CpG 커버리지

종양 케이스	원시 리드의 # (# of Raw reads)	인간 게놈(H19)에 대해 정렬된 리드의 # (# of Aligned reads to human genome (Hg19))	인간 게놈(H19)에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to human genome (Hg19))	바이설파이트 변환 효율	10 리드의 최소 커버리지를 가진 CpG의 # (# of CpGs with a minimum coverage of 10 reads)
1	36,348,593	22,050,682	60.7	99.65	1,152,313
2	56,788,591	35,512,606	62.5	98.29	1,790,326
3	55,115,742	35,229,781	63.9	98.94	1,630,272
4	58,503,145	37,373,806	63.9	99.48	1,777,824
5	54,364,708	34,274,401	63.0	98.84	2,053,577
6	57,291,238	34,912,515	60.9	99.23	2,001,726
7	42,683,835	25,509,282	59.8	97.79	1,471,270
8	51,393,779	31,437,264	61.2	99.52	1,745,355
9	66,023,766	41,284,714	62.5	99.17	1,788,895
10	37,026,164	20,805,815	56.2	98.67	1,435,724
11	40,053,025	22,116,738	55.2	99.47	1,521,135
12	42,065,012	23,591,687	56.1	98.22	1,599,425
13	34,527,362	22,101,495	64.0	99.79	733,408
14	38,624,627	23,317,534	60.4	99.82	952,714
15	36,799,407	22,072,921	60.0	98.45	1,442,393
16	33,672,535	19,735,978	58.6	98.70	1,064,718
17	51,918,938	32,239,409	62.1	99.08	1,810,260
18	26,344,807	15,531,839	59.0	99.87	792,650
19	43,744,321	26,819,066	61.3	98.45	1,510,987
20	49,861,059	28,520,788	57.2	97.75	1,852,841
21	44,061,826	27,903,839	63.3	99.68	1,368,522
22	55,029,698	33,444,993	60.8	99.10	2,006,233
23	70,468,323	45,424,428	64.5	97.86	2,331,030
24	42,043,232	24,828,943	59.1	97.44	1,520,504

표 6b : 건강한 공여자 및 췌장암 환자의 레이저-캡처 미세절제-풍부(LCM) 정상 조직 샘플을 사용하여 준비된 시퀀싱된 RRBS 라이브러리의 리드 수, 맵핑 효율, 바이설파이트 변환 효율 및 CpG 커버리지

정상 조직 케이스	원시 리드의 # (# of Raw reads)	인간 게놈(H19)에 대해 정렬된 리드의 # (# of Aligned reads to human genome (Hg19))	인간 게놈(H19)에 대한 맵핑 효율 (Mapping efficiency to human genome (Hg19))	바이설파이트 변환 효율	10 리드의 최소 커버리지를 가진 CpG의 # (# of CpGs with a minimum coverage of 10 reads)
1	44,991,458	25,708,044	57.1	98.88	1,688,179
2	50,603,038	30,001,913	59.3	99.81	1,767,046
3	50,790,690	31,585,415	62.2	99.61	1,733,966
4	49,480,382	30,017,286	60.7	99.60	1,895,462
5	46,587,496	29,742,054	63.8	98.94	1,648,785
6	55,402,162	33,193,299	59.9	99.10	2,149,673
7	35,010,018	20,646,990	59.0	99.83	1,188,194
8	51,130,341	30,543,069	59.7	99.64	1,780,696
9	53,415,206	32,049,549	60.0	99.63	1,720,213
10	40,977,129	22,109,663	54.0	99.60	1,690,112
11	37,913,346	20,202,691	53.3	98.35	638,859
12	47,943,388	26,962,401	56.2	97.74	1,467,609
13	28,416,315	16,532,481	58.2	98.36	1,214,093
14	34,809,298	20,603,577	59.2	99.26	1,105,920
15	36,930,467	21,513,886	58.3	99.76	1,434,653
16	38,762,192	23,242,114	60.0	99.79	1,539,278
17	51,257,989	29,870,486	58.3	99.66	1,915,596
18	28,789,569	17,038,843	59.2	98.21	1,222,106
19	41,387,115	25,996,349	62.8	98.57	1,712,186
20	31,704,499	17,421,599	54.9	99.41	977,256
21	44,152,396	26,604,688	60.3	99.68	1,646,272
22	46,462,469	27,012,950	58.1	99.43	1,940,763
23	53,534,041	33,359,195	62.3	99.50	1,650,915
24	37,042,798	22,775,661	61.5	99.31	435,114

Claims

(a) (i) 개체의 핵산 샘플에서 유래한 핵산 분자 및 (ii) 필러(filler) 핵산 분자를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계로서, 상기 필러 핵산 분자는 외인성이고 상기 개체의 상기 핵산 샘플에서 유래하지 않는, 단계; 및
(b) 상기 핵산 분자의 메틸화된 영역을 농축하기에 충분한 조건 하에서 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 필러 핵산 분자가 상기 메틸화된 영역의 농축율을 증가시키는, 단계
를 포함하고,
단계 (a)의 혼합물이 (i) 상기 핵산 분자를 포함하는 복수의 핵산 분자 및 (ii) 상기 필러 핵산 분자를 포함하는 복수의 필러 핵산 분자를 포함하고,
단계 (b)가, 상기 복수의 필러 핵산 분자를 사용하여 상기 복수의 핵산 분자의 복수의 메틸화된 영역을 농축하는 것을 포함하는 것인 개체의 핵산 샘플을 처리하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 핵산 분자가 DNA(deoxyribonucleic acid)인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 핵산 샘플이 무-세포 DNA (cfDNA) 샘플인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 복수의 메틸화된 영역이 99% 이상의 특이도로 농축되는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 복수의 필러 핵산 분자가 5% 이상의 메틸화된 필러 DNA(deoxyribonucleic acid) 분자를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 복수의 필러 핵산 분자의 필러 핵산 분자가 50 bp(base pair) 내지 800bp의 길이를 갖는 것인, 방법.
제6항에 있어서,
상기 길이가 100 bp 내지 600 bp인, 방법.
제6항에 있어서,
상기 길이가 200 bp 내지 600 bp인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 혼합물이 50 ng 이상의 핵산 분자를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
단계 (b)가 상기 복수의 핵산 분자의 상기 복수의 메틸화된 영역의 메틸화된 영역의 하나 이상의 메틸화된 뉴클레오티드에 결합하는 결합제를 포함하는 것인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 결합제가 메틸-CpG-결합 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는 것인, 방법.
제11항에 있어서,
상기 단백질이 MBD2 단백질인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 결합제가 항체를 포함하는 것인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 항체가 5-MeC 항체인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 항체가 5-하이드록시메틸 사이토신 항체인, 방법.
제10항에 있어서,
상기 결합제가 상기 복수의 핵산 분자의 비-메틸화된 뉴클레오티드에 대한 비-특이적 결합 수준의 감소를 나타내는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 복수의 핵산 분자 또는 이의 유도체를 분석하여 상기 핵산 샘플의 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR: Differential Methylated Region)을 확인하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 DMR 이 과메틸화를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 DMR 이 저메틸화를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 분석이 상기 복수의 핵산 분자 또는 이의 유도체를 시퀀싱하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제17항에 있어서,
상기 DMR을 건강한 대조군의 핵산 샘플의 DMR을 이용하여 처리하는 것을 더욱 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 개체가 췌장 선암(PDAC)을 가지거나 가진 것으로 의심되는, 방법.
(a) 개체의 핵산 샘플을 제공하는 단계; 및
(b) 2.8 이상의 CpG 농축 점수(Enrichment Score)에서 하나 이상의 메틸화된 영역에 대해 상기 하나 이상의 핵산 분자를 농축하기에 충분한 조건 하에서 상기 핵산 분자 샘플에서 유래한 하나 이상의 핵산 분자를 처리하는 단계로서, 상기 2.8 이상의 CpG 농축 점수는 상기 하나 이상의 메틸화된 영역의 CpG 빈도를 상기 개체의 게놈의 CpG 빈도로 나눔으로써 결정되는 것인, 단계
를 포함하는, 개체의 핵산 샘플을 처리하는 방법.
제23항에 있어서,
상기 핵산 샘플이 무-세포 DNA (cfDNA) 샘플인, 방법.
제24항에 있어서,
단계 (b)가 (i) 상기 하나 이상의 핵산 분자 및 (ii) 필러(filler) 핵산 분자를 포함하는 혼합물을 생성하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제23항에 있어서,
상기 CpG 농축 점수가 최소한 2.9 내지 3.3 인, 방법.
제23항에 있어서,
단계 (b) 가 농축된 샘플을 산출하고, 단계 (b) 이후에, 상기 농축된 샘플 또는 이의 유도체를 분석하여 상기 핵산 샘플의 하나 이상의 DMR을 확인하는 것인, 방법.
제27항에 있어서,
상기 분석이 시퀀싱을 포함하는 것인, 방법.
제23항에 있어서,
상기 하나 이상의 메틸화된 영역이 99% 이상의 특이도로 농축되는 것인, 방법.
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