CN111154846A

CN111154846A - 一种甲基化核酸的检测方法

Info

Publication number: CN111154846A
Application number: CN202010035112.6A
Authority: CN
Inventors: 谢丹; 曹凤; 张俊
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明提供了一种甲基化核酸的检测方法，包括如下步骤：1)将2个以上核酸样品连接上带不同标签的测序接头，混合，得混合核酸样品；2)将混合核酸样品、不带测序接头的filler DNA和带测序接头的spike‑in混合；3)使用加热后冷却的方式得到单链核酸；4)使用识别甲基化DNA的抗体捕获甲基化核酸；5)测序。本发明的方法可以在保证甲基化捕获效率的同时，极大地提高实验效率(每管中的反应可检测多个样本)，降低试验成本(m6A抗体、捕获磁珠、DNA纯化磁珠用量大幅减少，同时节约了filler DNA的用量)，省略了spike‑in的qPCR定量检测步骤，减少了测序样本在测序前的消耗，相比现有的cfMeDIP‑seq技术有较大提升。

Description

一种甲基化核酸的检测方法

技术领域

本发明属于核酸检验领域。

背景技术

游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是被正常或肿瘤组织释放到血液循环中的DNA片段，检测cfDNA逐渐成为肿瘤诊断的重要辅助手段。cfDNA的甲基化，是cfDNA检测的一项重要内容。

MeDIP-seq(甲基化DNA免疫共沉淀测序技术)是一项常用的甲基化DNA检测技术，其原理是利用能特异性识别甲基化DNA的抗体捕获具有甲基化修饰的DNA片段，然后对捕获片段进行二代测序。该方法难以应用于cfDNA的检测，因为待测样本中cfDNA含量极低(通常低于10ng/ml血浆)，而MeDIP-seq的最低上样量是160-300ng。

Shu Yi Shen等在MeDIP-seq的基础上，发明了cfMeDIP-seq(游离核酸甲基化DNA免疫共沉淀测序)技术，通过在cfDNA中加入完全甲基化及未甲基化的已知Lamda噬菌体DNA片段，实现了游离核酸中的甲基化DNA片段的捕获并进行测序分析。进一步地，该方法的技术路线如下：首先，将cfDNA加连接上Illumina二代测序建库的接头序列，纯化后完成建库；取1-100ng建好的cfDNA文库加入适量的filler DNA使二者的总量至少为100ng，并加入甲基化和未甲基化的拟南芥DNA片段(spike-in，由Diagenode MagMeDIP kit(C02010021)试剂盒提供)作为质控，以便建库完成后检测甲基化DNA捕获的回收率及特异性。接下来通过高温将DNA变性为单链，加入抗体和磁珠孵育过夜。之后将捕获的DNA纯化后通过对spike-in进行qPCR质检确定回收率和特异性，再通过PCR建库后测序(Preparation of cfMeDIP-seq libraries for methylome profiling of plasma cell-free DNA,NatProtoc.2019Aug 30.doi：10.1038/s41596-019-0202-2.)。

cfMeDIP-seq对样本量要求较低，只需使cfDNA文库与filler DNA总量不低于100ng即可，克服了传统的MeDIP-seq技术进样量不足的问题；但又产生了新的问题；(1)需要较多的filler DNA，制备成本较高；(2)需要对spike-in进行qPCR质检，较为繁琐；(3)通量低，每个反应只能处理一个样品，成本高。

发明内容

为了解决前述问题，本发明提供了一种新的甲基化核酸的检测方法。

本发明的技术方案包括：

一种甲基化核酸的检测方法，包括如下步骤：

1)将2个以上核酸样品连接上带不同标签的测序接头，得混合核酸样品，再与filler DNA、带测序接头的spike-in混合；

2)使用加热后冷却的方式得到单链核酸；

3)使用识别甲基化DNA的抗体捕获甲基化核酸；

4)使用与核酸样品和spike-in的测序接头相匹配的测序引物，对捕获到的甲基化核酸进行DNA测序；

filler DNA是序列已知的DNA，包括甲基化修饰的DNA以及未被甲基化修饰的DNA；

spike-in是序列已知的DNA，包括甲基化修饰的DNA、羟甲基化修饰的DNA以及未被甲基化修饰的DNA；

spike-in与filler DNA序列不同；

步骤1)所述的混合核酸样品和filler DNA的DNA含量总和不低于100ng。

如前述的检测方法，所述filler DNA中甲基化修饰的DNA以及未被甲基化修饰的DNA的质量比是15∶85到85∶15；优选地，为1∶1。

如前述的检测方法，所述spike-in中甲基化修饰的DNA、羟甲基化修饰的DNA以及未被甲基化修饰的DNA的质量比是(1～2)∶(1～2)∶(1～2)；优选地，为1∶1∶1。

如前述的检测方法，所述filler DNA是Lamda噬菌体DNA的PCR扩增产物。

进一步地，所述filler DNA是用序列如SEQ ID NO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12的引物扩增Lamda噬菌体DNA所得产物。

如前述的检测方法，所述序列如SEQ ID NO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10的引物分别用于扩增得到甲基化修饰的filler DNA，所述序列如SEQ ID NO.11-12的引物用于扩增得到未被甲基化修饰的filler DNA；

优选地，序列如SEQ ID NO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12的引物扩增得到的filler DNA的质量比为：1∶1∶1∶1∶1∶5。

如前述的检测方法，所述spike-in是Lamda噬菌体DNA的PCR扩增产物。

进一步地，所述spike-in是用序列如SEQ ID NO.13-14、15-16、17-18的引物扩增Lamda噬菌体DNA所得产物。

如前述的检测方法，所述序列如SEQ ID NO.13-14、15-16、17-18的引物分别用于扩增无甲基化、甲基化和羟甲基化的spike-in。

如前述的检测方法，步骤1)的核酸样品数量为2-100个；优选地，为4个。

如前述的检测方法，还包括对测序结果分析，计算捕获到的spike-in的数量来评估甲基化DNA捕获的特异性。

如前述的检测方法，步骤1)的核酸样品是cfDNA样品。

相比文献报道的cfMeDIP-seq技术，本发明具有如下有益效果：

本发明的方法可以在保证甲基化捕获效率的同时，极大地提高实验效率(每管中的反应可检测多个样本)，降低试验成本(主要是m6A抗体、捕获磁珠、DNA纯化磁珠用量大幅减少，同时节约了filler DNA的用量)，省略了spike-in的qPCR定量检测步骤，减少了测序样本在测序前的消耗，相比现有的cfMeDIP-seq技术有较大提升。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：测序Reads数统计。

图2：重复序列(Duplication)占比统计。

图3：spike-in数目统计；“混合建库”指本发明的混合捕获方法；“单独建库”指文献报道的单独捕获的方法。

图4：测序信号位于基因组中的“峰”个数统计。

图5：全基因组范围内测序“峰”的分布轮廓图。

图6：1号染色体上“峰”的分布轮廓图。

图7：4号染色体上“峰”的分布轮廓图。

具体实施方式

实施例1本发明的检测方法

1.filler DNA的制备

1.1扩增

以Lamda噬菌体基因组(λ-DNA)为模板，用6对引物PCR扩增出6个扩增子。引物序列如表1所示。

表1 filler DNA的扩增引物

PCR体系如下：

PCR反应程序如下：

94℃ 2min；94℃ 20s，53/65℃ 30s，72℃ 60s，40个循环；72℃，5min。

扩增完成后，使用常规核酸纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。

1.2甲基化修饰

Qubit dsDNA HS Assay Kit定量检测后，将DNA分为两份，一份进行甲基化修饰反应，一份作为对照，反应体系表2所示。

表2甲基化修饰处理体系

修饰后，使用商用核酸纯化试剂盒对核酸纯化。

1.3酶切鉴定

使用甲基化敏感的限制性内切酶HpyCH4 IV对1.2节甲基化修饰的DNA和对照进行甲基化修饰程度的鉴定。

1.4定量

将前述6个λ-DNA来源的扩增子(包括甲基化修饰的1CpG，5CpG,10CpG，15CpGand20LCpG和未甲基化修饰的20SCpG)分别用Qubit HS DNA kit定量，计算浓度后，将5种甲基化的DNA片段等量混合，然后与20SCpG以50∶50的比例混合(如每种甲基化DNA片段各10ng混合后，再加入50ng未甲基化的20SCpG)，即得filler DNA。

2.spike-in的准备

spike-in包括浓度已知的λ噬菌体的甲基化、羟甲基化和非甲基化DNA，带有测序接头，经由人工制备而成：

先使用PCR扩增得到甲基化、羟甲基化和非甲基化DNA，再将其混合，具体参数如下：

2.1扩增引物所需引物序列如下：

2.2 PCR扩增体系

甲基化spike-in：

羟甲基化spike-in：

未修饰的spike-in：

2.3混合

将甲基化、羟甲基化和非甲基化DNA可按照任意比例(但实验前需要记录比例)混匀。本例中，甲基化、羟甲基化和非甲基化DNA质量取常规比例1∶1∶1。

3.甲基化免疫共沉淀(捕获)

将cfDNA连接上二代测序接头序列，纯化后得到cfDNA文库。

取40-60ng的filler DNA与2个以上(优选4～8个，本例中为4个)cfDNA文库混合，制备100ng的文库DNA(Library DNA)，再与0.3pg(加入的spike-in量范围从0.1-2pg/100ng文库均是可行的)的spike-in混合，进行甲基化免疫共沉淀富集。具体步骤如下：

3.1磁珠准备

每个样品取11ul磁珠，用22ul 1×Magbuffer A(Diagenode MagMeDIP kit(C02010021))洗涤两次，22ul 1×Magbuffer A重悬。样品数量增加时，磁珠量依次倍增。

3.2抗体稀释

加水稀释抗m6A抗体(Diagenode MagMeDIP kit(C02010021)，稀释体积比是1∶15。m6A抗体理论上特异性识别甲基化DNA，而不识别羟甲基化和非甲基化DNA。

3.3 Antibody Mix(抗体预混液)制备

按表3制备，表3所示是单次反应(100ng文库DNA)的用量，不管混合几个样品，一个反应都是加入5ul Antibody Mix。

表3 AntibodyMix体系

3.4 Incubation Mix(孵育预混液)制备

按表4所示体系混合，再置于95℃变性10min后，立即置于冰浴中10min，目的是打开DNA双链，使其变成单链。

表4 Incubation Mix体系

试剂	体积(μl)
		5×Magbuffer A	24
Magbuffer B(Diagenode MagMeDIP kit(C02010021))	6
		已添加spike-in的文库DNA	不确定
H2O	补足至90ul
		Total	90

3.5孵育

Incubation Mix与Antibody Mix混合，4℃孵育过夜(17h)，孵育体系如下：

Antibody Mix 5ul

Incubation Mix 75ul

磁珠 20ul

将剩余的Incubation Mix作为对照置于4℃过夜。

3.6洗涤

(1)取出Mix，瞬时离心，置于预冷的磁力架上1min，弃上清；

(2)用MagWash buffer-1洗三次。加入Magwash buffer-1 100ul，吹打混匀，4℃旋转混匀5min，置于磁力架上1min，弃上清，重复3次；

(3)用150ul Magwash buffer-2洗一次，洗涤方法同上，上清吸干净；

4.洗脱纯化

以下旋转混匀均用40rpm。

4.1 DNA洗脱

(1)取7.5ul Input，加入92.5ul Elution buffer，室温放置；

(2)向磁珠沉淀中加入50ul Elution buffer，室温旋转混匀15min，置于磁力架1min，将洗脱液吸至新管。再向磁珠中加入50ul Elution buffer洗脱一次，两次的洗脱液混合，得到100ul洗脱液；

4.2 DNA结合

(1)向Input和MeDIP样品中分别加入2ul Carrier RNA，涡旋，瞬时离心；

(2)向各样品分别加入100ul 100％异丙醇，涡旋，瞬时离心；

(3)将Ipure kit中的磁珠涡旋重悬，向各样品分别加入磁珠10ul，吹打混匀，RT旋转混匀10min；

4.3洗涤及洗脱

(1)Wash buffer 1(已加入异丙醇)100ul洗一次，40rpm室温旋转混匀5min；

(2)Wash buffer2(已加异丙醇)100ul洗一次，40rpm室温旋转混匀5min；

(3)加44ul Buffer C洗脱40rpm室温旋转混匀5min；

(4)将洗脱液吸至新管，得测序用DNA模板。

5.测序

5.1测序建库反应体系

5.2测序建库反应条件

如表5所示。

表5 PCR建库反应条件

5.3用0.8×磁珠纯化，Labchip检测文库。

5.4 Illumina测序仪测序。

测序完成后，可对捕获得到spike-in进行数目统计，根据捕获后的spike-in数目确定抗体捕获甲基化DNA的效率。

以下用实验例的形式对本发明有益效果进一步说明。

实验例1本发明混合捕获方法的效果验证

从4个不同的志愿者甲、乙、丙、丁的血浆中提取cfDNA，Qubit HS DNA kit定量后，分别进行本发明多样品混合捕获甲基化cfDNA的方法(同实施例1)，以及背景技术中文献(Preparation of cfMeDIP-seq libraries for methylome profiling of plasma cell-free DNA，Nat Protoc.2019 Aug 30.doi：10.1038/s41596-019-0202-2)报道的cfMeDIP-seq单个样品捕获测序检测。

样品编号Mix1-4对应本发明方法，Sample1-4对应cfMeDIP-sep方法。

结果如下：

1.测序Reads数和duplication数。

如图1所示，测序数据量相当的情况下，本发明方法的单个样品的reads数与单个样品实验获得的reads数相当。

图2显示了duplication reads比率(duplication率)，本发明方法的duplication率比cfMeDIP-sep的要稍高，但总体维持在25％以内，不影响数据质量(duplication率可以通过降低测序数据量及减少建库时的循环数来降低)。

2.spike-in数目统计

如图3所示，本发明混合样品后仅捕获到5mC修饰的spike-in片段，5C和5hmC修饰片段均未捕获到，说明混合捕获的特异性非常好。

注：5mC，5-甲基胞嘧啶；5hmC，5-羟甲基胞嘧啶；5C，未甲基化的胞嘧啶。

3.获得的peak数量比较

通过m6A抗体捕获到的含5mC的DNA片段，数据分析之后进行可视化，在GenomeBrowser软件上看到的一个个峰(peak)，没有捕获到的基因组区域则不会有峰出现。

如图4所述，2种方法获得的单个样品的peak数目没有明显差别。

表明本发明的方法获得的数据与cfMeDIP方法一致，混合捕获方法可靠。

4.peak位置的比较

全基因组范围的peak分布如图5所示，两种方法获得的全基因组24条染色体的peak分布一致。

图6和图7分别展示了1号和4号染色体上peak分布情况，进一步表明，两种方法获得的peak分布在各染色体的peak分布一致。

综上，本发明的方法捕获甲基化DNA片段的能力强，捕获特异性好，其测序检测的准确性高，在数据质量达到了现有的cfMeDIP的水平的基础上，进一步可提高甲基化核酸检测通量，提高效率，并节约试剂(m6A抗体、甲基化捕获磁珠及DNA纯化磁珠)，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种甲基化核酸的检测方法

<130> GYKH1094-2020P018813CC19JS115

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggtgataa aattaactgc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggctctacca tatctccta 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgtccaga gctcattc 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtttaaaatc actaggcga 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgaccattt ccatcattc 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtaactaaac aggagccg 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtatccat tgagcattgc c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cacgaatcag cggtaaaggt 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagatatggt agagccgcag a 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttcagcagc tacagtcaga attt 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgatgggtta attcgctcgt tgtgg 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcacaacgga aagagcactg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtttccgtt cttcttcgtc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tactcgcacc gaaaatgtca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtggcgggtt atgatgaact 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cataaaatgc ggggattcac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgaaaacgaa aggggatacg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtccagctgg gagtcgatac 20

Claims

1.一种甲基化核酸的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将2个以上核酸样品连接上带不同标签的测序接头，得混合核酸样品，再与fillerDNA、带测序接头的spike-in混合；

2)使用加热后冷却的方式得到单链核酸；

3)使用识别甲基化DNA的抗体捕获甲基化核酸；

spike-in与filler DNA序列不同；

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述filler DNA中甲基化修饰的DNA以及未被甲基化修饰的DNA的质量比是15∶85到85∶15；优选地，为1∶1。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述spike-in中甲基化修饰的DNA、羟甲基化修饰的DNA以及未被甲基化修饰的DNA的质量比是(1～2)∶(1～2)∶(1～2)；优选地，为1∶1∶1。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述filler DNA是用序列如SEQ IDNO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12的引物扩增Lamda噬菌体DNA所得产物。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述序列如SEQ ID NO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10的引物分别用于扩增得到甲基化修饰的filler DNA，所述序列如SEQ ID NO.11-12的引物用于扩增得到未被甲基化修饰的filler DNA；

优选地，序列如SEQ ID NO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12的引物扩增得到的fillerDNA的质量比为：1∶1∶1∶1∶1：5。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述spike-in是用序列如SEQ IDNO.13-14、15-16、17-18的引物扩增Lamda噬菌体DNA所得产物。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO.13-14、15-16、17-18的引物分别用于扩增无甲基化、甲基化和羟甲基化的spike-in。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)的核酸样品数量为2-100个；优选地，为4个。

9.如权利要求1-8任一所述的检测方法，其特征在于，还包括对测序结果分析，计算捕获到的spike-in的数量来评估甲基化DNA捕获的特异性。

10.如权利要求1-8任一所述的检测方法，其特征在于，步骤1)的核酸样品是cfDNA样品。