CN114045342A - 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114045342A
CN114045342A CN202111455145.7A CN202111455145A CN114045342A CN 114045342 A CN114045342 A CN 114045342A CN 202111455145 A CN202111455145 A CN 202111455145A CN 114045342 A CN114045342 A CN 114045342A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
kit
cfdna
methylation
library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111455145.7A
Other languages
English (en)
Inventor
***
刘琦
赵金银
段心语
许立志
李�杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Gentalker Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Dalian Gentalker Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Gentalker Biotechnology Co ltd filed Critical Dalian Gentalker Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111455145.7A priority Critical patent/CN114045342A/zh
Publication of CN114045342A publication Critical patent/CN114045342A/zh
Priority to PCT/CN2022/111606 priority patent/WO2023098137A1/zh
Priority to GB2308241.5A priority patent/GB2620492A/en
Priority to US18/337,131 priority patent/US20230392190A1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种cfDNA甲基化突变的检测方法及试剂盒，属于癌症早期筛查技术领域。首先构建cfDNA基因文库和filler DNA片段，混合后获得cfDNA基因文库与filler DNA混合物，加入5‑mC抗体进行免疫共沉淀反应，对混合物中的DNA甲基化片段进行甲基化捕获，然后经纯化、洗脱得到捕获后产物片段；经过扩增富集、纯化回收并筛选，得到上机文库；使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得cfDNA甲基化突变情况。本发明的检测方法及试剂盒的检测灵敏度高，实验成本低，同时大大降低了传统检测出现的假阳性率，使结果更加可靠。

Description

一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于癌症早期筛查技术领域，尤其涉及一种新型cfDNA甲基化突变的检测方法及试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤，俗称癌症。由于机体细胞失去正常调控，过度增殖而失去正常调控，过度增殖而引起的疾病。癌细胞可发生发展于体内大多数器官和组织中，可侵犯周围组织，甚至可经体内循环/淋巴***转移到身体其他部分。据统计，癌症是全球第二大死亡原因，2018年约有1800万新发病例以及960万死亡病例。到2030年，预计全年将有2600万新发病例以及1700万死亡病例，对人类生命健康具有严重威胁。晚期癌症通常缺乏有效的治疗方法，但癌症若在早期发现，生存率将显著提高，五年生存约为91％，尽可能的在最早阶段发现肿瘤是治疗关键。近年来，在癌症早期诊断研究中，cfDNA已成为一种有前景的肿瘤生物标志物，具有巨大的早期诊断潜力。
癌症的发生、发展和转移机制的研究基于不同的平台，涉及基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和表观基因组。最近，表观基因组在正常细胞和癌细胞中的作用得到了证实，并取得了快速进展，表观基因组主要由DNA甲基化和染色质配置调控，通过改变核小体结构及其定位来调节基因表达。在正常人类细胞中，核小体保持开放构象，启动子区域没有DNA甲基化位点，而在肿瘤中核小体间距相对封闭。研究表明，DNA甲基化突变已被定义为癌症发生发展的关键事件。DNA甲基化发生于CpG位点，通过DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用，在胞嘧啶碱基的5’碳位置添加一个甲基形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化模式在癌症中频发，包括反转录因子、着丝粒和癌基因的DNA低甲基化事件等。5mC改变具有区分癌细胞和正常细胞的能力，其表观遗传谱可作为多种肿瘤标志物，用于早期诊断检测、预后监测，成为基因检测研究热点。
传统的DNA甲基化检测普遍采用重亚硫酸盐处理后进行高通量测序法，该方法由于cfDNA数量有限，并且重亚硫酸盐可导致约84％的DNA降解损失，CpGs全基因组丰度低，信息回收率有限，导致其检测灵敏度受限，结果可靠度低，检测所需成本高。
发明内容
为解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种基于免疫沉淀的cfDNA甲基化突变的检测方法以及检测试剂盒，本发明的检测方法灵敏、可靠、无重亚硫酸盐处理即可进行早期癌症筛查。
本发明目的是通过以下方式实现：
本发明提供一种cfDNA甲基化突变的检测方法，主要包括以下步骤：
(1)提取全血游离DNA，经过末端修复、末端加“A”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建cfDNA基因文库；
(2)将步骤(1)构建的cfDNA基因文库与提前构建好的filler DNA混合，获得cfDNA基因文库与filler DNA混合物，保证起始投入量达到100ng以上；
(3)将5-甲基胞嘧啶抗体(5-mC抗体)与步骤(2)得到的cfDNA基因文库与fillerDNA混合物进行免疫共沉淀反应，对混合物中的高DNA甲基化片段进行甲基化捕获，然后经纯化、洗脱得到捕获后产物片段；
(4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增富集，然后利用AMPure XP磁珠对扩增产物进行纯化回收并筛选，得到最终上机文库；
(5)使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得cfDNA甲基化突变情况。
进一步地，步骤(1)中所述的游离DNA通过
Figure BDA0003387175690000021
Circulating Nucleic AcidKit试剂盒提取获得。
进一步地，步骤(1)中所述的末端修复、末端加“A”通过End Repair&A-TailingEnzyme Mix反应体系完成。
进一步地，步骤(2)中所述的filler DNA未添加测序接头，目的仅为扩大cfDNA测序投入起始量。
进一步地，步骤(2)中所述的Filler DNA为6个不同大小、不同CpG密度(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG和20SCpG)的PCR扩增子组成，5个不同CpG含量的片段(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG片段)被甲基化，1个片段(20SCpG片段)未被甲基化。
进一步地，步骤(2)中所述的filler DNA以λDNA为模板进行PCR反应，纯化回收，对所得的PCR片段进行甲基化，纯化回收后获得。
进一步地，步骤(2)中所述的filler DNA由50％(wt/wt)甲基化片段(1CpG,5CpG,10CpG,15CpG和20CpGL片段)和50％(wt/wt)未甲基化片段(20CpGS PCR扩增)组成。
进一步地，步骤(3)中所述的甲基化捕获通过Diagenode MagMeDIP kit及Diagenode iPure kit V2试剂盒完成。
进一步地，步骤(4)中所述的扩增富集通过LM-PCR进行。
进一步地，步骤(5)中所述的Illumina测序平台包括Illmina NextSeq 500、Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq。
本发明一方面提供一种用于上述的cfDNA甲基化突变的检测方法的试剂盒，所述的试剂盒包括以下成分：高通量测序文库构建组分、filler DNA片段、免疫共沉淀反应、甲基化捕获及纯化回收组分和文库富集组分。
进一步地，所述的高通量测序文库构建组分主要包括高通量文库构建中常用的末端修复、加“A”及连接接头所需要的酶及illumina测序平台专用测序接头。
进一步地，所述的filler DNA片段为6个不同大小、不同CpG密度(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG和20SCpG)的PCR扩增子组成，5个不同CpG含量的片段(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG片段)被甲基化，1个片段(20SCpG片段)未被甲基化。
进一步地，所述的filler DNA片段以λDNA为模板进行PCR反应，纯化回收，对所得的PCR片段进行甲基化，纯化回收后获得。
进一步地，所述的PCR反应所需的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-12所示。
进一步地，所述的免疫共沉淀反应、甲基化捕获及纯化回收组分主要包括免疫沉淀反应所需的缓冲液试剂、抗体蛋白和甲基化捕获用的磁珠以及用于纯化回收所需要的试剂和洗脱buffer。
进一步地，所述的文库富集组分主要包括文库扩增所需要的酶及buffer，以及产物回收纯化、片段筛选所需要的磁珠。
本发明还提供上述试剂盒在泛癌种早筛中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的cfDNA甲基化突变的检测方法避免了重亚硫酸盐处理对DNA造成的降解损失，该发明不同于传统甲基化测序法，不依赖于重亚硫酸盐，核心为甲基化免疫沉淀法，使用5-mc甲基化抗体特异性抓取DNA甲基化区域片段，使样本中所有的甲基化变异DNA均沉淀富集。得到的样本均为筛选后基因组中含有甲基化的DNA部分，使反应特异性可达到99％，检测灵敏度高，实验成本降低，同时大大降低了传统检测出现的假阳性率，使结果更加可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为本发明的cfDNA甲基化突变的检测方法实验流程图；
图2样本S1-1DMRs测序深度统计图；
图3样本S1-2 DMRs测序深度统计图。
具体实施方案
下面将结合实例对本发明的实施方案进行详细的描述，但是本领域技术人员将会理解。在本发明各实施方案中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是即使没有这些技术细节，也可以实现本申请各权利要求保护的技术方案。
以下实例所使用的设备和试剂如下：外周血循环DNA基因组(cfDNA)提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，核酸扩增仪ABI2720，MeDIP试剂盒(比利时Diagenode公司)，文库制备试剂盒(美国Kapa biosystems公司)，测序平台Illumina NextSeq 500。
实施例1：filler DNA混合物的制备
filler DNA可提前根据实验规模批量构建，置于-20℃保存。filler DNA不添加测序接头，并未被纳入文库，目的仅为扩大cfDNA测序投入起始量，因此对后续测序结果无影响，具体操作过程如下。
1.设计filler DNA构建所需的引物
为解决cfDNA数量有限，cfDNA甲基化突变率低，本发明通过构建filler DNA/文库混合物，大幅度提高cfDNA测序起始投入量，使投入量达到100ng。Filler DNA为6个不同大小、不同CpG密度(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG和20SCpG)的PCR扩增子组成。它们由肠杆菌噬菌体(λ-DNA)片段组成，由PCR产生，然后在体外甲基化(在适当位点)。5个CpG含量不同的片段被甲基化，1个片段未甲基化，它们与哺乳动物基因组没有共同的同源性，fillerDNA构建所需引物如表1所示。
表1.filler DNA构建所需的引物列表
Figure BDA0003387175690000051
2.filler DNA的构建
filler DNA片段制备以λDNA为模板进行PCR反应，反应体系如表2所示：
表2.filler DNA的构建反应体系
Figure BDA0003387175690000052
Forward primer与Reverse primer为表1中提供的1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20CpGL、20CpGS引物，对上述6对引物分别单独进行PCR扩增，反应体系配制好后混匀离心，置于PCR仪上按照如下反应条件进行PCR反应：热盖温度105℃，98℃,30s；98℃,10s，57℃,10s，72℃,15s，共30个循环；72℃5min，4℃ever。
PCR反应后使用天根DNA产物纯化回收试剂盒进行PCR产物纯化回收，30μL超纯水洗脱。Qseq验证片段大小及Qubit定量，得到选定的PCR片段。
3.对选定的PCR片段进行甲基化
使用上步扩增得到的PCR片段1CpG,5CpG,10CpG,15CpG和20CpGL，分别对每个片段进行甲基化，反应体系如表3所示：
表3.PCR片段甲基化的反应体系
Figure BDA0003387175690000061
置于PCR仪中进行如下程序：37℃ 15min，65℃ 20min。
反应后使用天根DNA产物纯化回收试剂盒进行产物纯化回收，30μL纯水洗脱，Qubit定量。
filler DNA最终将由50％(wt/wt)甲基化片段(1CpG,5CpG,10CpG,15CpG和20CpGL片段)和50％(wt/wt)未甲基化片段(20CpGS PCR扩增)组成。将各片段产物按照表4所示比例混合得到filler DNA混合物。
表4.filler DNA混合物的组成
Figure BDA0003387175690000062
实施例2:两例肺癌患者血浆游离DNA(cfDNA)样本的甲基化突变检测
我们与医院合作，采取了2例癌症患者的血浆样本，运用本申请提供的方法对患者血浆样本游离DNA(cfDNA)进行甲基化突变检测，以说明本专利的可行性与实用性。具体操作流程如下：
1.样品采取以及运送保存
本发明样本采集选取人全血，采集2例癌症患者(编号为S1-1,S1-2)的3ml静脉血于装有EDTA/枸橼酸葡萄糖抗凝剂的收集管中。样本在常温环境中运输尽快送达实验室，在2-8℃条件下保存不超过3天，-20℃保存不超过1个月，需长期保存的样本放置于-80℃条件下。从样品采集之日起尽快完成基因组DNA的提取。
2.提取血游离DNA(cfDNA)
分别提取了编号为S1-1,S1-2两名患者的血浆游离DNA(cfDNA)样本。提取后的样品于Qubit3.0进行浓度定量，可暂放置于-20℃冰箱冷冻保存。
血浆游离DNA的提取方法参照Qiagen公司的
Figure BDA0003387175690000071
Circulating NucleicAcid Kit试剂盒，操作步骤如下所示：
1)用移液器将1mL的血浆样本加入一个干净的50mL离心管中，做好标记，加入200μL的Proteinase K与0.8mL的ACL，点振涡流30s，在60℃水浴孵育30min；
2)加入1.8mL的ACB buffer(确认已加入异丙醇)，点振涡流30s，冰上孵育5min；
3)将小的20mL扩张器***mini柱上，将mini柱***真空器上待用，将步骤2)中所得溶液倒入扩张器中后打开真空泵(真空压在-200～-800Mpa)液体抽干后关闭真空泵，做好标记；
4)加入600μL的ACW1(确认加入无水乙醇)到扩张器中开真空泵(真空压在-200～-800Mpa)液体抽干后关闭真空泵；
5)加750μL的ACW2(确认加入无水乙醇)到扩张器中开真空泵(真空压在-200～-800Mpa)液体抽干后关闭真空泵；
6)加750μL的无水乙醇(96％～100％)到扩张器中开真空泵(真空压在-200～-800Mpa)液体抽干后关闭真空泵；
7)弃扩张器，留mini柱放到2mL离心管中，14000rpm离心3min；
8)放入56℃金属浴干燥10min(开盖)；
9)将mini柱放到新的1.5mL离心管中，加入55μL的水室温放置5min；注：洗脱缓冲液AVE平衡至室温(15-25℃)且必须分配到膜的中心；
10)在14000rpm离心1min洗脱cfDNA。
3.文库制备
将血浆游离DNA样本进行文库构建实验，经过末端修复、加“A”及连接等过程，将2组DNA片段连上不同的index测序接头(相关试剂来自KAPA Hyper Prep Kit Illuminaplatforms)。具体程序在文库制备试剂盒协议基础上进行轻微改动，步骤如下：
1)末端修复及3’端加A，反应体系如表5所示：
表5.末端修复及3’端加A的反应体系
Figure BDA0003387175690000081
使用移液器吸打混匀(避免剧烈震荡混匀)，短暂离心；
反应条件：热盖温度85℃，20℃30min；65℃30min；4℃ever。
2)连接接头
将上述反应的PCR管中，按如表6在冰盒上配制反应体系：
表6.连接接头的反应体系
Figure BDA0003387175690000082
使用移液器吸打混匀(避免剧烈震荡混匀)，短暂离心；
反应条件：关闭热盖，20℃15min；4℃ever。
3)连接后纯化：
①PCR反应结束后向样品中加入88μL Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀；
②室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上3min待溶液澄清；
③保持PCR管在磁力架上，移除上清，向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s；
④保持PCR管在磁力架上，移除上清，向PCR管中加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
⑤室温孵育5min，使残留的乙醇彻底挥发；
⑥加入42μL Nuclease-free water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀；
⑦室温静置2min后，将PCR管置于磁力架上2min待溶液澄清；
⑧吸取40μL上清液转移到新的PCR管中，标记样品信息，得到连接后的文库产物。
4.甲基化捕获
甲基化捕获实验所需试剂均来自于试剂盒Diagenode MagMeDIP kit及DiagenodeiPure kit V2，具体步骤如下：
(1)试剂准备
1)稀释5×Mag Buffer到工作液浓度，按照下表比例稀释：
表7. 5×Mag Buffer的稀释比例
Figure BDA0003387175690000091
2)取11μL Magnetic beads到新的EP管中，将EP管置于磁力架上，待澄清后吸去上清。
3)用27.5μL冰浴的1×Mag Buffer清洗Magnetic beads两次。后用22μL1×MagBuffer重悬Magnetic beads后转移至新的EP管中放置冰上备用。
4)按照下表制备试剂Mag master mix备用：
表8.Mag master mix的配制比例
Figure BDA0003387175690000092
5)将5-mC抗体试剂对半稀释后按照下表比例进行配制成抗体反应液备用：
表9.抗体反应液配制比例
Figure BDA0003387175690000093
Figure BDA0003387175690000101
(2)免疫沉淀反应
1)将准备好的cfDNA文库与filler DNA混合物按照比例混合后与上步骤准备好的Mag master mix按下表比例混合在0.2ml PCR管中，震荡混匀。
表10.cfDNA文库与filler DNA混合比例
Figure BDA0003387175690000102
将混合好的PCR管置于PCR仪上，95℃变性3min，后立即置于冰上，取75μL混合物到新的PCR管中。
2)将准备好的5μL抗体反应液加入到PCR反应管中。
3)将准备好的20μL Magnetic beads组分加入到PCR反应管中，混匀后，4℃震荡孵育过夜。
(3)甲基化DNA片段纯化回收
1)按照下表配制Elution Buffer(BufferA使用前需室温放置30min)：
表11.Elution Buffer的配制
Figure BDA0003387175690000103
2)加入50μL Elution Buffer到上步免疫沉淀反应PCR管中，混匀后室温震荡孵育15min。
3)将PCR反应管置于磁力架上1min，将上清转移至新的EP管中。
4)再向原PCR反应管中加入50μL Elution Buffer混匀磁珠后室温震荡孵育15min。将PCR反应管置于磁力架上1min，将上清转移至EP管中。
5)向EP管中加入2μL Carrier，短暂涡旋并瞬时离心。
6)向EP管中加入100μL异丙醇，短暂涡旋并瞬时离心。
7)向EP管中加入10μL Magnetic beads，混匀后室温震荡孵育10min。
8)将EP管置于磁力架上1min，吸弃上清，向管中加入25μL Buffer C，颠倒混匀重悬磁珠后室温震荡孵育15min。
9)将EP管置于磁力架上1min，吸取25μL上清到新的EP管中，得到甲基化捕获后的DNA片段，用于下游实验。
5.甲基化捕获后文库扩增富集、纯化及筛选
利用上步甲基化捕获后得到的cfDNA文库片段，进入样本的LM-PCR富集操作。LM-PCR反应体系如以下表所示：
表12.LM-PCR反应体系
Figure BDA0003387175690000111
PCR反应条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共14个循环；72℃延伸1min；4℃保温。
PCR反应后，利用纯化磁珠AMPure beads纯化PCR扩增产物并进行片段筛选，得到样本文库，质检后用于测序分析。具体步骤如下：
①将Agencourt AMPure XP磁珠从4℃冰箱取出平衡至室温，涡旋震荡混匀后使用；向上步骤PCR产物中加入50μL磁珠，吸打混匀，室温静置5min后，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
②保持PCR管置于磁力架上，移除上清，向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s；
③保持PCR管置于磁力架上，移除上清，再次向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
④室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；
⑤加入32μL的Nuclease-free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀，静置2min；
⑥将PCR管置于磁力架上2min待溶液澄清，吸取30μL上清液，转移到新的PCR管中，做好标记；
⑦向PCR管中加入15μL磁珠，吸打混匀，室温静置5min后，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
⑧保持PCR管置于磁力架上，吸取上清到新的PCR管中，向管中加入12μL磁珠，吸打混匀，室温静置5min后，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
⑨保持PCR管置于磁力架上，移除上清，向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s；
⑩保持PCR管置于磁力架上，移除上清，再次向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
Figure BDA0003387175690000121
室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；
Figure BDA0003387175690000122
加入32μL的Nuclease-free Water，将PCR管从磁力架取下，吸打混匀，静置2min；
Figure BDA0003387175690000123
将PCR管置于磁力架上2min待溶液澄清，吸取30μL上清液，转移到新的PCR管中，做好标记；
Figure BDA0003387175690000124
经Qubit定量和Qseq片段质检后进行后续测序实验，或将文库置于-20℃冰箱中保存。
6.高通量测序及结果分析
经过上述方法构建出了甲基化捕获后的样本测序文库，利用illumina测序平台的pair-End测序技术，如Illmina NextSeq 500、Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq进行测序，获得DNA混合物的序列，每个样本至少需30Mreads。
分析流程从FastQC分析原始读取的基本QC开始，然后使用Trim Galore修剪adaptor污染。使用BWA-mem或Bowtie 2将修剪后的数据与参考基因组进行比对，使用SAMtools将得到的SAM文件转换为BAM文件格式。后利用生信分析对人基因组上14716个高甲基化区域(DMRs)进行测序深度统计分析，生成DMR分析数据及样本甲基化程度评分，根据建立的数据模型评判样本甲基化突变程度。对2例cfDNA样本的结果分析如下：
表13.样本测序后分析结果
Figure BDA0003387175690000125
利用本发明提供的甲基化突变的检测方法能更好地保存样本本身甲基化突变状态，因此检测结果更为准确可靠，减少检测过程中样本DNA的降解损失，可大幅提高检测灵敏度和特异性。根据表13分析结果可以看出，2例临床样本的检测结果可靠，测序数据质量较好，本发明提供的检测方法准确有效。图2、3展示了2例样本14716个甲基化区域深度情况，根据生信分析方法及肿瘤早筛大数据模型评判2例临床样本为高风险结果，与临床信息吻合。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连晶泰生物技术有限公司
<120> 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒
<130> 20211129
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaggtgataa aattaactgc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggctctacca tatctccta 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
catgtccaga gctcattc 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtttaaaatc actaggcga 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgaccattt ccatcattc 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtaactaaac aggagccg 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgtatccat tgagcattgc c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacgaatcag cggtaaaggt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gagatatggt agagccgcag a 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tttcagcagc tacagtcaga attt 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgatgggtta attcgctcgt tgtgg 25
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcacaacgga aagagcactg 20

Claims (10)

1.一种cfDNA甲基化突变的检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)提取全血游离DNA，经过末端修复、末端加“A”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建cfDNA基因文库；
(2)将步骤(1)构建的cfDNA基因文库与提前构建好的filler DNA混合，获得cfDNA基因文库与filler DNA混合物；
(3)将5-甲基胞嘧啶抗体与步骤(2)得到的cfDNA基因文库与filler DNA混合物进行免疫共沉淀反应，对混合物中的DNA甲基化片段进行捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段；
(4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增富集，然后利用磁珠对扩增产物进行纯化回收并筛选，得到最终上机文库；
(5)使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得cfDNA甲基化突变情况。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的游离DNA通过QI
Figure FDA0003387175680000011
Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒提取获得；所述的末端修复、末端加“A”通过End Repair&A-Tailing Enzyme Mix反应体系完成。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的Filler DNA为6个不同大小、不同CpG密度的PCR扩增子组成，5个不同CpG密度的片段被甲基化，1个片段未被甲基化，甲基化片段和未甲基化片段的质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的甲基化捕获通过Diagenode MagMeDIP kit及Diagenode iPure kit V2试剂盒完成；步骤(4)中所述的扩增富集通过LM-PCR进行；步骤(5)中所述的Illumina测序平台包括Illmina NextSeq 500、Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq。
5.一种用于权利要求1-4任一项所述的cfDNA甲基化突变的检测方法的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒主要包括以下成分：高通量测序文库构建组分、filler DNA片段、免疫共沉淀反应、甲基化捕获及纯化回收组分和文库富集组分。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的高通量测序文库构建组分主要包括高通量文库构建中的末端修复、加“A”及连接接头所需要的酶及illumina测序平台专用测序接头。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的filler DNA片段以λDNA为模板进行PCR反应，纯化回收，对所得的PCR片段进行甲基化，纯化回收后获得；所述的PCR反应所需的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-12所示。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的免疫共沉淀反应、甲基化捕获及纯化回收组分主要包括免疫沉淀反应所需的缓冲液试剂、抗体蛋白和甲基化捕获用的磁珠以及用于纯化回收所需要的试剂和洗脱buffer。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的文库富集组分主要包括文库扩增所需要的酶及buffer，以及产物回收纯化、片段筛选所需要的磁珠。
10.权利要求5-9任一项所述的试剂盒在泛癌种早筛中的应用。
CN202111455145.7A 2021-12-01 2021-12-01 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒 Pending CN114045342A (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111455145.7A CN114045342A (zh) 2021-12-01 2021-12-01 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒
PCT/CN2022/111606 WO2023098137A1 (zh) 2021-12-01 2022-08-11 一种游离dna甲基化突变的检测方法及试剂盒
GB2308241.5A GB2620492A (en) 2021-12-01 2022-08-11 Method and kit for detecting methylation mutation of free DNA
US18/337,131 US20230392190A1 (en) 2021-12-01 2023-06-19 Method and kit for detecting cell-free dna methylation

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111455145.7A CN114045342A (zh) 2021-12-01 2021-12-01 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114045342A true CN114045342A (zh) 2022-02-15

Family

ID=80211945

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111455145.7A Pending CN114045342A (zh) 2021-12-01 2021-12-01 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230392190A1 (zh)
CN (1) CN114045342A (zh)
GB (1) GB2620492A (zh)
WO (1) WO2023098137A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115323058A (zh) * 2022-10-17 2022-11-11 深圳市睿法生物科技有限公司 一种基于ctDNA甲基化模式的癌种定位方法
WO2023098137A1 (zh) * 2021-12-01 2023-06-08 大连晶泰生物技术有限公司 一种游离dna甲基化突变的检测方法及试剂盒
CN116287266A (zh) * 2023-03-07 2023-06-23 江苏先声医学诊断有限公司 Dna复制晚期区域在泛癌种诊断中的应用
CN116555426A (zh) * 2023-05-04 2023-08-08 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种鉴定肿瘤组织来源的试剂盒及数据分析方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017193833A1 (zh) * 2016-05-10 2017-11-16 广州嘉检医学检测有限公司 一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒
CN109415763A (zh) * 2016-05-03 2019-03-01 大学健康网络 捕获无细胞的甲基化dna的方法及其用途
CN111154846A (zh) * 2020-01-13 2020-05-15 四川大学华西医院 一种甲基化核酸的检测方法
CA3157323A1 (en) * 2019-11-06 2021-05-14 Samantha L. WILSON Synthetic spike-in controls for cell-free medip sequencing and methods of using same
CN113584168A (zh) * 2021-07-19 2021-11-02 深圳泰莱生物科技有限公司 基于甲基化免疫沉淀高通量测序技术的肺癌检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088433B (zh) * 2011-11-02 2014-09-24 深圳华大基因科技服务有限公司 全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用
CN113564226A (zh) * 2021-07-26 2021-10-29 深圳泰莱生物科技有限公司 一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法
CN114045342A (zh) * 2021-12-01 2022-02-15 大连晶泰生物技术有限公司 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109415763A (zh) * 2016-05-03 2019-03-01 大学健康网络 捕获无细胞的甲基化dna的方法及其用途
WO2017193833A1 (zh) * 2016-05-10 2017-11-16 广州嘉检医学检测有限公司 一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒
CA3157323A1 (en) * 2019-11-06 2021-05-14 Samantha L. WILSON Synthetic spike-in controls for cell-free medip sequencing and methods of using same
CN111154846A (zh) * 2020-01-13 2020-05-15 四川大学华西医院 一种甲基化核酸的检测方法
CN113584168A (zh) * 2021-07-19 2021-11-02 深圳泰莱生物科技有限公司 基于甲基化免疫沉淀高通量测序技术的肺癌检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHICAI FAN等: "Integrative analysis with expanded DNA methylation data reveals common key regulators and pathways in cancers", NPJ GENOMIC MEDICINE, vol. 4, no. 2, pages 1 - 11 *
王可等: "基于TCGA 数据库挖掘肺腺癌预后相关的甲基化位点和基因", 南京医科大学学报（自然科学版）, vol. 36, no. 6, pages 665 - 669 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023098137A1 (zh) * 2021-12-01 2023-06-08 大连晶泰生物技术有限公司 一种游离dna甲基化突变的检测方法及试剂盒
GB2620492A (en) * 2021-12-01 2024-01-10 Dalian Gentalker Bio Tech Co Ltd Method and kit for detecting methylation mutation of free DNA
CN115323058A (zh) * 2022-10-17 2022-11-11 深圳市睿法生物科技有限公司 一种基于ctDNA甲基化模式的癌种定位方法
CN116287266A (zh) * 2023-03-07 2023-06-23 江苏先声医学诊断有限公司 Dna复制晚期区域在泛癌种诊断中的应用
CN116555426A (zh) * 2023-05-04 2023-08-08 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种鉴定肿瘤组织来源的试剂盒及数据分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
GB202308241D0 (en) 2023-07-19
GB2620492A (en) 2024-01-10
US20230392190A1 (en) 2023-12-07
WO2023098137A1 (zh) 2023-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108753967B (zh) 一种用于肝癌检测的基因集及其panel检测设计方法
CN114045342A (zh) 一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒
CN110964826B (zh) 一种结直肠癌抑癌基因甲基化高通量检测试剂盒及其应用
CN113661249A (zh) 用于分离无细胞dna的组合物和方法
US20020137086A1 (en) Method for the development of gene panels for diagnostic and therapeutic purposes based on the expression and methylation status of the genes
CN108796061A (zh) 用于地中海贫血突变型基因检测的引物组、试剂盒、其应用及文库构建方法
CN114317762B (zh) 用于检测早期肝癌的三标记物组合物及其试剂盒
CN108517567A (zh) 用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
CN111705135A (zh) 一种检测mgmt启动子区甲基化的方法
CN114574587A (zh) 一种用于结直肠癌检测的标记物组合物及其应用
CN114182022A (zh) 一种基于cfDNA碱基突变频率分布检测肝癌特异突变的方法
CN111850116A (zh) 一组nk/t细胞淋巴瘤的基因突变位点群、靶向测序试剂盒及应用
CN106282361B (zh) 用于捕获血液病相关基因的基因捕获试剂盒
WO2016004548A1 (zh) 临床微量活检石蜡包埋组织的前处理方法
Dugé de Bernonville et al. From methylome to integrative analysis of tissue specificity
CN108130359A (zh) 一种dna甲基化检测试剂盒及其应用
Oh et al. Development of an ammonium sulfate DNA extraction method for obtaining amplifiable DNA in a small number of cells and its application to clinical specimens
CN109735611A (zh) 一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用
CN115197997A (zh) 一种应用于植物花粉的CUT&amp;Tag方法
Pierce et al. Finding needles in a haystack: dissecting tumor heterogeneity with single-cell transcriptomic and chromatin accessibility profiling
CN111235270B (zh) 一种基于高通量测序法的肿瘤抗原表达检测引物及试剂盒
CN114058681A (zh) 一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒
Montironi et al. Molecular techniques and prostate cancer diagnostic
CN111235241A (zh) 基于焦磷酸测序技术的foxa1基因甲基化检测试剂盒及检测方法
CN105713963A (zh) 从***固定石蜡包埋的组织样品中检测基因表达的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination