KR102508323B1

KR102508323B1 - 장 변이를 치료하는데 사용하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR102508323B1
Application number: KR1020197018872A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 비피; 루제로 로시; 발테르 피오레; 실비아 살라미나
Original assignee: 소파 에스피에이
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2023-03-08
Also published as: AU2017368931A1; EP3548006A1; SI3548006T1; IT201600122310A1; PT3548006T; CN110430870A; BR112019011007A2; US10881703B2; JP7321935B2; ES2968428T3; US11690889B2; CA3045267A1; DK3548006T3; US20200061141A1; KR20190111913A; LT3548006T; CN110430870B; FI3548006T3; RS65009B1; JP2020500934A

Abstract

본 발명은 (a) 하나 이상의 백시늄 속 식물 열매의 추출물 및 (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분을 포함하거나 또는 다른 예로 이들로 구성되는 혼합물을 포함하는 조성물, 및 게실 질환 또는 이로부터 유래되거나 이와 관련있는 병증의 예방 및/또는 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

장 변이를 치료하는데 사용하기 위한 조성물

본 발명은, (a) 하나 이상의 백시늄 속 식물의 열매의 추출물 및 (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 혼합물 또는 다른 예로 이들로 구성되는 혼합물을 포함하는 조성물, 및 게실 질환 또는 이로부터 유래되거나 이와 관련있는 병증의 예방 및/또는 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

장은, 중증 장애의 원인일 수 있으며 종종 임상의가 다루기 어려운, 수많은 염증성 병태들의 표적 장기이다.

이러한 병태들 중, 일차적으로 중요한 역할을 하는 것은 다음과 같다:

- 염증성 장 질환 (IBD).

- 낭염 (pouchitis).

- 게실 질환 및 게실염.

염증성 장 질환 (IBD)은 장 점막에 간헐적으로 발생하며 심각한 합병증을 유발할 수도 있는 만성 염증의 존재가 특징적이다. 이러한 질환으로는 크론 질환 (CD), 궤양성 직장잘록창자염 (URC) 및 소위 "불확실 대장염 (indeterminate colitis)" (IC) 등이 있다.

이들 그룹에 속하는 가장 중요한 2가지 병태, 즉, 크론 질환 (CD)과 궤양성 직장잘록창자염 (URC)은 증상이 서로 다르다.

CD의 경우, 가장 흔히 나타나는 초기 증상이 설사와 복통, 특히 (가장 질환 발병 빈도가 높은 부위인 회장 루프 제일 마지막 부위에 해당되는) 우장골에서의 복통이다.

반면, URC는 "이급후증" (불완전한 배설감), 때때로 빈혈을 동반한, 혈변성 설사 (변과 혼합된 선홍색 혈액과 점액 함유)로 거의 항상 나타난다.

이들 2가지 질환은 잠복기와 염증의 폭발 (flare-ups)기가 교대로 나타날 수 있다. 장 염증이 다시 급성으로 진행되면, 발열, 체중 감소, 무기력 및 식욕 감소와 같은 기본적인 증상들이 재발한다. CD는 시간 경과에 따라 협착 (궁극적으로 장 폐색을 유도할 수 있는, 장의 발병된 영역의 내강이 좁아지는 현상), 누공 (장과 피부 간의 통로 형성, 또는 복부 장기들 간의 통로 형성) 또는 농양 발생으로 인해 심각해질 수 있다.

이와는 대조적으로, 소위 "불확실 대장염" - IC는, CD로도 URC로도 분류할 수 없다는 점에서 분류하기 불가능한 조직학적, 임상적, 방사선 및 내시경 특징들을 동반한, 염증이 결장에만 국한되는, 상대적으로 최근 확립된 질환으로; 사례의 13-20%에서 이러한 2가지 형태들 중 어느 한 질환의 초기 형태를 나타낸다.

소위 "불확실 대장염" - IC는, 일반적으로 분절 병변의 존재, 광범위한 궤양, 우측 결장에서의 발병 가능성 - 원위 결장 (좌측 결장)이 더욱 심각하게 손상될 수도 있음 - 및 점막 표면의 50% 이상으로 염증 확산을 특징으로 할 수 있으며, 중독성 거대결장 (toxic megacolon)과 관련된 결장의 이완 가능성도 존재한다.

대부분의 경우에 (95%), 증상은 처음에는 설사성 배변 (diarrhoeal bowel movement)으로 시작하는 특징을 나타내며; 72%는 혈변성 설사가, 74%에는 복통이 나타난다. 적은 비율의 환자들에서는 체중 감소 (44%) 및 발열 (26%)이 나타난다.

낭염 (pouchitis)은 회장 저장소 (ileal reservoir) 또는 낭에서의 비-특이적인 염증으로, 회장 낭-항문 문합술로 알려진 외과적 개입시 가장 빈번하게 발생하는 만성적인 합병증이다.

병인은 아직 알려져 있지 않으며, 다요인성일 가능성이 높다. 대변 정체 (faecal stasis) 및 박테리아 과증식, URC 재발 및 파우치 점막 (pouch mucosa)의 허혈증 등의 다양한 병리학적 가설들이 제기되어 있다.

낭염은, 임상적으로, 배변 횟수 증가, 변의 유동성 증가, 직장 출혈, 경련성 복통, 절박뇨 및 이급후증, 때때로 실금 및 발열 등의, 다양한 증상들을 특징으로 한다.

대장 게실증은 대장내시경 검사에서 흔히 검출되는 매우 빈번한 대장의 해부학적 변형이다. 결장 벽에 구조적 변화가 존재하는 것을 의미하며, "게실"이라고 지칭되는 주머니가 존재하는 특징을 보이는데; 이는 염증성 장 질환 (IBD) 및 낭염과 구분된다.

게실은 장벽의 근육층이 상대적으로 약한 부위에서 결장 라이닝 내에 생길 수 있는 작은 주머니 모양으로 돌출된 현상이다.

게실이 검출되면, 이의 존재와 관련된 증상이 없더라도, "게실증"이라고 칭한다. 실무적인 관점에서, 게실증은 소화계의 중공 기관의 벽을 따라 - 정확하게는 게실로서 정의되는 - 점막 및 점막하 돌출부의 존재를 특징으로 하는 의학적인 상태이다. 일반적으로, 결장의 근육 층이 상대적으로 약한 부위 ("저항감소부 (locus minoris resistentiae)")에서 발생한다 (더 높은 압력으로 인해 S자형 결장 및 직장 전역). 게실증은 증상없이 나타나며; 예를 들어, 게실염의 경우, 증상이 나타난다면, 이를 게실 병증 또는 질환이라고 한다.

게실증은 서구에서 가장 흔히 발생하며, 30-39세 인구 집단에서의 유병률은 5%, 80세 이상의 인구 집단에서의 유병률은 60%이다.

게실은 S자 결장이라고 지칭되는 대장 (또는 결장)의 하행부에서 보다 흔히 나타난다.

결장 게실의 발생은 결장 내강내 압력 증가로 인한 것으로 생각된다. 분명한 것은, 게실 발생은 만성 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 크론 질환 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 및/또는 자가면역 현상과는 완전히 다른 현상이라는 것이며, 현재 알고 있는 지식에 근거하면, 이들 병증들은 게실증 및 이와 관련된 장애와 연관성이 없다.

게실의 존재는 결장 벽 구조의 영구적인 해부학적 변형이며, 증상이 없는 상태로 있거나 또는 증상이 나타날 수도 있다. 환자의 약 20%는 증상이 나타나는 것으로 추산되는데, 증상이 나타난 경우를 "게실 질환" (DD)이라 한다.

합병증을 수반하지 않는 (uncomplicated) 게실 질환은 일반적으로 구체적인 증상과 연관되어 있지 않다. 게실 질환은 결장에서 상당한 출혈의 원인이 되는 일반적인 요인이다.

DD의 하위 유형은, 게실에 기인한 지속적인 복부 증상이 육안으로 진단가능한 대장염 또는 게실염이 없는 상태에서 존재하는, SUDD (symptomatic uncomplicated diverticular disease: 증상이 있는 합병증을 수반하지 않은 게실 질환)이다.

다른 증상들은 일반적으로 육안으로 관찰되는 게실의 급성 염증인 "게실염"과 같은 게실 질환의 합병증과 관련되어 있다. 게실염은 농양, 복막염, 폐색, 누공 또는 출혈과 같은 합병증의 특징들이 컴퓨터 단층 촬영 (CT)에서 관찰되는 지의 여부에 따라 단순하거나 또는 복잡할 수 있다.

게실염은 복통, 떨림, 발열 및 배변 행동 변화를 유발할 수 있다. 가장 강력한 증상은 천공 (복부에서 자유 유출 (free break)), 농양 (고름 형성) 또는 누공 형성 (결장과 다른 장기 사이에 형성된 또는 게실의 천공 후 피부와 형성된 변칙적인 통로 형성) 등의 심각한 합병증과 연관되어 있다.

결장 게실 (게실증)의 형성을 유발하는 병리학적 기저 기전은 여전히 불분명하다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 형성은 식이, 장내 미생물총, 유전적 요인, 결장의 운동성 및 현미경적 염증 간의 복잡한 상호작용의 결과일 수 있다.

입증된 것은 아니지만, 현재 널리 퍼져있는 이론은 섬유질 섭취가 적은 식이가 게실 질환의 원인 중 하나라는 것이다. 이 질환은 미국에서 특정 식품이 미국인 식사에 도입되어 미국인의 섬유질 섭취를 상당히 떨어뜨리는 시기인 20세기 초반에 나타났다.

게실 질환은 선진국에서 일반적이며, 특히 섬유질 섭취가 낮은 식사가 일반적인 미국, 영국 및 호주에서 흔한 편이다. 반면, 이 질환은 대부분의 사람이 섬유질 섭취가 높은 식사를 하는 아시아와 아프리카에서는 드문 편이다.

섬유질은 과일, 채소 및 미정제 (홀) 곡물에서 발견되며, 신체가 이를 완전하게 소화시키지 못한다. 수용성 섬유질이라고 하는 일부 섬유질은 물에 쉽게 용해되어, 장내에서 부드러운 젤라틴성 물질이 되지만, 불용성 섬유질은 거의 온전한 상태로 장을 통과한다. 이러한 2가지 타입의 섬유질 모두 변비 예방에 도움이 되며, 쉽게 배출되는 부드러운 변을 만든다.

변비는 배변을 위해 상당한 노력이 필요한 방식으로 나타나며; 이러한 노력이 결장에 압력 증가를 유발할 수 있으며, 이는 결장의 라이닝이 결장의 벽부에서 약한 부위에서 팽창되게 유발하여, 낭, 즉 게실 형성을 야기할 수 있다.

신체 운동 부족이 아직까지 결정적인 인자로 생각되진 않았지만, 게실 발생 위험을 높일 순 있다.

현재, 장 휴식, 섬유질 함량이 낮은 특수 식이 및 항-경련제와 종종 관련있는 광범위한 항생제가 게실 질환 및/또는 게실염에 대한 의학적 치료로서 처방되고 있다. 비-스테로이드계 항-염증제 (NSAID) 및 코르티코스테로이드는 게실 근처에 천공 형성을 촉진할 수 있어, 이의 사용은 일반적이지 않다. 가장 복잡한 사례, 예를 들어, 복막염, 농양 및 누공의 경우, 문합을 수반한 또는 비-수반한 응급 절제가 필요할 수도 있다.

현재, 게실 질환 또는 게실증을 가진 개체에서 게실의 형성을 예방하거나, 감소를 유발하거나 또는 효과적으로 게실염을 예방할 수 있는 이용가능한 치료법은 없는 실정이다.

종래 기술의 전술한 한계를 해결하기 위해, 본 발명은, 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실증, 그리고 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실 질환, SUDD (증상이 있는 합병증을 수반하지 않은 게실 질환) 및 게실염과 같은 게실의 존재와 관련된 병리학적 상태 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 백시늄 (Vaccinium) 속의 식물로부터 유래되는 추출물을 포함하는, 새로운 경구 투여용 조성물을 제공한다.

본 발명은,

(i) (a) 백시늄 (Vaccinium) 속의 하나 이상의 식물의 추출물과 (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분 또는 부형제를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 코어; 및

(ii) 코어 (i)를 완전히 덮고 있으며, (c) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분 또는 부형제를 포함하는, 코어 (i)의 위-내성 외층 (gastro-resistent layer external to the core)

을 포함하거나, 또는 이들로 구성되며,

위-내성 외층 (ii)이 장 점막에서 추출물 (a)을 방출시킬 수 있으며; 바람직하게는 결장에서 추출물 (a)을 방출시킬 수 있는, 경구 투여 (CR)용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은,

(ii) 코어 (i)를 완전히 덮고 있으며, (c) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분 또는 부형제를 포함하는, 코어 (i)의 위-내성 외층

을 포함하거나, 또는 이들로 구성되며,

위-내성 외층 (ii)이 결장에서 추출물 (a)을 방출시킬 수 있는, 경구 투여 (CR)용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은,

을 포함하거나, 또는 이들로 구성되며,

위-내성 외층 (ii)이 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실증, 그리고 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실 질환, SUDD (증상이 있는 합병증을 수반하지 않은 게실 질환) 및 게실염과 같은 게실의 존재와 관련된 병리학적 상태 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 경구 투여 (CR)용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물 (CR)은 위-보호된 형태이며, 분말, 과립, 플레이크, 정제, 환제 또는 캡슐제인 고체 형태이며; 바람직하게는 위-보호된 단일 정제 (monolithic tablet)이다. 이 경우, 코어 (i)는 단일 정제로 표시되며, 단일 정제에 부합된다.

본 발명은

- (a) 하나 이상의 백시늄 속 식물의 열매의 추출물, 및

- (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분 또는 부형제

를 포함하거나, 또는 이들로 구성되며,

결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실증, 그리고 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실 질환, SUDD (증상이 있는 합병증을 수반하지 않은 게실 질환) 및 게실염과 같은 게실의 존재와 관련된 병리학적 상태 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이며; 바람직하게는 그 용도가 조성물 (C)의 경구 투여를 포함하는, 조성물 (C)에 관한 것이다.

또한, 고체 형태, 예를 들어, 분말, 과립, 비드 또는 마이크로비드 또는 플레이크 형태의 조성물 (C)은 셸 (shell), 예를 들어, > pH 6, 바람직하게는, pH 6.5-8 범위의 pH, 예를 들어 pH 7.5에서 분해될 수 있는, 위-내성 물질로 된 캡슐 또는 소프트겔 안에 포함되는 것 역시 가능하다. 이 경우, 캡슐 또는 소프트겔 안에 포함된 조성물 (C)은 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실증, 그리고 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실 질환, SUDD (증상이 있는 합병증을 수반하지 않은 게실 질환) 및 게실염과 같은 게실의 존재와 관련된 병리학적 상태 또는 질환의 예방 또는 치료에 유효한 용도를 가지며; 바람직하게는, 그 용도는 (C)의 경구 투여를 포함한다.

바람직한 구현예들이 이하 기술될 것이나, 어떠한 방식으로도 발명의 범위 및 내용을 제한하는 것은 아니다.

달리 명시되지 않은 한, 조성물 내 성분의 함량은 조성물의 총 중량에 대한 성분의 중량%를 의미한다.

달리 명시되지 않은 한, 조성물이 하나 이상의 성분을 "포함한다"라는 언급은, 다른 성분들이 명시된 것 외에도 존재할 수 있다는 것을 의미하며, 조성물이 해당 성분들로 "구성된다"는 기술은 다른 성분의 존재를 배제하는 것을 의미한다.

조성물 (C)은 (a) 및 (b)로 구성될 수 있거나, 또는 (a) 및 (b) 외에도 다른 성분 또는 부형제를 포함할 수 있다.

비-제한적인 예로, 본 발명의 조성물 (CR) 및 (C)에 존재할 수 있는 부가적인 성분들은, 하기와 같은, 다른 활성 성분일 수 있다:

· 섬유질 (예, 이눌린, 실리움 (psyllium))

· 효소 (예, 갈락토시다제 등)

· 항-염증제 (예, 메살라진 (mesalazine) 및 유도체, 베클로메타손 (beclometasone) 및 유사 활성 성분)

· 항체 (예, 리팍시민 (rifaximin) 및 유사 활성 성분)

· 장에서 가스 발생을 줄이기 위해, 장에서 흡수 작용 및/또는 구풍 (carminative) 및/또는 경구 소포 (oral anti-foaming) 작용을 가진 물질 (예, 페퍼민트, 시메티콘 (simethicone) 및 유도체, 활성탄)

· 항산화제

· 면역조절 작용을 하는 물질

· 단쇄 지방산 (SCFA, 예, 부티레이트 및 유도체)

· 오메가-3 고도불포화 지방산

· 프로바이오틱스 또는 다른 예로: 라이세이트 (lysate) 또는 추출물 형태의 미생물 (파라프로바이오틱스), 미생물에 의해 생산된 생물 대사산물 (metabolic bioproduct) (포스트바이오틱) 및/또는 이로부터 유래된 임의의 기타 산물.

본 발명의 조성물 (CR) 및 (C)에 존재할 수 있는 미생물에 대한 비-제한적인 예는, 각각 또는 다양한 조합으로 사용되는, 락토바실러스 (Lactobacillus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 및 엔테로코커스 (Enterococcus) 속에 속하는 프로바이오틱스 박테리아 및 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속에 속하는 효모이다.

바람직한 구현예에서, 조성물 (CR) 및 (C)에 존재하는 코어 (i)는 스테로이드계 항-염증제, 비-스테로이드계 약물 및 천연 기원의 물질 또는 천연 기원 물질들의 혼합물로부터 선택되는, 항-염증 활성을 가진 하나 이상의 활성 성분 및/또는 만니톨을 더 포함한다.

또한, 본 발명은 첨부된 도면을 참조할 것이다:
도 1: 용출 시험에 대한 캘리브레이션 그래프.
도 2: 장 단계 동안 본 발명에 따른 위-보호된 정제에 대한 용출 시험 결과.
도 3-10: 장 점막 (CacoGoblet)에 대한 보호 효능 관련 실험 결과: E.Coli 군락화 (colonisation).
도 11: 위장관 설명도.

본 발명과 관련하여, 용어 "항-염증제"는 용어의 일반적인 의미로 사용되며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 바와 같이 염증 프로세스를 - 특히, 비-제한적인 예로 개체의 장에 대한 손상을 - 감소시키거나 또는 없앨 수 있는, 임의 물질을 지칭한다.

전술한 바와 같이, 조성물 (CR)에서, 코어 (i)의 위-내성 외층 (ii)은, 폴리(메틸 아크릴레이트-co-메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산) 7:3:1 또는 다른 음이온성 메타크릴 코폴리머, 트리에틸 사이트레이트 E1505, 탈컴, 에틸 셀룰로스, 음이온성 메타크릴레이트 코폴리머 및 이의 혼합물, 셀락 (shellac), 소듐 알기네이트 및 이의 혼합물, 전분 및 변형 전분, 올레산, 스테아르산 및 중쇄 (medium-chain) 트리글리세라이드와 같은, 위-내성 폴리머인, Eudragard biotic E1207로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하거나 또는 이로 구성된다.

코어 (i)의 위-내성 외층 (ii)의 바람직한 형태는, 하기 성분들을 포함하거나 또는 하기 성분들로 구성된다:

- 폴리(메틸 아크릴레이트-co-메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산) 7:3:1 또는 다른 음이온성 메타크릴레이트 코폴리머와 같은 위-내성 폴리머: 5 내지 50 mg, 10 내지 35 mg, 18 내지 25 mg;

- 트리에틸 사이트레이트 E1505: 0.1 내지 5 mg, 0.3 내지 3 mg, 0.5 내지 2 mg;

- 탈컴 (talcum): 1 내지 30 mg, 3 내지 20 mg, 5 내지 15 mg,

또는 다른 예로:

- 에틸 셀룰로스: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 9.97 mg;

- 소듐 알기네이트: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 9.30 mg;

- 암모늄 하이드록사이드: 0.5 내지 4 mg, 1.5 내지 3 mg, 2.34 mg;

- 중쇄 트리글리세라이드: 0.5 내지 5 mg, 1.5 내지 3 mg, 2.12 mg;

- 올레산: 0.5 내지 3 mg, 1 내지 2 mg, 1.17 mg;

- 정제된 스테아르산: 0.01 내지 0.5 mg, 0.05 내지 0.3 mg, 0.1 mg,

또는 다른 예로:

- 에틸 셀룰로스: 5 내지 50 mg, 10 내지 30 mg, 15 내지 20 mg;

- 이산화티타늄: 0.1 내지 15 mg, 0.5 내지 10 mg, 1 내지 5 mg;

- 소듐 알기네이트: 0.1 내지 5 mg, 0.3 내지 4 mg, 0.5 내지 2 mg;

- 올레산, 스테아르산, 중쇄 트리글리세라이드: 각각 0.01 내지 3 mg, 0.05 내지 1 mg.

- Eudragard® biotic E1207 (Evonik): 예를 들어 20.4 mg;

- 트리에틸 사이트레이트 E1505: 예를 들어 1 mg;

- 탈컴: 예를 들어 10. 2 mg,

또는 다른 예로:

- 에틸 셀룰로스: 예를 들어 9.97 mg;

- 소듐 알기네이트: 예를 들어 9.30 mg;

- 암모늄 하이드록사이드: 예를 들어 2.34 mg;

- 중쇄 트리글리세라이드: 예를 들어 2.12 mg;

- 올레산: 예를 들어 1.17 mg;

- 정제된 스테아르산: 예를 들어 0.1 mg.

코어 (i)의 위-내성 외층 (ii)은, pH 및/또는 시간에 따라 분해 및 용해되는 특징을 가지며; 유익하게는, 외층 (ii)은 pH 약 6.5 내지 pH 약 8, 바람직하게는 pH 약 7 내지 약 7.5에서 30분 내지 120분, 바람직하게는 45분 내지 90분 내에, 예를 들어, 30℃ 내지 40℃, 바람직하게는 34℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 분해 및 용해될 수 있도록, 제형화 및 조제된다.

연장된 연구와 수많은 실험 시도를 통해, 유익하게는, 위-내성 외층 형성에 상기한 하나 이상의 성분을 사용하면, 온전한 상태로 구강, 식도 및 위관을 통과할 수 있으며, 말단 회장에서부터 시작해 pH 약 6.5-7에서 코어 (i)의 초기 용해 및 추출물 (a)의 방출을 수반 또는 비-수반하면서 코어 (i)의 위-내성 외층 (ii)의 초기 분해 (initial breakdown)를 달성할 수 있으며, 이후, 결장에서 pH 약 7-8에서 코어 (i)의 위-내성 외층 (ii)의 분해와, 주로 결장에서, pH 7.5에서 코어 (i)의 용해와 추출물 (a)의 방출을 달성할 수 있는 (도 11), 경구 사용을 위한 조성물 (CR), 예를 들어, 정제를 수득할 수 있다는 것을, 알게 되었다.

수행된 실험들을 통해, 본 발명의 조성물 (CR), 예를 들어, 실시예 1 및 2에 따른 단일 정제 형태의 조성물이 pH 1에서 2시간 동안, pH 6에서는 1시간 동안 온전한 상태로 유지된다는 것이 확인되었다. pH 7.2에서, 조성물 (CR)의 코어 (i)의 위-내성 외층은 약 30분 후 분해되기 시작하여, 90분 후 pH 7.2에서 완전히 분해되며; 막/코팅이 개방되고, 이의 내부에는 코어 (i)의 일부가 남아있거나, 또는 일부 경우에는 코어 (i)의 완전한 붕괴로 파생된 분말이 남아있게 된다.

코어 (i) 내에 존재하는 추출물 (a)의 방출과 관련하여, 최대 pH 6.5의 회장에 도달하기 전까지는 방출되지 않는다. 말단 회장에서는, 약 5% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 15%가 방출된다. 결장에서, pH 약 7.5, 예를 들어 pH 약 7.2에서, 방출율은 약 80% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 85% 내지 약 90%이다. 추출물 (a)의 방출 대부분이 정확하게는 게실이 존재하고 병리학적 상태 또는 질환 자체가 나타나는 부위인 결장에서 이루어진다. 이런 방식으로, 결장에서 방출된 추출물 (a)은 PAC (프로안토시아니딘)의 존재로 인해 작용할 수 있으며, 항-염증 활성을 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 (CR)은 식이 보충제 (dietary supplement)용 조성물 또는 의료 기기용 조성물 또는 특수 의학 목적의 식이용 조성물 또는 약학적 조성물의 형태이며; 이들 조성물 모두 경구용 약학적 형태이다.

본 발명에서, 용어 "의료 기기"는, 세계 보건기구에 의해 제시된 정의에 부합하며 URL http://www.who.int/medical_devices/full_deffinition/en/에서 이용가능한, 1997년 2월 24일자 이탈리아 입법령 46번에 따른 의미로 사용되며, 즉, 질병의 진단, 예방, 모니터링, 치료 또는 완화 목적으로 인간에 대해 단독으로 또는 병용하여 사용되도록 제조사에 의해 의도된, 단독 또는 병용 사용되는 물질 또는 기타 제품을 지칭하며, 기기는 인체 또는 인간 체내에서 약리학적, 면역학적 또는 대사적 수단에 의해 의도된 일차적인 작용을 달성하진 않지만 이러한 수단에 의해 의도된 기능을 보조할 수 있다.

상기 정의된 조성물 (CR)에서, 추출물 (a)은, 백시늄 (Vaccinium) 속에 속하는 열매 (보다 구체적으로 베리류), 선택적으로 또한 삼부쿠스 (Sambucus), 리슘 (Lycium), 유테르프 (Euterpe) 속에 속하는 열매 및 이들의 조합일 수 있다. 추출물 (a)은 바람직하게는 건조 추출물이다.

상기 정의된 조성물 (CR)에서, 추출물 (a)은 바람직하게는 백시늄 (Vaccinium) 속 및 옥시코커스 (Oxycoccus) 아속 (subgenus)의 하나 이상의 식물의 열매, 예를 들어 백시늄 마크로카르폰 (Vaccinium macrocarpon), 백시늄 옥시코코스 (Vaccinium oxycoccos) 또는 백시늄 아속, 예를 들어 백시늄 아르보레움 (Vaccinium arboreum), 백시늄 크라시폴리움 (Vaccinium crassifolium), 백시늄 보리얼 (Vaccinium boreale), 백시늄 미르틸러스 (Vaccinium myrtillus)의 열매 또는 이들의 혼합물로부터 유래되며; 바람직하게는, 추출물 (a)은 백시늄 마크로카르폰 (Vaccinium macrocarpon)의 열매 또는 백시늄 옥시코코스 (Vaccinium oxycoccos)의 열매 또는 이의 혼합물의 추출물이다. 더 바람직하게는, 추출물 (a)은 백시늄 마크로카르폰 (Vaccinium macrocarpon)의 열매를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 유익하게는, 추출물 (a)은 건조 추출물이고; 일 구현예에서, 이는 크랜베리의 건조 추출물이며, 바람직하게는 PAC (프로안토시아니딘)를 5% 내지 30 중량% 또는 부피%, 예를 들어 10%, 또는 15%, 또는 20%, 또는 25% 농도로 포함하는, 크랜베리의 건조 추출물이다.

아메리칸 크랜베리 (백시늄 마크로파르폰)는 북부 기후대, 특히 북아메리카 및 유럽과 아시아의 일부 북부 지역에서 자라는 진달래과 (Ericaceae)에 속하는 작은 상록관목 (evergreen shrub)으로, 베리류와 비슷한 붉은색 열매를 생산하며, 과육이 조밀하고, 전형적으로 시큼한 풍미를 가지고 있다.

과거, 북 아메리카 인디언들 사이에서, 크랜베리는 신성한 열매로 여겨져, 신장 결석 및 다양한 요로 장애들에 대한 치료제로서 그리고 식품으로서 사용되었다.

오늘날, 아메리칸 크랜베리는 기본적으로 프로안토시아니딘 (PACs), 특히 A형 프로안토시아니딘의 함량이 높아, 수많은 유익한 특성으로 인해 전세계적으로 활용되고 있다.

아메리칸 크랜베리 추출물은 특히 요로 장애의 예방 및 치료에 사용되며, 대개 위 및 십이지장 궤양의 원인 박테리아인 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)의 위벽 부착 또는 구강에서 번식하며 플라그 형성의 원인이 되는 박테리아의 부착 또는 장에서 E. Coli와 같은 잠재적인 병원성 박테리아의 부착에 대한 예방으로서 사용된다.

유럽 특허 EP 2135616 B1은, 전술한 바와 같이, 본 발명과 관련된 내용과는 완전히 구분되고 상이한 병태인, IBD 및 궤양성 대장염의 치료에 있어 크랜베리의 용도에 관한 것이다.

본 발명에서, 위벽에 헬리코박터 필로리의 부착을 방지하기 위한 크랜베리의 사용이 예상되지 않는 바와 같이, IBD 및 궤양성 대장염의 치료에 있어 크랜베리의 사용은 배제하며, 즉 고려하지 않는다. 또한, 방광염 (방광의 염증) 또는 세균성 방광염 또는 비-세균성 방광염, 예를 들어 간질 타입의 방광염과 같은 요로 감염 (UTI)의 치료에 있어 크랜베리의 용도 역시 배제하며, 고려하지 않는다.

본 발명자들은, 백시늄 속 식물, 특히 아메리칸 크랜베리의 열매의 추출물이 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실증, 및/또는 결장에서 또는 S자형 결장 및 직장의 일부분에서 게실 질환, SUDD (증상이 있는 합병증을 수반하지 않은 게실 질환) 및 게실염과 같은 게실의 존재와 관련된 병리학적 상태 또는 질환의, 바람직하게는 경구 투여에 의한 예방 및/또는 치료에 유용하다는 것을 발견하였다.

본 발명에 따른 조성물 (CR)에서, 추출물 (a)은 바람직하게는 프로안토시아니딘을, 더 바람직하게는 A형 프로안토시아니딘을 추출물 (a)의 충 중량 중 10% 이상, 더 바람직하게 15% 이상 또는 20% 이상 또는 30% 이상 및/또는 95% 이하 또는 60% 이하 또는 40% 이하로 포함한다. 프로안토시아니딘 (PAC)은 플라반-3-올 (flavan-3-ol)의 올리고머 및 폴리머이며, 이는 플라보노이드 패밀리에 속하며, 예를 들어, 기존의 R.L. et al. J. Sci Food Agric 2010, 90(9), 1473-8에 따른 "BL-DMAC" 방법 또는 비슷한 방법으로 정량할 수 있다. 추출물 (a)은 바람직하게는 건조 추출물이며; 더 바람직하게, 크랜베리의 건조 추출물이다.

본 발명에 따른 조성물 (CR) 또는 (C)는 바람직하게는 적어도 하기를 포함한다:

- 프로안토시아니딘 (PAC)을, 추출물 (a)의 총 중량 중 10% 이상, 더 바람직하게는 15% 이상으로 포함하는, 백시늄 마크로카르폰 (Vaccinium macrocarpon)의 추출물 (a) 150 내지 600 mg, 바람직하게는 200 내지 300 mg, 더 바람직하게 240 내지 260 mg;

- 셀룰로스, 만니톨, 마그네슘 스테아레이트, 포화 및/또는 불포화 지방산의 마그네슘 염, 이산화규소, 카르복시메틸 셀룰로스, 카르복시에틸 셀룰로스, 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 및 이의 혼합물로부터 선택적으로 선택되는, (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분 또는 부형제. (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 성분 또는 부형제는 바람직하게는 셀룰로스, 만니톨, 이산화규소, 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 및 포화 및/또는 불포화 지방산의 마그네슘 염들 중에서 선택된다.

전술한 조성물 (CR)은 특히 게실 질환 및 이와 관련된 병태를 치료 및/또는 예방하는데 유용하다.

일 구현예에서, 본 발명은,

- (a) 하나 이상의 백시늄 속 식물의 열매의 추출물, 및

- (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분을 포함하거나 또는 이들로 구성되는 조성물 (C)을 제공하며,

이 조성물은 게실 질환 또는 게실증으로부터 유래된 병태를 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 그 용도는 조성물 (C)의 경구 투여를 포함한다.

투여는 임의 경로를 통해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 경구로, 더 바람직하게는 환제, 캡슐제, 정제, 과립 분말, 경질 캡슐제 (hard-shelled capsule), 구강 용해성 과립제, 사셰제, 로젠지 (lozenges) 또는 마실 수 있는 바이얼 (drinkable vial)의 형태로 섭취된다.

다른 예로, 본 발명의 조성물은 액체로서, 예를 들어, 시럽 또는 음료로서 제형화되거나, 또는 식품, 예를 들어, 요거트, 치즈 또는 과일 주스에 첨가된다.

다른 예로, 본 발명의 조성물은 국소적으로, 예를 들어 관장제를 통해 작용할 수 있는 형태로 제형화된다.

조성물 (C)은 바람직하게는 게실 질환, 증상이 있는 합병증을 수반하지 않은 게실 질환 (SUDD) 및 게실염 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다. 조성물 (C)은 바람직하게는 게실염을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 전술한 용도의 조성물 (C)는, 위-내성 코팅을 포함하며 결장에서 추출물 (A)을 방출시킬 수 있는, 경구 약학적 제제 또는 식이 보충제 또는 의료 기기의 형태이다.

바람직한 구현예에서, 전술한 바와 같이 사용하기 위한 조성물 (C)에서, 추출물 (a)은 백시늄 (Vaccinium) 속 및 옥시코커스 (Oxycoccus) 아속 (subgenus)의 하나 이상의 식물의 열매, 예를 들어 백시늄 마크로카르폰 (Vaccinium macrocarpon), 백시늄 옥시코코스 (Vaccinium oxycoccos) 또는 백시늄 아속, 예를 들어 백시늄 아르보레움 (Vaccinium arboreum), 백시늄 크라시폴리움 (Vaccinium crassifolium), 백시늄 보리얼 (Vaccinium boreale), 백시늄 미르틸러스 (Vaccinium myrtillus) (빌베리)의 열매 또는 이들의 혼합물로부터 유래된다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물 (C)에서, 추출물 (a)은 백시늄 마크로카르폰의 열매 (아메리칸 크랜베리) 또는 백시늄 옥시코코스의 열매 또는 이들의 혼합물로부터 유래된다. 더 바람직하게는, 추출물 (a)는 백시늄 마크로카르폰의 열매 추출물을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 추출물 (a)은 바람직하게는 건조 추출물이다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물 (C)에서, 추출물 (a)은 바람직하게는 프로안토시아니딘을, 바람직하게는, 비-제한적으로, A형 프로안토시아니딘을, (a)의 총 중량 중 10% 이상, 더 바람직하게는 15% 이상 또는 20% 이상 또는 30% 이상 및 95% 이하 또는 60% 이하 또는 40% 이하로 포함한다. 유익하게는, 추출물 (a)은 건조 추출물이며; 일 구현예에서, 이는 크랜베리의 건조 추출물이며, 바람직하게는 PAC (프로안토시아니딘)를 5% 내지 30 중량% 또는 부피%의 농도로, 예를 들어 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25%의 농도로 포함하는, 크랜베리의 건조 추출물이다.

프로안토시아니딘 (PAC)은, 플라보노이드 패밀리에 속하는, 플라반-3-올의 올리고머 및 폴리머이며, 이는 Prior R.L. et al. J. Sci Food Agric 2010, 90(9), 1473-8에 따른 "BL-DMAC" 방법 또는 이와 유사한 방법으로 정량할 수 있다.

본 발명에서, 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 성분은, 비-제한적인 예로, 희석제, 흡착제, 감미제, 향미제, 착색제, 윤활제, 항-접착제, 유동화제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항미생물, 항산화제, 안정제, 증점제, 겔화제 및 주어진 생리학적 조건, 예를 들어 특정 pH 범위에서만 이의 방출을 허용하는 시간 동안 활성 성분의 방출을 변형시킬 수 있는 물질 등의, 경구 투여용 형태를 제조하기 위한, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 모든 보조 성분들을 포함한다.

전술한 바와 같이 사용하기 위한 조성물 (C)는, 바람직하게는 적어도:

- (a) 프로안토시아니딘을, 추출물 (a)의 총 중량 중 10% 이상, 더 바람직하게는 15% 이상으로 포함하는, 백시늄 마크로카르폰 (Vaccinium macrocarpon)의 추출물 150 내지 600 mg, 바람직하게는 200 내지 300 mg, 더 바람직하게 240 내지 260 mg;

- (b) 셀룰로스, 만니톨, 마그네슘 스테아레이트, 이산화규소, 카르복시메틸 셀룰로스 및 이의 혼합물 중에서 선택적으로 선택되는, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 성분을 포함한다. 더 바람직하게는, 조성물 (C)은 위-보호 코팅, 즉 적어도 (a) 및 (b)를 포함하는 혼합물을 위액의 작용으로부터 보호할 수 있는 물질을 더 포함한다.

아래 실시예들은 본 발명의 실제 구현예들을 제공하나, 발명의 범위 및 내용을 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물 (CR)의 바람직한 형태는 다음과 같다:

(i) 하기를 포함하는 코어:

10% 또는 15% 또는 30% (중량/중량) 농도로 PAC를 포함하는 크랜베리 추출물: 100 내지 500 mg, 150 내지 400 mg, 240 내지 300 mg

셀룰로스: 100 내지 400 mg, 200 내지 350 mg, 300 내지 310 mg

만니톨: 1 내지 50 mg, 5 내지 30 mg, 10 내지 18 mg

이산화규소: 1 내지 50 mg, 3 내지 30 mg, 5 내지 8 mg

가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스: 1 내지 30 mg, 3 내지 20 mg, 5 내지 12 mg

지방산의 마그네슘 염: 1 내지 30 mg, 3 내지 20 mg, 5 내지 10 mg

(ii) 하기 성분들을 포함하는, 코어 (i)에 대한 제1 타입의 코팅 (막):

- 위-내성 폴리머, 예를 들어, 폴리(메틸 아크릴레이트-co-메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산) 7:3:1 또는 다른 음이온성 메타크릴레이트 코폴리머: 5 내지 50 mg, 10 내지 35 mg, 18 내지 25 mg

- 트리에틸 사이트레이트 E1505: 0.1 내지 5 mg, 0.3 내지 3 mg, 0.5 내지 2 mg

- 탈컴: 1 내지 30 mg, 3 내지 20 mg, 5 내지 15 mg, 또는 다른 예로,

(ii) 하기 성분들을 포함하는, 코어 (i)에 대한 제2 타입의 코팅 (막):

- 에틸 셀룰로스: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 9.97 mg

- 소듐 알기네이트: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 9.30 mg

- 암모늄 하이드록사이드: 0.5 내지 4 mg, 1.5 내지 3 mg, 2.34 mg

- 중쇄 트리글리세라이드: 0.5 내지 5 mg, 1.5 내지 3 mg, 2.12 mg

- 올레산: 0.5 내지 3 mg, 1 내지 2 mg, 1.17 mg

- 정제된 스테아르산: 0.01 내지 0.5 mg, 0.05 내지 0.3 mg, 0.1 mg.

본 발명의 조성물 (CR)의 바람직한 형태는 다음과 같다:

(i) 하기 성분을 포함하는 코어:

미세결정 셀룰로스: 100 내지 400 mg, 200 내지 350 mg, 320 내지 335 mg

마그네슘 스테아레이트: 1 내지 30 mg, 2 내지 20 mg, 5 내지 10 mg

이산화규소: 1 내지 50 mg, 3 내지 30 mg, 5 내지 8 mg

- 에틸 셀룰로스: 5 내지 50 mg, 10 내지 30 mg, 15 내지 20 mg;

- 이산화티타늄: 0.1 내지 15 mg, 0.5 내지 10 mg, 1 내지 5 mg

- 소듐 알기네이트: 0.1 내지 5 mg, 0.3 내지 4 mg, 0.5 내지 2 mg

- 올레산, 스테아르산, 중쇄 트리글리세라이드: 각각 0.01 내지 3 mg, 0.05 내지 1 mg, 또는 다른 예로,

- 에틸 셀룰로스: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 9.97 mg

- 소듐 알기네이트: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 9.30 mg

- 암모늄 하이드록사이드: 0.5 내지 4 mg, 1.5 내지 3 mg, 2.34 mg

- 중쇄 트리글리세라이드: 0.5 내지 5 mg, 1.5 내지 3 mg, 2.12 mg

- 올레산: 0.5 내지 3 mg, 1 내지 2 mg, 1.17 mg

- 정제된 스테아르산: 0.01 내지 0.5 mg, 0.05 내지 0.3 mg, 0.1 mg

비-제한적인 예로, 본 발명에 따른 조성물 (CR)은 하기 실시예를 포함한다:

실시예 1

(i) 하기 성분을 포함하는 코어:

15% PAC (중량/중량)를 포함하는 크랜베리 추출물: 240 mg

셀룰로스: 304.4 mg

만니톨: 15 mg

이산화규소: 5.8 mg

가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스: 9 mg

지방산의 마그네슘 염: 5.8 mg.

코어 총 580 mg. 중량 범위: 575 mg - 585 mg

(ii) 하기 성분을 포함하는 코어 (i)의 코팅 (막):

- Eudragard® biotic E1207 (Evonik): 20.4 mg

- 트리에틸 사이트레이트 E1505: 1 mg

- 탈컴: 10.2 mg.

총 코팅/막 31.6 mg. 중량 범위: 26.1 mg - 37.7 mg.

전체 코팅된/막-피복된 정제 612 mg. 중량 범위: 607 mg - 617 mg.

실시예 2

(i) 하기 성분을 포함하는 코어:

15% PAC (중량/중량)를 포함하는 크랜베리 추출물: 240 mg

셀룰로스: 270 mg

만니톨: 29 mg

이산화규소: 5.8 mg

가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스: 29 mg

지방산의 마그네슘 염: 5.8 mg.

코어 총 580 mg. 중량 범위: 575 mg - 585 mg

(ii) 하기 성분을 포함하는 코어 (i)의 코팅 (막):

- 에틸 셀룰로스: 9.97 mg

- 소듐 알기네이트: 9.30 mg

- 암모늄 하이드록사이드: 2.34 mg

- 중쇄 트리글리세라이드: 2.12 mg

- 올레산: 1.17 mg

- 정제된 스테아르산: 0.1 mg.

총 코팅/막 25 mg. 중량 범위: 20 mg - 30 mg.

전체 코팅된/막-피복된 정제 605 mg. 중량 범위: 595 mg - 615 mg.

용출 시험

재료:

실시예에 따른 본 발명의 위-코팅된 정제를 시험하였다.

시약:

- 다이메틸아미노신남알데하이드 (DMAC, Sigmoid colon code D-4506).

- 프로시아니딘 A2 (PCAA2, Sigma, code 28660).

- 효소 및 GID 시약 (Sigma).

방법:

- Prior et al. (Multi-laboratory validation of a standard method for quantifying proanthocyanidins in cranberry powders. J. Sci. Food Agric. (2010), 9, 1473-1478. DOI 10.1002/jsfa.3966)에 제안된 분광광도법에 따른 PCA 분석.

- Minekus et al. ("A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus" Food Funct. (2014), 6, 1113-1124. DOI 10.1039/C3FO60702J)에 제안된 방법에 따른 시험관내 GID.

결과

정제에 대해 시험관내 GID (3 세트)를 수행하였으며, 위 단계(gastric phase)의 120분 후, 그리고 장 단계(intestinal phase)의 30분, 60분, 90분 및 120분 후 샘플을 취하였다. 여러 샘플들을 DMAC 방법을 이용해 mg 당량에서 PCAA2 함량에 대해 분석하고, (640 nm에서 PCAA2 표준 물질에 적용된 방법과 동일한 방법으로 수득한) 도 1에 도시된 캘리브레이션 곡선으로 정량하였다.

본 발명에 따른 정제의 용출 프로파일을 도 2에 도시한다.

실시예 1 및 2의 위-코팅된 정제들에서 실질적으로 동일한 결과가 수득되었다.

시험관내 GID의 위 단계 동안 분석적으로 검증가능한 PCA 방출은 없었다.

시험관내 장 단계 동안 PCA 방출 카이네틱스 (PCAA2 mg 당량/정제로 표시됨)를 도 2에 도시한다. 장 단계 동안 60분 경과시 PCA 방출을 분석을 통해 관찰할 수 있었다.

정제를 기계적으로 파괴한 후, 그리고 Prior et al. (2010)에 의해 제안된 위액 및 효소 (GID 블랭크) 또는 추출 용매 (아세톤/물/아세트산, 75:24.5:0.5 v/v/v)를 이용한 PCA 추출을 통해, 정제의 소화되지 않은 PCAA2 함량을 mg 당량으로 측정하였다. 수득한 결과는 각각 19.39 및 19.81 PCAA2 mg 당량/정제이었다.

효능 평가

본 발명의 효과를 평가할 목적으로, 특히 장 점막의 보호 효과와 관련하여, 몇가지 시험관내 검사를 수행하여 측정하였다:

· 특정 단백질의 분석을 토대로 한 부착 기전의 차단에 의한, 에스케리키아 콜리아 균주의 부착에 대한 경쟁 활성.

· 후술한 바와 같이 분석한, 장 투과성 실험에 기반한, 대식세포에서 단핵세포의 활성화 저하를 통한, 항-염증 활성:

o TEER (trans-epithelial electrical resistance) 측정

상피 관통 전기 저항 (transepithelial electrical resistance, TEER)은 상피 조직의 장벽 기능성을 직접 측정하는 방법이다: 이는 두께 및 구조 둘다에 따른 전체 조직 저항을 반영하며, 단일층의 온전성 수준, 즉 세포 간의 타이트한 정션 형성 정도를 나타낸다. 상피 관통 전기 저항 (Ωcm²로 표시)은 볼트-옴 미터 (ERS Millicell)를 사용해 측정한다.

o 루시퍼 옐로우를 이용한 분석 : 평가할 물질의 존재 하에.

루시퍼 옐로우는 세포 정션의 온전성을 검증할 수 있는 (%로서) 세포 막을 통과할 수 없는 형광 마커이다. Caco-2/Caco 술잔세포의 단일 세포 층에서 세포간 수준에서 물질의 투과성을 실험하는데 사용된다. LY의 이동은 지정된 기간 동안 인큐베이션한 후 기저측부 구획으로의 통과로서 평가한다. 분광형광측정기를 사용해 428 nm 여기 및 525 nm 방출에서 형광 물질의 판독값을 수득한다.

구체적으로, 훨씬 더 사실적인 시스템인 공-배양물 형태의 장 세포 뿐만 아니라 점액 분비 세포 HT29로 구성된 실험 모델 Caco2-goblet^®을 이용해, E. coli에 의해 유도된 스트레스에 따른, 본 발명의 장 점막 보호 효과를 평가하게 될 것이다.

장 점막 (CacoGoblet) 보호 효과에 대한 실험을 수행하였다: E. Coli 군락 형성.

1. 서론 및 실험 목표

Caco-2 모델은 장 점막의 기능을 재현하기 위해 사용되는 시험관내 기준 모델이므로, 이의 생물학적 적절성은 잘 확립되어 있다.

CacoGoblet는 인간 점액분비성 술잔세포와 분화 및 분극화된 Caco-2 세포를 포함하는 미세기공성 폴리카보네이트 필터 상에 투과가능한 접종된 지지체로 구성된, 점액을 분비하는 세포 모델이다.

CacoGoblet 모델에 기초한 실험 모델을 Sofar S.p.A. 대신 크랜베리 추출물의 효능 평가에 활용하였다.

산물의 잠재적인 고유한 독성을 배제하기 위해, MTT 분석으로 예비 단계에서 비-세포독성 농도를 검사하였다.

2가지 프로토콜을 사용하였다:

1) 공-배양 시스템에서 크랜베리 추출물의 항-염증 특성 (THP-1 세포 및 장 상피 세포)

2) E. coli의 점막 부착을 방지하는 크랜베리의 방지 능력

2. 실험 설계

1) 시험관내 공-배양 시스템에서 크랜베리 추출물의 항-염증 특성 (THP-1 세포 및 장 상피 세포)

CacoGoblet 세포에 IL1 beta 10 ng/ml을 밤새 전-처리하였다. IL1 beta를 제거한 후, 장 모델에 크랜베리를 비-세포독성 농도로 24시간 처리하였다. 점막의 염증 상태 회복 실험을 위해, 기준 분자 에타코르틸렌 (덱사메타손 소듐 포스페이트)을 0.15%로 사용해 병행 처리를 수행하였다.

그런 후, 산물을 제거하고, 표지된 THP-1 세포 (세포 추적물질 5-클로로메틸-플루오레세인 다이아세테이트로 표지)를 CacoGoblet 세포의 상단 구획에 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

부착되지 않은 세포는 제거하고, 남아있는 THP-1 세포의 표면 형광을 현미경으로 평가하였다.

장 수준에서 다양한 화합물들의 항-염증 활성을 엔드포인트 파라미터로서 CacoGoblet에서의 THP-1의 세포 부착 감소를 이용해 정적 분석 (static assay)으로 평가하였다.

2) 크랜베리의 점막에의 E. coli 부착 방지 능력

크랜베리로 4시간 전처리한 CacoGoblet 세포에, Escherichia Coli (ATCC 8739) 50 ㎕를 접종하여, 37℃에서 2시간 동안 콜로니를 형성시켰다. 군락화 후, 과량의 박테리아는 제거하고, 다음과 같은 파라미터를 분석하였다:

- 상피 관통 전기 저항 (TEER) 및 루시퍼 옐로우의 세포 간 통과

- α-액티닌의 면역형광: α-액티닌은 E. coli 단백질인 Tir과 상호작용하여, 페데스탈 (pedestal)이라고 하는 점착성 플라그를 형성하며, 이는 E. coli의 감염 마커이다.

- 세균 밀도 및 CacoGoblet 표면에의 부착을 분석하기 위한, 주사 전자 현미경 (SEM)을 이용한 E. coli의 초미세구조 분석.

3. 재료

3.1 실험 시스템

CacoGoblet^TM는 시험관내 장 흡수를 평가하기 위한 레디 투 유즈 점막 분비 키트이다. 본 키트는, 실온에서 안정적인 독점 전매 이동 배지가 보충된 HTS 트랜스웰 플레이트에, 인간 점액 분비성 술잔세포와 분화 및 분극화된 Caco-2 세포가 접종된 24개의 웰을 가진, 투과성 지지체로 구성된다.

CacoGoblet 세포주를 분화 20일차에 공급하여 5일 연속 사용하였으며, 완전 배지를 변형시켜 사용하였으며, 내부 절차를 토대로 TEER을 측정하였다. CacoGoblet^TM 기술 데이터시트를 부록 I에 첨부한다.

아래 나타낸 10% FBS, 1% 글루타민 200　mM 및 1% NEAA를 포함하는 DMEM (lot RNBF5082)을 배지로 사용하였다.

상품명 및 LOT	CACOGOBLET No. 24 CG 032 112816	상태
제조사	READYCELL
LY % (≤1.4)	0.51	용인됨
TEER (OHM*CM²) (≥70)	208.01
제조일	2016년 12월 15일	용인됨
유통 기한	2016년 12월 23일

3.1.1 실험 시스템의 배양 조건 및 사용

CacoGoblet 제품을 받으면, 플레이트가 든 집-락 파우치 백을 꺼낸다. 동일한 주의 금요일까지 실온 암 조건에서 지퍼를 열어 백을 꺼낸다. 금요일에, 플레이트를 37℃에서 5% CO₂, 포화 습도 하에 4시간 동안 인큐베이션한다. 배지를 교환하고, 다음 월요일에 실험을 개시한다.

3.2 검사 대상 물질: 식별 및 특징 확인

스폰서는 검사 중인 물질의 안전성 데이터시트와 특징을 보증한다 (표 2).

제품명	15% PAC를 포함하는 위-보호된 크랜베리 추출물
UNIQUE CODE	CRANBERRY
LOT / 제조사	- Sofar S.p.A.
형태	정제
MTT 사용 농도	10-100-1000 ㎍/ml
효능 실험에서의 사용 농도	1000 ㎍/ml
사용량 (DOSE)	상단 구획에 배지 300 ㎕ 내
보관	실온

3.3 음성 대조군 및 양성 대조군

음성 대조군은 배지 자체이다.

프로토콜 1의 양성 대조군: 인터루킨1 BETA (SRP6169; lot 9E126460)(표 3).

	프로토콜 1	프로토콜 2
	항-염증제	군락화된 대조군
제품명	에타코르틸렌 0.15% 덱사메타손 소듐 포스페이트	Escherichia Coli (ATCC 8739) Lot number 38/76
고유 코드	에타코르틸렌	E. coli
보관	실온	-80℃
사용 농도	에타코르틸렌+ 150 ㎕ 배지 150 ㎕	0.065 OD 600 nm =1.2*10⁷ CFU
사용량	300 ㎕	50 ㎕
검사 인증		부록 I

4. 방법

4.1 E.coli.

균주: E.COLI ATCC 8739, lot number.

실험 전 주에 영양 배지에 균주를 접종하였다. 또한, 아가 배지가 든 플레이트에 접종하여, 이의 정상적인 형태를 검증하였다. 그런 후, 37℃에서 16-24시간 인큐베이션하였다.

4.1.1 E. coli 현탁물 제조 및 군락화 절차

군락화 당일에, E. coli 용액의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 체크하여, 내부 절차 (PM 18)에 따른 군락화 현탁물의 제조에 이용하였다.

플레이트에 적절한 10X 희석물들을 접종함으로써, 박테리아 카운트를 계수하여, 영양 아가 배지에서 각 접종물을 검증하였다 (비-희석 버전에서부터 각 구획의 현탁물의 10^-7 희석까지). CacoGoblet에 사용된 살아있는 박테리아 수는 1.2*10⁷ CFU이다.

4.2 상피 관통 저항 검사 (TEER)

4.2.1 원리

상피 관통 저항 검사 (TEER)는 피부 장벽 기능을 직접 측정하는 방법이다: 이는 두께 및 구조 둘다에 따른 전체 조직 저항성을 나타내며, 장벽의 온전성을 타이트한 정션 측면에서 측정한다.

분화된 Caco-2 세포의 단일층의 TEER 값은 단일층 자체의 온전성 정도를 나타내며, 즉 장 세포간의 타이트한 정션의 형성을 반영한다. TEER (Ω * cm²)은 볼트-옴 미터 (ERS Millicell)를 사용해 측정한다 (범위 200-2000 Ω).

4.2.2 절차

적절한 전극을 사용해 삽입하여 측정을 수행하고, 전극의 짧은 단부를 인서트 내부에 정상부 위치 (배지 0.3 ml 내)에 위치시킴으로써, 배양 21일 후 잘-분화된 CacoGoblet 세포의 단일층에 대해 TEER을 분석하였다. 전극의 긴 단부는 웰 안에 기저 측부 위치로 침지시켰다 (배지 0.9 ml 내).

4.3 루시퍼 옐로우를 이용한 검사

4.3.1 원리

루시퍼 옐로우 (LY)는 세포막을 통과할 수 없는 형광 염료이다. 이것을 이용해 물질의 세포 간 투과성을 실험한다. 정션이 온전할 경우, 루시퍼 옐로우의 투과성은 매우 낮으며; 정션이 손상된 경우, 루시퍼 옐로우의 이동은 증가한다. 따라서, 본 검사로 검사할 물질의 존재시 세포 정션의 온전성을 검증할 수 있다.

4.3.2 절차

검사할 물질에 노출시킨 후, 식염수 (0.25 ml)에 용해된, 루시퍼 옐로우 (LY)를 100　μM 농도로 정단부 구획에 적용한다. 식염수 0.70 ml을 기저측부 구획에 첨가한다. 37℃에서 1시간의 지정된 기간 동안 인큐베이션한 후 정단부 구획에서 기저측부 구획으로의 통과 측면에서 LY의 이동을 평가한다.

분광형광측정기 (TECAN INFINITE M200)를 사용해 428 nm 여기 및 525 nm 방출 조건에서 판독값을 수득한다.

투과성 %를 하기 식으로 계산한다:

LY 이동 = (RFU_BL / RFU_AP 초기) x 100

온전한 CacoGoblet 단일층에서, LY 이동은 1.4% 미만이어야 한다.

4.4 주사 전자 현미경 (SEM)

SEM으로 검사할 샘플을 0.1 M PBS 중의 2.5% 글루타르알데하이드 용액에 24시간 고정한 다음, 0.1M 소듐 카코딜레이트 완충제 pH 7.4로 세척하고, 동일 샘플 내 1% 오스뮴 테트록사이드 (OsO4)로 (실온에서 2시간) 추출하였다. 그런 후, 샘플을 실온에서 에탄올과 헥사메틸다이실라잔의 농도를 실온에서 증가시키면서 밤새 처리하여 탈수 처리하였다.

샘플을 카본 탭이 있는 핀 위에 배치하고, Polaron Equipment Limited 사의 SEM E5100 금속 코팅기를 사용해 금 층으로 덮은 후, 검경 및 사진 촬영을 위해 Zeiss 시그모이드 콜론 전자 주사 현미경으로 이동시켰다.

실험 중에 수득한 SEM 샘플 (표 4)

VS 79-16 엔드포인트	샘플 코드
SEM	NC 6H-6
	E.COLI 2H-6
	PR (4 h) + E.COLI 2H-6

4.5 면역형광: α-액티닌

4.5.1 원리

면역형광 표지는 조직 단편의 세포 구획내 특정 구조 또는 분자를 검출하기 위한 조직학적 기법이다. 이 기법은, 간접적인 방법을 이용하여, 타겟 분자를 검출하기 위한 항원 결합성 항체의 특이성과 형광 현미경을 이용한 검출 시스템을 기반으로 한다: 타겟을 특이적으로 인지할 수 있는 일차 항체 및 일차 항체를 인지할 수 있는 형광단이 결합된 이차 항체.

4.5.2 절차

장 점막을 차가운 에탄올에서 30분간, 그리고 차가운 아세톤에서 3분간 고정시킨 후, PBS로 헹구고, PBS 중의 1% BSA로 30분간 비-특이적인 반응을 차단하였다. 각 인서트를 1% BSA/PBS 중의 α-액티닌 항체 (단일클론 마우스 항체, ab18061, lot GR256204-1) 1 ㎍/ml와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 후, 조직을 실온에서 1시간 동안 1% BSA/PBS 중의 400:1로 희석한 이차 항체 (염소 항-마우스 항체 Alexa Fluor 488, Invitrogen A10-680)와 함께 인큐베이션하였다. 이를 세척한 후, 핵을 DAPI로 염색하고, Leica DM 2500 형광 현미경 하에 분석하였다.

4.6 단핵구-상피 세포 부착 분석

4.6.1 원리

염증이 생긴 점막을 만들기 위해 부착 분석 전에, CacoGoblet 세포에 전-염증성 사이토카인 IL-1beta를 밤새 처리하였다. 그런 후, 처리한 단일층에 산물을 24시간 동안 처리하였다. 표지된 THP-1 세포를 각 웰 내 CacoGoblet 상단에 첨가하였다. THP-1 세포를 형광 염료 클로로메틸플루오레세인 다이아세테이트 (CMFDA; Invitrogen)로 표지하였다. 단일층을 인큐베이션한 후, 부드럽게 세척하여 비-부착성 THP-1 세포를 제거하였다. 형광 염료로 표지된 부착 세포를 형광 현미경 하에 검경하였다.

4.6.2 절차

처리 후, 표지된 THP-1 세포를 CacoGoblet 상부에 적용하였다.

THP-1 세포를 형광 염료 클로로메틸플루오레세인 다이아세테이트 (CMFDA Exc. 492, Em 517; Invitrogen)로 표지하였다.

단일층을 1시간 인큐베이션한 후, 부드럽게 세척하여 비-부착성 THP-1 세포를 제거하였다. 형광 염료로 표지된 부착 세포를 형광 현미경 하에 검경하였다.

5. 결과

5.1 MTT 검사를 통한 세포 생존성

MTT 검사 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3은 크랜베리를 10-100-1000 μg/ml 농도로 24시간 처리한 이후의 세포 생존성을 보여준다.

음성 대조군 (배지 단독)은 생존성 100%로 하였다.

검사 농도 전체에서, 산물은 음성 대조군과 비교해 생존성을 감소시키지 않았다.

효능 검사에서 선정된 비-세포독성 농도는 1000 μg/ml이었다. 이 농도에서, MTT 검사로 조사한 물질의 저해율은 32%였다.

시험관내 공-배양 시스템 (THP-1 세포 및 장 상피 세포)에서의 크랜베리 추출물의 항-염증 특성

5.2 단핵구-상피 세포 부착 분석

처리 후, 표지된 THP-1 세포를 CacoGoblet 상부에 적용하였다.

단일층을 1시간 인큐베이션한 후, 부드럽게 세척하여 비-부착성 THP-1 세포를 제거하였다. 형광 염료로 표지된 부착 세포를 형광 현미경 하에 검경하였으며; 그 결과는 도 4에 나타낸다.

도 4는 염증 발생된 무-처리 CacoGoblet에서의 단핵세포-상피 세포 부착성을 나타낸 것이다.

√ 예상된 바와 같이, IL1beta 처리 후 THP-1 세포의 부착 증가가 관찰되었다.

√ 예상된 바와 같이, 매우 적은 수의 THP-1 세포가 CacoGoblet 상피 (음성 대조군, NT)에 부착되는 것으로 나타났다.

√ 크랜베리는 단독으로 건강한 점막에서 THP-1 세포의 부착을 감소시켰다.

√ 염증 발생된 점막에 에타코르틸렌 적용 후 THP-1 세포의 현저한 부착 감소가 관찰되었다.

√ 염증 발생된 점막에 크랜베리 적용 후 현저한 THP-1 세포 부착 감소가 관찰되었으며, 이는 에타코르틸렌 처리한 이후 보다 약간 낮은 수준이었다.

크랜베리의 점막에의 E. coli 부착 방지 능력

5.3 TEER 측정

도 5는, 산물을 4시간 처리한 후, 그리고 E. coli에 의한 2시간 군락 형성 후 (함께 6시간 처리), 기저 수준 (0시간)에서 ohm * cm²으로 표시되는 상피 관통 전기 저항 (TEER) 결과를 보여준다.

처리 전 (T = 0시간) TEER 수치는 타이트 정션의 구조 온전성과 관련있는 장벽의 전체 저항성을 나타낸다.

점막 장벽 온전성에 대한 물리적인 파라미터인 TEER을 이용해, 점막 상피 수준에서 세포 간 이온 흐름에 대한 산물의 영향을 규명하였다.

도 5는 크랜베리 1000 μg/ml 단독 4시간 처리 후 또는 E. coli에 의한 2시간 군락 형성 후, 기저 수준 (0시간)에서 ohm * cm²로 표시되는 상피 관통 전기 저항 (TEER) 결과를 나타낸다. 6시간은 음성 대조군의 총 배양 시간이다.

도 5에 나타난 바와 같이, E. coli에 의한 군락 형성은 2시간 처리 후 TEER을 274.67 ohm * cm²에서 218.68 ohm * cm²로 감소시켰다 (-21%).

크랜베리 4시간 전처리시, TEER은 315 ohm* cm²에서 325.82 ohm*cm²로 증가하였으며, E. coli의 부착성을 떨어뜨렸다 (TEER 3% 회복).

4시간 처리 후, 크랜베리 단독은 TEER 수치를 43% 증가시켰으며 (299.86 ohm* cm²->430.54 ohm*cm²): 이러한 결과는 E. coli 존재 및 부재시 상피 장벽에 대한 크랜베리 추출물의 유효한 막 형성 특성과 긍정적인 효과를 입증해준다.

5.4 루시퍼 옐로우를 이용한 검사: 세포 간 투과성

루시퍼 옐로우 (LY)의 세포 간 흐름을 노출 기간 종료 시점에 평가하였으며; 형광 측정 결과는 도 6에 도시한다.

도 6은 정단부 구획에서 0시간대의 LY 대비 LY 유동성 %를 도시한 것이다. 도 6은 6시간 처리 (크랜베리 4시간 처리 및 2시간 E. coli 군락화) 후 LY의 이동을 보여준다.

음성 대조군 (NC)은 LY 투과성이 0.52%였다.

E. coli는 음성 대조군 (NC 대비 LY 이동 74% 증가)과 비교해 LY 투과성이 더 높았다 (0.91%).

음성 대조군과 검사 산물 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다: 크랜베리 전처리시 장 상피가 회복되었으며, E. coli의 부착이 방지되었다.

크랜베리 단독으로도 보호 효과가 있었다: 음성 대조군 대비 LY 이동 29% 감소가 관찰되었다.

5.5 α-액티닌의 면역형광 염색

첨부된 일련의 사진들을 형광 현미경으로 분석한 샘플이다. 녹색은 막 수준에 위치한 단백질 α-액티닌을 나타낸다. α-액티닌은 E. coli 단백질인 Tir과 상호작용하여, 페데스탈이라고 하는 부착성 플라그를 형성하며, 이것은 E. coli 감염의 마커이다.

도 7은 E. coli의 군락인 형성된 크랜베리 처리 또는 비-처리 샘플에서 α-액티닌의 면역형광 결과를 도시한 것이다.

막 수준에서 형광 증가는 음성 대조군과 비교해 E. coli에 의한 군락 형성 후 명확하게 드러났다.

크랜베리는, 단독 적용되거나 또는 E. coli 군락화 전 전처리로서 사용되었을 때, α-액티닌의 일부 감소를 유도하였다 (E. coli에 의한 군락 형성한 경우와 비교해 유의한 차이는 없었음).

5.6 주사 전자 현미경

도 8은 문헌에서 입수한 Caco-2 세포 미세융모의 초미세구조 사진을 도시한 것이다 (BCD Cancer 2008 8:227)

무처리 Caco-2 세포에서 많은 수의 미세융모를 관찰할 수 있다. 세포 가장자리 (cell margin)는 보이지 않는다. 삽입도: 긴 미세융모를 나타낸 것이다. b. EGF 처리된 세포. 다수의 소낭들이 확인된다. 삽입도: 미세융모의 수적 감소를 보여준다. c-f: 처리된 세포. 미세융모의 수가 감소하였으며, 직립 자세를 벗어났다.

E. coli에 의한 Caco-2 세포 군락화에 대한 조직학적 비트로스크린 데이터 (Historical VitroScreen data): E. coli의 증식 및 세포 층에의 부착이 확인되었다 (적색 화살표).

도 9A 및 9B는 주사 전자 현미경으로 분석한 샘플을 도시한 것이다.

도 10A는 6시간 경과시 음성 대조군: 무처리 CacoGoblet를 나타낸 것이다.

예상된 바와 같이, 음성 대조군에서 세포 스트레스 또는 박테리아 오염은 관찰되지 않았다. 조직은 영양성 (trophic)이었으며, 제대로 구조화된 데스모솜이 존재하였다 (1000x). 미세융모는 표면 전체에 잘 조직화되어 있는 것으로 보이며: 미세융모의 조밀한 브러쉬-유사 가장자리 (brush-like border)를 관찰할 수 있다 (5000x, 적색 박스).

도 10B는 2시간 경과시 조직의 E. coli 군락 형성을 나타낸 것이다.

기술적인 문제가 해결되어, CacoGoblet의 표면에서 E. coli 증식은 존재하지 않았다. 그러나, 단일층에서 표면에 손상된 미세융모가 관찰되었으며; 이는 음성 대조군과 비교해 그 수가 더 적고, 정상 자세가 아니었으므로, 이는 E. coli가 브러쉬-유사 가장자리에 손상을 유발하였음을 의미한다.

도 10C는 2시간 E. coli 군락 형성 전 크랜베리를 4시간 전처리한 경우를 보여준다.

단일층은 제대로 구조화된 것으로 보이며, 표면에 미세융모가 관찰되었다 (5000x). 수개의 E. coli 세포들이 관찰되었으며, 이의 형태가 변형되고 (10000x, 적색 화살표), 세포용해된 투명한 신호로 관찰되었다. 또한, 상당한 박테리아 파편 (10000x, 적색 별)들이 보이며, 이는 크랜베리 처리가 E. coli를 손상시켰음을 의미한다.

6. 결론

Sofar S.p.A.를 대리해 크랜베리 추출물의 효능을 평가하기 위해 시험관내 CacoGoblet 장 상피를 기반으로 하는 다양한 실험 모델을 적용하였다.

제품의 잠재적인 고유 독성을 배제하기 위해, MTT 분석으로 비-세포독성 농도를 예비 단계에서 검사하였다.

효능 실험에서 선택한 최대 비-세포독성 농도는 1000 μg/ml이었다.

2가지 프로토콜을 사용하였다:

2) E. coli의 점막 부착을 방지하는 크랜베리의 능력

결론을 도출하기 위해 하기 파라미터들을 평가하였다:

- IL1-beta에 의해 유발된 염증을 이용한 CacoGoblet에서의 단핵구-상피 세포 부착 (항-염증 효과)

- 상피 관통 전기 저항 (TEER) 및 LY의 세포 간 이동 (상피 장벽의 변형)

- 주사 전자 현미경 (SEM)을 이용한 E. coli의 초미세구조 분석 (E. coli의 부착 및 증식 대처)

- 면역형광에 의한 α-액티닌의 위치 (E. coli 부착 대처)

결론적으로, 결과는 다음과 같다:

1) 크랜베리, 염증 발생된 장 점막에 적용, THP-1 세포에의 상당한 부착 감소 유도, 현저한 항-염증 작용이 시사됨.

2) 4시간 동안 크랜베리 전처리시 E. coli의 부착에 의해 유발되는 장벽 손상을 일부 상쇄시키며; 크랜베리를 단독으로 4시간 처리 후 TEER 수치가 43% 증가하였으며, 이는 탁월한 막 형성력을 시사함.

3) 크랜베리 단독은 장벽의 온전성을 보호하는 작용을 수행한다: 음성 대조군 대비 29%의 LY 통과 감소가 관찰되었다. 음성 대조군과 비교해 검사 산물에서 유의한 차이는 나타나지 않았다: 크랜베리 전처리시 장 상피가 복구되었으며, E. coli에 의한 부착이 방지되었다.

4) E. coli 부착의 바이오마커로서 적합한 α-액티닌으로 염색시, 적용된 실험 조건 하에 크랜베리 처리에 의한 유의한 수준의 변형은 없었으며; 일부 형광 감소가 관찰되었다.

5) 주사 전자 현미경에 의한 분석에서 E. coli의 부착, 생존성 및 형태에 대한 크랜베리의 직접적인 활성이 확인되었다.

Claims

(i) (a) 백시늄 (Vaccinium) 속의 하나 이상의 식물의 추출물과 (b) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분을 포함하거나 또는 이들로 구성되는 코어; 및
(ii) 코어 (i)를 완전히 덮고 있으며, (c) 약학적 용도 또는 식품 용도로 허용가능한 하나 이상의 성분을 포함하는, 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (gastro-resistent layer external to the core)
을 포함하거나, 또는 이들로 구성되는 경구 투여용 조성물로서,
상기 위-내성 층 (ii)이 결장에서 상기 추출물 (a)을 방출시킬 수 있으며;
상기 조성물이:
- 게실 질환, SUDD (symptomatic uncomplicated diverticular disease) 및 결장 게실염으로부터 선택되는, 게실의 존재와 관련있는 병태 또는 질환; 또는
- 결장 게실증
의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것인,
경구 투여용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 (a) 백시늄 (Vaccinium) 속의 하나 이상의 식물의 추출물이 (a)의 총 중량을 기준으로 150 mg - 600 mg인 함량으로 존재하는 건조 추출물인, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 추출물 (a)이 (a)의 총 중량을 기준으로 200 mg 내지 300 mg 범위의 함량으로 존재하며, (a)의 총 중량에 대해 프로안토시아니딘을 80% 내지 99%로 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출물 (a)이 크랜베리 건조 추출물이거나; 또는 중량% 또는 부피%로서 5 내지 30%, 또는 10%, 15%, 20% 또는 25%의 농도로 PAC (프로안토시아니딘)를 포함하는 크랜베리 건조 추출물인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이 pH 및/또는 시간에 따라 분해 및 용해되는 특징을 가지거나; 또는 상기 층 (ii)이 pH 6.5 내지 pH 8의 pH에서 분해 및 용해될 수 있는, 조성물.
제5항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이 pH 7 내지 pH 7.5의 pH에서, 30분 내지 120분, 또는 45분 내지 90분 범위의 시간 내에 분해 및 용해될 수 있는, 조성물.
제1항 또는 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이 위-내성 폴리머, 음이온성 메타크릴 코폴리머, 7:3:1의 메틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트 및 메타크릴산이 중합된 폴리(메틸 아크릴레이트-co-메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산), 트리에틸 사이트레이트, 탈컴 (talcum), 에틸 셀룰로스, 음이온성 메타크릴레이트 코폴리머 및 이의 혼합물, 셀락 (shellac), 소듐 알기네이트 및 이의 혼합물, 전분 및 변형 전분, 올레산, 스테아르산 및 중쇄 (medium-chain) 트리글리세라이드로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이,
- 위-내성 폴리머, 음이온성 메타크릴레이트 코폴리머, 또는 7:3:1의 메틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트 및 메타크릴산이 중합된 폴리(메틸 아크릴레이트-co-메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산): 5 내지 50 mg, 10 내지 35 mg, 또는 18 내지 25 mg;
- 트리에틸 사이트레이트: 0.1 내지 5 mg, 0.3 내지 3 mg, 또는 0.5 내지 2 mg; 및
- 탈컴: 1 내지 30 mg, 3 내지 20 mg, 또는 5 내지 15 mg
을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이,
- 에틸 셀룰로스: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 또는 9.97 mg;
- 소듐 알기네이트: 5 내지 15 mg, 8 내지 12 mg, 또는 9.30 mg;
- 암모늄 하이드록사이드: 0.5 내지 4 mg, 1.5 내지 3 mg, 또는 2.34 mg;
- 중쇄 트리글리세라이드: 0.5 내지 5 mg, 1.5 내지 3 mg, 또는 2.12 mg;
- 올레산: 0.5 내지 3 mg, 1 내지 2 mg, 또는 1.17 mg; 및
- 정제된 스테아르산: 0.01 내지 0.5 mg, 0.05 내지 0.3 mg, 또는 0.1 mg
을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이,
- 에틸 셀룰로스: 5 내지 50 mg, 10 내지 30 mg, 또는 15 내지 20 mg;
- 이산화티타늄: 0.1 내지 15 mg, 0.5 내지 10 mg, 또는 1 내지 5 mg;
- 소듐 알기네이트: 0.1 내지 5 mg, 0.3 내지 4 mg, 또는 0.5 내지 2 mg; 및
- 올레산, 스테아르산, 중쇄 트리글리세라이드: 각각 0.01 내지 3 mg, 또는 0.05 내지 1 mg
을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이,
- 7:3:1의 메틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트 및 메타크릴산이 중합된 폴리(메틸 아크릴레이트-co-메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산): 20.4 mg;
- 트리에틸 사이트레이트: 1 mg; 및
- 탈컴: 10.2 mg
을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코어 (i)의 외층인 위-내성 층 (ii)이,
- 에틸 셀룰로스: 9.97 mg;
- 소듐 알기네이트: 9.30 mg;
- 암모늄 하이드록사이드: 2.34 mg;
- 중쇄 트리글리세라이드: 2.12 mg;
- 올레산: 1.17 mg; 및
- 정제된 스테아르산: 0.1 mg
을 포함하는, 조성물.