KR102440206B1 - Composition and method for producing ginsenoside compound k using enzyme liquid of aspergillus tubingensis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) A composition for preparing a ginsenoside compound K containing an enzyme solution and a manufacturing method.
Description
본 발명은 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for preparing a ginsenoside compound K using an Aspergillus tubingensis enzyme solution and a manufacturing method.
인삼은 예로부터 아시아의 여러 나라에서 면역기능을 강화하고 영양을 공급하며 피로를 줄이기 위한 전통한약으로 사용되어 왔다. 그 중 인삼의 진세노사이드는 이러한 다양한 생물학적, 의약적 화성을 담당하는 주성분으로 총 인삼의 1~3% 추출이 가능한 것으로 알려져 있다. 인삼 내에 다량으로 존재하는 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd로부터 달려 있는 글루코오스, 아라비노오스와 같은 당이 분해되어 생성되는 진세노사이드 컴파운드 케이는 콜레스테롤저하, 혈압강하, 세포독성 및 암 억제, 기억력 증가, 항스트레스, 항노화 등과 같은 여러 활성을 가지고 있다. 그러나, 진세노사이드 컴파운드 케이는 장내 세균에 의해 생성되는 것으로 알려져 있으나 분해 능력이 적거나 없는 사람에게는 약학적 효과를 기대하기 어렵다. 따라서 이러한 효과를 보기 위하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 이용한 건강식품 및 화장품 산업이 많이 발전하고 있으며 이를 대량생산하는 방법이 요구되고 있는 실정이다.Ginseng has been used as a traditional herbal medicine to strengthen immune function, provide nutrition, and reduce fatigue in many Asian countries since ancient times. Among them, ginsenoside of ginseng is the main component responsible for these various biological and medicinal chemical conversions, and it is known that 1-3% of total ginseng can be extracted. Ginsenoside compound K, which is produced by decomposition of sugars such as glucose and arabinose from ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, and Rd, which are protophanaxadiol-based saponins present in large amounts in ginseng, lowers cholesterol and lowers blood pressure. , cytotoxicity and cancer suppression, memory increase, anti-stress, anti-aging, etc. have several activities. However, although ginsenoside compound K is known to be produced by intestinal bacteria, it is difficult to expect a pharmaceutical effect in those who have little or no decomposition ability. Therefore, in order to see this effect, the health food and cosmetic industry using ginsenoside compound K is developing a lot, and a method for mass production thereof is required.
현재까지 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하는 기술에는 효소를 이용하는 방법과 세균을 이용하는 방법들이 있다. 효소를 이용한 방법은 유전자 조작으로 얻은 효소로 반응하여 생산하는 방법이기 때문에 높은 활성을 보였으나 식품에 이용하기에는 부적합하며, 기질대비 매우 다량의 효소를 첨가하고 있어 다량의 효소 자체를 얻는 데에도 많은 노력이 요구되는 문제점이 있다. 세균을 이용한 전환반응의 특성상 성장의 한계 및 곰팡이류를 이용한 반응에 비해 생산 역가가 낮다는 단점이 있다. 한편, 기존 곰팡이 효소를 이용한 방법의 경우, 이러한 곰팡이 유래 효소를 수득하는 것은 균주로부터 직접 분리 및 정제하는 방법을 사용하거나 균주로부터 효소의 유전자를 클로닝하여 재조합 발현벡터에서 발현시키고 이를 정제하여 수득하는 방법을 통상적으로 이용하는데 이는 산업화에 이용하기에는 정제 비용과 부산물들로 인한 환경오염이 될 수 있어 산업화에 적합하지 않은 방법이다. To date, the technology for producing ginsenoside compound K includes methods using enzymes and methods using bacteria. The method using the enzyme showed high activity because it is a method for producing by reaction with an enzyme obtained by genetic manipulation, but it is not suitable for use in food. This is a required problem. Due to the nature of the conversion reaction using bacteria, there is a limitation in growth and a low production titer compared to the reaction using fungi. On the other hand, in the case of a method using a conventional fungal enzyme, to obtain such a fungal-derived enzyme is a method of direct isolation and purification from a strain, or a method of cloning an enzyme gene from a strain, expressing it in a recombinant expression vector, and purifying it. is commonly used, which is not suitable for industrialization because it can cause environmental pollution due to refining costs and by-products for industrial use.
따라서, 상기의 문제점을 해결하기 위해 여러 특허에서는 식품에 사용 가능한 곰팡이 또는 곰팡이에게서 분리한 효소들을 사용하여 문제점을 해결하고자 하였다. Therefore, in order to solve the above problems, various patents have tried to solve the problems by using molds or enzymes isolated from molds that can be used in food.
또한, 인삼 추출물을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산할 시 문제점 중 하나인 주요 진세노사이드 중 하나인 진세노사이드 Rb2를 거의 분해하지 못한다는 점이다. 진세노사이드 Rb2는 인삼 내에 존재하는 주요 진세노사이드 중 하나지만 아라비노오스 당이 달려 있어 분해가 어려웠고, 이를 분해하는 효소를 찾는 연구는 거의 진행되지 않았다. In addition, when producing ginsenoside compound K using ginseng extract, one of the problems is that it hardly decomposes ginsenoside Rb2, which is one of the main ginsenosides. Ginsenoside Rb2 is one of the major ginsenosides present in ginseng, but it is difficult to decompose because it contains arabinose sugar, and few studies have been conducted to find an enzyme that decomposes it.
따라서, 이러한 문제점들을 해결하기 위해서 진세노사이드 Rb2를 효과적으로 분해하는 효소를 생산하는 곰팡이를 스크리닝하고, 이를 산업적으로 이용되기 위해서 식품에 사용이 적합한 방법으로 효소의 활성을 높이기 위한 연구가 필요한 실정이다. Therefore, in order to solve these problems, it is necessary to screen a fungus that produces an enzyme that effectively decomposes ginsenoside Rb2, and to increase the activity of the enzyme in a method suitable for use in food for industrial use.
본 발명은 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 등을 제공하고자 한다. The present invention is to provide a composition for producing a ginsenoside compound K including Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain enzyme solution.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for preparing a ginsenoside compound K, including an Aspergillus tubingensis strain enzyme solution.
상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주는 KCTC 14166BP로 기탁된 것일 수 있다. The Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain may be deposited as KCTC 14166BP.
상기 효소액은 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다. The enzyme solution may be an extracellular enzyme solution of the Aspergillus tubingensis strain.
상기 효소액은 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주를 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 5 g/L 내지 25 g/L의 농도로 포함하는 발현 배지에서 배양하여 수득한 것일 수 있다. The enzyme solution is the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain as a carbon source, citrus pectin (citrus pectin) or sugar beet sludge (sugar beet sludge) in an expression medium comprising a concentration of 5 g / L to 25 g / L It may be obtained by culturing.
상기 조성물 내 상기 효소액의 농도는 1 mg/ml 내지 15 mg/ml일 수 있다. The concentration of the enzyme solution in the composition may be 1 mg/ml to 15 mg/ml.
상기 조성물은 기질로서, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌; 또는 인삼 추출물을 포함할 수 있다. The composition comprises, as a substrate, one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd; Or it may include a ginseng extract.
상기 조성물 내 상기 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 1 mg/ml 내지 20 mg/ml일 수 있다.The concentration of the protopanaxadiol-based saponin in the composition may be 1 mg/ml to 20 mg/ml.
상기 조성물은 황산마그네슘(MgSO4), 염화망간(MnCl2), 황산철(FeSO4) 및 염화철(FeCl3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미네랄 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. The composition may further include one or more mineral additives selected from the group consisting of magnesium sulfate (MgSO 4 ), manganese chloride (MnCl 2 ), iron sulfate (FeSO 4 ), and iron chloride (FeCl 3 ).
본 발명의 일 구현예로, 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다. In one embodiment of the present invention, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) It provides a method for producing a ginsenoside compound K comprising the step of treating a strain enzyme solution to a substrate.
상기 처리는 40~65℃ 및 pH 3.5~6.0 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. The treatment may be performed for 2 hours to 24 hours at 40-65° C. and pH 3.5-6.0 conditions.
본 발명의 다른 구현예로, 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose) 가수분해 활성을 가지는 진세노사이드 컴파운드 케이 생산 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주(KCTC 14166BP)를 제공한다. In another embodiment of the present invention, aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain (KCTC 14166BP) produced by a ginsenoside compound having a glucose or arabinose hydrolysis activity in protopanaxadiol-based saponin ) is provided.
본 발명에 따르면, 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 이용한 것을 특징으로 하는바, 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose) 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다. 특히, 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주를 배양하는 발현 배지 내 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 최적 농도로 포함시키고, 최적 온도 및 pH 조건에서 기질에 처리함으로써, 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산성 및 수율을 보다 높일 수 있다. According to the present invention, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) It is characterized by using a strain enzyme solution, a ginsenoside compound through protopanaxadiol-based saponin glucose (glucose) or arabinose (arabinose) hydrolysis K can be produced with high productivity and yield. In particular, the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) As a carbon source in the expression medium for culturing the strain, citrus pectin or sugar beet sludge is included at an optimal concentration, and the substrate at the optimum temperature and pH conditions By processing to, it is possible to further increase the productivity and yield of the ginsenoside compound K.
특히, 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다. In particular, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) The strain is a safe mold available for food, the ginsenoside compound K prepared in the same way as above has the advantage that it can be usefully utilized for food.
도 1은 신규 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) KU-509 균주(KCTC 14166BP)의 계통도를 보여주는 그림이다.
도 2(a)는 발현 배지의 탄소원을 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서 진세노사이드 Rb2에 각각 처리한 경우, 그 글리코시다아제 활성을 나타낸 그래프이고, 도 2(b)는 발현 배지의 탄소원 농도를 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서 진세노사이드 Rb2에 처리한 경우, 그 글리코시다아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3(a)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 온도의 변화에 따른 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성 및 안정성을 나타낸 그래프이고, 도 3(b)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 pH의 변화에 따른 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성 및 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 4(a)는 최적화된 발현 배지를 통해 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서 진세노사이드 Rb2에 처리하고, 다양한 미네랄 첨가제를 각각 첨가한 경우, 그 글리코시다아제 활성을 나타낸 그래프이고, 도 4(b)는 최적화된 발현 배지를 통해 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서 진세노사이드 Rb2에 처리하고, MgSO4의 농도를 다양하게 하여 각각 첨가한 경우, 그 글리코시다아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5(a)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액을 이용하되, 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도를 다양하게 하여 반응시킨 경우, 그 생산성을 나타낸 그래프이고, 도 5(b)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 농도를 다양하게 하여 반응시킨 경우, 그 생산성을 나타낸 그래프이며, 도 3(c)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액 및 프로토파낙사다이올계 사포닌의 총 농도를 다양하게 하여 반응시킨 경우, 그 생산성 및 그 전환 수율을 나타낸 그래프이다.
도 6(a)는 최적화된 발현 배지를 통해 세포 외 효소액을 배양한 다음, 최적화된 조건에 따라 반응시킨 경우, 그 전환 정도를 시간별로 나타낸 그래프이고, 도 6(b)는 반응 전후의 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC) 측정 결과를 나타낸 그림이다.1 is a new Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) It is a figure showing a phylogenetic diagram of the KU-509 strain (KCTC 14166BP).
Figure 2 (a) is a graph showing the glycosidase activity when the extracellular enzyme solution is cultured by varying the carbon source of the expression medium and then treated with ginsenoside Rb2 as a substrate, respectively, and Figure 2 (b) is This is a graph showing the glycosidase activity when the extracellular enzyme solution is cultured with various carbon source concentrations in the expression medium and then treated with ginsenoside Rb2 as a substrate.
Figure 3 (a) is a graph showing the glycosidase activity and stability of the extracellular enzyme solution according to the change in temperature of the extracellular enzyme solution cultured through the optimized expression medium, Figure 3 (b) is through the optimized expression medium It is a graph showing the glycosidase activity and stability of the extracellular enzyme solution according to the change in the pH of the cultured extracellular enzyme solution.
Figure 4 (a) is a graph showing the glycosidase activity when the extracellular enzyme solution is cultured through an optimized expression medium, then treated with ginsenoside Rb2 as a substrate, and various mineral additives are added, respectively. 4(b) is a graph showing the glycosidase activity when the extracellular enzyme solution is cultured through an optimized expression medium, then treated with ginsenoside Rb2 as a substrate, and added with varying concentrations of MgSO 4 . to be.
Figure 5 (a) is a graph showing the productivity of the reaction using an extracellular enzyme solution cultured through an optimized expression medium, but varying the concentration of protopanaxadiol-based saponin, and Figure 5 (b) is When reacted by varying the concentration of the extracellular enzyme solution cultured through the optimized expression medium, it is a graph showing the productivity, FIG. 3 (c) is the extracellular enzyme solution and protopanaxadi cultured through the optimized expression medium It is a graph showing the productivity and the conversion yield when the total concentration of the ol-based saponin is varied and reacted.
Figure 6 (a) is a graph showing the degree of conversion by time when the extracellular enzyme solution is cultured through an optimized expression medium and then reacted according to the optimized conditions, and Figure 6 (b) is a high-performance liquid before and after the reaction The figure shows the results of high performance liquid chromatography (HPLC) measurements.
본 발명자들은 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하는 방법을 연구하던 중, 탄소원이 최적화된 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주를 배양하여 세포 외 효소액을 수득한 후, 최적 조건(온도, pH, 미네랄 첨가제의 최적 농도로 첨가, 세포 외 효소액의 농도 및 프로포파낙사다이올계 사포닌의 농도)에서 반응시킴으로써, 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산성 및 수율을 보다 높일 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. The present inventors were studying a method for producing a ginsenoside compound K using an Aspergillus tubingensis enzyme solution, and by culturing the Aspergillus tubingensis strain through an expression medium optimized for a carbon source, After obtaining the extracellular enzyme solution, by reacting under optimal conditions (temperature, pH, addition at the optimum concentration of mineral additives, the concentration of the extracellular enzyme solution and the concentration of propophanaxadiol-based saponin), the productivity and It was confirmed that the yield could be further increased, and the present invention was completed.
본 명세서 내 "진세노사이드 컴파운드 케이(C-K)"라 함은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미하는 것으로, 종래부터 다양한 생리 활성이 보고된 바 있다:In the present specification, "ginsenoside compound K (C-K)" refers to a compound represented by the following Chemical Formula 1, and various physiological activities have been previously reported:
[화학식 1][Formula 1]
진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물Composition for preparing ginsenoside compound K
본 발명은 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for preparing a ginsenoside compound K, including an Aspergillus tubingensis strain enzyme solution.
상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이로서, 자낭균류 누룩곰팡이속에 속한다. 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주는 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주(KCTC 14166BP)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain is a safe fungus that can be used in food, and belongs to the genus Ascomycetes yeast mold. The Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain is preferably an Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain (KCTC 14166BP), but is not limited thereto.
구체적으로, 상기 균주(KCTC 14166BP)는 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 중에서도, 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose) 가수분해 활성을 가지며, 특히, 상기 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose)를 쉽게 가수분해시킬 수 있고, 상기 프로토파낙사다이올계 사포닌이 진세노사이드 Rb2인 경우, 여기에 하나 존재하는 아라비노오스(arabinose)를 쉽게 가수분해시킬 수 있다. 상기 균주(KCTC 14166BP)의 계통도는 도 1에 도시한 바와 같으며, 메주로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 균주(KCTC 14166BP)는 2020년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14166BP를 부여받았다.Specifically, the strain (KCTC 14166BP) has a hydrolytic activity of glucose or arabinose in the protopanaxadiol-based saponin among Aspergillus tubingensis , and in particular, the protopa It can easily hydrolyze glucose in naxadiol-based saponin, and when the protopanaxadiol-based saponin is ginsenoside Rb2, it can easily hydrolyze arabinose present here. . The phylogenetic diagram of the strain (KCTC 14166BP) is as shown in FIG. 1 , and may be isolated from Meju. The strain (KCTC 14166BP) was deposited with the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Biological Resources Center (KCTC: Korean Collection for Type Cultures) on April 7, 2020 and was given an accession number KCTC 14166BP.
상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주로부터 배양액을 수득하기 위해서는, 상기 균주를 평판배양하여 포자를 수득하는 단계; 상기 포자를 성장 배지에서 배양하여 균사를 활성화시키는 단계; 및 상기 성장 배지를 제거한 후, 상기 활성화된 균사를 발현 배지로 옮겨 배양하여 배양액을 수득하는 단계를 포함한다. In order to obtain a culture solution from the Aspergillus tubingensis strain, plate-culturing the strain to obtain spores; activating the mycelium by culturing the spores in a growth medium; And after removing the growth medium, transferring the activated mycelium to an expression medium and culturing to obtain a culture solution.
추가적으로, 상기 배양액으로부터 세포 외 효소액을 수득하기 위해서는, 상기 배양액을 여과하는 단계; 상기 여과액을 회수하여 황산암모늄을 첨가 및 혼합하여 효소 침전액을 수득하는 단계; 상기 효소 침전액을 투석막에 넣어 투석하는 단계; 및 센트리콘을 이용하여 남은 염을 추가 제거 및 농축하는 단계를 포함한다. Additionally, in order to obtain an extracellular enzyme solution from the culture solution, filtering the culture solution; recovering the filtrate, adding and mixing ammonium sulfate to obtain an enzyme precipitate; dialyzing the enzyme precipitate solution into a dialysis membrane; and further removing and concentrating the remaining salt using a centricon.
즉, 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액은 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주를 배양함으로써 수득될 수 있는데, 본 발명에서는 상기 발현 배지를 최적화시킨 것을 특징으로 한다. That is, the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain enzyme solution can be obtained by culturing the Aspergillus tubingensis strain through an expression medium, and the present invention is characterized in that the expression medium is optimized .
상기 발현 배지는 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 포함할 수 있고, 시트러스 펙틴(citrus pectin)을 포함하는 것이 바람직한바, 기질로서 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose)의 최적 가수분해를 통해 최종적으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.The expression medium may contain citrus pectin or sugar beet sludge as a carbon source, and preferably contains citrus pectin, and as a substrate, glucose in protopanaxadiol-based saponins. Through optimal hydrolysis of (glucose) or arabinose, ginsenoside compound K can be finally prepared with high productivity and yield.
상기 발현 배지 내 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose)의 농도는 5 g/L 내지 25 g/L일 수 있고, 5 g/L 내지 20 g/L인 것이 바람직하고, 15 g/L 내지 20 g/L인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. As a carbon source in the expression medium, the concentration of cellulose may be 5 g/L to 25 g/L, preferably 5 g/L to 20 g/L, and 15 g/L to 20 g/L It is more preferable, but is not limited thereto.
반면, 탄소원으로서, 셀룰로오스 (cellulose), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 녹말(starch), 밀기울(wheat bran), 인삼 뿌리 추출물(ginseng root extract), 자몽 펙틴(grapefruit pectin) 및 사과 펙틴(apple pectin)을 사용한 경우에는, 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose)의 최적 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 효과적으로 전환하지 하는데 한계가 있다. On the other hand, as a carbon source, cellulose, carboxymethyl cellulose, starch, wheat bran, ginseng root extract, grapefruit pectin and apple pectin ), there is a limit in not effectively converting ginsenoside compound K through optimal hydrolysis of glucose or arabinose in protopanaxadiol-based saponin.
또한, 상기 발현 배지는 질소원으로는 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose)의 최적 가수분해를 통해 최종적으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.In addition, the expression medium preferably includes corn steep solid as a nitrogen source, but is not limited thereto. Likewise, through optimal hydrolysis of glucose or arabinose in protopanaxadiol-based saponin, ginsenoside compound K can be finally prepared with high productivity and yield.
상기 발현 배지 내 질소원(특히, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid))의 농도는 5 g/L 내지 20 g/L일 수 있고, 10 g/L 내지 15 g/L인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of the nitrogen source (in particular, corn steep solid) in the expression medium may be 5 g/L to 20 g/L, preferably 10 g/L to 15 g/L, but limited thereto doesn't happen
그밖에, 상기 발현 배지는 KH2PO4, MgSO47H2O, CaCl2, FeSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O, MnSO4·H2O 및 CoCl2·6H2O 를 추가로 포함할 수 있는데, 구체적으로, KH2PO4 1~3 g/L, MgSO47H2O 0.1~1.0 g/L, CaCl2 0.1~1.0 g/L, FeSO4.7H2O 1.0~10.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 0.5~5.0 mg/L, MnSO4·H2O 0.5~5.0 mg/L 및 CoCl2·6H2O 1.0~10.0 mg/L 를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the expression medium is KH 2 PO 4 , MgSO 4 7H 2 O, CaCl 2 , FeSO 4 ·7H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O, MnSO 4 ·H 2 O and CoCl 2 ·6H 2 O In addition It may include, specifically, KH 2 PO 4 1-3 g/L, MgSO 4 7H 2 O 0.1-1.0 g/L, CaCl 2 0.1-1.0 g/L, FeSO 4.7H 2 O 1.0-10.0 mg /L, ZnSO 4.7H 2 O 0.5 to 5.0 mg/L, MnSO 4· H 2 O 0.5 to 5.0 mg/L, and CoCl 2 ·6H 2 O 1.0 to 10.0 mg/L may be further included.
한편, 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 효소액은 전술한 바와 같이, 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다. Meanwhile, the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) enzyme solution may be an extracellular enzyme solution of the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain, as described above.
상기 조성물 내 상기 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 1 mg/ml 내지 20 mg/ml일 수 있고, 2 mg/ml 내지 20 mg/ml인 것이 바람직하고, 7 mg/ml 내지 20 mg/ml인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of the protopanaxadiol-based saponin in the composition may be 1 mg/ml to 20 mg/ml, preferably 2 mg/ml to 20 mg/ml, and 7 mg/ml to 20 mg/ml is more preferable, but is not limited thereto.
한편, 상기 조성물은 기질에 처리하기 위한 것으로, 상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.On the other hand, the composition is for treating a substrate, wherein the substrate contains one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd. It is preferred, but not limited thereto.
또한, 상기 기질은 인삼 추출물일 수 있고, 상기 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. In addition, the substrate may be a ginseng extract, and the ginseng extract may be a solvent extraction of the root, fruit, stem or leaf of ginseng. In this case, the solvent extraction may be performed using water, a C1 to C2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, and the lower alcohol may be ethanol or methanol.
상기 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 1 mg/ml 내지 20 mg/ml일 수 있고, 8 mg/ml 내지 20 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of protopanaxadiol-based saponin in the composition may be 1 mg/ml to 20 mg/ml, preferably 8 mg/ml to 20 mg/ml, but is not limited thereto.
한편, 상기 조성물은 황산마그네슘(MgSO4), 염화망간(MnCl2), 황산철(FeSO4) 및 염화철(FeCl3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미네랄 첨가제를 추가로 포함할 수 있고, 황산마그네슘(MgSO4)를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 황산마그네슘(MgSO4)은 두부를 응고하는 경우와 같이 식품에 널리 사용되고 있는 첨가제로서, 사람에게 필수적인 미네랄 중 하나이다. Meanwhile, the composition may further include one or more mineral additives selected from the group consisting of magnesium sulfate (MgSO 4 ), manganese chloride (MnCl 2 ), iron sulfate (FeSO 4 ) and iron chloride (FeCl 3 ), magnesium sulfate (MgSO 4 ) It is preferable to further include, but is not limited thereto. The magnesium sulfate (MgSO 4 ) is an additive widely used in food, such as when coagulating tofu, and is one of essential minerals for humans.
상기 조성물 내 미네랄 첨가제의 농도는 0.01 mM 내지 1.0 mM일 수 있고, 0.01 mM 내지 0.1 mM인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of the mineral additive in the composition may be 0.01 mM to 1.0 mM, preferably 0.01 mM to 0.1 mM, but is not limited thereto.
진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법Manufacturing method of ginsenoside compound K
본 발명은 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a ginsenoside compound K, comprising the step of treating the Aspergillus tubingensis strain enzyme solution to a substrate.
상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다. Since the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain enzyme solution has been described above, a redundant description will be omitted.
한편, 상기 효소액에 황산마그네슘(MgSO4), 염화망간(MnCl2), 황산철(FeSO4) 및 염화철(FeCl3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미네랄 첨가제를 첨가할 수 있고, 황산마그네슘(MgSO4)를 첨가하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 황산마그네슘(MgSO4)은 두부를 응고하는 경우와 같이 식품에 널리 사용되고 있는 첨가제로서, 사람에게 필수적인 미네랄 중 하나이다. Meanwhile, one or more mineral additives selected from the group consisting of magnesium sulfate (MgSO 4 ), manganese chloride (MnCl 2 ), iron sulfate (FeSO 4 ) and iron chloride (FeCl 3 ) may be added to the enzyme solution, and magnesium sulfate (MgSO 4 ) is preferably added, but is not limited thereto. The magnesium sulfate (MgSO 4 ) is an additive widely used in food, such as when coagulating tofu, and is one of essential minerals for humans.
또한, 상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.In addition, the substrate preferably includes one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd, but is not limited thereto.
또한, 상기 기질은 인삼 추출물일 수 있고, 상기 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. In addition, the substrate may be a ginseng extract, and the ginseng extract may be a solvent extraction of the root, fruit, stem or leaf of ginseng. In this case, the solvent extraction may be performed using water, a C1 to C2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, and the lower alcohol may be ethanol or methanol.
또한, 상기 처리는 40~65℃ 및 pH 3.5~6.0 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 처리를 위한 온도 조건은 50~60℃인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 온도가 50℃ 미만인 경우, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 크게 감소할 수 있고, 온도가 60℃ 초과인 경우, 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 양상을 보일 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 4.0~5.0인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, pH가 4.0 미만이거나 pH가 5.0 초과인 경우, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성과 세포 외 효소액의 안정성이 모두 크게 저하되는 양상을 보일 수 있다. 따라서, 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 즉, 이러한 pH 및 온도 조건을 유지함으로써, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지할 수 있다. 따라서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose)의 최적 가수분해를 통해 최종적으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.In addition, the treatment may be carried out for 2 hours to 24 hours at 40 ~ 65 ℃ and pH 3.5 ~ 6.0 conditions. Specifically, the temperature condition for the treatment is preferably 50 to 60 ℃, but is not limited thereto. At this time, if the temperature is less than 50 ℃, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution may be greatly reduced, and if the temperature is more than 60 ℃, the stability of the extracellular enzyme solution may be significantly reduced. In addition, the pH conditions for the treatment are preferably pH 4.0 to 5.0, but is not limited thereto. At this time, when the pH is less than 4.0 or the pH is more than 5.0, both the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution and the stability of the extracellular enzyme solution may be significantly reduced. Therefore, in order to maintain such a pH condition, a buffer solution may be used as a reaction solvent. In addition, by maintaining these pH and temperature conditions, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution is high, and the stability of the extracellular enzyme solution can be maintained even for a long time reaction. Therefore, it is possible to finally prepare ginsenoside compound K with high productivity and yield through optimal hydrolysis of glucose or arabinose in protopanaxadiol-based saponin.
그밖에, 본 발명은 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose) 가수분해 활성을 가지는 진세노사이드 컴파운드 케이 생산 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주(KCTC 14166BP)를 제공한다. In addition, the present invention provides a ginsenoside compound K producing Aspergillus tubingensis strain (KCTC 14166BP) having glucose or arabinose hydrolysis activity in protopanaxadiol-based saponin do.
상기 균주(KCTC 14166BP)는 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose) 가수분해 활성을 가지는 것으로, 특히, 상기 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose)를 쉽게 가수분해시킬 수 있고, 상기 프로토파낙사다이올계 사포닌이 진세노사이드 Rb2인 경우, 여기에 하나 존재하는 아라비노오스(arabinose)를 쉽게 가수분해시킬 수 있다. 그밖의 특징에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다. The strain (KCTC 14166BP) has glucose or arabinose hydrolysis activity in protopanaxadiol-based saponins, and in particular, easily hydrolyzes glucose in the protopanaxadiol-based saponins. In the case where the protopanaxadiol-based saponin is ginsenoside Rb2, arabinose present therein can be easily hydrolyzed. Since other features have been described above, redundant description will be omitted.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주 효소액을 이용한 것을 특징으로 하는바, 프로토파낙사다이올계 사포닌 내 글루코오스(glucose) 또는 아라비노오스(arabinose) 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다. 특히, 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주를 배양하는 발현 배지 내 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 최적 농도로 포함시키고, 최적 온도 및 pH 조건에서 기질에 처리함으로써, 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산성 및 수율을 보다 높일 수 있다. As described above, according to the present invention, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) It is characterized in that the strain enzyme solution is used, glucose (glucose) or arabinose (arabinose) hydrolysis in protopanaxadiol-based saponins Through this, ginsenoside compound K can be manufactured with high productivity and yield. In particular, the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) As a carbon source in the expression medium for culturing the strain, citrus pectin or sugar beet sludge is included at an optimal concentration, and the substrate at the optimum temperature and pH conditions By processing to, it is possible to further increase the productivity and yield of the ginsenoside compound K.
특히, 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다. In particular, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) The strain is a safe mold available for food, the ginsenoside compound K prepared in the same way as above has the advantage that it can be usefully utilized for food.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
실시예 1: 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Example 1: Aspergillus tubing ensis ( Aspergillus tubingensisAspergillus tubingensis ) KU-509 균주 분리 및 동정) KU-509 strain isolation and identification
신규 균주를 분리하기 위해, 메주를 시료로 사용하였다. 메주를 10배 희석법을 사용하여 포테이토 덱스트로오즈 한천배지(Potato dextrose agar medium, PDA)에 도말하고 여러 차례 획선 도말하고 배양한 후 콜로니 형태를 관찰하여 신규 균주를 분리하였다. 분리된 신규 균주의 동정을 위해 genomic DNA를 얻었으며, β-tubulin 유전자를 다음과 같은 PCR 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 통한 증폭 및 시퀀싱하였다:To isolate new strains, meju was used as a sample. Meju was spread on a potato dextrose agar medium (PDA) using a 10-fold dilution method, streaked several times, and cultured, followed by observing the colony form to isolate a new strain. For the identification of the isolated new strain, genomic DNA was obtained, and the β-tubulin gene was amplified and sequenced through polymerase chain reaction (PCR) with the following PCR primers:
정방향 : 5'-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3'Forward: 5'-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3'
역방향 : 5'-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3'Reverse: 5'-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3'
시퀀싱하여 얻은 β-tubulin 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 나타내었고, 이에 대한 계통도를 도 1에 나타내었다. 이때, 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) KU-509 균주는 2020년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14166BP를 부여받았다.The nucleotide sequence of the β-tubulin gene obtained by sequencing is shown in SEQ ID NO: 1, and a systematic diagram thereof is shown in FIG. 1 . At this time, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) KU-509 strain was deposited at the Korea Research Institute of Biotechnology and Biotechnology Biological Resources Center (KCTC: Korean Collection for Type Cultures) on April 7, 2020 and was given an accession number KCTC 14166BP.
실시예 2: 발현 배지 내 탄소원 및 이의 농도에 따른, 세포외 효소액의 글리코시다아제 활성 확인Example 2: Confirmation of glycosidase activity of the extracellular enzyme solution according to the carbon source and its concentration in the expression medium
본 발명에서는 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 효소액을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함에 있어서, 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 발현 배지를 최적화하였다. In the present invention, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) In preparing a ginsenoside compound K using an enzyme solution, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) The expression medium of the strain was optimized.
구체적으로, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 기반으로 한 브래드포드(Bradford) 방법을 이용하여 효소 단백질의 양을 측정하였고, 파라-니트로페놀 효소 분석(para-nitrophenol enzyme assay) 방법을 이용하여 글리코시다아제 활성을 측정하였다. 구체적으로, 파라-니트로페놀 효소 분석 방법은 파라-니트롤페닐 글루코오스(para-nitrophenyl glucose, pNP-glu) 1 mM을 기질로 하여 효소와 반응하고 난 후, Na2CO3를 첨가하여 반응 종결을 시켜 파라-니트롤페놀(para-nitrolphenol, 염기조건에서 노란색으로 발색반응을 일으킴)이 얼마나 생성되는지 450 nm의 흡광도에서 흡광값을 측정하여 글리코시다아제 활성을 확인하였다. Specifically, the amount of the enzyme protein was measured using the Bradford method based on bovine serum albumin, and the glycolytic protein was measured using a para-nitrophenol enzyme assay method. The sidase activity was measured. Specifically, in the para-nitrophenol enzyme analysis method, para-nitrophenyl glucose ( p NP-glu) 1 mM was used as a substrate to react with the enzyme, and then Na 2 CO 3 was added to terminate the reaction. Glycosidase activity was confirmed by measuring the absorbance value at absorbance at 450 nm to see how much para-nitrolphenol (which causes a yellow color reaction under basic conditions) was produced.
먼저, 실시예 1에서 분리 및 동정한 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주(KCTC 14166BP)를 포테이토 덱스트로오즈 한천배지(Potato dextrose agar medium, PDA)에서 26℃에서 7일간 평판배양하였다. 평판배양된 접시(plate)내의 포자를 거즈에 걸러 회수하고 4 ㎖의 액상 포테이토 덱스트로오즈 배지(Potato dextrose medium, PDB)에 포자 농도가 2.0 X 106 spores/mL 농도로 희석한 포자액을 1 ㎖ 접종하고, 26℃ 및 150 rpm으로 24시간 동안 성장배양하였다. 성장배양으로 만들어진 성장배양액 내의 균사를 탄소원 및 질소원이 제외된 발현 배지로 세척하여 균사만 100㎖의 발현 배지에 옮긴 후, 26 및 150 rpm으로 7일간 배양하였다. First, Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain (KCTC 14166BP) isolated and identified in Example 1 was plate-cultured at 26 ° C. for 7 days in Potato dextrose agar medium (PDA). The spores in the plate cultured plate were collected by filtering with gauze, and the spore solution diluted to a spore concentration of 2.0 X 10 6 spores/mL in 4 ml of liquid potato dextrose medium (PDB) was added to 1 ㎖ inoculated, and grown and cultured for 24 hours at 26 ℃ and 150 rpm. After washing the mycelium in the growth medium made from the growth culture with an expression medium excluding carbon and nitrogen sources, and transferring only the mycelium to 100 ml of expression medium, 26 and 150 rpm for 7 days.
이때, 발현 배지의 조성은 탄소원 20 g/L, 질소원 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO47H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4.7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다. 탄소원으로서, 셀룰로오스 (cellulose)(대정화금㈜), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)(시그마 알드리치 사), 녹말(starch)(바이오세상㈜), 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)(홀리메드캠), 밀기울(wheat bran)(심즈펫), 인삼 뿌리 추출물(ginseng root extract)(에이스젬), 시트러스 펙틴(citrus pectin)(대정화금㈜), 자몽 펙틴(grapefruit pectin)(소스네추럴스) 및 사과 펙틴(apple pectin)(네추럴스플러스)로 총 6가지를 사용하였고, 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)(시그마 알드리치 사)를 사용하였다. At this time, the composition of the expression medium is carbon source 20 g/L, nitrogen source 10 g/L, KH 2 PO 4 2 g/L, MgSO 4 7H 2 O 0.3 g/L, CaCl 2 0.3 g/L, FeSO 4.7H 2 O 5.0 mg/L, ZnSO 4.7H 2 O 1.4 mg/L, MnSO 4· H 2 O 1.3 mg/L, and CoCl 2 ·6H 2 O 3.7 mg/L. As a carbon source, cellulose (Daejeong Chemical Co., Ltd.), carboxymethyl cellulose (Sigma Aldrich), starch (Biosang Co., Ltd.), sugar beet sludge (Holy Medcam), Wheat bran (Sims Pet), ginseng root extract (Ace Gem), citrus pectin (Daejeong Hwageum Co., Ltd.), grapefruit pectin (Source Naturals) and apple pectin A total of six were used as (apple pectin) (Naturals Plus), and as a nitrogen source, corn steep solid (Sigma-Aldrich) was used.
그 다음, 배양액을 와트만 여과지를 사용하여 여과한 후, 여과액을 회수하여 황산암모늄을 80 % 포화가 되도록 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 혼합하여 효소 침전액을 수득하였다. 효소 침전액 내의 황산암모늄을 제거하기 위해 셀룰로오스 투석막을 이용하여 200 mM의 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액으로 4℃에서 24시간 동안 투석하고, 센트리콘을 이용하여 남은 황산암모늄 추가 제거 및 농축을 진행하여 세포 외 효소액을 수득하였다.Then, the culture solution was filtered using Whatman filter paper, the filtrate was recovered, ammonium sulfate was added to 80% saturation, and the mixture was mixed at 4° C. for 24 hours to obtain an enzyme precipitate solution. To remove ammonium sulfate in the enzyme precipitation solution, dialysis was performed at 4° C. for 24 hours with 200 mM Mcilvaine buffer using a cellulose dialysis membrane, and the remaining ammonium sulfate was further removed and concentrated using Centricon. An extracellular enzyme solution was obtained.
그 다음, 세포 외 효소액 0.5 mg/ml 및 기질로서 진세노사이드 Rb2(Ambo Institute) 0.4 mg/ml가 함유된 완충용액을 55℃ 및 pH 4.0에서 10분 동안 반응시켜, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성을 측정하였다. Then, a buffer solution containing 0.5 mg/ml of extracellular enzyme solution and 0.4 mg/ml of ginsenoside Rb2 (Ambo Institute) as a substrate was reacted at 55° C. and pH 4.0 for 10 minutes, and glycosidase of the extracellular enzyme solution Activity was measured.
그 결과, 도 2(a)에 나타난 바와 같이, 발현 배지 내 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)(특히, 시트러스 펙틴(citrus pectin))를 사용한 경우, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 높은 것으로 확인된다. 다만, 탄소원으로서, 셀룰로오스(cellulose), 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 녹말(starch), 밀기울(wheat bran), 인삼 뿌리 추출물(ginseng root extract), 자몽 펙틴(grapefruit pectin) 및 사과 펙틴(apple pectin)을 사용한 경우에는, 세포외 효소액의 글리코시다아제 활성이 상대적으로 크게 저하되는 것으로 확인된다. As a result, as shown in Figure 2 (a), as a carbon source in the expression medium, when using citrus pectin or sugar beet sludge (in particular, citrus pectin), extracellular enzyme solution It is confirmed that the glycosidase activity of However, as a carbon source, cellulose, carboxymethyl cellulose, starch, wheat bran, ginseng root extract, grapefruit pectin and apple pectin ), it is confirmed that the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution is relatively significantly decreased.
또한, 도 2(b)에 나타난 바와 같이, 발현 배지 내 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin)이 5 g/L 내지 20 g/L (특히, 15 g/L 내지 20 g/L)인 경우, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 크게 향상되는 것으로 확인된다. In addition, as shown in Figure 2(b), as a carbon source in the expression medium, when citrus pectin is 5 g/L to 20 g/L (in particular, 15 g/L to 20 g/L), It is confirmed that the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution is greatly improved.
따라서, 최적화된 발현 배지의 조성은 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin) 20 g/L, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid) 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO47H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4.7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다.Therefore, the composition of the optimized expression medium as a carbon source, citrus pectin (citrus pectin) 20 g / L, corn steep solid (corn steep solid) 10 g / L, KH 2 PO 4 2 g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.3 g/L, CaCl 2 0.3 g/L, FeSO 4.7H 2 O 5.0 mg/L, ZnSO 4.7H 2 O 1.4 mg/L, MnSO 4 H 2 O 1.3 mg/L and CoCl 2 6H 2 O is 3.7 mg/L.
실시예 3: 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성 및 안정성 확인Example 3: Confirmation of glycosidase activity and stability of extracellular enzyme solution according to temperature and pH change of extracellular enzyme solution
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성 및 안정성을 확인하였다. In the present invention, the glycosidase activity and stability of the extracellular enzyme solution according to the temperature and pH changes of the extracellular enzyme solution cultured through the optimized expression medium were confirmed.
(1) 세포 외 효소액에 대한 온도 효과 확인(1) Confirmation of temperature effect on extracellular enzyme solution
세포 외 효소액에 대한 온도 효과를 확인하기 위해서, 세포 외 효소액 0.5 mg/ml 및 기질로서 진세노사이드 Rb2(Ambo Institute) 0.4 mg/ml가 함유된 완충용액(pH 4.0)을 40℃ 내지 65℃의 범위에서 10분 동안 반응시켜 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성을 확인하였다. In order to confirm the temperature effect on the extracellular enzyme solution, a buffer solution (pH 4.0) containing 0.5 mg/ml of extracellular enzyme solution and 0.4 mg/ml of ginsenoside Rb2 (Ambo Institute) as a substrate was prepared at 40°C to 65°C. The glycosidase activity of the extracellular enzyme solution was confirmed by reacting in the range for 10 minutes.
또한, 세포 외 효소액 0.5 mg/ml를 40℃ 내지 65℃의 범위에서 12시간 동안 방치한 후, 이와 기질로서 진세노사이드 Rb2(Ambo Institute) 0.4 mg/mL가 함유된 완충용액(pH 4.0)을 온도별로 10분 동안 반응시켜 세포 외 효소액의 안정성을 확인하였다. In addition, 0.5 mg/ml of the extracellular enzyme solution was left in the range of 40°C to 65°C for 12 hours, and a buffer solution (pH 4.0) containing 0.4 mg/mL of ginsenoside Rb2 (Ambo Institute) as a substrate was added thereto. The stability of the extracellular enzyme solution was confirmed by reacting for 10 minutes at each temperature.
그 결과, 도 3(a)에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 높은 온도는 50~60℃(특히, 55℃)인 것으로 확인되나, 60℃ 이상의 온도에서 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 문제점이 있는 것으로 확인된다. 따라서, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지하는 온도인 50~55℃가 최적 온도인 것으로 확인된다. As a result, as shown in FIG. 3(a), it was confirmed that the temperature at which the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution is high is 50-60°C (in particular, 55°C), but the stability of the extracellular enzyme solution at a temperature of 60°C or higher It is confirmed that there is a problem that this is greatly reduced. Therefore, it is confirmed that the optimum temperature is 50 to 55° C., which is a temperature that maintains the stability of the extracellular enzyme solution even after a long reaction while having high glycosidase activity of the extracellular enzyme solution.
(2) 세포 외 효소액에 대한 pH 효과 확인(2) Confirmation of pH effect on extracellular enzyme solution
세포 외 효소액에 대한 pH 효과를 확인하기 위하여, 세포 외 효소액 0.5 mg/ml 및 기질로서 진세노사이드 Rb2(Ambo Institute) 0.4 mg/ml가 함유된 완충용액(55℃)을 pH 3.5 내지 6.5의 범위에서 10분 동안 반응시켜 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성을 확인하였다. In order to confirm the effect of pH on the extracellular enzyme solution, a buffer solution (55° C.) containing 0.5 mg/ml of extracellular enzyme solution and 0.4 mg/ml of ginsenoside Rb2 (Ambo Institute) as a substrate was used in the pH range of 3.5 to 6.5. was reacted for 10 minutes to confirm the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution.
또한, 세포 외 효소액 0.5 mg/ml를 pH 3.5 내지 6.5의 범위에서 12시간 동안 방치한 후, 이와 기질로서 진세노사이드 Rb2(Ambo Institute) 0.4 mg/ml가 함유된 완충용액(55℃)을 pH별로 10분 동안 반응시켜 세포 외 효소액의 안정성을 확인하였다. In addition, after 0.5 mg/ml of the extracellular enzyme solution was left at a pH of 3.5 to 6.5 for 12 hours, a buffer solution (55° C.) containing 0.4 mg/ml of ginsenoside Rb2 (Ambo Institute) as a substrate was added thereto. By reacting for 10 minutes, the stability of the extracellular enzyme solution was confirmed.
그 결과, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성 및 안정성이 모두 높은 pH는 모두 4.0~5.0(특히, 4.0~4.5)인 것으로 확인된다. pH가 5.0을 초과하는 경우, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 크게 저하되는 양상을 보였고, 오랜 시간 반응에 있어 세포 외 효소액의 안정성 역시 저하되는 양상을 보였다. As a result, as shown in Figure 3 (b), it is confirmed that all of the high pH of the glycosidase activity and stability of the extracellular enzyme solution is 4.0 to 5.0 (in particular, 4.0 to 4.5). When the pH exceeded 5.0, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution was greatly reduced, and the stability of the extracellular enzyme solution was also decreased in the long-time reaction.
실시예 4: 미네랄 첨가제의 첨가 및 이의 첨가 농도에 따른, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성 확인Example 4: Confirmation of glycosidase activity of extracellular enzyme solution according to the addition of mineral additives and the concentration thereof
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 미네랄 첨가제의 첨가 및 이의 첨가 농도에 따른, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성을 확인하였다. In the present invention, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution was confirmed according to the addition and concentration of the mineral additive in the extracellular enzyme solution cultured through the optimized expression medium.
먼저, 세포 외 효소액 0.5 mg/ml 및 기질로서 진세노사이드 Rb2(Ambo Institute) 0.4 mg/ml가 함유된 완충용액에 9종 미네랄 첨가제(CaCl2, CoCl2, KCl, MgSO4, MnCl2, NaCl, FeSO4, FeCl2 및 FeCl3) 1.0 mM을 각각 첨가하고 55및 pH 4.0에서 10분 동안 반응시켜 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성을 확인하였다. First, in a buffer containing 0.5 mg/ml of extracellular enzyme solution and 0.4 mg/ml of ginsenoside Rb2 (Ambo Institute) as a substrate, 9 mineral additives (CaCl 2 , CoCl 2 , KCl, MgSO 4 , MnCl 2 , NaCl) , FeSO 4 , FeCl 2 and FeCl 3 ) 1.0 mM each was added and 55 And by reacting at pH 4.0 for 10 minutes, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution was confirmed.
그 결과, 도 4(a)에 나타난 바와 같이, 미네랄 첨가제로서, MgSO4, MnCl2, FeSO4 및 FeCl3(특히, MgSO4)를 첨가한 경우, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 높은 것(MgSO4 첨가시, 1.12배 향상)으로 확인된다. 다만, 미네랄 첨가제로서, CaCl2, CoCl2, KCl, NaCl 및 FeCl2 를 첨가한 경우에는 세포외 효소액의 글리코시다아제 활성의 변화가 거의 없거나 오히려 저하되는 것으로 확인된다.As a result, as shown in FIG. 4(a), as a mineral additive, MgSO 4 , MnCl 2 , FeSO 4 and FeCl 3 (particularly, MgSO 4 ) When added, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution is high (When MgSO 4 is added, 1.12-fold improvement). However, as a mineral additive, when CaCl 2 , CoCl 2 , KCl, NaCl and FeCl 2 are added, it is confirmed that the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution is hardly changed or rather decreased.
또한, 세포 외 효소액 0.5 mg/ml 및 기질로서 진세노사이드 Rb2(Ambo Institute) 0.4 mg/ml가 함유된 완충용액에 MgSO4 0.01~1.0 mM을 각각 첨가하고 55및 pH 4.0에서 10분 동안 반응시켜 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성을 확인하였다. In addition, in a buffer containing 0.5 mg/ml of extracellular enzyme solution and 0.4 mg/ml of ginsenoside Rb2 (Ambo Institute) as a substrate, 0.01~1.0 mM of MgSO 4 was added, respectively, 55 And by reacting at pH 4.0 for 10 minutes, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution was confirmed.
그 결과, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, MgSO4를 0.01~0.1 mM(특히, 0.05 mM) 첨가한 경우, 세포 외 효소액의 글리코시다아제 활성이 높은 것(MgSO4 0.05 mM 첨가시, 1.40배 향상)으로 확인된다. As a result, as shown in FIG. 4(b), when 0.01 to 0.1 mM (particularly, 0.05 mM) of MgSO 4 was added, the glycosidase activity of the extracellular enzyme solution was high (MgSO 4 when 0.05 mM was added, 1.40) double improvement).
실시예 5: 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌 및 세포외 효소액의 농도에 따른, 세포 외 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조Example 5: Preparation of ginsenoside compound K using extracellular enzyme solution according to the concentration of protopanaxadiol-based saponin and extracellular enzyme solution in the composition
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액을 이용하되, 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌 및 세포외 효소액의 농도에 따라, 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하였다.In the present invention, but using an extracellular enzyme solution cultured through an optimized expression medium, according to the concentration of protopanaxadiol-based saponin and extracellular enzyme solution in the composition, a ginsenoside compound K was prepared.
먼저, 세포 외 효소액 7 mg/ml 및 기질(인삼 뿌리 추출물)로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 1~11 mg/ml가 함유된 완충용액을 55℃ 및 pH 4.0에서 5시간 동안 반응시켰다. First, a buffer solution containing 7 mg/ml of extracellular enzyme solution and 1 to 11 mg/ml of protopanaxadiol-based saponin as a substrate (ginseng root extract) was reacted at 55° C. and pH 4.0 for 5 hours.
그 결과, 도 5(a)에 나타난 바와 같이, 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도가 8~11 mg/ml인 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이 생산성이 높일 수 있는 것을 확인된다.As a result, as shown in Figure 5 (a), when the concentration of the protopanaxadiol-based saponin in the composition is 8 to 11 mg/ml, it is confirmed that the productivity of the ginsenoside compound K can be increased.
또한, 세포 외 효소액 1~10 mg/ml 및 기질(인삼 뿌리 추출물)로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 9 mg/ml가 함유된 완충용액을 55및 pH 4.0에서 5시간 동안 반응시켰다.In addition, a buffer solution containing 9 mg/ml of protopanaxadiol-based saponin was added to 55 as an
그 결과, 도 5(b)에 나타난 바와 같이, 조성물 내 세포 외 효소액의 농도가 2~10 mg/ml(특히, 7~10 mg/ml)인 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이 생산성이 높일 수 있는 것을 확인된다.As a result, as shown in Figure 5 (b), when the concentration of the extracellular enzyme solution in the composition is 2 ~ 10 mg / ml (particularly, 7 ~ 10 mg / ml), ginsenoside compound K productivity can be increased that is confirmed
상기 결과로부터, 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌 및 세포 외 효소액의 최적 농도는 각각 9 mg/ml 및 7 mg/ml인 것으로 확인되는바, 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌 및 세포 외 효소액의 최적 농도비를 1.29:1로 하되, 그 총 농도를 증가시켰다. 즉, 세포 외 효소액 1~15 mg/ml 및 기질(인삼 뿌리 추출물)로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 1.29~19.35 mg/ml가 함유된 완충용액을 55및 pH 4.0에서 5시간 동안 반응시켰다.From the above results, it was confirmed that the optimal concentrations of protopanaxadiol-based saponin and extracellular enzyme solution in the composition were 9 mg/ml and 7 mg/ml, respectively, the optimal concentration of protopanaxadiol-based saponin and extracellular enzyme solution in the composition The concentration ratio was set to 1.29:1, but the total concentration was increased. That is, a buffer solution containing 1.29 to 19.35 mg/ml of protopanaxadiol-based saponin was added to 55 as an extracellular enzyme solution at 1 to 15 mg/ml and a substrate (ginseng root extract). and pH 4.0 for 5 hours.
그 결과, 도 5(c)에 나타난 바와 같이, 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌 및 세포 외 효소액의 최적 농도가 각각 9 mg/ml 및 7 mg/ml인 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이 2.0 mg/ml를 생산하며, 그 전환 수율은 55%인 것으로 확인된다. 한편, 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌 및 세포 외 효소액의 최적 농도가 각각 14.19 mg/ml 및 11 mg/ml인 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이 3.9 mg/ml를 생산하며, 그 전환 수율은 47%인 것으로 확인된다. 즉, 조성물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌 및 세포 외 효소액의 총 농도를 증가시킴에 따라, 생산성은 1.35배 증가하였지만, 그 전환 수율은 0.85배 저하된 것으로 볼 수 있다. As a result, as shown in FIG. 5(c), when the optimal concentrations of protopanaxadiol-based saponin and extracellular enzyme solution in the composition were 9 mg/ml and 7 mg/ml, respectively, ginsenoside compound K 2.0 mg/ ml, and the conversion yield is found to be 55%. On the other hand, when the optimal concentrations of protopanaxadiol-based saponin and extracellular enzyme solution in the composition are 14.19 mg/ml and 11 mg/ml, respectively, ginsenoside compound K 3.9 mg/ml is produced, and the conversion yield is 47% is confirmed to be That is, as the total concentration of protopanaxadiol-based saponin and extracellular enzyme solution in the composition was increased, productivity was increased 1.35 times, but the conversion yield was reduced by 0.85 times.
실시예 6: 최적화된 조건에 따른, 세포 외 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조Example 6: Preparation of ginsenoside compound K using an extracellular enzyme solution according to optimized conditions
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액을 이용하여, 최적화된 조건에 따라, 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하였다.In the present invention, using an extracellular enzyme solution cultured through an optimized expression medium, according to the optimized conditions, a ginsenoside compound K was prepared.
세포 외 효소액 11 mg/ml 및 기질(인삼 뿌리 추출물)로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 14.19 mg/ml가 함유된 완충용액에 MgSO4 0.05 mM을 첨가하고 55℃ 및 pH 4.0에서 24시간 동안 반응시켰다.11 mg/ml of extracellular enzyme solution and as a substrate (ginseng root extract), 0.05 mM MgSO 4 was added to a buffer containing 14.19 mg/ml of protopanaxadiol-based saponin and reacted at 55° C. and pH 4.0 for 24 hours. .
그 결과, 도 6(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 인삼 뿌리 추출물 내 프로토파낙사다이올계 사포닌(진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd)은 반응 20시간 만에 진세노사이드 컴파운드 케이 8.34 mg/ml로 완전히 전환됨을 확인하였다. As a result, as shown in FIGS. 6(a) and (b), the protophanaxadiol-based saponins (ginsenosides Rb1, Rb2, Rc and Rd) in the ginseng root extract were ginsenoside compound K after 20 hours of reaction. It was confirmed that it was completely converted to 8.34 mg/ml.
참고로, 국내공개특허 제10-2011-0113228호에서는 아스퍼질러스 나이저 (Aspergillus niger)를 이용한 컴파운드 케이의 제조를 개시하고 있는데, 밀기울과 락토오스 혼합물을 탄소원으로 이용 시에 얻은 효소와 프로토파낙사다이올 파우더를 반응시킨 결과, 컴파운드 케이로의 최대 전환율은 55%에 불과하였다. 또한, 국내공개특허 제10-2018-0040784호에서는 아스퍼질러스 속 균주들을 이용하여 액체 및 고체발효에 의한 홍삼 내의 진세노사이드의 함량을 확인하고 있는데, 이때, 진세노사이드 Rb2에 대한 함량은 변화되지 않은 것을 확인하였다. For reference, Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2011-0113228 discloses the production of compound K using Aspergillus niger , and the enzyme obtained when using a mixture of bran and lactose as a carbon source and protopanaxadi As a result of reacting all powder, the maximum conversion to compound K was only 55%. In addition, in Korea Patent Publication No. 10-2018-0040784, the content of ginsenoside in red ginseng by liquid and solid fermentation is confirmed using Aspergillus sp. strains, and at this time, the content of ginsenoside Rb2 is changed It was confirmed that it was not.
따라서, 이를 통해 아스퍼질러스 속의 곰팡이를 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하는 경우 전환율이 100%에 도달한 균주가 없었으며, 진세노사이드 Rb2를 전환시키는 균주는 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주가 유일한 것으로 확인된다. Therefore, when producing a ginsenoside compound K using a fungus of the genus Aspergillus, there was no strain that reached 100% conversion, and the strain that converts the ginsenoside Rb2 is Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) ) strain is identified as unique.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The foregoing description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING GINSENOSIDE COMPOUND K USING ENZYME LIQUID OF ASPERGILLUS TUBINGENSIS <130> 2020-I098 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 463 <212> DNA <213> Aspergillus tubingensis <400> 1 cttagcttga gttcagatgt tatccatcgg ggatatagct acggttaaga acacgtctaa 60 caactcaaca ggcagaccat ctctggcgag cacggccttg acggctccgg tgtgtaagta 120 caactttttc acacctctca attggtcaac aatgtggaaa ggattgggtt tcctgacgcg 180 caggatagtt acaatggcac ctccgacctc cagctggagc gcatgaacgt ctacttcaac 240 gaggttagat cacaccgtcc ctgagttttt tcacgacaat atcatcaatg tcctgaccac 300 ttcagcaggc tagcggtaac aagtatgtcc cccgtgccgt cctcgtcgat ctcgagcccg 360 gtaccatgga cgccgtccgt gccggtccct tcggccagct cttccgcccc gacaacttcg 420 tcttcggcca gtccggtgct ggtaacaact gggccaaggg tca 463 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING GINSENOSIDE COMPOUND K USING ENZYME LIQUID OF ASPERGILLUS TUBINGENSIS <130> 2020-I098 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 463 <212> DNA <213> Aspergillus tubingensis <400> 1 cttagcttga gttcagatgt tatccatcgg ggatatagct acggttaaga acacgtctaa 60 caactcaaca ggcagaccat ctctggcgag cacggccttg acggctccgg tgtgtaagta 120 caactttttc acacctctca attggtcaac aatgtggaaa ggattgggtt tcctgacgcg 180 caggatagtt acaatggcac ctccgacctc cagctggagc gcatgaacgt ctacttcaac 240 gaggttagat cacaccgtcc ctgagttttt tcacgacaat atcatcaatg tcctgaccac 300 ttcagcaggc tagcggtaac aagtatgtcc cccgtgccgt cctcgtcgat ctcgagcccg 360 gtaccatgga cgccgtccgt gccggtccct tcggccagct cttccgcccc gacaacttcg 420 tcttcggcca gtccggtgct ggtaacaact gggccaaggg tca 463
Claims (11)
Aspergillus tubingensis deposited as KCTC 14166BP A composition for producing a ginsenoside compound K containing an enzyme solution of the strain Aspergillus tubingensis .
상기 효소액은 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 세포 외 효소액인, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
According to claim 1,
The enzyme solution is the extracellular enzyme solution of the Aspergillus tubingensis strain, ginsenoside compound K production composition.
상기 효소액은 상기 아스퍼질러스 튜빙엔시스(Aspergillus tubingensis) 균주를 탄소원으로서, 시트러스 펙틴(citrus pectin) 또는 사탕무 슬러지(sugar beet sludge)를 5 g/L 내지 25 g/L의 농도로 포함하는 발현 배지에서 배양하여 수득한 것인, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
According to claim 1,
The enzyme solution is the Aspergillus tubingensis ( Aspergillus tubingensis ) strain as a carbon source, citrus pectin (citrus pectin) or sugar beet sludge (sugar beet sludge) in an expression medium comprising a concentration of 5 g / L to 25 g / L A composition for preparing a ginsenoside compound K obtained by culturing.
상기 조성물 내 상기 효소액의 농도는 1 mg/ml 내지 15 mg/ml인, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
According to claim 1,
The concentration of the enzyme solution in the composition is 1 mg / ml to 15 mg / ml, ginsenoside compound K composition for preparing.
상기 조성물은 기질로서, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌; 또는 인삼 추출물을 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
According to claim 1,
The composition comprises, as a substrate, one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd; Or, a composition for preparing a ginsenoside compound K, including a ginseng extract.
상기 조성물 내 상기 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 1 mg/ml 내지 20 mg/ml인, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
7. The method of claim 6,
The concentration of the protopanaxadiol-based saponin in the composition is 1 mg/ml to 20 mg/ml, a composition for preparing a ginsenoside compound K.
상기 조성물은 황산마그네슘(MgSO4), 염화망간(MnCl2), 황산철(FeSO4) 및 염화철(FeCl3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미네랄 첨가제를 추가로 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
According to claim 1,
The composition further comprises one or more mineral additives selected from the group consisting of magnesium sulfate (MgSO 4 ), manganese chloride (MnCl 2 ), iron sulfate (FeSO 4 ) and iron chloride (FeCl 3 ) For producing ginsenoside compound K composition.
Aspergillus tubingensis deposited as KCTC 14166BP ( Aspergillus tubingensis ) A method of producing a ginsenoside compound K, comprising the step of treating a strain enzyme solution to a substrate.
상기 처리는 40~65℃ 및 pH 3.5~6.0 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
10. The method of claim 9,
The method for producing a ginsenoside compound K, wherein the treatment is carried out for 2 hours to 24 hours at 40 ~ 65 ℃ and pH 3.5 ~ 6.0 conditions.
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