KR100695779B1 - Microorganism producing fucoidan and method for producing fucoidan using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 푸코이단을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 푸코이단의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물 및 이를 이용한 푸코이단 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물을 이용하는 경우 종래 산 분해 추출법에 비해 안전성의 향상, 생산 비용의 감소 및 생산 수율의 향상을 가져올 수 있으므로, 식품, 화장품 및 약품 분야에서 주목받는 푸코이단을 대량생산할 수 있는 장점이 있다. The invention in Hippo creatinine producing fucoidan from that, more specifically, the seaweed to a method for producing fucoidan by microorganism and the production of this Fucoidan (hypocrea sp . The present invention relates to a microorganism and a method for producing fucoidan using the same. In the case of using the microorganism of the present invention, since it can lead to an improvement in safety, a reduction in production cost, and an improvement in production yield, compared to the conventional acid decomposition extraction method, there is an advantage of mass production of fucoidan, which is attracting attention in the food, cosmetic, and pharmaceutical fields.
푸코이단, 해조류, 히포크레아 속(hypocrea sp.), 효소 Fucoidan, algae, hypocreas sp., Enzyme
Description
도 1은 4개의 분리 균주가 미역귀를 분해하여 생성하는 황산기 함량을 측정한 결과이다. 1 is a result of measuring the sulfate content generated by the four isolated strains of seaweeds.
도 2는 4개의 분리 균주가 미역귀를 분해하여 생성하는 푸코스 함량을 측정한 결과이다.Figure 2 is the result of measuring the content of fucose produced by the four isolated strains disintegrate seaweed.
도 3은 B2206 균주로부터 얻은 효소 분획이 미역귀를 분해하여 생성하는 황산기 함량을 측정한 결과이다. Figure 3 is the result of measuring the sulfuric acid group content generated by the enzyme fraction obtained from the B2206 strain decomposition of seaweed.
도 4는 B2206 균주로부터 얻은 효소 분획이 미역귀를 분해하여 생성하는 푸코스 함량을 측정한 결과이다. Figure 4 is the result of measuring the fucose content of the enzyme fraction obtained from the B2206 strain decomposition by seaweed.
도 5는 HCX-3 및 CFN-2의 혼합물의 pH에 따른 황산기 함량 변화를 나타낸 결과이다.5 is a result showing the change of sulfuric acid group content according to the pH of the mixture of HCX-3 and CFN-2.
도 6는 HCX-3 및 CFN-2의 혼합물의 첨가량에 따른 황산기 함량 변화를 나타낸 결과이다.Figure 6 shows the change in sulfuric acid group content according to the amount of the mixture of HCX-3 and CFN-2.
도 7은 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp .) A2203 균주에서 분리한 해조류 다당분해제로 해조류(다시마)를 분해한 결과이다.7 is a genus of Microbacterium sp . This is the result of digesting seaweed (Kashima) with algae polysaccharide degrading agent isolated from A2203 strain.
본 발명은 푸코이단을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 푸코이단의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물 및 이를 이용한 푸코이단 생산 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a microorganism producing fucoidan and a method of producing fucoidan using the same, and more particularly, to a hypocrea sp . Microorganism producing hypocoa from seaweeds and a method of producing fucoidan using the same.
푸코이단(fucoidan)은 평균 분자량 15~50만의 황산화 푸코스-함유 다당류의 총칭으로서, 1) 푸코스(fucose)와 황산기만으로 이루어진 황산화푸칸, 2) 글루쿠론산, 만노스, 푸코스 및 황산기를 함유하는 황산화푸코스글루로만난, 예컨대, WO 97/26896 공보에 기재된 황산화 푸코스-함유 다당-U(구성당 및 그의 몰비가 푸코스 : 만노스 : 갈락토스 : 우론산 : 황산기 = 약 10 : 7 : 4 : 5 : 20), 3) 푸코스 및 갈락토스로 이루어진 황산화푸코갈락탄, 예컨대, PCT/JP00/00965호 명세서에 기재된 황산화푸코갈락탄(구성당 및 그의 몰비가 푸코스 : 갈락토스 = 1 : 1∼6), 및 4) 푸코스 및 만노스로 이루어진 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 등을 포함한다(Larsen, B., Acta. Chem . Scand ., 12:1395, 1970). 상기 푸코이단은 특히 홍조류 또는 다시마 및 미역 등과 같은 갈조류에 다량 함유되어 있다. 천연상태의 푸코이단은 해조류 내에서 알긴산, 단백질 및 푸코이단 등으로 이뤄진 거대분자의 구성성분 중 하나로 존재한다. Fucoidan is a generic term for sulfated fucose-containing polysaccharides having an average molecular weight of 15 to 500,000, comprising 1) fucose and sulfate groups, and 2) glucuronic acid, mannose, fucose, and sulfate groups. Sulfated fucosegluromannan containing, for example, sulfated fucose-containing polysaccharide-U described in WO 97/26896 publication (constitution sugars and molar ratios thereof are fucose: mannose: galactose: uronic acid: sulfuric acid group = about 10: 7 4: 5: 20), 3) fucogalactan sulfate, consisting of fucose and galactose, such as fucogalactan sulfate, as described in PCT / JP00 / 00965 specification 1: 1 to 6), and 4) fucose mannose (consisting of sulfate ester-fucose-mannose) consisting of fucose and mannose (Larsen, B., Acta. Chem . Scand . , 12: 1395, 1970). The fucoidan is particularly contained in large amounts of red algae or brown algae such as kelp and seaweed. Natural fucoidan exists as one of the components of macromolecules composed of alginic acid, protein and fucoidan in algae.
푸코이단은 항암 작용, 항종양 작용, 항혈액응고 작용, 면역력 강화 작용, 간세포 성장 촉진 작용 및 항알레르기 작용 등과 같은 다양하고 우수한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 대한민국 공개공보 제 2002-31411호에는 푸코이단의 싸이토카인 생성 조절을 요구하는 질환, 일산화질소 생성을 요구하는 질환 및 알레르기 질환의 치료 용도가 개시되어 있고, 대한민국 공개공보 제 1995-07868호에는 푸코이단의 궤양 치료 용도 및 파일로리의 정착 저해 용도가 개시되어 있으며, 대한민국 공개공보 제 2004-32992호에는 푸코이단의 유착, 관절염 및 건선 치료 용도가 개시되어 있다. Fucoidan is known to have a variety of excellent activities such as anticancer action, antitumor action, anticoagulant action, immune enhancing effect, hepatocyte growth promoting action and antiallergic action. For example, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2002-31411 discloses the use of fucoidan for treating cytokine production, diseases requiring nitrogen monoxide production, and allergic diseases, and Korean Patent Publication No. 1995-07868 discloses the use of Uses for the treatment of ulcers and inhibition of the fixation of pylori are disclosed, and Republic of Korea Patent Publication No. 2004-32992 discloses the use of fucoidan adhesion, arthritis and psoriasis treatment.
상기와 같은 다양하고 우수한 푸코이단의 활성이 알려지면서 해조류로부터 푸코이단을 분리 및 정제하기 위한 시도가 1980년대 이후 일본을 중심으로 이루어지고 있다. 일반적으로 해조류로부터 푸코이단을 생산하기 위해 사용되는 방법은 열수 추출법, 산 가수분해 추출법 및 효소 추출법 등을 포함한다. Attempts to separate and purify fucoidan from seaweed have been made in Japan since the 1980s, as the activities of various excellent fucoidans are known. In general, methods used to produce fucoidan from seaweed include hot water extraction, acid hydrolysis extraction and enzyme extraction.
상기 푸코이단 추출 방법들 중 산 가수분해 추출법이 가장 널리 사용되고 있다. 하지만, 산 가수분해 분해법은 중화공정을 반드시 필요로 하고, 중화적정조작이 미비할 경우 최종제품에 강산이 잔재하게 될 우려가 있다. Among the fucoidan extraction methods, acid hydrolysis extraction is most widely used. However, acid hydrolysis requires a neutralization step, and there is a fear that strong acid remains in the final product if neutralization is not adequate.
또한, 종래의 방법들은 푸코이단을 포함하는 수용성 성분의 추출을 용이하게 하게 하기 위하여, 통상적으로 해조류를 미세 분말화하는 전처리 과정을 거친다. 하지만, 해조류를 미세하게 분말화하면 그 표면적 확대로 인하여 수분을 과도하게 흡착하므로 추출 과정 중 과량의 용매가 필요하게 되는 문제가 있고, 또한 고형분의 함량이 매우 적어져 생산 경비에 비하여 그 수율이 현저히 낮아 비경제적이라는 문제가 있다. In addition, conventional methods typically undergo a pretreatment process to finely powder seaweeds to facilitate extraction of water soluble components, including fucoidan. However, when the algae is finely powdered, it has a problem that excessive solvent is required during the extraction process because of excessive adsorption of water due to the expansion of its surface area, and the yield of the solids is very low compared to the production cost due to the extremely low content of solids. There is a problem of low economy.
본 발명자들은 해조류로부터 푸코이단을 추출하는 효과적인 방법을 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 해조류로부터 푸코이단을 생성하는 효소를 생산하는 능력이 우수한 신규의 미생물을 분리 및 동정하고, 상기 미생물을 이용하여 해조류로부터 푸코이단을 고수율로 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have been researching to develop an effective method for extracting fucoidan from seaweed, and isolated and identified a novel microorganism having excellent ability to produce the enzyme that produces fucoidan from seaweed, and using the microorganism from the seaweed The present invention has been completed by confirming that fucoidan can be produced in high yield.
본 발명의 목적은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a hypocrea sp. Microorganism that produces fucoidan from seaweed.
본 발명의 다른 목적은 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물의 배양방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for culturing the hypocrea sp.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물을 이용하여 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a method for producing fucoidan from seaweed using the hypocrea sp.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물 및 카 울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물을 이용하여 푸코이단을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is the hypocreatic genus ( hypocrea sp .) microorganisms and Caulobacter sp .) to provide a method for producing fucoidan using microorganisms.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention, the present invention is hypocreatic genus ( hypocreatic) for producing fucoidan from algae sp .) to provide microorganisms.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물의 배양방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method of culturing the hypocrea sp.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물을 이용하여 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for producing fucoidan from seaweed using the hypocrea sp.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물 및 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물을 이용하여 푸코이단을 생산하는 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the genus Hippocrea ( hypocrea sp .) microorganisms and Caulobacter sp .) provides a method for producing fucoidan using microorganisms.
이하 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 신규의 미생물을 찾고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 자연계 200여 곳으로부터 시료를 채취하고 그로부터 미생물을 분리하여, 각 미생물의 푸코이단 생성 능력을 측정하였다. 상기 측정은 상기 미생물이 해조류 내에서 알긴산 및 라미라닌 등과 결합하여 고분자 형태로 존재하는 황산화푸코스형 다당을 황산화푸칸, 황산화푸코갈락탄(sulfate ester-fucose-galactose 구성), 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 및 황산화푸코스글루로만난(sulfate ester-fucose-gluronic acid-mannose/xylose 구성) 등과 같은 푸코이단으로 분해시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이다. 이를 위해 구체적으로 푸코이단 형으로 분해되어야만 검출 가능한 황산기 및 푸코스의 생성 정도를 측정하였다. In the present invention, to find a novel microorganism that produces fucoidan from algae. To this end, the present inventors collected samples from about 200 places in nature and separated the microorganisms from them, and measured the ability to produce fucoidan of each microorganism. The measurement was carried out by the microorganisms combined with alginic acid and lamyranine in algae in the polymer form of sulfated fucose-type polysaccharides, including sulfated fucan, sulfated fucose-galactose, and sulfated fucose mannan. (sulfate ester-fucose-mannose composition) and fucoidan sulfate (sulfate ester-fucose-gluronic acid-mannose / xylose composition) to determine whether it can be broken down. For this purpose, the degree of production of sulfate and fucose, which can be detected only by decomposition into fucoidan type, was measured.
그 결과 200여개의 시료로부터 분리된 미생물 중 4종류의 미생물의 경우 황산기 함량 및 푸코스 함량이 높았으며, 이들을 각각 A2104 균주, B3321 균주, B2203 균주 및 B2206 균주로 명명하였다. 상기 4종류의 균주 중 B2203 균주 및 B2206 균주의 황산기 함량 및 구성 당 중 푸코스 함량이 상대적으로 더 높았다(도 1 및 도 2 참조). As a result, four kinds of microorganisms isolated from about 200 samples had high sulfuric acid group content and fucose content, and these were named as A2104 strain, B3321 strain, B2203 strain and B2206 strain, respectively. Among the four strains, the B2203 and B2206 strains had relatively higher sulfate group content and fucose content in constituent sugars (see FIGS. 1 and 2).
상기에서 높은 푸코이단 생성능을 갖는 것으로 확인된 B2206 균주를 ITS 영역 및 26S rDNA(리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA) D1/D2분석에 기초한 분류법을 이용하여 동정한 결과 상기 B2206 균주는 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina)에 속하는 신균주로 확인되었다.The B2206 strain identified as having high fucoidan production ability was identified using a classification method based on the ITS region and 26S rDNA (DNA encoding ribosomal RNA) D1 / D2 analysis.The B2206 strain was hypocrea jacorina ( hypocrea jacorina). It was identified as a new strain belonging to).
상기 신균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206의 푸코이단 생성능이 일반적인 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) 미생물의 성질인지를 확인하기 위하여, 한국유전자은행(KCCM)으로부터 상기 신균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206와 상동성이 95% 이상인 히포크레아 자코리나(Hypocrea jacorina ATCC24449), 히포크레아 자코리나(Hypocrea jacorina ATCC13631), 히포크레아 자코리나(Hypocrea jacorina ATCC56765) 균주들을 분양받아 상기와 동일하게 황산기 및 푸코스 생성여부를 통해 푸코이단 생성여부를 실험한 결과 한국유전자은행(KCCM)으로부터 분양 받은 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) 균주들은 푸코이단을 전혀 생성하지 못했다. 따라서, 본 발명자들은 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina)에 속하는 미생물 중 해조류로부터 푸코이단을 생성하는 신규 미생물을 최초로 동정하였다. The new strain Hippocrea jacina ( hypocrea) jacorina ) Fucoidan- producing ability of B2206 is hypocreatic jacorina) to determine whether the nature of the microorganism, Korea gene The novel strain Hippo creatinine from the bank (KCCM) Here Corina (hypocrea jacorina) B2206 and the homology is 95% or more Hippo creatinine chair Corina (Hypocrea jacorina ATCC24449), Hippo creatinine chairs Corina ( Hypocrea jacorina ATCC13631), Hypocrea jacorina ATCC56765) was tested for the generation of fucoidan through the production of sulfuric acid groups and fucose in the same manner as the above, as a result of hypocracked Jacacina ( hypocrease ) received from Korea Gene Bank (KCCM) jacorina ) strains did not produce fucoidan at all. Therefore, the present inventors first identified a novel microorganism that generates fucoidan from seaweed among the microorganisms belonging to hypocrea jacorina .
상기 신균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206의 균학적 성질을 정리하면 하기와 같다. The new strain Hippocrea jacina ( hypocrea) jacorina ) The bacteriological properties of B2206 are summarized as follows.
1) 작용: 해조류로부터 황산화푸칸, 황산화푸코갈락탄(sulfate ester-fucose-galactose 구성), 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 및 황산화푸코스글루로만난(sulfate ester-fucose-gluronic acid-mannose/xylose 구성) 등과 같은 푸코이단을 생산한다. 1) Action: Fucanated sulfate, fucogalactan sulfate (consisting of sulfate ester-fucose-galactose), sulfated fucosemanganate (consisting of sulfate ester-fucose-mannose) and sulfated fucose glutamate from algae produce fucoidan, such as -gluronic acid-mannose / xylose.
2) 형태적 특성 2) morphological characteristics
본 발명에 따른 상기 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206 균주를 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2004년 8월 28일에 기탁 신청하여, 수탁번호 KACC 93015로서 기탁하였다. Hypocreatic jacina ( hypercrease) according to the present invention jacorina ) B2206 strain was deposited with the Korea Agricultural and Microorganism Conservation Center (KACC) on August 28, 2004, and deposited as accession number KACC 93015.
본 발명에서 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물과 더불어 사용되는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물은 상기 B2203균주로서 본 발명자들에 의해 분리되고 16S 리보솜 DNA(rDNA; 리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA)의 염기배열의 상동성에 기초한 분류법을 이용하여 동정된 미생물로 다음과 같은 균학적 성질을 가지고 있다. Hypocrea genus in the present invention ( hypocrea sp .) Caulobacter used with microorganisms sp .) The microorganism is a microorganism isolated from the present inventors as the B2203 strain and identified using a homology based on homology of the nucleotide sequence of 16S ribosomal DNA (rDNA; DNA encoding ribosomal RNA). Have
1) 작용: 해조류로부터 황산화푸칸, 황산화푸코갈락탄(sulfate ester-fucose-galactose 구성), 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 및 황산화푸코스글루로만난(sulfate ester-fucose-gluronic acid-mannose/xylose 구성) 등과 같은 푸코이단을 생산한다. 1) Action: Fucanated sulfate, fucogalactan sulfate (consisting of sulfate ester-fucose-galactose), sulfated fucosemanganate (consisting of sulfate ester-fucose-mannose) and sulfated fucose glutamate from algae produce fucoidan, such as -gluronic acid-mannose / xylose.
2) 형태적 특성 : 무색의 막대모양이며, 스턱(stalk)이 거의 대부분 중심부에 위치한다.2) Morphological characteristics: Colorless rod-shaped, most of the stalk (stalk) is located in the center.
3) 생리화학적 성질3) Physicochemical Properties
생화학적, 배양학적 특성은 버기스 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)에 의거하여 분석하였다. Biochemical and culture characteristics were analyzed according to Burgy's Manual of Systematic Bacteriology.
상기 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203 균주는 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2004년 3월 24일에 기탁 신청하여, 수탁번호 KACC 91095로서 기탁되었다.The Caulobacter sp.) B2203 strain was deposited with the Korea Agricultural and Microbiological Conservation Center (KACC) on March 24, 2004, and deposited as accession number KACC 91095.
본 발명의 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물을 이용하여 푸코이단 생성할 수 있는 기질은 특별히 한정되지 않지만, 해조류가 바람직하다. 상기 해조류는 다시마(Laminaria japonica), 미역귀(Undaria pinnatifida Sporophyll), 아보레센스(Padina arborescens), 푸쿠스 에바네센스(Fucus evanescens), 히만스리아(Himanthulia), 비푸카리아(Bifurcaria) 및 푸쿠스 베지쿨로수스(Fucus vesiculosus) 등을 포함하는 갈조류 및 에오파이세아 코다리아레스 네마시스투스(Phaeophyceae Chordariales nemacystus) 등을 포함하는 홍조류가 바람직하고, 갈조류가 보다 바람직하며, 다시마 또는 미역귀가 가장 바람직하다. Hypocreatic genus of the present invention ( hypocrea sp .) The substrate capable of producing fucoidan using microorganisms is not particularly limited, but seaweeds are preferred. The algae is seaweed ( Laminaria japonica ), seaweed ( Undaria pinnatifida Sporophyll ), Padina arborescens , Fucus evanescence Brown algae and Phaeophyceae Chordariales , including evanescens , Himanthulia , Bifurcaria , and Fucus vesiculosus red algae, including nemacystus ), are preferred, brown algae are more preferred, and kelp or seaweed ears are most preferred.
상기 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 본 발명의 미생물이고, 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina)인 것이 보다 바람직하고, 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206(KACC 93015)인 것이 특히 바람직하다. Hypocreatic genus ( hypocrea sp . ) The microorganism is a microorganism of the present invention for producing fucoidan from seaweed, more preferably hypocreas jacorina , hypocreas jacorina ( hypocrea jacorina ) B2206 (KACC 93015) is particularly preferred.
또한, 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물은 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물과 혼합하여 사용될 수 있으며, 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 미생물이고, 특히 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095)인 것이 바람직하다. In addition, hypocreatic sp . ) Microorganisms in bakteo to the cowl (Caulobacter sp.) May be used in combination with the microorganism in bakteo a cowl (Caulobacter sp .) microorganisms are microorganisms that produce fucoidan from algae, especially Caulobacter sp .) is preferably B2203 (KACC 91095).
본 발명의 미생물은 통상적인 히포크레아 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. The microorganism of the present invention can be cultured in large quantities by a conventional culturing method of the genus micropore.
배양배지로는 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 해조류가 첨가된 배지를 사용할 수 있다. 예컨대, 펩톤, 이스트 추출물, 황산마그네슘, 아가 및 미역귀 분말이 함유된 배지에서 배양할 수 있다. 상기 미생물의 배양은 통상의 히포크레아 속 미생물 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 20℃ 내지 40℃에서 24시간 내지 80시간 정도 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 30℃에서 72시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 상기 미생물의 배양물을 배양액과 파쇄물로 분리하게 위하여, 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. As the culture medium, a medium containing a carbon source and a nitrogen source may be used. Preferably, a medium to which seaweed is added may be used. For example, it can be cultured in a medium containing peptone, yeast extract, magnesium sulfate, agar and seaweed powder. Cultivation of the microorganisms is possible under the conditions for culturing the microorganism of the genus Hippocrea, for example, it may be cultured for 24 hours to 80 hours at 20 ℃ to 40 ℃. More preferably, it is preferable to incubate at 30 ° C. for about 72 hours. In order to separate the culture of the microorganism into the culture medium and the lysate, it may be subjected to centrifugation or filtration, and this step may be performed by those skilled in the art as needed. The concentrated cells may be frozen or lyophilized according to a conventional method so as not to lose their activity.
본 발명의 미생물의 배양액 또는 파쇄물을 당업계에 통상적인 방법으로 분자량별로 분획하여 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 수득할 수 있다. 바람직하게는 겔-컬럼 크로마토그래피에 의해 분자량 별로 분획물을 수득할 수 있다. The culture or lysate of the microorganism of the present invention may be fractionated by molecular weight by a method conventional in the art to obtain a fraction having fucoidan production activity. Preferably, fractions can be obtained for each molecular weight by gel-column chromatography.
상기 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활 성이 있는 분획물은 푸코이단을 생산할 수 있으면 그 종류에 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 확인하기 위해, 상기 균주의 세포내 및 세포외에서 효소를 분리한 다음, 겔-칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분자량에 따라 세포내 2개 및 세포외 4개의 총 6개의 효소 분획을 얻었다. 상기에서 얻은 6개의 효소 분획에 대하여 각 온도(30℃ 및 50℃) 및 각 pH(pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 및 pH 9)에 따른 푸코이단 생성능을 푸코이단 형으로 유리되어야만 검출 가능한 황산기 및 푸코스의 함량으로 공지의 방법에 따라 측정하였다. 그 결과 총 6개의 효소 분획 중 HCX-3 및 HCX-4의 황산기 함량이 높게 나타났으며(도 3 참조), HCX-4 및 HCX-3의 푸코스 함량이 높게 나타났다(도 4 참조). 따라서, 상기 히포크레아(hypocrea sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물은 예컨대, 상기 HCX-3 분획의 효소 및 HCX-4 분획의 효소일 수 있다. Hypocreatic genus ( hypocrea sp . Fucoidan production from microorganisms The active fraction is not particularly limited as long as it can produce fucoidan. In one embodiment of the present invention the genus Hippocrea ( hypocrea sp . ) In order to identify the fraction having the fucoidan production activity generated from the microorganism, the enzymes were separated from the cells intracellularly and extracellularly, and then two intracellulars and four extracellulars according to the molecular weight using gel-column chromatography. A total of six enzyme fractions were obtained. For the six enzyme fractions obtained above, the fucoidan production capacity according to each temperature (30 ° C. and 50 ° C.) and each pH (
바람직하게는 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물과 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 혼합하여 사용할 수 있다. 이 때 상기 분획물이라 함은 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물의 배양액 또는 파쇄물에서 분리되고 푸코이단 생산활성이 있는 분획물을 말한다. 보다 구체적으로는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095)의 파쇄물에서 분리되고 푸코이단 생산활성이 있으며, 분자량이 27 내지 71 KD인 분획물을 말한다. 본 발명의 일실시예에 서는 상기 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물을 배양하여 수득한 분획물(HCX-3)과 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물을 배양하여 수득한 분획물(CFN-2)을 혼합하여 각 pH(pH 5, pH 6, pH 7, 및 pH 8)에 따른 푸코이단 생성능을 푸코이단 형으로 유리되어야만 검출 가능한 황산기의 함량으로 공지의 방법에 따라 측정하였다(도 5 참조).Preferably hypocreatic sp . Fractions with Fucoidan Production Activity from Microorganisms and Caulobacter sp .) Fractions with fucoidan production activity produced from microorganisms can be mixed and used. At this time, the fraction refers to the genus Caulobacter sp .) A fraction separated from the culture medium or lysate of a microorganism and having a fucoidan production activity. More specifically, Caulobacter sp .) refers to a fraction separated from the crush of B2203 (KACC 91095), has a fucoidan production activity, molecular weight of 27 to 71 KD. In the Hippo creatinine standing with one embodiment of the present invention (hypocrea sp.) Fractions obtained by culturing a microorganism (HCX-3) and in bakteo a cowl (Caulobacter sp.) Fractions obtained by culturing a microorganism (CFN-2 ) Was mixed according to the known method by the content of sulfuric acid groups detectable only when the fucoidan production ability according to each pH (pH 5, pH 6, pH 7, and pH 8) to be released in the fucoidan type (see Fig. 5).
히포크레아 속(hypocrea sp.) 또는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물은 상기 미생물의 세포외 및 세포내의 분획물에서도 존재하였으므로 상기 미생물의 배양액 또는 상기 미생물의 파쇄물에서도 존재한다. 이 때, 배양액이란 상기 미생물을 본 발명에 의한 발명 또는 공지의 방법으로 배양한 경우에 상기 미생물을 제외한 나머지를 의미하며, 파쇄물이란 상기 미생물을 초음파 등 공지의 방법으로 파쇄시킨 것을 의미한다. Hypocrea sp. Or Caulobacter genus sp .) The fraction with the fucoidan production activity produced from the microorganism is also present in the extracellular and intracellular fractions of the microorganism, so it is also present in the culture of the microorganism or in the lysate of the microorganism. In this case, the culture medium means the rest except for the microorganism when the microorganism is incubated by the invention or a known method according to the present invention, the crushed means that the microorganism is crushed by a known method such as ultrasonic waves.
본 발명에 따른 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법은 보다 상세하게는, (a) 해조류를 분해하는 단계; (b) 상기 해조류분해물에서 알긴산 및 염을 제거하는 단계; (c) 상기 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물에 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물 또는 그로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 처리하여 조푸코이단액을 얻는 단계; 및 (d) 상기 조푸코이단액을 정제하여 푸코이단을 수득하는 단계를 포함한다. The method for producing fucoidan from the algae according to the present invention is more specifically, (a) degrading algae; (b) removing alginic acid and salt from the seaweed degradation product; (c) the genus Hippocrea in the algae degradation products from which the alginic acid and salts are removed;hypocrea sp .) Treating the microorganism or the fraction having a fucoidan production activity produced therefrom to obtain a crude fucoidan solution; And (d) purifying the crude fucoidan solution to obtain fucoidan.
상기 단계를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다. The above steps are described in more detail as follows.
(a) 단계: 해조류를 분해하는 단계(a) step: disintegrating algae
본 단계는 해조류를 수용성분을 함유하도록 분해하는 단계이다. 본 방법에 사용되는 해조류는 상기와 같이 갈조류 또는 홍조류인 것이 바람직하며 미역귀, 다시마가 가장 바람직하다. 상기 해조류는 공지의 방법에 의해 분해될 수 있으며, 해조류다당분해제를 가하여 분해하는 것이 바람직하다. This step is to decompose the algae to contain water-soluble components. Seaweeds used in the method is preferably brown algae or red algae as described above, seaweed and kelp are most preferred. The algae can be decomposed by a known method, it is preferable to decompose by adding a seaweed polysaccharide degrading agent.
상기 해조류다당분해제는 해조류로부터 수용성 다당류 성분을 액화하고, 해조류 내에서 푸코이단, 알긴산 및 라미라닌 등으로 이루어진 다당복합체로부터 알긴산을 유리시키는 효소를 말한다. 예컨대, 상기 해조류다당분해제는 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096)으로부터 분리한 것일 수 있지만, 그에 한정되는 것은 아니다. The seaweed polysaccharide degrading agent refers to an enzyme that liquefies a water-soluble polysaccharide component from seaweed and releases alginic acid from a polysaccharide complex composed of fucoidan, alginic acid, lamiranin, and the like in seaweed. For example, the algae polysaccharide may be isolated from Microbacterium sp. A2203 (KACC 91096), but is not limited thereto.
상기 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096)으로부터 분리된 해조류다당분해제는 다음과 같은 과정을 통해 얻을 수 있다. 마이크로박테리움속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096)을 다시마 또는 미역 분말을 포함하는 배지(pH 7.0)상에 25℃에서 30시간동안 배양한 후 10000rpm으로 원심분리하여 세포를 침전시키고 상등액을 회수한다. 이 상등액을 해조류다당분해제로 사용할 수 도 있지만, 아래와 같이 추가적인 분리과정을 거쳐 사용할 수도 있다. 즉, 회수된 상등액을 0.45μm 마이크로필터를 이용하여 1차 균체를 제거한 후, 분자량 100,000 내지 1,000,000의 조분해액(crude extract)를 분리하여 biomax 10(Phamacia co. Ltd, USA)로 pH 4.8 완충용액으로 버퍼교환을 실시한 추출액을 해조류다당분해제로 사용할 수 있다.Seaweed polysaccharides isolated from the Microbacterium sp. A2203 (KACC 91096) can be obtained by the following process. Microbacterium sp. A2203 (KACC 91096) was incubated at 25 ° C. for 30 hours on a medium containing kelp or wakame powder (pH 7.0) and then centrifuged at 10000 rpm to precipitate the cells and recover the supernatant. do. This supernatant can be used as an algae polysaccharide, but it can also be used after additional separation. That is, the recovered supernatant was removed from the primary cells using a 0.45 μm microfilter, and then a crude extract having a molecular weight of 100,000 to 1,000,000 was isolated to pH 4.8 buffer solution with biomax 10 (Phamacia co. Ltd, USA). By using the buffer exchange, the extract can be used as an algae polysaccharide.
갈조류 등의 해조류는 고염분 및 고점성의 특성을 갖고 있어 생산현장에서의 정제 추출시 액의 추출을 높이는 공정에 무리가 따른다. 따라서 본 단계의 해조류다당분해제를 사용하면 해조류의 조체(藻體)를 신속하게 분해 시킬 수 있고, 수용성 다당류 성분을 액화할 수 있으며, 액화된 다당복합체에서 알긴산 등의 점질 다당류를 분해하여 그 점도를 낮출 수 있으므로, 푸코이단의 추출수율을 높일 수 있다. 본 단계의 해조류 다당분해제를 해조류에 대해서 반응시킨 결과는 도 7과 같다.Seaweeds such as brown algae have high salinity and high viscosity, so it is difficult to increase the extraction of liquids during the extraction of tablets at the production site. Therefore, by using the algae polysaccharide degrader of this step, it is possible to rapidly decompose the algae algae, liquefy the water-soluble polysaccharide component, and decompose viscous polysaccharides such as alginic acid in the liquefied polysaccharide complex and its viscosity. Since it can be lowered, it is possible to increase the extraction yield of the fucoidan. The result of reacting the seaweed polysaccharide degrading agent of the present step with seaweed is shown in FIG. 7.
본 단계 이전에 1 중량부의 해조류를 10~20 중량부의 물로 수세하여 탈염한 후, 90~100℃의 열수로 수세하는 것이 바람직하다. 갈조류 등의 해조류는 염분의 농도가 높기 때문에 농축 공정 후 염의 제거비용이 높아지는 문제가 있으며, 또한 본 발명과 같이 해조류다당분해제의 처리를 통하여 가공하는 경우 외부 유래의 나트륨, 염소이온 등의 영향을 최소화할 필요가 있기 때문이다. 또한, 조해성으로 인한 분말화 공정의 난이성 등 이후 가공적성을 다양화하기 위해서도 본 탈염 공정 을 수행하는 것이 바람직하다. 상기와 같이, 90~100℃의 열수로 수세함으로써 해조류가 물을 흡수하는 시간을 줄일 수 있다.Prior to this step, 1 part by weight of seaweed is washed with 10 to 20 parts by weight of water and desalted, and then washed with hot water at 90 to 100 ° C. Seaweeds, such as brown algae, have a high salt concentration, which leads to a high cost of removing salts after the concentration process. Also, when processed through the treatment of a seaweed polysaccharide degrading agent as described in the present invention, the effects of external salts such as sodium and chlorine ion This is because it needs to be minimized. In addition, it is preferable to carry out the present desalting process in order to diversify the processing suitability, such as the difficulty of the powdering process due to deliquescent properties. As mentioned above, by washing with 90-100 degreeC hot water, the time which seaweeds take in water can be reduced.
(b) 단계: 알긴산 및 염이 제거된 (b) step: Alginic acid and salt removed 해조류분해물Seaweed Degradate 제조 단계 Manufacturing steps
본 단계는 (a)단계에서 제조한 해조류분해물에서 알긴산을 제거하고 탈염하는 단계이다. This step is a step of removing and desalting alginic acid from the seaweed degradation product prepared in step (a).
알긴산의 제거는 알긴산의 등전침전을 이용하는 방법 또는 알긴산과 침전을 형성하는 염을 가하는 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 예컨대 에틸알콜 및 염화칼슘을 첨가하여 알긴산을 침전시키고 여과하여 알긴산을 제거할 수 있다. Removal of alginic acid can be carried out using known methods, such as by isoelectric precipitation of alginic acid or by adding salts which form precipitates with alginic acid, for example by adding ethyl alcohol and calcium chloride to precipitate the alginic acid and filtering the alginic acid. Can be removed.
여액을 회수하고, 이를 수차례 한외여과하여 탈염 및 농축시킨다. 이 때, 이후 (c)단계에서 효소에 의해 원활하게 분해작용이 일어날 수 있도록, 정제수를 가하여 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물 내 고형물의 함량이 약 5 Brix(60cP 정도의 점도) 내지 10 Brix(80cP 정도의 점도)로 조정하는 것이 바람직하다. The filtrate is recovered and ultrafiltered several times to demineralize and concentrate. At this time, the solids in the algae digested product from which alginic acid and salts were removed by adding purified water to smoothly decompose by the enzyme in step (c) was about 5 Brix (viscosity of about 60 cP) to 10 Brix ( Viscosity of about 80 cP).
(c) 단계: (c) step: 조푸코이단을Jofukoidan 얻는 단계 Getting steps
본 단계는 상기 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물에 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물, 상기 미생물의 배양액, 상기 미생물의 파쇄물 또는 상기 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 처리하여 조푸코이단액을 얻는 단계이다. 이 때 상기 미생물, 상기 미생물의 배양액, 상기 미생물의 파쇄물 또는 상기 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 상기 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물에 0.7 부피% 내지 1.0 부피%로 첨가하여 반응시키는 것이 바람직하다. This step is a crude fucoidan solution by treating the algaic acid and salt-free algae digestion by treating hypocrea sp. Microorganisms, cultures of the microorganisms, crushed microorganisms or fractions with fucoidan production activity generated from the microorganisms. To get it. At this time, the reaction of the microorganism, the culture medium of the microorganism, the crushed product of the microorganism or the fraction having the fucoidan production activity generated from the microorganism is added to the alginic acid and salt-free seaweed digested products at 0.7% by volume to 1.0% by volume. desirable.
상기 미생물, 상기 미생물의 배양액, 상기 미생물의 파쇄물 또는 상기 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물의 작용에 의하여 라미라닌 등과 결합하여 고분자 다당으로 존재하는 황산화푸코스형 다당이 황산화푸코갈락탄, 황산화푸코스만난 및 황산화푸코스글루로만난 등의 푸코이단으로 유리되어 조푸코이단액을 얻을 수 있다. 생성된 푸코이단은 분해 시간, 효소의 량에 따라 가변적일 수 있으나, 통상 평균 분자량 50만 정도의 푸코이단이다.Fusulfated sulfated fucogalactan is a sulfated fucose-type polysaccharide that is present as a polysaccharide in combination with lamyranine by the action of the microorganism, the culture medium of the microorganism, the crushed product of the microorganism or the fucoidan production activity generated from the microorganism, It is liberated with fucoidans such as sulfated fucose mannan and sulfated fucose glumannan to obtain crude fucoidan liquid. The produced fucoidan may vary depending on the decomposition time and the amount of enzyme, but is usually fucoidan with an average molecular weight of about 500,000.
추가적으로 상기 조푸코이단액을 고온 및 고압 하에서 추출하여 저분자 푸코이단을 획득할 수 있다. 상기 고온 및 고압 추출은 100~135℃ 및 1.0~2.0 kgf/cm2 하에서 1~3 시간 동안 수행되는 것이 바람직하며 이로써 저분자 푸코이단을 획득할 수 있다. 추출 시간이 길수록 저분자량의 푸코이단을 얻을 수 있으며, 특히 2시간 이상 추출할 경우 평균 분자량 7000 정도의 저분자 푸코이단을 함유하는 조푸코이 단액을 얻을 수 있다. 이는 일본 등에서 시도 되어지고 있는 초저분자 푸코이단기술에 상응하는 안전한 분해법이다. Additionally, the crude fucoidan solution may be extracted under high temperature and high pressure to obtain low molecular fucoidan. The high temperature and high pressure extraction is preferably carried out for 1 to 3 hours at 100 ~ 135 ℃ and 1.0 ~ 2.0 kgf / cm2, thereby obtaining a low molecular fucoidan. The longer the extraction time, the lower molecular weight fucoidan can be obtained. In particular, when extracted for 2 hours or more, the crude fucoy monosaccharide containing the low molecular weight fucoidan with an average molecular weight of about 7000 can be obtained. This is a safe decomposition method corresponding to the ultra-low molecular weight fucoidan technology that has been tried in Japan.
한편, 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물, 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물의 배양액, 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물의 파쇄물 또는 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 단독으로 사용하는 대신에 히포크레아 속(hypocrea sp .) 미생물, 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물의 배양액, 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물의 파쇄물 또는 상기 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물과 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물, 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물의 배양액, 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물의 파쇄물 또는 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 혼합한 혼합물을 사용할 수도 있다.Meanwhile, the genus Hippocrea sp . ) Microorganism, the genus Hippocrea ( hypocrea sp .) culture of microorganisms, hypocreatic genus ( hypocrea sp .) microbial lysate or hypocreatic genus ( hypocrea sp.) Hippo creatinine in (hypocrea rather than exclusively by the fractions with a fucoidan-production activity produced from microorganisms sp . ) Microorganisms, in the Hippo creatinine (hypocrea sp.) The culture medium of the microorganism in the Hippo creatinine (hypocrea sp .) microbial lysate or hypocreatic genus ( hypocrea sp .) fractions with fucoidan production from microorganisms and Caulobacter sp .) microorganisms, the culture of the Caulobacter sp . microorganisms, the Caulobacter sp .) microbial lysate or Caulobacter sp .) A mixture of fractions with fucoidan production activity produced from microorganisms may be used.
상기 혼합물은 해조류분해물에 대해서 첨가량의 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 해조류분해물에 대해 0.1 부피% 내지 1.0 부피%의 범위, 가장 바람직하게는 0.5 부피% 내지 0.7 부피%의 범위로 사용될 수 있다. 0.1 부피%이하로 사용되는 경우 푸코이단 생산이 적어 비경제적이며, 1.0% 부피% 이상으로 사용되는 경우 혼합물의 단위 첨가량에 대한 푸코이단 생산량이 감소되어 비경제적이다.The mixture may be used without limitation in the amount of addition to the seaweeds, preferably in the range of 0.1% to 1.0% by volume and most preferably in the range of 0.5% to 0.7% by volume relative to the seaweeds. When used below 0.1% by volume, it is uneconomical because of less fucoidan production, and when used above 1.0% by volume, it is uneconomical because fucoidan production is reduced relative to the unit addition of the mixture.
(d) (d) 푸코이단Fucoidan 수득 단계 Obtaining Step
본 단계는 상기 조푸코이단액을 정제하여 푸코이단을 수득하는 단계로서, 공지의 정제 및 수득방법을 사용할 수 있으나 상기 조푸코이단액을 한외여과로 탈염, 농축한 후 이온교환칼럼에서 NaCl 농도구배로 용출하여 분획을 얻고, 분획물의 황산기 및 구성당조성을 측정하여 함량이 높은 분획을 수집하여 푸코이단을 수득하는 것이 바람직하다. This step is a step of purifying the crude fucoidan solution to obtain fucoidan, known purification and obtaining method can be used, but desalination and concentration of the crude fucoidan solution by ultrafiltration and eluting with NaCl concentration gradient in an ion exchange column. It is preferable to obtain a fraction, collect sulfuric acid and constituent sugar composition of the fraction to collect a high content fraction to obtain fucoidan.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
<실시예 1> <Example 1>
푸코이단Fucoidan 생성능을Generation ability 갖는 미생물의 탐색 Exploration of Having Microorganisms
<1-1> 미생물의 분리 및 배양<1-1> Isolation and Culture of Microorganisms
1999년부터 전남 여수 인근의 해안, 토양, 식물체, 동물체 및 가축분변 등으로부터 200여개의 시료를 채취하였다. 상기 각 시료를 하기 표 1의 각 배지를 이 용하여 1주일동안 계대배양한 다음 종균배양하였다. 하기 표 1의 각 배지는 분리할 미생물 상을 고려하여 A는 박테리아, B는 진균, C는 해양박테리아의 분리를 위한 배지조성이다. 상기에서 배양된 각 미생물 시료를 A배지에서 48시간, B배지에서 96시간, C배지에서 48시간 배양하여, 박테리아 및 해양박테리아는 순수분리 후 그람염색하고 현미경 검경을 거친 후 보관하여 사용하였고, 진균류는 분리 후 재분리 배양하여 보관하였다. Since 1999, more than 200 samples have been taken from the coast, soil, plants, animals and livestock feces near Yeosu, Jeonnam. Each sample was subcultured for one week using each medium of the following Table 1, followed by seed culture. Each medium of Table 1 is a medium for the separation of A, bacteria, B is fungi, C is marine bacteria considering the microbial phase to be separated. Each microbial sample cultivated above was incubated for 48 hours in medium A, 96 hours in medium B, and 48 hours in medium C. Bacteria and marine bacteria were gram-stained after pure separation and stored after microscopic examination. After the separation was separated and stored in culture.
<1-2> 알긴산 및 염이 제거된 해조류 해조류분해물 제조<1-2> Alginic acid and salt-free seaweed seaweed degradation product
미역귀(Undaria pinnatifida Sporophyll) 200g을 증류수 2kg으로 2차례 수세하여 원료에 묻어 있는 만니톨 및 염분을 제거하였다. 여기에 90℃의 증류수 2kg을 가한 다음, 4℃의 증류수 1.6kg을 추가로 가하여 약 50℃로 맞춘 후, 구연산-탄산나트륨 버퍼를 첨가하여 pH 4.8로 조정하였다. 여기에 해조류다당분해제로서 본 발명자들이 기탁한 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096) 미생물로부터 분리한 효소(대한민국 특허출원 제 2004-21662호)를 30g 첨가하고 8시간 동안 분해하여 수용성성분을 액화하였다. 다시 121℃에서 10분간 처리하여 점성을 60cP(25℃)이하로 낮추었다. 상기 해조류분해물에 에틸알콜을 1.7kg 첨가하고, 염화칼슘을 25g 첨가하여 30℃에서 2시간 교반하고, 원심분리(17,000g, 20분)하여 상등액을 수득하여 25㎛의 여과포가 장착된 원심탈수기에서 여과(1차 여과액 수득)하였다. 여과되지 않은 잔사를 다시 수세하여 원심분리(17,000g, 20분)한 상등액을 상기와 같이 25㎛의 여과포가 장착된 원심탈수기에서 여과하고 여과액을 수득한다. 수득한 여과액을 상기 1차 여과액과 합친 후 한외여과기(millipore, USA) MWCO 5,000으로 4회 탈염 및 농축하였다. 여기에 증류수를 투입하여 고형분 함량이 5 Brix(60cP 점도; 25℃)이하 또는 10 Brix(80cP 점도; 25℃)이하가 되도록 조정하여 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물을 제조하였다.Seaweed ear ( Undaria pinnatifida 200 g of Sporophyll ) was washed twice with 2 kg of distilled water to remove mannitol and salt from the raw materials. 2 kg of distilled water at 90 ° C. was added thereto, and then 1.6 kg of distilled water at 4 ° C. was further added to adjust to about 50 ° C., and then adjusted to pH 4.8 by adding citric acid-sodium carbonate buffer. This micro tumefaciens in which they deposit the inventors as the sugars released in the seaweed (Microbacterium sp.) By the addition of A2203 (KACC 91096) enzyme (Republic of Korea Patent Application No. 2004-21662 No.) separated from microbial decomposition and 30g for 8 hours The water-soluble component was liquefied. Treatment was carried out again at 121 ° C. for 10 minutes to reduce the viscosity to 60 cP (25 ° C.) or less. 1.7 kg of ethyl alcohol was added to the seaweed digested product, 25 g of calcium chloride was added, stirred at 30 ° C. for 2 hours, centrifuged (17,000 g, 20 minutes) to obtain a supernatant, and filtered in a centrifugal dehydrator equipped with a 25 μm filter cloth. (First filtrate obtained). The unfiltered residue was washed again with water, and the supernatant obtained by centrifugation (17,000 g, 20 minutes) was filtered in a centrifugal dehydrator equipped with a 25 μm filter cloth as described above to obtain a filtrate. The obtained filtrate was combined with the primary filtrate and then desalted and concentrated four times with an ultrafilter (millipore, USA) MWCO 5,000. Distilled water was added thereto to adjust the solids content to 5 Brix (60 cP viscosity; 25 ° C.) or less or 10 Brix (80 cP viscosity; 25 ° C.) or less to prepare alginic acid and salts.
한편, 다시마(Laminarea japonica)에 대해서도 상기 방법과 동일하게 해조류분해물을 제조하였다.Meanwhile, kelp ( Laminarea japonica ) was prepared in the same manner as above.
<1-3> 푸코이단 생성능이 우수한 균주 분리<1-3> Strain Isolation with Excellent Fucoidan Formation
해조류로부터 푸코이단을 생성할 수 있는 미생물을 확인하기 위하여, 기질로서 상기 실시예 <1-2>에서 제조된 고형분 함량이 10 Brix인 해조류분해물을 이용하여 상기 실시예 <1-1>에서 채취 및 분리한 각 미생물의 푸코이단 생성능을 조사하였다. 즉, 상기 실시예 <1-1>에서 채취 및 분리한 균주를 다시 종균 배양하고, 상기 해조류분해물에 대하여 1 부피%의 양으로 접종한 후 7시간 동안 방치하였다. 이후 하기의 방법에 따라 황산기 함량을 측정하고 구성 당 중 푸코스 함량을 측정하였다. In order to identify microorganisms capable of producing fucoidan from seaweeds, it was collected and separated in Example <1-1> using a seaweed degradation product having a solid content of 10 Brix prepared in Example <1-2> as a substrate. Fucoidan production ability of each microorganism was investigated. That is, the strains collected and separated in Example <1-1> were again seeded and cultured, and inoculated in an amount of 1% by volume with respect to the seaweed digested product and left for 7 hours. Since the sulfuric acid group content was measured according to the following method and the content of fucose in the constituent sugar.
황산기 함량의 측정은 공지의 방법(Dogson, K. S. et al ., A Note on the Determination of the Ester Sulphate Content of Sulphated Polysaccharides. Biochem. J., vol 84, 106, 1962)에 따라 수행하였다. 즉, 상기 분해액 0.3mL에 4% TCA용액(Trichloroacetic acid, Sigma Co. Ltd, USA) 3.8mL 및 염화바륨-젤라틴시약 1mL를 첨가 및 교반한 다음 20분간 방치하여 360nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선은 K2SO4(Sigma Co. Ltd., USA)로 하였다. 이 때 염화바륨-젤라틴시약은 증류수 400ml에 젤라틴 2g 넣고 65℃에서 완전히 녹이고 4℃에서 하룻밤 방치한 후 염화바륨 2g을 넣어 녹이고 2시간동안 방치한 후 사용하였다. The determination of sulfuric acid group content is known in the art (Dogson, KS et. al . , A Note on the Determination of the Ester Sulphate Content of Sulphated Polysaccharides. Biochem. J., vol 84, 106, 1962). That is, 3.8 mL of 4% TCA solution (Trichloroacetic acid, Sigma Co. Ltd, USA) and 1 mL of barium chloride-gelatin reagent were added and stirred to 0.3 mL of the degradation solution, and the mixture was left for 20 minutes to measure absorbance at 360 nm. The standard calibration curve was K2SO4 (Sigma Co. Ltd., USA). At this time, the barium chloride-gelatin reagent was added to 2 g of gelatin in 400 ml of distilled water and completely dissolved at 65 ° C., and left overnight at 4 ° C., followed by 2 g of barium chloride, which was used for 2 hours.
푸코스 함량의 측정은 공지의 방법(Somogyi-Nelson법)에 따라 수행하였다. 즉, 조제한 시료용액 1㎖와 구리시약 1㎖를 시험관에 각각 넣고, water bath에서 20분간 가열하여 산화 제1구리(Cu2O)를 생성시켰다. 여기에 몰리브덴용액 1㎖를 가하여 발색시킨 후 520㎚에서 흡광도를 측정하고, 검량선으로부터 푸코스-환원당을 정량 하였다. 단, 검량선 작성시 푸코스를 표준품으로하여 측정하였다.The measurement of the fucose content was carried out according to a known method (Somogyi-Nelson method). That is, 1 ml of the prepared sample solution and 1 ml of the copper reagent were put in a test tube, and heated for 20 minutes in a water bath to produce cuprous oxide (Cu 2 O). After 1 ml of molybdenum solution was added and developed, absorbance was measured at 520 nm, and the fucose-reducing sugar was quantified from the calibration curve. However, when preparing an analytical curve, the fucose was measured as a standard.
구성 당 조성의 분석은 이온 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다. 시료 50ml를 원심분리하여 상등액을 reaction vial에 취하고 1N HCl 5ml를 가하여 110℃에서 5시간동안 가수분해한 후 NaOH 로서 중화하고 증류수 20ml로 희석하여 감압농축 후 동결건조하여 분석시료로 하였다. 분석시료 1g을 증류수 10ml에 녹인후 를 Amberite IR 200에 통과시켜 금속이온을 먼저 제거한 뒤이후 셉-팩(Sep-pak) 카트리지(Waters Co., LTD, USA)로 탈염하여 하기 표 2의 ion chromatography(IC) 분석조건으로 측정하였으며 표준 구성당은 L-fucose, D-galactose, D-xylose, L-ribose, D-glucose, L-rhamnose, mannitol을 사용하였고 standard peak에 대한 면적비로 구성당 함량을 산출하였다.Analysis of the composition per composition was performed using ion chromatography. 50 ml of the sample was centrifuged, and the supernatant was collected in the reaction vial. 5 ml of 1N HCl was added thereto, hydrolyzed at 110 ° C. for 5 hours, neutralized with NaOH, diluted with 20 ml of distilled water, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to be an assay sample. After dissolving 1 g of analytical sample in 10 ml of distilled water and passing through Amberite IR 200 to remove metal ions first, it was then desalted with a Sep-pak cartridge (Waters Co., LTD, USA) and ion chromatography shown in Table 2 below. Measured by (IC) analytical conditions, L-fucose, D-galactose, D-xylose, L-ribose, D-glucose, L-rhamnose, and mannitol were used as standard composition sugars. Calculated.
그 결과 200여개의 시료로부터 분리된 미생물 중 황산기 함량 및 푸코스 함량이 높은 4종류를 선정하고, 각각 A2104 균주, B3321 균주, B2203 균주 및 B2206 균주로 명명하였다. 상기 4종류의 균주에 대한 황산기 함량 및 구성당 중 푸코스 함량을 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다. 도 1 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 4종류의 균주 중 B2203 균주 및 B2206 균주의 황산기 함량 및 구성당 중 푸코스 함량이 A2104 균주 및 B3321 균주에 비해 상대적으로 높았다. 상기 결과로부터 B2203 균주 및 B2206 균주의 푸코이단 생성능이 가장 우수함을 알 수 있다. As a result, four kinds of sulfuric acid group content and fucose content among microorganisms isolated from about 200 samples were selected and named as A2104 strain, B3321 strain, B2203 strain and B2206 strain, respectively. The sulfuric acid group content and the fucose content in the constituent sugars of the four strains are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. As can be seen in Figures 1 and 2, the sulfuric acid group content and the fucose content of the B2203 strain and B2206 strain of the four strains were relatively higher than the A2104 strain and B3321 strain. From the above results, it can be seen that the fucoidan production ability of the B2203 strain and the B2206 strain is the best.
<1-4> 푸코이단 생성능이 우수한 B2206 균주의 동정<1-4> Identification of B2206 strain with excellent fucoidan production
상기에서 높은 푸코이단 생성능을 갖는 것으로 확인된 B2206 균주를 ITS 영역 및 26S rDNA(리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA) D1/D2분석에 기초한 분류법을 이용하여 동정하였다. 동정 결과 상기 B2206 균주는 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina)의 신균주로 확인되었다.B2206 strains identified above with high fucoidan production capacity were identified using a classification based on ITS region and 26S rDNA (DNA encoding ribosomal RNA) D1 / D2 analysis. As a result of the identification, the B2206 strain was identified as a new strain of hypocrea jacorina .
상기 신균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206의 푸코이단 생성능이 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina)의 일반적인 성질인지를 확인하기 위하여, 한국유전자은행(KCCM)으로부터 상기 신균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206와 상동성이 95% 이상인 히포크레아 자코리나(Hypocrea jacorina ATCC24449), 히포크레아 자코리나(Hypocrea jacorina ATCC13631), 히포크레아 자코리나(Hypocrea jacorina ATCC56765) 균주들을 분양받아 상기와 동일한 실험을 수행한 결과 한국유전자은행(KCCM)으로부터 분양 받은 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) 균주들의 황산기 흡광도는 0.325 이하로 현저히 낮았고, 구성 당 중 푸코스에 해당하는 피크는 전혀 관측되지 않았다. 상기 결과로부터, 상기 신균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206의 푸코이단 생성능은 상기 균주의 독특한 균학적 성질임을 확인할 수 있었다. The new strain Hippocrea jacina ( hypocrea) jacorina ) To determine whether the fucoidan- producing ability of B2206 is a general property of hypocrea jacorina , it has more than 95% homology with the new strain, Hypocrea jacorina B2206 , from KCCM. Hypocrea jacorina ATCC24449), Hypocrea jacorina ATCC13631) and Hypocrea jacorina ATCC56765 strains were distributed and the same experiments were conducted. As a result, sulfate absorbance of hypocrea jacorina strains received from Korea Gene Bank (KCCM) was less than 0.325. Significantly lower, no peak corresponding to fucose in the composition sugar was observed. From the results, the new strain Hippocrea jacina ( hypocrea) jacorina ) Fucoidan production ability of B2206 was confirmed to be the unique bacteriological properties of the strain.
이에 상기 균주의 형태학적 ,배양적 특성을 조사하였다.The morphological and culture characteristics of the strain were investigated.
형태학적 특징은 현미경으로 관찰하였고 완전세대와 불완전세대의 형태학적 특징은 PDA 배지(Potato Dextrose Agar, Difco co., Ltd, USA) 에 접종하여 10일간 암기 12시간, 광기 12시간을 교대로 배양하여 분생자경, 분생포자 형태를 조사하였다.Morphological characteristics were observed under a microscope. Morphological characteristics of full and incomplete generations were inoculated in PDA medium (Potato Dextrose Agar, Difco co., Ltd, USA), and then alternately incubated for 12 days with 12 hours of flash memory and 12 hours of madness. Conidia and conidia were examined.
배양학적 특징은 상기 PDA 배지에 접종하여 25℃ 5일간 배양후 각각 배양기에서 암기와 광기를 교대로 적용하면서 7-25일간 배양하면서 균사생장온도, 균사생장 pH, 및 생장시간을 조사하였다(Webster, j. Trans . Br . Mycol . Soc. 47: 75-96, 1964).The culture characteristics were inoculated in the PDA medium and cultured for 5 days at 25 ° C. for 5 days, and then the mycelial growth temperature, the mycelial growth pH, and the growth time were examined while incubating for 7-25 days while alternately applying memorization and madness in each incubator (Webster, .... j Trans Br Mycol Soc 47:. 75-96, 1964).
그 결과, 다음과 같은 형태학적 특징을 가지고 있었으며, 최적온도 25도 (통상적으로 23-27도), 최적 pH 4.5 (통상적으로 3.5-5.0), 최적 배양시간 72시간 (통상적으로 72-168시간)을 가짐을 알 수 있었다.As a result, it had the following morphological characteristics: optimum temperature 25 degrees (typically 23-27 degrees), optimum pH 4.5 (typically 3.5-5.0),
상기 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206를 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2004년 8월 28일에 기탁 신청하여, 수탁번호 KACC 93015로서 기탁하였다. Hypocreatic jacina ( hypocrea) jacorina ) B2206 was deposited with the Korea Agricultural and Microbiological Conservation Center (KACC) on August 28, 2004, and deposited as accession number KACC 93015.
<1-5> 푸코이단 생성능이 우수한 B2203 균주의 동정<1-5> Identification of B2203 Strain with Excellent Fucoidan Formation
상기에서 높은 푸코이단 생성능을 갖는 것으로 확인된 B2203 균주를 16S 리보솜 DNA(rDNA; 리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA)의 염기배열의 상동성에 기초한 분류법을 이용하여 동정하였다. 동정 결과 상기 B2203 균주는 카울로박터속(Caulobacter sp.)의 신균주로 확인되었다.The B2203 strain identified above with high fucoidan production capacity was identified using a classification based on homology of the nucleotide sequence of 16S ribosomal DNA (rDNA; DNA encoding ribosomal RNA). As a result of identifying the B2203 strain is Caulobacter sp.) was identified as a new strain.
상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 푸코이단 생성능이 카울로박터속 미생물의 일반적인 성질인지를 확인하기 위하여, 한국유전자은행(KCCM)으로부터 상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203와 상동성이 95% 이상인 카울로박터 세그니스(Caulobacter segnis (AB023427.1)), 카울로박터 비브리오이데스(Caulrobacter vibrioides (ATCC11764)), 카울로박터 크레세큰투스(Caulobacter cresecntus (AJ227757.1))을 분양받아 상기와 동일한 실험을 수행한 결과 한국유전자은행(KCCM)으로부터 분양 받은 카울로박터속(Caulobacter sp.) 균주들의 황산기 흡광도는 0.325 이하로 현저히 낮았고, 구성 당 중 푸코스에 해당하는 피크는 전혀 관측되지 않았다. 상기 결과로부터, 상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 푸코이단 생성능은 상기 균주의 독특한 균학적 성질임을 확인할 수 있었다. The new strain Caulobacter sp.) To determine whether the fucoidan-producing ability of B2203 is a general property of the Kaulobacterium microorganisms, the new strain Caulobacter from KCCM. sp.) B2203 and the homology of 95% or more bakteo cowl segment varnish (Caulobacter segnis (AB023427.1)), Caulrobacter vibrioides (ATCC11764)), a cowl bakteo Crescent sekeun tooth (Caulobacter cresecntus (AJ227757.1) in bakteo accept the pre-sale) to receive the results from the pre-sale cowl Korea Gene Bank (KCCM) performed the same experiment with the (Caulobacter sp.) Sulfate absorbance of the strains was significantly lower than 0.325, and no peak corresponding to fucose among the constituent sugars was observed. From the results, the new strain Caulobacter sp.) It was confirmed that the fucoidan production ability of B2203 is the unique mycological properties of the strain.
상기 균주는 해조류로부터 황산화푸칸, 황산화푸코갈락탄(sulfate ester-fucose-galactose 구성), 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 및 황산화푸코스글루로만난(sulfate ester-fucose-gluronic acid-mannose/xylose 구성) 등과 같은 푸코이단을 생산하는 작용을 하며, 다음과 같은 성질을 가지고 있었다. The strains include fucosulfonate sulfate, fucogalactane sulfate (consisting of sulfate ester-fucose-galactose), sulfate fucosemannan (consisting of sulfate ester-fucose-mannose), and sulfated fucoseglumanane (sulfate ester-fucose-) from seaweeds. gluronic acid-mannose / xylose composition) to produce fucoidan and had the following properties.
상기 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203를 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2004년 3월 24일에 기탁 신청하여, 수탁번호 KACC 91095로서 기탁하였다.The Caulobacter sp.) B2203 was deposited with the Korea Agricultural and Microbiological Conservation Center (KACC) on March 24, 2004, and deposited as accession number KACC 91095.
<실시예 2><Example 2>
히포크레아Hippocrea 자코리나Jacolina (( hypocreahypocrea jacorinajacorina ) B2206로부터 ) From B2206 푸코이단Fucoidan 생성 효소의 정제 Purification of Producing Enzymes
<2-1> 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206으로부터 효소 분획의 분리<2-1> Hippocreatic jacina jacorina ) Isolation of Enzyme Fraction from B2206
상기 균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206로부터 균체내 및 균체외 조효소액을 분리하여 SDS-PAGE 전기영동으로 분자량 분포를 확인한 후 유효분자량 범위에서 겔-칼럼 크로마토그래피를 통하여 분자량 별로 분획을 수득하였다. The strain Hippocrea jacobina ( hypocrea jacorina ) Intracellular and extracellular coenzyme solutions were separated from B2206 to confirm molecular weight distribution by SDS-PAGE electrophoresis, and fractions were obtained by molecular weight through gel-column chromatography in the effective molecular weight range.
즉, 상기 균주 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206를 Peptone(Difco, USA) 2.0g, Yeast extract(Difco, USA) 1.0g, MgSO4?7H2O(Sigma Co Ltd, USA) 0.2g, Agar 10.0g, 증류수 1.0 L, 미역귀 분말 3g이 포함된 배지에 접종하여 10L 발효기(Korea fermenter Co. Ltd, Korea)에서 30℃를 유지하며 72시간 통기배양한 후 균체외 조효소액 및 균체내 조효소액을 분리하였다. That is, the strain Hippocrea jacobina ( hypocrea jacorina ) B2206 with 2.0g Peptone (Difco, USA), 1.0g Yeast extract (Difco, USA), 0.2g MgSO4-7H2O (Sigma Co Ltd, USA), 10.0g Agar, 1.0L distilled water, 3g seaweed powder After inoculation into the medium and maintained at 30 ℃ in a 10L fermenter (Korea fermenter Co. Ltd, Korea) for 72 hours aeration culture, extracellular coenzyme solution and intracellular coenzyme solution were separated.
균체외 조효소액은 상기 배양된 균주을 17,000g로 원심분리 한 후 상등액을 취하여 다중필터프레스(KHS Processtechnik, Germany) 9장으로 1차 여과하고, 0.1㎛ 마이크로여과기(millipore)로 2차 여과한 다음, 한외여과기(millipore) MWCO(molecular weight cut off) 5000으로 컷오프 하여 3회 반복 농축 탈염하였다. 이후 상기 조효소액 1mL을 취하여 유속 0.5ml/분, 이동상 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 OHpak SB-803, 804, 805, 806 HQ 컬럼을 사용하여 겔-침투 크로마토그래피(GPC, gel permeation chromatography) 로 280nm에서 분자량 분포를 확인하고, SDS-PAGE로 분자량을 확인한 뒤 유속 1ml/min, 이동상 (phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 Biogel p-100(Biorad Co Ltd)을 이용한 겔-칼럼 크로마토그래피(Gel-column chromatography; Biorad Co. Ltd, USA)를 통하여 해당 분자량 범위를 수집하여 분획하였다. 그 결과 4개의 효소액 분획을 획득하였고, 이를 HCX-1(평균분자량 98kD), HCX-2(평균분자량 63kD), HCX-3(평균분자량 34kD) 및 HCX-4(평균분자량 9kD)로 명명하였다. 이후 상기 각 분획에 pH 7.0의 인산완충용액을 5배의 양으로 첨가한 후 한외여과기 MWCO 5000으로 탈염 하였다.The extracellular coenzyme solution was centrifuged at 17,000 g of the cultured strain, and the supernatant was first filtered through 9 sheets of a multi-filter press (KHS Processtechnik, Germany), followed by secondary filtration with a 0.1 μm microfilter (millipore). Cut off with an ultrafilter (millipore) MWCO (molecular weight cut off) 5000, and concentrated repeated desalting three times. After taking 1 mL of the coenzyme solution, gel permeation chromatography (GPC, gel permeation chromatography) using OHpak SB-803, 804, 805, and HQ columns with a flow rate of 0.5 ml / min and mobile phase PBS (phosphate buffered saline, pH 7.2). Molecular weight distribution at 280 nm with SDS-PAGE, and then gel-column chromatography using Biogel p-100 (Biorad Co Ltd) with a flow rate of 1 ml / min and a mobile phase (phosphate buffered saline, pH 7.2). Gel-column chromatography; Biorad Co. Ltd, USA) collected and fractionated the corresponding molecular weight range. As a result, four enzyme liquid fractions were obtained, which were named HCX-1 (average molecular weight 98kD), HCX-2 (average molecular weight 63kD), HCX-3 (average molecular weight 34kD), and HCX-4 (average molecular weight 9kD). After each addition of a pH 7.0 phosphate buffer solution in each of the fractions and then desalted by ultrafiltration MWCO 5000.
균체내 효소는 상기 균주를 배양 후 17,000g로 원심분리 한 다음 상등액을 제거하고 균체를 회수하여 pH 7.0의 인산완충용액을 첨가하였다. 이후 초음파파쇄기로 균체를 파쇄한 다음, 상기 균체외 효소의 분획 방법과 동일한 방법을 사용하여 분획을 정제하였다. 그 결과 겔-칼럼 크로마토그래피(Gel-column chromatography; Biorad Co. Ltd, USA)를 통하여 2개의 효소액 분획을 획득하였으며, 이를 각각 HCN-1(평균분자량 61kD) 및 HCN-2(평균분자량 26kD)로 명명하였다. After culturing the strain, the enzyme was centrifuged at 17,000 g, the supernatant was removed, and the cells were recovered and phosphate buffer solution of pH 7.0 was added. Thereafter, the cells were crushed by an ultrasonic crusher, and the fractions were purified using the same method as the fractionation method of the extracellular enzyme. As a result, two enzyme-liquid fractions were obtained through gel-column chromatography (Biorad Co. Ltd, USA), which were respectively purified by HCN-1 (average molecular weight 61kD) and HCN-2 (average molecular weight 26kD). Named it.
<2-2> 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203로부터 효소 분획의 분리<2-2> Caulobacter sp.) Isolation of enzyme fractions from B2203
히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206 대신 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203를 접종하는 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일하게 균체내 효소와 균체외 효소 분획을 분리하였다.Hippocrea jacina ( hypocrea jacorina ) Intracellular enzyme and extracellular enzyme fractions were isolated in the same manner as in Example <2-1> except for inoculating Caulobacter sp. B2203 instead of B2206.
이를 통해, 균체외효소 분획물 CFX-1(평균분자량 85kD), CFX-2(평균분자량 73kD), CFX-3(평균분자량 52kD), CFX-4(평균분자량 13kD) 및 CFX-5(평균분자량 5.7kD)을 얻었고, 균체내효소 분획물 CFN-1(평균분자량 71kD), CFN-2(평균분자량 54kD) 및 CFN-3(평균분자량 27kD)을 얻었다.Through this, extracellular enzyme fractions CFX-1 (average molecular weight 85kD), CFX-2 (average molecular weight 73kD), CFX-3 (average molecular weight 52kD), CFX-4 (average molecular weight 13kD) and CFX-5 (average molecular weight 5.7) kD), and intracellular enzyme fractions CFN-1 (average molecular weight 71 kD), CFN-2 (average molecular weight 54 kD) and CFN-3 (average molecular weight 27 kD) were obtained.
<2-3> 푸코이단 생성능의 확인<2-3> Confirmation of Fucoidan Formation Capacity
상기 실시예 <2-1>에서 얻은 각 효소액 분획에 대하여 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물을 기질로 하여 푸코이단 분해실험을 수행하였다. 본 실시예에서는 푸코이단 형으로 유리되어야만 검출 가능한 황산기 및 구성 당 중 푸코스의 함량을 실시예 <1-3>에서와 같이 측정하였다. Fucoidan digestion experiments were performed on each enzyme liquid fraction obtained in Example <2-1> using the alginate and salts of the seaweed degraded algae prepared in Example <1-2> as a substrate. In the present Example, the content of fucose in the sulfate group and the constituent sugar which can only be detected by fucoidan type was measured as in Example <1-3>.
상기 알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물에 대하여 상기 각 분획물을 1 부피%가 되게 첨가한 후 24시간 반응시켰다. 이후 황산기 함량을 측정하고 구성 당 조성을 분석하였다. 구체적인 황산기 함량 측정 및 구성 당 중 푸코스의 함량 측정은 상기 실시예 <1-3>에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하여, 다양한 pH(pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 및 pH 9)의 알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물에 대하여 수행하였다. 또한, 상기 각 조건의 측정 과정은 30℃ 및 50℃의 반응 온도로 측정하였다. Each fraction was added to 1% by volume with respect to the algae and seaweeds from which the alginic acid and the salt were removed, followed by reaction for 24 hours. The sulfuric acid group content was then measured and the composition sugar composition was analyzed. Specific sulfuric acid group content measurement and determination of the content of fucose in the sugar composition using the same method as used in Example <1-3>, various pH (
50℃에서 수행된 HCX-1, HCX-2, HCX-3, HCX-4, HCN-1 및 HCN-2의 분획의 황산기 함량 및 푸코스 함량을 도 3, 도 4 및 표 3에 각각 나타내었다. 도 4 및 표 3의 경우 알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물의 pH는 5.0인 결과이다. 도 3 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 황산기 함량은 HCX-3이 가장 높고 HCX-4가 그 뒤를 이었으며, 기질의 pH가 6.0일 때 가장 높고 pH 5.0일 때 다음으로 높았다. 또한, 도 4 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 푸코스 함량은 HCX-4가 가장 높고 HCX-3이 뒤를 이었다. 한편, 온도 조건은 50℃가 바람직하였으나 30℃와 큰 차이를 보이지 않았다. Sulfuric acid group content and fucose content of the fractions of HCX-1, HCX-2, HCX-3, HCX-4, HCN-1 and HCN-2 performed at 50 ° C are shown in FIGS. 3, 4 and 3, respectively. . In the case of Figure 4 and Table 3, the pH of the seaweed seaweed degradation products from which alginic acid and salts were removed was 5.0. As shown in FIG. 3 and Table 3, the sulfuric acid group content was the highest in HCX-3, followed by HCX-4, the highest when the pH of the substrate was 6.0, and the next highest when the pH was 5.0. 4 and Table 3, the fucose content was the highest in HCX-4, followed by HCX-3. On the other hand, the temperature condition is preferably 50 ℃, but did not show a significant difference with 30 ℃.
상기 결과로부터, 본 발명의 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206(KACC 93015)으로부터 분리된 효소액 중 HCX-3 및 HCX-4의 푸코이단 생성 능력이 우수함을 알 수 있었다. From the above results, the hippocrea jacina of the present invention ( hypocrea It was found that HCX-3 and HCX-4 were excellent in the ability to produce fucoidan in the enzyme solution isolated from jacorina B2206 (KACC 93015).
<2-4> 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206(KACC 93015)의 분획물과 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 분획물의 혼합액의 푸코이단 생성능의 확인<2-4> Hypocreaa jacina ( hypocrea) jacorina ) fraction of B2206 (KACC 93015) and Caulobacter sp.) Confirmation of fucoidan formation ability of the mixture of fractions of B2203
상기 실시예 <2-1>에서 얻은 각 효소액 분획대신 상기 실시예 <2-1>에서 얻은 각 효소액 분획 중 HCX-3과 상기 실시예 <2-2>에서 얻은 효소액 분획 중 CFN-2를 3:1로 혼합한 혼합액을 사용하고, 황산기 함량 측정을 pH 5, pH 6, pH 7 및 pH 8에서 수행한 것 외에는 상기 실시예 <2-3>과 동일하게 하여 푸코이단 생성능을 확인하였다.Instead of the respective enzyme liquid fractions obtained in Example <2-1>, HCX-3 and CFN-2 in the enzyme liquid fractions obtained in Example <2-2> were obtained by replacing 3 with each enzyme liquid fraction obtained in Example <2-1>. Using a mixed solution of 1: 1, and the sulfuric acid group content measurement was carried out in the same manner as in Example <2-3> except that the measurement of pH 5, pH 6, pH 7 and pH 8 to confirm the fucoidan production ability.
그 결과, pH 6에서 가장 다량의 푸코이단이 생산됨을 알 수 있었다(도 5 참조).As a result, it was found that the largest amount of fucoidan was produced at pH 6 (see FIG. 5).
<2-5> 히포크레아 자코리나(hypocrea jacorina) B2206(KACC 93015)의 분획물과 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 분획물의 혼합액의 농도에 따른 푸코이단 생성량의 측정<2-5> Hippocrea jacina ( hypocrea) jacorina ) fraction of B2206 (KACC 93015) and Caulobacter sp.) Determination of fucoidan production according to the concentration of the mixed solution of the fraction of B2203
상기 <1-2>에서 제조한 미역귀 해조류분해물(고형분 10Brix)에 대해서 상기 실시예 <2-1>에서 얻은 각 효소액 분획 중 HCX-3과 상기 실시예 <2-2>에서 얻은 효소액 분획 중 CFN-2를 3:1로 혼합한 혼합액을 농도를 달리하여(전체 해조류분해물 부피의 0.1부피%, 0.3부피%, 0.5부피%, 0.7부피%, 0.9부피%, 1.0부피%) 첨가하고, pH 6.0, 50℃에서 12시간 분해 후 황산기 함량을 실시예 <1-3>에서와 같이 측정하였다(도 6 참조)HCX-3 in the enzyme solution fractions obtained in Example <2-1> and CFN in the enzyme solution fractions obtained in Example <2-2> for the seaweed-derived seaweed decomposition product (solid content 10Brix) prepared in <1-2>. -2 3: 1 mixture was added at different concentrations (0.1%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.9%, 1.0% by volume), pH 6.0 After 12 hours decomposition at 50 ° C., the sulfuric acid group content was measured as in Example <1-3> (see FIG. 6).
그 결과, 상기 혼합액의 첨가량이 증가함에 따라 황산기의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 그러나, 혼합액이 0.7%(v/v) 이상인 첨가된 경우에는 첨가랑이 증가하더라도 황산기의 함량이 거의 증가하지는 않았다. 푸코스의 경우 혼합액의 첨가량이 증가함에 따라 푸코스의 함량이 증가되었으나 0.5%(v/v)를 넘는 경우 뚜렷한 증가를 보이지 않았다(결과 미도시)As a result, it was found that the amount of sulfuric acid group increased as the amount of the mixed solution increased. However, in the case where the mixed solution was added at 0.7% (v / v) or more, the content of sulfuric acid group was hardly increased even if the addition amount was increased. In the case of fucose, the amount of fucose increased as the amount of the mixed liquor increased. However, the fucose content did not show a significant increase over 0.5% (v / v).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 히포크레아 속(hypocrea sp.) 미생물은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는데 매우 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 미생물을 이용하는 경우 종래 산 분해 추출법에 비해 안전성의 향상, 생산 비용의 감소 및 생산 수율의 향상을 가져올 수 있으므로, 식품, 화장품 및 약품 분야에서 주목받는 푸코이단을 대량생산할 수 있는 장점이 있다. As discussed above, the hypocreatic genus ( hypocrea) of the present invention sp .) Microorganisms can be used very effectively to produce fucoidan from seaweeds. In the case of using the microorganism of the present invention, since it can lead to an improvement in safety, a reduction in production cost, and an improvement in production yield, compared to the conventional acid decomposition extraction method, there is an advantage of mass production of fucoidan, which is attracting attention in the food, cosmetic, and pharmaceutical fields.
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