KR102458031B1 - Composition and method for producing ginsenoside compound k using enzyme liquid of aspergillus niger - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다. The present invention is Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) Ginsenoside compound containing an enzyme solution cultured in an expression medium containing carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) or ginseng powder (ginseng powder) ginsenoside compound K production composition and method is about

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Figure R1020200037986

Description

아스퍼질러스 나이거 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법{COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING GINSENOSIDE COMPOUND K USING ENZYME LIQUID OF ASPERGILLUS NIGER} Composition and method for preparing ginsenoside compound K using Aspergillus niger enzyme solution

본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition and method for preparing a ginsenoside compound K using Aspergillus niger enzyme solution.

인삼은 전통적으로 한방약에서 강심제나 이뇨제로 사용되어왔고, 그 중 인삼 내에 존재하는 사포닌을 일컫는 진세노사이드는 인삼의 여러 가지 유효성분 중에서 약리 작용을 하는 물질로 알려져 있다. Ginseng has been traditionally used as a cardiac agent or a diuretic in oriental medicine, and among them, ginsenoside, which refers to saponin present in ginseng, is known as a substance with pharmacological action among various active ingredients of ginseng.

그 중 진세노사이드 컴파운드 케이는 인삼 내에 다량으로 존재하는 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd로부터 글루코스, 아라비노스와 같은 당이 가수분해되어 체내에서 훨씬 흡수가 잘되는 형태가 되고, 항암, 항염증, 항알러지, 면역증강, UV에 의한 피부손상 회복 및 피부 노화 방지, 주름억제 등의 많은 효능에 대한 실험이 여러 논문으로 나타나있다. Among them, ginsenoside compound K contains sugars such as glucose and arabinose from ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd, which are protophanaxadiol-based saponins present in large amounts in ginseng. It is decomposed into a form that is much better absorbed in the body, and experiments on many effects such as anti-cancer, anti-inflammatory, anti-allergy, immune enhancement, UV-induced skin damage recovery, skin aging prevention, and wrinkle suppression have been reported in several papers.

현재까지 진세노사이드 컴파운드 케이의 고효율 생산기술로는 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 재조합 유전자를 대장균에 삽입시켜 얻은 효소로 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산할 수 있는 생산 방법이 알려져 있으나, 유전자 조작으로 얻은 효소로 반응하여 생산하는 방법이기 때문에 식품에 이용하기에는 한계가 있고, 장내 세균과 같은 유산균을 이용하여 여러 진세노사이드가 함유되어 있는 복합체를 기질로 하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하는 경우 전환율이 낮은 문제점이 있기에, 식품에 이용할 수 있고 유산균보다 높은 수율로 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하는 곰팡이 효소를 사용하였다. Until now, as a high-efficiency production technology of ginsenoside compound K, a production method capable of producing high-efficiency ginsenoside compound K with an enzyme obtained by inserting a recombinant gene derived from Caldicellulosiruptor bescii into E. coli is known. , because it is a method that reacts with an enzyme obtained by genetic manipulation, it has limitations in its use in food. Since there is a problem of low conversion rate, a fungal enzyme that can be used in food and produces ginsenoside compound K with a higher yield than lactic acid bacteria was used.

기존 곰팡이 효소를 이용한 방법으로는 트리코데르마 또는 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제를 이용하여 프로토파낙사다이올(protopanaxadiol, PPD)계 사포닌이 주로 함유된 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획과 인삼 추출엑스를 기질로 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하는 방법들이 보고 되어왔으나, 수율에 있어 한계가 있고 특히 기존 보고에 따르면 진세노사이드 Rb2를 기질로 하였을 때 생성되는 컴파운드 와이(compound Y)에서 오랜시간 반응을 진행하여야 컴파운드 케이로 전환할 수 있다는 단점이 있었다. As a method using existing fungal enzymes, protopanaxadiol (PPD)-based saponins are produced using cellulase isolated from Trichoderma or Penicillium or beta-galactosidase isolated from Aspergillus. Methods have been reported to prepare ginsenoside compound K using the saponin fraction isolated from ginseng root, which is mainly contained, and ginseng extract as a substrate, but there is a limitation in yield. There was a disadvantage in that it could be converted to compound K only after a long time of reaction in compound Y (compound Y) generated when it was used.

본 발명은 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조하기 위한 것으로, (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법 등을 제공하고자 한다. The present invention is for producing ginsenoside compound K with high productivity and yield, (a) Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) As a carbon source, cultured in an expression medium containing carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) to obtain an enzyme solution; And (b) to provide a method for producing a ginsenoside compound K, including the step of treating the obtained enzyme solution to a substrate.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다. The present invention is (a) Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) as a carbon source, culturing in an expression medium containing carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) or ginseng powder (ginseng powder) to obtain an enzyme solution; And (b) provides a method for producing a ginsenoside compound K comprising the step of treating the obtained enzyme solution to a substrate.

상기 (a) 단계에서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)일 수 있다. The Aspergillus niger strain in step (a) may be an Aspergillus niger strain (KACC 46495).

상기 (a) 단계에서 발현 배지 내 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)의 농도는 3 g/L 내지 20 g/L일 수 있다. As a carbon source in the expression medium in step (a), the concentration of carboxymethyl cellulose or ginseng powder may be 3 g/L to 20 g/L.

상기 (a) 단계에서 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함할 수 있다. In step (a), the expression medium may include corn steep solid as a nitrogen source.

상기 (a) 단계에서 발현 배지는 KH2PO4, MgSO4 .7H2O, CaCl2, FeSO4 .7H2O, ZnSO4 .7H2O, MnSO4 . H2O 및 CoCl2 .6H2O 를 추가로 포함할 수 있다. The expression medium in step (a) is KH 2 PO 4 , MgSO 4 . 7H 2 O, CaCl 2 , FeSO 4 . 7H 2 O, ZnSO 4 . 7H 2 O, MnSO 4 . H 2 O and CoCl 2 . 6H 2 O may be further included.

상기 (a) 단계에서 효소액은 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다. The enzyme solution in step (a) may be an extracellular enzyme solution of the Aspergillus niger strain.

상기 (b) 단계에서 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌; 또는 인삼 추출물을 포함할 수 있다. In step (b), the substrate is one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd; Or it may include a ginseng extract.

상기 (b) 단계에서 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml일 수 있다. The concentration of protopanaxadiol-based saponin in the substrate in step (b) may be 0.1 mg/ml to 10 mg/ml.

상기 (b) 단계에서 처리는 pH 4.0~6.5 및 40~65℃ 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. The treatment in step (b) may be performed for 2 hours to 24 hours at pH 4.0-6.5 and 40-65°C conditions.

본 발명의 일 구현예로, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다. In one embodiment of the present invention, Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) Ginseno containing an enzyme solution cultured in an expression medium containing a strain as a carbon source, carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) or ginseng powder (ginseng powder) A composition for preparing side compound K is provided.

상기 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함할 수 있다. The expression medium may include corn steep solid as a nitrogen source.

본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는바, 비용이 저렴한 탄소원을 이용하되, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다. The method for producing ginsenoside compound K according to the present invention is (a) Aspergillus niger strain as a carbon source, in an expression medium containing carboxymethyl cellulose or ginseng powder culturing to obtain an enzyme solution; and (b) treating the obtained enzyme solution on a substrate, using a low-cost carbon source, but through optimal hydrolysis of protopanaxadiol-based saponins in the substrate, ginsenoside compound K is produced with high productivity and It can be prepared in yield.

특히, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다. In particular, Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) The strain is a safe mold available for food, the ginsenoside compound K prepared in the same way as above has the advantage that can be usefully utilized for food.

도 1(a)~(c)는 발현 배지의 탄소원을 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, (a) 진세노사이드 Rb1, (b) 진세노사이드 Rb2 및 (c) 진세노사이드 Rc 에 각각 처리한 경우, 그 상대적인 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 발현 배지의 탄소원 농도를 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, 진세노사이드 Rb2에 처리한 경우, 그 상대적인 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 3(a) 및 (b)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 (a) 온도, (b) pH의 변화에 따른 상대적인 활성도 및 안정성을 나타낸 그래프로서, 이때, 상대적인 활성도는 진세노사이드 Rb1이 감소되는 정도에 따라 나타내었다.
도 4(a)~(c)는 최적화된 발현 배지를 통해 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, 기질로서, (a) 진세노사이드 Rb1, (b) 진세노사이드 Rb2 및 (c) 진세노사이드 Rc 에 각각 처리한 경우, 그 전환 정도를 시간별로 나타낸 그래프이다.
도 5는 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2 및 진세노사이드 Rc가 어떠한 중간 물질을 거쳐 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환되는지를 보여주는 그림이다.
도 6(a)는 최적화된 발현 배지를 통해 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 혼합물을 포함하는 고려 인삼 뿌리 추출물에 처리한 경우, 그 전환 정도를 시간별로 나타낸 그래프이고, 도 6(b)는 반응 전후의 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC) 측정 결과를 나타낸 그림이다. 1 (a) to (c) show that the extracellular enzyme solution is cultured by varying the carbon source of the expression medium, and then as a substrate, (a) ginsenoside Rb1, (b) ginsenoside Rb2 and (c) ginsenoside It is a graph showing the relative activity when each side Rc was treated.
Figure 2 is a graph showing the relative activity when the extracellular enzyme solution is cultured by varying the carbon source concentration of the expression medium, and then treated with ginsenoside Rb2 as a substrate.
3 (a) and (b) are graphs showing the relative activity and stability according to changes in (a) temperature, (b) pH of the extracellular enzyme solution cultured through the optimized expression medium, in which case the relative activity is The senoside Rb1 was shown according to the degree of decrease.
4(a) to (c) show that the extracellular enzyme solution is cultured through an optimized expression medium, and then as a substrate, as a substrate, (a) ginsenoside Rb1, (b) ginsenoside Rb2 and (c) gene It is a graph showing the degree of conversion by time when each treatment is performed on the senoside Rc.
5 is a diagram showing how ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2 and ginsenoside Rc are converted into ginsenoside compound K through which intermediate materials.
Figure 6 (a) shows the degree of conversion by time when the extracellular enzyme solution is cultured through an optimized expression medium and then treated with a Korean ginseng root extract containing a protopanaxadiol-based saponin mixture as a substrate, as a substrate. , and FIG. 6(b) is a diagram showing the measurement results of high performance liquid chromatography (HPLC) before and after the reaction.

본 발명자들은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함에 있어서, 이의 생산성 및 수율을 높이기 위한 방법을 연구하던 중, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액으로, 탄소원이 최적화된 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 배양하고, 이의 세포 외 효소액의 우수한 활성도를 확인한 다음, 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 기질에 처리하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다. The present inventors were studying a method for increasing the productivity and yield thereof in preparing a ginsenoside compound K using an Aspergillus niger enzyme solution, Aspergillus niger As an enzyme solution, Culturing the Aspergillus niger strain through an expression medium optimized for carbon source, confirming the excellent activity of its extracellular enzyme solution, and then treating it with a substrate containing protopanaxadiol-based saponin to compound a ginsenoside compound By making a K, the present invention was completed.

본 명세서 내 "진세노사이드 컴파운드 케이(C-K)"라 함은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미하는 것으로, 종래부터 다양한 생리 활성이 보고된 바 있다:In the present specification, "ginsenoside compound K (C-K)" refers to a compound represented by the following Chemical Formula 1, and various physiological activities have been previously reported:

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112020032740596-pat00001
Figure 112020032740596-pat00001

진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법Manufacturing method of ginsenoside compound K

본 발명은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder) 를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다. The present invention (a) Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) as a carbon source, carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) or culturing in an expression medium containing ginseng powder (ginseng powder) to obtain an enzyme solution; And (b) provides a method for producing a ginsenoside compound K comprising the step of treating the obtained enzyme solution to a substrate.

먼저, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계[(a) 단계]를 포함한다. First, the method for producing a ginsenoside compound K according to the present invention is cultured in an expression medium containing Aspergillus niger strain as a carbon source, carboxymethyl cellulose or ginseng powder to obtain an enzyme solution [step (a)].

상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 식품에 이용가능한 상업용 곰팡이로서, 자낭균류 누룩곰팡이속에 속한다. 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명자들은 농촌진흥청 국립농원과학원(KACC)으로부터 약 50종의 식품에 이용가능한 균주인 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 투빈젠시스(Aspergillus tubingensis), 페니실리움 크라이소제눔(Penicillium chrysogenum)등을 분양받았다. 이러한 곰팡이 균주를 배양하여 얻은 세포 외 효소 반응물과 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 반응시킨 결과, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KACC 46495 균주가 가장 활성이 우수한 균주로 나타나 위 균주를 선택하였다. The Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) strain is a commercial mold available for food, belonging to the genus Ascomycetes yeast mold. The Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) strain is preferably an Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) strain (KACC 46495), but is not limited thereto. Specifically, the present inventors from the National Academy of Agricultural Sciences (KACC), Rural Development Administration, Aspergillus oryzae, which are strains available for about 50 foods, Aspergillus oryzae , Aspergillus niger ( Aspergillus niger ), Aspergillus tubingen Sis ( Aspergillus tubingensis ), Penicillium chrysogenum ( Penicillium chrysogenum ), etc. were sold. As a result of reacting the extracellular enzyme reactant obtained by culturing these fungal strains with ginsenoside Rb1, Rb2 or Rc, Aspergillus niger KACC 46495 strain appeared as the most active strain, so the above strain was selected .

상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주로부터 배양액을 수득하기 위해서는, 상기 균주를 평판배양하여 포자를 수득하는 단계; 상기 포자를 성장 배지에서 배양하여 균사를 활성화시키는 단계; 및 상기 성장 배지를 제거한 후, 상기 활성화된 균사를 발현 배지로 옮겨 배양하여 배양액을 수득하는 단계를 포함한다. In order to obtain a culture solution from the Aspergillus niger strain, plate-culturing the strain to obtain spores; activating the mycelium by culturing the spores in a growth medium; And after removing the growth medium, transferring the activated mycelium to an expression medium and culturing to obtain a culture solution.

추가적으로, 상기 배양액으로부터 세포 외 효소액을 수득하기 위해서는, 상기 배양액을 여과하는 단계; 상기 여과액을 회수하여 황산암모늄을 첨가 및 혼합하여 효소 침전액을 수득하는 단계; 상기 효소 침전액을 투석막에 넣어 투석하는 단계; 및 센트리콘을 이용하여 남은 염을 추가 제거 및 농축하는 단계를 포함한다. Additionally, in order to obtain an extracellular enzyme solution from the culture solution, filtering the culture solution; recovering the filtrate, adding and mixing ammonium sulfate to obtain an enzyme precipitate; dialyzing the enzyme precipitate solution into a dialysis membrane; and further removing and concentrating the remaining salt using a centricon.

즉, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액은 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 배양함으로써 수득될 수 있는데, 본 발명에서는 상기 발현 배지를 최적화시킨 것을 특징으로 한다. That is, the Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) enzyme solution can be obtained by culturing the Aspergillus niger strain through an expression medium, and the present invention is characterized in that the expression medium is optimized.

상기 발현 배지는 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 것을 특징으로 하고, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 포함하는 것이 바람직한바, 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 효과적으로 전환할 수 있다. The expression medium is characterized in that it contains carboxymethyl cellulose or ginseng powder as a carbon source, and preferably contains carboxymethyl cellulose, ginsenoside Rb1, Rb2 or Rc can be effectively converted into ginsenoside compound K.

이때, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)는 셀룰로스의 수산기를 카복시메틸화시킨 것으로, 화학적으로 대단히 안정하고 특히 인체에 무해, 무독하여 식품산업 및 화장품산업에 등에 이용하기에 적합한 합성물로써 여러 산업분야에서 다양하고 폭넓게 사용되고 있다. At this time, carboxymethyl cellulose is a carboxymethylated hydroxyl group of cellulose. It is chemically very stable and especially harmless and non-toxic to the human body, so it is a compound suitable for use in the food industry and cosmetics industry. It is widely used.

또한, 인삼 파우더(ginseng powder)는 Panax ginseng 유래인 것으로, HP-20로 정제된 Panax ginseng 추출물 파우더일 수 있고, 상기 인삼 파우더(ginseng powder)는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 포함하는 프로토파낙사다이올계 사포닌을 총 120 mg/g 내지 140 mg/g의 농도로, 진세노사이드 Rg1, Rh1, Re, Rg2, Rf1 및 F1을 포함하는 프로토파낙사트리올계 사포닌을 총 40 mg/g 내지 60 mg/g의 농도로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용한 Panax ginseng(4년근) 유래 인삼 파우더(ginseng powder)의 세부 함량 및 농도는 하기 표 1과 같다. In addition, ginseng powder is derived from Panax ginseng, and may be Panax ginseng extract powder purified with HP-20, and the ginseng powder includes ginsenosides Rb1, Rb2, Rc and Rd. Protopanaxadiol-based saponins in a total concentration of 120 mg/g to 140 mg/g, and protopanaxatriol-based saponins including ginsenoside Rg1, Rh1, Re, Rg2, Rf1 and F1 total 40 mg/g to 60 mg/g may be included. Specifically, the detailed contents and concentrations of Panax ginseng (4-year-old root) derived ginseng powder used in the present invention are shown in Table 1 below.

진세노사이드Ginsenoside 인삼 파우더(ginseng powder)ginseng powder 함량((w/w)%)Content ((w/w)%) 농도(mg/g)Concentration (mg/g) 프로토파낙사다이올계 사포닌Protopanaxadiol-based saponins Rb1Rb1 21.421.4 38.038.0 Rb2Rb2 18.818.8 33.433.4 RcRc 17.517.5 31.131.1 RdRd 14.314.3 25.425.4 프로토파낙사트리올계 사포닌Protopanaxatriol-based saponins Rg1Rg1 2.62.6 4.64.6 Rh1Rh1 0.00.0 0.00.0 ReRe 9.79.7 17.317.3 Rg2Rg2 1.31.3 2.32.3 Rf1Rf1 0.60.6 1.21.2 F1F1 13.613.6 24.224.2 총gun 100.0100.0 177.5177.5

상기 발현 배지 내 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)의 농도는 3 g/L 내지 20 g/L일 수 있고, 10 g/L 내지 15 g/L인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of carboxymethyl cellulose or ginseng powder in the expression medium may be 3 g/L to 20 g/L, preferably 10 g/L to 15 g/L, but limited thereto doesn't happen

반면, 탄소원으로서, 셀룰로오스 (cellulose), 락토오스(lactose, 젖당) 또는 감귤류에서 추출한 펙틴(pectin from citrus)를 사용한 경우에는 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 효과적으로 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환하지 못한다.On the other hand, when cellulose, lactose, or pectin from citrus is used as a carbon source, ginsenoside Rb1, Rb2 or Rc cannot be effectively converted into ginsenoside compound K.

또한, 상기 발현 배지는 질소원으로는 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 효과적으로 전환할 수 있다. 이때, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)은 옥수수 전분을 제좌는 과정 중 침지 공정에서 배출되는 부산물로서, 비용이 저렴한 이점을 가질 뿐 만 아니라, 가용성 단백, 젖산, 당류, 비타민, 무기물 등을 함유하고 있어 영양가가 아주 높아 사료에 첨가하거나 미생물 배지의 질소원으로 적합하다.In addition, the expression medium preferably includes corn steep solid as a nitrogen source, but is not limited thereto. Likewise, ginsenoside Rb1, Rb2 or Rc can be effectively converted into ginsenoside compound K. At this time, the corn steep solid is a by-product discharged from the soaking process during the process of staking corn starch, and not only has the advantage of low cost, but also contains soluble protein, lactic acid, sugars, vitamins, minerals, etc. Because of its high nutritional value, it is suitable for addition to feed or as a nitrogen source for microbial media.

상기 발현 배지 내 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)의 농도는 5 g/L 내지 20 g/L일 수 있고, 10 g/L 내지 15 g/L인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of corn steep solid in the expression medium may be 5 g/L to 20 g/L, preferably 10 g/L to 15 g/L, but is not limited thereto.

그밖에, 상기 발현 배지는 KH2PO4, MgSO47H2O, CaCl2, FeSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O, MnSO4·H2O 및 CoCl2·6H2O 를 추가로 포함할 수 있는데, 구체적으로, KH2PO4 1~3 g/L, MgSO47H2O 0.1~1.0 g/L, CaCl2 0.1~1.0 g/L, FeSO4.7H2O 1.0~10.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 0.5~5.0 mg/L, MnSO4·H2O 0.5~5.0 mg/L 및 CoCl2·6H2O 1.0~10.0 mg/L 를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the expression medium is KH 2 PO 4 , MgSO 4 7H 2 O, CaCl 2 , FeSO 4 ·7H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O, MnSO 4 ·H 2 O and CoCl 2 ·6H 2 O In addition It may include, specifically, KH 2 PO 4 1-3 g/L, MgSO 4 7H 2 O 0.1-1.0 g/L, CaCl 2 0.1-1.0 g/L, FeSO 4.7H 2 O 1.0-10.0 mg /L, ZnSO 4.7H 2 O 0.5 to 5.0 mg/L, MnSO 4· H 2 O 0.5 to 5.0 mg/L, and CoCl 2 ·6H 2 O 1.0 to 10.0 mg/L may be further included.

한편, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액은 전술한 바와 같이, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다. On the other hand, the Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) As described above, the enzyme solution may be an extracellular enzyme solution of the Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) strain.

다음으로, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.Next, the method for producing a ginsenoside compound K according to the present invention includes the step [(b) step] of treating the obtained enzyme solution to a substrate.

상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The substrate preferably includes one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd, but is not limited thereto.

또한, 상기 기질은 고려 인삼 추출물일 수 있고, 상기 고려 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. In addition, the substrate may be a Korean ginseng extract, and the Korean ginseng extract may be a solvent-extracted product of the root, fruit, stem or leaf of ginseng. In this case, the solvent extraction may be performed using water, a C1 to C2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, and the lower alcohol may be ethanol or methanol.

상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml일 수 있고, 0.4 mg/ml 내지 7.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of protopanaxadiol-based saponin in the substrate may be 0.1 mg/ml to 10 mg/ml, preferably 0.4 mg/ml to 7.0 mg/ml, but is not limited thereto.

또한, 상기 처리는 pH 4.0~6.5 및 40~65℃ 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 4.5~5.0인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, pH가 5.0을 초과하는 경우, 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 양상을 보일 수 있다. 따라서, 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 55~60℃인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 온도가 50℃인 경우, 상대적 활성이 약 60% 이하로 감소할 수 있고, 온도가 65℃인 경우, 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 양상을 보일 수 있다. 즉, 이러한 pH 및 온도 조건을 유지함으로써, 세포 외 효소액의 활성도가 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지할 수 있다. 따라서, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 최종적으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.In addition, the treatment may be carried out for 2 hours to 24 hours at pH 4.0 ~ 6.5 and 40 ~ 65 ℃ conditions. Specifically, the pH condition for the treatment is preferably pH 4.5 to 5.0, but is not limited thereto. At this time, when the pH exceeds 5.0, the stability of the extracellular enzyme solution may be significantly reduced. Therefore, in order to maintain such a pH condition, a buffer solution may be used as a reaction solvent. In addition, the temperature condition for the treatment is preferably 55 ~ 60 ℃, but is not limited thereto. At this time, when the temperature is 50 ℃, the relative activity may decrease to about 60% or less, and when the temperature is 65 ℃, the stability of the extracellular enzyme solution may be significantly reduced. That is, by maintaining these pH and temperature conditions, the activity of the extracellular enzyme solution is high, and the stability of the extracellular enzyme solution can be maintained even for a long time reaction. Therefore, it is possible to finally produce ginsenoside compound K with high productivity and yield through optimal hydrolysis of protopanaxadiol-based saponins in the substrate.

한편, 상기 처리를 통한 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K) 외에, 부산물로서 진세노사이드 컴파운드 와이(compound Y) 또는 진세노사이드 에프투(F2)를 제조할 수 있다. On the other hand, when through the above treatment, in addition to ginsenoside compound K (compound K), as a by-product, ginsenoside compound Y (compound Y) or ginsenoside F2 (F2) may be prepared.

진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물Composition for preparing ginsenoside compound K

본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다.The present invention is Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) as a carbon source, carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) or ginseng powder (ginseng powder) ginsenoside compound K production composition comprising an enzyme solution cultured in an expression medium containing provides

본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는데, 상기 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함할 수 있다.The composition for preparing ginsenoside compound K according to the present invention uses an Aspergillus niger strain as a carbon source, and an enzyme solution cultured in an expression medium containing carboxymethyl cellulose or ginseng powder. Including, the expression medium may include a corn steep solid as a nitrogen source.

상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주, 상기 발현 배지 및 상기 효소액에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다. The Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) strain, the expression medium and the enzyme solution have been described above, and thus a redundant description will be omitted.

상기 조성물 내 효소액의 농도는 0.5 mg/ml 내지 10.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of the enzyme solution in the composition is preferably 0.5 mg/ml to 10.0 mg/ml, but is not limited thereto.

또한, 상기 조성물은 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다. In addition, the composition may be for treatment on a substrate.

상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The substrate preferably includes one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd, but is not limited thereto.

또한, 상기 기질은 고려 인삼 추출물일 수 있고, 상기 고려 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. In addition, the substrate may be a Korean ginseng extract, and the Korean ginseng extract may be a solvent-extracted product of the root, fruit, stem or leaf of ginseng. In this case, the solvent extraction may be performed using water, a C1 to C2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, and the lower alcohol may be ethanol or methanol.

상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml일 수 있고, 0.4 mg/ml 내지 7.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The concentration of protopanaxadiol-based saponin in the substrate may be 0.1 mg/ml to 10 mg/ml, preferably 0.4 mg/ml to 7.0 mg/ml, but is not limited thereto.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는바, 비용이 저렴한 탄소원을 이용하되, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다. As described above, the manufacturing method of the ginsenoside compound K according to the present invention is (a) Aspergillus niger strain as a carbon source, carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) or ginseng powder (ginseng powder) Obtaining an enzyme solution by culturing in an expression medium containing; and (b) treating the obtained enzyme solution on a substrate, using a low-cost carbon source, but through optimal hydrolysis of protopanaxadiol-based saponins in the substrate, ginsenoside compound K is produced with high productivity and It can be prepared in yield.

특히, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다. In particular, Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) The strain is a safe mold available for food, the ginsenoside compound K prepared in the same way as above has the advantage that can be usefully utilized for food.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

실시예 1: 발현 배지 내 탄소원 및 이의 농도에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이로의 전환 비교Example 1: Comparison of conversion to ginsenoside compound K according to the carbon source and its concentration in the expression medium

본 발명에서는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함에 있어서, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 발현 배지를 최적화하였다. In the present invention, Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) In preparing a ginsenoside compound K using an enzyme solution, Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) The expression medium of the strain was optimized.

구체적으로, 농촌진흥청 국립농원과학원(KACC)으로부터 분양받은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)를 감자한천배지(Potato dextrose agar medium, PDA)에서 26℃에서 7일간 평판배양하였다. 평판배양된 접시(plate)내의 포자를 거즈에 걸러 회수하고 4 ㎖의 액상 감자배지(Potato dextrose medium, PDB)에 포자 농도가 1.0 X 106 spores/mL 농도로 희석한 포자액을 1 ㎖ 접종하고, 26℃ 및 150 rpm으로 24시간 동안 성장배양하였다. 성장배양으로 만들어진 성장배양액 내의 균사를 탄소원 및 질소원이 제외된 발현 배지로 세척하여 균사만 100㎖의 발현 배지에 옮긴 후, 26℃ 및 150 rpm으로 6일간 배양하였다. Specifically, the Aspergillus niger strain (KACC 46495) received from the National Academy of Agricultural Sciences (KACC), Rural Development Administration, was plate-cultured for 7 days at 26° C. in Potato dextrose agar medium (PDA). The spores in the plate cultured plate were collected by filtering with gauze, and 1 ml of the spore solution diluted to a spore concentration of 1.0 X 10 6 spores/mL was inoculated into 4 ml of potato dextrose medium (PDB). , 26 ℃ and 150 rpm growth culture for 24 hours. After washing the mycelium in the growth medium made of the growth culture with an expression medium excluding carbon and nitrogen sources, only the mycelium was transferred to 100 ml of expression medium, and then cultured at 26° C. and 150 rpm for 6 days.

이때, 발현 배지의 조성은 탄소원 20 g/L, 질소원 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO47H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4.7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다. 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose)(시그마 알드리치 사), 셀룰로오스 (cellulose)(대정화금㈜), Panax ginseng(4년근) 유래 인삼 파우더(ginseng powder)(중국 에이스셈 바이올로지 사), 락토오스(lactose)(대정화금㈜), 감귤류에서 추출한 펙틴(pectin from citrus)(대정화금㈜) 및 밀기울(wheat bran)(심즈펫)로 총 6가지를 사용하였고, 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)(시그마 알드리치 사)를 사용하였다. At this time, the composition of the expression medium is carbon source 20 g/L, nitrogen source 10 g/L, KH 2 PO 4 2 g/L, MgSO 4 7H 2 O 0.3 g/L, CaCl 2 0.3 g/L, FeSO 4.7H 2 O 5.0 mg/L, ZnSO 4.7H 2 O 1.4 mg/L, MnSO 4· H 2 O 1.3 mg/L, and CoCl 2 ·6H 2 O 3.7 mg/L. As a carbon source, carboxymethyl cellulose (Sigma Aldrich Co., Ltd.), cellulose (Daejeong Chemical Co., Ltd.), Panax ginseng (4-year-old) derived ginseng powder (Aceem Biology, China), lactose A total of 6 types were used as (lactose) (Daejeong Hwageum Co., Ltd.), pectin from citrus (Daejeong Hwa Geum Co., Ltd.) and wheat bran (Sims Pet) extracted from citrus fruits. (corn steep solid) (Sigma Aldrich) was used.

그 다음, 배양액을 와트만 여과지를 사용하여 여과한 후, 여과액을 회수하여 황산암모늄을 30 ~ 80% 포화가 되도록 첨가하고 24시간 동안 혼합하여 효소 침전액을 수득하였다. 효소 침전액 내의 황산암모늄을 제거하기 위해 셀룰로오스 투석막을 이용하여 200 mM의 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액으로 24 시간 동안 투석하고, 센트리콘을 이용하여 남은 황산암모늄 추가 제거 및 농축을 진행하여 세포 외 효소액을 수득하였다.Then, the culture solution was filtered using Whatman filter paper, the filtrate was recovered, ammonium sulfate was added to 30 to 80% saturation, and the mixture was mixed for 24 hours to obtain an enzyme precipitate solution. To remove ammonium sulfate in the enzyme precipitation solution, dialysis was performed with 200 mM Mcilvaine buffer solution for 24 hours using a cellulose dialysis membrane. was obtained.

그 다음, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 기질로서, 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc 0.4 mg/ml가 각각 함유된 완충용액을 50℃ 및 pH 5.5에서 6 시간 동안 반응시켜, 세포 외 효소액의 활성도를 측정하였다. Then, 1.0 mg/ml of the extracellular enzyme solution and a buffer solution containing 0.4 mg/ml of ginsenosides Rb1, Rb2, and Rc as substrates were reacted at 50° C. and pH 5.5 for 6 hours, and the activity of the extracellular enzyme solution was was measured.

그 결과, 도 1(a) 내지 도 1(c)에 나타난 바와 같이, 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder) (특히, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose))를 사용하면서, 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 사용한 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 높은 것으로 확인된다. 다만, 탄소원으로서, 셀룰로오스 (cellulose), 락토오스(lactose), 감귤류에서 추출한 펙틴(pectin from citrus) 및 밀기울(wheat bran)을 사용한 경우에는, 세포외 효소액의 활성도가 크게 저하되는 것으로 확인된다. As a result, as shown in Figures 1 (a) to 1 (c), as a carbon source, while using carboxymethyl cellulose or ginseng powder (particularly, carboxymethyl cellulose)) , it is confirmed that the activity of the extracellular enzyme solution is high when corn steep solid is used as the nitrogen source. However, when cellulose, lactose, pectin from citrus and wheat bran are used as carbon sources, it is confirmed that the activity of the extracellular enzyme solution is greatly reduced.

한편, 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 중 가장 전환이 잘 되지 않았던 진세노사이드 Rb2를 이용하여, 발현 배지 내 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)의 최적 농도를 확인하였다. On the other hand, as a substrate, using the ginsenoside Rb2, which was not converted well among the protopanaxadiol-based saponins, as a carbon source in the expression medium, the optimal concentration of carboxymethyl cellulose was confirmed.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 발현 배지 내 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)가 10 g/L 내지 15 g/L (특히, 10 g/L)인 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 크게 높은 것으로 확인된다. As a result, as shown in Figure 2, as a carbon source in the expression medium, when carboxymethyl cellulose is 10 g/L to 15 g/L (particularly, 10 g/L), the activity of the extracellular enzyme solution is found to be significantly higher.

따라서, 최적화된 발현 배지의 조성은 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 10 g/L, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid) 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO47H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4.7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다.Therefore, the composition of the optimized expression medium is a carbon source, carboxymethyl cellulose 10 g / L, corn steep solid 10 g / L, KH 2 PO 4 2 g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.3 g/L, CaCl 2 0.3 g/L, FeSO 4.7H 2 O 5.0 mg/L, ZnSO 4.7H 2 O 1.4 mg/L, MnSO 4 H 2 O 1.3 mg/L and CoCl 2 6H 2 O 3.7 mg/L.

실시예 2: 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른 활성도 및 안정성 확인Example 2: Confirmation of activity and stability according to temperature and pH change of extracellular enzyme solution

본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른 활성도 및 안정성을 확인하였다. In the present invention, the activity and stability according to the temperature and pH change of the extracellular enzyme solution cultured through the optimized expression medium was confirmed.

(1) 세포 외 효소액에 대한 온도 효과 확인(1) Confirmation of temperature effect on extracellular enzyme solution

세포 외 효소액에 대한 온도 효과를 확인하기 위해서, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액(pH 5.5)을 40℃ 내지 65℃의 범위에서 10분 동안 반응시켰다. 반응액의 경우, 부탄올과 1.0 mg/mL의 내부 표준 물질(internal standard)인 다이고신을 같이 첨가하여 반응을 종결시키고 부탄올 층을 모아 진공압으로 용매를 증발 한 뒤, 메탄올을 넣어주어 측정 시료를 준비하였다. 측정 시료의 경우 HPLC (High performance liquid chromatography; 고성능 액체 크로마토그래피)를 이용하여 203nm의 흡광도에서 측정하였고, 각 진세노사이드 표준 물질을 측정하여 구한 표준 곡선에 따른 정량법으로 전환 정도를 확인하였다. In order to confirm the effect of temperature on the extracellular enzyme solution, a buffer solution (pH 5.5) containing 1.0 mg/ml of extracellular enzyme solution and 0.4 mg/mL ginsenoside Rb1 was reacted in the range of 40°C to 65°C for 10 minutes. did it In the case of the reaction solution, butanol and 1.0 mg/mL of digosine, an internal standard, are added together to terminate the reaction, the butanol layers are collected, the solvent is evaporated under vacuum, and methanol is added to prepare the measurement sample. prepared. In the case of the measurement sample, the absorbance was measured at 203 nm using HPLC (High performance liquid chromatography), and the degree of conversion was confirmed by a quantitative method according to the standard curve obtained by measuring each ginsenoside standard material.

한편, 세포 외 효소액을 40℃ 내지 65℃의 범위에서 24시간 동안 방치한 후, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액(pH 5.5)을 55℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음, 이전에 언급한 것과 같은 방법으로 반응을 종결시키고 측정하여 세포 외 효소액의 온도에 따른 안정성(글리코시다아제 활성)를 확인하였다. On the other hand, after the extracellular enzyme solution was left in the range of 40°C to 65°C for 24 hours, the buffer solution (pH 5.5) containing the extracellular enzyme solution 1.0 mg/ml and 0.4 mg/mL ginsenoside Rb1 was added at 55°C. The reaction was carried out for 10 minutes. Then, the reaction was terminated and measured in the same manner as previously mentioned to confirm the stability (glycosidase activity) of the extracellular enzyme solution according to the temperature.

그 결과, 도 3(a)에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 활성도가 높은 온도는 55~65℃(특히, 55℃)인 것으로 확인되나, 세포 외 효소액의 안정성이 60℃를 초과하는 경우, 60℃ 이하인 경우에 비해, 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 문제점이 있는 것으로 확인된다. 따라서, 세포 외 효소액의 활성도가 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지하는 온도인 55~60℃가 최적 온도인 것으로 확인된다. As a result, as shown in Figure 3 (a), the high temperature of the extracellular enzyme solution is confirmed to be 55 ~ 65 ℃ (in particular, 55 ℃), but when the stability of the extracellular enzyme solution exceeds 60 ℃, It is confirmed that there is a problem in that the stability of the extracellular enzyme solution is greatly reduced compared to the case of 60° C. or less. Therefore, it is confirmed that the optimum temperature is 55 to 60° C., which is a temperature that maintains the stability of the extracellular enzyme solution even after a long reaction while the activity of the extracellular enzyme solution is high.

(2) 세포 외 효소액에 대한 pH 효과 확인(2) Confirmation of pH effect on extracellular enzyme solution

세포 외 효소액에 대한 pH 효과를 확인하기 위하여, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액을 55℃에서 pH 4.0 내지 6.5의 범위로 10분 동안 반응시킨 다음, 반응을 종결시키고 HPLC를 이용하여 203 nm의 흡광도에서 측정하였고, 세포 외 효소액의 활성도(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.In order to confirm the effect of pH on the extracellular enzyme solution, a buffer solution containing 1.0 mg/ml and 0.4 mg/mL ginsenoside Rb1 of the extracellular enzyme solution was reacted at 55° C. in a pH range of 4.0 to 6.5 for 10 minutes. , the reaction was terminated, and the absorbance was measured at 203 nm using HPLC, and the activity (glycosidase activity) of the extracellular enzyme solution was confirmed.

한편, 세포 외 효소액을 pH 4.0 내지 6.5의 범위로 24시간 동안 방치한 후, 센트리콘을 이용하여 pH를 5.0으로 바꾼 다음, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액(pH 5.0)을 55℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음, 반응을 종결시키고 HPLC를 이용하여 203 nm의 흡광도에서 측정하였고, 세포 외 효소액의 안정성(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.On the other hand, after leaving the extracellular enzyme solution in a pH range of 4.0 to 6.5 for 24 hours, the pH was changed to 5.0 using a centricon, and 1.0 mg/ml and 0.4 mg/mL ginsenoside Rb1 was contained in the extracellular enzyme solution. The buffer solution (pH 5.0) was reacted at 55° C. for 10 minutes. Then, the reaction was terminated and the absorbance was measured at 203 nm using HPLC, and the stability (glycosidase activity) of the extracellular enzyme solution was confirmed.

그 결과, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 활성도 및 안정성이 모두 높은 pH는 모두 4.5~5.0인 것으로 확인된다. pH가 5.0을 초과하는 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 크게 저하되는 양상을 보였고, 오랜 시간 반응에 있어 세포 외 효소액의 안정성 역시 저하되는 양상을 보였다. As a result, as shown in Figure 3 (b), it is confirmed that all of the high pH of the extracellular enzyme solution activity and stability is 4.5 ~ 5.0. When the pH exceeded 5.0, the activity of the extracellular enzyme solution was greatly reduced, and the stability of the extracellular enzyme solution was also decreased in the long-time reaction.

실시예 3: 세포 외 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조Example 3: Preparation of ginsenoside compound K using extracellular enzyme solution

본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하였다. In the present invention, a ginsenoside compound K was prepared using an extracellular enzyme solution cultured through an optimized expression medium.

먼저, 세포 외 효소액 2.5 mg/ml를 기질로서, 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc 1.0 mg/ml이 함유된 시약을 55℃ 및 pH 5.0에서 2 시간 또는 24시간 동안 반응시켰다. First, 2.5 mg/ml of the extracellular enzyme solution was used as a substrate, and a reagent containing 1.0 mg/ml of ginsenosides Rb1, Rb2 and Rc was reacted at 55° C. and pH 5.0 for 2 hours or 24 hours.

그 결과, 도 4(a) 및 (c)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb1 또는 Rc가 2 시간 만에 모두 진세노사이드 C-K로 완전히 전환되었고, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb2가 24 시간 만에 약 94 몰%의 수율로 진세노사이드 C-K 전환됨을 확인하였다. 이를 통해 도 5와 같은 전환 경로를 따라 각 프로토파낙사다이올계 사포닌이 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환될 수 있다는 것을 제시할 수 있었다.As a result, as shown in FIGS. 4(a) and (c), ginsenoside Rb1 or Rc was completely converted to ginsenoside C-K in 2 hours, and as shown in FIG. 4(b), ginsenoside Rb1 or Rc It was confirmed that side Rb2 was converted to ginsenoside C-K in a yield of about 94 mol% in 24 hours. Through this, it could be suggested that each protopanaxadiol-based saponin can be converted into a ginsenoside compound K along the conversion path as shown in FIG.

한편, 세포 외 효소액 8.0 mg/ml를 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 6.0 mg/ml을 포함하는 고려 인삼 뿌리 추출물에 처리함에 있어, 55℃ 및 pH 5.0에서 18 시간 동안 반응시켰다. On the other hand, when 8.0 mg/ml of the extracellular enzyme solution was treated with a Korean ginseng root extract containing 6.0 mg/ml of protopanaxadiol-based saponin as a substrate, it was reacted at 55° C. and pH 5.0 for 18 hours.

그 결과, 도 6(a)에 나타난 바와 같이, 반응 전에 존재하던 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 경우 반응 초기에 모두 중간 물질들로 전환되고, 6 시간 이후부터 전환 정도가 낮아지는 양상을 나타내고, 18 시간 초과 반응에서는 더 이상 진세노사이드 컴파운드 케이로의 전환을 나타내지 않았다. 특히, 9 시간 동안 반응 결과 생성된 진세노사이드 컴파운드 케이의 전환 수율은 80 몰%이었고, 그 양은 2.8 mg/mL(4.5 mM)이었으며, 그 생산성은 313.0 mg/L/h(502.4 μM/h)인 것으로 확인된다. As a result, as shown in FIG. 6(a), in the case of ginsenosides Rb1, Rb2, Rc and Rd, which are protophanaxadiol-based saponins that were present before the reaction, all were converted to intermediate substances at the beginning of the reaction, and after 6 hours The degree of conversion showed a decreasing pattern, and the reaction over 18 hours did not show any more conversion to the ginsenoside compound K. In particular, the conversion yield of the ginsenoside compound K produced as a result of the reaction for 9 hours was 80 mol%, the amount was 2.8 mg/mL (4.5 mM), and the productivity was 313.0 mg/L/h (502.4 μM/h) is confirmed to be

즉, 도 6(b)에 나타난 바와 같이, 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd가 세포 외 효소액에 의해 짧은 반응 시간 동안 높은 수율로 많은 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환됨을 확인할 수 있었다. That is, as shown in Figure 6 (b), protopanaxadiol-based saponins ginsenoside Rb1, Rb2, Rc and Rd are converted into many ginsenoside compound K in high yield for a short reaction time by the extracellular enzyme solution was able to confirm

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The foregoing description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims (11)

(a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 10 g/L 내지 15 g/L 농도의 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 세포 외 효소액을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하고,
상기 (b) 단계에서 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌; 또는 인삼 추출물을 포함하는,
진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
(A) Aspergillus niger (Aspergillus niger) strain as a carbon source, cultured in an expression medium containing carboxymethyl cellulose at a concentration of 10 g / L to 15 g / L Aspergillus niger (Aspergillus niger) niger) obtaining an extracellular enzyme solution of the strain; and
(b) comprising the step of treating the obtained enzyme solution to a substrate,
In step (b), the substrate is one or more protopanaxadiol-based saponins selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd; or ginseng extract,
Method for producing ginsenoside compound K.
 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
According to claim 1,
In the step (a) Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) strain is Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) strain (KACC 46495), the method of producing a ginsenoside compound K.
 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
According to claim 1,
In the step (a), the expression medium is a nitrogen source, and a method for producing a ginsenoside compound K, including a corn steep solid.
 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 발현 배지는 KH2PO4, MgSO4 .7H2O, CaCl2, FeSO4 .7H2O, ZnSO4 .7H2O, MnSO4 . H2O 및 CoCl2 .6H2O 를 추가로 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
According to claim 1,
The expression medium in step (a) is KH 2 PO 4 , MgSO 4 . 7H 2 O, CaCl 2 , FeSO 4 . 7H 2 O, ZnSO 4 . 7H 2 O, MnSO 4 . H 2 O and CoCl 2 . 6H 2 O A method for producing a ginsenoside compound K, further comprising:
 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
According to claim 1,
The concentration of protopanaxadiol-based saponin in the substrate in step (b) is 0.1 mg/ml to 10 mg/ml, a method for producing a ginsenoside compound K.
 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 처리는 pH 4.0~6.5 및 40~65℃ 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
According to claim 1,
The method of producing a ginsenoside compound K, wherein the treatment in step (b) is carried out for 2 hours to 24 hours at pH 4.0-6.5 and 40-65°C conditions.
 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 10 g/L 내지 15 g/L 농도의 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 세포 외 효소액; 및 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌; 또는 인삼 추출물을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
Aspergillus niger (Aspergillus niger) strain as a carbon source, Aspergillus niger (Aspergillus niger) strain cultured in an expression medium containing carboxymethyl cellulose (carboxymethyl cellulose) at a concentration of 10 g / L to 15 g / L of extracellular enzymes; and at least one protopanaxadiol-based saponin selected from the group consisting of ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and ginsenoside Rd; Or a composition for preparing a ginsenoside compound K comprising a ginseng extract.
 제10항에 있어서,
상기 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.11. The method of claim 10,
The expression medium is a nitrogen source, comprising a corn steep solid (corn steep solid), ginsenoside compound K composition for producing.
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