KR102432412B1 - 항생제 대체용 동물 사료첨가제 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항생제 대체용 동물 사료첨가제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 갈색거저리 분말화공정(S1단계)와; 갈색거저리 탈지 탈키틴공정(S2단계)와; 항산화제 혼합공정(S3단계)와; 접종 발효공정(S4단계) 및; 상기 발효물에 L.plantarum 및 P.acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가 혼합하는 혼합공정(S5단계) 또는 미역 1차분말화공정(S11단계)와; 미역 2차분말화공정(S12단계)와; 항산화제 혼합공정(S13단계)와; 상기 프리바이오틱스(prebiotics)를 유화제와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효하는 발효물을 얻는 접종 발효공정(S14단계) 및; 상기 발효물에 L.plantarum 및 P.acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가 혼합하는 혼합공정(S15단계)로 이루어져 본 발명은 탈지 및 탈키틴 처리한 곤충갈색거저리(mealworm)추출물 또는 탈알긴산 처리한 미역부산물 분말을 프리바이오틱스로 사용하고 키틴분해 자화성 Bacillus thuringiensis T3와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효한 다음 복합유산균 L.plantarum 및 P.acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가하여 혼합, 제조함으로써 사료용은 물론 치료용 항생제의 대체 효과가 있고, 사료에 첨가하여 사용시 체격향상, 면역력 향상, 체질개선 뿐만 아니라 사료요구율이 현저하게 개선되어 상당한 경제적 이익을 향유할 수 있는 각별한 장점이 있는 유용한 발명이다.

Description

항생제 대체용 동물 사료첨가제 및 그 제조방법{Animal feed additives for substituting antibiotics and preparation method thereof}

본 발명은 항생제 대체용 동물 사료첨가제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탈지 및 탈키틴 처리한 곤충갈색거저리(mealworm)추출물 또는 탈알긴산 처리한 미역부산물 분말을 프리바이오틱스로 사용하고 키틴분해 자화성 Bacillus thuringiensis T3와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효한 다음 Lactobacillus plantarum 및 Pediococcus acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가하여 혼합, 제조하여 된 신규한 자돈 양계용 및 젖소용 가축 사료첨가제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

국내 사료첨가제 시장의 면역 증진 또는 항병력 기능성 사료첨가제의 기술 개발 수준은 선진국인 미국, 유럽, 일본 등에 비하여 70 ∼ 80% 수준으로 파악되며, 2011년 항생제 전면 금지 이후 기술 발굴을 위한 많은 연구 개발 투자가 진행되고 있으나 아직까지 인프라 구축이 부족한 실정이다.

또 지금까지 항생제 대체 목적의 생리활성물질은 생리대사적 및 면역학적 기초와 응용 연구가 다양하게 진행 중에 있으나, 이들은 단순 항생제 대체 목적의 연구 결과물로서, 프리바이오틱스와의 시너지효과를 목표로 한 종합적인 사료첨가제 개발 연구는 아직 미비한 실정이다.

한편, 통상적으로 사료첨가제는 배합사료와 비슷하게 배합기술과 가공기술, 품질 확보 및 평가 기술에 의해 제조되며, 사료첨가제 원료의 경우, 원료를 조합하거나 배합하는 기술은 국외 기술 대비 상대적으로 수준이 낮은 실정이며, 2011년 7월 국내 성장용 사료첨가 항생제 사용은 전면 금지(농림축산식품부,‘국가 항생제내성 안전관리 사업’, 2005년 5월부터 총 항생제 44종 중 28종 금지, 2009년 1월부터 7종 추가 금지, 2011년 7월 전면 금지)조치 되었다. 농림축산식품부는 2016 ∼ 2020년“제2차 곤충산업 육성 5개년 계획”에서 곤충의 공급과 수요를 대폭적으로 증가하려는 로드맵을 제시하였고, 사료 내 사용량이 큰 폭으로 증가할 것으로 예상하고 있다.

그러나, EU 등과 같은 축산 선진국에서는 10 ∼ 20년 정도 앞서 항생제 금지에 대해서 고민해 온 결과, 가축 질병에 대응할 수 있는 기술적 탄력성과 훌륭한 시스템적 인프라를 보유하고, 현재 EU, 중국 등 축산대국들은 가축사에 항생제 사용을 금지하고 있어, 이를 대체하기 위한 사료첨가제의 개발과 적용이 절실한 실정이다.

그러나, 생리대사적, 면역학적 반응에 대한 기초연구를 비롯하여 항생제 대체를 위한 펠렛, 파우더, 주사제와 같은 다양한 급여 형태에 대한 기술적 시도가 이루어지고 있지만, 이들 사료첨가제는 자국 원료를 활용하여 효율적으로 자원화한 것일뿐 국내에 직접 적용하기 어려운 점이 있어 국내에서도 유용한 천연부산물의 발굴과 이의 효율적인 자원화 나아가 기능성 사료첨가제 개발이 매우 시급한 실정이다.

지금까지 천연항생 효능을 가지고 있는 곤충 단백질 원료의 사료 자원화의 일환으로 누에, 벌 외에 최근 갈색거저리(T.molitot)의 유충 또는 배설물의 건조물을 함유한 사료첨가제제 대하여는 특허공개 제2011-54692호에 개시되어 있다(특허문헌 1 참조). 그러나, 상기 공지문헌에는 항생 기능성에 대하여는 개시된 바 없고 단지 계육에 미치는 불포화지방산의 조성비의 변화에 의한 육질향상 효과가 개시되어 있을 뿐이다.

문헌 1 : 특허공개 제2011-0054692호 공개특허공보,

따라서, 본 발명은 탈지 및 탈키틴 처리한 곤충갈색거저리(mealworm)추출물 또는 탈알긴산 처리한 미역부산물 분말을 프리바이오틱스의 원물로 사용하고 키틴분해 자화성 Bacillus thuringiensis T3와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효한 다음 복합유산균 Lactobacillus plantarum 및 Pediococcus acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가하여 혼합, 제조함으로써 사료용은 치료용 항생제의 대체 효과가 있는 항생제 대체용 동물 사료첨가제 및 그 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 사료에 첨가하여 사용시 체질향상, 면역력 향상, 체질개선 뿐만 아니라 사료요구율이 현저하게 개선되어 상당한 경제적 이익을 향유할 수 있는 항생제 대체용 동물 사료첨가제 및 그 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법은 갈색거저리를 건조 분말화하는 갈색거저리 분말화공정(S1단계)와; 상기 갈색거저리 분말화공정(S1단계)을 통해 얻은 갈색거저리 분말을 탈지 탈키틴 처리하여 탈지 탈키틴된 갈색거저리를 얻는 갈색거저리 탈지 탈키틴공정(S2단계)와; 상기 탈지 탈키틴된 갈색거저리에 항산화제 또는 Vitamin C 0.05 ∼ 0.5%를 혼합 밀봉하여 프리바이오틱스(prebiotics)를 얻는 항산화제 혼합공정(S3단계)와; 상기에서 얻은 프리바이오틱스(prebiotics)를 키틴분해 자화성 Bacillus thuringien sis T3와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효하는 발효물을 얻는 접종 발효공정(S4단계) 및; 상기 발효물에 Lactobacillus plantarum 및 Pediococcus acidlactici 복합유산균 생균제(이하, 각각 L. plantarum 및 P.acidlactici 라 한다)를 첨가 혼합하는 혼합공정(S5단계)로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법은 채취한 미역을 콘크리트 트렌치 사일로에 널은 후 태양광에 건조한 후 분쇄하는 미역 1차분말화공정(S11단계)와; 분쇄한 미역 원료를 로터리 킬른(원통형 열풍 건조기)에서 넣어 건조한 후 Hammer Mill에 투입하여 미립 분쇄하는 미역 2차분말화공정(S12단계)와; 상기 미역 2차분말화공정(S12단계)을 거친 분말 미역에 항산화제 또는 Vitamin C 0.05 ∼ 0.5%를 혼합 밀봉하여 프리바이오틱스(prebiotics)를 얻는 항산화제 혼합공정(S13단계)과; 상기 프리바이오틱스(prebiotics)를 0.9 ∼ 1.6% 유화제와 0.08 ∼ 0.7% 효모와 함께 고체 배지에 접종 발효하는 발효물을 얻는 접종 발효공정(S14단계) 및; 상기 발효물에 L.plantarum 및 P.acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가 혼합하는 혼합공정(S15단계)로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 탈지 및 탈키틴 처리한 곤충갈색거저리(mealworm)추출물 또는 탈알긴산 처리한 미역부산물 분말을 프리바이오틱스로 사용하고 키틴분해 자화성 Bacillus thuringiensis T3와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효한 다음 복합유산균 L.plantarum 및 P.acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가하여 혼합, 제조함으로써 사료용은 물론 치료용 항생제의 대체 효과가 있고, 사료에 첨가하여 사용시 체격향상, 면역력 향상, 체질개선 뿐만 아니라 사료요구율이 현저하게 개선되어 상당한 경제적 이익을 향유할 수 있는 각별한 장점이 있다.

도 1a 내지 도 1c는 갈색거저리 첨가에 따른 유산균의 성장 곡선(CFU 카운트) 그래프,
도 2a 내지 도 3c는 갈색거저리 첨가에 따른 배지의 pH변화를 나타낸 그래프,
도 3은 Basillus 내 chitinase 유전자 확인 결과를 나타낸 도면으로서, (a) B. licheniformis T2, (b) B.thuringiensis T3, (c) b. subtilis T4
도 4는 Bacillus 내 protease와 chitinase 유전자 확인 결과를 나타낸 도면,
도 5는 sugar reduction assay 결과 bacillus 균주의 chitin 분해능을 보인 그래프,
도 6은 NAG 첨가에 따른 B.thuringiensis T3 성장변화를 나타낸 그래프,
(a) OD, (b) CFU
도 7은 NAG 첨가에 따른 B.thuringiensis T3의 PH변화를 보인 그래프,
도 8은 WMW와 DFDC의 항균능력평가(1, 2차)를 나타낸 도면,
도 9는 Basillus의 갈색거저리 첨가에 따른 pH 및 성장곡선을 나타낸 도면,
(a) T2, (b) T3, (c)T4
도 10은 L.plantarum과 P.acidilactici를 포함한 복합미생물 생균제의 E.coli K99에 대한 항균력 test를 나타낸 도면,
도 11은 갈색거저리를 이용한 본 발명 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법을 실행하는 공정 순서도,
도 12는 미역부산물을 이용한 본 발명 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법을 실행하는 공정 순서도,
도 13은 본 발명 갈색거저리를 이용한 동물사료 첨가제의 최종 제형을 보안 사진,
도 14는 본 발명 미역 부산물을 이용한 동물사료 첨가제의 최종 제형을 보안 사진,
도 15는 본 발명 미역 부산물의 최종 제형 분말형(15a), 크럼블형(15b) 및 펠렛형(15c)를 보인 사진이다.

이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명 항생제 대체용 동물 사료첨가제 및 그 제조방법의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.

본 발명 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법은 갈색거저리를 건조 분말화하는 갈색거저리 분말화공정(S1단계)와; 상기 갈색거저리 분말화공정을 통해 얻은 갈색거저리 분말을 탈지 탈키틴 처리하여 탈지 탈키틴된 갈색거저리를 얻는 갈색거저리 탈지 탈키틴공정(S2단계)와; 상기 탈지 탈키틴된 갈색거저리에 항산화제 또는 Vitamin C 0.05 ∼ 0.5%를 혼합 밀봉하여 프리바이오틱스를 얻는 항산화제 혼합공정(S3단계)과; 상기에서 프리바이오틱스를 키틴분해 자화성 Bacillus thuringiensis T3와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효하는 발효물을 얻는 접종 발효공정(S4단계) 및; 상기 발효물에 L.pamtarum 및 P.acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가 혼합하는 혼합공정(S5단계)로 이루어진다.

상기 갈색거저리 분말화공정(S1단계)에서 갈색거저리에 마이크로웨이브( Microwave)를 조사하여 수분의 함량을 8% 이하로 하는 것이 바람직하다.

상기 갈색거저리 탈지 탈키틴공정(S2단계)에서 지방 함량은 6% 이하로 공지된 방법에 따라 탈지 탈키틴하는 것이 바람직하다.

상기 혼합공정(S5단계)에서 복합유산균 생균제는 유산균, 바실러스, 효모(yeast) 중 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법은 채취한 미역부산물을 콘크리트 트렌치 사일로에 널은 후 태양광에 건조한 후 분쇄하는 미역 1차분말화공정(S11단계)와; 분쇄한 미역 원료를 로터리 킬른(원통형 열풍 건조기)에서 넣어 건조한 후 Hammer Mill에 투입하여 미립 분쇄하는 미역 2차분말화공정(S12단계)과; 상기 미역 2차분말화공정을 거친 분말 미역에 항산화제 또는 Vitamin C 0.05 ∼ 0.5%를 혼합 밀봉하여 프리바이오틱스(prebiotics)를 얻는 항산화제 혼합공정(S13단계)과; 상기 프리바이오틱스(prebiotics)를 0.9 ∼ 1.6% 유화제와 0.08 ∼ 0.7% 효모와 함께 고체 배지에 접종 발효하는 발효물을 얻는 접종 발효공정(S14단계) 및; 상기 발효물에 L.plantarum 및 P.acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가 혼합하는 혼합공정(S15단계)로 이루어진다.

상기 미역 1차분말화공정(S11단계)에서 콘크리트 트렌치 사일로에 미역 원료를 겹치지 않게 잘 펴서 널은 후 태양광에 48 시간 건조한 후 Pin Mill에 투입하여 분쇄하여 분쇄 후 입자의 크기가 가로 0.5 cm, 세로 0.5 cm 인 것이 바람직하다.

상기 2차분말화공정(S12단계)에서 분쇄한 원료를 직경 1.2m, 길이 12m의 로터리 킬른(원통형 열풍 건조기)에서 4시간 건조 후 Hammer Mill에 투입하여 분말화하여 분말의 수분 함량 12% 이하가 바람직하다.

상기 혼합공정(S15단계)에서 복합유산균 생균제는 유산균, 바실러스, 효모(yeast) 중 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합 균주를 사용하는 것이 바람직하다.

실시예 1

(원물의 선택)

현재 국내를 비롯한 동아시아 지역에서 대량 양식 중인 곤충은 갈색거저리 (mealworm; 이하 '밀웜'이라 함)와 동애등에 (soldier fly), 왕귀뚜라미의 영양분을 분석하였다.

이 중 밀웜이 경제성 측면과 영양적 측면을 종합 고려했을 때 사료로서의 가치가 가장 뛰어난 것으로 인정받고 있는데, 이는 사육 과정이 용이하고 병해에 강하며 사료를 가리지 않으므로 가장 저렴하게 양식이 가능하며, 동시에 다른 곤충에 비해 영양소가 균형을 이루고 있기 때문이다(표 1 참조).

사료용 곤충 후보종의 영양성분

시료명	성분별 분석결과 (%)
	수분	조단백질	조지방	조섬유	조회분
갈색거저리 (밀웜)	0.76	46.42	39.42	5.13	3.26
동애등에	1.74	41.54	36.45	7.09	8.24
왕귀뚜라미	4.97	65.92	12.10	6.78	5.75

※ 국립농업과학원. 2015. p36

실시예 2

(갈색거저리(mealworm) 탈지, 탈키틴)

우선 양식장에서는 밀웜의 수확과 동시에 Microwave를 조사하여 밀웜 내 존재하는 수분을 극도로 건조시키고(여기서 쇼핑몰 "밀웜나라"로부터 구입한 건조된 밀웜을 사용하여도 좋다) 이를 통해 수분을 8% 이하로 유지함으로써 수분으로 인한 부패 문제를 미연에 방지하며, 이렇게 건조된 상태를 본 발명에서는‘밀웜 원물’이라 칭하였다.

한편 밀웜은 풍부한 지방(fat)과 유효성분인 키틴을 다량 함유하고 있는데 국내에서는 지방과 키틴을 추출하는 공장이 전무한데 반해, 중국에는 탈지 탈키틴 가공 공장이 다수 존재하고 있다. 이들 가공공장에서는 밀웜으로부터 지방과 키틴을 추출하여 고가에 판매되고, 남은 추출물을 사료화하여 사료회사나 농가에 판매 하고 있다. 본 발명에서는 중국에서 수입된 추출물을‘탈지 탈키틴 밀웜’으로 정의 한다.

탈지 탈키틴 밀웜은 지방 추출 공정으로 인해 지방이 6% 수준으로 낮아져, 지방으로 인한 산패 문제가 부각되지 않는다. 본 발명자들은 그럼에도 불구하고 산패 문제가 발생할 경우를 대비해, 탈지 탈키틴 밀웜에는 항산화제를 혼합하고, 밀봉 포장하여 공기와의 접촉을 차단함으로써 밀웜의 산패를 방지하였다.

본 발명자들은 밀웜 원료를 구입하여 성분분석을 실시한 후 탈지/탈키틴한 밀웜과 원물 밀원의 일반성분을 분석한 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다.

일반성분 분석

구분 (단위: %)	탈지 탈키틴 밀웜			밀웜 원물
	1차	2차	평균	1차	2차	평균
수분	7.88	8.24	8.06	4.39	6.36	5.38
조단백질	68.96	68.90	68.93	52.68	51.96	52.32
조지방	6.86	-	6.86	28.40	-	28.40
조섬유	2.11	2.45	2.28	6.13	6.82	6.48
조회분	6.94	-	6.94	3.97	4.26	4.12
키틴	0.38	-	0.38	4.28	-	4.28

※ 충남대학교 농업과학연구소

아미노산 분석

구분 (단위: %)	탈지 탈키틴 밀웜			밀웜 원물
	1차	2차	평균	1차	2차	평균
아스파르트산	4.76	4.69	4.73	4.55	4.24	4.40
트레오닌	2.66	2.54	2.60	2.28	2.13	2.21
세린	4.33	3.60	3.97	2.79	2.58	2.69
글루탐산	9.51	8.86	9.19	6.91	6.34	6.63
프롤린	4.78	4.12	4.45	3.83	3.33	3.58
글리신	5.97	4.70	5.34	2.99	2.65	2.82
알라닌	4.09	3.89	3.99	3.82	3.38	3.60
발린	3.00	2.98	2.99	2.86	3.26	3.06
이소루신	1.99	1.91	1.95	2.14	1.92	2.03
루신	5.29	5.05	5.17	3.99	3.58	3.79
티로신	1.85	1.64	1.75	3.91	3.47	3.69
페닐알라닌	2.66	2.53	2.60	2.05	1.86	1.96
히스티딘	1.07	1.14	1.11	1.63	1.46	1.55
라이신	4.28	4.09	4.19	2.92	2.95	2.94
아르기닌	4.60	4.14	4.37	2.87	2.70	2.79
시스틴	2.55	1.87	2.21	0.81	0.86	0.84
메티오닌	1.65	1.89	1.77	0.77	0.83	0.80
트립토판	0.40	0.43	0.42	0.58	0.53	0.56
합계	65.44	60.07	62.76	51.7	48.07	49.89

※ 충남대학교 농업과학연구소

밀웜과 어분의 아미노산 비교

	탈지 탈키틴 밀웜	외산어분	국산어분	수입어분
아지닌	4.37	-	-	3.44
글라이신	5.34	4.29	1.76	5.67
라이신	4.19	-	-	5.19
메티오닌	1.77	2.43	1.60	2.00
페닐알라닌	2.60	2.16	2.17	2.40
이소루신	1.95	3.47	2.32	2.82
루신	5.17	4.38	3.10	5.25
트레오닌	2.60	0.04	0.07	2.64
트립토판	0.42	-	-	-
발린	2.99	4.19	3.69	1.90

※ 사료자원핸드북 제 4판. 2011.

<실험예 1> 미생물 소재 선발

1-1. 유산균 소재 선발

생균제 후보군들 중 유산균인 Lactobacillus 3종 (Lactobacillus reuteri KLR 3004, Lactobaillus salivarius KLW001, Lactobacillus plantarum GS-1)에 대해서 밀웜 첨가시 균수 증진 효과 등 prebiotics적인 기능이 있는지 확인해보고자 하였다.

이를 확인하는 데에는 분말화시킨 밀웜을 0.1% w/v으로 섞어준 De Man, Rogosa and Sharpe(MRS, 이후 MRS) Broth (밀웜(0.1%w/v))에서 36시간 동안 각각의 유산균들을 배양시키면서 0, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36시간대 별로 배양액 샘플링, 이를 MRS agar 배지에 spreading 해준 뒤 24시간 후 생성되는 colony forming unit(CFU, 이하 CFU) 수를 count하여 그 결과를 도 1에 나타내고, 배양시간에서의 pH를 측정한 뒤, 이를 밀웜이 첨가되지 않은 MRS broth(No mealworm)과 비교하여 도 2에 나타냈다.

도 1, 도 2로부터 0.1% w/v의 밀웜을 처리했을 때, 유산균 3종에 대해서 균수 증가나 유산 생산 등을 통한 pH 변화에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었고, 특별한 부정적인 영향도 없는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 바실러스 균 소재 선발

생균제 후보군 중 바실러스는 3종류 (Bacillus licheniformis T2, Bacillus thuringiensis T3, Bacillus subtilis T4, 이하 각각 T2, T3, T4로 명명)에 대해서 소재 선발 작업을 진행했다. 상기 균주는 미생물 기탁기관 0000에 0000년 00월 00일 기탁번호 0000로 각각 기탁되었다.

밀웜 내에는 chitin 함량이 높아 chitin을 분해하여 이용할 수 있는 생균제와의 시너지 효과를 기대할 수 있고, 이를 위해 기준으로 삼은 것은 chitin을 분해하는 유전자인 chitinase(chi, 이후 chi로 명명) 유전자의 유무이다. 이는 기존에 존재하는 reference primer를 이용하여 각각의 균 DNA를 extraction, PCR을 통해서 확인하고 그 결과를 도 3에 나타냈다.

또한 새우 등으로부터 chitin과 같은 다당류가 분리가 될 때 protease의 분비가 중요한 역할을 한다는 내용이 있기 때문에, 밀웜에서의 chitin 분해에 있어서도 동일하게 작용할 가능성이 크다 판단하였고, 이에 바실러스 균 후보군들 가운데 protease 관련 유전자가 존재하는지 또한 PCR을 통해서 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타냈다.

최종적으로는 sugar assay를 통해서 실제 해당 유전자 등에 의해 chitin의 분해에 따른 sugar 함량 변화가 있는지를 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타냈다.

한편, 밀웜 내 함유된 chitin이 분해됨으로써 생성될 수 있는 monomer형태인 N-acetyl glucosamine(NAG, 이하 NAG로 명명)을 Lysogeny broth(LB, 이하 LB로 명명) broth에 1.5% w/v으로 첨가해줌으로써, 해당 단당체를 바실러스 균이 생장에 필요한 영양소로 사용할 수 있는지 확인하는 작업을 Optical density(O.D., 이후 O.D.로 명명) 측정 및 CFU count와 pH측정으로 확인하고 그 결과를 도 6 및 도 7에나타냈다.

<실험예 3-1> chi 유전자 유무 확인

실험결과, 바실러스 균 3종 중 T2와 T3의 경우 chi 유전자가 존재하는 것을 도 3으로부터 확인할 수 있었고, 이는 곧 밀웜 내 존재하는 chitin을 분해하여 배타적인 영양원으로 사용할 수 있는 가능성을 도 4로부터 확인할 수 있었다. 즉, T2와 T3가 밀웜을 prebiotics로써 이용할 수 있는 가능성을 확인하였다.

<실험예 3-2> protease 유전자 유무 확인

또한 실험결과, 도 4로부터 바실러스 후보군 중 T2와 T3의 경우, protease detection용 primer를 이용하여 PCR을 해보았을 때 증폭이 되는 것을 확인할 수 있었다.

앞서서 chi 유전자가 있음을 확인한 T2와 T3가 protease 유전자도 가지고 있음을 확인한 것이고, 이는 곧 2 종류의 바실러스 균 후보군들이 chitinase와 protease를 분비함으로써 밀웜 등 chitin이 풍부한 소재로부터 chitin과 같은 다당류를 분해하여 이용할 수 있다는 것을 의미한다.

<실험예 3-3> protease 유전자 유무 확인

실험결과, chitin을 분해할 수 있는 가능성을 확인한 T2와 T3를 이용하여 chitin 분해에 따른 sugar 함량변화가 있는지 sugar reduction assay를 진행하고 그 결과를 도 5에 나타냈다.

도 5로부터 T2와 T3의 sugar 생성을 확인했고, 특히 T3의 경우 chitin 첨가에 따라 sugar 함량이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 실제적으로 T3에 의해 chitin이 분해되는 것을 의미하며. 즉, T3가 밀웜을 prebiotics로 이용할 가능성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.

<실험예 3-4> NAG 첨가에 따른 T3 생장 변화 확인

실험결과, 도 6, 도 7로부터 O.D.와 CFU count를 통한 균수 확인과 pH 변화 확인을 통해서 기존 LB배지에 1.5% w/v으로 NAG를 첨가해주었을 때 균 생장이 증진되는 역할은 없다는 것을 확인하엿다. 이는 곧 T3가 chitin의 monomer형태인 NAG를 영양원으로써 선호하지 않는다는 것을 의미한다.

<실험예 4> 탈지 곤충소재의 in vitro 기능성 평가

밀웜 내에 항균소재인 tenecin으로 대표되는 antimicrobial peptide가 풍부하다고 알려져 있기 때문에, 수급한 밀웜 원물(본 절에서는 whole mealworm, WMW로 명명)과 탈지 탈키틴 밀웜(이하, "de-fatted de-chitin mealworm, DFDC"라 한다)을 각각 LB배지에 0.5% 혹은 1/0% w/v으로 첨가해준 배지를 이용하여 대표적인 병원균인 Escherichia coli K99(E.coli K99, 이하 E.coli K99로 명명)에 대한 항균효과가 있는지를 E.coli K99의 CFU count를 통해 확인하고 그 결과를 도 8에 나타냈다.

또한 후보군으로 두고 있는 바실러스 후보군들을 이용하여 DFDC첨가에 따른 균 생장 증진효과가 있는지를 확인하기 위해 0.5% w/v으로 LB에 섞어줬을 때의 균 생장곡선을 기본 LB배지와 0.5% w/v 밀웜 첨가 LB배지에서의 균 생장곡선과 비교헝ud시간대는 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 시간대 별로 배양액을 샘플링 한 후, 도 9에 나타냈다.

이를 LB agar plate에 spreading해준 후 생성되는 CFU를 count하고 해당시간대의 배양액 pH를 측정함으로써 첨가효과가 균 생장에 미치는 영향을 확인하였다.

<실험예 4-1> Mealworm(WMW)과 DFDC의 E.coli K99에 대한 항균 효과 확인

2차의 실험결과, 2번의 시도 결과 WMW 첨가 혹은 DFDC 첨가에 따른 E.coli K99의 CFU count수에 차이가 나지 않는 것을 확인하여 도 10에 나타냈다. 이는 곧 mealworm 자체와 이를 탈지화시킨 DFDC가 자체적으로 병원균인 E.coli K99에 대한 항균효과는 없음을 의미한다.

<실험예 4-2> CFU count (0.5% w/v DFDC 첨가 LB, 0.5% w/v mealworm LB, 기본 LB 배지)

실험결과, T2와 T3에서 공통적으로 균 생장에 있어서는 mealworm(WMW) 첨가 배지에서 초반 6시간에서 12시간 구간에서 성장을 빨리 증진시키는 것을 도 1을 통해 확인할 수 있었고, 84시간 이후 균수에 있어서는 DFDC가 다소 균의 증진에 도움이 되는 것을 알 수 있었다.

특히 T3에서 WMW 첨가 시, 성장 속도가 처음 24시간 동안 크게 증가하는 것을 확인하였고, T4에서는 WMW이 성장에 큰 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

또한 도 9에 도시한 바와 같이 공통적으로 WMW 첨가 배지에서 pH의 증가 속도가 더딘 것을 확인하였고, 이를 통해서 균 생장에 있어서 WMW과 DFDC 모두 부정적인 영향은 없다는 것을 확인하였으며, 더불어 초반 생장시간에서는 WMW이 좀 더 생장을 촉진시키는 것과 최종 평형상태에서의 균수는 DFDC첨가에 의해 증가될 가능성을 확인하였다.

특히 DFDC의 경우, pH에 있어서 기본 LB배지와 차이가 없는 것을 확인함으로써 균 생리에 부정적인 영향을 끼치지 않는 것으로 보였다.

<실험예 5> 시제품의 in vitro 기능성 평가

본 발명의 시제품으로써, Mealworm 및 B. thuringiensis T3와 효모를 함께 고체 발효하였다.

통상적인 액상 또는 건조분말 형태가 아닌 고체 발효를 택한 이유는 고체 발효시, 포자 형성능이 향상되어 균주의 생존에 유리하며, 액상 배양 후 동결건조 과정과 비교하여 공정이 간단하여 산업화에 유리 또한 발효 과정 동안 균주가 생산한 유효 대사산물 및 분해 산물이 포함되어 있기 때문이다.

Bacillus 균주와 mealworm 외에도 산업용 배지 내 유효 성분과 yeast가 함께 포함되어 있어 복합 생균제로의 활용이 용이하였다.

가축 사료첨가제로의 활용성을 생각해볼 때 단일 균주 첨가제보다는 여러 균주를 복합적으로 사용하는 복합 미생물 생균제의 형태가 더 적합하다.

복합 미생물 생균제로의 제형을 고려할 때, 밀웜과 바실러스의 조합은 병원성 미생물에 대한 항균력을 기대하기 어렵기 때문에 항균 활성이 뛰어난 균주의 조합이 필요하였다.

고체 발효를 통해 생산한 제품과 현재 생균제로 많이 이용되고 있으며 병원성 미생물(E. coli K99)에 항균력이 있는 것으로 알려진 유산균주 (Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici)를 혼합하여 복합 미생물 생균제 형태의 제형을 확립하였다.

<실험예 5-1> 복합 미생물 생균제의 E. coli K99에 대한 항균력 확인

E. coli K99는 대장균성 설사병을 유발하는 병원균으로 양돈에 있어 특히, 이유 시기에 자돈의 설사를 유발한다.

고체 발효를 통해 생산한 복합 미생물 제제(배지 성분, 밀웜, B. thuringien sis T3, yeast 및 대사 산물포함)에 E. coli K99에 대해 항균력이 있는 것으로 알려져 있는 유산균인 L. plantarum과 P. acidilactici 두 균주를 각각 혼합하여 복합 미생물 생균제의 항균 활성을 검정하였다.

L. plantarum과 P. acidilactici 두 균주를 포함한 복합 미생물 생균제에서 모두 15 mm 이상의 Inhibition zone 직경을 나타내 병원성 미생물인 E. coli K99에 대한 항균력을 확인할 수 있었다.

특히 본 발명에서 복합 미생물 생균제의 후보물질로 선정한 유산균 중 L.plantarum의 경우 평균 18.4 mm의 Inhibition zone 직경을 보여, 항균력이 우수함을 입증할 수 있었다.

Inhibition zone 직경

(단위: mm)	L. plantarum	P. acidilactici
Sample 1	17.01	15.28
Sample 2	17.02	14.95
Sample 3	17.26	15.98
Sample 4	17.71	16.06
Sample 5	19.26	15.37
Sample 6	19.80	16.50
Sample 7	16.50	15.20
Sample 8	17.12	15.64
Sample 9	21.42	19.06
Sample 10	21.09	18.57
평균	18.419	16.243

실험결과, 유산균과 바실러스, yeast를 복합 미생물 생균제로 사용할 경우, 유산균의 항균력, 바실러스의 효소 활성과 축사 환경 개선 효과, yeast의 단백질, 미네랄 공급 효과와 비특이적 면역 촉진 효과를 함께 기대할 수 있었다.

뿐만 아니라 고체 발효를 통해 포함되어 있는 미생물 유래의 유용 대사산물들을 함께 이용할 수 있어 보다 더 사료첨가제로써의 이용 가능성이 우수한 형태라고 할 수 있다.

<사양실험예1>

본 발명 갈색거저리 제품의 기능성을 확인하기 위해 2019년 6 ∼ 7월 간 돼지(이유자돈) 대상으로 하기와 같이 사양실험을 실시하였다.

밀웜 시제품을 24일령 이유자돈 22두에 급여함으로써, 시제품의 안전성과 기능성을 확인하는 사양실험을 실시하였다. 배합사료에 2% 혼합하여 21일간 급여한 후 일당 증체량, 사료요구율, 폐사율을 확인하였다.

증체량이 목표에 미달하였으나, 이는 보통의 이유자돈 실험이 4주인데 반해 본 실험 실시 농장의 사정에 의해 실험기간이 3주로 제한함에 따라 이유후기의 증체량 증가 효과를 누리지 못하였다. 또한, 개별 농장의 환경, 급여사료, 기후조건 등에 따라 일당 증체량은 변이를 나타냈다.

하지만 실험 기간 밀웜 시제품을 급여한 실험구의 사료요구율이 1.25로 급여하지 않은 대조구의 사료요구율의 1.69 대비 현저하게 우수한 결과를 나타냈다.

이는, 무작위로 배치한 자돈을 동일한 환경에서 동일한 사료를 급여하였음에도 불구하고, 본 발명 밀웜 시제품과 탈지/탈키틴 밀웜을 급여한 자돈이 더욱 빠르게 성장함을 보임으로써 본 발명의 기능성을 확인할 수 있었다.

경제성 측면을 분석하자면, 실험에 사용된 이유자돈용 3호 사료는 kg에 1,025원이며, 탈지/탈키틴 밀웜을 2% 첨가 시 kg에 100원만 상승하는데 그쳤고, 한편 밀웜 첨가에 따라 사료요구율이 현저히 개선되므로, 실제 사용농가에서 밀웜을 급여함에 따라 상당한 경재적 잉익을 향유할 수 있을 것으로 판단되었다.

실험을 수행한 양동농장의 종사자들의 정성적인 평가에 따르면, 본 실험기간 동안 실험구에서 미약돈/폐사돈이 전혀 발생하지 않았으며, 체격이 커지고 피모의 윤기를 롸ㄱ인할 수 있었다고 함. 이는 밀웜 급여에 따라 체격향상, 면역력 향상, 체질개선 등의 효과가 예상되는 결과이다.

해당 실험 기간, 항생제를 전혀 사용하지 않고도 실험 동물의 건강/면역 관련 문제가 나타나지 않았기에, 사료용은 물론 치료용 항생제의 대체 효과가 잇다고 판단되었고, 구체적인 사양실험 설게 및 결과는 하기 표 6과 같다.

밀웜을 활용한 사양실험 결과(Certificate of Analysis) 단위: kg

구분	대조구	1처리구(밀웜 + 생균제 2% 첨가)	1처리구(밀웜 단독 2% 첨가)
시험두수	35두	35두	35두
개시총체중 개치 세중(두당)	270 7.71	261 7.46	245 7.00
종료 총 체중 종료 체중(두당)	415 11.36	441 12.60	416 11.39
총 사료급여량 사료급여량(두당)	245 7.00	225 6.43	225 6.43
총 증체량 증체량(두당)	145 4.14	180 5.14	171 4.89
일당증체량(g) 사료요구율	197.28 1.69	244.90 1.25	232.65 1.32

주) 실험명: 밀원을 활용한 이유자돈 사양실험

실험장소: 충청남도 홍성군 정일농장

실험기간 2019년 6월 7일 ∼ 28일(21일간)

실헌동물: 23일령 이유자돈 105두(35두 × 3)

체중측정방법: 돈군별 전자저울을 활용한 체중 측정

실시예 3

(알긴산 추출 미역 부산물 제조)

콘크리트 트렌치 사일로에 미역 원료를 겹치지 않게 잘 펴서 널은 후 태양광에 48 시간 건조한 후 무작위로 3곳에서 원료의 샘플을 채취하여 수분을 측정하였다.

태양 건조한 원료를 시간 당 500kg 분쇄 능력의 Pin Mill에 투입하여 분쇄하였고, 분쇄 후 입자의 크기는 가로 0.5 cm, 세로 0.5 cm 수준이었으나, 입자의 모양과 크기는 균일하지 않았다.

분쇄한 원료를 직경 1.2m, 길이 12m의 로터리 킬른(원통형 열풍 건조기)에서 4시간 건조 후 원료 샘플을 채취하여 수분을 측정하였다. 열풍 건조 후 원료를 시간 당 5톤 분쇄 능력의 Hammer Mill에 투입하여 미립 분쇄하였고, 태양 건조와 열풍 건조를 거쳐 원물의 수분이 12% 수준으로 낮아져 사료용 원료로 사용 가능한 수준이 되었다.

2회에 걸친 분쇄 과정을 통해 사료용 원료로 사용 가능한 균일한 입자도를 가진 제품 생산이 가능하였고, 미역의 불가식 부위를 건조하고 분쇄하는 본 실험을 통해 미역 원료의 수분을 88%에서 12%로 낮추고 입자도를 미립분말로 제형화하는데 성공하였다. 제형화된 분말은 사료 및 사료첨가제의 원료로 사용하기에 적절한 것으로 판단되었다.

하지만 건조 과정 상 과도한 인력이 소요되고, 알긴산의 점착력으로 인해 기계에 원료가 흡착되어 생산성이 현저히 낮아지는 문제점이 발견되었다.

실시예 4

(알긴산 추출 미역 부산물의 제형화)

중국 강소성 감위현의 알긴산 가공 공장에서 알긴산을 추출하고 남은 미역 부산물 용액을 수거하여 동 공장의 부산물 처리 지역으로 이동시킨 후, 원심분리 후 산화칼슘을 용액 중량의 5 ∼ 10% 추가하여 발열 건조한 원료를 사용하였다.

이 과정을 통해 반건조된 미역부산물 원료를 수거하여 동 지역의 건조공장과 주관기관의 공장으로 이동하여, 무작위로 3곳에서 원료를 채취하여 수분을 측정하였다.

원료를 2 그룹으로 나누어, 첫 번째 그룹은 원료를 1톤 용량 페이로더를 이용하여 콘크리트 트렌치 사일로 지면 상에 두께 3 ∼ 5cm 수준으로 얇게 도포한 후 오전 11시와 오후 15시에 원료를 뒤집어 주었으며, 이 후 태양건조를 72시간 진행하였다.

두 번째 그룹은 직경 1.2m, 길이 12m의 로터리 킬른(원통형 열풍 건조기)에 원료를 투입하여 4시간 건조하였고, 건조 과정 중 응결된 덩어리를 시간 당 5톤 분쇄 능력의 Hammer Mill에 투입하여 미립분쇄하였고, 미립분쇄한 원료를 200마력 펠릿 성형기룰 사용하여 직경 8mm로 성형하였다.

수분의 변화 추이

원물 (반건조 용액)	태양건조 72시간	열풍 건조 4시간
46%	14%	13%

태양 건조를 한 1 그룹과 열풍 건조를 한 2 그룹 모두 수분이 14% 이하로 낮아져 사료용 원료로 사용 가능한 수준이 되었다.

입자도 변화 추이

원물 (반건조 용액)	건조	Hammer mill 분쇄
걸쭉한 죽 형태	최대 직경 7cm 수준의 덩어리와 가루 형태가 혼재	가로 0.1cm, 세로 0.1cm

건조 과정 중 미역에 함유된 알긴에 의해 원료가 스스로 뭉쳐 큰 덩어리를 형성하는 경우가 있었으며, 이를 사료용 원료로 사용하기 위해 분쇄과정을 거쳐 사료용 원료로 사용 가능한 균일한 입자도를 가진 제품 생산이 가능하였다.

태양 건조 과정 중 지속적으로 상하를 뒤집지 않으면 하부 원료 건조가 부진하였으며, 펠릿 과정 중 알긴산의 강한 결착력으로 인해 펠릿 성형기의 온도가 급격히 상승하였고, 이로 인해 펠릿 외부에 불에 탄 자국이 일부 발생하였으며, 이는 추가 실험에서 유화제를 1.5% 첨가함으로써 상당 부분 해결할 수 있었다.

본 실험에서는 반건조 상태의 원료를 사용하여 건조 시간과 비용을 절약할 수 있었고, 알긴산 추출 후에도 알긴산을 포함한 미역 유효물질이 대부분 잔류하므로 공정 편의 및 경제성을 고려할 때 미역 원물을 가공하는 것에 비해 유리한 제형화 방법으로 판단되었다.

먼저 미역 원물의 경우 미역 불가식 부위 특유의 두껍고 질긴 섬유질로 인해 분쇄가 어려웠고, 따라서 특수 분쇄기인 Pin mill을 사용하여 분쇄했으나 일반 분쇄기인 Hammer mill에 비해 분쇄 효율이 떨어졌다. 또한 미역 원물을 분쇄한 후 로터리킬른을 이용한 열풍 건조를 실시했을 때, 미역의 알긴산 성분으로 인해 원료가 로터리킬른의 벽에 흡착되는 현상을 보였으며, 이는 생산성 하락의 원인이 되었다.

한편, 건조 과정 중에 미역은 흑갈변함과 동시에 풍미가 거의 사라지게 되었고, 이는 최종 소비자의 선호도를 하락시킬 것으로 예상되며, 또한 해조류의 알긴산 성분이 공기 중 수분을 흡착하고 보습하는 성질을 지녀 비록 건조된 분말이더라도 공기 중 노출 시 점점 수분이 높아지는 현상을 보였다.

이 문제의 해결을 위해 건조 분말에 스팀을 추가하여 펠릿으로 성형한 결과, 스팀 첨가가 미역 원물의 색상과 풍미가 재현하는 효과를 보였고, 펠릿의 단단한 외벽이 수분의 침투를 막아 건조 상태를 장기간 유지함을 확인할 수 있었다.

이를 통해, 알긴산 추출 미역 부산물을 원료로 태양 건조 및 미립 분쇄한 후 펠레팅하는 것이 제품의 정성적 기호도와 경제성 및 유통 안정성을 모두 만족하는 것으로 판정되었다(도 15a, 도 15b, 도 15c 참조).

<사양실험 2>

미역 부산물을 활용한 젖소 사양실험 내용 및 결과

1). 실험설계

홀스타인 착유우 34두를 각 17두씩 2처리구로 할당하여 실험구(실험사료 2% 첨가구)와 대조구(미첨가구)로 나누어 경기도 화성시 환이목장에서 4주간 시험을 진행하였다.

모든 착유우는 Free stall에서 사육되었으며 수원축협 TMR사료를 급여하였다. 사료의 급여는 1일 2회로 나누어 자유채식하도록 설계하였고, 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.

실험구는 일일 급여사료의 2% 수준(400g)을 TMR사료에 별도 첨가하여 혼합하여 급식하였다. 산유량과 체세포 수준은 매일 착유우별로 측정하였으며, 실험기간 중 건강상태, 섭취상태, 폐사율을 수시로 검사하였다.

2).실험결과

홀스타인 젖소는 품종의 특성 상 고온스트레스에 가장 취약한 가축 중 하나로서, 고온 및 강수량이 많은 환경에서 건강 상 문제 및 산유량이 감소될 우려가 있었고, 본 실험을 개시한 후 3일째 되는 날 실험 농장의 일부 젖소에서 설사 및 산유량 감소 현상이 나타나 본 연구진은 실험을 잠정 중단하였다.

이 현상은 미역시제품을 급여한 실험군 뿐만 아니라 급여하지 않은 대조군에서도 동일하게 발생된 점으로 보아, 미역시제품으로 인한 문제는 아닌 것으로 판단되었다.

실험 4일차 고온스트레스(추정)으로 인한 젖소 농장 건강 모니터링 결과

	반추활동 감소	유량감소	체세포 증가
실험군	5	4	1
대조군	3	4	1

실험 4일차 고온스트레스(추정)으로 인한 유량 및 체세포 경고

	체세포 증가	유량 감소
실험군	2	2
대조군	4	4

한편, 실험기간이 너무 짧아 본 발명 시제품의 습여에 따른 결과로 판단할 수는 없으나, 실험 기간 중 산유량은 아래표와 같이 실험군과 대조군 공히 본 발명 과제의 목표인 일당 산유량 30kg을 초과했으며, 실험군이 소폭 높음을 볼 수 있었다.

실험기간 중 젖소의 산유량

산유량(kg/en/일)	1일차	3일차	6일차		평균
실험군	33.8	34.5	34.2		34.2
대조군	33.0	32.9	33.1		33.0

Claims (8)

1. 갈색거저리를 건조 분말화하는 갈색거저리 분말화공정(S1단계)와; 상기 갈색거저리 분말화공정을 통해 얻은 갈색거저리 분말을 탈지 탈키틴 처리하여 탈지 탈키틴된 갈색거저리를 얻는 갈색거저리 탈지 탈키틴공정(S2단계)와; 상기 탈지 탈키틴된 갈색거저리에 항산화제로서 Vitamin C 0.05 ∼ 0.5%를 혼합 밀봉하여 프리바이오틱스를 얻는 항산화제 혼합공정(S3단계)와; 상기에서 얻은 프리바이오틱스를 키틴분해 자화성 Bacillus thuringien sis T3와 효모를 함께 고체 배지에 접종 발효하여 발효물을 얻는 접종 발효공정(S4단계) 및; 상기에서 얻은 발효물에 Lactobacil lus plantarum 및 Pediococcus acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가 혼합하는 혼합공정(S5단계)로 이루어진 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 갈색거저리 분말화공정(S1단계)에서 갈색거저리에 마이크로웨이브(Microwave)를 조사하여 수분의 함량을 8% 이하로 건조하는 것을 특징으로 하는 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 갈색거저리 탈지 탈키틴공정(S2단계)에서 지방 함량을 6% 이하로 탈지하는 것을 특징으로 하는 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법.
4. 채취한 미역부산물을 콘크리트 트렌치 사일로에 널은 후 태양광에 건조한 후 분쇄하는 미역 1차분말화공정(S11단계)와; 상기 분쇄한 미역 원료를 로터리 킬른(원통형 열풍 건조기)에서 넣어 건조한 후 Hammer Mill에 투입하여 미립 분쇄하는 미역 2차분말화공정(S12단계)와; 상기 미역 2차분말화공정을 거친 분말 미역에 항산화제로서 Vitamin C 0.1%를 혼합 밀봉하여 프리바이오틱스(prebiotics)를 얻는 항산화제 혼합공정(S13단계)와; 상기에서 얻은 프리바이오틱스(prebiotics)를 0.9 ∼ 1.6% 유화제와 0.08 ∼ 0.7% 효모와 함께 고체 배지에 접종 발효하는 발효물을 얻는 접종 발효공정(S14단계) 및; 상기에서 얻은 발효물에 Lactobacil lus plantarum 및 Pediococcus acidlactici 복합유산균 생균제를 첨가 혼합하는 혼합공정(S15단계)로 이루어진 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 미역 1차분말화공정(S11단계)에서 콘크리트 트렌치 사일로에 미역 원료를 겹치지 않게 잘 펴서 널은 후 태양광에 48 시간 건조한 후 Pin Mill에 투입하여 분쇄하여 분쇄 후 입자의 크기가 가로 0.5 cm, 세로 0.5 cm 인 것을 특징으로 하는 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 미역 2차분말화공정(S12단계)에서 분쇄한 원료를 직경 1.2m, 길이 12m의 로터리 킬른(원통형 열풍 건조기)에서 4시간 건조 후 Hammer Mill에 투입하여 분말화하여 분말의 수분 함량이 12% 이하인 것을 특징으로 하는 항생제 대체용 동물 사료첨가제 제조방법.
7. 삭제
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 항생제 대체용 동물 사료첨가제.

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