KR102354126B1 - 스트렙토코쿠스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주, 이를 이용하여 제조된 발효물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P) 배양액의 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

스트렙토코쿠스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물{Streptococcus thermophilus_Breezytail_AIR21 and Fermented Product Manufactured Using Thereof}

본 발명은 항알러지 및 반려동물 피부 개선 활성을 갖는 신규의 스트렙토코쿠스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물에 관한 것이다.

피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 사람은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성 물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적 및 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어 있고, 각질세포(keratinocyte)와는 분화하여 떨어져 있다. 상기 표피는, 일명 "벽돌과 몰탈 구조"라고 불리는 형태를 띄고 있다. 피부 조직은 계속적인 자가회복과정을 거치는데, 분화과정의 마지막을 거친 인설(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.

한편, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria)이라고 한다. 유산균은 장내에 서식하면서 인체의 소화계와 공생을 하며 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 또한, 장내 환경을 산성으로 유지시킴으로 유해세균의 성장을 억제하고 설사 및 변비 개선, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저해 등의 역할을 한다. 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 주며, 대식세포 및 비장의 활성을 증진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, 면역 조절 기능도 가지고 있어 아토피 및 알러지 관련 질환에 효과가 있다.

화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트랩토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

그 중에서도 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-2173646호「피부 유래 스트렙토코쿠스 살리바리우스 sbk4 신균주 및 이를 이용한 기능성 화장료 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-2154927호「클로로겐산, 페롤산, 라스베라트롤 및 스트렙토코쿠스 테르모필루스 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 기능성화장료 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-0926047호「아토피성 피부염 개선제 조성물」등이 개시되어 있다.

피부 생태환경을 다시 살펴보면, 물리적인 요소들과 생물학적인 요소들이 잘 어우러져 다양한 서식처를 제공하며, 더 나아가 사람과 미생물 사이의 미묘한 균형에 대해 생각해 볼 수 있을 것이다. 공생관계의 균형이 무너지게 되면 그와 동시에 피부의 붕괴와 감염이 발생하게 된다.

이에, 본 발명자들은 반려동물의 피부에서 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)를 분리 동정하였고, 이를 이용하여 MRS 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 발효물을 제조할 경우, 반려동물의 유해한 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-2173646호 대한민국 등록특허공보 제10-2154927호 대한민국 등록특허공보 제10-0926047호

본 발명의 목적은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 균주를 효능활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법 및 이로부터 제조된 발효물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 균주의 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 갖는 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 반려동물 피부 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)를 효능활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 Maltose 및 Glutamine을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 배양은 35 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)로 발효된 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 갖는 스트렙토코투스 테르모필루스Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P) 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.

본 발명으로부터 제공되는 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P) 발효물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1은 본 발명에 따른 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)을 피부에 처리하였을 시 S. aureus의 감소, 유산균의 증대 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P) 발효물의 항알러지 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4은 본 발명에 따른 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P) 발효물의 피부장벽강화 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5은 본 발명에 따른 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P) 발효물의 보습 효과 결과를 나타낸 그래프이다.

이에, 본 발명에서는 반려동물로 부터 분리된 미생물로부터 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 갖는 균주를 스크리닝하여 우수한 균주를 선발하고, 16s rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 스트렙토코투스 테르모필루스와 유사한 염기서열을 가진 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주로 명명하고 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하여 기탁번호 KCCM13005P를 부여받았다.

따라서, 본 발명은 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)(이하 'Breezytail_AIR21'로 약칭함)에 관한 것이다.

이때, 상기 Breezytail_AIR21 균주는 반려동물에서 유래한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 Breezytail_AIR21 균주를 효능활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 배양에 사용되는 배지는 Maltose 및 Glutamine을 포함하는 것을 특징으로 한다. 그 중에서도 MRS 배지(proteose peptone No.3 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, dextrose 20g, Polyoxyethylene sorbitan monooleate 1g, ammonium citrate 2g, maganessium sulfate 0.1g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g/L, pH 6.5)을 기본으로하여 Maltose 0.5g/L, Glutamin 0.25g/L를 추가시킨 배지를 사용하여 발효 된 것이 발효물의 수율을 가장 효과적으로 향상 시키고 항알러지 및 마이크로바이옴 변화를 그대화 시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.

상기 Breezytail_AIR21 균주를 Maltose 및 Glutamine이 첨가 된 MRS 액체배지에 1.0x10⁷ 내지 1.0x10⁹의 세균수가 되도록 하여 1~3% 수준으로 접종하고, 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 정치 배양을 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도 (S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

상기와 같이, 배양된 균주를 pH 4.0~5.0 조건에서 여과한 다음, 상기 여과된 균주를 20~30℃에서 7일 동안 배양하여 발효물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)의 발효물이 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과가 있어 화장료 조성물로서의 효과가 매우 우수하다.

따라서, 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)로 발효된 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.

본 발명의 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome)변화유도 (S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습, 피부장벽강화 효과용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 발효물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome)변화유도 (S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주의 분리

생후 12개월 된 말티즈 강아지 등부위 피부를 거즈로 스왑하여 하여 MRS 배지에 진탕한 후 이를 10^-4배(부피)로 희석한 샘플 0.1mL을 MRS 한천배지(Peptospecial 10 g, beef extract 10g, yeast extract 5g, Glucose 20g, Triammonium Citrate 2g, sodium acetate 5g, maganessium sulfate 0.2g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, Agar 15g, Tween80 1g/L, pH 6.2±0.2, MBcell(Cat.No. MB-M1025))에 도말하여 혐기성 인큐베이터에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 형성된 집락을 순수 분리 배양하여, 24 시간 동안 혐기 인큐베이터에서 재배양한 후 형성된 단일 colony를 분리하였다. 분리된 균주들 중 피피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화가 우수한 Breezytail_AIR21 균주를 선발하였다.

<실시예 2> 선발균주 16s rRNA 염기서열 분석

최종 선발된 Breezytail_AIR21 균주의 gDNA와 Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')를 이용하여 16s DNA 염기서열 분석을 통하여 스트렙토코투스 테르모필루스(Streptococcus thermophillus)와 상동성이 높은 균주인 것으로 확인하였으며, 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(서열번호 3)로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하고, 수탁번호 KCCM13005P를 부여받았다.

<실시예 3> Breezytail_AIR21 균주의 발효물 제조

분리된 Breezytail_AIR21 균주의 발효물을 제조하기 위해 MRS 배지에 Maltose 및 Glutamine을 첨가하여 제조한 후 Breezytail_AIR21균주를 1.0x10⁹의 균수가 되도록 하여 1% 접종하였다. 접종 후 혐기상태가 유지되도록 산소공급은 없으며, 정치배양을 37℃에서 120시간 동안 실시하였다. 배양을 마치고 pH가 4.0(오차 0.2)으로 형성되는지 확인한 뒤, 육안상으로 짙은 갈색인 것이 확인되면 배양을 마치고 0.2㎛필터(밀리포어) 제균을 실시하였다. 필터가 완료되면 상온에서 1주간 숙성기간을 거쳐 Breezytail_AIR21 균주의 발효물을 제조하였다.

<비교예 1> Breezytail_AIR21균주의 MRS 일반 배지활용 발효물 제조

분리된 Breezytail_AIR21 균주의 일반 배지를 활용한 발효물을 제조하기 위하여 일반 MRS 배지만을 활용하고 Maltose 및 Glutamine을 첨가하지 않은 것을 제외하면 <실시예 3>과 동일한 방법으로 비교예 1을 제조하였다.

<실험예 1> Skin-Microbiome 샘플채집

본 실험에 사용된 샘플은 지에프씨생명과학 연구소에서 견주에게 사전동의를 얻은 개을 대상으로 실험을 실시하였다. 시험에 사용된 프로바이오틱스(Probiotics)로는 Breezytail_AIR21 균주의 발효물을 사용하였으며, 배양 후 균체를 제거한 배양액을 개의 등 부분에 적용시켜 총 72시간 동안 피부샘플을 채집하여 분석에 사용하였으며 채집방법은 코튼스왑 방법을 이용하였으며 거즈를 이용하여 스크럽하여 피부샘플을 채취하였다. 피부상재 미생물을 채취는 처리 전, 처리 후, 미처리(휴지기) 및 재처리 그룹으로 이루어졌다.

피부 샘플 채집은 참고문헌을 바탕으로 멸균수와 스크래퍼를 이용하여 채집하였으며, 모든 작업은 clean bench 내에서 실시되었다. 본 연구는 IRB 심의기준에서 면제사유에 해당되는 것으로 확인하였다.

<실험예 2> 피부 상재 미생물의 genomic DNA 추출 및 DNA 증폭

피부로부터 채집된 샘플을 0.85% NaCl에 현탁한 상등액을 원심분리(17,000 rpm/m)하여 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 1회 세척한 후, FastDNA SPIN KIT(MP Biomedical, France)를 사용하여 DNA를 추출하였다.

<실험예 3> NGS 분석을 통한 피부 상재균 16s metagenome 분석

추출된 DNA를 이용하여 균총의 분석을 위하여 16s metagenome 분석을 수행하였다. NGS 분석에는 Thermofisher의 Ion torrent S5 Plus system과 16s metagenome kit를 사용하였다. 분석 되어진 16s metagenome sequence는 Thermofisher의 ion repoter DB 및 software를 이용하여 분석 후 도식화 하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, Breezytail_AIR21 균주 발효물 처리에 의존하여 대표 유해균주인 S. aureus의 감소 및 유익균주인 유산균의 증대를 확인하였다. 따라서, Breezytail_AIR21 균주 발효물 처리에 의존하여 유익한 피부상재균의 증대를 확인하였다.

<실험예 4> 항알러지시험: 히스타민 저해 활성

베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 비만세포의 과립을 구성하는 물질로서, 비만세포의 탈 과립에 의한 히스타민 분비는 베타-헥소사미니다제 방출량에 비례한다. 따라서, 더덕 사포닌 분획의 탈과립 및 히스타민 분비억제효과를 랫트의 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 베타-헥소사미니다제의 방출량을 측정함으로써확인하였다. RBL-2H3 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 24 well plate에 각 well당 2X10⁵개의 세포를 분주한 다음, 각 well당 0.5 μg/ml DNP-IgE로 감작시킨 후 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 이후 각well의 세포들을 Siraganian 완충액(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 40mM NaOH, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)으로 2번 세척한 다음 37℃에서 10분간 Siraganian 완충액으로 전 반응시키고, 시험물질을 첨가한 후 10분간 다시 반응시켰다. 이후 세포를 37℃에서 30분간 항원(DNP-BSA, 10 μg/ml)을 처리하여 탈 과립상태로 만든 후, 얼음에서 10분간 두어 반응을 종결시키고, 상층액 20 μl를 취해 96well plate에 옮긴 후 1mM p-nitrophenyl-N-acetyl- β-D-glucosaminide를 넣고 1시간 동안 배양시킨 다음stop solution (0.1 M Na2CO3/NaHCO3)을 넣은 다음 ELISA로 흡광도 405 nm에서 측정하여 정량하였다.

도 3은 본 발명의 실시예 3에서 제조된 발효물 및 비교예 1에서 제조된 발효물에 대한 히스타민 억제 활성 결과를 도시한 것이다.

그 결과, 비교예 1 대비 실시예 3에서 수득한 발효물에서 히스타민 저해능이 현저하게 우수하였으며 농도의존적으로 향상되어 자극완화 효과가 우수함을 확인하였다.

<실험예 5> 항염 효능 시험 : Nitric Oxide(NO)를 억제 활성

실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 이용하여 항염증 활성 효과를 확인하기 위해 니트릭 옥사이드(Nitric oxide)를 억제하는 정도를 측정하였다.

대식세포의 일종인 RAW 264.7 cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신 및 10% FBS(fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24Well plate에 1.0x10⁴ cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 RAW 264.7 cell에 실시예 3 및 비교예 1을 50(㎍/㎖) 농도로 배지와 혼합 후, 각 Well에 1ml씩 첨가하고 37℃ 및 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 24시간 반응시켰다. 이때, NO를 발현시키는 염증유발인자인 LPS(Lipo poly saccharide)를 1㎍/㎖의 농도로 같이 처리하고 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 각 well의 상등액 만을 따로 취한 뒤 각 Well에 Nitric Oxide detection kit를 이용하여 배양액 중 100㎖ 를 96 Well plate에 취하고 Griess reagent A(N-1-Naphthylethylenediamine (NEDHC)) 50㎕ 및 Griess reagent B(Sulfanilamide) 50㎕를 각각 넣어준 뒤 각각 10 분 동안 반응시킨 뒤, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.

구분	NO 생성농도(μM)
양성대조군	12.10.98
음성대조군	81.01.02
실시예 3	17.70.86
비교예 1	43.50.88

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 실시예 3은 비교예 1 대비 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성농도가 낮은 것으로 확인되어 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.

이러한 결과는 Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P) 발효물에 항염 효과가 있다는 것을 의미한다.

<실험예 6> 항균 효능 시험 : MIC 테스트

실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 이용하여 항균 활성 정도를 확인하였다.

1. 평가 배지의 준비

평가 방법으로 원형여과지법(Paper disc method)을 이용하였으며, 항균 활성 평가에는 유해한 표준시험균주(식약처 및 MIC test guide line)인 대장균(Escherichia coli, ATCC 8739), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus, ATCC 6538P), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027), 칸디다 알비칸스(Candida albicans, ATCC 10231)를 한국미생물자원센터(KCTC, Korea) 및 한국미생물보존센터(KCCM, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. 상기 표준시험균주 중 대장균, 황색 포도상구균 및 녹농균의 배양에는 TSA 배지(Tryptic Soy Agar) 배지를 사용하였으며, 칸디다 알비칸스의 배양에는 YM 배지(Yeast extract Media) 배지를 사용하였다.

2. MIC 테스트

121℃에서 15분간 멸균한 독립적인 영양배지(Nutrient Broth)를 준비한 후, 각 표준 시험균주를 3X10⁵cfu/㎖의 양으로 접종하였다. 실시예 3 및 비교예 1을 대표적으로 시험 농도 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 0.0625%, 0.03125%, 0.015625%, 0.0078125% 농도로 맞추고, 시험 균주의 Single colony 이용하여 접종하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 흡광도(600nm)를 측정하여 결과를 확인하였다. 미생물이 검출되지 않는 최저 농도로 항균 효과를 확인하였다.

구분(단위: %)	대장균	황색 포도상구균	녹농균	칸디다 알비칸스
실시예 3	0.125	0.125	0.125	0.25
비교예 1	0.125	0.5	0.5	-

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 실시예 3은 4개의 공시 기준시험균주(식약처 및 MIC test guide line 참조)인 대장균(Escherichia coli, ATCC 8739), 황색 포도상구균(Staphylococcusaureus, ATCC 6538P), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027), 칸디다 알비칸스(Candida albicans, ATCC 10231)에 대한 억제 효과가 비교예 1 대비하여 현저하게 높은 것이 확인되어 항균 효과가 우수한 것을 확인하였다.

<실험예 7> 피부장벽 개선 시험 : 필라그린(Filaggrin) 생성 증대 효과

실시예 3 및 과 비교예 1의 피부장벽 기능 개선효과를 측정하기 위해서 표피의 각질층 분화와 자연보습인자 형성에 중요한 역할을 하는 물질인 필라그린(Filaggrin)의 생성 증대능을 RT-PCR로 확인하였다. 인간 표피 각질형성세포(Human epidermal keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fetal bovine serum(FBS), 1% Penisilin-Streptomycin와 함께 24well에 2x10⁵/well로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 인간 표피 각질형성세포가 80% 이상 Confluence될 때 Serum-free medium을 바꿔 배양한 뒤, 실시예 3 및 비교예 1의 샘플을 농도별로 각각 세포에 처리하였다. 그 후 24시간 추가 배양하여 필라그린(Filaggrin) 유전자 발현을 Real-time PCR법으로 확인하였다. RNA isolation과 cDNA 합성은 Nucleospin RNA(Cat.no MN740955-50)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 DBPS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)으로 세척하고, Nucleospin RNA 매뉴얼에 따라 RNA Isolation 하였다. 분리된 RNA를 cDNA Synthesis kit(Gendepot)을 사용하여 합성한 뒤, 필라그린(Filaggrin) 유전자 발현을 분석하기 위하여 합성된 cDNA를 Template로 하여 2X IQ Sybr Green SuperMIX(Bio-Rad)를 사용하여 진행하였다. 발현율은 Housekeeping genes(beta-actin)으로 Normalization하였다. qRT-PCR 조건은 Polymerase activation과 DNA denaturation은 95℃에서 3분 동안 수행하고, Amplication은 94℃에서 15초 동안 수행하고, Denaturation, Annealingdms은 62℃에서 30초 동안 수행하고, Extension은 72℃에서 30초의 조건에서 30 cycle 수행하였다. 필라그린(Filaggrin)의 RT-PCR에 사용한 프라이머는 서열번호 4: For(5'- GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAG-3')와 서열번호 5: Revers(5'- GCCAACTTGAATACCATCAGAAG-3')이고, 베타-액틴의 qRT-PCR에 사용한 프라이머는 서열번호 6: For(5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3')와 서열번호 7: Revers(5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3')와 같다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 비교예 1은 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능이 확인되지 않았다. 반면, 실시예 3의 발효물 1% 처리 시 필라그린(Filaggrin) 생성 증대능이 202%를 나타내었다. 따라서, 비교예 1 대비 실시예 3의 발효 조건에 의해 피부장벽의 기능이 상승된 것을 확인하였다.

<실시예 8> 보습 효능 시험 : 아쿠아포린(Aguaporin) 생성 증대 효과

실시예 3 및 비교예 1의 보습 효능을 측정하기 위해서 세포 내에 물의 출입을 조절하는 막이동 단백질인 아쿠아포린(Aquaporin)의 생성 증대능을 Western blot 시험으로 확인하였다. 사람 유래의 각질형성세포인 HaCaT 세포를 10% Fetal bovin serum(FBS) 및 1% Penicillin/streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 배양된 HaCaT 세포를 100mm plate에 1.2ㅧ10⁶개의 농도로 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하여 Plate에 부착시켰다. 24시간 뒤, FBS가 함유되지 않은 Serum free media로 교체하여 24시간 배양하였다. 그 뒤, 실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 농도별로 함유된 Media를 처리하여 배양기에서 3시간 배양한 다음, 세포를 회수하여 RIPA buffer 50㎕로 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 BCA assay를 통해 단백질을 정량하였다. 각각의 시료의 단백질량을 25㎍으로 희석한 후 8% SDS gel에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 PVDF membrane으로 옮긴 다음, 5% Bovine serum albumin 용액으로 Blocking을 실시하였다. 1차 항체(Rabbit anti-aquaporin 3 antibody)와 Overnight으로 반응시킨 다음, TBS-T buffer로 남은 항체를 세척하여 제거한 후 2차 항체(Goat anti-rabbit IgG-HRP)와 반응시켰다. 남은 항체를 제거한 후 발색 반응을 일으키는 ECL 용액을 Membrane에 처리한 후 ChemiDoc gel imaging system을 통해 촬영하여 Image Lab 프로그램을 통해 수치화하였다. 이때, 양성 대조군으로 Retinoic acid를 사용하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 비교예 1은 보습인자인 아쿠아포린(Aquaporin) 생성 증대능이 확인되지 않았다. 반면, 실시예 3은 0.5% 처리 시 아쿠아포린(Aquaporin) 생성 증대능이 105.34%을 나타내었고, 1% 처리 시 아쿠아포린(Aquaporin) 생성 증대능이 150.92%을 나타내었다. 따라서, 비교예 1 대비 실시예 3의 발효 조건에 의해 보습효과가 상승된 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM) KCCM12750P 20210609

<110> Breezytail Inc. <120> Streptococcus thermophilus_Breezytail_AIR21 and Fermented Product Manufactured Using Thereof <130> p21063 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus thermophillus_Breezytail_AIR21 <400> 3 cccagcgctg caactgcagt agaagctgaa agaggagctt gctcttcttg gatgagttgc 60 gaacgggtga gtaacgcgta ggtaacctgc cttgtagcgg gggataacta ttggaaacga 120 tagctaatac cgcataacaa tggatgacac atgtcattta tttgaaaggg gcaattgctc 180 cactacaaga tggacctgcg ttgtattagc tagtaggtga ggtaatggct cacctaggcg 240 acgatacata gccaacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 300 ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt cggcaatggg ggcaaccctg accgagcaac 360 gccgcgtgag tgaagaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgtaagtca agaacgggtg 420 tgagagtgga aagttcacac tgtgacggta gcttaccaga aagggacggc taactacgtg 480 ccagcagccg cggtaatacg taggtcccga gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg 540 agcgcaggcg gtttgataag tctgaagtta aaggctgtgg ctcaaccata gttcgctttg 600 gaaactgtca aacttgagtg cagaagggga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg 660 cgtagatata tggaggaaca ccggtggcga aagcggctct ctggtctgta actgacgctg 720 aggctcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780 atgagtgcta ggtgttggat cctttccggg attcagtgcc gcagctaacg cattaagcac 840 tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900 agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960 cccgatgcta tttctagaga tagaaagtta cttcggtaca tcggtgacag gtggtgcatg 1020 gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta 1080 ttgttagttg ccatcattca gttgggcact ctagcgagac tgccggtaat aaaccggagg 1140 aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200 atggttggta caacgagttg cgagtcggtg acggcgagct aatctcttaa agccaatctc 1260 agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat 1320 cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380 gtttgtaaca cccgaagtcg ggaggtaacc tttgagccgc cgctaaggac gg 1432 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin primer For <400> 4 gctgaaggaa cttctggaaa ag 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Filaggrin primer Revers <400> 5 gctgaaggaa cttctggaaa ag 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer For <400> 6 gtggggcgcc ccaggcacca 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer Revers <400> 7 ctccttaatg tcacgcacga ttc 23

Claims (7)

1. 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 감소, 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과를 갖는 신규한 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 반려동물의 피부 유래인 것을 특징으로 하는 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P).
   
3. 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)를 Maltose 및 glutamine이 포함된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 배양은 35 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법.
   
5. Maltose 및 Glutamine이 포함된 배지에 스트렙토코투스 테르모필루스_Breezytail_AIR21 균주(기탁번호:KCCM13005P)로 발효된 발효물.
   
6. 제5항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 감소, 항염증, 항알러지, 보습 및 피부장벽강화 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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