KR102226187B1

KR102226187B1 - 락토바실러스 이너스 ahc2030 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물

Info

Publication number: KR102226187B1
Application number: KR1020200121904A
Authority: KR
Inventors: 민진우; 정연선; 윤현주; 김지영; 강희철
Original assignee: (주)지에프씨생명과학
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2021-03-10

Abstract

본 발명은 락토바실러스 이너스 AHC2030 균주, 이를 이용하여 제조된 발효물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호KCCM1275OP) 배양액의 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

락토바실러스 이너스 AHC2030 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물{Lactobacillus iners AHC2030 and Fermented Product Manufactured Using Thereof}

본 발명은 락토바실러스 이너스 AHC2030 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물에 관한 것이다.

피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 사람은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성 물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적 및 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어 있고, 각질세포(keratinocyte)와는 분화하여 떨어져 있다. 상기 표피는, 일명 "벽돌과 몰탈 구조"라고 불리는 형태를 띄고 있다. 피부 조직은 계속적인 자가회복과정을 거치는데, 분화과정의 마지막을 거친 인설(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.

한편, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria)이라고 한다. 유산균은 장내에 서식하면서 인체의 소화계와 공생을 하며 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 또한, 장내 환경을 산성으로 유지시킴으로 유해세균의 성장을 억제하고 설사 및 변비 개선, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저해 등의 역할을 한다. 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 주며, 대식세포 및 비장의 활성을 증진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, 면역 조절 기능도 가지고 있어 아토피 및 알러지 관련 질환에 효과가 있다.

화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트랩토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

그 중에서도 락토바실러스(Lactobacillus) 속을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1846796호「한국형 유산균으로 발효하여 얻은 유청을 포함하는 탄력 개선 또는 보습용 화장품」, 대한민국 등록특허공보 제10-1492003호「피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 플란타룸 HY7714 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품」 및 대한민국 등록특허공보 제 10-1998067호 「비피도박테리움 속 GFC-B09 및 이를 이용하여 제조된 발효물」등이 개시되어 있다.

피부 생태환경을 다시 살펴보면, 물리적인 요소들과 생물학적인 요소들이 잘 어우러져 다양한 서식처를 제공하며, 더 나아가 사람과 미생물 사이의 미묘한 균형에 대해 생각해 볼 수 있을 것이다. 공생관계의 균형이 무너지게 되면 그와 동시에 피부의 붕괴와 감염이 발생하게 된다.

이에, 본 발명자들은 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P)를 분리 동정하였고, 이를 이용하여 MRS 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 발효물을 제조할 경우, 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1846796호 대한민국 등록특허공보 제10-1492003호 대한민국 등록특허공보 제10-1998067호

본 발명의 목적은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 균주를 효능 활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법 및 이로부터 제조된 발효물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 균주의 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부-마이크로바이옴피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 인체 피부 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P)를 효능활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 Maltose, Lactose, Glycine 및 Inulin을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 배양은 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P)로 발효된 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부-마이크로바이옴피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.

본 발명으로부터 제공되는 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P) 발효물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주의 발효물을 피부에 처리하였을 시 큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P) 발효물의 항산화 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4은 본 발명에 따른 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P) 발효물의 항주름 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5은 본 발명에 따른 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P) 발효물의 항주름 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P) 발효물의 미백 효과 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P) 발효물의 항염 효과 결과를 나타낸 그래프이다.

이에, 본 발명에서는 20대의 여성 피부로부터 분리된 미생물로부터 피부-마이크로바이옴피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 균주를 스크리닝하여 우수한 균주를 선발하고, 16s rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners)와 유사한 염기서열을 가진 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주로 명명하고 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다.

따라서, 본 발명은 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호:KCCM12750P)(이하 'AHC2030'로 약칭함)에 관한 것이다.

이때, 상기 AHC2030 균주는 20대 여성 피부 유래한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 AHC2030 균주를 효능활성이 극대화 되게 조성된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 배양에 사용되는 배지는 Maltose, Lactose, Glycine 및 Inulin을 포함하는 것을 특징으로 한다. 그 중에서도 MRS 배지(proteose peptone No.3 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, dextrose 20g, Polyoxyethylene sorbitan monooleate 1g, ammonium citrate 2g, maganessium sulfate 0.1g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g/L, pH 6.5)을 기본으로하여 Maltose 0.5g/L, Lactose 1.0g/L, Glycine 0.5g/L, Inulin 1.0g/L를 추가시킨 배지를 사용하여 발효된 것이 발효물의 수율을 가장 효과적으로 향상 시키고 피부상재균의 변화를 그대화 시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.

상기 AHC2030 균주를 Maltose, Lactose, Glycine 및 Inulin이 첨가된 MRS 액체배지에 1.0x10⁷내지1.0x10⁹의 세균수가 되도록 하여 1~3% 수준으로 접종하고, 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 정치 배양을 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 충분한 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

상기와 같이, 배양된 균주를 pH 3.8~4.2 조건에서 여과한 다음, 상기 여과된 균주를 20~30℃에서 10~16일 동안 숙성하여 발효물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호KCCM1275OP)의 발효물이 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 있어 화장료 조성물로서의 효과가 매우 우수하다.

따라서, 본 발명은 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호KCCM12750P)로 발효된 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.

본 발명의 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 발효물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> Lactobacillus iners AHC2030 균주의 분리

20대 여성 얼굴 피부를 거즈로 스왑하여 하여 MRS 배지에 진탕한 후 이를 10^-4배(부피)로 희석한 샘플 0.1mL을 MRS 한천배지(Peptospecial 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, Glucose 20g, Triammonium Citrate 2g, sodium acetate 5g, maganessium sulfate 0.2g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, Agar 15g, Tween80 1g/L, pH 6.2±0.2, MBcell(Cat.No. MB-M1025))에 도말하여 혐기성 인큐베이터에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 형성된 집락을 순수 분리 배양하여, 24시간 동안 혐기 인큐베이터에서 재배양한 후 형성된 단일 colony를 분리하였다. 분리된 균주들 중 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(C. acne의 감소 및 S. aureus의 감소, 유산균의 증대), 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 우수한 AHC2030 균주를 선발하였다.

<실시예 2> 선발균주 16s rRNA 염기서열 분석

최종 선발된 AHC2030 균주의 gDNA와 Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')를 이용하여 16s DNA 염기서열 분석을 통하여 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners)와 상동성이 높은 균주인 것으로 확인(서열번호 3)하였으며, 락토바실러스 이너스 AHC2030 균주(Lactobacillus iners AHC2030) 균주로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하고, 수탁번호 KCCM12750P를 부여받았다.

<실시예 3> AHC2030 균주의 발효물 제조

분리된 AHC2030 균주의 발효물을 제조하기 위해 MRS 배지에 Maltose, Lactose, Glycine 및 Inulin를 첨가하여 제조한 후 AHC2030 균주를 1.0x10⁹의 균수가 되도록 하여 1% 접종하였다. 접종 후 혐기상태가 유지되도록 산소공급은 없으며, 정치배양을 37℃에서 120시간 동안 실시하였다. 배양을 마치고 pH가 4.0(오차 0.2)으로 형성되는지 확인한 뒤, 육안상으로 짙은 갈색인 것이 확인되면 배양을 마치고 0.2㎛필터(밀리포어) 제균을 실시하였다. 필터가 완료되면 상온에서 2주간 숙성기간을 거쳐 AHC2030 균주의 발효물을 제조하였다.

<비교예 1> AHC2030균주의 MRS 일반 배지활용 발효물 제조

분리된 AHC2030 균주의 일반 배지를 활용한 발효물을 제조하기 위하여 일반 MRS 배지만을 활용하고, Maltose, Lactose, Glycine 및 Inulin를 첨가하지 않은 것을 제외하면 실시예 3과 동일한 방법으로 비교예 1을 제조하였다.

<실험예 1> 피험자와 Skin-Microbiome 샘플채집

본 실험에 사용된 샘플은 지에프씨생명과학 연구소에서 사전동의를 얻은 피험자를 대상으로 실험을 실시하였다. 시험에 사용된 프로바이오틱스(Probiotics)로는 AHC2030 균주의 발효물을 사용하였으며, 배양 후 균체를 제거한 배양액을 피험자의 얼굴 피부에 적용시켜 총 72시간 동안 피부샘플을 채집하여 분석에 사용하였으며 채집방법은 코튼스왑 방법을 이용하였으며 거즈를 이용하여 스크럽하여 피부샘플을 채취하였다. 피부상재 미생물을 채취는 처리 전, 처리 후, 미처리(휴지기) 및 재처리 그룹으로 이루어졌다.

피부 샘플 채집은 참고문헌을 바탕으로 멸균수와 스크래퍼를 이용하여 채집하였으며, 모든 작업은 clean bench 내에서 실시되었다. 본 연구는 IRB 심의기준에서 면제사유에 해당되는 것으로 확인하였다.

<실험예 2> 피부 상재 미생물의 genomic DNA 추출 및 DNA 증폭

피부로부터 채집된 샘플을 0.85% NaCl에 현탁한 상등액을 원심분리(17,000 rpm/m)하여 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 1회 세척한 후, FastDNA SPIN KIT(MP Biomedical, France)를 사용하여 DNA를 추출하였다.

<실험예 3> NGS 분석을 통한 피부 상재균 16s metagenome 분석

추출된 DNA를 이용하여 균총의 분석을 위하 16s metagenome 분석을 수행하였다. NGS 분석에는 Thermofisher의 Ion torrent S5 Plus system과 16s metagenome kit를 사용하였다. 분석 되어진 16s metagenome sequence는 Thermofisher의 ion repoter DB 및 software를 이용하여 분석 후 도식화 하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, AHC2030 균주 발효물 처리에 의존하여 대표 유해균주인 큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소 및 유익균주인 유산균의 증대를 확인하였다. 따라서, AHC2030 균주 발효물 처리에 의존하여 유익한 피부상재균의 증대를 확인하였다.

<실험예 4> 항산화 시험 : DPPH radical 소거 활성

실시예 3(AHC2030 균주 발효물) 및 비교예 1의 발효물을 이용하여 항산화 효능 테스트를 진행하였다. 프리라디칼은 활성산소를 말하며, 우리가 호흡한 산소가 에너지를 만들고 물로 환원되는 과정에서 나타나는 산화력이 수 천 배나 높은 물질이다. 동식물의 체내 세포들의 대사과정에서 생성되거나 스트레스, 광자극, 세균 침투에 의해서도 발생되며, 과량의 활성산소가 체내에 존재하면 정상 세포까지 무차별 공격, 각종 질병과 노화의 주범이 된다. 또한, 외부 자극에 민감한 면역 반응을 보이는 병리적 인자로 작용하게 된다. 본 발명의 추출물이 항산화능을 나타냄으로써 염증 완화 효과를 가지는지를 DPPH의 자유라디칼 소거능으로 확인하였으며, 실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 DPPH 억제 정도를 평가하였다. 실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석한 다음, 0.1M DPPH 250㎕(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)용액을 혼합 후 30분간 4℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 각 Sample을 96Well plate에 담아 ELISA reader기를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로 아스코르브산(Ascorbic acid)를 사용하여 진행하였다.

DPPH radical 소거 활성을 확인하기 위하여 아래의 수학식 1를 이용하여 계산하였다.

[수학식 1]

자유라디칼소거능(%)=[100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)]

구분	자유라디칼소거능(%)
양성대조군	70.32±1.31
실시예 3(AHC2030 균주 발효물)	88.05±0.69
비교예 1	58.14±0.28

그 결과, 표 1 및 도 3에 나타난 바와 같이 실시예 3(AHC2030 균주 발효물)은 비교예 1 대비 DPPH 라디칼 소거능이 우수한 것을 확인하였다.

이러한 결과는 발효 과정 시 첨가되는 물질에 의하여 균주의 생장량의 차이 및 유효 postbiotics의 생성량이 달라지는 것에 기인한 효과로 판단 되었다.

<실험예 5> 항주름 효능 시험 : MMP-1 억제 및 PIP Assay

실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 이용하여 MMP-1(콜라겐분해효소) 억제와 PIP(Procollagen type 1 C-Peptide) 생성 정도를 평가하였다.

(1) MMP-1 억제

실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 주름 억제 활성을 확인하기 위하여, MMP-1에 대한 assay 실험을 진행하였다. UVA의 조사에 의하여 발현되는 MMP-1의 억제 활성을 Real-time PCR을 통하여 확인 하였으며, 샘플 처리 농도 별로 조제하여 처리함으로써 MMP-1의 억제 활성에 영향을 주는지 확인하였다.

구분	MMP-1 저해 활성(%)
양성 대조군 (EGCG)	58.03±1.42
음성 대조군	1.10±0.39
실시예3(AHC2030 균주 발효물)	72.58±0.40
비교예 1	47.36±0.65

(2) Procollagen Type Ⅰ C-peptide(PIP) Assay

실시예 3 및 비교예 1의 발효물이 시료가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 처리하고 24시간 배양 후 Procollagen TypeⅠC-peptide(PIP) kit인 96well plate에 각각 농도별로 처리한 배양액을 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 2시간동안 반응시켜 주었다. 그리고 D-PBS로 세척해준 뒤, antibody-POD conjugate solution을 각각 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 1시간동안 반응시켜주었다. 다시 D-PBS로 세척해준 뒤, substrate solution(3,3',5,5'- Tetrametylbenzidine)을 각각 100㎕씩 분주해주고 상온에서 15분간 반응시켜주었다. 15분 뒤, multi-reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

구분	PIP 생성(ng/ml)
Control	100±0.3
양성 대조군 (EGCG)	165±3.9
실시예 3(AHC2030 균주 발효물)	155±4.4
비교예 1	121±6.2

그 결과, 표 3 및 도 4~5에 나타난 바와 같이 실시예 3은 비교예 1 대비 MMP-1 저해 활성과 콜라겐 생성 활성이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 발효 과정 시 첨가되는 물질에 의하여 균주의 생장량의 차이 및 유효 postbiotics의 생성량이 달라지는 것에 기인한 효과로 판단되었다.

<실험예 6> 미백 효능 시험 : 멜라닌 생성량 측정

실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 이용하여 피부의 미백과 관련이 있는 멜라닌 생성에 미치는 효과를 확인하기 위해 멜라닌 생성량을 측정하였다.

B16F10 melanoma cell을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 60ΦPetri dish에 한 dish 당 2.0x10⁵cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 멜라닌 생성을 유도하기 위한 α-MSH 50nM과 함께 실시예 및 비교예를 각각 취하여 배지와 혼합하여 분주하고 60시간 반응시켜준 뒤, 배양액(상층액) 수거하였다. 60시간 반응시킨 배양액(상층액)은 세포 외 멜라닌 생성량을 측정하기 위하여 1ml을 덜어 ELISA plate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로 알부틴(Arbutin)을 사용하여 진행하였다.

멜라닌 생성량을 확인하기 위하여 아래의 수학식 2를 이용하여 계산하였다.

[수학식 2]

멜라닌 생성량(%)=(시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)X100

.

구분	Melanin contents (% of control)
양성 대조군 (Arbutin)	24.40±0.30
음성 대조군	89.63±1.88
실시예 3(AHC2030 균주 발효물)	25.19±0.96
비교예 1	28.54±0.93

그 결과, 표 4 및 도 6에 나타난 바와 같이 실시예 3 및 비교예 1 모두 멜라닌 생성량이 낮은 것으로 확인되어 멜라닌 생성억제 활성이 우수한 것이 확인되었다. 이러한 결과는 AHC2030 균주(수탁번호: KCTC12750P) 균주 발효물에 미백 효과가 있다는 것을 의미한다.

<실험예 7> 항염 효능 시험 : Nitric Oxide(NO)를 억제 활성

실시예 3 및 비교예 1의 발효물을 이용하여 항염증 활성 효과를 확인하기 위해 니트릭 옥사이드(Nitric oxide)를 억제하는 정도를 측정하였다.

대식세포의 일종인 RAW 264.7 cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신 및 10% FBS(fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24 Well plate에 1.0x10⁴ cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 RAW 264.7 cell에 실시예 3 및 비교예 1을 50(㎍/㎖) 농도로 배지와 혼합 후, 각 Well에 1ml씩 첨가하고 37℃ 및 5% CO₂조건의 인큐베이터에서 24시간 반응시켰다. 이때, NO를 발현시키는 염증유발인자인 LPS(Lipo poly saccharide)를 1㎍/㎖의 농도로 같이 처리하고 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 각 well의 상등액 만을 따로 취한 뒤 각 Well에 Nitric Oxide detection kit를 이용하여 배양액 중 100㎖ 를 96 Well plate에 취하고 Griess reagent A(N-1-Naphthylethylenediamine (NEDHC)) 50㎕ 및 Griess reagent B(Sulfanilamide) 50㎕를 각각 넣어준 뒤 각각 10분 동안 반응시킨 뒤, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.

구분	NO 생성농도(μM)
양성대조군	14.4±1.09
음성대조군	70.1±0.82
실시예 3(AHC2030 균주 발효물)	13.6±1.24
비교예 1	26.8±0.90

그 결과, 표 5 및 도 7에 나타난 바와 같이 실시예 3은 비교예 1 대비 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성농도가 낮은 것으로 확인되어 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.

이러한 결과는 AHC2030 균주(수탁번호: KCTC12750P) 균주 발효물에 항염 효과가 있다는 것을 의미한다.

<실험예 8> 항균 효능 시험 : MIC 테스트

실시예 및 비교예의 발효물을 이용하여 항균 활성 정도를 확인하였다.

1. 평가 배지의 준비

평가 방법으로 원형여과지법(Paper disc method)을 이용하였으며, 항균 활성 평가에는 유해한 표준시험균주(식약처 및 MIC test guide line)인 대장균(Escherichia coli, ATCC 8739), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus, ATCC 6538P), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027), 칸디다 알비칸스(Candida albicans, ATCC 10231)를 한국미생물자원센터(KCTC, Korea) 및 한국미생물보존센터(KCCM, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. 상기 표준시험균주 중 대장균, 황색 포도상구균 및 녹농균의 배양에는 TSA 배지(Tryptic Soy Agar) 배지를 사용하였으며, 칸디다 알비칸스의 배양에는 YM 배지(Yeast extract Media) 배지를 사용하였다.

2. MIC 테스트

121℃에서 15분간 멸균한 독립적인 영양배지(Nutrient Broth)를 준비한 후, 각 표준 시험균주를 3X10⁵cfu/㎖의 양으로 접종하였다. 실시예 3 및 비교예 1을 대표적으로 시험 농도 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 0.0625%, 0.03125%, 0.015625%, 0.0078125% 농도로 맞추고, 시험 균주의 Single colony 이용하여 접종하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 흡광도(600nm)를 측정하여 결과를 확인하였다. 미생물이 검출되지 않는 최저 농도로 항균 효과를 확인하였다.

구분(단위: %)	대장균	황색 포도상구균	녹농균	칸디다 알비칸스
실시예 3(AHC2030 균주 발효물)	0.25	0.125	0.125	0.50

그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이 AHC2030 균주 배양물은 4개의 공시 기준시험균주(식약처 및 MIC test guide line 참조)인 대장균(Escherichia coli, ATCC 8739), 황색 포도상구균(Staphylococcusaureus, ATCC 6538P), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027), 칸디다 알비칸스(Candida albicans, ATCC 10231)에 대한 억제 효과가 확인되어 항균 효과가 우수한 것을 확인하였다.

<제조예 1> AHC2030 균주의 발효물을 함유하는 화장료 제조

(1) 화장수 제조

하기 표 7에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
AHC 2030 발효물	3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액)	12.00
잔탄검(2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글라이콜	6.00
글리세린	4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액)	5.00
정제수	68.00
합계	100.00

(2) 로션 제조

하기 표 8에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
AHC 2030 발효물	3.00
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	91.94
합계	100.0

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM)

KCCM12750P

20200617

<110> GFC Life Science Co., Ltd <120> Lactobacillus iners AHC2030 and Fermented Product Manufactured Using Thereof <130> p20218 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1461 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus iners AHC2030 <400> 3 ccgagcgcgt caactgcagt cgagcgagtc tgccttgaga tcggagtgct tgcactctgt 60 gaaacaagat acaggctagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccaagag 120 atcgggataa cacctggaaa cagatgctaa taccggataa caacagatga tgcctatcaa 180 ctgtttaaaa gatggttctg ctatcactct tggatggacc tgcggtgcat tagctagttg 240 gtagggtaac ggcctaccaa ggcgatgatg catagccgag ttgagagact gatcggccac 300 attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa 360 tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaagc 420 tctgttgttg gtgaagaagg acaggggtag taactgacct ttgtttgacg gtaatcaatt 480 agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540 ccggatttat tgggcgtaaa gcgagtgcag gcggctcgat aagtctgatg tgaaagcctt 600 cggctcaacc ggagaattgc atcagaaact gtcgagcttg agtacagaag aggagagtgg 660 aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccggtg gcgaaggcgg 720 ctctctggtc tgttactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt gctaagtgtt gggaggtttc cgcctctcag 840 tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatccatag ccagtctaag agattagatg ttcccttcgg 1020 ggactatgag acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcatta gttgccagca ttaagttggg cactctaatg 1140 agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga gaagcgaccc tgtgaaggca 1260 agcggatctc tgaaagccgt tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc ctgcatgaag 1320 ctggaatcgc tagtaatcgc aaatcagcac gttgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccat gagagtctgt aacgcccgaa gccggcgggt aaccgaaagg 1440 atcagcctca agcgacgtgg g 1461

Claims

큐티박테리움 아크네(Cutibacterium acnes)의 감소, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 감소, 항산화, 미백, 주름 개선, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 신규한 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호KCCM12750P).
제1항에 있어서, 상기 균주는 피부 유래인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호KCCM12750P).
락토바실러스 이너스 AHC2030(Lactobacillus iners AHC2030) 균주(기탁번호KCCM12750P)를 Maltose, Lactose, Glycine 및 Inulin이 포함된 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 배양은 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법.
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