KR101796500B1

KR101796500B1 - 락토바실러스 펜토서스 gfc03 균주 및 이를 이용하여 제조된 유청 발효물

Info

Publication number: KR101796500B1
Application number: KR1020170073353A
Authority: KR
Inventors: 강희철; 차미연; 김주연; 정연선; 김은미; 김수경; 이지은; 천우영; 조소현
Original assignee: (주)지에프씨; 주식회사 비앤비코리아
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2017-06-12
Publication date: 2017-12-01

Abstract

본 발명은 락토바실러스 펜토서스 GFC03 균주 및 이를 이용하여 제조된 유청 발효물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226), 균주 배양액 또는 GFC03 균주를 이용하여 제조된 유청 발효물은 미백 및 피부 주름개선 효과 주름 효과가 우수하기 때문에, 화장료 조성물로 활용 가능하다.

Description

락토바실러스 펜토서스 GFC03 균주 및 이를 이용하여 제조된 유청 발효물 {Lactobacillus Pentosus GFC03 and Fermented Whey Manufactured Using Thereof}

본 발명은 락토바실러스 펜토서스 균주 및 이를 이용하여 제조된 유청 발효물 에 관한 것이다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 Pro와 Biotics의 합성어로서, Pro는 '~를 위한'을 의미하고, 'Biotics'는 생명을 뜻한다. 세계보건기구(WHO)는 프로바이오틱스를 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균으로 정의하고 있다. 프로바이오틱스라는 단어의 역사는 그리 길지 않으나 인류의 생활에 들어온 지는 수천 년이 되었다. 치즈와 요구르트부터 우리나라의 김치와 된장에 이르기까지 발효를 이용하고 부패를 막고 영양가를 높인 전통 음식들에도 프로바이오틱스가 들어있다. 이 중 대표적인 것이 바로 유산균이다.

화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 락토코쿠스 속(Lactococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 유용성과 안전성을 모두 갖춘 유익균으로 알려진 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)는 락토바실러스 속 유산균으로 사람의 장내에 상재하며, 항균·항산화 효과를 가지며, 항염 작용, 면역조절 작용에도 관여하는 매우 유용한 균주로서 유제품이나 건강기능식품, 화장품 등 다방면의 산업에서 유익하게 활용되고 있다.

한편, 유청(乳淸)은 우유가 엉겨서 응고된 뒤 남은 액체이며, 훼이(Whey) 또는 유장(乳漿)이라고도 한다. 우유에는 수분, 단백질, 지방, 탄수화물, 무기질, 비타민, 효소 등이 포함되어있다. 지방은 가장 중요한 성분이며 이것을 제외한 것을 탈지유라고 한다. 탈지유에 산 또는 응유효소를 첨가하면 응고물이 생기는데 이것을 응유(Curd)라 하며 우유의 주단백질인 카세인이 주성분이다. 응유를 제외한 수용액을 유청(Whey)이라 하고 전 단백질의 20%를 포함한다. 유청에는 유당, 락토알부민, 락토글로불린, 무기질 등이 포함되어 있다. 락토글로불린에는 면역글로불린이 포함되어 있으며 특히 초유에 함량비가 높다. 유청은 보통 치즈 생산물의 부산물로만 여겨져 왔으나, 차츰 그 영양학적 중요성과 건강증진 기능성의 우수함이 밝혀지고 있다. 치즈 제조 중 우유 성분의 상당 부분이 유청으로 흘러나오므로 유청은 단백질, 유당, 무기질 및 비타민의 함량이 상당히 높다.

유청을 화장품 소재에 적용하는 기술로서, 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-0030790호「피부용 보습제의 제조법」에서는 동물의 젖을 주성분으로 하는 배양기에 유산균을 접종한 다음, 유산발효시켜 얻어진 배양물에서 유청을 채취하고, 그 유청을 감압 하에 약 30-50℃로 가열하고, 유청을 약 10-20% 증발시켜 유청 중의 아세트알데히드, 아세톤 및 다이아세틸성분이 0.5ppm이하로 될때까지 그 일부를 증발시키는 것을 특징으로 하는 피부용 보습제의 제조법을 개시하였다.

또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0027759호「항산화제 함유 화장품」에서는 동물의 유배지를 사용한 유산균 배양액에서 채취된 유청에서 분자량 6000 이상의 고분자량물질을 실질적으로 제거하여서 이루어진 항산화제를 0.03-3.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화제 함유 화장품을 개시하였다.

이에, 본 발명자들은 우리나라 전통식품인 김치에서 분리한 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226), 균주 배양액 또는 GFC03 균주를 이용하여 제조된 유청 발효물이 엘라스타아제(Elastase) 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능을 갖는다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-0030790호 대한민국 등록특허공보 제10-0027759호

본 발명의 목적은 엘라스타아제(Elastase) 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능을 갖는 신규한 균주 및 이를 이용하여 제조된 유청 발효물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 엘라스타아제(Elastase) 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능을 갖는 유청 발효물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 균주, 균주 배양액 또는 유청 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엘라스타아제(Elastase) 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능을 갖는 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 김치 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226)를 우유에 접종하고, 배양하여 요거트를 제조하는 단계; 및 제조된 요거트를 원심분리시킨 다음 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유청 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양은 28 ~ 33℃에서 2 ~ 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 제조방법을 통해 제조된 유청 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 균주 배양액 또는 유청 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226), 균주 배양액 또는 GFC03 균주를 이용하여 제조된 유청 발효물은 엘라스타아제(Elastase) 억제능 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능이 우수하기 때문에, 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물로 활용 가능하다.

도 1은 MRS 배지에서 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226)를 분리한 사진이다.
도 2는 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226) 배양액의 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 유청 발효물 및 시판되는 식품 요거트 유청의 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주 배양액 및 락토바실러스 봄비콜라 균주 배양액의 Elastase 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유청 발효물, 시판되는 식품 요거트 유청 및 락토바실러스 봄비콜라 유청 발효물의 Elastase 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주 배양액, 락토바실러스 봄비콜라 균주 배양액 및 락토바실러스 쿠바투스 균주 배양액의 Elastase 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유청 발효물, 시판되는 식품 요거트 유청 및 락토바실러스 퍼멘튬 유청 발효물의 세포 외 멜라닌 생성 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유청 발효물의 피부 첩포 안전성 결과를 나타낸 것이다.

이에, 본 발명에서는 우리나라 전통식품 김치에서 분리된 미생물로부터 미백 및 주름개선 효능을 갖는 균주를 스크리닝하여, 엘라스타아제(Elastase) 억제능 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능이 우수한 균주를 선발하고, 16s rDNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226)로 명명하고 2016년 8월 19일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다.

따라서, 본 발명은 엘라스타아제(Elastase) 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능을 갖는 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226)(이하 'GFC03'로 약칭함)에 관한 것이다.

이때, 상기 GFC03 균주는 김치 유래인 것을 특징으로 한다.

상기 GFC03 균주는 MRS 배지(Proteose peptone) No. 3. 10g, (Beef extract) 10g, 효모 추출물(Yeast extract) 5.0g, 덱스트로오스(Dextrose) 20g, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 1.0g, 시트르산암모늄(Ammonium citrate) 2.0g, 아세트산나트륨(Sodium acetate) 5.0g, 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1g, 황산망간(Manganese sulfate) 0.05g, 디포타슘포스페이트(Dipotassium phosphate) 2.0g, 한천(agar) 15.0g / 1L, Difco, USA)에 접종한 다음, 혐기조건 하에 28 ~ 33℃에서 2 ~ 7일 동안 배양하는 것이 균주 증식이 원활하게 이루어지는 측면에서 바람직하다.

상기 GFC03 균주 및 균주 배양액은 엘라스틴을 과도하게 분해하여 콜라겐 간 결합의 약화와 피부 주름의 원인으로 작용하는 엘라스타아제(Elastase)를 억제하는 효능이 우수하여 피부 주름개선 효능을 갖으며, 세포 외 멜라닌 생성 억제능이 우수하여 미백 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 GFC03 균주를 우유에 접종하고, 배양하여 요거트를 제조하는 단계; 및 제조된 요거트를 원심분리시킨 다음 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유청 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

이때, 우유는 시중에 판매하는 우유를 사용할 수 있으며, 최적의 요거트를 제조하기 위해서는 저지방, 고칼슘 우유는 제외하는 것이 바람직하다.

상기 GFC03 균주는 혐기조건 하에 28 ~ 33℃에서 2 ~ 7일 동안 배양하여 요거트를 제조하는 것을 특징으로 한다. 만일, GFC03 균주를 접종하고 배양 시, 상기 배양 온도 및 시간을 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 충분한 미백 및 주름 개선효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

상기와 같이 제조된 요거트는 원심분리시킨 다음 상층액을 수득하여 유청 발효물을 제조하는 것일 수 있다. 이때, 요거트를 원심분리 할 경우 응유(Curd)과 상층액인 액상으로 분리되는데, 최종적으로 수득된 유청 발효물은 응유(Curd)를 제외한 액상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 유청 발효물의 제조방법을 통해 제조된 유청 발효물에 관한 것이다.

상기 유청 발효물은 엘라스타아제(Elastase) 억제능 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능이 우수하여 미백 및 주름개선 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 상기 균주, 균주 배양액 또는 유청 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 주름 개선 및 피부탄력 개선용 화장료 조성물에서, 상기 유청 발효물은 상기 화장료 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 99 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 7 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 피부 미백 또는 주름 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 균주의 분리 및 선발

전통 발효 식품인 김치로부터 유용한 기능을 하는 유산균을 분리하기 위해, 먼저 김치 시료를 10진 희석법으로 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 희석한 후 Bromophenol blue를 0.002% 첨가한 MRS 배지((Proteose peptone) No. 3. 10g, (Beef extract) 10g, 효모 추출물(Yeast extract) 5.0g, 덱스트로오스(Dextrose) 20g, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 1.0g, 시트르산암모늄(Ammonium citrate) 2.0g, 아세트산나트륨(Sodium acetate) 5.0g, 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1g, 황산망간(Manganese sulfate) 0.05g, 디포타슘포스페이트(Dipotassium phosphate) 2.0g, 한천(agar) 15.0g / 1L, Difco, USA)에 도말한 다음, 주변에 노란색 환을 형성하는 콜로니(Colony)를 유산균 속 후보군(GFC01~04)으로 분리하였다.(도 1) 분리된 균주들 중 엘라스타아제(Elastase) 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능 테스트를 통해 가장 효능이 우수한 GFC03 균주를 선발하였다.

< 실시예 2> 선발균주 16s rDNA 염기서열 분석

최종 선발된 GFC03 균주의 gDNA와 Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3')을 이용하여 PCR을 수행한 다음, 16S rDNA sequence 분석을 수행하여 염기서열(서열번호 3)을 확인하였다.(도 2) 16s rDNA sequencing 결과를 바탕으로 NCBI에서 제공하는 BLAST search를 통하여 상동성 분석을 수행하였다. 상동성 분석 결과 분리 균주는 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)와 98.76%의 유사성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03)으로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 8월 19일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM 43226를 부여받았다.

<실시예 3> GFC03 균주 배양액 제조

GFC03 균주를 MRS 배지(Difco, USA)에 접종하고, 37℃에서 4일동안 배양하여 최종 GFC03 균주 배양액을 제조하였다.

<실시예 4> 유청 발효물 제조

우유는 시중에 판매하는 우유를 구매하여 사용하였다. 먼저, 우유 100g에 GFC03 균주를 1X10⁷cfu/ml로 접종하고, 28℃에서 3일동안 정치배양하여 요거트를 제조하였다. 수득된 요거트를 원심분리하여 응유(Curd)과 상층액인 액상(유청 발효물)으로 분리하였고, 응유(Curd)를 제외한 최종 유청 발효물을 수득하였다.

< 실시예 5> 세포독성 시험 : WST assay

상기 실시예 3의 균주 배양액 및 실시예 4의 유청 발효물의 세포에 대한 자극성을 확인하기 위해 B16-F10 멜라노마 세포를 대상으로 세포독성 실험을 진행하였다. 먼저, B16-F10 멜라노마 세포(ATCC^ⓡ CRL 6475™)는 96 well plate(Corning 3590)에 5*10^{^3} / well로 배양하였다. 균주 배양액 및 유청 발효물을 농도별로 처리하고 48시간 이후에 DMEM media에 10% EZ-Cytox(대일, 99-EZ3000)을 혼합하여 시료 처리한 Media를 Suction 후 1well당 100ul씩 분주하였다. 2시간 배양 후 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader; Biotek, Synergy HT)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 비교예로는 시중에 판매하는 식품 요거트 유청을 사용하였다.

세포 생존율은 시료를 처리하지 않은 처리군(무처리군)과 비교하여 계산하였으며 계산식은 다음과 같다.

세포 생존율 (%) = (시료를 처리군의 흡광도 / 무처리군의 흡광도) * 100

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 GFC03 균주 배양액은 최대 2% 처리 농도까지 생존율이 90% 이상으로 B16/F10 세포에 대한 독성이 나타나지 않았으며, 도 4에 나타난 바와 같이 유청 발효물 및 식품 요거트 유청 역시 최대 4% 처리 농도까지 생존율이 90% 이상으로 B16/F10 세포에 대한 독성이 나타나지 않아 화장품에 안전한 소재로 사용이 가능함을 확인하였다.

<실시예 6> 항주름 효능 시험 : 엘라스타아제(Elastase) 활성 억제

상기 실시예 3의 균주 배양액 및 실시예 4의 유청 발효물을 다양한 농도별로 희석한 다음, 10mM Tris-HCl buffer에 녹인 1.6mM N-석시닐-알라닌-알라닌-알라닌-p-니트로아닐라이드(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide)(S4760, Sigma)를 첨가한 다음, 혼합하여 5분 동안 반응시킨 후 410nm에서 흡광도를 측정하여 항주름 활성을 확인하였다.

이때, 실시예 3의 비교예로는 락토바실러스 봄비콜라(Lactobacillus bombicola)(수탁번호: KCCM 43227) 균주를 적용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 균주 배양액을 사용하였으며, 실시예 4의 비교예로는 ①시중에 판매하는 식품 요거트 유청 및 ③락토바실러스 봄비콜라(Lactobacillus bombicola)(수탁번호: KCCM 43227) 균주를 적용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 제조된 유청 발효물을 사용하였다.

Elastase 활성억제 (%) = (시료 처리군의 흡광도 / control군의 흡광도) *100

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 락토바실러스 봄비콜라 균주 배양액은 4% 처리시 엘라스타아제 억제율이 30%였으나, GFC03 균주 배양액은 4% 처리시 엘라스타아제 억제율이 60%이고, IC₅₀ 값이 3.96%인 것으로 나타났다. 따라서, 같은 락토바실러스 속이라 할지라도, 락토바실러스 봄비콜라 균주 배양액 대비 락토바실러스 펜토서스 GFC03 균주 배양액이 피부 주름개선 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이 식품요거트 유청 대비 GFC03 균주를 이용한 유청 발효물을 농도별로 처리하였을 때 유의성있는 엘라스타아제 억제율을 나타내었다. 식품요거트 유청의 경우에는 4% 처리시 엘라스타아제 억제율이 65.85%였으나, GFC03 균주를 이용한 유청 발효물은 4% 처리시 엘라스타아제 억제율이 83.98%로 확인되어 피부 주름개선 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 락토바실러스 봄비콜라(Lactobacillus bombicola) 균주를 적용한 유청 발효물은 4% 처리시 엘라스타아제 억제율이 18%인 것으로서, GFC03 균주를 이용한 유청 발효물 대비 피부 주름개선 효과가 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> 미백 효능 시험 : 세포 외 멜라닌 분석

B16-F10 멜라노마 세포는 6well에 1.2X10^{^5}/well로 배양하였다. 배양 24시간 이후, 멜라닌 분비를 유도하기 위해 α-MSH(Sigma M4135)를 50nM로 처리하였고 동시에 실시예 3의 균주 배양액 및 실시예 4의 유청 발효물을 다양한 농도로 세포에 처리하였다. 이때 멜라닌 분석을 위해 페놀이 없는 DMEM media(10% FBS, 페니실린(100 unit/ml), 스트렙토마이신(100 ug/ml))를 사용하였다. 시료 처리 48~60시간 후 세포와 배양액을 15ml Conical tube에 옮긴 후 상온에서 3,000RPM에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 세포 외 멜라닌 분석을 위해 세포의 배양액을 96 well plate(corning 3595)에 1well 당 100ul씩 농도별로 총 4well을 분주 한 후 마이크로 플레이트 리더기로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

이때, 실시예 3의 비교예로는 ①락토바실러스 봄비콜라(Lactobacillus bombicola)(수탁번호: KCCM 43227) 균주를 적용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 균주 배양액 및 ②락토바실러스 쿠바투스(Lactobacillus curvatus) 균주를 적용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 균주 배양액을 사용하였으며, 실시예 4의 비교예로는 ①시중에 판매하는 식품 요거트 유청 및 ②락토바실러스 퍼멘튬(Lactobacillus fermentum) 균주를 적용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 제조된 유청 발효물을 사용하였다.

세포 외 멜라닌 contents (%) = (시료 처리군의 흡광도 / control군의 흡광도) *100

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 GFC03 균주 배양액은 2% 처리시 세포 외 멜라닌 함량이 약 20% 이상이였으나, 락토바실러스 봄비콜라 균주 배양액은 세포외 멜라닌 저해능이 없었으며, 락토바실러스 쿠바투스 균주 배양액은 4% 처리시 세포 외 멜라닌 생성 저해능이 약 60% 이상이였다. 따라서, 같은 락토바실러스 속이라 할지라도, 락토바실러스 봄비콜라 균주 배양액 및 락토바실러스 쿠바투스 대비 락토바실러스 펜토서스 GFC03 균주 배양액이 세포 외 멜라닌 함량이 현저하게 낮은 것으로 나타난 바, 세포 외 멜라닌 생성 저해능이 월등히 높아 미백 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8에 나타난 바와 같이 시판되는 식품요거트 유청의 경우에는 2% 처리시 세포 외 멜라닌 함량이 49%였으나, GFC03 균주를 이용한 유청 발효물은 2% 처리시 세포 외 멜라닌 함량이 33%로 확인되어 세포 외 멜라닌 생성 저해능이 월등히 높아 미백 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 락토바실러스 퍼멘튬 균주를 적용한 유청 발효물은 4% 처리시 세포 외 멜라닌 함량이 78.06%인 것으로서, GFC03 균주를 이용한 유청 발효물 대비 세포 외 멜라닌 생성 저해능이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.

상기 항주름 및 미백 효능 시험을 통해, GFC03 균주 배양액 및 GFC03 균주 를 이용한 유청 발효물이 시중에 판매하는 식품 요거트 유청 및 락토바실러스 속 균주 배양액 및 유청 발효물 대비 엘라스타아제(Elastase) 억제능 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능이 현저하게 높아 미백 및 피부 주름개선에 효과가 있음을 확인하였다.

<실시예 8> 피부 첩포에 의한 안전성 평가

상기 실시예 4로부터 제조된 유청 발효물의 피부 첩포에 의한 안전성을 확인하였다. 피부첩포에 의한 안전성 평가 인체적용 시험은 ㈜엘리드에서 진행하였으며, 엘리드 기관 생명윤리위원회 표준운영지침(Ver. 3.0)에 의거하여 승인 후에 식품의약품안전처 기능성 화장품 심사에 관한 규정(제 2015-14 호), PCPC(Personal Care Products Council) Safety Evaluation Guidelines의 규정 및 국제 접촉피부염연구회(ICDRG:International Contact Dermatitis Research Group)3에서 제시하는 평가기준에 따라 연구를 수행하여 자극유무를 판정하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 첩포 제거한 다음 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 120시간 경과 후에서 모두 반응을 관찰할 수 없었다. 평균 피부 반응도는 0.00으로써 판정기준에 따라 무자극으로 판정되었다.(보고번호 EL-160822513S179)

<제조예 1> 유청 발효물을 함유하는 화장료 제조

(1) 화장수 제조

하기 표 1에 기재된 함량의 성분을 사용하여 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 4의 유청 발효물	3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액)	12.00
잔탄검(2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글라이콜	6.00
글리세린	4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액)	5.00
정제수	68.00
합계	100.00

(2) 로션 제조

하기 표 2에 기재된 함량의 성분을 사용하여 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 4의 유청 발효물	3.00
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	91.94
합계	100.0

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM)

KCCM43226

20160819

<110> GFC Co., Ltd. B&B Korea Co., ltd <120> Lactobacillus Pentosus GFC03 and Fermented Whey Manufactured Using Thereof <130> P17067 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFC03 16s rDNA <400> 3 nggccncana tcatgcagtc gaacgaactc tggtatngat tggtgcttgc atcatgattt 60 acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca gaagcggggg 120 ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg gtccgagntt 180 gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct agatggtggg 240 gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg gccacattgg 300 gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac 360 gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaaactctgt 420 tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat tgacggtatt tattgacggt 480 atttaaccag aaagccacgg ctnactacgt gccagcagcc cgcggtaata cgtaggtggc 540 aagcgntgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt 600 gaaagccttc ggctcaaccg aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga 660 ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720 cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagtatggg tagcaaacag 780 gattagatac cctggtagtc cataccgtaa acgatgaatg ctaagtgttg gagggtttcc 840 gcccttcagt gctgcagcta acgcattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggc 900 tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 960 agctacgcga agaaccttac caggtcttga catactatgc aaatctaaga gattagacgt 1020 tcccttcggg gacatggata caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080 ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat taagttgggc 1140 actctggtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1200 gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc 1260 gcgagagtaa gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc 1320 tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1380 ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccaaag tcggtggggt 1440 aacctttagg aaccagccgc ctatgtggtn ctg 1473

Claims

엘라스타아제(Elastase) 및 세포 외 멜라닌 생성 억제능을 갖는 김치 유래의 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226).
삭제
김치 유래의 락토바실러스 펜토서스 GFC03(Lactobacillus pentosus GFC03) 균주(기탁번호: KCCM43226)를 우유에 접종하고, 배양하여 요거트를 제조하는 단계; 및 제조된 요거트를 원심분리시킨 다음 상층액을 수득하는 단계를 포함하되,
상기 배양은 28 ~ 33℃에서 2 ~ 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 유청 발효물의 제조방법.
삭제
제3항의 제조방법을 통해 제조된 유청 발효물.
제1항의 균주, 균주 배양액 또는 제5항의 유청 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.