KR102323015B1

KR102323015B1 - 다공성 기재상의 세포로 대형 카고의 효율적인 전달

Info

Publication number: KR102323015B1
Application number: KR1020167029900A
Authority: KR
Inventors: 팅-샹 우; 페이-유 이 치우; 마이클 에이 테이텔
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2021-11-05
Also published as: US10472651B2; JP7334127B2; AU2015235932A1; EP3122885A1; JP6839073B2; EP3122885A4; AU2015235932B2; CA2947539A1; US20200199628A1; KR20160145623A; CA2947539C; WO2015148842A1; JP2020062049A; US20170175139A1; IL248092A0; JP2017510300A; CN106460011A

Abstract

다양한 구현예에서, 대형 카고(예를 들어, 기관, 염색체, 세균 등)를 세포로 전달하기 위한 방법 및 장치가 제공된다. 특정 구현예에서, 진핵 세포를 다공성 막의 하나의 측면상에 분배되도록 제공하고, 용액 중에서 전달될 카고를 상기 다공성 막의 반대 측면상의 저장소 챔버에 분배되도록 제공하고, 상기 다공성 막을 포함하는 공극을 통해 카고(여기서, 카고는 세포막을 통과하여 세포로 진입한다)를 통과시키기에 충분히 압력을 상기 저장소 챔버에 적용함을 포함하는 대형 카고를 진핵 세포로 전달하는 방법이 제공된다.

Description

다공성 기재상의 세포로 대형 카고의 효율적인 전달 {EFFICIENT DELIVERY OF LARGE CARGOS INTO CELLS ON A POROUS SUBSTRATE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는, 2014년 3월 28일자로 출원된 USSN 61/972,145의 이득 및 우선권을 주장한다.

정부 지원의 진술

[적용될 수 없음]

단백질, DNA, RNA, 염색체, 핵; 및 퀀텀 도트, 표면-증진된 라만 스캐터링(SERS) 입자 및 마이크로비드와 같은 무생물 입자를 포함하는, 광범위한 크기 이상의 포유동물 세포로 카고를 전달하는 것은 많은 생물학 분야에서 매우 바람직할 수 있다. 엔도시토시스와 같은 전달 방법은 엔도좀에 카고를 포집할 수 있고, 상기 엔도좀에서 낮은 pH 미세환경 및 용해 효소는 흔히 카고 분해를 유도한다 (문헌참조: Luo 및 Saltzman (2000) Nat. Biotechnol. 18: 33-37). 바이러스 및 화학적 전달 방법은 카고를 바이러스 내부에 팩키징하거나 취득을 증진시키는 화학적 복합체를 형성한다(Naldini 등 (1996) Science, 272: 263-267; Felgner 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417). 그러나, 독성, 세포-유형 특이적 취득 및 보다 중요하게 제한된 카고 팩킹 능력은 카고 크기 및 전달 가능한 세포 유형에 상당한 제한을 부과한다 (문헌참조: Luo 및 Saltzman, 상기).

물리적 전달 방법은 전기천공 (문헌참조: Chu, 등 (1987) Nucleic Acids Res. 15: 1311-1326) 및 초음파천공(sonoporation)(문헌참조: Mitragotri (2005) Nat. Rev. Drug Discovery, 4: 255-260) (이것은 무작위로 분포된 나노스케일 공극을 생성한다) 및 광학천공(optoporation) (Tirlapur 및 Konig (2002) Nature, 418: 290-291; Vogel, 등 (2005) Appl. Phys. B: Laser Opt., 81: 1015-1047; Clark 등 (2006) J. Biomed. Opt., 11: 014034) (이것은 레이져 초점에서 세포막 상에 공극을 생성시킨다)를 포함한다. 이들 공극을 통해 소형 카고는 열 확산에 의해 또는 전기장에 의해 세포로 전달된다. 이들 방법을 사용한 대형 카고의 전달은 카고 확산의 느린 속도로 인해 낮은 효율을 갖고 공극 크기의 증가와 함께 세포 생존능은 감소한다(문헌참조: Stevenson 등 (2006) Opt. Express, 14: 7125-7133). 미세모세관 주사(Microcapillary injection) (문헌참조: King (2004) Methods in Molecular Biology 245: Gene Delivery to Mammalian Cells 1; Humana Press Inc.: Totowa, NJ)는 전달을 위해 세포막에 기계적으로 침투시키기 위해 예리한 글래스 팁(glass tip)을 사용한다. 그러나, 막 침투로 인한 기계적 외상은 세포 생존능을 유지하기 위해 직경에서 전형적인 피펫 팁을 0.5 um로 제한한다(문헌참조: Han 등 (2998) J. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med., 4: 215-225).

피펫 팁 보다 큰 카고는 피펫 막힘 및 카고 전단으로 인해 주사될 수 없다. 전기천공과 미세모세관 주사를 조합하는 전기-주사는 생존 세포로의 RNA 및 플라스미드 DNA와 같은 소분자 전달 (문헌참조: Boudes 등 (208) J. Neurosci . Meth., 170: 204-211; Kitamura 등 (2008) Nat. Meth ., 5: 61-67) 및 전기장을 사용한 접촉 세포 막을 약화시킴에 이어서 세포로의 약한 기계적 침투에 의한 인공 지질 소포체로의 세균 전달 (문헌참조: Hurtig 및 Orwar (2008) Soft Matter, 4: 1515-1520)을 입증하였다. 대안적으로, 단순한 지질 원조 미세주사 (SLAM) 기술 (문헌참조: Laffafian 및 Hallett (1998) Biophys . J., 75: 2558-2563)은 유리 미세모세관의 팁에 합성 지질 분자를 혼입한다. SLAM 마이크로피펫과 세포막의 접촉은 지질 분자가 세포막과 융합하도록 하여 카고 전달을 위한연속 및 일시적 경로를 형성한다. 상기 방법은 세포막을 통한 마이크로피펫 팁의 지그재그 찌르기 움직임을 회피한다. 그러나, 전달 카고 뿐만 아니라 카고 및 세포막과의 친지성 상호작용은 세포에서 원치않는 생리학적 효과를 나타낼 수 있고 상기 방법을 특이적 세포 유형 및 카고 내용물로 제한한다.

요약

다양한 측면에서, 본원에서 고려되는 발명(들)은 하기 구현예 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한될 필요는 없다:

구현예 1: 대형 카고를 진핵 세포로 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함한다: 상기 세포를 다공성 막의 한 측면상에 분배되도록 제공하는 단계; 상기 다공성 막의 반대 측면상에 저장소 챔버에 분배된 용액내 상기 카고를 제공하는 단계; 및 상기 다공성 막을 포함하는, 공극을 통해 상기 카고를 통과시키는데 충분한 압력을 상기 저장소 챔버에 적용하는 단계(여기서, 상기 카고는 세포막을 통해 상기 세포로 통과한다).

구현예 2: 구현예 1에 있어서, 상기 저장소 챔버가 약 10 μL 내지 약 500 μL 이하, 또는 약 40 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 400 μL, 또는 약 60 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 70μL 내지 약 200 μL, 또는 약 80 μL 내지 약 150 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 1 mL 이하, 또는 약 10 μL 내지 약 500 μL 이하, 또는 약 10 μL 내지 약 100 μL 이하의 용적 범위로 있는, 방법.

구현예 3: 구현예 2에 있어서, 상기 저장소 챔버가 약 100 μL의 용적을 갖는, 방법.

구현예 4: 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 다공성 막이 약 5 μm 내지 약 30 μm, 또는 약 5 μm 내지 약 20 μm, 또는 약 5 μm 내지 약 15 μm의 두께 범위에 있는, 방법.

구현예 5: 구현예 4에 있어서, 상기 다공성 막이 약 10 μm의 두께를 갖는, 방법.

구현예 6: 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에서, 상기 다공성 막의 평균 또는 중앙 공극 크기가 약 100 nm 내지 약 20 μm 이하, 또는 약 500 nm 내지 약 8 μm 이하, 또는 약 1 μm 내지 약 5 μm 이하의 범위로 있는, 방법.

구현예 7: 구현예 6에 있어서, 상기 다공성 막에서 중앙 또는 평균 공극 크기가 약 1 μm인, 방법.

구현예 8: 구현예 6에 있어서, 상기 다공성 막에서 중앙 또는 평균 공극 크기가 약 3 μm인, 방법.

구현예 9: 구현예 6에 있어서, 상기 다공성 막에서 중앙 또는 평균 공극 크기가 약 5 μm인, 방법.

구현예 10: 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 다공성 막이 약 1×10⁵ 공극/cm² 내지 약 1×10⁷ 공극/cm² 이하, 또는 약 5×10⁵ 공극/cm² 내지 약 5×10⁶ 공극/cm² 이하, 또는 약 1×10⁵ 공극/cm² 내지 약 1×10⁷ 공극/cm²인, 방법.

구현예 11: 구현예 10에 있어서, 상기 다공성 막이 약 1.6×10⁶ 공극/cm²에서 약 1 μm의 직경 평균 공극 크기를 포함하는, 방법.

구현예 12: 구현예 10에 있어서, 상기 다공성 막이 약 8×10⁵ 공극/cm²에서 약 3 μm 직경 평균 공극 크기를 포함하는, 방법.

구현예 13: 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 막이 중합체 막을 포함하는, 방법.

구현예 14: 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 막이 나일론 막, 나일론 메쉬, 필터 막, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 막, 확장된 폴리테트라플루오로에틸렌 (ePTFE) 막, 폴리에스테르 막, 폴리에테르에테르케톤 (PEEK) 막, 확장된 폴리에테르에테르케톤 (ePEEK) 막, 폴리에틸렌 (PE) 막, 폴리프로필렌 (PP) 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA) 막, 열가소성 폴리우레탄 (TPU) 막, 폴리에테르설폰 (PES) 막, 폴리카보네이트 막, 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 물질을 포함하는, 방법.

구현예 15: 구현예 14에 있어서, 상기 막이 폴리에스테르 막, 폴리카보네이트 막, 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막을 포함하는, 방법.

구현예 16: 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에서, 상기 압력을 적용하는 것이 상기 다공성 막의 굴절을생성시키는, 방법.

구현예 17: 구현예 16에 있어서, 상기 굴절이 약 20 μm에서, 또는 약 50 μm에서, 또는 약 100 μm에서, 또는 약 500 μm에서 약 1 cm까지, 또는 약 500 mm까지, 또는 약 300 mm까지, 또는 약 100 mm까지의 범위에 있는, 방법.

구현예 18: 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에서, 상기 압력을 적용하는 것이 일시적 압력을 적용하는 것을 포함하는, 방법.

구현예 19: 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 압력을 적용하는 것이 약 1 msec 내지 약 1분 또는 약 100 msec 내지 약 1 분, 또는 약 1초 내지 약 1분 동안 압력을 적용하는 것을 포함하는, 방법.

구현예 20: 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 압력을 적용하는 것이 포트를 통해 상기 저장소 챔버에 압력을 적용하는 것을 포함하는, 방법.

구현예 21: 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 압력을 적용하는 것이, 상기 챔버가 충전되고 폐쇄된 상기 저장소 챔버의 벽을 굴절시킴을 포함하는, 방법.

구현예 22: 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 압력을 적용하는 것이 상기 저장소 챔버의 벽을 통해 용액을 주사함을 포함하는, 방법.

구현예 23: 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 포트를 통해 상기 용액을 상기 저장소 챔버에 도입함을 포함하는, 방법.

구현예 24: 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 상기 카고 용액을 상기 저장소로 피펫팅 첨가함을 포함하는, 방법.

구현예 25: 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 상기 챔버 상 또는 상기 챔버내 상기 다공성 막을 위치시키기 전에 상기 저장소 챔버에 로딩함을 포함하는, 방법.

구현예 26: 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 상기 저장소 챔버의 벽을 관통하는 니들을 통해 상기 용액을 주사함을 포함하는, 방법.

구현예 27: 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배되도록 제공하는 것이 상기 막을 통해 상기 용액을 통과시켜 상기 저장소 챔버에 로딩함을 포함하는, 방법.

구현예 28: 구쳬예 1 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 카고가 천연 염색체 또는 염색체 단편, 합성염색체, 세균, 합성 입자, 세포내 진균류, 세포내 원생동물, 리포좀 (예를 들어, 리포펙타민) 내 팩키징된 DNA 및/또는 RNA, 및 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하는, 방법.

구현예 29: 구현예 28에 있어서, 상기 카고가 세포 핵을 포함하는, 방법.

구현예 30: 구현예 28에 있어서, 상기 카고가 미토콘드리아를 포함하는, 방법.

구현예 31: 구현예 28에 있어서, 상기 카고가 염색체 또는 염색체 단편을 포함하는, 방법.

구현예 32: 구현예 28에 있어서, 상기 카고가 인공 염색체를 포함하는, 방법.

구현예 33: 구현예 28에 있어서, 상기 카고가 세균을 포함하는, 방법.

구현예 34: 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 척추동물 세포, 진균류 세포 및 효모세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.

구현예 35: 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포 및 무척추동물 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.

구현예 36: 구현예 35에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포를 포함하는, 방법.

구현예 37: 구현예 35에 있어서, 상기 세포가 인간 세포를 포함하는, 방법.

구현예 38: 구현예 35에 있어서, 상기 세포가 비-인간 포유동물 세포를 포함하는, 방법.

구현예 39: 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 림프구 또는 줄기 세포를 포함하는, 방법.

구현예 40: 구현예 39에 있어서, 상기 세포가 성숙한 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 탯줄 (cord) 혈액 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 줄기 세포를 포함하는, 방법.

구현예 41: 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 분화된 체세포를 포함하는, 방법.

구현예 42: 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 세포주 기원의 세포를 포함하는, 방법.

구현예 43: 구현예 42에 있어서, 상기 세포가 표 1에 열거된 세포주 기원의 세포를 포함하는, 방법.

구현예 44: 구현예 42에 있어서, 상기 세포가 HeLa, 국립암 연구 60개 암세포주 (NCI60), ESTDAB 데이터베이스, DU145 (전립선암), Lncap (전립선 암), MCF-7 (유방암), MDA-MB-438 (유방암), PC3 (전립선암), T47D (유방암), THP-1 (급성 골수 백혈병), U87 (교모세포종), SHSY5Y 인간 신경모세포종 세포, 골수종으로부터 클로닝된 세포 및 Saos-2 세포(골암)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포주 기원의 세포를 포함하는, 방법.

구현예 45: 구현예 1 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막상에서 배양되는, 방법.

구현예 46: 구현예 1 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에서 접착층으로서 배양되는, 방법.

구현예 47: 구현예 45 또는 46에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에서 컨플루언스 때까지 배양되는, 방법.

구현예 48: 구현예 1 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 다공성 막이 금속성 필름 또는 금속성 나노입자를 함유하지 않는, 방법.

구현예 49: 구현예 1 내지 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 상기 막의 표면을 가열함을 포함하지 않는, 방법.

구현예 50: 구현예 1 내지 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 상기 막의 표면을 레이져로 가열시킴을 포함하지 않는, 방법.

구현예 51: 대형 카고를 진핵 세포로 전달하기 위한 장치로서, 상기 장치가 다음을 포함하는, 방법: 다공성 막; 및 상기 다공성 막의 한 측면상에 저장소 챔버(여기서, 상기 저장소 챔버의 용적은 약 500 μL 미만이다)

구현예 52: 구현예 51에 있어서, 상기 저장소 챔버가 약 40 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 400 μL, 또는 약 60 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 70μL 내지 약 200 μL, 또는 약 80 μL 내지 약 150 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 100 μL 이하의 용량 범위로 있는, 장치.

구현예 53: 구현예 52에 있어서, 상기 저장소 챔버가 약 100 μL의 용적을 갖는, 장치.

구현예 54: 구현예 51 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 다공성 막이 약 5 μm 내지 약 30 μm, 또는 약 5 μm 내지 약 20 μm, 또는 약 5 μm 내지 약 15 μm의 두께 범위로 있는, 장치.

구현예 55: 구현예 54에 있어서, 상기 다공성 막이 약 10 μm의 두께를 갖는, 장치.

구현예 56: 구현예 51 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 다공성 막의 평균 또는 중앙 공극 크기가 약 100 nm 내지 약 20 μm 이하, 또는 약 500 nm 내지 약 8 μm 이하, 또는 약 1 μm 내지 약 5 μm 이하의 범위로 있는, 장치.

구현예 57: 구현예 56에 있어서, 상기 다공성 막에서 중앙 또는 평균 공극 크기가 약 1 μm인, 장치.

구현예 58: 구현예 56에 있어서, 상기 다공성 막에서 중앙 또는 평균 공극 크기가 약 3 μm인, 장치.

구현예 59: 구현예 56에 있어서, 상기 다공성 막에서 중앙 또는 평균 공극 크기가 약 5 μm인, 장치.

구현예 60: 구현예 51 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 다공성 막이 약 1×10⁵ 공극/cm² 내지 약 1×10⁷ 공극/cm² 이하, 또는 약 5×10⁵ 공극/cm² 내지 약 5×10⁶ 공극/cm² 이하, 또는 약 1×10⁵ 공극/cm² 내지 약 1×10⁷ 공극/cm²을 포함하는, 장치.

구현예 61: 구현예 60에 있어서, 상기 다공성 막이 약 1.6×10⁶ 공극/cm²에서 약 1 μm의 직경 평균 공극 크기를 포함하는, 장치.

구현예 62: 구현예 60에 있어서, 상기 다공성 막이 약 8×10⁵ 공극/cm²에서 약 3 μm 직경 평균 공극 크기를 포함하는, 장치.

구현예 63: 구현예 51 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 막이 중합체 막을 포함하는, 장치.

구현예 64: 구현예 51 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 막이 나일론 막, 나일론 메쉬, 필터 막, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 막, 확장된 폴리테트라플루오로에틸렌 (ePTFE) 막, 폴리에테르에테르케톤 (PEEK) 막, 확장된 폴리에테르에테르케톤 (ePEEK) 막, 폴리에틸렌 (PE) 막, 폴리프로필렌 (PP) 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA) 막, 열가소성 폴리우레탄 (TPU) 막, 및 폴리에테르설폰 (PES) 막으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 물질을 포함하는, 장치.

구현예 65: 구현예 51 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 막이 폴리에스테르 막, 폴리카보네이트 막 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막을 포함하는, 장치.

구현예 66: 구현예 51 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 저장소 챔버가 용액을 상기 챔버로 도입하기 위해 구성된 포트 또는 채널과 유체 통류하는, 장치.

구현예 67: 구현예 51 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 저장소 챔버가 폐쇄되고/되거나 밀봉된 (예를 들어, 상기 저장소로부터의 유체가 단지 다공성 막을 통해 일어날 수 있다), 장치.

구현예 68: 구현예 51 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 저장소 챔버가 상기 진핵 세포로 전달될 카고를 포함하는 용액을 함유하는, 장치.

구현예 69: 구현예 68에 있어서, 상기 카고가 천연 염색체 또는 염색체 단편, 합성 염색체, 세균, 합성 입자, 세포내 진균류, 세포내 원생동물, 리포좀 또는 지질 입자내 팩키징된 DNA 및/또는 RNA 및 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하는, 장치.

구현예 70: 구현예 69에 있어서, 상기 카고가 세포 핵을 포함하는, 장치.

구현예 71: 구현예 69에 있어서, 상기 카고가 미토콘드리아를 포함하는, 장치.

구현예 72: 구현예 69에 있어서, 상기 카고가 염색체 또는 염색체 단편을 포함하는, 장치.

구현예 73: 구현예 69에 있어서, 상기 카고가 인공 염색체를 포함하는, 장치.

구현예 74: 구현예 69에 있어서, 상기 카고가 세균을 포함하는, 장치.

구현예 75: 구현예 51 내지 74 중 어느 한 구현예에 있어서, 진핵 세포가 상기 저장소 챔버에 병치된 측면 반대편에 있는 상기 다공성 막의 표면상에 분배된, 장치.

구현예 76: 구현예 74에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 및 무척추 동물 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.

구현예 77: 구현예 76에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포를 포함하는, 장치.

구현예 78: 구현예 76에 있어서, 상기 세포가 인간 세포를 포함하는, 장치.

구현예 79: 구현예 76에 있어서, 상기 세포가 비-인간 포유동물 세포를 포함하는, 장치.

구현예 80: 구현예 77 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 림프구 또는 줄기 세포를 포함하는, 장치.

구현예 81: 구현예 80에 있어서, 상기 세포가 성숙한 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 코드 혈액 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 줄기 세포를 포함하는, 장치.

구현예 82: 구현예 77 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 분화된 체세포를 포함하는, 장치.

구현예 83: 구현예 51 내지 74 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 세포주 기원의 세포를 포함하는, 장치.

구현예 84: 구현예 83에 있어서, 상기 세포가 표 1에 열거된 세포주 기원의 세포를 포함하는, 장치.

구현예 85: 구현예 83에 있어서, 상기 세포가 HeLa, 국립암 연구 60개 암세포주 (NCI60), ESTDAB 데이터베이스, DU145 (전립선암), Lncap (전립선 암), MCF-7 (유방암), MDA-MB-438 (유방암), PC3 (전립선암), T47D (유방암), THP-1 (급성 골수 백혈병), U87 (교모세포종), SHSY5Y 인간 신경모세포종 세포, 골수종으로부터 클로닝된 세포 및 Saos-2 세포(골암)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포주 기원의 세포를 포함하는, 장치.

구현예 86: 구현예 51 내지 85 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에서 배양되는, 장치.

구현예 87: 구현예 51 내지 85 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에 접합층으로서 배양되는, 장치.

구현예 88: 구현예 86 또는 87에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에서 컨플루언스때까지 배양되는, 장치.

구현예 89: 구현예 51 내지 88 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 다공성 막이 금속성 필름 또는 금속성 나노입자를 함유하지 않는, 장치.

구현예 90: 구현예 51 내지 89 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 상기 막의 표면을 가열시킴을 포함하지 않는, 장치.

구현예 91: 대형 카고를 진핵 세포로 전달하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템이 다음을 포함하는 시스템: 구현예 51 내지 90 중 어느 한 구현예에 따른 제1 장치; 및 구현예 51 내지 90 중 어느 한 구현예에 따른 제2 장치 (상기 제1 장치 및 상기 제2 장치는 상기 제1 장치 및 상기 제2 장치를 포함하는 저장소 챔버와 유체 통류하는 포트 및/또는 채널을 포함하고 상기 포트 및/또는 채널이 서로 유체 통류하거나; 상기 제1 장치 및 상기 제2 장치가 상기 제1 장치 및 상기 제2 장치를 포함하는 저장소 챔버와 유체 통류하는 포트 및/또는 채널을 포함하고, 상기 포트 및/또는 채널이 서로 유체 통류하지 않는다).

구현예 92: 구현예 91에 있어서, 상기 제1 장치 및 상기 제2 장치가 상기 제1 장치 및 상기 제2 장치를 포함하는 저장소 챔버와 유체 통류하는 포트 및/또는 채널을 포함하고, 상기 포트 및/또는 채널이 서로 유체 통류하는, 시스템.

구현예 93: 구현예 91에 있어서, 상기 제1 장치 및 상기 제2 장치가 상기 제1 장치 및 상기 제2 장치를 포함하는 저장소 챔버와 유체 통류하는 포트 및/또는 채널을 포함하고, 상기 포트 및/또는 채널이 서로 유체 통류하지 않는, 시스템.

구현예 94: 구현예 93에 있어서, 상기 제1 장치의 저장소 챔버에 존재하는 카고가 상기 제2 장치의 저장소 챔버에 존재하는 카고와는 상이한, 시스템.

구현예 95: 구현예 91 내지 94 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 장치에 존재하는 진핵 세포가 상기 제2 장치에서의 동일한 유형의 진핵 세포인, 시스템.

구현예 96: 구현예 91 내지 94 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 장치에 존재하는 진핵 세포가 상기 제2 장치에서의 진핵 세포와는 상이한, 시스템.

구현예 97: 구현예 91 내지 96 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 시스템이 구현예 51 내지 90 중 어느 한 구현예에 따른 제3 장치를 포함하고; 상기 제1 장치 및 상기 제3 장치가 상기 제1 장치 및 상기 제3 장치를 포함하는 저장소 챔버와 유체 통류하는 포트 및/또는 채널을 포함하고, 상기 포트 및/또는 채널이 서로 유체 통류하거나; 상기 제1 장치 및 상기 제3 장치가 상기 제1 장치 및 상기 제3 장치를 포함하는 저장소 챔버와 유체 통류하는 포트 및/또는 채널을 포함하고, 상기 포트 및/또는 채널이 서로 유체 통류하지 않는, 시스템.

정의

세포로의 전달과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "카고"는 세포로의 전달이 요구되는 임의의 모이어티를 언급한다. 예시적인 카고는 기관, 전체 염색체 또는 세균, 대형 핵산 또는 단백질 작제물, 합성 입자 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "대형 카고"는 약 100 nm에서, 또는 약 500 nm에서, 또는 약 800 nm에서, 또는 약 1 μm에서, 또는 약 3 μm에서, 또는 약 5 μm에서 약 20 μm까지, 또는 약 15 μm까지, 또는 약 10 μm까지(길이 및/또는 너비 및/또는 직경에 있어서) 크기 범위의 카고를 언급한다. 특정 구현예에서, 대형 카고는 약 100 nm (예를 들어, 지질 또는 리포좀 복합체 중 DNA 및/또는 RNA)에서 약 10 μm (예를 들어, 염색체, 핵, 등)까지의 크기 범위에 있다.

밀봉되고/되거나 폐쇄된 저장소 챔버와 관련하여 사용되는 경우 용어 "밀봉된" 또는 "폐쇄된"은 상기 저장소의 유체 배출이 다공성 막을 통해서만 일어나거나 주로 막을 통해서 일어날 수 있음을 지적한다.

도면의 간단한 설명

도1은 전달 공정의 한 구현예를 설명하는 도식을 보여준다.

도2a 및 2b는 본원에 기재된 바와 같은 형질감염 시스템의 다양한 비제한적인 구현예의 도해를 보여준다.

도3는 미토콘드리아 전달 후 다공성 막 상에서 수용자 143BTK rho(0) 세포를 보여준다. 전달된 DsRed 표지된 미토콘드리아는 세포 내부에서 및 막 공극 내부에서 관찰될 수 있다.

도4는 2주 동안 제한 배지에서 배양한 후 mtDNA(우측) 없이 rho(0) 세포에서 대량 사멸과 비교하여 전달된 mtDNA 형성된 증식 센터(좌측)를 함유하는 성공적으로 형질전환된 143BTK rho(0)를 보여준다.

도5는 성공적으로 형질전환된 수용자 143BTK rho(0) 세포가 미토콘드리아 공여자 세포주 MDAMB453의 것과 동일하고 모세포주 143BTK와는 상이한 mtDNA를 함유함을 확인시켜주는 미토콘드리아 DNA 서열을 보여준다. 143BTK (서열번호 1), 143BTK rho(0) (서열번호 2), MDAMB453 (서열번호 3).

도6는 84%의 세균 전달 효율이 본원에 기재된 방법을 사용하여 수득되었음을 보여준다. 전달 후 9시간에, HeLa 세포는 핵(청색) 및 혈장 막(적색)에 대해 염색하였다. 세포 사이토졸 내부에서 복제되는 전달된 GFP 세균(녹색).

도7a 및 7b는 형질감염 시스템으로 통합된 다수의 형질감염 장치를 도식적으로 설명한다. 특정 구현예에서, 상기 형질감염 장치는 시스템을 포함하는 상이한 형질감염 장치 모두 또는 서브세트에 대해 상이한 로딩 포트/채널(도 7a) 및/또는 공통된 카고 로딩 채널/포트(도 7b)를 제공하고 이는 상기 시스템을 포함하는 상이한 형질감염 장치의 서브세트에 대한 것이다.

발명의 상세한 설명

다양한 구현예에서, 카고, 특히 "대형" 카고를 세포로 전달하기 위한 개선된 방법 및 장치가 본원에 제공된다. 본원에 기재된 방법 및 장치는 분리된 미토콘드리아 및 세균을 포함하지만 이에 제한되지 않는 대형 카고를 전례없는 처리량 및 용이성으로 포유동물 세포로 전달한다. 동시 전달은 10⁵ 세포가 수초 이내에 성취되고 세포 생존능(>90%)이 관찰되었음을 입증하였다.

상기 전달 방법의 하나의 예시적이지만, 비제한적인 구현예는 도 1에 도시한다. 여기에서 보여지는 바와 같은 수용자 세포(예를 들어, 진핵 세포)는 막관통 공극을 갖는 다공성 막 (예를 들어, 10 μm 두께의 중합체 막) 상에 위치하거나 배양된다. 수용자 세포로 형질감염되어야만 하는 카고는 용액 중에 위치하고 다공성 막의 반대 측면 상의 저장소 챔버에 로딩한다. 압력은 수용자 세포를 향해 막 공극을 통해 카고 현탁액을 펌핑하기 위해 바닥 저장소 챔버에 적용된다. 특정 구현예에서, 중합체 막은 압력 구동된 유체로 인해 약간 변형된다. 형질감염된 세포는 압력 적용 후 즉시 관찰될 수 있다.

형질감염 장치

특정 구현예에서, 형질감염 장치는 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 제공된다. 특정 예시에서 그러나 비제한적인 구현예에서, 상기 형질감염 장치는 저장소 챔버 상에 분배된, 본원에 기재된 바와 같은 다공성 막을 포함한다(문헌참조, 예를 들어, 도 2a 참조).

도 2a에 설명된 바와 같이, 저장소 챔버는 수용자 세포로 형질감염되어야만 하는 카고를 함유하도록 구성된다. 상기 다공성 막은 또한 수용자 세포를 지지하고, 특정 구현예에서, 다공성 막 상의 접착층으로서 상기 세포의 배양을 허용하기 위해 선택된다.

다양한 구현예에서, 상기 세포는 접착층으로서 배양될 필요가 없다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 상기 세포는 단순히 막으로 흡착되고, 예를 들어, 직접퇴적에 의해 및/또는 원심분리에 의해 흡착된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 다양한 접착 분자 (예를 들어, 인테그린, 캐드헤린, 셀렉틴, 및 다양한 합성 링커 (예를 들어, 이종이기능성 또는 동종이기능성 펩타이드 링커))를 사용하여 막으로 접착된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 겔 매트릭스 (예를 들어, 겔라틴, HYDROMATRIX®, MAXGEL®, 콜라겐 겔, 하이드로겔 등)에 의해 상기 막으로 "접착"된다.

특정 구현예에서, 저장소 챔버는 하기 설명된 바와 같이 상기 포트 또는 채널이 요구되지 않지만 형질감염 동안에 카고 용액의 도입을 위해 및/또는 챔버의 압력 적용을 위해 포트 및/또는 채널과 함께 제공될 수 있다.

다양한 예시이지만 비제한적인 구현예에서, 상기 저장소 챔버는 약 10 μL에서, 또는 약 20 μL에서, 또는 약 30 μL에서, 또는 약 40 μL에서, 또는 약 50 μL에서, 또는 약 60 μL에서, 또는 약 70 μL에서, 또는 약 80 μL에서 약 500 μL까지, 또는 약 400 μL까지, 또는 약 300 μL까지, 또는 약 200 μL까지, 또는 약 100 μL까지의 용적 범위에 있다.

다양한 구현예에서, 다공성 막 및/또는 저장소 챔버는 세포로 전달되어야만 하는 진핵 세포 및 카고와 양립할 수 있는 필수 임의의 물질로부터 조립된다. 적합한 물질은 세라믹, 유리 및 플라스틱을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 저장소 챔버는 단단하고/경직된 플라스틱 (예를 들어,폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 등)으로부터 조립되고, 다른 구현예에서, 상기 저장소 챔버는 유연성 중합체 (예를 들어, PDMS 또는 다른 중합체)로부터 조립된다.

상기 지적된 바와 같이, 형질감염 방법은 다공성 막을 사용하고 특정 구현예에서 유연한 다공성 막을 사용한다. 다공성 막은 다양한 물질 (예를 들어, 나일론 또는 나일론 메쉬, 필터 막, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 확장된 폴리테트라플루오로에틸렌 (ePTFE), 폴리에테르에테르케톤 (PEEK), 확장된 폴리에테르에테르케톤 (ePEEK), 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 열가소성 폴리우레탄 (TPU), 폴리에테르설폰 (PES) 등)로 가용하다. 특정 구현예에서, 다공성의 단단한 물질 (예를 들어, 다공성 세라믹, 다공성 유리, 등)이 또한 고려된다. 다공성 막은 당업자에게 널리 공지되어 있고 다수의 공급원으로부터 다양한 공극 크기로 시판되고 있다(참조: 예를 들어, Porex Corp. Fairburn GA, 등).

특정 구현예에서, 다공성 막은 약 3 μm에서, 또는 약 5 μm에서, 또는 약 7 μm에서 약 30 μm까지, 또는 약 25 μm까지, 또는 약 20 μm까지, 또는 약 15 μm까지, 또는 약 10 μm까지의 두께 범위로 있다. 특정 구현예에서, 다공성 막은 두께가 약 10 μm이다.

특정 구현예에서, 다공성 막의 평균 또는 중앙 공극 크기는 약 50 nm에서, 또는 약 100 nm에서, 또는 약 200 nm에서, 또는 약 300 nm에서, 또는 약 400 nm에서, 또는 약 500 nm에서, 또는 약 600 nm에서, 또는 약 700 nm에서, 또는 약 800 nm에서, 또는 약 900 nm에서, 또는 약 1 μm에서 약 30 μm까지, 또는 약 20 μm까지, 또는 약 15 μm까지, 또는 약 10 μm까지, 또는 약 8 μm까지, 또는 약 5 μm까지의 범위로 있다. 특정 구현예에서, 상기 다공성 막에서 중앙 또는 평균 공극 크기는 약 1 μm 또는 약 3 μm, 또는 약 5 μm이다.

전형적인 구현예에서, 막의 공극 밀도는 충분히 높아서 평균적으로 이의 위의세포의 적어도 절반은 적어도 하나의 공극, 또는 적어도 2개의 공극 또는 적어도 3개의 공극 또는 적어도 4개의 공극 또는 적어도 5개의 공극 또는 적어도 10개의 공극상에 위치한다. 특정 구현예에서, 다공성 막은 약 1×10⁵ 공극/cm² 내지 약 1×10⁷ 공극/cm²이하, 또는 약 5×10⁵ 공극/cm² 내지 약 5×10⁶공극/cm²이하, 또는 약 1×10⁵ 공극/cm² 내지 약 1×10⁷공극/cm² 이하를 포함한다. 특정 구현예에서, 다공성 막은 약 1.6×10⁶ 공극/cm²에서의 1 μm 직경 평균 공극 크기 또는 약 8×10⁵ 공극/cm²에서의 약 3 μm 직경 평균 공극 크기를 포함한다.

본원에 기재된 형질감염 장치의 구성 및 이들을 내포할 수 있는 미소유체 성장치에 사용될 수 있는 다수의 포맷, 물질 및 크기 스케일이 있다. 일부 양태에서, 형질감염 장치, 및 존재하는 경우, 연결 유체 채널 및/또는 포트는 PDMS(또는 다른 중합체)로 구성되고, 소프트 리소그래피를 사용하여 조립되며, 다공성 막은 전형적으로 상기 막의 판매회사로부터 구입한다.

PDMS는 저가, 광학적 투명성, 성형의 용이성 및 탄성 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 이유 때문에 본원에 기재된 장치의 조립을 위해 매력적인 물질이다. PDMS는 또한 바람직한 화학적 특성을 갖고, 이는 통상적인 실록산 화학적 특성 및 세포 배양 요건 (예를 들어 낮은 독성, 가스 침투성) 둘 다와의 상용성을 포함한다. 예시적 소프트 리소그래피 방법에서, 마스터 주형은 하나 이상의 저장소 챔버, 및 존재하는 경우 연합된 포트 및/또는 채널을 형성하도록 제조된다. 상기 마스터 주형은 마이크로매칭 공정, 포토리소그래피 공정에 의해 또는 당업자에게 공지된 임의의 다수의 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법은 습식 에칭, 전자빔 진공 침적, 포토리소프래피, 플라스마 증진된 화학적 증착, 분자 빔 에피택시, 반응성 이온 에칭, 및/또는 화학적 원조 이온 빔 밀링을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (문헌참조: Choudhury (1997) The Handbook of Microlithography , Micromachining, and Microfabrication, Soc . Photo-Optical Instru . Engineer.; Bard & Faulkner, Fundamentals of Microfabrication).

일단 제조된 경우, 마스터 주형은 전구중합체에 노출되고, 이어서 상기 중합체는 경화되어 PDMS에서 패턴화된 레플리카를 형성한다. 상기 레플리카는 마스터 주형으로부터 제거되고, 다듬어지고, 요구되는 경우, 유체 주입구가 부가된다. 상기 중합체 레플리카는 임의로 플라스마 (예를 들어 O₂ 플라스마)로 처리될 수 있고 유리와 같은 적합한 기재에 결합된다. O₂ 플라스마를 사용한 PDMS의 처리는 적합한 기재와 등각으로 접촉하는 경우 촘촘하고 비가역적으로 밀봉되는 표면을 생성하고, 수용액과 연계하여 사용되는 경우 음으로 하전된 유체 채널 벽을 생성한다는 이점을 갖는다. 이들 고정된 하전은 장치를 통해 유체를 이동시키기 위해 사용될 수 있는 전기역학적 펌핑을 지원한다. 소적(droplet) 생성 장치의 상기 기재된 조립이 PDMS를 사용하지만, 다수의 다른 물질이 상기중합체를 대체할 수 있거나 이와 연계하여 사용될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 예는 폴리올레핀 플라스토머, 퍼플루오로폴리에틸렌, 폴리우레탄, 폴리이미드 및 가교결합된 페놀/포름알데하이드 중합체 수지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

형질감염 장치 작동.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 다공성 막의 한 측면상에 분배되도록 "수용자 세포"를 제공하고; 상기 다공성 막의 반대 측면상에 저장소 챔버에 분배된 용액 중에 카고를 제공하고; 다공성 막을 포함하는 공극을 통해 카고를 통과시키기에 충분한 압력을 저장소 챔버에 적용함(여기서, 상기 카고는 세포 막을 통과하여 상기 세포 내로 진입한다)을 포함한다. 특정 구현예에서, 챔버의 압력 적용은 다공성 막의 변형을 수반한다.

카고-함유 용액은 임의의 다수의 간편한 방법에 의해 저장소 챔버로 도입될 수있다. 예를 들어, 하나의 예시이고 비제한적인 구현예에서, 카고-함유 용액은 챔버로 향하는 포트 또는 채널을 통해 저장소 챔버로 도입된다 (예를 들어, 도 2a 참조).

또 다른 예시이고 비제한적인 구현예에서, 상기 저장소 챔버는 연속 채널의 일부로서 조립된다. 채널의 유출 부분은 밸브와 함께 구성될 수 있다. 상기 카고 용액은 챔버로 유입되어 이를 통과한다. 경우에 따라, 상기 밸브는 폐쇄되어 상기 저장소 채널을 밀봉하고 압력 헤드는 증가된 압력을 제공하기 위해 유지될 수 있거나 상기 챔버는 추가로 가압될 수 있다. 상기 밸브는 특히 다수의 저장소 채널이 하나의 카고 충전 채널을 따라 구성되는 경우 유용하다 (예를 들어, 도 7b 참조).

또 다른 예시이고 비제한적 구현예에서, 카고-함유 용액은 챔버 상에 또는 챔버 내 (예를 들어, 세포를 함유하는) 다공성 막을 위치시키기 전에 저장소 챔버에 로딩한다.

또 다른 예시이고 비제한적인 구현예에서, 카고-함유 용액은 저장서 챔버의 벽을 관통하는 니들을 통해 저장소 챔버로 주사한다. 상기 구현예에서, 카고의 도입을 위한 포트 또는 채널은 용이하게 제거될 수 있다.

또 다른 예시이고 비제한적인 구현예에서, 카고-함유 용액은 단순히 저장소 챔버에 로딩하기 위해 다공성 막을 통과할 수 있다.

상기 저장소 챔버는 또한 임의의 다수의 방법에 의해 가압될 수 있다. 예를 들어, 다공성 챔버가 채널 또는 포트와 유체 통류하는 경우, 유체 또는 가스 압력은 펌프 또는 중력 공급을 사용하여 상기 포트에 적용될 수 있다.

또 다른 예시적 구현예에서, 저장소 챔버는 단순히 저장소 챔버의 하나 이상의 벽 내부를 향해 변형시킴에 의해, 예를 들어, 수동으로 미세조작기를 사용하여, 다공성 챔버가 분배되어 있는 용기를 가압하고, 전기기계적 작동기 등을 사용함에 의해 적용되는 압력에 의해 밀봉될 수 있다.

또 다른 예시적 구현예에서, 상기 저장소 챔버는 예를 들어, 시린지, 시린지 펌프 또는 다른 주사 장치를 사용하여 카고-함유 용액 또는 추가의 용액을 저장소 채널로 주사함에 의해 적용된 압력에 의해 밀봉될 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 압력은 일시적으로 적용된다. 상기 경우의 다양한 구현예에서, 상기 압력은 약 1 msec에서, 또는 약 10 msec에서, 또는 약 20 msec에서, 또는 약 50 msec에서, 또는 약 80 msec에서, 또는 약 100 msec에서, 또는 약 500 msec에서, 또는 약 1 sec에서, 또는 약 5 sec에서, 또는 약 10 sec에서 약 20 sec까지, 또는 약 30 sec까지, 또는 약 40 sec까지, 또는 약 50 sec까지, 또는 약 1 min까지, 또는 약 1.5 min까지, 또는 약 2 min까지, 또는 약 2.5 min까지, 또는 약 5 min까지 또는 약 10 min까지 범위의 시기동안 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 압력은 약 100 msec에서 약 1 min까지 범위의 시기 동안 적용된다.

상기 세포는 표준 방법을 사용하여 다공성 매트릭스에 적용된다. 전형적으로, 상기 세포는 다공성 매트릭스 상에서 배양될 수 있다. 이것은 형질감염 장치에서 수행될 수 있거나 대안적으로 이것은 별도로 수행될 수 있고 이어서 세포를 함유하는 다공성 매트릭스는 형질감염 장치에 전달된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 접착 층으로서 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 형질감염 전후에 컨플루언스할 때까지 배양된다.

이전의 작동 방법은 예시적이고 비제한적이다. 본원에 제공된 기술을 사용하여, 당업자는 통상적으로 특정 세포 및/또는 카고 유형을 수용하기 위해 형질감염 방법 및 장치를 최적화할 수 있다.

형질감염 시스템

특정 구현예에서, 다수의 형질감염 장치는 형질감염 시스템으로 커플링된다. 상기 구현예에서, 각각의 형질감염 장치는 상이한 카고를 각각의 장치에 존재하는 세포로 로딩하고/형질감염시키기 위해 구성될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 특정 구현예에서, 단일 시스템은 상기 시스템을 포함하는 상이한 형질감염 장치에 대한 상이한 로딩 포트/채널을 제공할 수 있다(예를 들어, 도 7a 참조). 대안적으로, 상기 시스템을 포함하는 각각의 형질감염 장치는 다른 로딩 수단 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은)을 사용하여 상이한 카고로 로딩할 수 있다.

특정 구현예에서, 단일 시스템은 상기 시스템을 포함하는 상이한 형질감염 장치에 대해 공통된 로딩 포트/채널을 제공할 수 있다 (예를 들어, 도 7b 참조). 따라서 모든 또는 형질감염 장치 서브세트는 공통된 카고 로딩 채널/포트를 공유할 수 있다 (예를 들어, 도 7b 참조). 상이한 세포는 공통된 채널 상에 각각의 장치를 포함하고 상이한 세포 유형의 공통된 카고로의 형질감염을 촉진시키는 다공성 막 상에서 배양될 수 있다.

특정 구현예에서, 이들 구성은 단일 시스템에서 조합됨으로써 공통된 카고 로딩 채널/포트를 공유하는 장치 서브세트 및 분리된 카고 로딩 채널/포트를 갖는 장치 서브세트를 제공한다.

이들 구성은 예시적이고 비제한적인 것으로 인지될 것이다. 본원에 제공된 교시를 사용하여, 다수의 다른 구성이 당업자에게 가용할 것이다.

모듈러 시스템

특정 구현예에서, 본원에 기재된 상기 형질감염 플랫폼은 기존의 장비와 용이하게 통합될 수 있는 "모듈"로서 제공된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 형질감염 이온 기재는 기존의 현미경으로 부가될 수 있거나 위에 스테이지를 대체할 수 있는 포맷으로 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 기재는 반전된 현미경 (예를 들어, Zeiss 반전된 현미경) 상의 x/y/z 스테이지를 대체하도록 포맷팅된다.

특정 구현예에서, 상기 형질감염 기재는 미세유동 시스템 (예를 들어, 칩 시스템 상의 랩)으로서 및/또는 미세유동 시스템과 통합될 수 있는 모듈로서 제공된다.

전달될 수 있는 물질(카고).

이것은 본원에 기재된 방법 및 장치를 사용하여 임의의 목적하는 물질을 필수적으로 세포로 전달할 수 있는 것으로 사료된다. 상기 물질은 핵산, 단백질, 기관, 약물 전달 입자, 프로브, 표지 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 상기 카고는 천연 염색체 또는 염색체 단편, 합성 염색체, 세균, 합성 입자, 세포내 진균류 (예를 들어, 뉴모시스티스 지로벡시 ( Pneumocystis jirovecii ), 히스토플라스마 캡슐라툼 ( Histoplasma capsulatum ), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans ), 등), 세포내 원생동물 (예를 들어, 아피콤플렉산스(Apicomplexans) (예를 들어, 플라스모디움 (Plasmodium) 종, 톡소플라스마 곤디 ( Toxoplasma gondii ), 크립토스포리디움 파르붐 ( Cryptosporidium parvum )), 트리파노소마티드스(Trypanosomatids) (예를 들어, 레이슈마니아 ( Leishmania ) 종, 트 리파노소마 크루지 ( Trypanosoma cruzi ), 등), 등), 및 기관 (예를 들어, 핵, 핵소체, 미토콘드리아, 엽록체, 리보솜, 리소좀 등)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 카고는 핵 및/또는 엽록체, 및/또는 핵소체, 및/또는 미토콘드리아를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 카고는 전체 염색체, 또는 염색체 단편, 또는 합성 염색체 (예를 들어, BAC (세균 인공 염색체))를 포함한다. 본원에 기재된 장치 및 방법은 전체 또는 부분적 천연 또는 합성 염색체를 전달하기 위해 사용될 수 있는 것으로 사료된다. BAC와 유사하게, 이전의 방법에 의해 대부분의 세포 유형으로 형질도입될 수 없는 대형 염색체 또는 염색체 단편은 예를 들어, 특히 인간 삼중염색체 장애(예를 들어, 다운 증후군 및 클라인펠터 증후군)의 모델을 확립하기 위해, 본원에 기재된 방법에 의해 세포로 전달될 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 카고는 다양한 세균, 진균류 및 원생동물을 포함하지만이에 제한되지 않는 세포내 병원체를 포함한다. 다양한 무생물 입자의 형질감염이 또한 고려된다. 상기 입자는 퀀텀 도트, 표면-증진된, 라만 스캐터링 (SERS) 입자, 마이크로비드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

이들 카고는 예시적인 것이고 비제한적인 것으로 의도된 것으로 인지된다. 본원에 제공된 기술을 사용하여, 다수의 다른 카고, 특히, 대형 카고가 세포로 형질감염될 수 있다.

세포 유형

본원에 기재된 방법 및 장치가 필수적으로 세포막을 갖는 임의의 세포와 함께사용될 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 다양한 구현예에서, 필수적으로 임의의 진핵 세포는 본원에 기재된 방법 및 장치를 사용하여 형질감염될 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 형질감염될 수 있는 적합한 세포는 척추동물 세포, 진균류 세포 및 효모 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 무척추 동물 세포이다.

통상적으로, 본원에 기재된 방법은 인간 포유동물 세포 및 비-인간 포유동물 세포 (예를 들어, 비-인간 영장류, 개, 말, 고양이, 돼지, 소, 유제류, 라고몰프 등) 둘다를 포함하는 포유동물 세포와 함께 수행된다.

특정 구현예에서, 형질감염된 세포는 줄기 세포 또는 열성적 선조 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 줄기 세포는 성숙 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 탯줄 혈액 줄기 세포, 산-유전된 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포 (IPSC)를 포함한다.

특정 구현예에서 상기 세포는 림프구 또는 다른 분화된 체세포를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 세포는 세포주 기원의 세포를 포함한다. 적합한 세포주는 예를 들어, HeLa, 국립 암 연구 60 암세포주 (NCI60), ESTDAB 데이터베이스, DU145 (전립선암), Lncap (전립선암), MCF-7 (유방암), MDA-MB-438 (유방암), PC3 (전립선암), T47D (유방암), THP-1 (급성 골수 백혈병), U87 (교모세포종), SHSY5Y 인간 신경모세포종 세포, 골수종으로부터 클로닝된 세포, Saos-2 세포 (골암), 등을 포함한다.

특정 구현예에서 적합한 세포주는 표 1에 열거된 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

다양한 구현예에서, 세포는 (예를 들어, 1시간 이상 동안, 또는 2시간 이상 동안 또는 4시간 이상 동안, 또는 6시간 이상 동안 또는 12시간 이상 동안, 또는 1일 이상 동안, 또는 2일 이상 동안, 또는 3일 이상 동안, 또는 4일 이상 동안, 또는 5일 이상 동안, 또는 6일 이상 동안, 또는 1주 이상 동안, 또는 2주 이상 동안) 다공성 막 상에서 배양한다.

표 1. 본원에 기재된 방법을 사용하여 형질감염될 수 있는 예시적이고 비제한적인 세포.

이전 세포 유형은 예시적이고 비제한적인 것으로 의도되는 것으로 인지된다. 많은 다른 진핵 세포 유형은 본원에 기재된 방법 및 장치에 용이하게 사용될 수 있는 것으로 인지된다.

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실시예

하기의 실시예는 청구된 발명을 예시하지만 이에 제한되지 않는다.

실시예 1

대형 카고의 다공성 기재 상의 세포로의 전달

본원 발명자는 단리된 기능성 미토콘드리아의 mtDNA 고갈된 rho(0) 세포 및공여자 세포 미토콘드리아 게놈을 함유하는 수득된 형질전환된 rho(0) 세포주로의 전달을 입증하였다. 안정하게 형질전환된 트랜스미토콘드리아 세포주를 수득하는 빈도는 ~10^-4이고, 이는각각의 전달 실험으로부터 십여 개 무리의 콜로니에 상응하고, 현실적으로 트랜스미토콘드리아 세포주는 매번 수득된다. 전달 공정은 도 1에 도시되어 있다. 1수용자 세포는 막 관통 공극 (1.6×10⁶ 공극/cm²에서 1μm 직경 공극 또는 8×10⁵ 공극/cm²에서 3 μm 공극)을 갖는 10 μm 두께의 중합체 막 상에서 배양하였다. 공여자 세포로부터 미토콘드리아를 단리하고 상기 미토콘드리아 현탁액(단백질 농도 10 mg/mL)은 중합체 막의 반대 측면상의 저장소 챔버에 로딩하였다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막을 사용하여 시험하였다. 상기 저장소 챔버는 100 μL의 용량을 갖는다. 일시적 압력은 수용자 세포를 향하여 미토콘드리아 현탁액을 막 공극을 통해 펌핑하기 위해 바닥저장소 챔버에 적용한다. 상기 중합체 막은 압력 구동된 흐름으로 인해 약간 변형되었고 미토콘드리아 및 미토콘드리아 응집체는 전달 후 수용자 세포 및 막 공극 내부에서 관찰되었다 (도 3).

세포는 전달 24시간 후 수거하였고 전달된 미토콘드리아를 함유하는 성공적인형질전환체를 선별하기 위해 제한 배지에서 배양하였다(도. 4). D-루프 초가변 영역내 미토콘드리아 DNA의 직접적인 서열 분석으로 형질전환체 콜로니가 전달된 공여자 세포 미토콘드리아로부터 기원하는 mtDNA를 함유함을 추가로 확인하였다 (도. 5).

미토콘드리아 전달 효율을 비교하기 위해, 하기의 실험을 또한 수행하였다:

(A) 100 μL의 미토콘드리아 현탁액을 다공성 막 상에서 배양된 수용자 세포로 부가하였고 24시간동안 동시 항온처리하였고;

(B) 100 μL의 미토콘드리아 현탁액은 다공성 막 상으로 회전시키고 이어서 수용자 세포를 씨딩하고 24시간 동안 항온처리하였다.

표 2는 이들 실험으로부터의 형질전환체 콜로니의 수 및 혈질전환체 빈도수를 열거한다. 방법 (A) 및 (B)을 사용해서는 어떠한 생존 콜로니가 수득되지 않았다.

표 2. 미토콘드리아 전달 효율의 비교.

본 발명의 전달 방법을 사용하여, 본원 발명자는 재현적으로 상이한 미토콘드리아 게놈을 갖는 여러 트랜스미토콘드리아 세포주를 생성하였다. 현재 결과는 표3에 요약한다.

표 3. 전달 방법을 사용하여 생성된 트랜스미토콘드리아 주의 요약

세균의 전달을 입증하기 위해, 비-식세포성이고 세균을 효율적으로 내재화하지 않는 HeLa 세포는 3 μm 공극을 갖는 중합체 막상에서 배양하였다. 10¹⁰ 세균/mL에서 GFP 프란시스엘라 노비시다(Francisella novicida) 세균 현탁액을 저장소 챔버에 로딩하였다. 유체 펌핑 및 세균 전달 후, 세포는 세포외 세균을 사멸시키기 위해 30분 동안 고농도의 항생제 (10 mg/mL 겐타마이신)로 처리하였다. 항온처리 9시간 후, HeLa 세포의 84%는 세포 시토졸 내부에서 복제하는 GFP 세균에 의해 보여지는 바와 같이 세포내 세균을 함유한다 (도. 6).

본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이고 이의 측면에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안되고 본원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허원은 모든 목적을 위해 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.

Claims

대형 카고를 진핵 세포로 전달하는 방법으로서, 상기 방법은:
상기 세포를 복수의 공극을 포함하는 다공성 막의 하나의 측면상에 분배되도록 제공하는 단계로서, 상기 다공성 막의 평균 또는 중앙 공극 크기가 100 nm 내지 20 μm 이하의 범위로 있는 단계;
용액 중 상기 카고를 상기 다공성 막의 반대 측면상의 저장소 챔버에 분배되도록 제공하는 단계로서, 상기 카고가 100 nm 내지 20 μm 크기 범위로 있는 단계; 및
상기 막의 굴절을 생성시키고, 상기 카고가 상기 공극 및 상기 세포의 세포 막을 통과하여 상기 세포로 진입하여 상기 카고로 형질감염된 세포를 제공하기에 충분한 압력을 상기 저장소 챔버에 적용하는 단계를 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 저장소 챔버가 10 μL 내지 500 μL 이하의 용적 범위로 있는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다공성 막이 5 μm 내지 30 μm의 두께 범위로 있는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다공성 막이 1×10⁵ 공극/cm² 내지 1×10⁷ 공극/cm² 이하를 포함하는, 전달 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 다공성 막이 하기를 포함하는, 전달 방법:
1.6×10⁶ 공극/cm²에서 1 μm 직경 평균 공극 크기; 또는
8×10⁵ 공극/cm²에서 3 μm 직경 평균 공극 크기.
청구항 1에 있어서, 상기 다공성 막이 중합체 막을 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다공성 막이 나일론 막, 나일론 메쉬, 필터 막, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 막, 확장된 폴리테트라플루오로에틸렌 (ePTFE) 막, 폴리에스테르 막, 폴리에테르에테르케톤 (PEEK) 막, 확장된 폴리에테르에테르케톤 (ePEEK) 막, 폴리에틸렌 (PE) 막, 폴리프로필렌 (PP) 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막, 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA) 막, 열가소성 폴리우레탄 (TPU) 막, 폴리에테르설폰 (PES) 막, 폴리카보네이트 막, 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 물질을 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 굴절이 20 μm에서 500 mm이하까지의 범위로 있는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 압력을 적용하는 것이 일시적 압력을 적용함을 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 압력을 적용하는 것이 포트를 통해 상기 저장소 챔버로 압력을 적용함을 포함하거나;
상기 압력을 적용하는 것이 상기 챔버가 충전되고 폐쇄되는 경우 상기 저장소 챔버의 벽을 굴절시킴을 포함하거나;
상기 압력을 적용하는 것이 상기 저장소 챔버의 벽을 통해 용액을 주사함을 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 포트를 통해 상기 용액을 상기 저장소 챔버로 도입함을 포함하거나;
용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 상기 카고 용액을 상기 저장소로 피펫팅함을 포함하거나;
용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 상기 챔버 상 또는 챔버내에 상기 다공성 막을 위치시키기 전에 상기 저장소 챔버에 로딩함을 포함하거나;
용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 상기 저장소 챔버의 벽을 관통하는 니들을 통해 상기 용액을 주사함을 포함하거나;
용액 중 상기 카고를 저장소 챔버에 분배하도록 제공하는 것이 상기 저장소 챔버에 로딩하기 위해 상기 다공성 막을 통해 상기 용액을 통과시킴을 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 카고가 천연 염색체 또는 염색체 단편, 합성 염색체, 세균, 합성 입자, 세포내 진균류, 세포내 원생동물, 및 기관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 척추동물 세포, 진균류 세포 및 효모 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 성숙 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 탯줄 혈액 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 줄기 세포를 포함하는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 하기 중 하나 이상에 의해 상기 다공성 막에 접착되어 있는, 전달 방법: 흡착, 접착 분자, 원심력 및 겔 매트릭스.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에서 배양되는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에서 접착층으로서 배양되는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 상기 다공성 막 상에서 컨플루언스할 때까지 배양되는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다공성 막이 금속성 필름 또는 금속성 나노입자를 함유하지 않고, 상기 방법이 상기 다공성 막의 표면을 가열시킴을 포함하지 않는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포, 곤충 세포, 및 무척추동물 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다공성 막이 5 μm 내지 20 μm 의 두께 범위로 있는, 전달 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법이 상기 다공성 막의 표면을 레이져로 가열시키는 것을 포함하지 않는, 전달 방법.
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