KR101968778B1 - 세포의 선택적 트랜스펙션을 위한 광열 기판 - Google Patents

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쉬라즈 카림 버트
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Abstract

본 발명은 선택 세포로 시약을 전달하기 위한 단일 세포 및 기판/장치 상에서의 수술을 위한 신규한 도구를 제공한다. 특정 구현예에서 기판은 하나 이상의 오리피스를 포함하는 표면을 포함하며, 이때 나노입자 및/또는 박막은 상기 오리피스 표면 상에 또는 상기 오리피스 근처에 침착되며, 이때 나노입자 및/또는 박막은 전자기파 방사선과 접촉시 가열되는 물질로 형성된다. 특정 구현예에서 공극은 세포로 전달되는 하나 이상의 시약을 함유하는 마이크로채널과 플루이드 내에서 소통한다.

Description

세포의 선택적 트랜스펙션을 위한 광열 기판{PHOTOTHERMAL SUBSTRATES FOR SELECTIVE TRANSFECTION OF CELLS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 본원에 그 전문이 참조로서 포함되어 있는 2011년 5월 13일자로 출원된 USSN 61/486,114 의 우선권 및 권리를 주장한다.
정부 지원 성명
본 발명은 연방 정부의 지원으로 행해진 연구 및 개발로서 이에 대한 권리는 연방 정부에 있음을 밝힌다.
[ 해당사항 없음 ]
단백질, DNA, RNA, 염색체, 핵, 및 무생물 입자, 예컨대 양자점, 표면-증강된 Raman 산란 (SERS) 입자, 및 마이크로비드를 포함하는 크기 1 의 폭 범위 초과의 카고를 포유동물 세포로 이동시키는 것은, 많은 생물학 분야에서 매우 바람직한 것일 수 있다. 엔도시토시스와 같은 전달 방법은 낮은 pH 미환경의 엔도솜에서 카고를 포획할 수 있고, 용해 효소는 종종 카고 분해를 야기한다 (Luo and Saltzman (2000) Nat. Biotechnol. 18: 33-37). 바이러스 및 화학 전달 방법은 바이러스 내부에 카고를 포장하거나, 흡수를 증강시키는 화학적 착물을 형성한다 (Naldini et al. (1996) Science, 272: 263-267; Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417). 그러나, 독성, 세포 유형별 특이적 흡수, 더욱 중요하게는 제한된 카고 포장 용적은 카고 크기 및 이동가능한 세포 유형에 대한 현저한 제약을 부여한다 (Luo and Saltzman, supra.).
물리적인 트랜스퍼 방법은 전기천공법 (Chu, et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 1311-1326) 및 소노포레이션 (Mitragotri (2005) Nat. Rev. Drug Discovery, 4: 255-260) (이는 무작위 분포된 나노규모 공극을 생성함), 및 옵토포레이션 (Tirlapur and Konig (2002) Nature, 418: 290-291; Vogel, et al. (2005) Appl. Phys. B: Laser Opt., 81: 1015-1047; Clark et al. (2006) J. Biomed. Opt., 11: 014034) (이는 레이져 초점에서 세포막 상의 공극을 생성함) 을 포함한다. 이들 공극을 통해, 작은 카고는 열 발산 또는 전기장에 의해 세포로 전달된다. 이들 방법으로 큰 카고를 전달하는 것은, 카고 발산의 느린 속도 및 공극 크기 증가에 따른 세포 생존력의 감소로 인해 낮은 효율을 갖는다 (Stevenson et al. (2006) Opt. Express, 14: 7125-7133). 마이크로모세관 주입 (King (2004) Methods in Molecular Biology 245: Gene Delivery to Mammalian Cells 1; Humana Press Inc.: Totowa, NJ) 은 전달을 위해 세포막을 기계적으로 관통하는 예리한 라스 팁을 이용한다. 막 관통으로부터의 기계적 트라우마는 직경이 0.5 um 까지인 전형적인 피펫 팁을 사용하여 세포 생존력을 유지시킨다 (Han et al. (2998) J. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med., 4: 215-225).
피펫 팁보다 더욱 큰 카고는 피펫 클로깅 및 카고 전단으로 인해 주입될 수 없다. 마이크로모세관 주입과 전기천공법을 결합시킨 전기주입은, 세포막을 전기장과 접촉키시고 이어서 세포를 기계적으로 온화하게 관통하는 것을 약하게 함으로써, 생세포로의 RNA 및 플라스미드 DNA 와 같은 소분자 전달을 입증하고 있으며 (Boudes et al. (208) J. Neurosci. Meth., 170: 204-211; Kitamura et al. (2008) Nat. Meth., 5: 61-67) 인공 지질 소포로의 박테리아 전달을 입증하고 있다 (Hurtig and Orwar (2008) Soft Matter, 4: 1515-1520). 대안적으로는, 단순 지질 보조 현미주사 (SLAM) 기술 (Laffafian and Hallett (1998) Biophys. J., 75: 2558-2563) 은 유리 마이크로모세관의 팁에서 합성 지질 분자를 혼입한다. SLAM 마이크로피펫을 세포막과 접촉시키는 것은, 지질 분자가 카고 전달에 대한 연속적이고 일시적인 경로를 형성하기 위해 세포막과 융합하는 것을 허용한다. 이러한 방법은 세포막을 통한 마이크로팁의 지그재그 천자 움직임을 피한다. 그러나, 카고 및 세포막과의 친지질성 상호작용은 전달 카고 뿐만 아니라 세포에서 원치 않는 생물학적 효과를 나타낼 수 있으며, 이러한 방법은 특정 세포 유형 및 카고 내용물에 한정적이다.
발명의 개요
특정 구현예에서, 본 발명은 세포에 대한 현저하게 감소된 손상 또는 스트레스를 갖는 세포의 매우 국지적인 관통을 달성할 수 있도록 세포 수술 도구를 제공한다. 특정 구현예에서 세포 마이크로서저리 도구가 제공되는데 여기서 도구는 팁에서 및/또는 팁 근처에서 전자기 에너지의 적용에 의해 가열될 수 있는 복수의 나노입자 또는 금속 필름을 갖는 마이크로모세관 (예를 들어, 마이크로피펫) 을 포함한다.
특정 구현예에서 세포 마이크로서저리 도구가 제공된다. 전형적으로, 도구는 전자기 에너지의 적용에 의해 가열될 수 있는 복수의 나노입자 또는 금속 필름을 팁에서 및/또는 팁 근처에서 갖는 마이크로모세관을 포함한다. 특정 구현예에서, 마이크로모세관은 중공 보어를 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관의 팁의 직경은, 약 0.01 ㎛, 0.05 ㎛, 0.1 ㎛, 또는 0.5 ㎛ 내지 약 1 ㎛, 3 ㎛, 5 ㎛, 8 ㎛, 또는 10 ㎛ 의 범위이다. 특정 구현예에서 마이크로피펫은 약 0.5 내지 약 2 ㎛ 또는 3 ㎛ 의 OD 를 갖는다. 다양한 구현예에서 나노입자 크기는 약 50 nm 내지 약 500 nm 범위이다. 다양한 구현예에서 나노입자 크기는 약 10 nm 내지 약 500 nm 범위이다. 다양한 구현예에서 나노입자는 나노비드, 나노와이어, 나노튜브, 나노도트, 나노콘 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서 금속 필름 또는 나노입자는 귀금속, 귀금속 합금, 귀금속 니트라이드, 및/또는 귀금속 옥시드를 포함한다. 다양한 구현예에서 금속 필름 또는 나노입자는 전이 금속, 전이 금속 합금, 전이 금속 니트라이드, 및/또는 전이 금속 옥시드를 포함한다. 다양한 구현예에서 금속 필름 또는 나노입자는 자성, 상자성, 또는 초상자성 물질을 포함한다. 다양한 구현예에서 마이크로모세관은 유리, 광물, 세라믹 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서, 마이크로모세관은 팁 근처에서 나노입자를 갖는 유리 마이크로모세관을 포함한다. 특정 구현예에서, 마이크로모세관은 팁 근처에서 금 나노입자를 갖는 유리 마이크로모세관을 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 나노입자가 마이크로모세관의 팁의 100 μm 내에 우세하게 위치하고 있는 유리 마이크로모세관을 포함한다.
또한 제공되는 것은 세포 상에서 현미조작을 수행하는 방법이다. 본 방법은 전형적으로, 본원에 기술된 바와 같이 세포를 마이크로서저리 도구과 접촉시키는 것; 및 전자기파 에너지를 도구에 적용시키는 것을 포함하며, 이에 의해 금속 필름 또는 금속 나노입자의 온도는 증가되며, 이에 의해 세포막으로 또는 세포막을 통해 도구의 관통을 촉진시킨다. 특정 구현예에서, 전자기파 에너지는 금속 필름 또는 나노입자를 가열시키기 위해 빛을 적용시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 전자기파 에너지를 적용하는 것은 금속 필름 또는 나노입자를 가열시키기 위해 레이져 빔을 적용하는 것을 포함한다. 레이져 가열이 일반적으로 바람직한 반면, 다른 전자기파 원천도 고려된다. 따라서, 특정 구현예에서, 전자기파 에너지를 적용하는 것은, 금속 필름 또는 나노입자를 가열시키기 위해 자기장을 적용시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 전자기파 에너지를 적용하는 것은 금속 필름 또는 나노입자를 가열하기 위해 전기장을 적용하는 것을 포함한다. 다양한 구현예에서 금속 필름 또는 금속 나노입자의 온도는, 주위온도보다 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 또는 350 도 (Celsius) 초과로 증가된다. 특정 구현예에서, 방법은 마이크로모세관 튜브를 통해 세포에 물질을 주입하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서 방법은 마이크로모세관 튜브를 통해 세포로부터 물질을 제거하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 중공 보어를 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관 팁의 직경은 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 ㎛ 범위이다. 특정 구현예에서 나노입자 크기는 약 5 nm 내지 약 500 nm 및/또는 약 10 nm 내지 약 400 nm 범위이다. 특정 구현예에서 나노입자는 나노와이어, 나노튜브, 나노도트, 나노콘 및 양자도트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서 금속 필름 또는 나노입자는 귀금속, 귀금속 합금, 귀금속 니트라이드, 및 귀금속 옥시드를 포함한다. 다양한 구현예에서 금속 필름 또는 나노입자는 전이 금속, 전이 금속 합금, 전이 금속 니트라이드, 및 전이 금속 옥시드를 포함한다. 다양한 구현예에서 금속 필름 또는 나노입자는 자성, 상자성, 또는 초상자성 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 유리, 광물 (예를 들어, 석영), 세라믹, 및 플라스틱 (예를 들어, 폴리프로피넨, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, DELRIN®, TEFLON®, 등) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 팁 근처에서 나노입자를 갖는 유리 또는 석영 마이크로모세관을 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 팁 근처에서 금 나노입자를 갖는 유리 마이크로모세관을 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은, 나노입자가 마이크로모세관의 팁의 100 μm 내에서 우세하게 위치한 유리 마이크로모세관을 포함한다.
또한 제공되는 것은 세포 상에서 현미수술을 수행하기 위한 시스템이고, 상기 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 현미수술 도구를 포함하고, 현미수술 도구를 위치시키기 위한 미조정 장치 (마이크로포지셔너) 를 포함한다. 특정 구현예에서 시스템은 현미수술 도구에 의해 조작되는 세포를 가시화하기 위한 현미경을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 시스템은 현미수술 도구를 사용하여 시약 (예를 들어, 분자, 세포기관, 또는 세포액) 을 제거하거나 전달하기 위한 펌프를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 시스템은 현미수술 도구에 대한 입자/나노입자 및/또는 박막을 자극하기 위한 전자기파 에너지원 (예를 들어, 레이져) 을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서 전자기파 에너지원은 자기장 생성기, 레이져, RF 장 생성기 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서 본 발명은 세포 상의 현미수술에 대한 도구를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 전형적으로 마이크로모세관의 팁에서 또는 이의 근처에서 마이크로모세관 튜브에 부착하는 복수의 나노입자를 포함하며, 이에 의해 나노입자에 대한 전자기파 에너지의 적용에 의해 국지적으로 가열될 수 있는 장치가 제공된다. 특정 구현예에서 부착은 마이크로모세관으로 나노입자를 흡수하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서 부착은 마이크로모세관으로의 나노입자의 화학적 커플링을 포함한다.
특정 구현예에서 본 발명의 단일-세포 수술 도구는 원자력 측정 (AFM) 팁을 포함한다. 예를 들어, 나노입자는 세포 수술 적용을 위한 AFM 팁으로 통합될 수 있다. 나노입자 통합된 AFM 팁은 팁을 스캔하고 이를 레이져 펄스함으로써 세포막 상에서 임의의 원하는 모양으로 절단할 수 있다.
특정 다른 구현예에서 본 발명의 도구는 원자력 측정 (AFM) 팁을 명백히 배제한다.
또한 제공되는 것은 작용물질을 세포로 전달하기 위한 장치이다 (트랜스펙션 장치). 다양한 구현예에서 장치는 입자 및/또는 나노입자 및/또는 필름 (예를 들어, 박막) 를 갖는 표면 (예를 들어, 트랜스펙션 기판) 을 포함하며, 이때 입자/나노입자 및/또는 박막은 에너지원 (예를 들어, 전자기파 방사 예컨대 레이져) 에 노축시 (예를 들어 조사에 의해) 가열되는 물질을 포함한다. 세포는 표면 상에 또는 표면 근처에 배치될 수 있고, 입자/나노입자 및/또는 박막이 가열될 때, 오프닝이 세포에서 형성되어 (예를 들어, 세포막이 관통가능하게 됨) 세포로 다양한 시약의 도입 또는 세포로부터 다양한 시약의 제거가 허용된다. 특정 구현예에서 표면은 관의 표면 (예를 들어, 미세유체역학 장치에서 세포 배양관, 미세적정 플레이트, 챔버 등) 을 포함한다. 특정 구현예에서, 표면은 미세유체역학 장치에서 미세적정 플레이트, 실리콘 또는 유리 웨이퍼, 현미경 슬라이드, 세포 배양관, 또는 챔버 또는 채널에서 웰의 벽 및/또는 웰의 바닥을 포함한다. 특정 구현예에서 표면은 현미경으로 관찰하기 위해 배치되고 세포를 함유하도록 배열되는 챔버의 표면을 포함한다. 특정 구현예에서 표면은 현미경 (예를 들어, 도립 현미경) 에 대한 스테이지를 대체하기 위해 배열된 챔버의 표면을 포함한다. 특정 구현예에서 챔버는 오픈 탑을 갖고, 다른 구현예에서, 챔버의 탑은 닫힌다. 특정 구현예에서 표면은 유리, 광물, 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 표면은 II 족 물질, III 족 물질, IV 족 물질, V 족 물질, 및/또는 VI 족 물질로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 표면은 IV 족 물질 (예를 들어, 규소, 게르마늄, 등) 을 포함한다.
다양한 구현예에서 표면은 하나 이상의 오리피스를 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 오리피스의 표면 상에 또는 오리피스 근처에 침착된다. 특정 구현예에서 표면은 둘 이상의 오리피스, 또는 적어도 3 오리피스, 또는 적어도 4 오리피스, 또는 적어도 5 오리피스, 또는 적어도 8 오리피스, 또는 적어도 10 오리피스, 또는 적어도 15 오리피스, 또는 적어도 20 오리피스, 또는 적어도 25 오리피스, 또는 적어도 30 오리피스, 또는 적어도 40 오리피스, 또는 적어도 50 오리피스, 또는 적어도 75 오리피스, 또는 적어도 100 오리피스, 또는 적어도 200 오리피스, 또는 적어도 300 오리피스, 또는 적어도 500 오리피스를 포함한다. 특정 구현예에서 상기 오리피스는 모두 약 2 ㎠ 이하, 또는 약 1 ㎠ 이하, 또는 약 0.5 ㎠ 이하, 또는 약 0.1 ㎠ 이하의 상기 표면적 내에서 위치한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 약 100 μm 이내, 또는 약 50 μm 이내, 또는 약 25 μm 이내, 또는 약 20 μm 이내, 또는 약 15 μm 이내, 또는 약 10 μm 이내, 또는 약 5 μm 의 상기 오리피스(들) 이내에 배치된다. 특정 구현예에서 입자/나노입자 및/또는 박막은 복수의 오리피스의 표면 상에 및/또는 복수의 오리피스의 표면 상에 침착된다. 특정 구현예에서 입자/나노입자 및/또는 박막은 대다수의 오리피스의 표면 상에 및/또는 대다수의 오리피스 근처에 침착된다. 특정 구현예에서 입자/나노입자 및/또는 박막은 실질적으로 모든 오리피스의 표면 상에 및/또는 실질적으로 모든 오리피스의 근처에 침착된다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 오리피스(들)의 립 주변에 모두 침착되고/침착되거나 벽 위에 침착된다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 오리피스(들)의 벽 또는 립의 하나의 영역 상에서 우선적으로 존재한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 세포가 배치된 동일한 면 위에서 오리피스의 립 상에서 및/또는 표면의 표면상에 침착된다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 세포가 배치된 면 반대편 오리피스의 립 위에 및/또는 표면의 표면상에 침착된다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 박막을 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 나노입자를 포함하고, 나노입자 크기 범위는 약 5 nm 내지 약 500 nm 이다. 특정 구현예에서 나노입자 크기 범위는 약 2 nm, 또는 약 5 nm, 또는 약 10 nm, 또는 약 15 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 400 nm, 또는 내지 약 300 nm, 또는 내지 약 250 nm, 또는 내지 약 200 nm, 또는 내지 약 150 nm, 또는 내지 약 100 nm, 또는 내지 약 75 nm, 또는 내지 약 50 nm 이다. 특정 구현예에서 나노입자는 나노비드 또는 나노스피어, 나노와이어, 나노튜브, 나노도트, 나노콘, 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 반도체, 금속, 금속 합금, 금속 니트라이드, 및 금속 옥시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 전이 금속, 전이 금속 합금, 전이 금속 니트라이드, 및 전이 금속 옥시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막 금, 티탄 (Ti), TiN, TiCn, 및 TiAlN 로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 III 족 물질 또는 V 족 물질로 도핑된 IV 족 물질 (예를 들어, 규소, 게르마늄, 등) 을 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 붕소, 비소화합물, 인, 또는 갈륨로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 도핑되는 규소 또는 게르마늄을 포함한다. 특정 구현예에서 하나 이상의 오리피스는 플루이드 내에서 세포로 전달되는 시약을 함유하는 챔버와 소통한다. 특정 구현예에서 장치는 플루이드 내에서 마이크로채널과 소통하는 하나 이상의 오리피스 및 마이크로채널을 포함한다. 특정 구현예에서 장치는 복수의 마이크로채널을 포함한다. 특정 구현예에서 상이한 마이크로채널은 플루이드 내에서 상이한 오리피스와 소통한다. 특정 구현예에서 장치는 상이한 마이크로채널로 플루이드를 전달하기 위한 다기관 및/또는 밸브를 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로채널(들)은 상기 세포로 전달되는 시약을 함유한다. 특정 구현예에서 시약은 핵산, 리보자임, 단백질 또는 펩티드, 효소, 항체, 세포기관, 염색체, 병원체, 및 마이크로입자 또는 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서 마이크로채널(들) (또는 챔버(들))은 펌프의 제어 하에서 가압되거나, 중력 공급에 의해 공급되거나, 또는 전기동역학적으로 펌핑된다. 특정 구현예에서 장치는, 상기 마이크로채널에서 플로우를 모니터링하고 / 모니터링하거나 제어하고 시간 및 임의적으로는 상기 표면의 조명 위치를 제어하는 콘트롤러를 포함한다. 특정 구현예에서 장치는 도립 현미경 상에서 단계를 대체하기 위해 설정된다. 다양한 구현예에서 하나 이상의 세포는 표면 상에 배치되고 특정 구현예에서, 세포(들)은 기판에서 오리피스 상에 배치되거나 오리피스에 인접하여 배치된다. 특정 구현예에서 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 비-인간 포유동물 세포) 이다. 특정 구현예에서 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 태아 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포 (IPSC), 등) 이다.
특정 구현예에서 시스템은 세포 또는 세포 그룹으로의 오프닝을 선택적으로 창출하기 위해 제공된다. 특정 구현예에서 시스템은 작용물질을 세포로 선택적으로 전달하기 위한 것이다. 시스템은 전형적으로, 트랜스펙션 기판 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음) 및 나노입자 또는 박막을 가열할 수 있는 전자기파 에너지원을 포함하는 장치를 포함한다. 특정 구현예에서 전자기파 에너지원은 레이져 또는 비-간섭성 광원이다. 특정 구현예에서 전자기파 에너지원은 레이져이다. 특정 구현예에서 시스템은 렌즈 시스템, 반사경 시스템 또는 마스크 및/또는 표면의 특정 영역으로 전자기파 에너지를 직접 가하는 위치화 시스템을 포함한다. 특정 구현예에서 시스템은 전자기파 방사원에 의해 조명의 패턴 및/또는 시간을 제어하는 콘트롤러를 포함한다.
특정 구현예에서 방법은 세포 또는 세포의 그룹으로 오프닝을 선택적으로 창출하기 위해 제공된다. 특정 구현예에서 본 방법은 시약 (또는 다중 작용물질) 을 세포로 선택적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 방법은 트랜스펙션 기판 및/또는 시스템 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음) 을 이용한다. 따라서 특정 구현예에서, 시약을 세포로 전달하는 방법이 제공된다. 본 방법은 세포를 트랜스펙션시키기 위한 장치 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음) 를 포함하는 시스템에 및/또는 트랜스펙션 기판 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음) 을 포함하는 장치에 세포를 제공하는 단계 (이때 세포는 표면 (트랜스펙션 기판) 상에 배치됨); 세포와 시약을 접촉시키는 단계; 및 표면 영역을 전자기파 방사에 노출시키는 단계 (이에 의해 박막 및/또는 입자의 가열이 유도되며, 이때 가열은 시약을 상기 세포로 전달되게 하는 가열 영역 (또는 근처 영역) 에서 세포막의 오프닝을 도입시키는 버블을 형성함) 를 포함한다. 특정 구현예에서 세포는 세포 주변에서 플루이드 (예를 들어, 버퍼, 배양 배지) 내에 시약을 제공함으로써 시약과 접촉한다. 특정 구현예에서 세포는 표면에 존재하는 하나 이상의 오리피스에서 시약을 제공함으로써 시약과 접촉한다. 특정 구현예에서 세포는, 플루이드 내에서 오리피스와 소통하는 하나 이상의 미세유체역학 채널에 시약을 제공함으로써 시약과 접촉한다. 특정 구현예에서 노출시키는 것은, 기판 영역을 비-간섭성 광원 또는 레이져 펄스에 노출시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서 시약은 핵산, 염색체, 단백질, 라벨, 세포기관, 및 작은 유기 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서 팁에서 열 분포를 미세조정하고/미세조정하거나 광 가이드로서 마이크로모세관의 팁을 이용하는, 세포에 대한 현미조작을 수행하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서 본 방법은, 세포를 현미수술 도구 (상기 도구는 팁에서 및/또는 팁 근처에서 금속 필름 (코팅) 을 갖는 마이크로모세관을 포함함) 및/또는 전자기파 에너지의 적용에 의해 가열될 수 있는 금속 나노입자와 접촉시키는 단계; 전자기파 에너지를 도구에 적용시키는 단계 (이에 의해 금속 필름 또는 금속 나노입자의 온도는 세포막의 오프닝 형성을 야기하도록 증가되고, 이때 연미수술 도구의 각과 세포의 접촉 및/또는 전자기파 에너지의 편광화는 세포로 도입되는 오프닝의 크기 및/또는 모양을 변경하기 위해 다변화시킬 수 있음) 를 포함한다. 특정 구현예에서, 전자기파 에너지를 적용하는 것은 필름 또는 나노입자를 가열하기 위해 빛 (예를 들어 레이져 또는 비-간섭성 빛) 을 적용하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서 현미수술 도구의 팁은 광 가이드로서 작용하도록 설정된다. 특정 구현예에서, 전자기파 에너지를 적용하는 것은 필름 또는 나노입자를 가열하기 위해 레이져 빔을 적용하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 전자기파 에너지를 적용하는 것은 금속 필름 또는 나노입자를 가열하기 위해 전기장 및/또는 자기장을 적용하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 금속 필름 또는 금속 나노입자의 온도는 주위 온도보다 적어도 150 ℃ 초과로 증가된다. 특정 구현예에서 본 방법은 마이크로모세관 튜브를 통해 시약을 세포에 주입하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 마이크로모세관의 팁 직경 범위는 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 ㎛ 이다. 특정 구현예에서 나노입자의 크기 범위는 약 5 nm 내지 약 500 nm 이다. 특정 구현예에서 금속 필름 또는 나노입자는 반도체, 또는 귀금속, 귀금속 합금, 귀금속 니트라이드, 및 귀금속 옥시드로 이루어진 군으로붙 선택되는 금속을 포함한다. 특정 구현예에서 금속 코팅 또는 나노입자는 전이 금속, 전이 금속 합금, 전이 금속 니트라이드, 및 전이 금속 옥시드를 포함한다. 특정 구현예에서 금속 코팅 또는 나노입자 금, 티탄 (Ti), TiN, TiCn, 및 TiAlN 로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 유리, 광물, 세라믹, 및 플라스틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서, 나노입자 또는 필름은 필름을 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자 또는 필름은 나노입자를 포함한다.
정의
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "나노입자"는, 약 800 nm 또는 700 nm 또는 600 nm, 또는 500 nm 이하, 바람직하게는 약 200 nm 또는 150 nm, 또는 100 nm 이하, 보다 바람직하게는 약 50 또는 20 nm 이하의 평균 크기를 갖는 치수 하나 이상을 갖는 입자를 지칭하거나, 또는 표준 2-세타 x-선 회절 스캔의 절반 회절 피크 폭 및/또는 전자 현미경 이미지로부터 측정된 바와 같이 약 10 nm 이하의 결정 크기를 갖는다. 특정 구현예에서, 바람직하게는, 크기 분포의 제 1 표준 편차는 평균 입자 크기의 60% 이하, 바람직하게는 40% 이하, 가장 바람직하게는 15 내지 30% 이다.
나노입자 크기에 대한 표현 "크기 범위" 는 나노입자가 그 크기 범위 이내에서 우세하게 존재함을 나타내는 것이다. 따라서, 예를 들어, 특정 구현예에서, 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98%, 99%, 또는 심지어 모든 나노입자가 언급된 크기 범위 내에서 존재한다.
용어 "전이 금속" 은 전형적으로, 아연, 카드뮴 및 수은을 배제한 주기율표 d-블록의 임의의 원소를 지칭한다. 이는 주기율표의 3 족 내지 12 족에 상응한다.
용어 "마이크로모세관 튜브", "마이크로모세관" 및 "마이크로피펫" 은 상호교환적으로 사용된다. "마이크로모세관" 은 약 50 μm 이하, 바람직하게는 약 25 μm 이하, 보다 바람직하게는 약 15 μm 또는 10 μm 이하, 가장 바람직하게는 약 5 μm 이하의 직경의 팁을 갖는 튜브이다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 약 2 μm 이하의 팁 직경을 갖는다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 고체 막대일 수 있다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 더 큰 팁 직경 (예를 들어 상기 기술된 바와 같이 약 200 nm 초과) 을 갖는 피펫 (모세관 튜브) 으로 대체될 수 있다.
본원에 문법적으로 등가의 표현인 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 는 공유적으로 함께 연결된 둘 이상의 뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명의 핵산은 바람직하게는 단일-가닥 또는 이중 가닥이고, 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유하며, 몇몇 경우 하기 개요되는 바와 같이, 포함되는 핵산 유사체는 예를 들어 하기를 포함하는 대안적인 골격을 가질 수 있다: 포스포라미드 (문헌 Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925) 및 이에 인용된 것; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; 및 문헌 Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419), 포스포로티오에이트 (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; 및 U.S. 특허 No. 5,644,048), 포스포로디티오에이트 (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111 :2321, O-methylphophoroamidite linkages (참조, Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), 및 펩티드 핵산 골격 및 연쇄 (참조, Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008; Nielsen (1993) Nature, 365: 566; Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207). 다른 핵산 유사체는 하기를 포함한다: 양성 골격을 갖는 것 (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097; 비-이온성 골격 (U.S. 특허 Nos. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141 및 4,469,863; Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) 및 비-로오스 골격 (하기에 기술되는 것 포함: U.S. 특허 Nos. 5,235,033 및 5,034,506, 및 Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook). 하나 이상의 카르보시클릭 당을 함유하는 핵산이 또한 핵산의 정의 내에 포함된다 (참조, Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. pp169-176). 수 개의 핵산 유사체는 문헌 [Rawls, C & E News June 2, 1997 page 35] 에 기술되어 있다. 리보오스-포스페이트 골격의 이들 변형은 추가의 부분, 예컨대 라벨의 첨가를 촉진하거나 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 행해질 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 은 본원에서 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하기 위해 호환되어 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학물 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드를 만들어내는 아미노산을 결합시키는 전통적인 펩티드 연결 상의 변이체를 포함한다. 바람직한 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질" 은 그의 α 탄소가 펩티드 연결을 통해 연결된 아미노산의 사슬이다. 따라서, 사슬의 한 말단 (아미노 말단) 에서의 말단 아미노산은 유리된 아미노기를 갖고, 사슬의 다른 말단 (카르복시 말단) 에서의 말단 아미노산은 유리된 카르복실기를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노 말단" (N-말단으로 간략하게 함) 은 펩티드의 아미노 말단에서의 아미노산 상의 유리된 α-아미노기 또는 펩티드 내 임의의 기타 위치에서의 아미노산의 α-아미노기 (펩티드 결합에 참여하는 경우에는 이미노기) 를 지칭한다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단" 은 펩티드의 카르복시 말단 상의 유리된 카르복실기 또는 펩티드 내 임의의 기타 위치에서의 아미노산의 카르복실기를 지칭한다. 펩티드에는 또한 본질적으로, 이에 제한되지 않으나, 아미드 결합과는 대조적으로 에테르에 의해 결합된 아미노산과 같은 펩티드 모사체를 포함하는 임의의 폴리아미노산이 포함된다.
세포로 전달되는 물질에 대해 사용될 때 용어 "시약(들)"은, 세포로 전달되는 임의의 물질 또는 세포로부터 추출되는 임의의 물질을 포함한다. 이러한 시약에는 예를 들어 하기가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다: 핵산 (예를 들어, 벡터 및/또는 발현 카세트, 저해성 RNA (예를 들어, siRHA, shRNA, miRNA 등 포함), 리보자임, 단백질/펩티드, 효소, 항체, 이미징 시약, 세포기관 (예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 핵소체, 라이소좀, 리보솜 등), 염색체, 세포내 병원체, 무생물 입자, 예컨대 양자점, 표면-증강된, Raman 산란 (SERS) 입자, 마이크로비드, 등.
도 1 은 세포-수술 도구의 하나의 구현예를 도식적으로 나타낸다.
도 2 는 합성된 금 나노입자의 TEM 이미지 (우측 패널) 및 탄소로 코팅된 유리 마이크로피펫의 SEM 이미지 (좌측 패널) 를 나타낸다.
도 3 은 레이져 펄스 전후의 세포를 나타낸다. (상부) 유리 마이크로피펫 (중간) 탄소 코팅된 마이크로피펫 (하부) 금 나노입자 코팅된 마이크로피펫.
도 4 는 가로세로 비 3.2 (A:24 hr) 및 5.8 (C: 72 hr) 의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 5 는 플라스틱 기판 상에 직접 금 입자를 포격하기 위해 바이오리스틱 주입기 (좌측 패널) 를 사용하는 트랜스펙션 기판의 제작을 나타낸다. 중간 패널은 기판 상의 전형적인 입자를 나타내는 반면, 우측 패널은 기판 상의 입자 밀도를 나타낸다.
도 6 패널 A-D 는 어닐링 입자를 형성하기 위해 박막을 가열하여 (예를 들어 펄스 레이져를 이용하여) 나노입자를 표면 상에 형성시키는 방법을 나타낸다. 이러한 예에서, 2 nm 티탄 부착 층을 갖는 30 nm 금 필름을 100 펄스 동안 113.2 mJ/㎠ 에서 펄스 레이져 (532 nm, 6 ns) 로 가열하였다. 입자 크기 범위는 0.1 내지 0.7 μm (참조, 예를 들어, 패널 C) 였다. 입자 밀도는 약 0.65 입자/ μm2 = 65 입자 /세포 (세포 면적~10 μm x 10 μm 로 가정) 였다.
도 7 은 금 입자 코팅된 기판을 사용하여 광-패턴 분자를 전달할 수 있는 장치의 하나의 구현예를 도식적으로 나타낸다.
도 8 은 공동 기포 역학을 포착하기 위해 사용되는 시간-분해 이미징 시스템 및 광-패턴 분자 전달을 위한 실험적 단계를 도식적으로 나타낸다.
도 9 는 금 입자 상에서 펄스 레이져 조사에 의해 유도된 기포를 나타낸다. (a) 레이져 펄스 전 (b) 레이져 펄스 후 78 ns. Bar = 50 μm.
도 10 은 쉐도우 마스크를 사용하는 HEK293T 세포에서의 광-패턴 형광 염료 흡수를 나타낸다. (a) 밝은 영역 (b) 형광 이미지 (파선의 우측 면을 커버하는 마스크).
도 11 은 293T 세포 상에서 예비 광열 피펫을 나타낸다. 레이져 펄스 전 (좌측 컬럼) 및 후 (우측 컬럼). 피펫을 상이한 두께의 Au/Pd 박막으로 코팅하였다. 필름 두께 = 5 nm (패널 a) 대 13 nm (패널 b). 둘 모두의 실험에서 사용되는 레이져 플루언스는 88.3 mJ/㎠ 였다.
도 12 패널 a-c 는 금 박막 코팅된 피펫을 사용하여 점착성 293T 세포로의 GFP-인코딩 플라스미드의 현미주사를 나타낸다. 패널 a: 현미주사 절차, 패널 b: 주입 24 시간 후 세포의 형광 이미지 (이는 세포 생존력 및 GFP 발현을 나타냄), 패널 c: 상 콘트라스트 및 형광 이미지를 오버랩하는 이미지.
도 13 은 광학 트위져와 결합된 플라즈몬 광열 피펫을 사용하는 비-점착성 세포 현미주사 (상부 패널) 및 광열 피펫 팁과 접촉하면서 광학 트위져에 의패 포획된 Nalm-6 세포를 나타내는 이미지 (하부 패널) 를 도식적으로 나타낸다.
도 14 는 하나 이상의 시약의 세포로의 평행적 선택적 전달을 위한 기판을 도식적으로 나타낸다.
도 15 는 시약을 세포로 선택적으로 전달하기 위한 마이크로채널을 포함하는 "트랜스펙션 기판" 의 하나의 배치를 도식적으로 나타낸다.
도 16A-16C 는 하나 이상의 시약을 세포로 평행적 선택적으로 전달하기 위한 하나의 기판의 작업을 기재하고 있다. 도 16A 에서 나타낸 바와 같이, 정렬에서 오리피스 중 하나에 걸쳐 세포를 배치하고 오리피스는 플루이드 내에서 마이클로채널과 소통한다. 도시된 바와 같이, 이 경우 오리피스의 하나의 가장자리를 티탄의 박막으로 코팅한다. 에너지원 (예를 들어, 펄스 레이져) 를 사용하여 필름을 가열한다. 이는 도 16B 에서 나타낸 바와 같이 박막의 가열을 야기한다. 팽창 증기 기포가 형성되어 세포의 지질이중층을 통해 오프닝 형성을 야기한다. 도 16C 에서 나타낸 바와 같이, 수동적 발산 또는 활성 펌핑을 통해 오리피스를 세포로 통한 마이크로채널로부터 전달 가능한 물질을 통과시킨다.
도 17 은 도 14 에서 설명한 바와 같은 것과 같이 기판을 제작하는 방법을 도식적으로 나타낸다.
도 18 은 설명적인 트랜스펙션 기판의 사진을 나타낸다.
도 19 는 시약 전달 기판 상에서 기포 자극을 나타낸다. 레이져 펄스로 구조를 조사함으로써 (펄스폭 6 ns 및 파장 532 nm), 순환적 오프닝의 경우 기포가 동시에 생성된다. 초승달 모양 Ti-박막 코팅으로 인해, 기포 폭발은 오직 원통형 측벽 부분에 따라 발생한다.
도 20 패널 A 및 B 는, 막 오프닝 (패널 (a)) 및 HeLa 세포로 시험 시약을 전달하기 위해 시약 전달 기판의 사용 (패널 (b)) 을 나타낸다. 막-불침투성 녹색-형광 FITC-덱스트란 (분자량 = 3kDa) 을 200 μg/ml 의 농도로 세포 배양 배지에 적재하였다. 156 mJ/㎠ 에서 레이져 펄스 후 형광 염료 흡수를 환형 오리피스의 상부에서 성장시킨 세포에서 관찰하였고 레이져-촉발된 기포 팽창으로 처리하였다. 여기서 전달은 수동적 발산이다.
도 21 은 살아 있는 포유동물 세포로 카고 전달을 위한 광열 나노 블레이드를 사용하는 초고속 막 절단 기전을 나타낸다. Ti 박막은 유리 마이크로피펫의 외측을 코팅한다. 나노초 레이져 펄스로 자극시, Ti 는 열 전도를 통해 수성 층 주변에 필름에 따라 신속히 가열된다. 팽창하고 <1 μs 에서 붕괴하는 폭발성 증기 나노기포는 마이크로모세관 내용물의 압력 유도 전달에 따른 동기화에서 접촉 세포막을 국지적으로 절단한다.
도 22A-22D 는 Ti-코팅된 마이크로피펫의 구조 및 레이져 자극으로부터 계산된 밀도 패턴을 나타낸다. 도 22A 및 22B: 당겨진 전자 스캔 현미경 이미지, Ti-코팅된 마이크로피펫. 내부 직경 = 1.38 ± 0.1 μm (평균 ± s.d.). 외부 직경 = 1.88 ± 0.1 μm. Ti 박막 두께 = 102 ± 8 nm. (화살표는 마이크로피펫 내부에 흐르는 유리 필라멘트의 가장자리를 나타냄). 도 22C: 레이져 자극 하에서 마이크로피펫의 팁에서 정상화 강도 특성 (nTi = 1.86 + 2.56i (Lynch and Hunter (1998) Introduction to the data for several metals. In Handbook of optical Constants of Solids , Vol. III; Academic Press: San Diego, CA), n유리 = 1.46, n물 = 1.34, λ = 532 nm, θ=30°). 도 22D: 마이크로피펫 팁에서 Ti 고리에서 시간-평균 광학 흡수 특성
Figure 112013114031110-pct00001
.
도 23A-23C 는 광열 나노블레이드에 의한 초속 막 절단 및 세포 생존력 평가를 나타낸다. 도 23A: 세포막과 접촉시 피펫 팁의 테두리로부터 0.4 μm 로 확장된 최대 반경을 갖는 나노기포. 접촉 막으로의 에너지 전달은 형성 나노기포의 크기를 감소시키고 원형질막을 국지적으로 절단한다. 도 23B: HeLa 세포막과 접촉시 170 ns 및 자유 현탁액에서 270 ns 내에서 증기 나노기포의 신속 팽창 및 붕괴 역학. 도 23C: 광열 전달 후 세포 생존력. 세포와 접촉시 유리만의 마이크로피펫을 사용하여 제어 실험을 수행하고 (막을 통한 피어싱 없음) 동일한 플루언스에서 레이져 펄스로 조명하였다 (180 mJ/㎠). 세포가 레이져 펄스로 처리될 때 세포 생존력은 >90% 이고 막 오프닝 단독 (98 ± 11% (평균 ± s.d.)) 및 실험에서 레이져 펄스 및 액체 주입으로 처리되는 세포 (94 ± 4%).
도 24 는 광열 나노블레이트에 의해 전달 가능한 카고 크기의 폭넓은 범위를 나타낸다. GFP-발현 RNA 는 리포펙타민-내성 IMR90 주요 인간 폐 섬유증으로 전달되었다. 100 nm 녹색 형광 비드 상에서 코팅된 DsRed-함유 렌티바이러스는 이동에 따른 ROCK 저해제 분산된 인간 배아 줄기 세포에서 발현되었다. 직경이 200 nm 인 형광 비드를 클로깅 없이 HEK293T 세포로 전달하였다. HeLa 세포로의 B. 타이란덴시스 박테리아의 전달이 고효율 및 고 세포 생존력을 갖고 달성되었다.
도 25A-25C 는 광열 나노블레이트에 의해 HeLa 세포로의 고효율 박테리아 전달을 나타낸다. 도 25A: 이동에 따른 박테리아 흡수 경로 (Wiersinga et al. (2006) Nat. Rev. Microbiol. 4: 272-282). 도 25b: 적색-형광 덱스트란테트라메틸로다민에 따라 GFP-라벨링된 부르크홀더리아 타이란덴시스를 HeLa 세포로 이동시켰다 (평균 효율 = 46 ± 33% (평균 ( s.d.)). 공초점 z-축 스캐닝은 적색-형광 세포 내에서 다중 박테리아를 나타낸다. 도 25b: 이동된 mCherry-라벨링된 B. 타이란덴시스의 증식 및 액틴 중합.
도 26 은 상이한 레이져 편광 하에서 광열 나노블레이트에 의해 생성된 세포막 절단 패턴 및 마이크로피펫 지향을 나타낸다. 레이져 플루언스 = 360 mJ/㎠. 피펫 팁 직경 = 2 μm. (a) 선형 편광. (b) 원형 편광. (c) 수직 축으로부터 30°기울어진 선형 편광화된 레이져 자극. 설정 바 = 1 μm.
도 27 은 나노블레이트 팁에서 열 분포에 대한 편광 및 조명각의 효과를 나타낸다. 순간적인 강도를 상부줄에 나타내고 시간 평균 강도를 바닥줄에 나타낸다. 좌측 컬럼은 선형 편광을 갖는 수직 지향 팁을 나타낸다. 중간 컬럼은 원형 편광을 갖는 수직 지향 팁을 나타낸다. 우측 컬럼은 선형 편광을 갖는 기울어진 팁 (30°) 을 나타낸다.
도 28A-28C 는 세포로 들어가는 오프닝에 대한 편광 및 조명각의 효과를 나타낸다. 도 28A 는 선형 편광화된 빛을 사용하여 가열된 수직 피펫 (나노블레이드) 로 제조된 오프닝을 나타낸다. 도 28B 은 원형 편광화된 빛을 이용하여 가열된 수직 피펫 (나노블레이드) 으로 제조된 오프닝을 나타낸다. 도 28C 는 기울어진 피펫 (나노블레이드) 으로 제조된 오프닝을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명은 단일 세포에 대한 "수술" 절차에 유용한 신규한 도구/장치 및 세포의 조작을 위한 기판 및/또는 이들 세포로부터 시약의 전달 또는 추출에 관한 것이다.
세포 상의 작업을 위한 수술 도구.
다양한 구현예에서, "단일 세포 수술 도구" 는 세포 손상을 최소한으로 하면서 현미주사, 마이크로추출 및/또는 세포내 조작을 수행하기 위해 제공된다. 지질 이중층에 의해 결합되는 임의의 세포를 이용할 수 있다 (예를 들어, 진핵 세포, 보다 바람직하게는 척추동물 세포, 여전히 보다 바람직하게는 포유동물 세포 유형). 특정 구현예에서, 장치는 세포벽을 포함하는 세포 (예를 들어 식물 세포) 를 이용할 수 있다.
특정 설명적 구현예에서, 장치는 마이크로모세관의 팁에서 또는 마이크로모세관의 근처에서 "에너지 흡수제" 나노입자 및/또는 "에너지 흡수제" 박막을 포함하는 마이크로모세관 튜브 (예를 들어 마이크로피펫) 을 포함한다. 이러한 장치는, 마이크로모세관 상에서 코팅된 금속 입자/나노입자 및/또는 금속 필름 (예를 들어 나노코팅) 의 자극/가열 (예를 들어, 레이져-유도 가열) 에 의한 정확하고 제어가능한 나노규모 세포 변형을 달성한다. 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 이러한 극도의 국지적인 가열은 세포 표면 근처에서 또는 세포 표면과 접촉시, 세포막 (및/또는 세포벽) 에서 정확한 크기의 정공을 생성시킨다. 이러한 방식으로, 마이크로피펫은 현재 현미주사 및 추출 기술과 연계된 기계적 및 생물학적 손상을 유도하지 않으면서 용이하게 세포막을 관통한다. 이러한 도구는 높은 성공 비율로, 작고 기계적으로 깨지기 쉬운 세포에 대한 작업 절차를 촉진한다.
단일-세포 현미주사는 외인성 물질을 세포로 도입하기 위한, 세포 사이의 세포 성분을 추출하고 이동시키기 위한, 및/또는 세포 내에서 발견되는 정상적이지 않은 성분 (예컨대 프로브, 디텍터 또는 유전자조작된 세포기관, 유전자, 단백질 등) 을 도입하기 위한, 강력하고 다재다능한 기술이다. 트랜스제닉 마우스를 생성하기 위해 사용되는 기술과 같은 통상적인 유리 마이크로피펫 기술은, 세포에 기계적이고 생물학적인 큰 스트레스를 주는 것이고 성공률은 낮으며, 특히 깨지기 쉬운 세포를 기계적으로 조작할 때 그러하다.
현재 레이져-유도 세포 제거 절차는 이러한 기계적 스트레스를 없앴으나 초정밀도로 초점을 맞추는 것이 요구되며 손상 부피는 회절-제한적이다. 대조적으로, 본원에 기술되는 세포 수술 도구는 피펫 팁에서 또는 피펫 팁 근처에서 입자/나노입자 및/또는 박막의 국지적 가열에 의한 모세관 마이크로피펫의 팁에서 또는 팁 근처에서 나노미터 크기 규모로 조작 (예를 들어, 제거) 을 달성할 수 있다. 전자기파 방사 (예를 들어, 자기장, 전기장, RF 장, 폭넓은 또는 초첨 레이져 펄스 등) 를 사용하여 입자/나노입자 및/또는 박막이 가열된다.
다양한 구현예에서 세포 수술 방법은 금속 입자/나노입자 및/또는 박 금속 필름의 광열 효과를 이용한다. 예를 들어, 입자의 조성 및/또는 기하학 (예를 들어, 가로세로비) 및/또는 필름의 조성 또는 두께를 제어함으로써, 전자기파 방사 (예를 들어, 레이져 에너지) 가 입자 및/또는 박막에 의해 강하게 흡착되도록, 물질은 "미세조정" 될 수 있으나 (세포 근처 또는 세포 내용물 근처가 아님), 이로써 통상적인 레이져 기반 세포 조작 방법에 의한 세포 또는 유전적 손상을 피하게 된다. 현재의 레이져 세포 기술은 제거 또는 공동 효과를 창출하기 위해 세포 내용물에 의해 레이져 파워의 강한 흡수에 의존적이다. 이러한 방법은 세포를 손상시킬 수 있고 세포 구성성분의 원치 않는 분해를 야기할 수 있거나 조작 세포의 생물학적 측면에 영향을 미치는 화학적 효과를 낼 수 있다.
대조적으로, 본원에 기술된 미세수술 도구, 레이져 또는 전자기파 에너지의 다른 원천은 마이크로모세관 피펫에 결합됨으로써 세포막에서 위치할 수 있는 입자/나노입자 및/또는 박막을 가열하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 에너지원 (예를 들어, 레이져) 은 조작 세포를 실질적으로 손상시키지 않느다.
물질의 선택에 따라, 나노입자 및/또는 박막은 본질적으로 임의의 전자기파 방사 적용에 의해 여기될 수 있다 (가열될 수 있다). 따라서, 다양한 구현예에서, 나노입자 및/또는 박막(들)의 가열은 나노입자 및/또는 박막(들)은 자기장, 및/또는 전기장, 및/또는 RF 장, 및/또는 빛 (예를 들어, 레이져) 의 적용에 의해 수행된다.
예를 들어, 금속 입자, 나노입자, 및 박막은 가시영역 및 IR 근처 영역에서 통상적으로 표면 플라즈몬 진동수에 근사한 진동수를 갖는 전자기파 파를 강하게 흡수한다. 입자, 나노입자, 및 박막은 흡수된 에너지로 인해 신속하게 가열되어, 주위 매질이 증발되는 초가열 현상을 생성한다. 세포 수술 도구의 특정 구현예에서, 개별 나노입자 또는 다중 나노입자는 마이크로피펫의 팁 상에서 코팅되며, 예를 들어 도 1 에 나타낸 바와 같다. 레이져 펄스 자극시, 나노미터 직경 증기 기포는 나노입자 주변에서 창출된다. 세포 표면 근처에서 또는 세포 표면과 접촉시, 이러한 공정은 세포막 (및/또는 세포벽) 에서 제어된 정확한 크기의 정공을 생성한다. 이러한 방식으로, 마이크로피펫은 현재 현미주사 및 추출 기술과 연계된 기계적 및 생물학적 손상을 입히지 않으면서 용이하게 세포막을 관통할 수 있다. 공동 또는 "정공 펀칭" 방법은 수 나노초 내에서 마감된다. 결과적으로, 막의 나머지는 반응할 시간을 갖지 못하고 기계적으로 그대로 남아있게 된다. 일단 피펫이 세포 내에 위치하면, "막 정공" 은 섬유 광학 장치와 같은 장치를 이용한 조작을 위해 오픈되게 유지될 수 있으며, 피펫의 할로우 보어를 통해 꿰어진다. 특정 구현예에서 마이크로모세관의 팁에서 및/또는 마이크로모세관의 팁 근처에서 침착된 박 금속 필름을 사용하여 유사한 효과가 수득될 수 있다.
이러한 작업의 하나의 설명 양식에서, 마이크로피펫은 현미경 (예를 들어 도립 현미경) 하에서 미조정 장치에 의해 표적화된 세포 근처에 위치시키고/위치시키거나 자동조정된다 (예를 들어, 압력 구동). 마이크로피펫의 팁 상에서 펄스 레이져 (또는 다른 에너지원) 에 의해, 피펫은 현저한 세포 변형을 야기하지 않으면서 막을 통과한다. 피펫이 세포 내에 들어가면, 분자 및 세포 성분의 후속적 주입 또는 추출이 수행될 수 있으며, 세포내 조작 동안 세포는 살아 있을 수 있다.
따라서, 세포 수술 도구는 단일세포 현지주사 및/또는 추출 및/또는 세포내 조작을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 점착성 세포막에 대한 정공 펀칭이 설명되고, 이는 현탁액 중 세포로 용이하게 확장되어, 광학 트위져를 사용하여 고정된 세포로 용이하게 확장되고/확장되거나 클러스터, 콜로니 또는 클럼프에서 일상적으로 성장시킨 세포로 확장된다 (표준 흡입 기반 홀딩 피펫의 도움으로). 실험적 설명을 도 3 에 나타낸다.
다양한 구현예에서, 피펫 (나노블레이드) 의 각을 다양하게 함으로써 및/또는 레이져 편광을 다양하게 함으로써 상이한 막 절단이 수행될 수 있다. 예를 들어, 0 (수직) 내지 30 도의 피펫 기울기로, 티탄 고리에 대한 핫 스팟은 서로 멀어지는 쪽에서 서로 가까워지는 쪽으로 이동하다 (예를 들어 도 27 참조). 막에서 생성되는 절단은 "배트 아이" 모양이다 (예를 들어 도 28A-28C 참조).
절단 패턴을 제어하는 다른 인자 (광학 표시지에서 나타냄) 는 피펫 팁 크기이다. 피펫 팁 크기가 2 미크론으로 감소할 때, 가열은 2 개의 핫 스팟 사이에서 퍼질 수 있으며 따라서 막 상에서 절단된 하나의 "캣 도어" 를 생성한다.
이를 도 26 에 나타낸다. 이미징을 위한 광열 나노블레이드에 의한 절단 패턴을 유지하기 위해, HeLa 세포를 20 분 동안 글루타르알데히드로 예비 처리하여 단백질 가교를 유도하고 세포막 재밀봉을 현저하게 느리게 하였다. 레이져 펄스 동안 (360 mJ/㎠ 에서 레이져 플루언스), 2 μm-크기의 팁 직경 Ti 코팅된 마이크로피펫을 광 하에 두고 세포막 표면에 대해 빛 접촉이 수직이게 두었다.
레이져 펄스 후, 스캔 전자 현미경 하에서 세포막을 이미지화하였다. 2 개의 정공 (각각 < 1 μm) 을, 선형적으로 편광화된 레이져 펄스를 적용함으로써 Ti 나노구조 코팅 팁의 면에 따라 세포막에서 절단하면서, 상응하는 기포 패턴을 매칭시켜, 원형적으로 편광화된 레이져 자극에 의해 원형으로 절단하였다 (~1.5 μm 직경) (도 26(a) 및 26(b)). 오직 Ti 고리의 한쪽 면만 세포막과 접촉하도록 마이크로모세관을 기울여, ~1.5 μm "캣-도어" 반달 모양 오프닝을 막에서 제조하였다 (도 26 (c)). 이들 제어된 절단 패턴은 매우 재생가능한 것이다.
또다른 예시적인 비-제한적 배열에서, 피펫은 유리 모세관의 외벽 및 팁 둘 모두에서 티탄 코팅을 갖는다. 이 경우, 기포는 모든 팁 주변에서 생성된다 (도넛). 막 절단은 피펫 팁과 접촉시 면적으로 국한된다. 이러한 시나리오에서, 기포 모양은 피펫 기울기 또는 레이져 편광에 따라 현저히 다르지 않으며, 이는 특정 구현예에서, 현미주사에 보다 적합한 것이다.
세포 수술 도구는 살아 있는 세포 조작에 대한 세포 손상을 최소한으로 하게 필요에 따라 신속하게 닫히거나, 오퍼레이터에 의해 측정된 기간 동안 오픈되게 남아 있는 특정 크기의 막을 통해 세포 내로 정확하게 접근하는 것을 제공할 수 있다. 상기 장치는 예컨대 탐침과 같은 비-세포 물질의 도입을 위해, 프로핵 DNA 현미주사, 낭포로의 배아 줄기세포 이동, 세포내 세포기관의 체세포 핵 이동, 손상 또는 대체를 수행하는 성공률 및 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
시약 전달 및 세포 트랜스펙션을 위한 기판.
또다른 구현예에서, 방법, 장치 및 시스템은 살아 있는 세포로의 작용물질 (예를 들어, 핵산, 단백질, 유기 분자, 세포기관, 항체 또는 다른 리간드, 등) 의 전달 및/또는 상기 세포로부터 작용물질의 추출을 위해 제공된다. 전형적으로, 장치는 기판 포함 입자 (예를 들어, 나노입자) 및/또는 박막 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음) 를 포함한다. 세포는 이러한 기판 상에서 시딩될 수 있으며, 임의적으로는 합류 배양액이 형성될 때까지 성장한다. 특정 구현예에서 펄스화 레이져 (또는 다른 전자기파 에너지원) 는 전체 기판을 방사처리할 수 있거나, 기판 영역을 선택적으로 방사처리할 수 있다 (예를 들어, 쉐도우 마스크를 방사처리함으로써 상응하는 조명 패턴이 기판 상에서 이미지화됨). 에너지원 (예를 들어, 펄스 레이져) 에 노출된 면적에서, 입자 및/또는 박막은 흡수된 에너지로 인해 높은 온도로 가열된다. 전형적으로, 수 나노초 이내에, 가열은 입자 및/또는 박막 주변의 액체 매질 층으로 소멸되며, 이로써 증기 기포가 발생한다. 증기 기포의 신속한 팽창 및 후속 붕괴는, 세포막 (및/또는 세포벽) 에서 공극 형성을 국지화시킬 수 있는 세포(들) 근처에서 강한 전단 스트레스를 유도하는 일시적인 플루이드 흐름을 발생시킨다. 결과적으로, 막-불투과성 분자는 열적 확산 또는 플루이드 플로우에 의해 세포로 이동될 수 있다. 입자(들) 및/또는 박막이 에너지원에 노출되는 곳에 공동 기포(들)이 우선적으로 형성되기 때문에, 조사 패턴은 특정 시간 및/또는 세포 배양액의 특정 면적에서 흡수되는 분자를 유도하도록 선택될/지정될 수 있다. 기판 상의 흡수 영역 위치는 조명 패턴과 조합으로 입자/나노입자 및/또는 박막의 패턴의 조합에 의해 측정될 수 있다. 유사하게, 흡수 시간은 조명 시기에 의해 조절될 수 있다. 이러한 방식으로, 고출력, 공간 표적화 및/또는 일시적 표적화 분자 전달이 입자 크기, 물질, 및/또는 기판 상의 밀도 및/또는 기판 상의 필름 물질 및/또는 두께, 에너지원 시간, 강도 및 빈도수, 및 조사 패턴(들)을 제어함으로써 가능하게 된다.
또다른 예시적 구현예에서, 시약 전달 플랫폼 (예를 들어, 트랜스펙션 기판) 은 기판 및/또는 미세유체역학 구조 상에서 필름 및/또는 마이크로- 또는 나노입자를 흡수하는 에너지를 통합함으로써 제공된다. 특정 구현예에서 나노입자 및/또는 박막은 기판 상에서 제작된 특정 구조물 (예를 들어, 공극 프로튜브란스 채널 등) 에서, 특정 구조물 상에서 또는 특정 구조물 근처에서 위치할 수 있다. 특정 구현예에서, 입자/나노입자 및/또는 박막은 기판의 "상부 면" 상에서 배치되는 (여기서, 세포(들)이 배치됨) 반면, 다른 구현예에서, 추가적으로 또는 대안적으로, 입자/나노입자 및/또는 박막은 기판의 바닥 면 상에서 배치된다 (예를 들어, 반대면은 세포가 배치되는 면 위에 있음). 각 경우, 필름 또는 입자 (예를 들어, 금속 입자/나노입자 및/또는 박막) 을 흡수하는 에너지는 흡수된 에너지로 인해, 표면 플라즈몬 진동수에 근사한 진동수를 갖는 전자기파 파를 강하게 흡수하고 신속히 가열되어, 매질 주변의 증발을 갖는 초가열 현상을 발생시킨다. 예를 들어, 레이져 펄스 자극시, 나노미터 직경의 증기 기포는 나노입자 또는 박막 주변에서 생기며, 세포 표면과 접촉시 또는 이 근처에서, 이러한 공정은 세포막 (및/또는 세포벽) 내에서 제어되는 정확한 크기의 정공을 생성시켜 예를 들어 시약의 도입 또는 배출을 허용한다. 공동 또는 "정공 펀칭" 방법은 수 나노초 이내에 마감된다. 결과적으로, 막의 나머지는 실질적으로 반응하는 시간을 갖지 않고 기계적으로 상대적으로 방해받지 않고 남아 있다.
특정 구현예에서 이러한 장치는 오리피스(들)의 립 상에서 및/또는 오리피스(들)의 측벽 상에서 (또는 오리피스의 가장자리 근처에서) 배치된 나노입자 또는 필름 (예를 들어 Ti 필름) 을 흡수하는 에너지를 갖는 하나 이상의 미세유체역학 오리피스 (예를 들어 기판 상에서/기판으로/기판을 통해) 를 포함할 수 있다 (참조, 예를 들어, 도 14 및 도 18). 특정 구현예에서 장치는 오리피스의 립 상에서 또는 오리피스의 측벽(들) 상에서 또는 오리피스의 근처에서 에너지 흡수제 마이크로입자 또는 필름을 갖는 미세유체역학 오리피스 (예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상 오리피스) 의 어레이를 포함한다. 오리피스(들)은 채널 (예를 들어, 미세유체역학 채널) 의 네트워크에 또는 이에 연결될 수 있다. 세포는 오리피스(들) 상에서 또는 오리피스(들) 근처에 배치될 수 있다.
특정 이론에 얽매이지 않으면서, 이러한 장치에서 세포막 오프닝을 위한 2 개의 기전이 존재하는 것으로 여겨진다. 하나는, 입자 또는 필름을 갖는 세포막의 직접적인 접촉 (또는 대략 근사한 접촉) 으로, 공동 기포(들)이 세포막 바로 옆에 생성되고 이를 분열시킨다. 또다른 기전은 세포막이 입자 및/또는 박막과 접촉하지 않는 것이다. 예를 들어, 세포 및 입자 및/또는 필름이 기판의 반대 면 상에서 존재하는 경우, 공동 기포는 강/공극을 통해 플루이드를 짜내게 되고 생성되는 액체 제트는 세포막에 구멍을 뚫게 된다.
이러한 하나의 기판 (예를 들어 트랜스펙션 기판) 을 도 15 에 도식적으로 나타낸다. 본원에 나타낸 바와 같이, 기판은 각 열이 마이클로채널에 의해 연결되는 오리피스의 열을 포함한다. 이러한 예시적인 비제한적 구현예에서, 2 개의 다기관은 2 개의 마이크로채널로 각 시약을 전달하는 것으로 제공된다. 오리피스 근처의 표면 또는 오리피스를 포함하는 표면은 조명시에 선택적으로 가열되는 나노입자 및/또는 박막 (예를 들어, Ti 를 포함하는 박막) 으로 코팅된다. 기판의 선택적인 면적 (예를 들어 조명 면적 1 및 2) 는 조명 면적 내에서 배치되는 세포로의 시약의 전달에 영향을 미치기 위해 바람직한 것으로 조명될 수 있다. 도 15 가 2 개의 다기관을 설명하느 반면, 다양한 구현예에서, 더 적은 다기관이 고려된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 오리피스로의 시약의 전달은 밸브 시스템에 의해 제어될 수 있다. 특정 구현예에서 다기관은 제거될 수 있다.
하나의 예시적인 비제한적 구현예에서, 시약 전달 플랫폼은 미세유체역학 구조 상에서 필름 및/또는 마이크로- 또는 나노입자를 흡수하는 에너지를 통합함으로써 제공된다. 이러한 장치는 오리피스(들)의 립 상에 및/또는 오리피스(들)의 측벽 상에서 (또는 오리피스의 가장자리 근처에서) 배치되는 에너지 흡수 필름 (예를 들어, Ti 필름) 또는 나노입자를 갖는 하나 이상의 미세유체역학 오리피스 (예를 들어 기판 상에서/기판으로/기판을 통해) 를 포함할 수 있다 (참조, 예를 들어, 도 14). 특정 구현예에서 장치는 오리피스 립 상에서 또는 측벽(들) 상에서 또는 오리피스 근처에서 에너지 흡수제 마이크로입자를 갖는 미세유체역학 오리피스의 어레이를 포함한다 (예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상 오리피스). 오리피스(들)은 하나에 연결되거나 채널의 네트워크 (예를 들어, 미세유체역학 채널) 에 연결될 수 있다. 세포는 오리피스(들) 상에서 또는 근처에서 배치될 수 있다.
도 16 에서 도식적으로 나타낸 바와 같이, 오리피스(들)의 가열/자극시 (예를 들어, 레이져 펄스를 통해), 세포막 및/또는 세포벽에서 오프닝이 형성되고, 미세유체역학 채널(들)에서 시약이 발산에 의해 세포로 전달될 수 있거나, 또는 예를 들어, 외부 압력원을 사용하여 마이크로채널(들)을 통해 플루이드를 펌핑함으로써 전달될 수 있다.
다양한 구현예에서 오리피스(들)의 직경 범위는 약 1 μm 에서 약 100 μm 까지 또는 약 50 μm 까지, 또는 약 2 μm 또는 약 5 μm 에서 약 20 μm 또는 30 μm 까지, 또는 약 1 μm 또는 2 μm 또는 약 5 μm 에서 약 10 μm, 또는 약 15 μm, 또는 약 20 μm, 또는 약 25 μm, 또는 약 30 μm 까지, 또는 약 5 μm 에서 약 10 μm, 15 μm 또는 20 μm 까지이다. 특정 구현예에서 오리피스(들)은 직경이 약 10 μm 이다.
다양한 예시적 구현예에서, 미세유체역학 채널 (마이크로채널) 은 약 1000 μm 이하의 폭 및/또는 깊이, 또는 약 800 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 500 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 400 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 300 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 200 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 150 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 100 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 50 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수), 또는 약 20 μm 이하의 폭 및/또는 깊이 (또는 직경 또는 특징적인 치수) 를 갖는다.
특정 오리피스를 선택적으로 조사/가열함으로써, 시약 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음) 은 조사처리된/가열된 오리피스 상부 또는 근처에서 세포로 선택적으로 전달될 수 있다. 유사하게, 적절한 마이크로채널(들)에서 전달되는 물질을 선택적으로 제공함으로써, 동일한 물질 또는 상이한 물질은 동일한 시판 상에서 상이한 세포로 전달될 수 있다.
본원에 기술되는 "접근가능한" 전달 장치/기판은 폭넓게 다양한 내용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 고출력 시스템에서, 상이한 웰 또는 단일 웰의 상이한 영역은 작용물질을 배지에 단순히 투여하고 작용물질이 이동되는 세포를 함유하는 영역을 조사처리 (예를 들어 레이져 방사) 함으로써 표적 세포로 시약이 선택적으로 전달되는 시약을 가질 수 있다. 제 1 작용물질은 세척될 수 있고, 제 2 작용물질이 적용되고 상이한 영역이 조사처리되고 이로써 배양액에서 상이한 위치에서 상이한 작용물질로 트랜스펙션된 세포를 제조할 수 있다. 이는 시간에 따른 놀라운 제어 및 하나 이상의 작용물질의 공간적으로 접근 가능한 전달을 허용하는 세포의 대량적 평행적 가공을 촉진한다.
반면, 특정 구현예에서, 세포로 트랜스펙션되는 물질이 기판 상에서 플루이드 내에서 오리피스와 소통하는 마이크로채널 내에서 제공되며, 장치는 이러한 양상으로 작동될 필요가 없다. 예를 들어, 세포로 트랜스펙션되는 물질은 배양 배지에 제공될 수 있다. 세포에서 또는 세포 근처에서 선택적 가열 영역은 세포로의 공극을 형성하고 이로써 물질은 세포로 트랜스펙션된다. 따라서, 나노입자 또는 박막 영역은 표면의 일부 상에서 존재할 수 있으며 아퍼추어/오리피스와 연계될 필요가 없다.
특정 구현예에서 본원에 기술되는 장치는 예를 들어 세포로의 특정 작용물질의 전달을 위한 펌프 및 밸브 (예를 들어 칩 상의 랩) 를 갖는 다른 미세유체역학 장치와 통합될 수 있다.
본원에 기술되는 구현예는 예시적이고 비제한적인 것으로 의도된다. 본원에 제공되는 교시에 따라, 이러한 "트랜스펙션 기판" 및 미세유체역학 장치의 배열은 예를 들어, 기판 상의 특징 (예를 들어 공극 (오리피스) 크기, 크기 분포, 공간적 분포) 를 일상적으로 변경할 수 있으며, 필름 및/또는 나노입자의 유형, 미세유체역학 채널 등의 분포 및/또는 배열이 변화될 수 있다.
에너지원 및 선택적 조명.
물질의 선택에 따라, 본원에 기술되는 수술적 장치 및/또는 기판을 포함하는 나노입자 및/또는 박막(들)은 본질적으로 임의의 다양한 방법의 적용에 의해 여기될 수 있다 (가열될 수 있다). 이러한 방법은 마이크로파, 레이져, 비-간섭성 광학 방사 (예를 들어, 적외선 방사), 전기적 가열, 전자 스핀 공명 (ESR) 가열, 자성 가열, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 예시적 구현예에서, 나노입자 및/또는 박막(들)의 가열은 자기장, 및/또는 전기장, 및/또는 RF 장, 및/또는 빛 (예를 들어, 레이져) 의 적용에 의해 수행된다.
예를 들어, 금속 입자/나노입자 및/또는 박막은 통상적으로 가시영역 및 IR 근처 영역에서 표면 플라즈몬 진동수를 갖는 전자기파 파를 강하게 흡수한다. 입자, 나노입자, 및 박막은 흡수된 에너지로 인해 신속하게 가열되어, 배지를 둘러싼 증발을 갖는 초가열 현상을 발생시킨다.
수술적 장치 및/또는 기판이 선택적으로 가열되는 곳에서 (예를 들어, 기판의 일부에서), 장치 또는 기판을 국지적으로/선택적으로 조명하는 임의의 평균을 사용할 수 있음을 숙지한다. 따라서, 예를 들어, 특정 구현예에서, 기판의 특정 영역의 국소 조명은 예를 들어 초점화 레이져, 초점화 비-간섭성 광원 (예를 들어 적외선) 에 의해 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 기판의 하나 이상의 영역의 선택적 조명은 마스크 (쉐도우 마스크)를 사용하여 수행된다. 특정 구현예에서, 국소 조명은 렌즈 및/또는 반사경 시스템을 사용하는 특정 영역으로 에너지원 (예를 들어, 레이져) 를 조명처리함으로써 단순히 초점을 맞춰 달성될 수 있다. 특정 구현예에서 에너지원은 고정 영역에서 초점을 맞출 수 있고 기판은 이동되어 (예를 들어, 이동가능한 스테이지 또는 다른 조작기를 사용하여) 특정 영역의 국소 조명을 달성한다. 조명 면적은 임의의 원하는 모양일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 조사처리된 면적은 원형, 직사각형, 타원형, 6각형, 초승달 모양, 또는 임의의 다른 규칙적이거나 불규칙적인 모양이다. 특정 구현예에서 기판의 다중 면적은 동시에 또는 순차적으로 조명처리된다.
특정 구현예에서 에너지 펄스 (예를 들어, 레이져 펄스) 는 실시예에서 나타낸 바와 같은 스태틱 쉐도우 마스크 모양 뿐 아니라, TI's DMD 마이크로디스플레이 또는 LCD 디스플레이와 같은 공간적 빛 조절제를 사용하는 역학 마스크일 수 있다. 이는 현미주사의 표적 세포로의 실시간 및 상호활성 제어를 제공한다.
제작.
특정 구현예에서 팁 입자 근처에서 또는 팁 입자에서 전자기파 에너지원 (예를 들어, 레이져) 을 사용하여 가열될 수 있는 나노입자 및/또는 박막을 갖는 마이크로피펫을 포함하는 단일 세포 수술 장치가 제공된다. 다양한 구현예에서 전자기파 에너지원 (예를 들어, 레이져) 을 사용하여 가열될 수 있는 나노입자 및/또는 박막을 포함하는 기판 (예를 들어 세포 배양관, 미세적정 플레이트 등) 을 포함하는 세포 트랜스펙션 장치가 제공된다.
본원에 기술된 마이크로피펫 및 "트랜스펙션 기판" 은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 다양한 구현예에서 주입 마이크로피펫은, 예를 들어 시판 피펫 풀러를 사용하여 제작되는 반면, 기판은 반도체 산업에서 공지된 마이크로제작 방법을 사용하여 제작될 수 있다.
마이크로모세관/마이크로피펫 제작.
마이크로모세관/마이크로피펫은 풀링되거나 에칭될 수 있는 임의의 물질로부터 제작될 수 있거나, 또는 다르게는 원하는 치수(들)로 제작될 수 있는 반면, 필수요건인 강직성 및 열 저항성을 제공하여 가열 및 세포 관통을 허용해야 한다. 또한, 물질은 바람직하게는 관심 세포(들)에게 독성이 없다. 특정 구현예에서 마이크로모세관은 물질 예컨대 유리, 광물 (예를 들어, 석영), 세라믹, 플라스틱 (예를 들어, DELRIN®, TEFLON®, 등), 금속, 반도체, 등을 포함한다.
마이크로피펫이 제작될 때, 피펫의 단면도는 전형적으로 원형이다. 그러나, 이는 평균적인 것이 아미녀, 오직 원형 피펫이 세포 수술 도구용으로 사용될 수 있다. 다른 단면 모양을 갖는 마이크로피펫이 제작될 수 있다. 예를 들어, 원형, 직사각형 또는 삼각형의 임의의 원하는 패턴을 갖는 마이크로피펫이 우선 유리 또는 실리콘 웨이퍼 상에서 제작될 수 있으며, 이어서 주입 피펫으로 이동되고 조립된다.
또한, 많은 예비-풀링된 마이크로피펫이 시판되고 있다 (예를 들어, World Precision Instruments, Hertfordshire, England 참조).
피펫 직경은 단일-세포 수술 장치를 위한 중요한 파라미터이다. 본원에 기술된 단일-세포 수술의 이점은, 세포에 대한 덜 부수적인 손상을 갖는 세포막에서 ~μm 크기 정공 오프닝을 허용한다. 이는, 이를 살생하지 않으면서 큰 크기의 DNA 또는 다른 물질을 세포로 전달하는 것을 허용한다. 부수적인 손상을 감소시키기 위해, 통상적인 마이크로피펫 기술은 전형적으로 200 nm 미만의 유리 피펫의 외부 팁 직경을 요구하여, 작은 포유동물 세포의 가요성 세포막을 통해 관통하는 것을 촉진한다. 이는, 통상적인 마이크로피펫 기술을 통해 전달될 수 있는 입자 크기를 매우 제한하는 것이다. 염색체, 핵, 세포기관, 또는 다른 세포외 물질과 같은 물질은, 피펫 오프닝의 물리적 크기보다 더욱 큰 크기를 종종 가지나 통상적인 기술을 통해 세포로 도입될 수 없다.
본원에 기술된 "레이져" 세포 수술 피펫은 전체 마이크로피펫 산업에 혁명적일 정도로 잠재성을 갖는 상기 과제에 대한 특별한 해결책을 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 장치는 큰 DNA 단편 (예를 들어, BAC-크기 또는 더 큰 DNA), 핵, 세포기관 및 다른 큰 부분을 다른 기술보다 세포 손상을 덜 입히면서 더욱 효과적으로 도입하는데 효과적이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기술된 단일 세포 수술 도구를 포함하는 마이크로피펫은 200 nm 초과의 팁 직경을 가지며, 특정 구현예에서, 약 300 nm 초과, 약 400 nm 초과, 약 500 nm 초과, 약 600 nm 초과, 약 700 nm 초과, 약 800 nm 초과, 또는 약 900 nm 또는 1 μm 초과의 팁 직경을 갖는다.
트랜스펙션 기판 제작.
유사하게, "트랜스펙션 기판" 을 포함하는 기판(들)은 세포(들)에 대해 바람직하게는 독성이 없는 임의의 통상적인 물질로부터 제작될 수 있으며, 이는 입자, 나노입자 또는 박막 코팅을 가질 수 있고, 이는 입자, 나노입자 및/또는 박막(들)에 대해 전자기파 에너지를 적용함으로써 생성되는 국소 가열에 대한 내성을 가질 수 있다. 적합한 물질은 유리/규소, 게르마늄, 광물 (예를 들어, 석영), 세라믹, 플라스틱 (예를 들어, DELRIN®, TEFLON®, 등), 금속, 반도체, 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 기판은 세포 스크리닝 및/또는 세포 배양을 위해 사용되는 관의 표면을 포함한다. 이는 예를 들어, 점착성 또는 현탁된 세포 배양액을 위한 관을 포함할 수 있다. 이는 또한 미세적정 플레이트 (예를 들어, 96, 384, 864, 1536 웰, 등), 미세유체역학 장치, 고밀도 (마이크로어레이) 기판, 현미경 슬라이드 또는 챔버, 등을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 세포 트랜스펙션 기판은 반도체 산업에서 공지된 기술을 사용하여 제작된다. 하나의 접근법은 도 17 에 도식적으로 나타낸다. 이러한 예시적 구현예에서, 미세유체역학 오리피스 및 채널은 유리 커버슬립 기판 상에서 패턴화 SU-8 포토레지스트에 의해 제작된다. 우선, 바닥 트렌치는 100-μm-크기 SU-8 2075 포토레지스트의 층에서 포토리소그래프적으로 규정된다. SU-8 2005 포토레지스트의 또다른 박층 (4 μm 두께) 은 바닥 상에서 스펀 코팅되고 원형 오프닝은 제 2 포토리토그래피 단계에 의해 규정된다. 2 개의 층 SU-8 구조를 발전시킨 후, 100 nm 두께 Ti 박막은 원형 오리피스의 측벽 및 상부 둘 모두에서 코팅되기 위해 60도의 기울기 각을 갖는 기판에서 전자 빔 증발에 의해 구조 상에서 침착된다. 최종 단계는 상부 층 Ti 를 건조 에칭하는 것을 포함하고 외부 플루이드 펌프로 마이크로채널을 연결하는 것을 포함한다. 하나의 예시적인 구현예에서 바닥 트렌치는 200 μm 폭 및 300 μm 아파트였다. 원형 오리피스는 10 내지 20 μm 범위의 직경을 갖는다. 이들 오리피스는 사각형 어레이에서의 범위이고 100 μm 에 의해 분리된다. 초승달은 모양의 Ti 박막은 원형 오리피스의 측벽 상에 코팅되었다.
예시적인 오리피스가 원형인 반면, 이들은 그렇게 한정될 필요가 없다. 표준 방법 (예를 들어 에칭 방법) 을 사용하여, 본질적으로 임의의 모양 (예를 들어, 둥근 모양, 사각형, 5각형, 6각형, 사다리꼴, 불규칙한 모양 등) 의 오리피스가 제조될 수 있다. 유사하게, 오리피스의 패턴화는 본질적으로 임의의 원하는 패턴일 수 있다.
반면, 특정 구현예에서, 나노입자 및/또는 박막은 오리피스의 일부 상에서 코팅된다 (예를 들어 각에서 필름을 침착시킴으로써). 특정 다른 구현예에서, 오리피스 및/또는 남아 있는 표면은 나노입자 및/또는 박막으로 균일하게 코팅된다.
입자/나노입자/박막 물질.
다양한 장치를 포함하는 다양한 구현예에서 입자 및/또는 나노입자 또는 박막(들)이 모두 동일한 물질로 형성된다. 다른 구현예에서, 특정 장치에서 입자 및/또는 나노입자 또는 박막(들)이 상이한 물질을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 주어진 장치 (예를 들어, 피펫 또는 트랜스펙션 기판) 는 입자의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 상이한 유형의 입자 (예를 들어, 입자 크기, 및/또는 모양 및/또는 물질) 를 갖는 입자/나노입자 또는 박막을 포함할 수 있다. 유사하게, 상기 장치를 포함하는 박막은 다중 필름 (예를 들어, 마이크로피펫 또는 기판 상에서 상이한 위치에서 상이한 필름으로서 또는 다중 층으로서) 을 포함할 수 있다. 예를 들어, 장치는 또다른 금속 층 코팅에 의해 변형될 수 있거나, 또는 금속 박막의 상부에서 유전체 물질 (예를 들어, 산화규소, 질화규소 등) 의 코팅에 의해 변형되어 열 소멸 경로를 제어할 수 있고 피펫 팁에 의해 또는 기판 가열에 의해 손상되는 세포 상의 면적의 양에 영향을 미치는 마이크로기포 팽창 패턴을 제어할 수 있다.
다양한 구현예에서 마이크로피펫및/또는 "트랜스펙션 기판" 상의 입자/나노입자 및/또는 박막은 금속, 금속 합금, 반도체, 또는 적절한 전자기파 에너지의 적용에 의해 가열되는 다른 물질로부터 제작된다. 다양한 구현예에서, 반도체, 금속, 금속 합금, 및 이의 옥시드 및/또는 니트라이드가 고려된다. 크기, 가로세로비, 필름 두께, 및/또는 물질에 따라, 이러한 금속은 다양한 에너지원 (예를 들어, 레이져 빛, 전기장, RF 장, 자기장, 초음파 원천 등) 을 사용하여 용이하게 가열된다.
본원에 제공되는 대부분의 논의가 반도체 또는 금속 입자/나노입자 및/또는 필름에 적용되는 반면, 실시예는 금 입자 및/또는 금 또는 티탄 필름을 기술하고 있으며, 에너지원에 의해 가열되는 물질은 이에 한정될 필요는 없다. 본질적으로, 생성되는 가열에 적절한 에너지를 흡수하는 임의의 물질이 본원에 기술되는 방법 및 장치에서 가열 물질에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 금, 은, 탄탈륨, 백금, 팔라듐, 로듐 또는 티탄, 또는 이의 옥시드, 니트라이드 또는 합금을 포함하는 나노입자 및/또는 필름이 고려된다.
본원에 기술되는 나노입자 및/또는 박막(들)을 포함하는 장치 및 방법에서 유용한 하나의 중요한 물질은 티탄 (Ti) 및/또는 이의 옥시드, 니트라이드, 합금 또는 도핑된 옥시드, 도핑된 니트라이드 또는 합금이다. 특정 구현예에서 본원에 기술되는 나노입자 및/또는 박막(들)을 포함하는 장치 및 방법은 티탄 및/또는 티탄 니트라이드 (TiN) 을 포함하며, 이는 금 보다 3배 높은 용융 온도를 갖는 매우 경질인 물질이다. 피펫 상에서 코팅될 때, 40 세포는 임의의 피펫 손상을 보지 않고 하나의 단일 피펫을 사용하여 연속하여 주입되었다. 이는 또한 주석 코팅된 피펫이 피펫을 변경할 필요 없이 수백개 또는 수천개의 세포를 잠재적으로 주입할 수 있다. 이는 금 코팅된 피펫에 비해 현저히 개선된 것이며, 이는 하나, 둘 또는 몇 개의 용도에서 높은 온도 자극 및 강한 폭발성 기포에 의해 손상입을 수 있다.
주석의 다양한 변형은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이들은 티탄 탄소 니트라이드 (TiCN) 및 티탄 알루미늄 니트라이드 (TiAlN) 를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이는 주석 입자를 갖는 혼합 입자 개체로 또는 주석과 교대 층에서 또는 개별적으로 사용될 수 있다. 이들 코팅은 부식 저항성 및 경도에서 유사하거나 더욱 우수한 증가를 제공하며, 상이한 (심지어 조정 가능한) 흡수 특성을 갖는다.
상기 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 입자 또는 필름을 포함하는 장치 및/또는 기판은 금속을 포함하는 물질에 한정될 필요가 없다. 예를 들어, 본 발명자들은, 블랙카본이 또한 피펫 근처에 폭발성 기포를 유도할 수 있고 단일 세포를 죽이거나 관통시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, 특정 구현예에서, 예를 들어, 탄소 나노튜브를 포함하나 이에 한정되지 않는 탄소 나노입자가 본원에 기술된 방법 및 장치에서 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서 주기율표의 II, III, IV, V, 또는 VI 족으로부터의 하나 이상의 물질을 포함하는 입자/나노입자 및/또는 박막이 또한 고려되며, 옥시드, 니트라이드, 합금, 및 이의 도핑된 형태 및/또는 전이 금속, 전이 금속 옥시드, 전이 금속 니트라이드, 합금 또는 전이 금속을 포함하는 합성물 등이 또한 고려된다. 특정 바람직한 구현예에서, 나노입자 및/또는 필름은 II, III, IV, V 족 물질 (예를 들어, 탄소, 규소, 게르마늄, 주석, 납), II, III, IV, V, 및 VI 족 원소로 도핑된 것 또는 II, III, IV, V, 또는 VI 족 원소 또는 전이 금속, 전이 금속 옥시드 또는 전이 금속 니트라이드 또는 이것으로 도핑된 것의 옥시드를 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서 입자/나노입자 및/또는 박막은 III, IV, 또는 V 족 반도체를 포함한다.
특정 구현예에서, 입자/나노입자 및/또는 박막은 하나 이상의 물질 예컨대 Si, Ge, SiC, Au, Ag, Cu, Al, Ta, Ti, Ru, Ir, Pt, Pd, Os, Mn, Hf, Zr, V, Nb, La, Y, Gd, Sr, Ba, Cs, Cr, Co, Ni, Zn, Ga, In, Cd, Rh, Re, W, 및 이들의 옥시드 및 니트라이드를 포함하는 것을 본원의 교시로부터 알 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 다양한 구현예에서, II, III, IV, V, 또는 VI 족 원소, 전이 금속, 전이 금속 옥시드 또는 니트라이드를 포함하는 나노입자(들) 및/또는 박막은 본질적으로 순수 형태일 수 있거나, 또는 도핑될 수 있고/있거나 (예를 들어, p- 또는 n-도핑됨), 합금처리된다. II-VI 족 원소로 이용하기 위한 P- 및 n-도판트, 특히 III, IV, 및 V 족 원소로 이용하기 위한 것, 보다 특히 IV 족 원소 (예를 들어, 규소, 게르마늄, 등) 로 이용하기 위한 것이 당업계에 익히 공지되어 있다. 이러한 도판트는 인 화합물, 붕소 화합물, 비소화합물, 알루미늄 화합물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서 입자/나노입자 및/또는 필름은 IV 족 반도체 예컨대 규소, 게르마늄, 및 규소 카르바이드를 포함한다. 이러한 반도체를 위한 가장 통상적인 도판트는 III 족 원소로부터의 수용체 또는 V 족 원소로부터의 공여체를 포함한다. 이러한 도판트는 붕소, 비소 화합물, 인 및 때때로 갈륨을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 나타낸 바와 같이, 다양한 구현예에서, 입자/나노입자는 반도체를 포함한다. 많은 도핑된 II, III, IV, V, 또는 VI 족 원소는 반도체이고, 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다: ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb, AlS, AlP, AlSb, PbS, PbSe, Cd3Sb2, Zn3P2, Zn3As2, Zn3Sb2, TiO2, TiO2, TiO2, Cu2O, CuO, UO2, UO3, Bi2O3, SnO2, BaTiO3, SrTiO3, LiNbO3, La2CuO4, PbI2, MoS2, GaSe, SnS, Bi2S3, GaMnAs, InMnAs, CdMnTe, PbMnTe, La0.7Ca0.3MnO3, FeO, NiO, EuO, EuS, CrBr3, Cu(In,Ga)Se2, Cu2ZnSnS4, CuInSe2, AgGaS2, ZnSiP2, As2S3, PtSi, BiI3, HgI2, TlBr, Se, Ag2S, FeS2 , Ge 및 Si 및 이의 3요소 및 4요소 혼합물.
레이져 에너지 외에도, 자성, 전기장, 및 RF 장이 입자, 나노입자 및/또는 특정 박막을 가열하기 위해 용이하게 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 미국 특허 공개공보 제 2007/0164250 호 (이는 본원에 참조로서 포함되어 있음) 는 자기장에 둘 때 이들의 크기, 조성 또는 둘 모두의 함수로서 자기장의 특정 진동수에서 선택적으로 가열되는 자성 나노입자를 제공한다.
다양한 구현예에서 이러한 ㄴ나노입자 또는 필름은 자성 물질 (예컨대 페로 V 자성 안료) 를 포함하며, 이는 충분한 강도의 자기장에 노출시 에너지를 변환시킨다. 따라서, 예를 들어 자기장을 교대하는 것은 열을 생성하는 현 입자에서 교대를 유도할 것이다. 다양한 자성 물질이 사용될 수 있다. 이러한 물질에는 자성 물질, 예컨대 Fe-O4, Fe2O3 이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 특정 구현예에서, 은, 구리, 백금, 팔라듐 등은 본 발명의 장치에 사용되는 입자, 나노입자 및/또는 박막을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 입자, 나노입자, 및/또는 박막은 TiO2, CeO2, Ag, CuO, 이트륨 알루미늄 가닛 (YAG), InO2, CdS, ZrO2, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 임의의 금속 옥시드, 금속 합금, 금속 카르바이드, 및/또는 전이 금속은 본 발명에 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 적용 분야에 대해 이들의 각 반응성은 변경되지 않도록 입자는 코팅될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 장치에서 사용되는 입자, 나노입자 또는 박막은 자성 물질로 제조되는 반면, 다른 구현예에서, 이들은 상자성 또는 초상자성 물질을 포함할 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서 입자, 나노입자 및/또는 박막은, 전자 스핀 공명 흡수 (SPM) 및/또는 페로자성 공명을 사용하여 가열될 수 있는 상자성 또는 초상자성 물질을 포함할 수 있다. 전자 스핀 공명 (ESR) 가열 및 페로자성 공명 (FMR) 가열은 본원에 참조로서 혼입되어 있는 미국 특허 공개공보 2006/0269612 및 2005/0118102 에 기재되어 있다. 이트륨-이온 가닛 Y3Fe5O12 및 γ-Fe2O3 은 ESR 및/또는 FMR 가열에 적합한 2 개의 익히 공지되어 있는 물질이다. 상이한 도판트는 이들 물질을 다양하게 적용하는 스핀 공명 진동수를 낮추기 위해 첨가될 수 있다. 자성 가닛 및 스피넬은 또한 시판되고 있으며 정상 환경 조건 하에서 불활성이다.
또한 주기율표의 II, III, IV, 및 V 족 물질을 포함하는 다양한 물질 및/또는 반도체가 고려된다.
일반적인 {c}3(a)2[d]3O12 및 스피넬 A[B]2O4 페라이트 화합물을 위한 잠재적인 희석 이온의 예시적 목록을 표 1 에 나타낸다.
[표 1] 예시적인 페라이트 희석 이온
Figure 112013114031110-pct00002
입자 또는 나노입자는 임의의 다수의 가능한 형태를 가질 수 있고 본 발명에 사용되기에 적합한 형태를 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어 하기 종류의 나노튜브를 사용하는 본 발명을 고려할 수 있다: 단일 벽, 이중 벽, 다중 벽, 지그재그 키랄성 또는 키랄 혼합물, 트위스트, 직쇄형, 구부러진 형, 뒤틀린 것, 곱슬거리는 것, 평편한 것 및 둥근것; 나노튜브의 로프, 트위스트 나노튜브, 꼬은 나노튜브; 나노튜브의 작은 묶음 (예를 들어 특정 구현예에서 10 개 미만의 튜브), 나노튜브의 중간 묶음 (예를 들어 특정 구현예에서 백개의 튜브), 나노튜브의 큰 묶음 (예를 들어 특정 구현예에서 천개의 튜브); 나노토리, 나노코일, 나노로드, 나노와이어, 나노호른; 텅빈 나노케이지, 채워진 나노케이지, 다면 나노케이지, 텅빈 나노코쿤, 채워진 나노코쿤, 다면 나노코쿤; 얇은 나노플레이트, 두꺼운 나노플레이트, 삽입된 나노플레이트, 나노콘 등. 다양한 나노입자 (나노구조) 가 비균질 형태일 수 있다. 이러한 비균질 형태에는 구조의 일부가 특정 화학 조성을 갖는 것이 포함되나, 상기 구조의 다른 부분은 상이한 화학 조성물을 갖는다. 예는 다중 벽 나노튜브이고, 여기서 상이한 벽의 화학 조성은 서로 상이할 수 있다. 또한 비균질 형태는 상이한 형태의 나노구조의 물질을 포함하며, 여기서 1 개 초과의 상기 목록의 형태가 더 큰 불규칙적 구조로 연결된다. 또한, 특정 구현예에서, 임의의 상기 물질은 균열이 갈 수 있으며, 전위, 분지형 또는 다른 불순물 및/또는 불완전성을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 사용되기 위한 박막(들)의 두께 및/또는 면적 및/또는 입자 또는 나노입자의 크기는 나노입자 또는 필름 물질의 선택, 자극 에너지의 성질 및 자극 에너지의 진동수 및/또는 강도를 반영하여 조정되거나 최적화될 수 있다. 특정 구현예에서 나노입자 크기 범위는, 약 10 내지 약 500 nm, 바람직하게는 약 20 nm 내지 약 200nm, 보다 바람직하게는 약 20 nm, 30 nm, 40 nm 또는 50 nm 내지 100 nm, 또는 150 nm 또는 200 nm 이다. 특정 구현예에서 본 발명에 사용되기 위한 나노입자의 크기 범위는 약 4 nm 내지 약 25 nm 이며, 또다른 구현예에서, 8 nm 내지 5 nm 이며, 또다른 구현예에서 5 nm 내지 100 nm, 또다른 구현예에서, 10 nm 내지 800 nm, 또다른 구현예에서, 10 nm 내지 50 nm, 또다른 구현예에서, 50nm 내지 200 nm, 및 또다른 구현예에서 150 nm 내지 500 nm 이다.
다양한 구현예에서, 존재하는 경우, 금속 필름의 두께 범위는 약 1, 2, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500 nm 내지 약 800 nm, 1 μm, 5 μm, 10μm, 50 μm, 또는 100 μm 이다. 특정 구현예에서 금속 필름의 두께 범위는 약 2 nm 또는 5 nm, 10 nm, 20 nm, 또는 30 nm 내지 약 100 nm, 300 nm, 500 nm, 800 nm 또는 1 μm 이다. 특정 구현예에서 금속 필름의 두께 범위는 1 nm 내지 150 nm, 바람직하게는 약 5 nm 내지 100 nm, 보다 바람직하게는 약 5 nm, 10 nm, 또는 20 nm 내지 약 50 nm, 75 nm, 또는 100 nm 이다. 특정 구현예에서 금속 필름의 두께는 약 30 nm 이다.
다양한 구현예에서 본원에 기술된 장치를 포함하는 코팅 층은 연속 박막일 수 있으며, 박막은 작은 도메인으로 깨질 수 있으며 (예를 들어, 5 nm, 10 nm, 20 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm 도메인), 또는 본원에 기술된 바와 같이 개별적인 입자 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 입자의 형태 및 박막의 두께 뿐 아니라 입자 또는 필름 조성은 물질의 흡수 스펙트럼 및 원하는 국소 가열을 생성시키기 위해 요구되는 에너지원 및 강도에 영향을 미칠 것이다.
일반적으로, 필름 두께 및/또는 입자 크기는 국소 가열에 의해 제조되는 기포(들)의 크기에 영향을 미치고 기포 근처의 미세유체역학의 성질에 영향을 미친다. 이는 생성된 전단 스트레스를 결정하고 세포에서 제조된 오프닝(들)의 크기를 결정한다. 일반적으로, 입자가 더 클수록, 생성되는 기포가 더 크고 세포 상에서 생성되는 충격이 더욱 크다. 박막의 두께는 입자 크기와 동일한 영향을 미친다. 필름이 두꺼울수록, 생성되는 기포가 더욱 크고 세포(들)에서 생성되는 공극(들)이 더욱 크다.
입자/나노입자의 제작 및 미세모세관 및/또는 " 트랜스펙션 기판"으로 입자 및/또는 필름의 적용.
입자 또는 나노입자를 제작하는 방법 및 이들을 표면에 침착시키는 방법 또는 이러한 입자를 제자리 합성하는 방법 및 표면 상에 박막을 침착시키는 방법이 당업자에게 익히 공지되어 있다.
예를 들어, 박막은 스파터링 침착, 화학적 증착 (CVD), 분자 빔 에피택시 (MBE), 플라즈마-보조 증착, 캐소드 아크 침착 또는 rc-PVD 및 전자 빔 증발 침착을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법에 의해 침착될 수 있다. 단일 세포 수술 장치에서, 다양한 구현예에서 필름은 부분적으로 또는 완전하게 마이크로모세관의 팁을 커버하여 팁으로부터의 거리가 100 μm, 50 μm, 25 μm, 10 μm, 또는 5 μm 까지, 팁으로부터의 거리가 1 μm 까지, 보다 바람직하게는 800 nm 까지, 바람직하게는 500 nm 까지, 300, 200, 150, 100, 50, 또는 25 nm 까지이다. 또한 박막은 마이크로모세관 또는 세포 트랜스펙션 기판 상에서 화학적으로 침착될 수 있다.
입자 및 나노입자를 제작하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 방법은 연소 합성 (예를 들어, 산화기를 사용 (예를 들어, 금속 염) 및 연료 (예를 들어, 유기 화합물) 산화환원 반응에서), 증발/응축 (EC) 생성기, 분무 열분해 (예를 들어 플라즈마 가공 및 분말 분무), 용액 화학 예컨대 초임계 플루이드, 화학적 환원 또는 화학적 산화, 기계적 합금을 사용하는 액체 상 방법, 템플레이트 방법 (예를 들어, 작은 보이드 또는 면적 이내에서 나노입자 형성) 을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제올라이트, 필라레드 클레이, 나노다공성 막 및 역 마이셀) 등 (예를 들어 본원에 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 제 7,212,284, 7,204,999, 7,147,712, 7,128,891, 6,972,046, 6,688,494, 5,665,277 호 및 본원에 참조로서 포함되어 있는 PCT 특허 출원 제 WO/2007/024323 호 참조). 나노호른의 제조는 예를 들어 문헌 [Berber et al. (2000) Physical Review B, 62(4): R2291-2294] 에 기술되어 있으며, 나노파이버의 제조는 예를 들어 본원에 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 제 6,706,248, 6,485,858 호에 기술되어 있다. 또한 하기 문헌을 참조한다: Fedlheim and Colby (2001) 금속 나노입자: Fedlheim and Colby (2001) Metal Nanoparticles: Synthesis Characterization & Applications, Marcel Dekker, Inc., N.Y.; Baraton (2002) Synthesis, Functionalization and Surface Treatment of Nanoparticles, American Scientific Publishers; Fendler (1998) Nanoparticles and Nanostructured Films: Preparation, Characterization and Applications, Wiley-VCH, N.Y. 등.
특정 구현예에서 나노입자는 계면활성제 시스템에서 합성된다. 이러한 계면활성제-기재 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 하나의 이러한 접근법은 실시예 1 에 기술되어 있다.
더욱 일반적으로, 특정 구현예에서, 나노입자는 유기 용매 (예를 들어, 에탄올) 에 의해 금속 염의 환원에 대해 형성될 수 있으며 금속 콜로이드를 형성한다 (참조, 예를 들어, Hirai et al. (1979) J. Macromol. Sci. Chem., A13: 727; Hirai et al. (1976) Chem. Lett., 905; Toshima and Yonezawa (1992) Makromol. Chem., Macromol. Symp., 59: 281; Wang and Toshima (1997) J. Phys. Chem., 97: 11542, 등). 하나의 예시적인 접근법은 문헌 [Pastoriza-Santos and Liz-Marzan (2000) Pure Appl. Chem., 72(1-2): 83-90] 에 기술되어 있다. 이러한 접근법에서, Ag+ 이온은 안정화제의 존재 하에 또는 부재 하에 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 에 의해 환원된다. 상기 반응은 정전기적으로 표면 상에 부착된 은 나노입자의 박막의 형성을 야기하거나, 또는 은 나노입자의 안정적인 분산액을 야기한다.
또다른 예시적인 접근법은, 자성 나노입자 물질은 알코올, 카르복실산 및 아민과 철 염을 혼합함으로써 유기 용매 중에서 제조될 수 있고 혼합물을 200-360 ℃로 가열된다. 입자의 크기는, 철 옥시드를 갖는 작은 나노입자 코팅에 의해 또는 산/아민 비율에 대한 철 염을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 자성 나노입자의 크기 범위가 2 nm 내지 20 nm 의 폭 좁은 크기 분포를 갖는 것이 용이하게 수득될 수 있다. 상기 방법은 철 옥시드 기재 나노입자 물질로 용이하게 확장될 수 있으며, 이는 하기를 포함한다: MFe2O4 (여기서 M 은 예를 들어 Co, Ni, Cu, Zn, Cr, Ti, Ba, Mg, 등이다) 나노물질, 및 철 옥시드 코팅된 나노입자 물질. 또한 본 방법은 반응 혼합물에서 알코올을 티올로 대체함으로써 철 술피드 기재 나노입자 물질의 합성에 관한 것이다. 자성 나노입자는 γ-Fe2O3, 또는 -Fe2O3 로 산화될 수 있거나, bcc-Fe 나노입자로 환원될 수 있는 반면, 철 옥시드 기재 물질은 2원 철 기재 금속성 나노입자, 예컨대 CoFe, NiFe, 및 FeCoSmx 나노입자를 제조하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어 본원에 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 제 7,128,891 참조).
금 나노입자를 제조하는 하나의 방법은 흡수제를 갖는 금 염 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 착물 형태의 금은 흡수제의 표면 상에서 흡수된다. 스크리닝에 의한 용액으로부터 분리된 후, 금-적재된 흡수제는 회분을 형성하기 위해 회분처리된다. 회분은 금 나노입자 및 불순물, 예컨대 나트륨, 칼륨 및 칼슘의 옥시들 함유한다. 불순물은 희석 산을 사용하는 분해에 의해 제거될 수 있다. 상대적으로 순수한 금 나노입자는 불순물 제거 후 수득된다. 활성화 탄소 또는 금-흡착 수지는 흡수제로서 사용될 수 있다. 은 또는 백금 그룹 금속 나노입자는 또한 이러한 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다 (예를 들어 본원에 참조로서 포함되어 있는 미국 특허 제 7,060,121 호 참조).
또다른 접근법에서, 나노입자는 레이져 열분해를 사용하여 형성될 수 있다. 통상적인 레이져 열분해 공정 (종종 광열 공정으로 불림) 은 당업자에게 익히 공지되어 있다 (예를 들어 본원에 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제 5,958,348, 3,941,567. 6,254,928 호 참조). 이러한 공정에서, 방사 흡수체 또는 다른 전구체 기상 종은 에너지 (예를 들어 레이져 빛) 을 흡수하고, 이는 반응 대역에서 화학적 성분 사이에서 화학적 반응을 열적으로 야기하는 반응 대역에서 물질의 가열을 초래한다. 전형적으로, 레이져 열분해 공정은 예를 들면 화학적 증기 대역을 통해 레이져 빔을 통과시킴으로써 생성되는 정확하게 규정된 고온 대역 (전형적으로 1000~1500℃) 을 사용하며, 이때 기체는 원하는 나노규모 미립자 물질을 형성하기 위해 열적으로 반응한다. 고온 대역과 접촉시 벽의 부재는 임의의 오염물질을 제거한다. 열분해 반응에서 형성된 물질은 중력 또는 기체 플로우에 의해 전형적으로 구동되는 고온 대역을 이탈한다. 물질은 신속하게 냉각되고/켄칭되고, 이로써 크기 및 모양의 매우 균일한 분포를 갖는 나노입자를 형성한다. 전형적인 구현예에서, 이산화탄소 (CO2) 레이져는 빛 흡수에 의해 기체 분자를 직접 가열하기 위해 사용된다. 레이져를 사용하는 또다른 이점은 이의 폭좁은 스펙트럼 폭이며, 이는 정확한 파장을 갖는 분자 전구체와 빛 사이의 효율적인 커플링을 허용한다 (소비되는 레이져 전력의 15% 초과). 금속, 금속 카르바이드, 금속 니트라이드 및 금속 옥시드로부터의 다양한 나노크기 물질을 제조하기 위한 기술을 사용하였다 (참조: 예를 들어, Haggerty et al. (1981) pp 165-241 In: Laser Induced Chemical Processes, edited by J. J. Steinfeld; Bi et al. (1993) J. Mater. Res., 8(7): 1666-1674; Bi et al. (1995) J. Mater. Res. 10(11): 2875-2884; Curcio et al. (1990) Applied Surface Science, 46: 225-229; Danen et al. (1984) SPIE, 458: 124-130; Gupta et al. (1984) SPIE, 458: 131-139; U.S. 특허s 5,958,348, 6,225,007, 6,200,674, 6,080,337, 등).
유사하게, 주석 박막 크레아틴의 가장 통상적인 방법은 물리적 증착 (PVD, 통상적으로 스파터 침착, 캐소드 아크 침착 또는 전자 빔 가열) 및 화학적 증착 (CVD) 이다. 둘 모두의 방법에서, 순수 티탄이 승화되고 고에너지 진공 환경에서 질소와 반응한다.
벌크 세라믹 물체는, 원하는 모양으로 분말화 금속 티탄을 패킹하고, 이를 적절한 밀도로 압착하고, 이어서 순수 질소의 대기 중에서 이를 태워 제작될 수 있다. 금속과 기체 사이에서 화학적 반응에 의해 방출되는 열은 나트라이드 반응 생성물을 경질의 마감처리된 물품으로 소결하기에 충분하다.
입자 또는 나노입자는 당업자에게 공지된 다양한 임의의 방법에 의해 세포 트랜스펙션 기판 또는 마이크로모세관에 부착될 수 있다. 입자는 적소에서 단순히 스퍼터링될 수 있으며, 금속 콜로이드의 형성 동안 표면 상에서 형성되며, 친핵 입자 상에서 성장하고, 표면에 이온적으로 부착되거나, 또는 표면에 공유적으로 커플링되며, 예를 들어 작용물질 (예를 들어, -SH, 실란 (예를 들어 3-아미노프로필티르메톡시실란 등) 등) 를 연결하고/관능화하는 것을 통해 또는 직접 표면에 공유적으로 커플링된다.
예에서 나타낸 바와 같이, 하나의 구현예에서, 세포 트랜스펙션 기판은 바이오리스틱 세포 주입기 (BioRad) 를 사용하여 플라스틱 기판 상에 직접 금 입자를 포격함으로써 제작된다 (예를 들어 실시예 4 및 도 5 참조).
이에 대한 또다른 접근법에서, 예를 들어 펄스화 레이져를 사용하는 기판 또는 마이크로피펫 상의 박막을 가열하는 것이 나노입자를 분산하기 위해 박막을 어닐링할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 도 6 에 나타낸 바와 같이, 제작은 부착 금속의 층을 침착하는 것을 포함하고 (예를 들어 티탄, 크롬) 이어서 유리 또는 플라스틱 또는 석영 등 기판 상에 금 (또는 다른 금속) 필름의 층을 침착하는 것을 포함한다. 이어서 샘플은 가열되고 (예를 들어 레이져 펄스로 조사처리됨). 충분히 높은 레이져 에너지에서, 금속 필름은 용융하고, 용융된 금속은 응축되어 비드 유사 입자를 기판 상에서 또는 마이크로피펫 상에서 형성한다 (도 6 에서 SEM 이미지 참조).
임의적인 부착 금속 (예를 들어 티탄) 층은 기판과 금 층 사이에서 샌드위치처리되며, 금 필름의 더욱 강한 부착을 제공할 뿐 아니라 기판으로의 어닐링 후 금 비드의 더욱 강한 부착을 제공한다. 부착 층의 부재에서, 금은 레이져 펄스 또는 다른 가열 방법에 의해 표면 상에서 나노입자 비드로 여전히 어닐링될 수 있다.
또다른 접근법에서, 기판 또는 마이크로피펫은 박막을 포함하여 제공된다. 이어서, 박막은 레이져 또는 다른 에너지원을 적용함으로써 가열될 수 있는 나노규모 크기 도메인을 이탈하기 위해 에칭된다.
입자 어레이 제작 방법(들)은 다른 마이크로 또는 나노제작 기술 예컨대 나노임프린트, e-빔 리소그래피 및 기타 방법으로 확장될 수 있다. 현재 플라스틱 기판은 다른 중합체 물질, PDMS 또는 유리 기판, 또는 실리콘 기판 등으로 대체될 수 있다.
상기 기술된 표면 상에 박막을 형성하거나 표면으로 입자 및 나노입자를 제조하고 부착하는 방법은 예시적인 것이며 한정하고자 하는 의도가 아니다. 본원에 제공된 기술을 사용하여, 다른 입자, 나노입자 및 박막 코팅된 표면은 가장 일상적인 실험을 사용하여 제조될 수 있다.
광학 트위져와의 통합.
비-점착성 세포에서 통상적인 현미주사는 흡인을 적용할 또다른 유지 피펫을 사용하면서 세포를 안정화시키는 것이 요구되기 때문에 힘든 작업이다. 이러한 방식으로, 피펫이 세포막을 관통하면서 주입 피펫에 의해 발휘되는 힘에 대항하기 위해 세포는 앵커리지를 갖는다. 주입 피펫 및 유지 피펫의 상대적으로 배치되는 흡인 압력은 세포를 손상시키는데 기여하고 깨지기 쉬운 세포는 죽을 수 있다. 현재 비-점착성 세포의 현미주사 효율을 증가시키기 위한 하나의 방법은, 주입 전에 처리된 표면을 갖는 기판 상에서 이들을 결합하고 이후 기판으로부터 이들을 방출시키는 것이다. 이러한 방법은 세포에 추가의 화학적 처리를 도입해야 할 뿐 아니라 시간이 소요되는 방법이다. 광학 트위져는 미크론 및 심지어 서브미크론-크기의 물체 및 생물학적 내용물을 포획하고 조작하는 것으로 나타났다. 광학 트위져의 포획력은 전형적으로 대략 피코뉴튼이다. 결과적으로, 통상적인 유리 마이크로모세관 주입 동안 비-점착성 세포를 고정시키기 위해 광학 트위져를 사용하는 것은 일반적으로 가능하지 않다.
반면, 플라즈몬 광열 피펫 (본 발명의 단일 수술 도구) 은 광학 트위져와 용이하게 조합될 수 있다. 이 경우, 조작되는 세포는 광학적 힘에 의해 주입 위치에 대해 자가-정렬된다. 주입 공정 동안 세포는, 주입되는 세포를 살아 있게 하는 2 개의 중요한 파라미터인 최소 전단력 및 기계적 왜곡을 겪게된다. 레이져 세포 수술 기술에 통합되는 광학 트위져는 비-점착성 세포에 대한 고속 및 고효율의 현미주사를 달성하기 위해 잠재적이다.
세포 유형.
일반적으로, 본원에 기술된 방법 및 장치는 본질적으로 세포막을 갖는 임의의 세포로 이용될 수 있다. 또한, 방법 및 장치는 세포벽을 갖는 세포 상에서 사용될 수 있다.
따라서, 예를 들어 NIH3T3 마우스 섬유아세포, HEK293T 배아 신장 섬유아세포, 및 HeLa 자궁경부 암종 세포를 포함하는 점착성 세포는 본원에 기술된 장치 및 방법을 사용하여 GFP-발현 플라스미드가 주입되었다. 일반적으로, 임의의 점착성 포유동물 세포 유형은 본원에 기술된 장치 및 방법을 사용하여 용이하게 주입될 수 있는데, 이는 하기의 이유 때문이다:
1) 효과적인 정공-펀칭 측면에서 최적으로 측정되는 레이져 플루언스 및 세포 생존력 유지는 시험되는 모든 세포 유형에 대해 상대적으로 폭좁은 범위에 놓여 있음; 및
2) 적절한 주입 위치를 측정하기 위해 사용되는 점착성 세포 특성 (예를 들어, 핵 주변 또는 가능하게는 핵) 은 가시적으로 용이하게 식별됨.
림프세포, 다양한 유형의 줄기 세포, 생식 세포 및 다른 세포들은 비-점착성이나, 이러한 세포 상에서 다른 "수술적" 절차를 수행하기 위해 또는 주입하기 위해 종종 바람직한 세포이다. 본원에 기술된 세포 수술 도구와 광학 트위져의 통합은 이를 가능하게 한다.
또한, 본원에 기술된 방법 및 장치를 이용하여, 세포 클러스터 내에서 개별적인 세포를 주입하는 것 (예컨대 인간 배야 줄기 세포를 성장시키고 다능성을 유지하기 위해 요구되는 것) 은 본원에 기술된 방법 및 장치를 사용하여 줄기 세포 클러스터의 표면 상에서 특시 달성될 수 있다. 주촉성 있게 특정 세포를 클러스터 내에 주입하는 것이 가능한 것으로 여겨지는데, 이는 다양한 이유로 바람직하다 (예를 들어 발전 트래킹, 구배 수립 등).
전달 가능한 물질.
본원에 기술된 방법 및 장치를 이용하여 본질적으로 임의의 원하는 물질을 세포로 전달하는 것이 가능한 것으로 여겨진다. 이러한 물질에는 핵산, 단백질, 세포기관, 약물 전달 나노입자, 탐침, 라벨 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 플라스미드 DNA 를 세포로 전달하는 것은 3 개 이상의 점착성 세포 유형에서 이미 입증되었다. 따라서 임의의 플라스미드 크기의 유전적 물질은 본원에 기술된 방법 및 장치에 의해 용이하게 전달되어야만 한다.
BAC (박테리아 인공 염색체) - 개발 동안 특정 유전자의 조절된 발현을 추적하기 위한 또는 큰 유전적 이형을 도입하기 위한 크기 제한을 갖는 (플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스) 비히클 전단을 위한 세포를 변환시키기에 어려운 원하는 목표.
따라서, 본원에 기술된 장치 및 방법은 전체 또는 부분적으로 천연 또는 합성 염색체를 절달하기 위해 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. BAC 와 유사하게, 이전 방법에 의해 대부분의 세포 유형으로 변환될 수 없는 큰 염색체 또는 크로모좀 단편은 다른 방법에 의해 세포로 이동될 수 있었으며, 예를 들어 인간 3염색체성 장애의 모델을 수립하기 위한 다른 방법에 의해 세포로 이동될 수 있었다 (예를 들어, Down 및 Klinefelter 증후군).
유사하게, 본 방법은 핵의 이동 (예를 들어, 체세포 핵 이동) 을 위해 사용될 수 있거나, 또는 다른 세포기관 (예를 들어, 미토콘드리아 또는 나노조작된 구조) 은 세포로 용이하게 도입될 수 있다.
다양한 구현예에서 전달가능한 물질은, 핵산 (예를 들어, 벡터 및/또는 발현 카세트, 저해성 RNA (예를 들어, siRHA, shRNA, miRNA, 등), 리보자임, 단백질/펩티드, 효소, 항체, 이미징 시약, 세포기관 (예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 핵, 리소좀, 리보솜, 등), 염색체, 세포내 병원체, 무생물 입자, 예컨대 양자점, 표면-증강된, Raman 산란 (SERS) 입자, 마이크로비드, 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약을 포함하나 이에 한정되는 것을 아니다.
모듈 시스템.
특정 구현예에서 기판 (트랜스펙션 기판) 은 기존 장치와 용이하게 통합될 수 있는 "모듈"로서 제공된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 트랜스펙션 기판은 기존 현미경 상의 스테이지를 대체할 수 있거나 이에 첨가될 수 있는 포맷으로 제공된다. 특정 구현예에서 기판은 도립 현미경 (예를 들어, Zeis 도립 현미경) 상에서 x/y/z 스테이지로 그리고 이를 대체하기 위해 포맷된다.
특정 구현예에서 트랜스펙션 기판은 미세유체역학 시스템 (예를 들어 칩 시스템 상의 랩) 으로서 제공되고/제공되거나 미세유체역학 시스템과 통합될 수 있는 모듈로서 제공된다.
세포 수술 시스템 및 패턴화 트랜스펙션 시스템.
다양한 구현예에서 본 발명에서는 세포의 패턴화 트랜스펙션 또는 세포 수술을 위한 시스템이 고려된다. 특정 구현예에서, 세포 수술 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 현미수술 도구 및 미조정 장치 및/또는 예를 들어 세포에 대한 도구를 정확하게 위치시킬 수 있는 포지셔너를 포함한다. 본 시스템은, 임의적으로는 세포를 유지하기 위한 수단 (예를 들어 피펫 또는 다른 조작기), 플루이드를 전달하기 위한 수단 및/또는 수술 도구를 통해 기체 또는 장치를 세포로 전달하기 위한 수단, 도구를 통해 세포로부터 플루이드, 세포기관 등을 제거하기 위한 수단을 추가적으로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 시스템은 뷰어 시스템 (예를 들어, 현미경), 데이타/이미지 습득 시스템, 및 뷰어 시스템, 미조정 장치, 데이타/이미지 습득 시스템 등을 제어하기 위한 컴퓨터 제어 시스템을 추가적으로 포함할 수 있다.
유사하게, 다양한 구현예에서 패턴화 트랜스펙션 시스템은 세포 트랜스펙션 기판 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 입자, 나노입자, 및/또는 박막을 포함하는 하나 이상의 표면을 포함하는 배양관) 을 포함한다. 기판은 전형적으로 세포 및/또는 세포 배양액을 포함한다. 시스템은 임의적으로는 시약 전달용 수단, 세포(들)로 트랜스펙션되는 작용물질, 전자기파 에너지원으로부터 기판의 일부를 마스킹하는 수단 등을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 시스템 임의적으로는 수술 도구 또는 트랜스펙션 기판 상에서 입자, 나노입자 및/또는 박막을 가열하기 위한 전자기파 에너지원을 추가적으로 포함한다. 적합한 원천은 레이져, 자기장 생성기, RF 장 생성기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 구현예에서 시스템은 콘트롤러 (예를 들어, 레이져 콘트롤러) 를 포함할 수 있다. 콘트롤러는 현미수술 도구 및/또는 트랜스펙션 기판의 조명원 및/또는 조명 패턴의 강도 및/또는 기간 및/또는 파장을 제어하기 위해 설정될 수 있다. 특정 구현예에서 콘트롤러는 트랜스펙션 기판이 배치되는 미세유체역학 시스템 및/또는 트랜스펙션 기판을 포함하는 마이크로채널을 통해 시약의 플로우를 검출하고/검출하거나 제어한다. 트랜스펙션 기판이 현미경 (예를 들어, 도립 현미경) 상에서 제공되는 곳에서 콘트롤러는 임의적으로는 현미경 스테이지, 현미경 포커스 및/또는 현미경으로부터 습득되는 이미지를 제어할 수 있다. 특정 구현예에서 콘트롤러 임의적으로는 마이크로모세관 (현미수술 도구 포함) 의 충전, 및/또는 세포 표면 및/또는 조명에 대한 현미수술 도구의 각 및/또는 현미수술 도구의 모션 및/또는 시약을 세포로 주입하기 위한 마이크로모세관의 작동을 제어한다. 특정 구현예에서 콘트롤러는 에너지원에 의해 팁의 조명으로 현미수술 도구의 작용의 좌표를 지정한다.
키트 .
또다른 구현예에서, 본 발명은 작용물질의 세포로의 패턴화 전달 (패턴화 트랜스펙션) 또는 단일 세포 수술을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 특정 구현예에서 키트는 본원에 기술된 바와 같은 단일 세포 수술 도구 및/또는 트랜스펙션 기판을 함유하는 용기를 포함한다. 다양한 구현예에서 키트는 임의적으로는 본원에 기술된 임의의 시약 또는 장치를 추가적으로 포함하여 (예를 들어, 시약, 완충제, 튜빙, 인디케이터, 조작기 등) 세포(들)의 단일 수술 및/또는 패턴화 트랜스펙션을 수행한다.
또한, 키트는 임의적으로는 본 발명의 수술 도구 및/또는 패턴화 트랜스펙션 기판을 사용하기 위한 지침 (즉, 프로토콜) (예를 들어, 방법의 실시) 을 제공하는 라벨링 및/또는 지시사항을 포함한다. 특정 구현예에서 지시사항은 본원에 기술된 세포 수술 도구의 물질 주입용 또는 물질 제거용 용도 및/또는 세포 성분 조작용 용도 및/또는 하나 이상의 작용물질을 세포로 전달하기 위한 트랜스펙션 기판의 용도를 기재한다.
전형적으로 지시사항은 적혀지거나 인쇄된 지시사항을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 지시사항을 저장할 수 있는 매체 및 최종 사용자에게 이를 알릴 수 있는 매체가 본 발명에서 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체 (예를 들어 자기 디스크, 테입, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들어 CD ROM) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 매체는 이러한 지시사항을 제공하는 인터넷 사이트에 접근하는 것을 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명할 목적으로 제공되며, 본 청구범위를 한정하고자 함이 아니다.
실시예 1
세포 수술 도구의 제작 및 용도.
이 실시예는 마이크로모세관 기술과 나노입자 광열 효과를 통합하는 신규한 세포 수술 장치에 관한 것이다. 개념 증명 실험 결과가 이에 제시된다. 통상적인 마이크로모세관 기술은 단일 세포 기록 및 조작을 수행하기 위한 만능 도구이다. 그러나, 마이크로모세관이 세포막을 통해 펀칭할 때 세포에 큰 스트레스를 주게 된다. 결과적으로, 이러한 절차는 종종 세포 사망, 특히 기계적으로 깨지기 쉬운 세포 또는 작은 세포에 세포사를 야기한다.
레이져 제거술을 이용한 현재의 세포 수술 (Vogel et al. (2005) Appl. Phys. B-레이져s O., 81(8): 1015-1047) 은 기계적 스트레스는 제거하였으나 매우 정밀하게 포커스를 맞추고 레이져로 포커스를 맞춘 지점에 주입 마이크로피펫을 정확하게 배치하는 것을 요구한다. 이러한 실시예에서 본 발명자들이 기재하고 있는 세포 수술 장치는 마이크로모세관 피펫의 팁 상에서 나노입자의 광열 효과를 이용한다. 나노입자의 레이져 유도된 가열은 피펫이 세포와 만날 때 세포막에 일시적으로 구멍을 낸다. 가열은 오직 나노입자와 접촉하는 막 영역에서만 발생하기 때문에, 이러한 장치는 비- 또는 약하게-초점을 맞춘 레이져를 이용하여 작업할 수 있다. 이러한 방식으로 원치 않는 스트레스가 최소화된다. 강한 레이져 강도로 인해 발생 가능한 화학적 결과는, 연구 중인 조작 세포의 생물학적 측면이 영향을 받지 않는 것을 보장하기 위해 피해야만 한다.
도 1 은 세포 수술 도구를 도식적으로 나타낸다. 금 나노입자는 마이크로피펫의 팁 상에서 코팅된다. 귀금속 나노입자는 이의 표면 플라즈몬 진동수에 근사한 진동수를 갖는 전자파를 강하게 흡수한다 (통상적으로 가시영역 및 NIR 영역) (Hartland (2006) Annu. Rev. Phys. Chem., 57: 403-430). 예를 들어, 30 nm 직경의 금 나노스피어는 이들의 소멸 스펙트럼에서 532 nm 주변 파장에서 피크를 나타낸다. 레이져 펄스 자극시, 나노입자는 흡수된 에너지로 인해 신속하게 가열되며, 매질 주변의 초가열 및 증발을 야기한다. 이러한 직접적인 가열 또는 증기 기포가 붕괴하는 공동현상의 힘은 세포막 투과성 또는 막에서의 "정공 펀칭" 의 증가를 야기한다. 손상 부피는 레이져 펄스 플루언스 및 나노입자 크기에 의해 제어될 수 있다. 가열 부피는 30 nm 금 나노스피어의 표면으로부터 수십 나노미터로 확장되며, 나노입자는 레이져 펄스 이후 수 나노초 이내로 형행 온도로 냉각되는 것으로 밝혀졌다 (Pitsillides et al. (2003) Biophys. J., 84: 4023-4032, 2003; Kotaidis et al. (2006) J. Chem. Phys., 124(18), Art. No. 184702). 결과적으로, 막의 나머지 또는 세포는 반응할 충분한 시간을 갖지 못하며 기계적으로 방해받지 않은 상태로 남아 있다. 이러한 방식으로 마이크로피펫은 용이하게 세포막을 관통할 수 있고 세포 손상이 최소화된다.
실험 및 결과.
금 나노로드의 합성.
다양한 구현예에서 나노로드의 합성은 강성 주형 또는 계면활성제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 적용을 위해, 본 발명자들은 상대적으로 손쉬운 합성 방법에 대한 계면활성제 루트를 사용하였다. 간단하게, 합성된 나노로드를 하기 문헌에서 개발된 시드 중재 성장을 통해 생성시키고: Jana et al. (2001) J. Phys. Chem. B, 105(19): 4065-4067, 반면, 성장 용액에 첨가되는 3-4 nm 시드는 계면활성제의 존재 하에서 성숙되어, 독특한 가로세로비를 갖는 나노로드를 생성한다. 계면활성제 농도에 더하여, 가로세로비는 특정 양의 은 이온의 첨가에 의해 제어되는 것으로 나타났다 (Nikoobakht 및 El-Sayed (2003) Chem. Mater. 15(10): 1957-1962). 생성되는 나노로드 용액은 탄소 코팅된 구리 그리드 상에서 TEM 을 통해 특정화되었다.도 4 는 3.2 및 5.8 의 2 개의 가로세로비를 갖는 합성된 나노로드를 나타낸다.
합성 공정.
벤질디메틸암모늄클로라이드 히드레이트 (BDAC), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), L-아스코르브산, 은 니트레이트 (AgNO3), 나트륨 보로하이드라이드 (NaBH4), 수소 테트라클로로아우레이트 (HAuCl4-3H2O) 를 Sigma Aldrich 로부터 수득하였다. 탈이온수 (18 M) 를 실험에 이용하였다.
시드 용액:
5.0 ㎖ 의 0.20 M CTAB 를 25℃ 에서 교반 하에 5.0 ㎖ 의 0.0005 M HAuCl4 와 혼합하였다. 0.60 ㎖ 의 빙냉 0.01 M NaBH4 를 혼합물에 첨가하였다. 금의 환원으로부터 생성 용액을 황갈색으로 조정하였다. 생성 용액을 2 분 동안 강하게 교반하여 모든 Au 가 Au0 로 환원되는 것을 보장하였다.
성장 용액:
20.0 ㎖ 의 0.15 M BDAC, 및 0.40 g CTAB 를 결합하고 40℃ 에서 20 분 동안 초음파 처리하여, CTAB 를 완전히 용해시켰다. 4 개의 개별 바이알에, 200 ㎕ 의 0.004 M AgNO3 를 조제하고 이어서 5 ml BDAC/CTAB 계면활성제 용액을 조제하였다. 이로써 일정치 않게 성숙하는 4 개의 상이한 성장 용액을 제조했다. 성장 용액은 약간 오렌지색을 나타냈다. 각 바이알에, 5.0 ㎖ 의 0.0010 M HAuCl4 를 첨가하고 부드럽게 혼합하고, 이어서 70 ㎕ 의 0.0778 M L-아스코르브산을 첨가하였다. Au3 + 이 Au0 로 환원되는 동안 오렌지색을 띄던 것이 사라졌다. 12 ㎕ 의 시드 용액을 각 바이알에 첨가하였다. 이는 붉은 색을 생성하였고, 이는 Au 의 적어도 60% 의 환원 지점이다. 생성 용액을 1hr, 24 hr, 48 hr, 및 72 hr 동안 성장시켰다.
시드 Au 는 유리 상에 직접 성장시켰고 이어서 Au 입자를 더 크게 만들기 위해 성장 용액에서 피펫을 함침하였다.
세포 수술 도구의 용도.
본원에 기술된 실험에서, 532 nm 의 파장 및 5 나노초의 기간 동안 펄스를 사용하였다. 레이져는 5×3 mm2 의 초점을 맞추지 않은 지점 상에 883 J/m2 의 플루언스를 전달하였다. 문헌 [ Xu et al. (2004) Chem. Mater., 16(11):2259 -2266] 에 의해 보고된 방법을 사용하여 유리 마이크로모세관 상에서 금 나노입자를 직접 합성하였다 (도 2). RPMI 에서 배양된 Nalm-6 세포 (인간 B 세포 전구체 백혈병) 를 사용하였다. 세포막의 매우 국소화된 일시적 오프닝은 유리 마이크로피펫 상의 나노입자의 광열 효과에 의해 생성되었으며, 대략 2 μm 의 마이크로피펫 팁 크기에 근접한 전형적인 오프닝의 치수이다 (도 3C). 세포는 절차 수행 후 생존하여 남아 있었다. 금 나노입자를 갖지 않는 동일한 크기의 유리 마이크로피펫을 사용하는 대조군 실험을 수행하였다. 세포막은 이의 모양을 그 즉시 회복하였고 레이져 펄스 후 정공 오프닝의 징후를 나타내지 않았다. 또한, 본 발명자들은 전기적으로 및 열적으로 전도성인 무정형 탄소 코팅의 레이져-유도 광열 효과를 조사하였다. 무정형 탄소의 박막을 유리 마이크로피펫 상에서 스파터링하였다. 실험적 결과는 동일한 레이져 영향 하에서 즉시 세포를 용균시키고 죽이는 큰 부피에 걸쳐 확장되는 팽창 효과를 나타냈다.
결론.
본 실시예는 금속 나노입자의 광열 효과를 이용하는 신규한 세포 수술 도구를 나타내고 개념 입증 실험으로 제공된 것이다. 세포막 상에서 국지화되고 일시적인 정공 오프닝은 무정형 탄소 코팅된 마이크로피펫에 의해 즉각적인 세포 용균 및 세포 사멸과 비교하여 금 나노입자 코팅된 마이크로피펫을 사용하여 완수하였다.
실시예 2
플라스미드 DNA 트랜스펙션 및 발현.
플라즈몬 광열 피펫을 사용하여 세포막 상에 정공-오프닝을 입증하였다. 본원에 기술된 실험에서, Q-스위칭된 진동수-배가된 Nd:YAG 펄스 레이져 (파장 532 nm) 및 6 ns 의 펄스 시간을 사용하였다 (Continuum Minilite I). 레이져는 11.8 mm2 의 포커스를 맞추지 않은 지점 상에서 88.3 mJ/㎠ 의 플루언스를 전달하였다. 금/팔라듐 박막은 스파터링을 통해 유리 마이크로피펫 상에서 침착되었다. DMEM 에서 배양된 인간 배아 신장 HEK293T 세포를 사용하였다. 유리 마이크로피펫 상에서 Au/Pd 박막의 광열 효과에 의해 세포막이 파열되었다. 5 nm 의 필름 두께를 이용하여, 막 오프닝의 치수는 마이크로피펫 팁 크기에 근사하며 대략 2 μm 이다 (참조: 예를 들어, 도 11, 패널 a). 13 nm 두께의 필름에 대해, 동일한 레이져 플루언스 하에서 즉시 세포를 용균시키고 살생시키는 큰 부피에 걸쳐 확장하는 폭발성 효과가 나타났다 (도 11, 패널 b). 코팅이 없는 동일한 크기의 유리 마이크로피펫을 사용한 대조군 실험을 또한 수행하였다. 세포막은 레이져 펄스 후 손상 또는 정공 오프닝의 징후를 나타내지 않았다.
본 발명자들은 녹색 형광 단백질 (GFP) 인코딩 플라스미드의 HEK293T 세포로의 현미주사를 입증하였다. 플라스미드는 원형 가닥 DNA 이고, 이는 세포로의 주입시 세포가 GFP 및 형광 녹색을 생성하도록 하였다. 도 12, 패널 a 는 현미주사 절차를 나타낸다. 플라므시드 함유 버퍼의 연속식 흐름은 세포막과 온화한 접촉에 이르는 광열 피펫으로서 피펫 팁으로부터 사출시켰다. 레이져 펄스 적용 후, 버퍼는 세포를 통해 삽입되었고 피펫은 세포로부터 즉시 제거되었다. 주입된 세포는 주입 후 24 시간 동안 생존하였으며 GFP 를 발현하였다. 레이져 펄스를 적용하지 않으면서 세포막과 접촉시키는, 피펫이 플라스미드를 함유하는 버퍼의 스트림으로부터 나오는 곳에서 별도의 대조군 실험을 수행하였다. 24 시간 후 세포 발현 GFP 를 관찰되지 않았다. 이는, 플라즈몬 광열 피펫이 세포막 상에서 정공을 성공적으로 오픈함에 대한 직접적인 증거이며, 이는 플라스미드가 흘러들어가게 한다. 또한 세포는 공정에서 살아 남아 24 시간 후에도 생존하였다.
실시예 3
광학 트위져와의 통합.
도 13 에서 나타낸 바와 같이, Nalm-6 세포를 광열 피펫 팁과 접촉시키면서 N.A. 1.3 100× 오일 함침 렌즈의 초점 지점에서 50 mW, 1064 nm 레이져 빔으로 포획하였다. 광열 세포 수술 공정의 시간 분해 이미지를 위해 사용되는 동일한 Zeiss 도립 현미경 상에서 이러한 광학 트위져를 수행하였다. 이는 광학 포획, 세포 수술 및 시간 분해 이미지를 동시에 수행할 수 있는 통합된 광학 시스템을 제공한다. 원형질막 상에서 정공을 오픈하기 위해 광열 피펫이 나노 기포 팽창에 의존적이기 때문에, 피펫 팁은 오직 세포와 온화한 접촉시 요구된다. 이 경우, 광학 트위져는 절차 동안 세포를 유지하기 위해 충분한 포획력을 제공한다. 유지 및 주입 피펫 둘 모두로부터 세포 상의 접촉력을 최소화하는 것 외에도, 광학 트위져를 혼입시키는 또다른 이점은 조작 동안 세포를 선택하고, 포획하고 방출시키기 용이하다는 것이다.
실시예 4
금 입자 코팅된 기판을 사용하는 살아 있는 세포로의 광 이미지 패턴화 분자 전달.
옵토포레이션 (세포로 분자 및 유전자를 전달하는 방법) 은 초정밀하게 초점을 맞춘 펄스화 레이져 빔을 이용하여 세포막에서 공극을 창출한다 (Vogel et al. (2005) Appl. Phys. B-lasers O., 81(8): 1015-1047). 이는 접촉이 없는 전달을 허용하며, 펨토초 레이져의 사용으로, 단일 세포에서 표적화된 100% 트랜스펙션 효율이 입증되었다 (Tirlapur and Konig (2002) Nature418: 290-291). 이러한 접근법의 하나의 단점은 부위-특이적 또는 패턴화 세포 트랜스펙션을 수득하기 위한 것이며, 레이져 빔은 모든 세포를 통해 스캔해야만 하고, 이는 대규모 패턴화 세포 트랜스펙션이 요구되는 경우 (예컨대 복합 조직에서) 시간 소비적이다.
세포막 투과성을 증가시키기 위한 접촉이 없는 또다른 방법은 빛-흡수 마이크로 또는 나노입자를 사용하는 것이다 (Pitsillides et al. (2003) Biophys. J. 84: 4023-4032). 단펄스 레이져에 의한 조사시, 입자는 일시적이고 국소적인 폭발성 기포를 창출하며, 이들 입자에 인접한 세포막의 일부를 파열시키고 잔류 세포의 구조를 온전하게 남겨둔다. 입자 크기, 밀도 및 레이져 플루언스를 제어함으로써, 세포는 투과가능하게 되고 트랜스펙션은 고효율로 달성될 수 있다 (Yao et al. (2005) J. Biomed. Optics, 10(6): 064012).
하나의 접근법은, 본원에서는 빛 이미지 패턴화에 의한 분자 전달을 위한 세포를 공간적으로 선택하고 표적화할 수 있는 단순 장치가 기술된다. 복잡한 나노층 혼합물 내에서 규정된 패턴을 특정 세포로 전달하는 대규모의 이미기 기반 분자 및 유전자를 달성하는 잠재성에 있다.
원리 및 장치 구조.
특정 구현예에서, 장치는 표면 상에 고정된 입자를 갖는 플라스틱 기판으로 이루어진다 (예를 들어 금 입자) (예를 들어 도 7 참조). 세포는 이러한 기판 상에 시딩되고, 예를 들어 합류 배양액이 형성될 때까지 시딩된다. 펄스화 레이져는 쉐도우 마스크를 조사처리하고 상응하는 조명 패턴은 기판 상에 이미지화된다. 펄스화 레이져에 노출된 면적에서, 금 입자는 흡수된 광학 에너지로 인해 고온으로 가열된다. 수 나노초 이내에, 가열은 금 입자 주변에 박 액체 매질 층에 소비되며, 이는 폭발성 증기 기포를 발생시킨다 (Kotaidis et al. (2006) J. Chem. Phys., 124: 184702). 증기 기포의 신속한 팽창 및 후속 붕괴는 세포막에서 국소화 공극 형성을 야기하는 점착성 세포에 대한 강한 전단 스트레스를 유도하는 일시적인 플루이드 플로우를 발생시킨다. 결과적으로, 막-불투과성 분자는 플루이드 플로우 또는 열적 확산에 의해 세포로 운반될 수 있다. 공동 기포가 오직 금 입자가 레이져에 노출되는 곳에서만 일어나기 때문에, 광학 패턴은 세포 배양의 특정 면적에서 흡수되는 분자에 접근하기 위해 지정될 수 있다. 이러한 방식으로, 고출력의 공간적으로 표적화된 분자 전달은, 금 입자 크기, 기판 상의 밀도 및 자극 레이져 플루언스를 제어함으로써 가능하게 된다.
실험 및 결과.
하나의 실험에서, 0.6 μm 금 나노스피어 (Bio-Rad) 는 2200 psi 포격 압력 (Bio-Rad, PDS-1000) 에서 바이오리스틱 주입기를 사용하는 플라스틱 페트리 디쉬 상에서 포격되었다 (Bio-Rad, PDS-1000). DMEM 에서 배양된 불멸의 인간 배아 신장 세포 (HEK293T) 는 디쉬에 플레이팅되고 약 70-80% 세포 합류에 도달할 때까지 밤새 인큐베이션되었다. 파장 (Continuum, Minilite I) 이 532 nm 인 Q-스위칭 진동수-배가된 Nd:YAG 레이져는 장치를 조사처리하기 위해 사용되었다. 레이져는 6 나노초의 펄스폭을 가지고 9.4 mm2 의 스팟 크기를 가졌다. 원하는 광학 패턴을 주조하기 위해 쉐도우 마스크를 빔 경로에 두고, 이를 0.83× 환원에서 장치 상에서 이미지화하였다. 금 입자로부터 유도된 공동 기포는 도 8 에 기술된 시간 분해 이미징 시스템을 사용하여 포획되었다. 고속 집중 CCD 카메라 (Princeton Instrument, PI-MAXII) 는 500 ps 와 같이 단시간 노출로 제공되었다. 포획된 기포 이미지와 여기 레이져 펄스 사이의 나노초 시간 지연은, 광 섬유 지연선의 길이에 의해 제어되었다. 레이져 펄스 동안, 1 mg/ml 로 막 불투과성 형광 염료 Calcein (Invitrogen, mol wt 622.5) 을 함유하는 배지에 세포를 함침시켰다. 공동 유도 후, 세포 배양액을 완충 염수로 세척하고 형광 염색을 확인하기 전에 신선한 배지에서 다시 함침시켰다.
도 9 는 쉐도우 마스크 없이 레이져 펄스 78 나노초 이후 가열된 금 입자에 의해 유도된 공동 기포를 나타낸다. 입자의 밀도는 약 0.004 입자/μm2 이다. 이는 세포 당 약 0.9 기포에 해당하는 것이다 (HEK293T 세포의 면적을 ~15x15 μm 로 가정). 도 10 에서, 쉐도우 마스크를 사용하고 장치의 오직 좌측 절반을 레이져 펄스로 조사처리하였다 (파선은 쉐도우 마스크 경계선에 상응함). 레이져 플루언스는 128.2 mJ/㎠ 였고 7 펄스를 적용하였다. 형광 이미지는 염료 흡수 패턴이 빛을 조사한 면적과 일치함을 명백히 나타낸다.
결론.
빛 패턴화 분자 전달이 가능한 장치를 본원에 기재한다. 형광 분자의 성공적인 전달이 점착성 세포 배양에서 입증되었다. 표적화된 전달 면적은 쉐도우 마스크에 의해 제어되었다. 이러한 장치는 대규모의 빛 패턴화 분자 및 유전자를 살아 있는 세포로 전달하게 하는 잠재성을 갖는 것이다.
실시예 5
표적 세포로의 시약의 평행적 전달.
미세유체역학 구조 상에 빛을 흡수하는 금속성 나노구조를 통합함으로써 또다른 평행적 전달 플랫폼을 개발하였다 (예를 들어 도 14 참조). 기술되는 장치는 측벽 상에 티탄 코팅되는 미세유체역학 오리피스의 어레이로 이루어진다. 오리피스는 미세유체역학 채널 네트워크 아래에서 연결된다. 레이져 펄스 및 세포막 오프닝시, 미세유체역학 채널에서 보류되어 있는 카고는, 외부 압력원을 통해 플루이드를 펌핑함으로써 오리피스의 상부에서 세포로 활성적으로 전달될 수 있다.
평행적 기포 자극은 장치 상에서 시험되었다. 레이져 펄스로 구조를 조사처리함으로써 (6 ns 펄스폭 및 532 nm 파장), 기포는 원형 오프닝 각각에서 동시에 생성되었다. 초승달 모양 Ti 박막 코팅으로 인해, 기포 폭발은 오직 실린더형 측벽의 부분에 따라 발생하였다 (예를 들어 도 19 참조)
세포막 오프닝 및 카고 전달을 시험하기 위해, HeLa 세포를 장치 상에 시딩하였다. 세포를 성장시키고 통상적으로 SU-8 기판 및 오리피스의 상부로 나누었다. 막 불투과성 녹색 형광 FITC-덱스트란 (분자량 = 3k Da.) 을 200 μg/ml 의 농도로 세포 배양 배지에 적재하였다. 156 mJ/㎠ 에서 레이져 펄스 후, 형광 염료 흡수가 원형 오리피스의 상부에서 성장시킨 세포에서 관찰되었으며 레이져 촉발된 기포 폭발 처리하였다 (예를 들어 도 20 참조). 본원에서 전달은 수동적 발산을 통한 것이었다.
실시예 6
포유동물 세포로 큰 카고 전달을 위한 광열 나노브렐이드 .
탄성의 기계적으로 깨지기 쉽고 신속하게 재밀봉되는 포유동물 세포막의 제어된 절단을 달성하는 것은 어렵다. 이 실시예에서, 본 발명자들은, 단 레이져 펄스 에너지를 수확하고 매우 국지적인 폭발성 증기 기포로 전환시키기 위해 금속성 나노구조를 이용하는 광열 나노블레이드를 기술하고 있으며, 이는 고속 플루이드 플로우를 통해 세포막을 약간 접촉시키고 일시적인 전단 스트레스를 유도한다. 공동 기포 패턴은 금속성 구조 배열 및 레이져 펄스 기간 및 에너지에 의해 제어된다. 마이크로피펫과 금속성 나노구조의 통합, 나노블레이드는 포유동물 세포로의 높은 세포 생존력 (>90%) 및 고효율 (46%) 로 고도로 농축된 카고 (5 x 108 살아 있는 박테리아/mL) 를 전달하기 위한 마이크로미터 크기의 막 접근 포트를 생성시킨다. 2 μm 박테리아에 대해 DNA, RNA, 200 nm 폴리스티렌 비드를 포함하는 1000 배 초과의 크기의 추가의 생물적 및 무생물적 카고는 다중 포유동물 세포 유형으로 전달되었다. 전반적으로, 광열 나노블레이드는 카고를 포유동물 세포로 전달하기 위한 효과적인 접근법이다.
본 실시예는 마이크로모세관 피펫과 통합된 금속성 나노구조인 광열 나노블레이드에 관한 것이다 (도 21). 광열 나노블레이드는 공간적으로 패턴화된 고속 국소화 플루이드 플로우를 발생시키는 일시적으로 동조화된 공동 기포를 촉발하기 위해 광학 펄스 에너지를 수확한다. 연질 물질 또는 깨지기 쉬운 구조, 예컨대 세포막은 광열 나노블레이드와 접촉하며, 초고속이며 국소화된 플로우는 구조의 나머지에 대해 기계적으로 약간 동요되는 접촉 면적 근처에서 막에 구멍을 뚫을 수 있다. 막 절단은 레이져-유도 공동 기포로부터 강한 일시적 기계 전단 스트레스에 의해 제조된다 (Marmottant 및 Hilgenfeldt (2003) Nature, 423: 153-156; Lokhandwalla 및 Sturtevan (2001) Phys. Med. Biol. 46: 413-437; Hellman et al. (2008) Biophoton., 1: 24-35). 이로써 세포막에서 전달 포탈은 세포에 부착되는 마이크로피펫을 발전시키지 않고 생성된다. 블레이드는 절단 동안 막과 온화하게 접촉하고, 막 아래에서 강한 기계적 지지의 필요성을 제거한다. 이러한 새로운 장치는 고효율 및 높은 세포 생존력을 갖고, 생물 분자에서 박테리아에 이르기까지 다양한 크기의 물체를 연질의 포유동물 체세포의 세포 내로의 전달을 허용한다.
광열 나노블레이드를 입증하기 위해, 100 nm 두께 티탄 (Ti) 박막을 2 μm 팁 직경을 갖는 유리 마이크로모세관의 팁 상에서 침착시켰다 (도 22A 및 22B). Ti-코팅된 마이크로피펫은 도립 현미경 스테이지 상에서 자동화 미조정 장치 상에 탑재된다.
마이크로피펫 팁이 세포막과 접촉한 빛 하에 위치하고, 532 nm 파장에서 6 ns Nd: YAG 레이져 펄스가 대물 렌즈를 통해 260 μm-폭의 장을 조사처리한다. 펄스 레이져 노출은 Ti 를 신속하게 가열하고 인접한 얇은 수층은 고리 세포막과 접촉하여 절단되는 고리 모양 Ti 박막에 따라 국소화된 증기 기포 폭발을 유도한다. 레이져 펄스로부터 공정, Ti 가열, 공동 기포 팽창, 및 붕괴는 수백 나노초만에 발생한다. 마이크로피펫 내에서 플루이드 및 카고의 압력 제어된 전달은 레이져 펄스 및 막 절단과 동조된다.
물질 및 방법.
장치 제작 및 실험적 셋업 .
1 mm 직경의 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 가열하고 풀링하여 티탄 (Ti)-코팅된 마이크로피펫을 제작하고 (P-97, Sutter Instrument), 마그네트론 스파터 침착 시스템을 사용하여 끝부분이 가늘어지는 말단 상에서 Ti 박막 침착처리하였다. Ti 코팅 두께 및 마이크로피펫 팁 직경을 주사 전자 현미경을 사용하여 정량화하였다. 레이져 펄스 시스템은 532 nm 파장 및 6 ns 펄스폭에서 작동하는 Q-스위칭된, 진동수-배가된 Nd:YAG 레이져 (Minilite I, Continuum) 였다.
레이져 빔은 도립 현미경 (AxioObserver, Zeiss) 의 형광 포트로 보내지는 암을 갖는 편광화 빔 스플리터에 의해 쪼개지고, 이어서 대물 렌즈 (40 X, 0.6 NA) 를 통해 샘플 면 상에서 260 μm-폭 레이져 지점을 생성시킨다. 카고 전달에 사용되는 최적화 레이져 플루언스는 180 mJ/㎠ 였다. 자극 레이져 펄스를 액체 주입 시스템과 동조화시키기 위해 전기적 스위칭 처리하였다 (FemtoJet, Eppendorf). 공동 기포 역학을 특징화하기 위한 시간-분해 이미징 시스템 500 ps 와 같은 단시간의 노출 시간으로 집중 CCD 카메라 (PI-MAX2, Princeton Instruments) 를 사용하여 수행되었다. 레이져 촉발 신호를 수용하는 것과 카메라 셔터 오프닝 사이의 프로그램적인 지연은 카메라 제어 단위에 의해 설정되었다. 편광화 빔 스플리터 후, 레이져 빔의 다른 암은 형광 염료 세포를 통해 보내졌다. 여기된 형광 펄스 (파장 중심 ∼698 nm) 를 다중방식 섬유에 커플링되고 이어서 현미경 축합기를 통해 카메라 셔터와 동일하게 동기화되도록 조사처리된다. 포획된 기포 이미지와 샘플 자극 레이져 펄스 사이의 나노초 시간 지연은 광학 섬유 지연선의 길이에 의해 제어되었다.
Ti -코팅된 마이크로피펫에 대한 강도 패턴의 다양한 계산법.
3D 유한 시간차 도메인 (FDTD) 방법은 전자기파 강도 패턴을 자극하기 위해 사용되었다 (FullWAVE, RSoft Design Group). 자극 도메인은 팁 및 외부 측벽 상에 박막 코팅된 100 nm Ti (nTi = 1.86 + 2.56i) 를 갖는 수성 매질 영역 (n물=1.34) 및 유리 마이크로피펫 (n유리 = 1.46) 으로 수행되었다. 전체 도메인은 경계층을 완전히 매칭함으로써 둘러쌓여져서 무한 확장 공간을 흉내낸다. 평면파 자극은 피펫 팁에 대해 30°각을 만드는 웨이브 벡터 k 및 y 에 따라 편광화된다. Ti 에서 시간-평균 강도 특성, |Eave|2, 은 하나의 전자기파 파 진동에 걸쳐 정상화된 전기 에너지 밀도를 평균화함으로써 수득된다.
막 절단 동안 광열 나노블레이트의 최적 레이져 플루언스 측정.
최적 레이져 플루언스에 대한 기준, 막 오프닝 및 높은 세포 생존력을 유지하는 것이 고려되었다. 프로피듐 요오다이드 (PI) 염료는 레이져 펄스 전에 세포 배양 배지 (10 μg/mL) 에 첨가되었다. 마이크로피펫은 세포막과 접촉되고 특정 플루언스 수준에서 레이져 펄스로 조명처리하였다. 처리된 세포를 레이져 펄스 직후 확인하여 PI 의 흡수를 증명하였다. 세포 생존력을 PI 와 유사한 방식으로 별도로 측정하고 레이져 펄스 90 분 후 첨가하고, 이어서 시간에 따라 가시적인 성장을 검출하였다.
세포 생존력 평가.
광열 나노블레이드 절단 90 분 후 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 (PI) 세포 염색하여 세포 생존력을 측정하였다. 정확하게 트랙 주입된 세포에 대해, 화학적으로 패턴화 유리 커버슬립 기판상에 세포를 시딩하였다 (Peterbauer et al. (2006) Lab Chip, 6: 857-863). 원형 면적 (직경 ∼200 μm) 을 기판 상에 규정하여 세포 부착을 한정하고 이들 영역 이내에서 성장시켰다. 각 실험에 대해, 동일한 원형 패턴 내에서 모든 세포 (하나의 패턴에서 ∼60 세포) 를 동일한 레이져 펄스로 처리하고 카고 전달 조건으로 처리하였다. 패턴화 기판에 대한 배양 세포의 생존력 효과를 배제하기 위해, 처리 패턴에서 생존가능한 세포의 백분율을 동일한 유리 기판 상에서 근처의 처리되지 않은 패턴에서 생존하는 새포의 백분율로 추가로 정상화하였다. 3 개의 독립적인 실험의 평균으로 전달후 생존력을 측정하였다.
생물분자, 카르복실레이트 비드 및 면역형광 이미징을 이용한 박테리아 전달.
GFP-발현 RNA 는 1X PBS (pH 7.4) 에서 희석시키고, IMR90 주요 인간 폐 섬유아세포로 주입하였다. DsRed-인코딩 렌티바이러스 DNA 를 양이온적으로 인큐베이션하고, 100 nm 녹색 폴리스티렌 비드를 구체 표면 상에서 DNA 흡착시켰다. 이어서, 비드를 1X PBS (pH7.4) 에서 현탁시키고, 인간 배아 줄기 (hES) 세포로 주입하였다. hES 세포를 분리하고 마트리겔 (BD Biosciences) 의 박층 상부에서 저해제 ROCK 을 사용하여 배양하였다 (Watanabe et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25: 681-686). DsRed 발현을 주입 24 시간 후 증명하였다. 녹색 카르복실레이트 변형된 폴리스티렌 비드 (200 nm) 를 1x PBS (pH 7.4) 에서 현탁하고 (0.1% 고체 부피) HEK293T 세포로 주입하였다. 형광 B. 타이란덴시스 박테리아를 1X PBS, pH7.4 (농도 108-109 /mL) 에서 현탁하고 HeLa 세포로 주입하였다. 세포를, 페니실린 및 스트렙토마이신이 없는 Dulbecco's 변형 Eagle's 배지 (DMEM) 를 사용하여 현미경 슬라이드 (LabTek, Nunc) 챔버에서 배양하였다. 주입 직후, 세포를 PBS 로 3 회 세척하고 1000 mg/mL 카나마이신을 함유하는 신선 배지에서 2 시간 동안 인큐베이션하여 세포외 박테리아를 죽였다. 이어서, 성장 배지를 5 mg/mL 세프타지딤을 함유하는 DMEM 으로 대체하여 세포외 박테리아 성장을 억제하고 5% CO2 에서 37℃ 에서 추가의 16-24 h 동안 인큐베이션하였다. 주입 16-24 h 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 Alexa-Fluor-라벨링된 팔ㄹ로이딘으로 염색하여 액틴 세포골격을 가시화하였다 (Invitrogen). 이어서 세포를 Leica SP2 AOBS 레이져 스캔 공초점 현미경 설정을 사용하여 가시화하였다.
박테리아 균주 및 성장 조건.
부르크홀더리아 타이란덴시스 및 돌연변이체를 L-배지에서 배양하였다. 클로람페니콜 (25 μg/mL) 또는 테트라시클린 (20 μg/mL) 을 필요에 따라 첨가하였다.
박테리아 침입 효율 검정.
B. 타이란덴시스 E264 를 1.0 (4 x 108 CFU/mL) 의 광학 밀도 (OD600) 로 L-브로쓰에서 성장시켰다. 총체적으로, 12-웰 플레이트에서 성장시킨 1 x 105 HeLa 세포를 37℃ 에서 2 시간 동안 10:1 의 다중도에서 박테리아를 이용하여 감염시켰다. 이어서 감염된 세포를 PBS 로 세척하고 15 분 동안 400 μg/mL 카나마이신을 함유하는 신선 배지로 인큐베이션하여 세포외 박테리아를 없애고, PBS 에서 1% Triton X-100 으로 용균시켰다. 감염된 HeLa 세포 용해물의 일련의 희석액을 L-아가 상에서 펼치고, 세포내 박테리아의 수를 CFU 에 대한 검정으로 결정하였다.
결과 및 논의.
광열 나노블레이트에 대한 광학 강도 패턴의 자극.
공동 기포 패턴은 박막 조성 및 배열에 의해 제어될 뿐 아니라 파장, 펄스 기간 및 에너지를 포함하는 레이져 자극에 의해 제어된다. 도 22C 는 3D 유한 시간차 도메인 (FDTD) 자극을 사용하여 레이져 여기된 Ti-코팅된 마이크로피펫 상에서 계산된 강도 패턴을 나타낸다. Ti-코팅된 마이크로피펫은 팁에 대해 30°의 각에서 조명처리되었다. 플라즈몬-증강된 광학 흡수는 선형적으로 편광화된 빛에 대해 2 μm 폭 Ti 고리에 걸쳐 불균일하다 (도 22D). 고강도 면적은 파장 편광 방향을 따라 고리의 가장자리에 대해서 농축된다. Ti 고리에서 온도 분포는 이들 고강도 면역에서 생성된 열에 의해 통제될 뿐 아니라 냉각기 금속 영역으로의 열 발산 및 레이져 펄스 동안 주변 매질로의 열 발산에 의해 통제된다. 마이크로피펫 상의 Ti 필름에서, 추정 열 반산 길이 (∼(Dτ)1/2) 는 6 ns 에서 230 nm 이다. 이는 전체 고리 모양 피펫 팁에 따라 온도 특성을 더욱 완화시킨다. 결과적으로 Ti 필름으로부터 나오는 열 에너지 전달은 인접한 얇은 수 층을 임계 온도 초과로 가열시켜 (Kotaidis et al. (2006) J. Chem. Phys. 124: 184702), 고리모양 마이크로피펫 팁 상에서 증기 나노기포를 발생시킨다 (도 23A).
공동 기포 유도 막 절단 및 상응하는 세포 생존력.
살아 있는 포유동물 세포로 마이크로미터 크기의 카고 전달을 위해, 일시적인 막 포탈은 카고 크기를 수용하기 위해 바람직하다. 더욱이, 손상 대역은 바람직하게는 세포 손상을 허용하고 생존력을 유지하도록 억제된다. 도 23A 은 레이져 펄스 조사 후 기울어진 Ti-코팅된 마이크로피펫 70 ns 의 팁에서 공동 기포를 나타낸다. 기포 크기에서의 극적인 감소는, 이러한 상호작용이 기포 팽창을 지체시키는 동안 팁이 세포막과 접촉할 때 관찰되었다. 이 경우, 기포는 70 ns 로 팁의 립으로부터 나오는 400 nm 최대 반경으로 성장되고 레이져 펄스 자극 후 200 ns 내에서 완전히 붕괴된다 (도 23A 및 23B). 블레이드 팁은 세포로 전혀 들어가지 못하고 따라서 세포내 구조 통합이 보존되며, 이는 신속함을 촉진하며, 회복되는 공극은 재밀봉되며, 이는 지속된 세포 생존력에 의해 입증된다 (도 23C). 세포 생존력은 레이져 펄스 90 분 후 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 (PI) 배제에 의해 측정되었다. 이들 조건 하에서, >90% 세포 생존력은 레이져 펄스를 이용하여 수득되고 기포 폭발 단독 (180 mJ/㎠ 의 최적 플루언스에서) 또는 HeLa 세포 또는 HEK293T 세포로 버퍼 주입과 커플링될 때 수득된다. 24 시간에 걸쳐 처리된 광열 나노블레이드를 모니터링하는 것은, 세포가 생존력 있게 남아 있고 성장이 계쏙되고 통상적으로 나뉘어진다.
광열 나노블레이드에 의한 생물분자 및 박테리아 전달.
본 발명자들은, 다양한 세포 유형에 대한 광열 나노블레이드를 사용하여 카고 크기 범위를 전달하였다. GFP-발현 RNA 은 리포펙타민-내성 IMR90 주요 인간 폐 섬유아세포로 효과적으로 전달되고, 100 nm 녹색 형광 폴리스티렌 비드 상에 코팅된 DsRed-함유 렌티바이러스는 주입 후 ROCK38 저해제 분산된 인간 배아 줄기 세포에서 성공적으로 발현되었다. 직경이 200 nm 인 형광 비드는 클로깅 없이 전달되며, 마이크로미터 크기의 박테리아 또한 그러하다 (도 24). 본 발명자들은, 이러한 접근법에 의해 전달되는 가장 크고 가장 깨지기쉬운 카고로서 세포내 박테리아를 추가로 평가하였다 (도 25). 부르크홀더리아 타이란덴시스는 ∼0.7 μm x 2 μm 로 측정되는 막대 모양 박테리아이다. 주입 효율을 측정하기 위해, GFP-라벨링된 박테리아는 통상적인 현미주사보다 100 배인 ∼5 x 108 per mL 의 농도에서 버퍼에 현탁되었다 (Goetz et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 98: 12221-12226). 높은 카고 농도는 높은 전달 효율을 달성하는데 중요한데, 이는 세포로 전달되는 액체 부피가 ∼1 pL 로 한정되기 때문이다. 고농도 없이, 주입 당 1 박테리아를 주입하는 진동수는 낮다. 우리의 실험에서, 레이져 펄스 및 세포막 오프닝 시, 1-5 pL 의 박테리아 용액이 피펫으로부터 배출되고, 이는 주입 당 평균 ∼1 박테리아에 상응한다. 배출된 용액이 모두 세포로 전달되는 것은 아닌데, 이는 피펫 팁이 세포막과 접촉하는 빛 하에 존재하고 피펫의 보어가 절단 후 막으로 완벽히 밀봉되지 않기 때문이다. 이러한 조건 하에서, 본 발명자들은 다중의 독립적인 실험을 통해 평균 전달 효율을 46% 로 수득했다.
본 발명자들은, 2 시간 동안 B. 타이란덴시스로 인큐베이션함으로써 HeLa 세포에서 자연 박테리아 침입 효율을 추가로 평가하였다. 광열 주입에 의한 전달 효율은 0.8% 의 B. 타이란덴시스의 천연 HeLa 세포보다 100 배 높다. 중요한 것은, 세포 주입 24 시간 후 세포는 생존하고, 유리 피펫 내에서 기포 사이클 동안 파괴로부터 보호되고 보어 팁 오프닝에 의한 주입 동안 전단으로부터 보호된다 (박테리아 증가 및 액틴 중합에 의해 증명된 바와 같음) (Stevens et al. (2005) J. Bacteriol., 187: 7857- 7862).
광열 나노블레이드의 신뢰도 평가.
강건 작업 동안, 금속성 박막은 바람직하게는 고온 및 충격파로부터의 고압 및 공동 기포에 의해 생성되는 고속 플로우를 견딘다. 금과 같은 비활성 금속과 비교시 유리 기판으로의 강한 부착 및 높은 용융 온도를 갖는 코팅 물질로서 Ti 가 선택되었다 (Benjamin 및 Weaver (1961) Proc. R. Soc. London, Ser. A, 261: 516-531). 본 발명자들의 실험에서 수 개의 레이져 펄스 후 금 코팅된 마이크로피펫은 박막 손상으로 인해 실패한 것으로 나타났다. 본 발명자들은 Ti-코팅된 마이크로피펫이 50 회 이상의 레이져 펄스 및 기포 폭발 사이클을 통해 여전히 기능한다는 것을 증명하였다.
결론.
이 실시예에서 기술된 광열 나노블레이드는 현재 트랜스펙션 불가능한 큰 카고를 포유동물 세포, 예컨대 염색체, 세포기관 및 세포내 병원체로 전달하는 것을 보장하고, 이는 동시대 접근법의 크기 제약을 뛰어넘는 것이다. 광열 나노블레이드의 추가의 이점은 이용의 용이함에 있다. 막 절단이 레이져 펄스 에너지에 의해 제어되고 Ti 코팅 배열에 의해 제어되기 때문에, 사용자는 단순히 세포막과 온화하게 접촉시킨 마이크로피펫 팁을 단순히 위치시켜 전달을 수행한다. 대조적으로, 통상적인 유리 마이크로모세관 현미주사에 대해서, 전달 효율 및 세포 생존력은 유리 니들이 세포에 들어가는 방식에 의해 매우 영향 받는다 (예를 들어 속도, 힘, 각). 결과적으로, 통상적인 방법은 사용자가 상당한 훈련을 받아 매우 숙련되어 있는 것을 요구한다. 또한, 광열 나노블레이드를 사용하여 깨지기 쉬운 마이크로피펫 팁을 파괴할 가능성이 더 적은데, 이는 세포를 관통한 다음에 이를 나오는 마이크로피펫에 대한 움직임이 신속하게 "지그-재그" 움직임이 되는 것을 요구하지 않기 때문이다. 광열 나노블레이드는 현재 데모에서 임의의 특정 표면 플라즈몬 공명 모드로 작업하지 않았다. 또한, 자극 레이져 파장을 매칭하기 위한 금속성 나노구조의 최적화는 공동 기포를 자극하기 위한 역치 레이져 에너지를 감소시킬 수 있었다.
본원에 기술된 구현예 및 실시예는 단지 설명의 목적으로만 기술된 것이며, 당업자는 이를 다양하게 변경 및 변화시킬 수 있으며 이는 본 특허청구범위의 취지 및 적용 범주 이내에 포함됨을 숙지한다. 본원에 인용된 모든 공개공보, 특허 및 특허 출원은 이의 전문이 참조로서 본원에 포함되어 있다.

Claims (65)

  1. 작용물질을 세포로 전달하기 위한 장치로서, 하기를 포함하는 장치:
    전자기파 방사선 접촉시 가열되는 물질의 나노입자 또는 박막을 포함하는 관 표면을 포함하는 관으로서,
    상기 관 표면이 상기 관 표면을 통과하는 복수의 오리피스를 포함하고,
    상기 나노입자 또는 박막이 하나 이상의 상기 오리피스의 표면상에서 또는 상기 관 표면에서 하나 이상의 상기 오리피스의 100 μm 이내에 침착되는, 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 관 표면이 미세유체역학 장치에서의 챔버 또는 채널의 표면을 포함하는 장치.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 관이 세포 배양관 또는 미세적정 플레이트 내의 웰을 포함하는 장치.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 관이 세포를 함유하도록 형성되고 현미경으로 관찰되도록 배열되는 장치.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 관 표면이 5 개 이상의 오리피스를 포함하는 장치.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 관 표면이,
    상기 오리피스의 100 μm 이내에 배치되는 나노 입자 또는 박막을 갖거나, 나노입자 또는 박막을 포함하는 표면을 각각 포함하는 오리피스를, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 50 개 이상, 100 개 이상, 200 개 이상, 또는 500 개 이상 포함하는 장치.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 오리피스가 2 ㎠ 이하, 또는 1.5 ㎠ 이하, 또는 1 ㎠ 이하, 또는 0.5 ㎠ 이하, 또는 0.1 ㎠ 이하의 상기 관 표면적 내에서 모두 위치하는 장치.
  8. 제 5 항에 있어서, 나노입자 또는 박막이, 하나 이상의 상기 오리피스의 100 μm 이내, 또는 50 μm 이내, 또는 25 μm 이내, 또는 20 μm 이내, 또는 15 μm 이내, 또는 10 μm 이내, 또는 5 μm 이내에서 배치되는 장치.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 나노입자 또는 박막이 오리피스의 벽 상에서 또는 립 주변에 전반적으로 침착되거나;
    상기 나노입자 또는 박막이 오리피스의 벽 또는 립의 하나의 영역 상에서 우선적으로 존재하는 장치.
  10. 제 1 항에 있어서, 나노입자 또는 박막이 세포가 배치되는 면과 동일한 면 상에서 오리피스의 립에 또는 표면의 마주보는 면 상에서 침착되는 장치.
  11. 제 1 항에 있어서, 나노입자 또는 박막이 세포가 배치되는 면과 반대에서 오리피스의 립에 또는 표면의 마주보는 면 상에서 침착되는 장치.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 관 표면이 박막을 포함하는 장치.
  13. 제 1 항에 있어서, 나노입자 또는 박막이 5 nm 내지 500 nm 의 크기 범위의 나노입자를 포함하는 장치.
  14. 제 1 항에 있어서, 나노입자 또는 박막이,
    반도체, 금속, 금속 합금, 금속 니트라이드 및 금속 옥시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질; 또는
    전이 금속, 전이 금속 합금, 전이 금속 니트라이드 및 전이 금속 옥시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질; 또는
    금, 티탄 (Ti), TiN, TiCn 및 TiAlN 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질; 또는
    III 족 물질 또는 V 족 물질로 도핑된 IV 족 물질인 반도체
    를 포함하는 장치.
  15. 제 5 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 오리피스가 세포로 전달되는 시약을 함유하는 챔버와 플루이드 내에서 소통하거나;
    상기 장치가 하나 이상의 마이크로채널을 포함하고, 하나 이상의 상기 오리피스가 상기 하나 이상의 마이크로채널과 플루이드 내에서 소통하는 장치.
  16. 제 15 항에 있어서, 상이한 마이크로채널이 상이한 오리피스와 플루이드 내에서 소통하는 장치.
  17. 제 16 항에 있어서, 플루이드를 상이한 마이크로채널로 전달하기 위한 다기관 또는 밸브를 포함하는 장치.
  18. 제 15 항에 있어서, 마이크로채널이 상기 세포로 전달되는 시약을 함유하는 장치.
  19. 제 15 항에 있어서,
    상기 마이크로채널이 펌프의 제어 하에서 가압되거나, 또는 중력 이용 공급 장치에 의해 공급되고;
    상기 마이크로채널에서 플로우를 모니터링 및 제어하고, 상기 관 표면의 조명 시기 및 조명 위치를 제어하는 콘트롤러를 추가로 포함하는 장치.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 장치가, 도립 현미경 상의 스테이지를 대체하도록 설정되는 장치.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 상기 관 표면 상에 배치되는 장치.
  22. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 장치; 및
    상기 나노입자 또는 박막을 가열할 수 있는 전자기파 에너지원
    을 포함하는, 작용물질을 세포로 전달하는 선택적 오프닝 시스템.
  23. 제 22 항에 있어서, 전자기파 에너지원이 레이져 또는 비-간섭성 광원인 시스템.
  24. 제 22 항에 있어서,
    렌즈 시스템, 반사경 시스템 또는 마스크, 또는 전자기파 에너지를 상기 관 표면의 특정 영역으로 향하게 하는 위치화 시스템을 포함하거나;
    전자기파 방사원에 의한 상기 관 표면의 조명 시기 또는 조명 패턴을 제어하는 콘트롤러를 포함하는 시스템.
  25. 하기 단계를 포함하는, 시약을 세포로 전달하는 방법:
    제 22 항에 따른 시스템에 세포를 제공하는 단계로서, 이때 상기 세포는 상기 관 표면상에 배치됨;
    상기 세포를 상기 시약과 접촉시키는 단계; 및
    상기 관 표면의 영역을 전자기파 방사선에 노출시키고, 이로써 상기 박막 또는 나노입자의 가열을 유도하는 단계로서, 이때 상기 가열은 가열된 영역에서 또는 가열된 영역 근처에서 세포막의 오프닝을 도입하는 기포를 형성하여 상기 시약을 이들 세포로 전달시킴.
  26. 제 25 항에 있어서,
    세포를 둘러싸고 있는 배양 배지에 상기 시약을 제공함으로써 상기 세포와 상기 시약을 접촉시키거나;
    상기 관 표면 내에 존재하는 하나 이상의 오리피스에 상기 시약을 제공함으로써 상기 세포와 상기 시약을 접촉시키거나;
    오리피스와 플루이드 내에서 소통하는 하나 이상의 미세유체역학 채널에 상기 시약을 제공함으로써 상기 세포와 상기 시약을 접촉시키는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상이한 시약을 상이한 오리피스에 도입하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 노출시키는 것이, 상기 관 표면의 영역을 레이져 펄스 또는 비-간섭성 광원에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 시약이 핵산, 염색체, 단백질, 라벨, 세포기관, 및 소 유기 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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