CN1759172A - 高度可控制性电穿孔方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可控制性电穿孔***和方法，由于所述***和方法可以控制水性膜孔的大小、数量、位置与分布，因此增加了适用性。所述的可控制性电穿孔***和方法一般运用至少两个激活子***和子过程。其中一个子***和子过程运用相对广泛的效用以削弱膜，称为广效性子***。另一个子***和子过程运用相对局限的效用以定位膜中的膜孔的位置，称为局效性子***。

Description

高度可控制性电穿孔方法及其应用
                      技术领域
本发明涉及高度可控制性电穿孔方法及其应用。
                      背景技术
细胞膜起将分子内容物与其外部环境分隔的重要功能。细胞膜大部分由两亲类脂质组成，其可白组装成高度隔离的结构，因此对于膜间的离子传输表现为高能屏障。
然而，类脂基质可因强大的外部电场而被破坏，导致膜间传导和扩散通透性增加，如熟知的电穿孔现象。这些现象是因细胞膜中形成水性膜孔的结果。尤其是，电穿孔过程涉及在施加短期电场脉冲通常是介于较大盘电极之间时细胞膜的通透作用(Neumann，et al.，Bioelectrochem Bioenerg 48，3-16(1999)；Ho，et al.，Crit Rev Biotechnol16，349-62(1996))。
例如，图2A和2B显示传统电穿孔***20，电场的作用(如封闭环路22所示)会在细胞膜24上产生无规的膜孔26。这些膜孔的分布，仅就大小与数量而言，取决于施加电场的强度与时间。施加的电场越强且时间越长，则膜孔越多且越大。然而，这些膜孔的确切位置无法被控制，所以膜孔的最终分布是随机的。研究人员无法控制化合物被导入细胞内基质中的位置，而这常常是生化反应途径的重要因素。因此研究人员常需要依赖细胞本身的自然机制，但这在运用上却是缓慢且困难。
电穿孔法用于导引大分子如DNA、RNA、染料、蛋白质与各种化学药剂进入细胞。大的外部电场能引发高的膜间电位从而形成膜孔(例如，具有直径为20-120nm范围)。在施加电脉冲时，带电大分子，如DNA，可以通过电泳主动地经由所述膜孔穿入细胞膜(Neumann，etal.，Biophys J 712 868-77(1996))。不带电的分子也可通过被动扩散经由所述孔进入。在脉冲终止时，膜孔于上百毫秒时间内再次关闭，该时间由恢复为常规膜的传导值检测出(Ho，1996，前述)
此方法常用于实验室设备中，以将化学和生物化合物注入细胞中，并避免依赖细胞本身的蛋白质受体和细胞膜间的膜间通道。这使得研究人员易于研究化合物的生物效应，判断其是抗癌药物还是致死毒物。然而，现有的电穿孔技术是有局限的。
因此，必须提供一种方法和***以克服传统电穿孔法的限制。
                      发明内容
上述及其它现有技术中的问题和不足可以由本发明的可控制性电穿孔法的多种方法与设备加以克服或改进。本发明的可控制性电穿孔***和方法允许控制水性膜孔的大小、数量、位置与分布，因此增加了适用性。此处所述的可控制性电穿孔***和方法一般运用至少两个子***和子过程。其中一个子***和子过程运用较广泛的效用以削弱细胞膜，称为广效性子***。另一个子***和子过程运用较局限的效用以定位膜上膜孔的位置，称为局效性子***。
本发明的上述与其它的特色及优点，可由以下详细的叙述和附图为本领域技术人员领会与了解。
                      附图说明
图1A和1B显示本发明所述的可控制性电穿孔***的操作；
图2A和2B显示传统的电穿孔***的操作；
图3A-3D显示一细胞注入***的一般实施方式；
图4A-4B显示一细胞注入***的实施例；
图5A-5B显示用于一列细胞的细胞注入***的实施例；
图6显示一利用多重磷脂质膜层和电穿孔法的分离装置；
图7显示一利用多膜层、电穿孔法和一组微流的分离装置；
图8显示一利用在不同位置具有不同的孔的单膜层的分离装置；
图9显示一可用于本发明各种实施方式的电极板网栅(electrodegrid)的实施例。
                      发明详述
本发明所述的可控制性电穿孔***和方法允许控制水性膜孔的大小、数量、位置与分布，因此增加了实用性。参照图1A与1B，本发明所述的对于膜12可控制性电穿孔***10与方法，一般而言运用至少两个激活的子***和子过程。图1A显示膜12的一部份，而图1B显示本发明所述的可控制性电穿孔***10。
值得注意的是，仅存在其中一个激活的子***将不足以在膜上开启或产生膜孔14而必须运用两个激活的子***，以类似于逻辑“与”门方式运作。其中一个广效性子***16运用较广泛的效用以削弱膜，而另一个局效性子***18则运用较局限的效用以定位在膜12上的膜孔14的位置。同时运用广效性子***16与局效性子***18可高度定位且控制电穿孔法，从而开启膜孔14。
因此，举例而言，相比于描述于背景技术部分及图2A与2B的传统的细胞膜电穿孔法，除了传统电穿孔技术所使用的电场以外，本发明所公开的电穿孔***和方法运用一个在细胞膜上特定位置的局效性子***18，以控制膜孔14的位置。局效性子***18会激发磷脂质分子，因而降低广效性子***16产生水性膜孔所需的能量。因此，举例而言，可施加给***一极弱的电场，其不发生电穿孔现象。然而，此弱电场可在激光束激发过细胞膜的位置开启水性膜孔。
广效性子***或子过程16可选自任何适用的膜削弱***和/或过程。此弱***和/或过程可选自电场(在某些优选实施方式中为均匀电场)、微波能量、其它电磁辐射、低能激光束(即低于引发随机电穿孔法所需的能量)、和包含至少一种前述弱能***和/或过程的任意组合。广效性子***或过程16的能量大小一般低于传统随机开启膜孔的电穿孔法的能量。另外，弱能***和/或过程16的覆盖区域(例如横截面区域)一般包含大于所期望膜孔大小的区域。在某些实施方式中，该区域包含整个细胞膜或一组细胞膜。在其它实施方式中，该区域为细胞膜的一个部位。
局效性子***或子过程18可选自任何适用的膜孔定位***和/或过程。上述定位***和/或过程可选自激光束、电极头、和包含至少一种前述定位***和/或过程的任意组合。定位***和/或过程18的区域(例如横截面区域)一般相对于所期望的膜孔大小较狭窄。因此，可以使受控制的膜孔具有亚微米级或纳米级的尺寸(例如1-100nm)，现今及开发中的激光器和电极头技术能达到上述亚微米级和纳米级的尺寸。
应用
细胞注入
本发明所述的可控制性电穿孔***和过程，在控制的条件下，可用于注入大分子，包括DNA、RNA、染料、蛋白质与各种化学药剂。在不限制本发明的可控制性电穿孔***的应用的情况下，图3A-5B显示了运用可控制性电穿孔***的细胞膜孔开口***的各种实施方式。
参照图3A-3D，***30可控制性地将大分子注入细胞。图3A显示***30包括用以固定细胞24的机构32。机构32为合适的微机械装置，其包括在生物工艺领域广泛已知的相关微***。此机构32优选可固定个别细胞或控制细胞组。另外，机构32也可用于从细胞24获取生物的、电的、光的或其它的数据。
参照图3B，***30包括用以固定细胞24的机构32，且可控制性电穿孔***包括广效性子***16与局效性子***18，其中局效性子***18针对于细胞24的某一位置以引发膜孔34开口。
参照图3C，经由一纳米喷嘴或其它合适的注射装置36导入一大分子38。当移除局效性子***18和/或广效性子***16时，膜孔会关闭，使细胞24’内具有大分子38。
图4A与4B显示用以在细胞24中引入例如以导入上述大分子的可控制性开孔34的可控制性电穿孔***40。***40包括以电场发生装置42、44、46的形式的广效性子***，和来自适当源的激光束48(未示出)。电场发生装置的形式为一电极板42偶合至一可切换(经由一开关44)的电压源46。如图所示，激光束可聚焦，而施加电场以激活膜孔开口机制，其类似于前述的逻辑“与”电路方式。
有关图3A-3D和图4A-4B的***和方法的描述，研究人员仅需以组织结构中少量的细胞暴露于生物化合物，并观察其传导至邻近细胞讯号的方式。或者，研究人员可研究是否非对称的细胞如神经元和肠胃粘膜细胞对于在不同位置注入的化合物反应不同。
参照图5A与5B，***50为类似图3A-3D或图4A-4B并结合一列细胞24组52的操作。当广效性子***16与局效性子***18操作时，细胞24上形成膜孔34。此膜孔可用于选择性地将大分子导入细胞24中。
分离装置
参照图6-10，其为利用本发明的可控制性电穿孔***而获得的过滤/分离装置的各种实施方式。
图6描述了***60的一个实施方式，例如，分子筛。***60包括多个膜层62，例如，磷脂质双层膜。每一膜层62在运用广效性子***时可经受局效性子***，另外膜孔64的位置可在组装和/或制造时预先决定，例如，具有适当的微-或毫微-缺陷，或由各膜层的不同电压水平决定孔大小时可以一致。每一膜层所施加的不同电压(例如V1、V2与V3)可产生从大膜孔64至小膜孔64的过滤梯度，从而使得分子66通过合适的膜层。
使用生产成本极低的磷脂质双层膜，相同的滤膜60可重复使用且采用电穿孔法可适用于所需的任何尺寸，小心控制施加的电场。除了多层滤膜，可以使用单个滤膜并并构造使之适合于任何情形。
参照图7，***70显示具有类似于图6中所述功能的分子筛，其与具有通道74的生物芯片组72相连。通道74可基于尺寸收集各级大分子和分子。另外，通道74可加入或与梯度***，例如压力、热力、电力或其它梯度相连以引导大分子和分子至组72。组72可为任何适用的微流体或毫微流体装置。举例而言，制造此类装置的方法如描述于2003年11月30日的Reveo Inc.PCT Application No.PCT/US03/37304，其标题为“Three Dimensional Device Assembly and Production MethodsThereof”，将其加入本文作为参考。
图8显示另一动态过滤装置的实施例，其中一列激光器组提供膜孔开口的定位。图8显示过滤***80，其包括连接于一广效性子***16与一局效性子***18的膜层82。举例而言，局效性子***18可由激光器组88产生。或者，除了激光器组88，可加入一光束导向装置，从而只使用一个激光源。当与膜层82上某位置相连的激光器组被激活时，膜孔84会开启。膜孔的大小受控于预定的膜特性、局效性子***区域或大小，或者广效性子***的大小。
细胞、蛋白质、酶、DNA分子、RNA分子与其它大分子或分子可受制于一列容器86组，例如位于合适的微流体装置上。因此，分离装置80在任何用途下需要极规整和高度灵活。
图9显示本发明的各实施方式中，适于提供广效性子***的电极的范例。经由以栅格形式提供电极，可供应适用的电场产生***以符合各种用途，包括局效性子***、大分子导引、过滤或任何其它目的。
除了基于大小的过滤，前述的分离装置也可基于离子价而分离，因为施加的电压仅能驱使一种类型的离子通过膜。
尽管已显示和描述了优选实施方式，但在不背离本发明精神和范围的情况下可以做各种改进和修改。因此，需要指出的是通过举例而描述的本发明并不限于此。

Claims (47)

1.膜的可控制性电穿孔***，其包含有：
广效性子***，用以给所述膜提供广泛的能量，和
局效性子***，用以给所述膜提供局限的能量，
其中在对应于所述局限的能量位置的位置处打开或产生孔。
2.如权利要求1所述的***，其中所述广效性子***是选自电场、微波能、其它电磁辐射、和低能激光束的弱能***，或者是包含至少一种前述弱能***的任意组合。
3.如权利要求1所述的***，其中所述广效性子***的能量大小低于不具有所述局效性子***从而产生无规膜孔的电穿孔***的能量大小。
4.如权利要求1所述的***，其中所述广效性子***所覆盖的区域包含大于所期望的膜孔的大小的区域。
5.如权利要求1所述的***，其中所述广效性子***所覆盖的区域包含一个细胞的膜。
6.如权利要求1所述的***，其中所述广效性子***所覆盖的区域包含一列细胞的膜。
7.如权利要求1所述的***，其中所述广效性子***所覆盖的区域包含膜的一个部位。
8.如权利要求1所述的***，其中所述局效性子***是选自激光束、和电极头的定位***，或者是包含至少一种前述定位***的任意组合。
9.如权利要求1所述的***，其中所述局效性子***的区域对应于所述膜孔的大小。
10.如权利要求1所述的***，其中所述膜孔具有亚微米级尺寸。
11.如权利要求1所述的***，其中所述膜孔具有约100纳米或更小的尺寸。
12.可控制性电穿孔***，其包含有：
广效性子***，用以给膜提供广泛的能量，和
局效性子***，用以给膜提供局限的能量，
其中当所述广效性子***与所述局效性子***均被激活时，孔被打开。
13.可控制性地在膜上开孔的方法，其包括：
导引广泛的能量至所述膜，和
导引局限的能量至所述膜，
其中在对应于所述局限的能量位置的位置处打开或产生孔。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述广泛的能量是选自电场、微波能、其它电磁辐射、和低能激光束的能源***，或者是包含至少一种前述能源***的任意组合。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述广泛的能量的大小低于不具有所述局限的能量从而产生无规膜孔的电穿孔***的能量大小。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述广泛的能量所覆盖的区域包含大于所期望的膜孔大小的区域。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述广泛的能量所覆盖的区域包含一个细胞的膜。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述广泛的能量所覆盖的区域包含一列细胞的膜。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述广泛的能量所覆盖的区域包含膜的一个部位。
20.如权利要求13所述的方法，其中所述局限的能量是选自激光束、和电极头的定位***，或者是包含至少一种前述定位***的任意组合。
21.如权利要求13所述的方法，其中所述局限的能量的区域对应于所述膜孔的大小。
22.如权利要求13所述的方法，其中所述孔具有亚微米级的尺寸。
23.如权利要求13所述的方法，其中所述孔具有约100纳米或更小的尺寸。
24.细胞开孔***，其包含有：
微机械装置，用以固定细胞，和
如权利要求1所述的***，用以可控制性地在所述细胞上开孔。
25.如权利要求24所述的细胞开孔***，其中所述广效性子***包含电极板和可切换的电压源。
26.如权利要求24所述的细胞开孔***，其中所述局效性子***包含激光器。
27.细胞孔大分子***，其包含有：
微机械装置，用以固定细胞，
如权利要求1所述的***，用以可控制性地在所述细胞上开孔，和
大分子注入装置，用以经由所述孔将大分子注入所述细胞。
28.细胞开孔的方法，其包括：
固定细胞，和
应用如权利要求13所述的方法，可控制性地在所述细胞上开孔。
29.用以将大分子引入细胞内的方法，其包括：
固定细胞，
应用如权利要求13所述的方法，可控制性地在所述细胞上开孔，和
经由所述孔将所述大分子引入所述细胞内。
30.用于过滤分子或大分子的***，其包含有：
多个膜层，各膜层包括如权利要求1所述的可控制性地在细胞上开孔的***，各膜层被开启成具有不同的孔径，从而产生孔大小梯度。
31.过滤分子或大分子的***，其包含有：
多个膜层，和
广效性子***，其与各膜层相结合，
其中各膜层包括具有缺陷的位置，在不激活所述广效性子***的情况下，所述位置关闭，而在激活所述广效性子***的情况下，所述位置被打开。
32.如权利要求31所述的***，其中位于各膜层的缺陷控制所述孔的大小。
33.如权利要求31所述的***，其中所述广效性子***的能量大小控制所述孔的大小。
34.用以过滤分子或大分子的***，其包含有：
膜层，其包括如权利要求1所述的用以可控制性地在细胞上开孔的***，
其中所述局效性能量子***包含一组局效性能量次子***。
35.用以过滤分子或大分子的***，其包含有：
膜层，其包括如权利要求1所述的用以可控制性地在细胞上开孔的***，
其中所述局效性能量子***包含一组激光器。
36.用以过滤分子或大分子的***，其包含有：
膜层，其包括如权利要求1所述的用以可控制性地在细胞上开孔的***，
其中所述局效性能量子***包含与电磁能量源相连结的光束导向装置。
37.可控制性开孔装置，其包含有：
双层细胞膜，
激光束源，和
电场源，
其中将由来自所述激光束源的激光束施加于所述双层细胞膜的一个位置，从而界定出一开孔位置，并施加来自所述电场源的电场，从而开孔。
38.如权利要求37所述的可控制性开孔装置，其中所述双层细胞膜包含磷脂。
39.如权利要求37所述的可控制性开孔装置，其中，由所述激光束激发所述位置的分子，从而减少开孔所需的电场能量，其中所述电场可以比不存在激光束时开启所述孔所需的电场弱。
40.过滤装置，其包含如权利要求37、38和39所述的可控制性开孔装置。
41.分离装置，其包含数个如权利要求40所述的过滤装置，所述过滤装置堆叠在一起，并对各个过滤装置施加不同的电压从而使孔大小不同。
42.如权利要求40所述的过滤装置，其中所述激光束源能将激光束导引至膜上的多个部位，由此界定当施加电场时用以开孔的不同位置。
43.如权利要求42所述的过滤装置，其中孔的大小因膜的特性或电场的级别而改变，所述过滤装置还包括多个与膜上用以施加激光束的位置相连的容器。
44.用以分离颗粒的方法，其包括：
提供双层膜，
导引激光束至膜上的某位置，
施加电场以在所述膜上的所述位置开孔，由此，小于所述孔大小的颗粒将被分离。
45.用以分离颗粒的方法，其包括：
提供多个双层膜的堆叠，
导引激光束至所述膜上的某位置，
施加单独的电场至各个膜，以在各个膜上开孔。
46.如权利要求45所述的方法，其中改变施加至至少一个所述多个膜中的电场以改变开口大小。
47.分离颗粒的方法，其包括：
提供双层膜，
导引激光束至所述膜上的第一位置，
施加电场以在所述膜上的第一位置处开孔，则小于第一膜孔大小的颗粒将被分离，并被收集于一第一容器中，
导引激光束至所述膜上的第二位置，
施加电场以在所述膜上的第二位置处开孔，则小于第二膜孔大小的颗粒将被分离，并被收集于一第二容器中。
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