KR102258496B1 - 옥수수 이벤트 mon87429 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 독특한 재조합 DNA 분자 및 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 형질전환 옥수수 식물, 옥수수 식물 일부분, 옥수수 종자, 옥수수 세포, 및 농작물뿐만 아니라 옥수수 이벤트 MON87429를 사용 및 검출하는 방법을 제공한다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 형질전환 옥수수 식물은 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제에 대한 내성을 나타낸다.

Description

옥수수 이벤트 MON87429 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2018년 2월 2일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/625,537의 우선권의 이점을 주장하며, 그것의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 편입되어 있다.
서열목록의 편입
44.2 KB (MS-윈도우에서 측정됨)이고 2019년 1월 17일 창작된, "MONS430WO-seq.txt"로 명명된 파일에 함유된 서열목록은 전자적 제출에 의해 본원과 함께 출원되고, 본 명세서에 참고로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 옥수수 이벤트(maize event) MON87429의 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 형질전환 옥수수 식물, 일부분, 종자, 세포, 및 농작물뿐만 아니라 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 형질전환 옥수수 식물, 일부분, 종자, 세포, 및 농작물을 사용하고 옥수수 이벤트 MON87429를 검출하는 방법에 관한 것이다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 형질전환 옥수수 식물, 일부분, 종자, 및 세포는 퀴잘로포프 및 할록시포프와 같은 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제; 합성 옥신 예컨대 디캄바 및 2,4-D; 글루포시네이트와 같은 글루타민 합성효소의 억제제; 및 글라이포세이트와 같은 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS)의 억제제에 대해 내성을 나타낸다.
옥수수 (학명 지아 메이스 ( Zea mays))는 세계의 많은 지역에서 중요한 작물이며, 작물 생산에서 잡초 방제를 위한 제초제의 사용은 잘-확립된 도구이다. 생명공학의 방법은 이식유전자로도 알려져 있는, 이종성 유전자의 발현에 기인한 특이적 제초제에 대한 내성인 형질전환 옥수수를 생산하는데 사용되어 왔다. 제초제 내성 특성은 단독으로 또는 다른 특성, 예컨대 또 다른 제초제에 대한 내성 또는 해충 또는 병원체에 대한 저항과 조합하여 사용될 수 있다. 제초제 내성 특성의 조합은 재배자 유연성을 증가시키고 제거가 힘든 잡초를 방제하기 위한 다수의 제초제 작용 방식의 사용을 가능하게 하는 잡초 방제 선택을 제공하는 것이 바람직하다. 특성의 조합은 각각의 개별 특성을 함께 교배시킴에 의해 달성될 수 있다. 옥수수에서 개별 특성을 함께 교배시키고 다양한 엘리트 생식질의 풀로 교배하는 동안 이 조합을 유지하는 것은 시간이 걸리고 비싼 과정이다. 특성의 조합은 또한 게놈에서 일 위치 또는 유전자좌에서 다수의 특성을 조합하고, 그것에 의해 교배 과정을 간소화함으로써 달성될 수 있다. 이를 달성하는 하나의 방법은 다수의 이식유전자를 함유하는 단일 형질전환 삽입을 통해서 된다. 옥수수에서의 단일 유전자좌에서 다수의 제초제 내성 특성의 조합은 다양한 엘리트 생식질의 풀로 교배하는 동안 유지하기가 훨씬 단순하고 덜 비싼 잡초 방제에 유용한 도구를 제공할 것이다.
형질전환 식물, 일부분, 종자, 또는 세포에서 이식유전자의 발현과 그에 따른 유효성은 많은 상이한 인자, 예컨대 이식유전자의 발현 카세트에 사용된 요소 및 이들 요소의 상호작용에 의해 영향을 받을 수 있다. 이것은 2개 또는 그 초과의 발현 카세트를 함유하는 형질전환 삽입에 대해 더욱 복잡하게 되며, 각각의 발현 카세트는 다중-유전자 형질전환 이벤트로도 알려져 있는 별개의 특성을 부여하는 이식유전자를 갖는다. 상업적으로 유용한 다중-유전자 형질전환 이벤트는 형질전환 삽입에서 각각의 이식유전자가 각각의 특성에 필요한 방식으로 발현되는 것을 요한다. 이를 달성하기 위해, 개별 발현 카세트를 먼저 설계하고 식물에서 시험하고, 그리고 각각의 특성에 대해 최상의 발현 카세트를 선택한다. 다음으로, 일 특성에 대해 선택된 발현 카세트를 다른 특성(들)에 대한 선택된 발현 카세트와 하나의 작제물로 조합하고, 본 작제물은 모든 발현 카세트가 함께 잘 기능하고 각각의 이식유전자가 적절하게 발현되는지 확인하기 위해 시험된다. 그런 다음, 선택된 발현 카세트의 조합은 단일 형질전환 삽입물로 사용되어 수백 개의 다중-유전자 형질전환 이벤트를 생성하며, 각각의 이벤트는 상이한 게놈 위치에서 외래 DNA의 랜덤 삽입의 결과이다.
각각의 형질전환 이벤트는 고유하다. 고유의 이벤트는 그 다음 상업적 사용에 대한 우월한 이벤트를 선택하기 위해 식물의 다수 세대를 통하여 분석된다. 형질전환 식물, 일부분, 종자, 또는 세포에서 이벤트의 성능과 그에 따른 유효성은 형질전환 삽입의 게놈 위치에 의해 영향을 받을 수 있다. 이벤트는 동일한 형질전환 삽입을 가질 수 있으나 그럼에도 불구하고 조직 및 발달 단계에 걸쳐, 다양한 생식질에서 또는 특이적 성장 조건 하에서 상이한 이식유전자 발현 수준 및 성능을 갖는다. 상업적 사용을 위한 다중-유전자 이벤트의 창출은 여러 해에 걸쳐, 여러 위치에서, 그리고 다양한 조건하에서 엄격한 분자 특성규명, 온실 실험 및 현장 시험이 필요하고 따라서 광범위한 작물학적, 표현형 및 분자 데이터가 수집될 수 있다. 수득한 데이터는 그 다음 상업적 목적에 유용한 이벤트를 선택하기 위해 과학자와 농업경제학자에 의해 분석되어야 한다. 상업적 다중-유전자 이벤트는 그 다음 식물 육종 방법을 사용하여 신규한 생식질 내로 다수의 제초제 내성 특성을 갖는 단일 유전자좌로서 유전자침입될 수 있다.
본 발명은 서열번호:10, 서열번호:9, 서열번호:8, 서열번호:7, 서열번호:6, 서열번호:5, 서열번호:4, 서열번호:3, 서열번호:2, 및 서열번호:1로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 재조합 DNA 분자는 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물, 종자, 또는 세포로부터 유래되고, 상기 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 기탁 번호 PTA-124635로 기탁되었다. 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 DNA 분자는 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물, 종자, 또는 식물 일부분에 존재하고, 상기 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC PTA-124635로 기탁되었다. 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 DNA 분자는 옥수수 이벤트 MON87429의 존재에 대해 진단하는 앰플리콘이다.
본 발명은 4개의 발현 카세트를 포함하는 DNA 작제물을 제공하며, 제1 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) 에리안서스 라벤나에(Erianthus ravennae)로부터 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론, (II) 포스피노트리신 N-아세틸전달효소 코딩 서열, 및 (III) 세타리아 이탈리카(Setaria italica)로부터 푸룩토스-비스포스페이트 알돌라아제 3' UTR을 포함하고; 제2 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) 코익스 라크리마 - 요비(Coix lacryma-jobi)로부터 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론, (II) 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 알비노 및 옅은 녹색 6 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열, (III) 디캄바 모노옥시게나제 코딩 서열, 및 (IV) 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터 메탈로티오네인-유사 단백질 3' UTR을 포함하고; 제3 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) 아룬도 도낙스(Arundo donax)로부터 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론, (II) 아라비돕시스 탈리아나로부터 말레이트 탈수소효소 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열, (III) FT_T 단백질 코딩 서열, 및 (IV) 오리자 사티바로부터 무 정단(no apical) 분열조직 단백질 3' UTR을 포함하고; 그리고 제4 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) CaMV 35S 프로모터 및 리더, (II) 트리티쿰 아에스티범(Triticum aestivum)으로부터 클로로필 a/b-결합 단백질 리더, (III) 오리자 사티바로부터 액틴 1 인트론, (IV) 아라비돕시스 탈리아나로부터 ShkG 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열, (V) 아그로박테리움 sp ( Agrobacterium sp ) 균주 CP4로부터 글라이포세이트 내성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 코딩 서열, (VI) 지아 메이스(Zea mays)로부터 웅성 조직 특이적 siRNA 표적, 및 (VII) 오리자 사티바로부터 글리신-풍부 RNA 결합 단백질 3'UTR을 포함한다.
본 발명은 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 DNA의 샘플에서의 서열번호:10에 대해 특이적인 DNA 프로브로서 기능하기 위해 충분한 길이의 서열번호:10의 인접 뉴클레오타이드를 갖는 DNA 분자를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 DNA 프로브는 서열번호:13을 포함한다.
본 발명은 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자를 포함하는 한 쌍의 DNA 분자를 제공하며, 상기 제1 및 상기 제2 DNA 분자 각각은 서열번호:10의 단편을 포함하고, 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 진단하는 앰플리콘을 생산하도록 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 DNA와 증폭 반응에서 함께 사용될 때 DNA 프라이머로서 기능한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 서열번호:7 및 서열번호:8로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 DNA 분자는 서열번호:11을 포함하고 제2 DNA 분자는 서열번호:12를 포함한다.
본 발명은 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 DNA의 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 샘플을 DNA 프로브와 접촉시키는 단계; 샘플과 DNA 프로브가 엄격한 혼성화 조건을 받도록 하는 단계; 및 상기 샘플에서 DNA 분자에 대한 DNA 프로브의 혼성화를 검출하는 단계로서, 상기 DNA 분자에 대한 DNA 프로브의 혼성화는 DNA의 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명은 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 DNA의 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 샘플을 DNA 프라이머로서 기능하는 한 쌍의 DNA 분자와 접촉시키는 단계; 서열번호:10, 서열번호:9, 서열번호:8, 서열번호:7, 서열번호:6, 서열번호:5, 서열번호:4, 서열번호:3, 서열번호:2, 및 서열번호:1로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 앰플리콘을 생산하기에 충분한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 DNA 앰플리콘의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 DNA 앰플리콘의 존재는 상기 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명은 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 샘플에 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 샘플을 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나 이상의 단백질에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체와 접촉시키는 단계; 및 샘플에서 상기 항체의 상기 단백질에의 결합을 검출하는 단계로서, 상기 항체의 상기 단백질에의 결합은 상기 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 나타내는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 적어도 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 제2 단백질에 대해 특이적인 제2 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 적어도 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 각각 인코딩된 제2 단백질 및 제3 단백질에 대해 특이적인 제2 항체 및 제3 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 적어도 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 각각 인코딩된 제2 단백질, 제3 단백질, 및 제4 단백질에 대해 특이적인 제2 항체, 제3 항체, 및 제4 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 서열번호:10에 특이적인 DNA 프로브, 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 진단하는 앰플리콘을 생산하는 한 쌍의 DNA 프라이머, 또는 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체를 포함하는 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 및 서열번호:10으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 식물, 종자, 세포, 식물 일부, 또는 상품을 제공한다. 일 구현예에서, 식물, 종자, 세포, 또는 식물 일부는 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성이다. 또 다른 구현예에서, 식물, 종자, 세포, 또는 식물 일부는 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 및 글루포시네이트에 대해 내성이다.
본 발명은 작물-성장 지역에 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 옥수수 심기 및 옥수수를 손상함이 없이 상기 지역에서 잡초를 방제하기 위해, 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제의 유효량을 작물-성장 지역, 또는 이것의 임의의 부분에 적용하는 것을 포함하는 작물-성장 지역에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 성장 시즌에 걸쳐 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개 또는 그 초과 제초제를 적용하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 제초제를 적용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 디캄바의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.1 lb ae/에이커 내지 약 16 lb ae/에이커이다. 일 구현예에서, 디캄바의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.5 lb ae/에이커 내지 약 2 lb ae/에이커이다. 일 구현예에서, 글루포시네이트의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.1 lb ae/에이커 내지 약 16 lb ae/에이커이다. 일 구현예에서, 글루포시네이트의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.4 lb ae/에이커 내지 약 1.59 lb ae/에이커이다. 일 구현예에서, 2,4-D의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.1 lb ae/에이커 내지 약 10 lb ae/에이커이다. 일 구현예에서, 2,4-D의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.75 lb ae/에이커 내지 1.0 lb ae/에이커이다. 일 구현예에서, FOP 제초제의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.01 lb ai/에이커 내지 약 1.0 lb ai/에이커이다. 일 구현예에서, FOP 제초제의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 퀴잘로포프의 약 0.034 lb ai/에이커 내지 약 0.083 lb ai/에이커이다. 일 구현예에서, FOP 제초제의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 할록시포프의 약 0.018 ai/에이커 내지 약 0.07 lb ai/에이커이다.
본 발명은 적어도 하나의 사이클로헥산디온 (DIM) 제초제의 제초적 유효량을 적용하는 것을 포함하는 지역에서 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자생 옥수수를 방제하는 방법을 제공하며, 상기 제초제 적용은 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 옥수수의 성장을 방지한다. 일 구현예에서, 사이클로헥산디온 (DIM) 제초제는 클레소딤, 세톡시딤, 및 트랄콕시딤으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성인 식물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물을 그 자체 또는 제2 식물과 교배하여 종자를 생산하는 단계; 및 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 것은 자손 식물을 생산하도록 자손 종자를 성장시키는 것; 자손 식물을 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 글라이포세이트, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제의 유효량으로 처리하는 것; 및 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성인 자손 식물을 선택하는 것에 의한다. 일 구현예에서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 것은 자손 종자로부터 유래된 샘플에 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 것에 의한다. 일 구현예에서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 것은 자손 종자로부터 유래된 샘플에 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질의 존재를 검출하는 것에 의한다.
본 발명은 서열번호:10을 포함하는 식물을 성장시키는 단계; 식물의 웅성 생식 조직의 발달 이전 또는 그 동안 유효량의 글라이포세이트를 적용함으로써 상기 식물에서 웅성-불임을 유도하는 단계; 상기 식물을 제2 식물로부터의 꽃가루로 수정시키는 단계; 및 상기 식물로부터 잡종 종자를 수확하는 단계를 포함하는 잡종 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 글라이포세이트는 약 0.25 lb ae/에이커 내지 약 11.0 lb ae/에이커의 유효량으로 발달 이전 또는 그 동안 적용된다. 일 구현예에서, 글라이포세이트는 하나 이상의 적용에서 총 약 0.5 lb ae/에이커 내지 약 2.5 lb ae/에이커의 유효량으로 발달 이전 또는 그 동안 적용된다. 일 구현예에서, 유효량의 글라이포세이트는 옥수수 식물 발달의 V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, 및 V14 단계로 구성되는 군으로부터 선택된 발달 단계에서 적용된다. 본 발명은 서열번호:10을 포함하고, 그리고 서열번호:10을 포함하는 식물을 성장시키는 단계; 식물의 웅성 생식 조직의 발달 이전 또는 그 동안 유효량의 글라이포세이트를 적용함으로써 상기 식물에서 웅성-불임을 유도하는 단계; 상기 식물을 제2 식물로부터의 꽃가루로 수정시키는 단계; 및 상기 식물로부터 잡종 종자를 수확하는 단계를 포함하는 잡종 종자를 생산하는 방법을 사용함에 의해 생산된 잡종 종자를 제공한다.
본 발명은 식물로부터 유래된 DNA를 포함하는 샘플을, 옥수수 이벤트 MON87429의 존재에 대해 진단하는 제1 앰플리콘 및 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하지 않는 야생형 옥수수 게놈 DNA에 대해 진단하는 제2 앰플리콘을 생성할 수 있는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘을 검출하는 단계로서, 상기 양 앰플리콘의 존재는 샘플이 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 이종접합성임을 나타내고 유일한 상기 제1 앰플리콘의 존재는 샘플이 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 동종접합성임을 나타내는, 단계를 포함하는 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 식물의 접합형식을 결정하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 프라이머 세트는 서열번호:11 및 서열번호:12를 포함한다.
본 발명은 (a) 4개의 발현 카세트를 포함하는 DNA 작제물을 수득하는 단계로서, 제1 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) 에리안서스 라벤나에로부터 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론, (II) 포스피노트리신 N-아세틸전달효소 코딩 서열, 및 (III) 세타리아 이탈리카로부터 푸룩토스-비스포스페이트 알돌라아제 3' UTR을 포함하고; 제2 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) 코익스 라크리마 - 요비로부터 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론, (II) 아라비돕시스 탈리아나로부터 알비노 및 옅은 녹색 6 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열, (III) 디캄바 모노옥시게나제 코딩 서열, 및 (IV) 오리자 사티바로부터 메탈로티오네인-유사 단백질 3' UTR을 포함하고; 제3 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) 아룬도 도낙스로부터 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론, (II) 아라비돕시스 탈리아나로부터 말레이트 탈수소효소 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열, (III) FT_T 단백질 코딩 서열, 및 (IV) 오리자 사티바로부터 무 정단 분열조직 단백질 3' UTR을 포함하고; 그리고 제4 발현 카세트는 작동가능한 연결로 (I) CaMV 35S 프로모터 및 리더, (II) 트리티쿰 아에스티범으로부터 클로로필 a/b-결합 단백질 리더, (III) 오리자 사티바로부터 액틴 1 인트론, (IV) 아라비돕시스 탈리아나로부터 ShkG 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열, (V) 아그로박테리움 sp 균주 CP4로부터 글라이포세이트 내성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 코딩 서열, (VI) 지아 메이스로부터 웅성 조직 특이적 siRNA 표적, 및 (VII) 오리자 사티바로부터 글리신-풍부 RNA 결합 단백질 3'UTR을 포함하는, 단계; (b) 상기 DNA 작제물을 옥수수 세포의 게놈에 삽입하는 단계; (c) 상기 옥수수 세포를 옥수수 식물로 재생시키는 단계; 및 (d) 상기 DNA 작제물을 포함하는 옥수수 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 옥수수 식물에서 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 개선하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 선택은 옥수수 식물을 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 또는 글라이포세이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제의 유효량으로 처리하는 것에 의한다. 일 구현예에서, 본 발명은 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성이고 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포를 제공하며, 상기 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포는 상기 DNA 작제물을 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포는 서열번호:10을 포함한다.
도 1은 옥수수 이벤트 MON87429의 서열을 나타낸다. 수평 라인은 서열번호:10에 관하여 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 및 서열번호:9의 위치에 해당하고; SQ51062 (서열번호:11) 및 SQ51053 (서열번호:12)으로 표지된 수평 화살표는 옥수수 이벤트 MON87429를 검출하기 위해 사용될 수 있는 한 쌍의 프라이머의 근사 위치를 나타내고; 그리고 PB50370 (서열번호:13)으로 표지된 수평 라인은 옥수수 이벤트 MON87429를 검출하기 위해 사용될 수 있는 DNA 프로브의 근사 위치를 나타낸다.
도 2는 표 1에 기재된 바와 같이 표지된 그것의 각각의 유전 인자를 갖는 서열번호:9에 관한 옥수수 이벤트 MON87429의 4개의 발현 카세트를 나타낸다.
도 3은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 MON87429 이벤트의 창출, 시험, 특성규명, 및 선택을 나타낸다. 모든 시간은 근사치이다.
서열의 간단한 설명
서열번호:1은 옥수수 게놈 DNA의 5' 접합 및 이식유전자 삽입물을 나타내는 30개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호:1은 서열번호:10의 뉴클레오타이드 위치 1015 내지 1044에 해당한다.
서열번호:2는 옥수수 게놈 DNA의 3' 접합 및 이식유전자 삽입물을 나타내는 30개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호:2는 서열번호:10의 뉴클레오타이드 위치 15023 내지 15052에 해당한다.
서열번호:3은 옥수수 게놈 DNA의 5' 접합 및 이식유전자 삽입물을 나타내는 60개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호:3은 서열번호:10의 뉴클레오타이드 위치 1000 내지 1059에 해당한다.
서열번호:4는 옥수수 게놈 DNA의 3' 접합 및 이식유전자 삽입물을 나타내는 60개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호:4는 서열번호:10의 뉴클레오타이드 위치 15008 내지 15067에 해당한다.
서열번호:5는 옥수수 게놈 DNA의 5' 접합 및 이식유전자 삽입물을 나타내는 100개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호:5는 서열번호:10의 뉴클레오타이드 위치 980 내지 1079에 해당한다.
서열번호:6은 옥수수 게놈 DNA의 3' 접합 및 이식유전자 삽입물을 나타내는 100개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호:6은 서열번호:10의 뉴클레오타이드 위치 14988 내지 15087에 해당한다.
서열번호:7은 5' 측접하는 옥수수 게놈 DNA의 1029개 뉴클레오타이드 및 이식유전자 삽입물의 5' 말단의 321개 뉴클레오타이드를 나타내는 1350개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다.
서열번호:8은 이식유전자 삽입물의 3' 말단의 38개 뉴클레오타이드 및 3' 측접하는 옥수수 게놈 DNA의 1031개 뉴클레오타이드를 나타내는 1069개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다.
서열번호:9는 옥수수 MON87429 이벤트의 이식유전자 삽입물에 해당하는 14008개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다.
서열번호:10은 옥수수 MON87429 이벤트에 해당하는 16068개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다; 상기 서열은 위치 1부터 1029까지 5' 측접하는 게놈 DNA 서열, 위치 1030부터 15037까지 형질전환 DNA 삽입물, 및 위치 15038부터 16068까지 3' 측접하는 게놈 DNA 서열을 함유한다.
서열번호:11은 SQ51062로 지칭되고 샘플에서 옥수수 MON87429 이벤트 DNA를 동정하기 위해 사용된 프라이머에 해당하는 29개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다; 이것은 서열번호:10의 위치 15038 내지 15066에 해당한다.
서열번호:12는 SQ51053으로 지칭되고 샘플에서 옥수수 MON87429 이벤트 DNA를 동정하기 위해 사용된 프라이머에 해당하는 17개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다; 이것은 서열번호:10의 위치 14987 내지 15003에 해당한다.
서열번호:13은 PB50370으로 지칭되고 샘플에서 옥수수 MON87429 이벤트 DNA를 동정하기 위해 사용된 프로브에 해당하는 16개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다; 이것은 서열번호:10의 위치 15009 내지 15024에 해당한다.
하기 정의 및 방법은 본 발명을 보다 잘 정의하고 본 발명의 실시에 있어 당해 분야의 숙련가를 안내하기 위해 제공된다. 달리 지적되지 않는 한, 용어들은 관련된 기술 분야의 통상적인 기술자에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.
식물 형질전환 기술은 무작위로 외래 DNA (형질전환 DNA로도 알려져 있음)를 세포 게놈 염색체 안으로 삽입하여 유전자적으로 조작된 세포, 또한 일명 "형질전환" 또는 "재조합" 세포를 생산하기 위해 사용된다. 이 기술을 사용하여, 많은 개별 세포가 형질전환되어, 각각은 게놈 안으로 외래 DNA의 랜덤 삽입에 기인한 고유의 형질전환 이벤트를 초래한다. 형질전환 식물은 그 다음 각각의 개별 형질전환 세포로부터 재생된다. 이것은 형질전환 식물의 모든 세포가 그것의 게놈의 안정한 일부로 독특하게 삽입된 형질전환 이벤트를 함유하게 한다. 이 형질전환 식물은 그 다음 각각이 고유의 형질전환 이벤트를 함유하는 자손 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 옥수수 이벤트 MON87429는 (i) 4개의 발현 카세트 (각각의 발현 카세트는 개별 시험과 이어서 다른 3개의 발현 카세트와 조합한 시험 후 선택되었음)를 포함하는 DNA 작제물로 수 천의 옥수수 세포의 형질전환, (ii) 고유의 형질전환 이벤트를 각각 함유하는 형질전환 식물의 모집단의 재생, 및 (iii) 수 만의 식물을 통하여 분자 특성, 제초제 내성 효능, 및 수 천의 이벤트에 대한 다양한 유전적 배경에서 작물학적 특성의 시험 및 분석을 포함한 엄격한 다년간의 이벤트 선택에 의해 생산되었다. 옥수수 이벤트 MON87429는 따라서 넓은-규모로 작물학적 상업적 목적에 유용한 독특하게 우월한 이벤트로 생산되고 선택되었다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "형질전환 이벤트" 또는 "이벤트"는 당해 분야에서 알려진 식물 형질전환 방법을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA 안으로 형질전환 DNA 분자를 삽입하는 행동에 의해 창작된 DNA 분자이다. 이 삽입은 삽입된 외래 DNA ("형질전환 삽입물"로 칭함) 및 삽입 위치의 어느 한 면 상에서 형질전환 삽입물에 바로 인접하거나, 또는 "측접하는" 게놈 DNA ("측접 DNA"로 칭함)로 구성되는 신규한, 형질전환 게놈 DNA 서열을 만든다. 이벤트의 DNA 서열은 이벤트에 대해 독특하고 특이적이며 그리고 다른 이벤트 또는 형질전환되지 않은 옥수수 게놈 DNA의 것과 같은, 다른 DNA 서열에 비교할 때 쉽게 확인될 수 있다. 옥수수 이벤트 MON87429는 서열번호:9로 제공된 형질전환 삽입물 서열 및 각각 서열번호:7 및 서열번호:8에 제공된 5' 및 3' 측접 DNA 서열을 함유하는, 서열번호:10으로 제공되는 신규하고 고유의 DNA 서열을 갖는다. 옥수수 이벤트 MON87429는 따라서 형질전환 옥수수 세포 및 이벤트를 포함하는 식물의 염색체의 일체부인 DNA 분자이고 이와 같이 정적이고 자손 세포 및 식물로 계대될 수 있다.
본 발명은 또한 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 최초 형질전환된 세포 및 식물의 자손을 제공한다. 그와 같은 자손은 세포 조직 배양에 의해, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 옥수수 식물의 자가수정에 의해, 또는 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 옥수수 식물과 이벤트를 함유하거나 하지 않는 또 다른 식물 사이에 성적 교배에 의해 생산될 수 있다. 그와 같은 다른 식물은 동일 또는 상이한 이벤트(들)를 포함하는 형질전환 식물 또는 비형질전환 식물, 예컨대 상이한 종류로부터의 것일 수 있다. 옥수수 이벤트 MON87429는 최초 모체로부터 각각의 세대를 통하여 자손으로 계대된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "옥수수"는 지아 메이스 (또한 일명 콘(corn))를 의미하고 지아 메이스와 교배될 수 있는 모든 식물 품종을 포함한다.
본 발명은 퀴잘로포프 및 할록시포프와 같은 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제; 합성 옥신 예컨대 디캄바 및 2,4-D; 글루타민 합성효소의 억제제 예컨대 글루포시네이트; 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS) 억제제 글라이포세이트에 대해 내성인 이벤트를 포함하는 옥수수 세포, 식물, 및 종자를 제공하는, 옥수수 이벤트 MON87429를 제공한다. 옥수수 이벤트 MON87429는 4개의 발현 카세트를 함유한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "발현 카세트" 또는 "카셋트"는 형질전환된 세포에 의해 발현되는 뚜렷한 요소의 조합을 포함하는 재조합 DNA 분자이다. 표 1은 서열번호:10에 함유되고 도 2에서 예시된 바와 같은 요소의 목록을 제공한다.
Figure 112020076409844-pct00001
Figure 112020076409844-pct00002
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 자연에서 정상적으로 발견될 수 없고 인간 개입에 의해 창작된 비-천연 DNA, 단백질, 또는 유기체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재조합 DNA 분자"는 자연적으로 함께 일어날 수 없고 인간 개입의 결과인 DNA 분자, 예를 들어, 이식유전자 및 이식유전자에 인접한 식물 게놈 DNA를 포함하는 DNA 분자와 같이, 서로에 대해서 이종성인 적어도 2개의 DNA 분자의 조합으로 구성되는 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자이다. 재조합 DNA 분자의 예는 서열번호:1-10으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재조합 식물"은 자연에서 정상적으로 존재할 수 없고, 인간 개입의 결과이고, 형질전환 DNA 분자를 함유하는 식물이다. 이러한 게놈 변경의 결과로, 재조합 식물은 신규하고 관련된 야생형 식물과 뚜렷하게 상이한 것이다. 재조합 식물의 예는 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 옥수수 식물이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이식유전자"는 식물 형질전환 방법에 의한 것과 같이 인간 개입의 결과로 유기체의 게놈 안으로 인공적으로 편입된 DNA 분자를 지칭한다. 이식유전자는 유기체에 이종성일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "형질전환 삽입물"은 옥수수 이벤트 MON87429를 생산하기 위해 옥수수 게놈 안으로 식물 형질전환 기술에 의해 삽입된 외래 DNA를 지칭한다. 옥수수 이벤트 MON87429의 형질전환 삽입물에 대한 서열은 서열번호:9로 제공된다. 용어 "형질전환"은 이식유전자를 포함하는 것을 지칭하고, 예를 들어 "형질전환 식물"은 이식유전자를 포함하는 식물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종성"은 자연에서 유기체 또는 제2 분자와 정상적으로 연관되지 않은 제1 분자를 지칭한다. 예를 들어, DNA 분자는 제1 종으로부터의 것일 수 있고 제2 종의 게놈에 삽입될 수 있다. 상기 DNA 분자는 따라서 게놈 및 유기체에 이종성일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라"는 제1 또는 제2 DNA 분자 어느 것도 다른 것에 융합된 그 구성에서 정상적으로 발견될 수 없는, 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합함에 의해 생산된 단일 DNA 분자를 지칭한다. 키메라 DNA 분자는 따라서 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 신규한 DNA 분자이다. 키메라 DNA 분자의 예는 서열번호:1-10으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함하는 DNA 분자이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리"는 그것의 자연 또는 천연 상태에서 그것과 정상적으로 연관된 다른 분자로부터 분자를 분리하는 것을 지칭한다. 용어 "단리"는 따라서 그것의 자연 또는 천연 상태에서 그것과 연관된 다른 DNA 분자(들)로부터 분리된 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 그와 같은 DNA 분자는 재조합된 상태, 예컨대 재조합 DNA 분자로 존재할 수 있다. 따라서, 그것의 천연 상태로부터 제거되고 그것이 정상적으로 연관되지 않은 또 다른 DNA 분자에 융합된 DNA 분자는 단리된 DNA 분자일 것이다. 그와 같은 단리된 DNA 분자는 재조합 DNA를 만들거나 세포, 식물, 또는 종자의 염색체 안으로 외래 DNA 분자를 융합하는 것과 같은 생명공학 기술로부터의 유래할 수 있다.
본 발명은 DNA 분자 및 그것의 해당하는 DNA 서열을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "DNA" 및 "DNA 분자"는 데옥시리보핵산 (DNA) 분자를 지칭한다. DNA 분자는 게놈 또는 합성 기원의 것일 수 있고 관례상 5' (업스트림) 말단으로부터 3' (다운스트림) 말단으로 된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 사용된 명명법은 미국 연방 규정 코드 §1.822의 표제 37에 의해 요구되며 WIPO 표준 ST.25 (1998), 부록 2, 표 1 및 3에서의 표에 제시되어 있는 것이다. 협약에 의해, 본 발명의 DNA 서열 및 이의 단편은 2개의 상보성 DNA 서열 가닥 중 단지 하나의 가닥과 관련하여 개시된다. 연루 및 의도에 의해, 당업계에서 역 상보성 서열로 또한 지칭되는, 여기에 제공된 서열의 상보성 서열 (상보성 가닥의 서열)은 본 발명의 범위 내에 있고 청구된 요지의 범위 내로 되도록 명백하게 의도된다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 서열번호:1-10 및 이의 단편에 대한 언급은 상보성 가닥의 서열 및 이의 단편을 포함하고 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단편"은 전체 중 더 작은 조각을 지칭한다. 예를 들어, 서열번호:10의 단편은 서열번호:10의 완전한 서열 중 적어도 약 10개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 11개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 12개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 13개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 14개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 16개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 17개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 19개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 30개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 35개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 40개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 45개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 50개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 60개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 70개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 80개 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 약 90개 연속적인 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 100개 연속적인 뉴클레오타이드인 서열을 포함할 수 있다.
옥수수 이벤트 MON87429의 형질전환 삽입물에 대한 DNA 서열은 서열번호:9로 제공된다. 형질전환 삽입물 및 형질전환 삽입물의 각 측면에 측접하는 옥수수 게놈 DNA의 DNA 서열은 서열번호:10으로 제공된다. 형질전환 삽입물의 측접 DNA의 부분 및 5' 말단의 DNA 서열은 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:5, 및 서열번호:7로 제공된다. 형질전환 삽입물의 측접 DNA의 부분 및 3' 말단의 DNA 서열은 서열번호:2, 서열번호:4, 서열번호:6, 및 서열번호:8로 제공된다.
측접하는 옥수수 게놈 DNA에 형질전환 삽입물의 일 말단의 포스포디에스테르 결합 연결에 의한 연결에 걸치는 영역의 DNA 서열은 본 명세서에서 "접합"으로 언급된다. 접합은 형질전환 삽입물과 하나의 인접 분자로 측접하는 DNA의 연결 점이다. 일 접합은 형질전환 삽입물의 5' 말단에서 발견되고 다른 것은 형질전환 삽입물의 3' 말단에서 발견되어, 본 명세서에서 각각 5' 및 3' 접합으로 언급된다. "접합 서열"은 이벤트의 5' 또는 3' 접합에 걸치는 임의의 길이의 DNA 서열을 지칭한다. 옥수수 이벤트 MON87429의 접합 서열은 서열번호:10을 사용하여 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 옥수수 이벤트 MON87429의 접합 서열의 예는 서열번호:1-8로 제공된다. 도 1은 5'으로부터 3'으로 배열된 서열번호:1-10의 물리적 배열을 예시한다. 옥수수 이벤트 MON87429의 접합 서열은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물, 종자, 또는 세포의 게놈의 일부로 존재할 수 있다. 식물, 식물 일부분, 종자, 또는 세포로부터의 샘플에서 서열번호:1-8 또는 10 중 임의의 하나 이상의 확인은 DNA가 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 옥수수로부터 수득되었음을 나타내고 옥수수 이벤트 MON87429의 존재에 대한 진단이다.
본 발명의 식물, 종자, 세포, 식물 일부분, 및 상품은 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 나타내는 DNA 또는 단백질 분자의 검출을 위해 사용될 수 있다. 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있는 예시적인 DNA 분자가 제공된다. 그와 같은 프라이머 또는 프로브는 표적 핵산 서열에 대해 특이적이고 이와 같이 여기에 기재된 방법에 의한 옥수수 이벤트 MON87429의 확인에 유용하다. 옥수수 이벤트 MON87429의 존재의 검출은 당해 분야에서 알려진 방법, 예컨대 핵산의 열 증폭 또는 핵산 혼성화 기술 (예컨대 노던 블랏팅 및 서던 분석)을 사용함에 의해 수행될 수 있다.
"프라이머"는 증폭 반응을 포함하는 어닐링 또는 혼성화 방법에 사용하기 위해 설계된 DNA 분자이다. 증폭 반응은 앰플리콘을 생산하기 위해 템플레이트 DNA를 증폭시키는 시험관내 반응이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "앰플리콘"은 증폭 기술을 사용하여 합성된 DNA 분자이다. 본 발명의 앰플리콘은 서열번호:1-10 중 하나 이상, 또는 이의 단편을 포함하는 DNA 서열을 갖는다. 한 쌍의 프라이머가 증폭 반응, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 옥수수 게놈 DNA의 샘플과 같이 템플레이트 DNA로 사용되어 앰플리콘을 생산할 수 있으며, 상기 생산된 앰플리콘은 프라이머가 템플레이트에 혼성화된 2개의 부위 사이에 위치한 템플레이트 DNA의 서열에 해당하는 DNA 서열을 가질 수 있다. 프라이머는 전형적으로 프라이머와 표적 DNA 가닥 사이에 잡종을 형성하기 위해 상보성 표적 DNA 가닥에 혼성화하도록 설계된다. 프라이머의 존재는 템플레이트 표적 DNA 가닥을 사용하여 프라이머의 연장을 시작하도록 중합효소에 의한 인식의 지점이다. 프라이머 쌍은 이들 사이에서 뉴클레오타이드 분절을 증폭시킬 목적으로 이중가닥 뉴클레오타이드 분절의 반대편 가닥을 결합하는 2개의 프라이머의 사용을 지칭한다. 프라이머 서열의 예는 서열번호:11 (SQ51062) 및 서열번호:12 (SQ51053)로 제공된다. 서열번호:11 및 서열번호:12로 제공된 프라이머 쌍은 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자로 유용하며, 상기 제1 DNA 분자는 서열번호:10의 형질전환 삽입물 DNA 서열의 단편이고 상기 제2 DNA 분자는 서열번호:10의 측접 DNA 서열의 단편이고, 그리고 각각은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 DNA로 증폭 반응에서 함께 사용될 때 DNA 프라이머로서 기능하기에 충분한 길이의 것으로 샘플에서의 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 진단하는 앰플리콘을 생산한다. 본 발명의 프라이머 쌍은 특정 구현예에서 또한 제1 및 제2 DNA 분자를 포함하는 것으로 정의될 수 있으며, 상기 제1 DNA 분자는 서열번호:10의 옥수수 게놈 부분의 단편이고 제2 DNA 분자는 서열번호:10의 이식유전자 부분의 단편이고, 그리고 각각은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 DNA로 증폭 반응에서 함께 사용될 때 DNA 프라이머로서 기능하기에 충분한 길이의 것으로 샘플에서의 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 진단하는 앰플리콘을 생산한다.
"프로브"는 표적 핵산의 가닥에 대해 상보성이고 혼성화 검출 방법에 유용한 핵산 분자이다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 폴리아미드 및 다른 프로브 물질을 포함하며, 그리고 이러한 결합의 검출은 표적 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출하는데 유용할 수 있다. 프로브는 통상적인 검출가능한 표지 또는 리포터 분자, 예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광 제제, 또는 효소에 부착될 수 있다. 옥수수 이벤트 MON87429를 검출하기 위한 프로브로서 유용한 예시적인 DNA 서열은 서열번호:13 (PB50370)으로 제공된다.
프라이머 및 프로브를 디자인하고 사용하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 서열번호:1-10의 전장 또는 단편을 포함하는 DNA 분자는 옥수수 이벤트 MON87429를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브로서 유용하고 본원에 제공된 서열을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 설계될 수 있다.
본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 완전한 서열 동일성을 가질 수 있지만, 표적 서열에 대해 우선적으로 혼성화하는 능력을 보유하는 표적 서열과 상이한 프라이머 및 프로브가 통상적인 방법에 의해 설계될 수 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 기능하기 위해서는, 단지 이용된 특정한 용매 및 염 농도 하에서 안정한 이중-가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열 상 충분히 상보성일 필요가 있다. 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429로부터 형질전환 DNA의 존재를 확인하기 위해 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 사용될 수 있다. 프로브 및 프라이머는 길이에서 일반적으로 적어도 약 11개 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드, 적어도 약 24개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 30개 뉴클레오타이드 또는 그 초과이다. 그와 같은 프로브 및 프라이머는 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 DNA 서열에 구체적으로 혼성화한다. 통상적인 엄격 조건은 MR Green and J Sambrook, Molecular cloning: a laboratory manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)에 기재되어 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 분자는 상기 2개의 분자가 항-평행한, 이중-가닥 핵산 구조를 형성할 수 있는 경우 서로에 대해 구체적으로 혼성화할 수 있다. 핵산 분자는 이들이 완전한 상보성을 나타내는 경우 또 다른 핵산 분자의 "보체"이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 2개의 분자는 제1 분자의 모든 뉴클레오타이드가 정렬될 때 제2 분자의 모든 뉴클레오타이드에 상보성인 경우 "완전한 상보성"을 나타낸다. 2개의 분자는 이들이 적어도 통상적인 "낮은-엄격성" 조건 하에서 서로에 대해 어닐링되어 유지되도록 하기에 충분한 안정성으로 서로에 대해 혼성화할 수 있는 경우 "최소로 상보성"이다. 유사하게, 분자는 이들이 통상적인 "높은-엄격성" 조건 하에서 서로에 대해 어닐링되어 유지되도록 하기에 충분한 안정성으로 서로에 대해 혼성화할 수 있는 경우 "상보성"이다. 따라서 이탈이 분자가 이중-가닥 구조를 형성하는 능력을 완전히 금지하지 않는 한, 완전한 상보성으로부터의 이탈은 허용된다.
DNA 혼성화를 증진시키는 적절한 엄격 조건, 예를 들어, 약 45℃에서 6.0 x 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC)과, 이어서 50℃에서 2.0 x SSC의 세정은 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있거나 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 세정 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성으로부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격성까지 선택될 수 있다. 또한, 세정 단계에서 온도는 약 22℃인 실온에서 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65℃에서 높은 엄격성 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염 둘 모두는 변할 수 있거나, 온도 또는 염 농도 중 어느 하나는 일정하게 유지될 수 있는 한편 다른 변수는 변화된다.
샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하기 위한 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 단백질이 제공된다. 그와 같은 항체는 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩되는 하나 이상의 단백질에 대해 특이적이다. 이러한 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은 서열번호:10에 제공되고 코딩 서열의 시작 위치 및 중단 위치는 표 1에 나타나 있다. 각각의 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 및 본 서열에 의해 인코딩된 단백질은 여기에 기재된 방법에 의해 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하기 위한 항체를 생산하는데 유용하다. 옥수수 이벤트 MON87429의 존재의 검출은 당업계에서 알려진 임의의 단백질 검출 기술, 예컨대 웨스턴 블랏팅, 면역-침전, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 검출가능한 표지 또는 리포터 분자 (예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광 제제, 또는 효소)에 항체 부착, 또는 리포터 분자 상에 효소적 작용을 사용함에 의해 수행될 수 있다. 샘플을 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 DMO, PAT, FT_T 또는 CP4-EPSPS 단백질에 결합하는 항체와 접촉시키고 그 다음 항체 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 하나의 방법을 제공한다. 이러한 항체의 결합은 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 하나 이상의 단백질의 존재에 대해 진단적이다.
옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하기 위한 단백질 및 핵산 검출 키트가 제공된다. 이러한 키트에 대한 변형이 또한 본 명세서에 개시된 조성물과 방법 그리고 단백질 및 핵산 검출의 기술에서 잘 알려진 방법을 사용하여 개발될 수 있다. 단백질 및 핵산 검출 키트는 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물과 교배하기 위한 방법에 적용될 수 있다. 그와 같은 키트는 서열번호:1-10의 단편을 포함하는 프라이머나 프로브 또는 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 단백질에 대해 특이적인 항체를 함유한다.
검출 키트의 일 예는 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재 또는 부재를 검출하는데 유용한 DNA 프로브로서 기능하는 서열번호:10의 인접 뉴클레오타이드의 충분한 길이의 적어도 하나의 DNA 분자를 포함한다. 프로브로 사용하기에 충분한 예시적인 DNA 분자는 서열번호:13으로 제공된 서열을 포함하는 것이다. 다른 프로브가 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 설계될 수 있다. 검출 키트의 또 다른 예는 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재 또는 부재를 검출하는데 유용한 앰플리콘을 생산하는데 유용한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 그와 같은 방법은 또한 앰플리콘 또는 이의 단편을 서열분석하는 것을 포함할 수 있다. 프라이머 쌍으로 사용하기에 충분한 예시적인 DNA 분자는 각각 서열번호:11 및 서열번호:12로 제공된 서열을 포함하는 것이다. 다른 프라이머 쌍이 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 설계될 수 있다. 본 발명의 키트는 선택적으로 본 명세서에 기재된 검출 또는 진단 반응을 수행하기 위한 시약을 또한 포함할 수 있다. 검출 키트의 또 다른 예는 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 스트립의 선단이 수용액과 접촉될 때 활성화되는 시약을 포함한 측면 유동 스트립을 이용할 수 있다. 항체 생산에 사용하기에 충분한 예시적인 단백질은 서열번호:10으로 제공된 서열, 또는 임의의 이의 단편에 의해 인코딩된 것들이다.
본 발명은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 옥수수 식물, 자손, 종자, 세포, 및 식물 일부분, 및 이들을 사용하여 생산된 상품을 제공한다. 본 발명의 식물, 자손, 종자, 세포, 식물 일부분, 및 상품은 서열번호:1-8 및 서열번호:10으로 제공된 서열 중 적어도 하나를 갖는 DNA의 검출가능한 양을 함유한다.
본 발명의 식물, 자손, 종자, 세포, 및 식물 일부는 또한 하나 이상의 추가의 형질전환 특성, 특히 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 옥수수 식물을 추가의 형질전환 특성(들)을 함유하는 또 다른 식물과 교배시킴에 의해 도입된 것들을 함유할 수 있다. 그와 같은 특성은 비제한적으로 증가된 곤충 저항, 증가된 물 이용 효율, 증가된 수율 성능, 증가된 가뭄 저항, 증가된 종자 품질, 개선된 식물의 품질, 잡종 종자 생산, 및/또는 증가된 제초제 내성을 포함하며, 상기 특성은 그와 같은 형질전환 특성을 결하는 옥수수 식물에 대비하여 측정된다.
본 발명의 식물은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 자손을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "자손"은 서열번호:1-8 및 SE ID 번호:10으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 식물에 의해 나타난, 선조 식물로부터 유전된 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 임의의 식물, 종자, 및 세포를 포함한다. 식물, 종자, 및 세포는 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 동종접합성 또는 이종접합성일 수 있다. 자손 식물은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 옥수수 식물에 의해 생산된 종자 또는 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 꽃가루로 수정된 옥수수 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 "식물 일부분"은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물로부터의 임의의 일부분이다. 식물 일부분은 비제한적으로 조직 샘플, 꽃가루, 밑씨, 포드, 꽃, 뿌리, 줄기, 섬유, 및 잎을 전체로 또는 일부로 포함한다. 식물 일부분은 생존가능하거나 또는 생존가능하지 않을 수 있다.
본 발명은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물로부터 생산된 상품을 제공한다. 본 발명의 상품은 서열번호:1-10으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 검출가능한 양의 DNA를 함유한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "상품"은 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물, 종자, 세포, 또는 식물 일부로부터의 물질로 구성되는 조성물 또는 생성물을 지칭한다. 상품은 비제한적으로 가공된 종자, 곡물, 식물 일부분, 및 식품을 포함한다. 본 발명의 상품은 옥수수 이벤트 MON87429에 해당하는 검출가능한 양의 DNA를 함유할 것이다. 샘플에서 이 DNA 중 하나 이상의 검출은 상품의 내용물 또는 원천을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 검출의 방법을 포함하여 DNA 분자에 대한 검출의 표준 방법이 사용될 수 있다.
옥수수 이벤트 MON87429는 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제; 합성 옥신; 글루타민 합성효소의 억제제; 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS)의 억제제에 대한 내성을 함께 제공하는 4개의 발현 카세트를 함유한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제 ("FOP 제초제(들)"로 칭함)는, 비제한적으로, 클로디나포프, 클로디나포프-에틸, 클로디나포프-프로파르길, 사이할로포프, 사이할로포프-부틸, 디클로포프, 디클로포프-메틸, 디클로포프-P, 디클로포프-P-메틸, 페녹사프로프, 페녹사프로프-P, 페녹사프로프-P-에틸, 펜티아프로프, 플루아지포프, 플루아지포프-부틸, 플루아지포프-P, 플루아지포프-P-부틸, 플루록시피르, 할록시포프, 할록시포프.에토틸, 할록시포프-메틸, 할록시포프-P, 할록시포프-P-메틸, 이속사파이리포프, 메타미포프, 프로파퀴자포프, 퀴잘로포프, 퀴잘라포프-에틸, 퀴잘로포프-P, 퀴잘라포프-P-에틸, 퀴잘라포프-P-테퓨릴, 및 트리포프를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 합성 옥신은, 비제한적으로, 벤조산 제초제, 페녹시 산 제초제, 아릴피콜리네이트 제초제, 및 피리디닐옥시 산 제초제를 포함한다. 벤조산 제초제의 예는, 비제한적으로, 디캄바 (3,6-디클로로-2-메톡시벤조산), 디캄바 염, 디캄바-부토틸 디캄바-디글라이콜아민 염, 디캄바-디메틸암모늄, 디캄바-디에탄올암모늄, 디캄바-이소프로필암모늄, 디캄바-칼륨, 디캄바-나트륨, 및 디캄바-트롤아민을 포함한다. 페녹시 산 제초제의 예는 2,4-D (2,4-디클로로페녹시아세트산), 2,4-D-부토틸 2,4-D-부틸, 2,4-D-콜린, 2,4-D-디메틸암모늄, 2,4-D-디올라민, 2,4-D-에틸, 2,4-D-2-에틸헥실, 2,4-D-이소부틸, 2,4-D-이속틸, 2,4-D-이소프로필, 2,4-D- 이소프로필암모늄, 2,4-D-칼륨, 2,4-D-나트륨, 2,4-D-트리이소프로판올암모늄, 2,4-D-트롤아민, 클로메프로프, 디클로르프로프, 페노프로프, MCPA, MCPA-부토틸 MCPA-디메틸암모늄, MCPA-2-에틸헥실. MCPA-이소프로필암모늄, MCPA-칼륨, MCPA-나트륨, MCPA-티오에틸, 2,4-DB, MCPB, MCPB-메틸, MCPB-에틸-나트륨, 및 메코프로프이다. 아릴피콜리네이트 제초제의 예는 할라욱시펜, 할라욱시펜-메틸, 및 플로르피라욱시펜-벤질이다. 피리디닐옥시 산 제초제의 예는 트리클로피르, 플루록시피르, 아미노파이랄리드, 클로피랄리드, 및 피클로람이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 글루타민 합성효소의 억제제는, 비제한적으로, 포스피노트리신, 글루포시네이트, 글루포시네이트 염, 글루포시네이트-암모늄, 글루포시네이트-나트륨, 글루포시네이트-P, L-글루포시네이트-암모늄, 및 L-글루포시네이트-나트륨을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS)의 억제제는, 비제한적으로, 글라이포세이트, 글라이포세이트 염, 글라이포세이트-이소프로필암모늄, 글라이포세이트-암모늄, 글라이포세이트-디메틸암모늄, 글라이포세이트-트리메슘 (=설포세이트), 글라이포세이트-디암모늄, 글라이포세이트-칼륨, 및 글라이포세이트-나트륨을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "제초제 내성인" 또는 "제초제 내성" 또는 "내성"은 하나 이상의 제초제(들)의 존재 또는 적용에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 영향을 받지 않는, 예를 들어 적용될 때 제초제의 독성 효과에 대해 저항하는 능력을 의미한다. 세포, 종자, 또는 식물은 이것이 하나 이상의 제초제(들)의 존재에서 적어도 일부 정상적인 성장 또는 표현형을 유지할 수 있는 경우 "제초제 내성"이거나 또는 "개선된 내성"을 갖는다. 특성의 존재가 제초제에 대한 야생형 또는 대조군 세포, 식물 또는 종자에 비해 세포, 식물 또는 종자에 대한 개선된 내성을 부여할 수 있는 경우 그 특성은 제초제 내성 특성이다. 제초제 내성 특성을 포함하는 작물은 제초제의 존재에서 계속 성장할 수 있으며 제초제의 존재에 의해 최소로 영향을 받을 수 있다. 단백질의 발현이 제초제에 대하여 야생형 또는 대조군 세포, 식물 또는 종자에 비해 세포, 식물 또는 종자에서 개선된 내성을 부여할 수 있는 경우, 그 단백질은 "제초제 내성"을 부여한다. 제초제 내성 단백질의 예는 아그로박테리움 sp 균주 CP4로부터의 포스피노트리신 N-아세틸전달효소, 디캄바 모노옥시게나제 코딩 서열, FT_T 단백질, 및 글라이포세이트 내성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 코딩 서열이다. 제초제 내성은 특정 제초제에 대해 완전한 또는 부분적인 무감각일 수 있고 특정 제초제에 대한 퍼센트(%) 내성 또는 무감각으로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "잡초"는 임의의 바람직하지 않은 식물이다. 식물은 농업 또는 원예 목적 (예를 들어, 아마란써스 ( Amaranthus ) 종)에 대해 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주될 수 있거나 또는 특정 상황에서 바람직하지 않은 것으로 간주될 수 있다 (예를 들어, 상이한 종의 분야에서 한 종의 작물 식물, 지원자 식물로도 알려져 있음). 잡초는 통상적으로 당업계에서 알려져 있고 지리, 계절, 성장하는 환경 및 시간에 따라 변한다. 잡초 종의 목록은 농업 및 과학 사회와 노력 (예컨대 미국 잡초 과학 협회, 캐나다 잡초 과학 협회, 브라질 잡초 과학 협회, 국제 잡초 과학 협회 및 제초제 저항성 잡초 국제 조사), 정부 기관 (예컨대 미국 농무부 및 호주 환경 에너지부) 및 산업 및 농민 협회 (예컨대 국제 옥수수 재배자 회합)로부터 이용가능하다.
본 발명은 (i) 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제 예컨대 퀴잘로포프 및 할록시포프; (ii) 합성 옥신 예컨대 디캄바 및 2,4-D; (iii) 글루타민 합성효소 예컨대 글루포시네이트의 억제제; 및 (iv) 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS) 억제제 글라이포세이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제를 적용함에 의해 옥수수 재배를 위한 지역에서 잡초를 방제하는 방법을 제공하며, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 종자 또는 식물은 잡초 성장을 방지 또는 억제하고 옥수수 식물을 손상하지 않는 제초제를 적용하기 전, 적용할 때 또는 후 및 제초제 적용 지역에 심어진다. 식물 성장 지역은 제초제 적용 시에 잡초 식물을 포함할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 제초제(들)는 성장 시즌 동안 단독으로 또는 하나 이상의 제초제(들)과 조합하여 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 제초제(들)는 일시적으로 (예를 들어, 탱크 혼합물로서 또는 순차적인 적용으로), 공간적으로 (예를 들어, 옥수수 종자 심기 전후를 포함하여 성장 시즌 동안 상이한 시간에) 또는 둘 모두로 하나 이상의 제초제(들)과 조합하여 적용될 수 있다. 예를 들어, 지역에 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 종자 심기 및 디캄바, 글루포시네이트, 글라이포세이트, 2,4-D, 또는 FOP 제초제 중 하나 이상을 단독으로 또는 또 다른 제초제와 임의의 조합으로 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물을 손상함이 없이 그 지역에서 잡초를 목적할 목적으로, 성장 시즌에 걸쳐서 제초적 유효량을 적용하는 것으로 구성되는 잡초를 방제하는 방법이 제공된다. 제초제(들)의 이러한 적용은 심기 이전 (식물을 씨딩하기 이전에 출현하거나 또는 존재하는 잡초에 적용되는, 전소 목적을 포함하여, 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 종자를 심기 전에 언제든지), 발아 이전 (옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 종자가 식재된 후 그리고 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물이 발아하기 이전 언제든지) 또는 발아 이후 (옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물이 발아한 후 언제든지)일 수 있다. 하나 이상의 제초제, 또는 함께 또는 개별적으로 제초제의 조합의 다중 적용이 성장 시즌에 걸쳐, 예를 들어, 2번 적용 (예컨대 심기 이전 적용과 발아 이후 적용, 또는 발아 이전 적용과 발아 이후 적용) 또는 3 또는 그 초과 적용 (예컨대 심기 이전 적용과 2번의 발아 이후 적용)으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 실행함에 있어 제초제 적용은 권고된 상업적 비율 또는 이의 임의의 분획 또는 다수, 예컨대 2회의 권고되는 상업적 비율일 수 있다. 제초제 비율은 제초제 및 제형에 따라 에이커 당 파운드 당 산 당량 (lb ae/에이커) 또는 에이커 당 파운드 당 활성 성분 (lb ai/에이커)으로 표현될 수 있다. 제초제 적용은 권고된 상업적 비율 또는 이의 분획 또는 다수일 수 있다. 본 명세서에서 제공된 바와 같은 제초제 적용 비율에서 에이커의 사용은 단지 유익한 것이다; 본 명세서에 제공된 임의의 비율에 등가 투약량에서의 제초제 적용 비율은 에이커보다 더 크거나 더 작은 영역에 대해 사용될 수 있다. 제초제 적용은 (i) 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제 예컨대 퀴잘로포프 및 할록시포프; (ii) 합성 옥신 예컨대 디캄바 및 2,4-D; (iii) 글루타민 합성효소의 억제제 예컨대 글루포시네이트; 및 (iv) 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS) 억제제 글라이포세이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제를 포함한다. 식물 성장 지역은 제초제 적용 시에 잡초 식물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 잡초를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 FOP 제초제의 제초적 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.01 lb ai/에이커 내지 약 1.0 lb ai/에이커의 범위로 구성되어야 한다 (예를 들어, 퀴잘로포프는 약 0.034 lb ai/에이커 내지 약 0.083 lb ai/에이커의 비율로 적용될 수 있고 할록시포프는 약 0.018 ai/에이커 내지 약 0.07 lb ai/에이커의 비율로 적용될 수 있다). 잡초를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 합성 옥신 페녹시 산 제초제의 제초적 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.1 lb ae/에이커 내지 약 10 lb ae/에이커의 범위로 구성되어야 한다 (예를 들어, 2,4-D는 약 0.75 lb ae/에이커 내지 1.0 lb ae/에이커의 비율로 적용될 수 있다). 잡초를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 합성 옥신 피리디닐옥시 산 제초제의 제초적 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.05 lb ae/에이커 내지 약 5.0 lb ae/에이커의 범위로 구성되어야 한다 (예를 들어, 플루록시피르는 약 0.14 lb ae/에이커 내지 약 0.49 lb ae/에이커의 비율로 적용될 수 있다). 잡초를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 합성 옥신 벤조산 제초제의 제초적 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.1 lb ae/ac 내지 약 16 lb ae/ac 만큼 많은 범위로 구성되어야 한다 (예를 들어, 디캄바는 약 0.5 lb ae/에이커 내지 약 2.0 lb ae/에이커의 비율로 적용될 수 있다). 잡초를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 글루타민 합성효소 억제제의 제초적 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.1 lb ae/에이커 내지 약 10 lb ae/에이커 만큼 많은 범위로 구성되어야 한다 (예를 들어, 글루포시네이트는 약 0.4 lb ai/에이커 내지 약 1.59 lb ai/에이커의 비율로 적용될 수 있다). 잡초를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 EPSPS 억제제의 제초적 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.5 lb ae/ac 내지 약 12 lb ae/ac의 범위로 구성되어야 한다 (예를 들어, 글라이포세이트는 약 0.75 lb ae/에이커 내지 약 2.25 lb ae/에이커의 비율로 적용될 수 있다).
본 발명은 제초적 유효량의 적어도 하나의 사이클로헥산디온 (DIM) 제초제, 예컨대 클레소딤, 세톡시딤, 및 트랄콕시딤을 적용함에 의해 작물 배양을 위한 지역에서 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자생 옥수수를 방제하는 방법을 제공하며, 상기 제초제 적용은 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 옥수수의 성장을 방지한다. 자생 옥수수를 방제하기 위한 지역에서 사용하기 위한 DIM 제초제의 제초적 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.03 lb ai/에이커 내지 약 2.75 lb ai/에이커의 비율로 적용될 수 있다 (예를 들어, 클레소딤은 약 0.0625 lb ai/에이커 내지 약 0.125 lb ai/에이커로 적용될 수 있고 세톡시딤은 약 0.188 lb ai/에이커 내지 0.281 약 lb ai/에이커로 적용될 수 있다).
옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 및 종자를 생산하는 방법이 제공된다. 식물은 당해 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 교배될 수 있고, 예를 들어, 일반적으로 사용되는 교배 방법의 설명은 WR Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)에서 찾을 수 있다. 식물은 자가-수분 ("자가수정"으로도 알려져 있음) 또는 교배-수분 ("교배수정"으로도 알려져 있음)될 수 있다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물은 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 동종접합성인 식물의 진성 교배 계열을 생성하도록 자가-수분될 수 있다. 자가수정은 "근친교배된" 것으로 알려진 자손을 초래하며 유전자적으로 균일한 근교 계열을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물은 변종 또는 잡종 종자를 생산하기 위해 교배-수분될 수 있다 (형질전환 또는 비형질전환인 또 다른 식물과 교배될 수 있다). 본 발명의 방법에 의해 제조된 종자 및 자손 식물은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유한다. 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 내성을 부여하는 하나 이상의 제초제의 적용은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 자손을 선정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 자손은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 또는 종자에 대해 선정하기 위한 진단 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 자손은 변종 또는 잡종 식물일 수 있고; 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물에 의해 생산된 종자 또는 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물로부터의 꽃가루로 수정된 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장될 수 있고; 그리고 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 동종접합성 또는 이종접합성일 수 있다.
옥수수 이벤트 MON87429를 사용하여 잡종 종자를 생산하는 방법이 제공된다. 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물은 웅성 생식 조직을 제외한 모든 조직에서 글라이포세이트 내성 단백질 CP4-EPSPS의 발현을 갖는다. 이것은 식물의 및 자성 생식 조직에서 글라이포세이트 내성 및 웅성 생식 조직에서 글라이포세이트 민감도를 초래한다. 이 글라이포세이트 민감도는 글라이포세이트의 적절한 적용을 통하여 웅성-불임을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 글라이포세이트는 식물에서 조직을 싱크하기 위해 원천으로부터 전위되는 전신 제초제이다. 옥수수에서의 글라이포세이트 대사의 비율에 기인하여, 웅성 생식 조직의 발달 이전에 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물에 적용은 꽃가루 발달, 꽃가루 탈피, 또는 꽃밥 압출을 방지할 수 있다. 이 글라이포세이트-유도된 웅성-불임은, 예를 들어 잡종 종자 생산 동안 주어진 교배에서 자성으로 사용된 옥수수 식물을 물리적으로 거세할 필요를 제거 또는 감소시킴에 의해 잡종 종자 생산의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 (a) 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물을 성장시키는 단계, (b) 유효량의 글라이포세이트를 식물에 적용하여 웅성-불임을 유도하는 단계로서, 상기 제초제 적용은 식물의 웅성 생식 조직의 발달 이전 내지 발달 동안 되고 그것에 의해 식물에서 웅성-불임을 유도하는 단계; (c) 식물을 제2 식물로부터의 꽃가루로 수정시키는 단계; 및 (d) 식물로부터 잡종 종자를 수확하는 단계를 포함하는 잡종 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 글라이포세이트는 하나 이상의 적용에서 적용된, 총 약 0.25 lb ae/에이커 내지 약 11.0 lb ae/에이커의 유효량으로 발달 이전 또는 그 동안 적용된다. 또 다른 구현예에서, 수정시키는 단계는 수동적인 수정 (예를 들어 바람 수분을 통함)을 허용함에 의해, 다른 수단 예컨대 기계적 또는 손 수분에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 달성될 수 있다. 제초제 적용은 웅성 생식 조직의 발달 이전 또는 그 동안, 예컨대 옥수수 식물 발달의 V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, 및 V14 단계로 구성되는 군으로부터 선택된 단계에서 하나 이상의 적용으로 적용될 수 있고 적어도 꽃가루 발달, 꽃가루 탈피, 또는 꽃밥 압출을 방지할 수 있다. 웅성-불임은 부분적이거나 완전할 수 있다. 일 구현예에서, 유효량의 글라이포세이트는 V4 내지 V8 단계 또는 개화 전 최대 100 성장 정도 단위 (GDU)에서 적용된 총 약 0.5 lb ae/에이커 내지 약 2.5 lb ae/에이커 (1회 적용 또는 2 또는 그 초과의 적용으로 분할)일 수 있다.
본 발명의 식물, 자손, 종자, 세포, 및 식물 일부분은 또한 하나 이상의 추가의 옥수수 특성(들) 또는 형질전환 이벤트, 특히 추가의 특성(들) 또는 형질전환 이벤트를 함유하는 또 다른 옥수수 식물과 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 옥수수 식물을 교배시킴에 의해 도입된 것들을 함유할 수 있다. 그와 같은 특성(들) 또는 형질전환 이벤트는, 비제한적으로, 증가된 곤충 저항, 증가된 물 이용 효율, 증가된 수율 성능, 증가된 가뭄 저항, 증가된 종자 품질, 개선된 식물의 품질, 잡종 종자 생산, 및 제초제 내성을 포함하며, 상기 특성은 그와 같은 형질전환 특성을 결하는 옥수수 식물에 대비하여 측정된다. 옥수수 형질전환 이벤트는 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있고; 예를 들어, 이와 같은 특성의 목록은 미국 농무부 (USDA) 동물 및 식물 건강 검사 서비스 (APHIS)에서 제공하며 그것의 웹 사이트 www.aphis.usda.gov에서 찾아 볼 수 있다. 2 또는 그 초과 형질전환 이벤트는 따라서 하나 이상의 형질전환 이벤트(들)를 각각 포함하는 2개의 모체 식물을 교배시키는 단계, 자손 종자를 수집하는 단계 및 2 또는 그 초과 형질전환 이벤트를 함유하는 자손 종자 또는 식물을 선택하는 단계에 의해 자손 종자 또는 식물에서 조합될 수 있다; 이들 단계들는 그 다음 자손에서 형질전환 이벤트의 원하는 조합이 달성될 때까지 반복될 수 있다. 식물의 번식과 마찬가지로, 친계 식물에 역-교배 및 비-형질전환 식물과 외부-교배가 또한 고려된다.
옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 부다페스트 조약에 따라 미국 버지니아주 마나사스 10801 유니버시티 블러바드, 우편 번호 20110에 주소를 갖는 미국 종균 협회 (ATCC®)에 기탁되었다. 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 종자에 대한 ATCC 특허 기탁 명칭 (수탁 번호)은 PTA-124635이고 기탁일은 2018년 1월 12일이었다. 기탁은 30년 또는 마지막 요청 후 5년 동안, 또는 특허의 유효 기간 중 더 긴 기간 동안 기탁소에 유지될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 "비제한적으로 함유하는"을 의미한다
실시예
하기 실시예는 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 포함된다. 옥수수 이벤트 MON87429의 창출 및 궁극적인 선택을 위해 필요한 엄격한 분자, 작물학적, 및 현장 시험을 통한 35개의 발현 작제물의 구축 시험, 15,000개가 넘는 고유의 이벤트의 생산 및 7년에 걸친 수십만 개의 개별 식물의 분석이 요약되어 있다.
개시된 특정 실시예에서 많은 수정이 이루어질 수 있고 여전히 유사한 결과를 얻을 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되어야 한다. 화학적 및 생리적 둘 모두로 관련된 특정 작용제는 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본 명세서에 기재된 제제에 대해 치환될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 모든 그와 같은 치환 및 수정은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
실시예 1: 발현 카세트 시험, 작제물 디자인, 및 R0 식물 시험
본 실시예는 옥수수 식물에서 35개 상이한 작제물의 디자인 및 시험을 기술한다. 각각의 작제물은 상이한 이식유전자를 발현하기 위해 각각 사용된 발현 카세트인, 4개의 발현 카세트를 함유했다. 이 시험은 옥수수에서 4개의 이식유전자 모두를 발현하는데 사용하기 위한 최상의 작제물을 선택하기 위해 수행되었다. 각각의 작제물은 발현 카세트 지향 및 발현 요소에 의해 변하는 고유의 구성을 가졌다.
상이한 발현 요소 조합 및 이식유전자를 갖는 다양한 개별 발현 카세트가 설계되고, 식물 형질전환 벡터 안으로 클로닝되고, 그리고 옥수수 식물에서 특성 효능에 대해 시험되어 최상의 개별 발현 카세트의 풀을 생성하였다. 개별 발현 카세트의 이 풀을 사용하여, 각각이 4개의 발현 카세트 (각각의 발현 카세트는 PAT, DMO, CP4-EPSPS, 또는 FT에 대한 이식유전자를 가짐)를 함유하고 상이한 발현 카세트의 사방 조합을 시험하기 위해 사용될 수 있도록 35개 상이한 작제물이 설계되었다. 발현 카세트 조합은 발현 요소, 단백질 코딩 서열, 및 지향에 의해 다변하였다. 이것은 2개의 PAT 발현 카세트, 6개 DMO 발현 카세트, 5개 FT 발현 카세트, 18개 CP4-EPSPS 발현 카세트의 시험을 초래했다.
35개 사-발현 카세트 작제물이 식물 형질전환 벡터 안으로 클로닝되었고, 그리고 이들 벡터는 그 각각이 옥수수 게놈 안으로 이식유전자 삽입물의 랜덤 삽입에 의해 만들어진 15,326개 고유의 형질전환 이벤트를 생성하기 위해 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 LH244 옥수수 미성숙한 배아의 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위해 사용되었다. R0 식물은 그 다음 형질전환 세포로부터 재생되었고, 정상 표현형 특성을 갖는 뿌리 식물이 성장 및 추가로 평가를 위해 토양으로 옮겨졌다.
15,326개 R0 식물은 형질전환 삽입물의 단일 카피를 갖는 것 및 벡터 골격 서열의 부재에 대해 분석되었다. 삽입물의 단일 카피를 갖는 식물은 제초제 내성 효능 시험에 대해 진전되었다. 단일 카피 R0 식물은 V1/V2 성장 단계에서 분무된, 퀴잘로포프 (0.16 lb ai/ac의 Assure II® 제초제) 이어서 탱크 혼합물의 글루포시네이트 (0.98 lb ae/ac의 Ignite® 280 제초제), 디캄바 (2.0 lb ae/ac의 Clarity® 제초제), 또는 2,4-D (2.0 lb ae/ac 2,4-D Amine 4® 제초제) (또는 이들의 임의의 조합)에 대한 내성에 대해 온실에서 평가되었다. >30% 손상을 나타낸 식물은 폐기되었다.
35개 형질전환 벡터를 사용하여 생산된 초기 15,326개 고유의 형질전환 이벤트로부터, 1,945개 고유의 이벤트가 복제수 및 제초제 분무 데이터를 분석한 후 선택되었다. 데이터는 표 2에 제공되어 있다. 선택된 이벤트에 대한 R0 식물은 자가-수분되어 R1 종자를 생산하였거나 또는 교배되어 제1 시즌 현장 실험으로 진전된 F1 종자를 생산하였다.
Figure 112020076409844-pct00003
실시예 2: 제1 시즌 현장 실험
현장 실험은 35개 작제물의 각각에 대해 R0 분석으로부터 진전된 이벤트로 여러 해에 걸쳐 수행되었고 그것의 현장 실험의 제1 시즌에서 각각의 작제물에 대한 모든 식물의 성능이 그 다음 세트로 분석되었다. 각각의 작제물은 따라서 많은 고유의 이벤트에 의해 제시되었다. 이것은 다수의 작제물이 제1 시즌 현장 실험에서 시험되도록 하는 반면 제1 시즌 실험을 지나 최상의 수행성 작제물 만이 진행하도록 한다. 별도의 제1 시즌 현장 실험이 (1) 글루포시네이트+디캄바, 퀴잘로포프, 및 2,4-D 내성에 대한 근친교배 효능, (2) 라운드업 혼성화 시스템 (RHS) 효능, 및 (3) 상기 제초제 퀴잘로포프, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 디캄바의 더 높은 적용 비율에 대한 내성에 대한 제초제 압력 시험에 대하여 R2 식물 (각각의 이벤트에 대해 동종접합성)로 수행되었다.
글루포시네이트+디캄바, 퀴잘로포프, 및 2,4-D에 대한 제초제 내성을 평가하기 위해 식물의 근친교배 효능 스크린이 수행되었다. 제초제 처리는: 0.8 lb ai/에이커에서 글루포시네이트 플러스 2.0 lb ae/에이커에서 디캄바의 탱크-혼합물 적용; 0.16 lb ai/에이커에서 퀴잘로포프; 또는 2.0 lb ai/에이커에서 2,4-D로 구성되었다. 플롯은 제초제 처리 후 10-14 일 작물 손상에 대해 0-100의 규모로 시각적으로 등급이 매겨졌으며, "0"은 작물 손상이 없고 "100"은 완전한 작물 파괴로 하였다. 식물 높이 (PHT), 귀 높이 (EHT), 50% 실크에 대한 일수 (S50D), 50% 꽃가루에 대한 일수 (P50D), 껍질 중량 (SHW), 시험 중량 (TWT), 수분 (MST) 및 곡물 수율 (YLD)도 또한 수집되었다. 모든 데이터는 분산 분석에 적용되었으며 p<0.05에서의 분리를 의미한다. 동일한 이벤트를 함유하는 다수의 식물에 대한 전체적인 평균을 사용하였고, 근친교배 효능은 탁월 (4), 양호 (3), 보통 (2), 또는 불량 (1) 또는 해당 없음 (NA)으로 글루포시네이트+디캄바, 퀴잘로포프, 및 2,4-D에 대해 요약되었다. 데이터는 표 3에 제공되어 있다.
Figure 112020076409844-pct00004
근친교배한 물질의 글라이포세이트 내성 및 글라이포세이트-유도된 태슬 멸균을 확인하기 위해 식물의 RHS 효능 스크린이 수행되었다. 단일 제초제 처리가 스크리닝을 위해 사용되었고 V2에 적용된 1.5 lb ae/에이커 이어서 대략 V8 (875 성장 정도 일) 이어서 대략 V10 (1025 성장 정도 일)에 0.75 lb ae/에이커에서의 글라이포세이트로 구성되었다. 플롯은 0 내지 100의 규모로 제초제 적용 후 10-14 일에 % 작물 손상 (CIPV2, CIPV8, CIPV10, 및 CIPVT) 플러스 VT (태슬 출현 후)에서 최종 손상 등급에 대해 시각적으로 등급이 매겨졌다. 플롯은 또한 0 내지 100의 유사한 규모로 % 실크 출현 [(SES9A (S90) 및 SES9C (S90 플러스 4일) SES9E (S90 플러스 8일)] 및 % 꽃밥 압출 [(AES9A (S90), AES9C (S90 플러스 4일), 및 AES9E (S90 플러스 8일)]에 대해 시각적으로 등급이 매겨졌으며, "0"은 무 실크 출현 또는 꽃밥 압출이고 "100"은 완전한 실크 출현 또는 꽃밥 압출로 하였다. 다른 작물학적 파라미터가 근친교배 효능 스크린에서와 같이 수집되었다. 동일한 이벤트를 함유하는 다수의 식물에 대한 전체적인 평균이 사용되었고, 글라이포세이트 내성, 태슬 멸균, 및 수율은 각각 탁월 (4), 양호 (3), 보통 (2), 또는 불량 (1) 또는 해당 없음 (NA)으로 요약되었다. 데이터는 표 4에 제공되어 있다.
Figure 112020076409844-pct00005
아래와 같이 제초제 퀴잘로포프, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 디캄바의 더 높은 적용 비율에 대한 작제물 수준 작물 내성을 평가하기 위해 제초제 압력 테스트가 수행되었다. 퀴잘로포프 처리는: 1) VE-V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 0.32 lb ai/에이커에서의 퀴잘로포프 (4X) 플러스 0.25% v/v 비-이온성 계면활성제 (NIS); 2) VE-V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 0.64 lb ai/에이커에서 퀴잘로포프 (8X) 플러스 0.25% v/v NIS; 또는 3) VE-V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 1.28 lb ai/에이커에서 퀴잘로포프 (16X) 플러스 0.25% v/v NIS로 구성되었다. 2,4-D 처리는 1) VE-V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 2 lb ai/에이커에서 2,4-D 아민 플러스 0.25% v/v 비-이온성 계면활성제 (NIS); 2) VE-V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 4 lb ai/에이커에서 2,4-D 아민 플러스 0.25% v/v NIS; 3) VE-V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 8 lb ai/에이커에서 2,4-D 아민 플러스 0.25% v/v NIS; 또는 4) VE-V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 16 lb ai/에이커에서 2,4-D 아민 플러스 0.25% v/v NIS로 구성되었다. 글루포시네이트 처리는: 1) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 글루포시네이트 1.0 lb ai/에이커; 2) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 글루포시네이트 2.0 lb ai/에이커; 3) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 글루포시네이트 4.0 lb ai/에이커; 또는 4) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 글루포시네이트 8.0 lb ai/에이커로 구성되었다. 디캄바 처리는: 1) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 2.0 lb에서 디캄바; 2) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 4.0 lb에서 디캄바; 또는 3) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 8.0 lb에서 디캄바. 4) V2 이어서 V4 이어서 V8에 적용된 16 lb에서 디캄바로 구성되었다. 플롯은 작물 손상에 대해 시각적으로 등급이 매겨졌고 작물학적 파라미터는 근친교배 효능 스크린에서와 같이 수집되었다. 동일한 이벤트를 함유하는 다수의 식물에 대한 전체적인 평균이 사용되었고, 제초제 내성 효능은 각각의 4개의 제초제에 대해 탁월 (4), 양호 (3), 보통 (2), 또는 불량 (1) 또는 해당 없음 (NA)으로 요약되었다. 데이터는 표 5에 제공되어 있다.
Figure 112020076409844-pct00006
각각의 35개 작제물로 생산된 R2 식물의 복합체 성능의 데이터가 컴파일링되고 (1) 글루포시네이트+디캄바, 퀴잘로포프, 및 2,4-D 내성에 대한 근친교배 효능 테스트, (2) 글라이포세이트 내성, 태슬 멸균, 및 수율에 대한 RHS 효능 테스트, 및 (3) 상기 제초제 퀴잘로포프, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 디캄바의 더 높은 적용 비율에 대한 내성에 대하여 제초제 압력 시험에 대해 분석되었다. 이 데이터를 사용하여, 3개 작제물 (HT4-14, HT4-32, 및 HT4-34)이 시험된 35개 작제물로부터 진전을 위해 선택되었다. 이들 3개 작제물에 대한 이벤트는 그 다음 제2 시즌 현장 실험으로 진전되었다.
실시예 3: 분자 분석
분자 분석은 진전된 이벤트에 대한 현장 실험과 동반하여 수행되었다. DNA 증폭 및 서열분석이 사용되어 삽입물 서열, 삽입물 복제수, 및 삽입물 내 골격의 부재를 확인하였다. 각각의 이벤트에 대한 옥수수 게놈에서 삽입 부위가 맵핑되었다. 노던 분석이 수행되어 pat, dmo , ft_t, 및 cp4 - epsps 유전자의 mRNA 전사체를 검출하고 측정하였다. 형질전환 식물로부터 정제된 PAT, DMO, FT_T, 및 CP4-EPSPS 단백질의 N-말단 단백질 서열분석이 수행되어 재조합 단백질 서열을 확인하였다. PAT, DMO, FT_T, 및 CP4-EPSPS 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블랏 분석은 형질전환 식물 샘플로 수행되었다. 깊이에서 서던 분석이 R1 식물로부터 게놈 DNA에 대해 수행되어 복제수 및 골격의 부재를 확인하였다.
실시예 4: 진전된 현장 실험
진전된 현장 실험 (제2 시즌 시험 및 그 이후)이 작제물 HT4-14, HT4-32, 및 HT4-34에 대한 제1 시즌 현장 실험으로부터 진전된 이벤트로 여러 해에 걸쳐 수행되었다. 각각의 현장 실험에서 각각의 이벤트에 대한 많은 개별 식물의 성능이 세트로 분석되었다. 각각의 이벤트는 따라서 많은 고유의 식물에 의해 제시되었다. 이것은 상이한 위치 및 지역에서, 그리고 다양한 특성에 대해 많은 조건하에서 각각의 이벤트의 성능이 분석될 수 있도록 하였다.
현장 실험은 (1) 글루포시네이트, 디캄바, 퀴잘로포프, 및 2,4-D 내성의 상업적 비율에 대한 특성 효능, (2) 작물학적 성능, (3) 라운드업 혼성화 시스템 (RHS) 효능 및 글라이포세이트, 및 (4) 퀴잘로포프, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 디캄바 제초제의 더 높은 적용 비율에 대한 내성에 대하여 제초제 압력 시험을 평가하기 위해 근친교배한 식물 (이벤트에 대한 동종접합성) 및 잡종 식물 (이벤트에 대한 반접합성)로 수행되었다.
현장 시즌 1 실험에서, 30개 이벤트가 작제물 HT4-14에 대해 시험되었고, 41개 이벤트가 작제물 HT4-32에 대해 시험되었고, 21개 이벤트가 작제물 HT4-34에 대해 시험되었다. 이들 실험으로부터 복합체 데이터를 사용하여, 진전을 위한 이벤트가 선택되었다. 현장 시즌 2 실험에서, 15개 이벤트가 HT4-14 작제물에 대해 시험되었고, 38개 이벤트가 HT4-32 작제물에 대해 시험되었고, 38개 이벤트가 HT4-34 작제물에 대해 시험되었다 (이 수는 그 시즌 동안 종자 부족 때문으로 인해 현장 시즌 1에서 시험되지 않은 일부 이벤트를 포함했음). 작제물 HT4-14에 대한 이벤트는 실시예 3에서 기재된 바와 같은 분자 분석에 의해 특징되어 지고 이 데이터는 또한 이벤트를 선택하기 위해 사용되었다. 이들 실험으로부터 복합체 데이터 및 HT4-14 작제물에 대한 이벤트의 심층적인 분자 특성규명이 HT4-14 작제물에 대한 진전을 위한 3개 이벤트를 선택하기 위해 사용되었다. 이들 실험으로부터 복합체 데이터는 HT4-32 작제물에 대한 진전을 위한 24개 이벤트를 선택하고 HT4-34 작제물에 대한 임의의 이벤트를 진전하기 않는 것을 결정하기 위해 사용되었다. 현장 시즌 3 실험에서, 작제물 HT4-14에 대한 3개 이벤트 및 HT4-34 작제물에 대한 24개 이벤트가 시험되었다. 이들 실험으로부터 복합체 데이터는 HT4-14 작제물에 대한 진전을 위한 2개 이벤트를 선택하고 HT4-32 작제물에 대한 임의의 이벤트를 진전하지 않는 것을 결정하기 위해 사용되었다. 현장 시즌 4 실험은 우월한 이벤트를 선택하기 위해 필요한 데이터를 생성하기 위해 다수의 위치에서, 다양한 조건하에서, 그리고 잡종 및 근친교배한 생식질에서 최종 2개의 이벤트를 비교하기 위해 사용되었다. 표 6은 각각의 시즌 동안에 수행된 현장 실험에서 각각의 작제물에 대해 시험된 고유의 이벤트의 수를 제공한다.
Figure 112020076409844-pct00007
작물학적 성능 현장 실험이 특성 효능 현장 실험과 동일한 시즌 동안 수행되었다. 모든 현장 실험은 무작위화된 완전한 블록 디자인을 사용하였고 다수의 위치에서 수행되었다. 현장 실험은 북아메리카와 남아메리카에서의 위치에서 수행되었다. 양 효능 및 작물 현장 실험의 경우, 작물학적 평점은 현장 실험 시즌 전반에 걸쳐 수집되었고, 시즌의 말기에 수율이 결정되었다 (효능 수율 또는 작물학적 수율). 효능 현장 실험은 제초제 적용에 이어서 10 내지 14일에 작물 손상을 평가하기 위해 수행되었다. 표적 작물 손상 등급은 이벤트의 진전에 대해 10% 미만의 점수였다. 작물 현장 실험의 경우, 플롯은 잡초 없이 유지되었고 성장 시즌 동안 시험 제초제는 적용되지 않았다. 잡종 작물 현장 실험은 형질전환 이벤트를 함유하지 않지만, 형질전환 하이브리드 크로스를 제조하기 위해 사용된 동일한 친계 옥수수 계열을 사용하여 생산된 비교할만한 잡종의 대조군 (잡종 대조군)을 포함했다. 근친교배한 대조군은 형질전환 근교 계열에 비교할만한 근친교배였다.
현장 실험 데이터를 비교하기 위해, 다중-시즌, 다중-위치 현장 실험 데이터에서 모든 식물의 집합체를 사용하여 메타-분석이 수행되었다. 예로서, 표 7은 다중 시즌에 걸쳐 2개의 선택된 HT4-14 이벤트에 대해 관찰이 반복된 복제 (reps)의 수와 각각의 이벤트에 대해 각각의 실험에서 시험된 개별 식물의 총수를 설명한다.
Figure 112020076409844-pct00008
다중 잡종 효능 현장 실험의 메타-분석은 잡종 손상 등급의 비교를 위해 완료되었다. 예로서, 표 8은 다중 시즌에 걸쳐 95% 신뢰 수준에서 통계적인 최소 유의차 (p<0.05에서 LSD)로 V8 (V8 분석이 V2, V4, V6, 및 V8 제초제 적용으로부터 누적 손상을 포괄하는 경우)에서 채점된 2개의 선택된 HT4-14 이벤트에 대한 손상 등급을 제공한다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 및 이벤트 2를 함유하는 식물 둘 모두는 이들 실험에서 잘 수행되었다.
Figure 112020076409844-pct00009
다중 잡종 효능 현장 실험의 메타-분석은 부셸/에이커 (Bu/ac)로서 수율의 비교를 위해 완료되었다. 예로서, 표 9는 다중 시즌에 걸쳐 95% 신뢰 수준에서 통계적인 최소 유의차 (p<0.05에서 LSD)로 2개의 선택된 HT4-14 이벤트에 대한 잡종으로부터의 수율을 제공한다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 및 이벤트 2를 함유하는 식물 둘 모두는 이들 실험에서 잘 수행되었다.
Figure 112020076409844-pct00010
상업적 사용보다 더 높은 적용 비율로 적용된 제초제로 압력 시험 현장 실험이 단일 형질전환 이벤트를 함유하는 잡종 및 근친교배한 식물로 수행되었다. 제초제 글루포시네이트 (1.6 내지 6.4 lb ai/에이커의 범위에 걸침), 디캄바 (2.0 내지 16 lb ai/에이커의 범위에 걸침), 퀴잘로포프 (0.32 내지 1.28 lb ai/에이커의 범위에 걸침), 2,4-D (2.0 내지 8.0 lb ai/에이커의 범위에 걸침), 및 글라이포세이트 (3.0 lb ae/에이커)가 제초제 내성 특성의 효능의 압력 시험을 위해 현장 실험에 적용되었다. 시즌의 말기에, 잡종 압력 시험 현장 실험이 수확되었고 수율 (Bu/ac)이 결정되었다. 예로서, 표 10은 95% 신뢰 수준에서 통계적인 최소 유의차 (p<0.05에서 LSD)로 2개의 선택된 HT4-14 이벤트에 대한 상이한 실험에서 잡종 및 근친교배로부터 수율 데이터를 제공한다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 및 이벤트 2를 함유하는 식물 둘 모두는 모든 제초제 처리에 대한 잡종 및 근친교배 수율 실험에서 잘 수행되었다. 결과는 추가의 현장 시험이 이벤트 2보다 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 근친교배 수율 이점을 확인할 수 있었다는 것을 제안했다.
Figure 112020076409844-pct00011
잡종 작물 현장 실험이 수행되었고, 작물학적 측정이 시즌 전반에 걸쳐 수집되었고, 그리고 작물학적 수율은 시즌의 말기에서 결정되었다. 다중-시즌, 다중-위치 잡종 작물 현장 실험에 걸친 메타-분석이 잡종 대조군과 잡종의 수율을 비교하기 위해 사용되었다. 예로서, 표 11은 95% 신뢰 수준에서 통계적인 최소 유의차 (p<0.05에서 LSD)로 2개의 선택된 HT4-14 이벤트에 대한 수율 데이터 (Bu/ac)를 제공한다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 및 이벤트 2를 함유하는 식물 둘 모두는 이들 실험에서 잘 수행되었고, 대조군 식물에 비교할 때 이들 이벤트 중 어느 하나를 함유하는 식물에 대해 잡종 수율에서 통계적인 차이는 발견되지 않았다.
Figure 112020076409844-pct00012
근친교배 효능 현장 실험이 글라이포세이트 내성에 대하여 수행되었고, 라운드업 혼성화 시스템 (RHS) 및 수율은 시즌의 말기에 결정되었다. 글라이포세이트는 잡초 방제를 위해 1.5 lb ae/에이커 이어서 대략 V8에서 0.75 lb ae/에이커 이어서 대략 V10에서 0.75 lb ae/에이커로 글라이포세이트의 2번 멸균 적용의 비율로 적용되었다. 다중-시즌, 다중-위치 근친교배 효능 현장 실험에 걸친 메타-분석이 식물의 수율을 비교하기 위해 사용되었다. 예로서, 표 12는 95% 신뢰 수준에서 통계적인 최소 유의차 (p<0.05에서 LSD)로 2개의 선택된 HT4-14 이벤트에 대한 수율 데이터 (Bu/ac)를 제공한다. 현장 시즌 2 및 현장 시즌 3 실험 둘 모두는 이벤트 MON87429를 함유하는 식물에 비교할 때 이벤트 2를 함유하는 식물에서의 수율에서 통계적으로 상당한 감소를 보여주었다. 이들 데이터는 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물의 근친교배 효능 수율 실험에서 우월한 성능을 나타냈다.
Figure 112020076409844-pct00013
근친교배 작물 현장 실험이 수행되었고 수율은 처리되지 않은 식물에 대한 시즌의 말기에서 결정되었다. 실험은 형질전환 근교 계열에 비교할만한 근교 계열의 대조군을 포함했다. 다중-시즌, 다중-위치 근친교배 작물 현장 실험에 걸친 메타-분석이 짝지은 대조군과 형질전환 근친교배에 대한 수율을 비교하여 수행되었다. 예로서, 표 13은 95% 신뢰 수준에서 통계적인 최소 유의차 (p<0.05에서 LSD)로 2개의 선택된 HT4-14 이벤트에 대한 수율 데이터 (Bu/ac)를 제공한다. 대조군 식물과 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 간에 근친교배 작물학적 수율에서의 통계적인 차이는 발견되지 않았다. 그에 반해서, 현장 시즌 3 실험 경우, 대조군 식물 및 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물에 비교할 때 이벤트 2를 함유하는 식물에서 수율에서의 통계적으로 상당한 감소가 있었다. 이들 데이터는 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물의 근친교배 작물학적 수율 실험에서 우월한 성능을 나타냈다.
Figure 112020076409844-pct00014
잡종 효능 시험은 글루포시네이트, 디캄바, 퀴잘로포프, 할록시포프, 2,4-D, 및 글라이포세이트에 대한 식물 내성을 평가하기 위해 아르헨티나에서 4개 위치에서 수행되었다. MON87429를 함유하는 식물은 3개 이벤트 (MON87429 x MON88017 x MON89034) 모두를 함유하는 자손을 생산하기 위해 옥수수 이벤트 MON88017 및 옥수수 이벤트 MON89034 둘 모두를 함유하는 식물과 교배되었다. 제초제 처리는 1) 비-처리된 대조군; 2) V2 단계에서 적용된 0.448 kg ai/ha에서 글루포시네이트 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 3) V2 단계에서 적용된 0.896 kg ai/ha에서 글루포시네이트 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 4) V2 단계에서 적용된 0.56 lb ae/에이커에서 디캄바 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 5) V2 단계에서 적용된 1.12 lb ae/에이커에서 디캄바 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 6) V2 단계에서 적용된 0.09 kg ae/ha에서 퀴잘로포프 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 7) V2 단계에서 적용된 0.18 kg ae/ha에서 퀴잘로포프 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 8) V2 단계에서 적용된 0.1 kg ae/ha에서 할록시포프 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 9) V2 단계에서 적용된 0.2 kg ae/ha에서 할록시포프 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 10) V2 단계에서 적용된 1.12 lb ai/에이커에서 2,4-D 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 11) V2 단계에서 적용된 2.24 lb ae/에이커에서 2,4-D 이어서 V6 단계에 동일한 적용; 또는 12) V2 단계에서 적용된 2.24 lb ae/에이커에서 글라이포세이트 이어서 V6 단계에 동일한 적용으로 구성되었다. 데이터 수집은 V2 및 V6 제초제 적용 후 10 내지 14일에 작물 손상 및 VT에서 최종 등급, 50% 꽃가루까지 일수, 50% 실크까지 일수, 식물 높이, 귀 높이, 껍질 중량, 테스트 중량, 수분, 및 곡물 수율로 구성되었다. 모든 데이터는 분산 분석에 적용되었으며 p<0.05에서의 분리된 것을 의미한다.
MON87429 x MON88017 x MON89034를 함유하는 식물의 제초제 내성은 시험된 글라이포세이트, 글루포시네이트, 디캄바, 퀴잘로포프, 할록시포프, 및 2,4-D의 모든 비율에 걸쳐 탁월하였다 (<10% 작물 손상). 제초제 처리 비율은 시각적 작물 손상에 관하여 차이를 생성하지 않았다. 귀 높이는 표준 제초제 처리 12 (2.24 lb ae/에이커에서 글라이포세이트)에 비교된 임의의 처리에 대해 상당히 상이하지 않았다. 비-처리된 식물의 것에 비하여 임의의 처리 내에서 MON87429 x MON88017 x MON89034를 함유하는 식물의 식물 높이 또는 테스트 중량에서의 상당한 감소, 곡물 수분에서의 증가, 성숙 지연 (50% 꽃가루 또는 실크까지 증가한 일수로 측정됨), 곡물 수율에서의 감소가 없었다. 웅성 조직에서 글라이포세이트 내성을 제공하는 이벤트 (예컨대 상업적으로 이용가능한 옥수수 이벤트 MON88017 또는 NK603)를 함유하는 식물과 MON87429를 함유하는 식물의 교배를 통해 생산된 잡종 식물은 상업적 표지 비율로 적용될 때 글라이포세이트, 글루포시네이트, 디캄바, 퀴잘로포프, 할록시포프, 및 2,4-D에 대한 탁월한 식물의 내성을 제공한다
클레소딤을 사용하여 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물의 방제를 시험하기 위해 3년의 현장 실험이 사용되었다. 이들 실험은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물로 DIM 제초제의 지원자 방제 방법에서의 사용을 평가하였다. 식물은 상업적 표지 비율로 클레소딤으로 처리되었고 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물의 완전한 방제가 관측되었다.
분자 분석 및 (1) 글루포시네이트, 디캄바, 퀴잘로포프, 및 2,4-D 내성의 상업적 비율에 대한 특성 효능, (2) 작물학적 성능, (3) 라운드업 혼성화 시스템 (RHS) 효능 및 글라이포세이트 내성, 및 (4) 퀴잘로포프, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 디캄바 제초제의 더 높은 적용 비율에 대한 내성에 대하여 제초제 압력 시험을 평가하는 근친교배 및 잡종 식물로 현장 실험으로부터 축적된 데이터가 작제물 HT4-14, HT4-32, 및 HT4-34에 대해 시험된 모든 이벤트에 대해 분석되었다. 누적 데이터의 분석은 다른 이벤트에 비교하여 옥수수 이벤트 MON87429의 전반적인 우월한 성능을 실증했고 상업적 목적을 위해 이 이벤트의 선택을 초래했다.
실시예 5: 옥수수 이벤트 MON87429의 분자 특성규명
옥수수 이벤트 MON87429는 상업적 이벤트로서 선택 시 광범위한 분자 특성규명을 거쳤다. 옥수수 이벤트 MON87429의 형질전환 삽입물은 표 1에 기재된 요소 및 서열을 함유한다.
옥수수 이벤트 MON87429의 DNA 서열 분석이 수행되었다. 옥수수 이벤트 MON87429를 함유한 식물이 임의의 형질전환 벡터 골격 없이 전체 형질전환 삽입물의 단일의 온전한 복제를 함유했다는 것을 확인하기 위해 서던 블랏 분석이 수행되었다. 측접 DNA는 삽입물의 5' 및 3' 말단 둘 모두에 대해 서열분석되었고 각각의 접합은 서열 포착, 농축, 서열분석, 역 PCR, 및 게놈 워킹 기술을 사용하여 결정되었다. 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 측접하는 DNA의 서열은 알려진 옥수수 게놈 물리적 어셈블리에 대해 맵핑되었다. 삽입 부위 서열 정보는 이벤트의 염색체 위치의 생물정보학 분석을 위해 사용되었다. 삽입 부위 완전성은 옥수수 이벤트 MON87429의 측접 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 야생형 대립유전자에 걸쳐 PCR에 의해 결정되었다. 야생형 삽입 부위는 옥수수 참조 게놈에 대해 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 이식유전자 통합의 고유의 부위를 맵핑하기 위해 사용되었다. 형질전환 동안 이식유전자의 어떠한 영역에도 변형 또는 돌연변이가 도입되지 않았다는 것을 보장하기 위해, 옥수수 이벤트 MON87429의 전체 형질전환 삽입물은 식물로부터 단리되고 서열분석되었다. 5' 접합, 3' 접합, 및 형질전환 삽입물에 대한 서열 정보는 서열번호:1-10으로 본 명세서에 제공되어 있다.
옥수수 이벤트 MON87429의 작제물을 포함하는 식물의 RNA 분석이 수행되었다. 노던 분석은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물의 그레인으로부터 단리된 총 RNA에 대해 수행되었다. 이것은 pat, dmo , ft_t, 및 cp4 - epsps mRNA 생성물에 대한 전사체 크기 및 수를 확인했다. CP4-EPSPS에 대한 RNA 발현 수준이 또한 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 식물 조직으로부터 샘플을 사용하여 실시간 PCR에 의해 측정되었다. CP4-EPSPS 전사체의 절단은 단지 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물의 태슬에서만 일어난다는 것과 이것은 서열-특이적 방식에서 옥수수 내인성 웅성-특이적 작은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 유발된다는 것을 확인하기 위한 CP4-EPSPS 절단 생성물을 동정하기 위해 cDNA 단부 (RACE)의 신속한 증폭이 사용되었다. 저분자량 노던 분석은 비-태슬 조직에서 글라이포세이트 내성을 포함할 수 있는 CP4-EPSPS siRNA가 없다는 것을 입증하기 위해 수행되었다.
옥수수 이벤트 MON87429의 작제물을 포함하는 식물의 단백질 분석이 수행되었다. 발현된 PAT, DMO, FT_T, 및 CP4-EPSPS 단백질의 N-말단 단백질 서열분석은 진정한 N-말단 아미노산 서열을 확인하기 위해 그레인으로부터 면역정제된 단백질 추출물을 사용하여 수행되었다. 웨스턴 블랏 분석은 단일의 예상된-크기의 단백질이 각각 PAT, DMO, FT_T, 및 CP4-EPSPS에 대해 생산되었다는 것을 확인하기 위해 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 그레인으로부터의 단백질 추출물에 대해 수행되었다. ELISA는 PAT, DMO, FT_T, 및 CP4-EPSPS 단백질에 대해 식물의 잎, 종자, 뿌리, 및 꽃가루에서 단백질 수준을 결정하기 위해 사용되었다.
실시예 6: 옥수수 이벤트 MON87429의 검출
샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 검출은 DNA, RNA, 또는 단백질 검출 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 검출 방법 및 물질은 아래에 제공된다. 검출은 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 검출은 게놈 DNA의 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 게놈 복제 (즉, 반접합성, 동종접합성, 또는 이종접합성)의 수를 나타낼 수 있다.
샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429를 확인하기 위해 이벤트 특이적 종점 Applied Biosystems™ TAQMAN® 열 증폭 방법 (Thermo Fisher Scientific)이 전개되었다. 종점 검정에 사용된 DNA 프라이머 및 프로브는 프라이머 SQ51062 (서열번호:11), SQ51053 (서열번호:12), 및 6-FAM™ 표지된 프로브 PB50370 (서열번호:13)이다. 6-FAM은 DNA 프로브에 부착된 Applied Biosystems (캘리포니아주 포스터 시티 소재)의 형광 염료 제품이다. TAQMAN MGB™ 프로브 경우, Taq DNA 중합효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성은 형광단과 켄쳐 사이, 5'-말단으로부터 프로브를 절단한다. 표적 DNA 가닥에 혼성화될 때, 켄쳐 및 형광단은 형광 신호를 생성하고, 따라서 형광을 방출하기에 충분히 분리된다. 이들 반응 방법 및 PB50370과 함께 사용될 때 SQ51062 및 SQ51053은 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 진단하는 DNA 앰플리콘을 생산한다. 이 분석을 위한 대조군은 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 양성 대조군, 비-형질전환 옥수수로부터 음성 대조군, 및 템플레이트 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함하여야 한다. 추가로, PCR 반응에 대한 대조군은 옥수수 게놈에서 단일 카피 유전자에 대해 특이적인 내부 대조군 프라이머 및 내부 대조군 프로브를 최적으로 포함하여야 한다. 이들 검정은 최대 속도에서 수행하는 Applied Biosystems GeneAmp® PCR 시스템 9700 (Thermo Fisher Scientific)으로 사용에 대해 최적화되지만, 다른 설비가 사용될 수도 있다.
옥수수 이벤트 MON87429의 검출을 위한 TAQMAN 방법으로 유용한 조건의 예는 아래와 같다. 단계 1: 5 μl의 최종 부피에 대해 조정된 18 메그옴 물. 단계 2: 1X 최종 농도로 2.28 μl의 2X 유니버셜 마스터 믹스 (dNTP, 효소, 완충액). 단계 3: 0.9 μ 최종 농도로 0.05 μl 이벤트 프라이머-1 (SQ51062) 및 이벤트 프라이머-2 (SQ51053) (각각의 프라이머에 대해 100 uM의 농도로 18 메그옴 물에서 재현탁됨). 단계 4: 0.2 μM 최종 농도로 0.01 μl 이벤트 6-FAM MGB 프로브 PB50370 (100 μM의 농도로 18 메그옴 물에서 재현탁됨). 단계 5: 0.9 μM 최종 농도로 0.05 μl 내부 대조군 프라이머-1 및 내부 대조군 프라이머-2 믹스 (각각의 프라이머에 대해 100 μM의 농도로 18 메그옴 물에서 재현탁됨). 단계 6: 0.2 μM 최종 농도로 0.01 μl 내부 대조군 VIC™ 프로브 (100 μM의 농도로 18 메그옴 물에서 재현탁됨). 단계 7: (a) 분석되는 잎 샘플; (b) 음성 대조군 (비-형질전환 DNA); (c) 음성 물 대조군 (템플레이트없음); 및 (d) 옥수수 이벤트 MON87429 DNA를 함유하는 양성 대조군 옥수수를 포함하는 것 중 각각 하나와 각각의 샘플에 대해 2.5 μl 추출된 DNA (템플레이트). 단계 8: 95℃에서 20초 동안 일 사이클; 95℃에서 3초 동안 그 다음 60℃에서 20초 동안 사십 사이클; 및 10℃의 최종 사이클과 같은 열 주기 조건.
접합형식 검정은 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물이 이벤트 또는 야생형 대립유전자에 대해 이종접합성인지 또는 동종접합성인지 여부를 결정하기 위해 전개된다. 증폭 반응 검정은 본 명세서에 제공된 서열 정보를 사용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 이러한 PCR 검정은 적어도 3개 프라이머: 프라이머-1, 프라이머-2, 및 프라이머-3의 디자인을 포함할 수 있으며, 상기 프라이머-1은 옥수수 이벤트 MON87429의 3' 측접 상의 옥수수 게놈 DNA에 대해 특이적이고; 프라이머-2는 옥수수 이벤트 MON87429 형질전환 삽입물에 대해 특이적이고; 그리고 프라이머-3은 야생형 대립유전자에 대해 특이적이다. 증폭 반응에서 프라이머 쌍으로 사용될 때, 프라이머-2와 함께 프라이머-1은 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 특이적인 PCR 앰플리콘을 생성할 것이다. 증폭 반응에서 프라이머 쌍으로 사용될 때, 프라이머-3과 함께 프라이머-1은 야생형 대립유전자에 대해 특이적인 PCR 앰플리콘을 생성할 것이다. 옥수수 게놈 DNA 상에서 수행된 PCR 반응에서, 프라이머-1 + 프라이머-2로부터 생성된 각각의 PCR 앰플리콘 및 프라이머-1 + 프라이머-3으로부터 생성된 것들은 앰플리콘의 서열 및 크기에서 상이할 것이다. 3개의 프라이머가 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 동종접합성 식물로부터 추출된 DNA와 PCR 반응에 포함될 때, (옥수수 MON87429 삽입에 대해 특이적인) 단지 프라이머-1 + 프라이머-2 앰플리콘이 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 이종접합성 식물로부터 추출된 DNA와 PCR 반응에 포함될 때, (옥수수 MON87429 삽입에 대해 특이적인) 양 프라이머-1 + 프라이머-2 앰플리콘 및 (야생형 대립유전자 또는 옥수수 MON87429 삽입의 부재에 대해 특이적인) 프라이머-1 + 프라이머-3 앰플리콘이 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 (야생형인) 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 효과 없는 식물로부터 추출된 DNA와 PCR 반응에 함께 혼합될 때, (야생형 대립유전자에 대해 특이적인) 단지 프라이머-1 + 프라이머-3 앰플리콘이 생성될 것이다. PCR 반응을 사용하여 생산된 앰플리콘은 당해 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 확인 또는 구별될 수 있다.
옥수수 이벤트 MON87429에 대한 또 다른 접합형식 검정은 TAQMAN 열 증폭 반응이다. 이러한 유형의 검정의 경우, 상기에 기재된 바와 같은 프라이머에 부가하여, 검정은 2개의 형광으로 표지된 프로브를 포함할 것이다. 프로브-1은 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 특이적일 수 있고 프로브-2는 옥수수 이벤트 MON87429 (야생형)에 대해 효과 없는 옥수수 식물에 대해 특이적일 수 있고, 상기 2개의 프로브는 상이한 형광 라벨, 예를 들어 6-FAM-표지 또는 VIC™-표지를 함유한다. TAQMAN 반응에서 사용될 때, 프라이머-1 + 프라이머-2 + 프로브-1은 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 특이적인 제1 형광 신호를 생성할 것이고 프라이머-1 + 프라이머-3 + 프로브-2는 야생형 옥수수에 대해 특이적인 제2 형광 신호를 생성할 것이다. 3개의 프라이머 및 2개의 프로브가 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 동종접합성 식물로부터 추출된 DNA와 TAQMAN 반응에 포함될 때, (프라이머-1 + 프라이머-2 + 프로브-1에 대해 특이적인) 단지 제1 형광 신호가 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 이종접합성 식물로부터 추출된 DNA와 TAQMAN 반응에 포함될 때, (프라이머-1 + 프라이머-2 + 프로브-1에 대해 특이적인) 상기 제1 형광 신호 및 (프라이머-1 + 프라이머-3 + 프로브-2에 대해 특이적인) 상기 제2 형광 신호 둘 모두가 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 옥수수 이벤트 MON87429 (야생형)에 대해 효과 없는 식물로부터 추출된 DNA와 TAQMAN 반응에 함께 혼합될 때, (프라이머-1 + 프라이머-3 + 프로브-2에 대해 특이적인) 단지 제2 형광 신호가 생성될 것이다.
식물 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하기 위한 또 다른 방법은 서던 분석일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 특이적인 서던 혼성화 프로브(들) 및 옥수수 이벤트 MON87429 (야생형)에 대해 효과 없는 옥수수 식물에 대해 특이적인 제2 서던 혼성화 프로브를 디자인하는 방법을 이해할 수 있을 것이다. 서던 분석으로, 제1 서던 혼성화 프로브로부터 검출된 신호만이 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 동종접합성 식물을 나타낼 것이고; 제1 서던 혼성화 프로브 및 제2 서던 혼성화 프로브 둘 모두로부터 검출된 신호는 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 이종접합성 식물을 나타낼 것이고; 그리고 제2 서던 혼성화 프로브로부터 검출된 신호만이 DNA가 옥수수 이벤트 MON87429 (야생형)에 대해 효과 없는 식물로부터 추출되었다는 것을 나타낼 것이다
검출 키트의 또 다른 예는 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 스트립의 선단이 수용액과 접촉될 때 활성화된 시약을 포함한 측면 유동 스트립을 이용할 수 있다. 항체 생산에 사용하기에 충분한 예시적인 단백질은 서열번호:10으로 제공된 서열, 또는 임의의 이의 단편에 의해 인코딩된 것이다.
단백질 검출 방법은 샘플이 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물, 종자, 세포, 또는 식물 일부분으로부터의 것인지 여부를 결정하기 위해 전개된다. 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 단백질을 검출하기 위해, 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체가 사용된다. 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 하나 이상의 단백질에 대해 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는 검출 키트가 스트립의 선단이 수용액과 접촉될 때 활성화된 시약을 함유하는 측면 유동 스트립을 이용할 수 있다. 옥수수 조직의 샘플은 분쇄되고 단백질은 물 또는 수성 완충액 (예를 들어, 세제 및 소과 혈청 알부민을 함유하는 포스페이트 완충 식염수)을 사용하는 분석을 위해 추출될 수 있다. 원심분리에 이어, 수성 상청액은 흡수제 패드를 함유하는 측면 유동 스트립 상에서 샌드위치 형식으로 ELISA 방법을 사용하여 분석된다. 검출은 스트립의 선단을 시험되는 샘플을 함유하는 수용액에 침지함에 의해 활성화된다. 수용액은 모세관 작용에 의해 스트립 위로 운반되고 스트립 상에 금 표지된 항체를 용해시킨다. 금 표지된 항체는 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질에 대해 특이적이며, 샘플에서 단백질 상의 에피토프에 결합하여 항체-항원 복합체를 형성할 것이다. 금 표지된 항체-항원 복합체는 그 다음 스트립 위로 니트로셀룰로스 막으로 운반된다. 막은 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 단백질 상의 제2의 별도 에피토프에 결합하여, 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 단백질이 샘플에 존재하는 경우 가시적인 라인이 테스트 스트립에 걸쳐 나타나게 하는 고정화된 항체의 테스트 라인을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> Transgenic Maize Event MON87429 and Methods of Use Thereof <130> MONS:430WO <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of maize genomic DNA and transgene DNA <400> 1 ccactcttgt ttggtttcat gtccgggaaa 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of maize genomic DNA and transgene DNA <400> 2 cggtgcacaa actatagcaa gtgtggtcta 30 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of maize genomic DNA and transgene DNA <400> 3 acttgcaaaa atagaccact cttgtttggt ttcatgtccg ggaaatctac atggatcagc 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of maize genomic DNA and transgene DNA <400> 4 gcacaacaaa cgcaccggtg cacaaactat agcaagtgtg gtctattttt atatagcaag 60 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule 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tttaattagt ttcaagaaag ccaagcgtgt ttgggttcta ggatgaacaa agtcgtccaa 11400 gatgcaagaa gttctagaga ggtagctaca tttctggaaa ttgttgcatc ttcctttctt 11460 caatatatat atattgtcct atttcataat gtcattctag ccagctatct atattctata 11520 tatccatttc cgttgccata ctttattcac tatgttgcat cgagtgagct gcattgctct 11580 gtactacatg ttacttgata tgtgttgttc ataaacacac acattaataa tgatcagatt 11640 gtgaaaaata cgcgtccgat cctacctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag 11700 gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatgcctctg 11760 ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 11820 ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatac ttccactgac gtaagggatg 11880 acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 11940 tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctacaag atcggggatc tctagcccta 12000 gaaccatctt ccacacactc aagccacact attggagaac acacagggac aacacaccat 12060 aagatccaag ggaggcctcc gccgccgccg gtaaccaccc cgcccctctc ctctttcttt 12120 ctccgttttt ttttccgtct cggtctcgat ctttggcctt ggtagtttgg gtgggcgaga 12180 ggcggcttcg tgcgcgccca gatcggtgcg cgggaggggc gggatctcgc ggctggggct 12240 ctcgccggcg tggatccggc ccggatctcg cggggaatgg ggctctcgga tgtagatctg 12300 cgatccgccg ttgttggggg agatgatggg gggtttaaaa tttccgccgt gctaaacaag 12360 atcaggaaga ggggaaaagg gcactatggt ttatattttt atatatttct gctgcttcgt 12420 caggcttaga tgtgctagat ctttctttct tctttttgtg ggtagaattt gaatccctca 12480 gcattgttca tcggtagttt ttcttttcat gatttgtgac aaatgcagcc tcgtgcggag 12540 cttttttgta ggtagaagtg atcaaccatg gcgcaagtta gcagaatctg caatggtgtg 12600 cagaacccat ctcttatctc caatctctcg aaatccagtc aacgcaaatc tcccttatcg 12660 gtttctctga agacgcagca gcatccacga gcttatccga tttcgtcgtc gtggggattg 12720 aagaagagtg ggatgacgtt aattggctct gagcttcgtc ctcttaaggt catgtcttct 12780 gtttccacgg cgtgcatgct tcatggagct tcatctaggc cagctactgc caggaagtct 12840 agcgggctca gtggcaccgt gcgcatccct ggcgataaaa gtatttcaca caggagcttc 12900 atgttcggag gacttgctag tggagagacg agaatcactg gtttgcttga gggcgaagat 12960 gttatcaaca ccggtaaggc gatgcaagca atgggtgcca gaatccgaaa agagggcgat 13020 acgtggatca tcgacggtgt tggtaacgga ggattgctcg ctcccgaagc gccacttgac 13080 tttgggaacg cagctacggg gtgccgtctt actatgggac tggtaggcgt gtatgacttt 13140 gactctacct tcatcggtga cgcgagcctc actaagagac caatgggacg agtgctgaat 13200 cccctgaggg agatgggtgt ccaggtgaaa tctgaggatg gtgatcgtct tccggttact 13260 ctgcgaggcc ccaagacccc cacgccaatc acgtacaggg ttccgatggc gtcagcacag 13320 gtcaagtcag cggtactcct ggcgggcctc aacacacctg gaatcacaac cgtgattgaa 13380 cccatcatga ctagagacca cacggagaag atgttgcagg gtttcggcgc taatctaacg 13440 gtcgaaaccg acgccgacgg cgtgaggaca atccgcttgg agggcagagg taaactgact 13500 ggccaagtca tcgatgtgcc tggagatccc tcgtccacag cgtttcccct cgtagctgcg 13560 ttgctcgtcc ctggatctga tgtgacgatc ctgaatgtcc tcatgaatcc aactagaacc 13620 ggcctcatcc tcacattgca ggagatgggt gctgacatcg aggttatcaa tcctaggttg 13680 gcaggtggag aggatgtggc cgatctgcgc gtgcgttcta gtacactcaa aggcgtgacc 13740 gtccctgagg atcgcgctcc atccatgatc gacgagtacc ccattctcgc cgttgctgct 13800 gcgtttgccg agggcgcaac tgtaatgaac ggccttgagg agttgagggt taaggagagt 13860 gacaggctgt ccgcggtggc gaatggcctg aagctaaacg gcgtggactg cgacgaaggt 13920 gaaacgtccc ttgtagtccg tggtcgccca gacgggaagg ggttggggaa tgcttcggga 13980 gctgctgtgg cgacgcacct tgatcataga atcgccatgt catttctggt gatgggactt 14040 gtctccgaga atccggtgac cgttgacgat gctaccatga tcgccacctc ctttcctgag 14100 ttcatggacc tcatggcagg cttgggggcc aagatcgagc tgtctgatac taaggccgct 14160 tgacacgtga gacgacgacc gtgcatggtg atgaatcaca gacgacgaac acgcatgtcg 14220 catcgccgtc ctctttgtat cacacagcat caccttcttc gctctactac tcccccgagc 14280 aatcaccgac caataacacc aaccatcaac ctcccccgtc gccgccgcct tcaccgtcct 14340 cccctcacac catagaactg caaatgtccg cctgcagggt ggggcccatc gtggccagtt 14400 atccttagct atccgtgtca gaatcatctt atcatcgagt cgagtcgtta tcgtgtccag 14460 tggctctctc gagtcgagaa gccctctatc catccatcca gtgttaggtg ttcttcgtcc 14520 gtgatgttac catgaattga gttcgctttg gttatggtgt ttgaactgct tgttgctatc 14580 tatcggaatg aaatgaaata gaagacaagg agaaaaaaaa gagttcgaaa gttttgttcg 14640 cataccatat atttccttcc ggtgcgcgct gtttattcct cgctcagcag caagattgtt 14700 tgatcgatat tgcagcaagc aattacacaa taaatatatt gctacactgg tacttcaaac 14760 tacactggtg gtcggtgatt ttcaatagca tgaaccttaa ttgaacatct gtgtagctta 14820 catctccttc gaaagctgca atgcttgaga acttggaaag aaattcttgt gatggcagaa 14880 gctattcact gtccttcgct gcatttacag tccatacaga cacagcattt ccattttgca 14940 caagatagag aacaacaatc agccttttag gtcaatccca agtgtgcatg acgtcccgcg 15000 atcgcccgca caacaaacgc accggtgcac aaactatagc aagtgtggtc tatttttata 15060 tagcaagtga ggtcagataa aataataaat aaaatcatta aattttatat agcaagtgtg 15120 gtctattttt gcttgtaaac tacagagaat atatatatgt taaatcggta gaacaattgg 15180 ctatttaaac taaaagattt aaaaaaaaca aagataaaaa atgtttttga actgcgtgtc 15240 tcgagagcag ccagcatgct tccgacctgc atgagcagcg atgctcctgg tgaccgcacg 15300 aacggaacct ggcccgatgg atgattttgc atcaacagcg cctgtatgca acgatcatcc 15360 aaccaaacat acttcgcttt gaggatccac gcctacaacg tccgcgctcg tccatgcaac 15420 caaacacacg gaatgtgttc catgtgtccc aattgaaaga agtgtattcg gttaacaacg 15480 gaagtcataa ccgagccaga tatagagata gaaccagatc tatcatacca agaacacccc 15540 tccaagattc tagactgcaa ggaaagatcc actcgtgcga agacgaccaa gatgtataag 15600 atccaatgga gcaaccatac ggaagaagag gctacgtggg agactgagga ttatctatgc 15660 aaatactacc ccgattgtct acctaaggaa gtcagtacgt aaccatgccc cagccccctg 15720 ccctccgatt ccaaatatag aaaagatact cttaatgaaa actgaattaa gaaatgaaat 15780 taagcgaaga aggacttcct tctgaagttg caaagaggat ggcattcgaa gagcagattt 15840 ttctcgcgaa ccttaaaaag ctaaccaata ctatgcaagc aagctataac cacctcctca 15900 ctcctgggtg atctcgactc gaatctcggg gcgagattct tttaaggggg gagagctgta 15960 acaccccagg tgttacttag ggtttccccc ttagtacctc catttgtgac ctattatcac 16020 atgtggtttg gtttaagaaa aaggcaccaa acttgagggg ccaagccc 16068 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 11 ttgctatata aaaatagacc acacttgct 29 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 12 catgacgtcc cgcgatc 17 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Probe <400> 13 cacaacaaac gcaccg 16

Claims (53)

  1. 서열번호:10, 서열번호:9, 서열번호:8, 서열번호:7, 서열번호:6, 서열번호:5, 서열번호:4, 서열번호:3, 서열번호:2, 및 서열번호:1로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물, 종자, 또는 세포로부터 유래되며, 상기 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 기탁 번호 PTA-124635로 기탁된 것인 재조합 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물, 세포, 종자, 또는 식물 일부분에 존재하며, 상기 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC PTA-124635로 기탁된 것인 재조합 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 진단하는 앰플리콘인 재조합 DNA 분자.
  5. 4개의 발현 카세트를 포함하는 DNA 작제물이며,
    a) 제1 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) 에리안서스 라벤나에(Erianthus ravennae)로부터의 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론,
    (II) 포스피노트리신 N-아세틸전달효소 코딩 서열, 및
    (III) 세타리아 이탈리카(Setaria italica)로부터의 푸룩토스-비스포스페이트 알돌라아제 3' UTR
    을 포함하고,
    b) 제2 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) 코익스 라크리마-요비(Coix lacryma-jobi)로부터의 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론,
    (II) 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 알비노 및 옅은 녹색(pale green) 6 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열,
    (III) 디캄바 모노옥시게나제 코딩 서열, 및
    (IV) 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터의 메탈로티오네인-유사 단백질 3' UTR
    을 포함하고,
    c) 제3 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) 아룬도 도낙스(Arundo donax)로부터의 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론,
    (II) 아라비돕시스 탈리아나로부터의 말레이트 탈수소효소 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열,
    (III) FT_T 단백질 코딩 서열, 및
    (IV) 오리자 사티바로부터의 무 정단(no apical) 분열조직 단백질 3' UTR
    을 포함하고,
    d) 제4 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) CaMV 35S 프로모터 및 리더,
    (II) 트리티쿰 아에스티범으로부터의 클로로필 a/b-결합 단백질 리더,
    (III) 오리자 사티바로부터의 액틴 1 인트론,
    (IV) 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ShkG 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열,
    (V) 아그로박테리움 sp(Agrobacterium sp) 균주 CP4로부터의 글라이포세이트 내성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 코딩 서열,
    (VI) 지아 메이스(Zea mays)로부터의 웅성 조직 특이적 siRNA 표적, 및
    (VII) 오리자 사티바로부터의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질 3' UTR
    을 포함하는 것인
    DNA 작제물.
  6. 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 DNA의 샘플에서 서열번호:10에 대해 특이적인 DNA 프로브로서 기능하는, 서열번호:10의 충분한 길이의 인접 뉴클레오타이드를 갖는 DNA 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 DNA 프로브가 서열번호:13을 포함하는 것인 DNA 분자.
  8. 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자를 포함하는 한 쌍의 DNA 분자이며,
    상기 제1 및 상기 제2 DNA 분자 각각은
    서열번호:10의 단편을 포함하고,
    샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 진단하는 앰플리콘을 생산하도록, 옥수수 이벤트 MON87429를 함유하는 DNA와의 증폭 반응에서 함께 사용될 때 DNA 프라이머로서 기능하는 것인
    한 쌍의 DNA 분자.
  9. 제8항에 있어서, 적어도 하나의 DNA 프라이머가 서열번호:7 및 서열번호:8로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 단편을 포함하는 것인 한 쌍의 DNA 분자.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1 DNA 분자가 서열번호:11을 포함하고,
    상기 제2 DNA 분자가 서열번호:12를 포함하는 것인
    한 쌍의 DNA 분자.
  11. 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 DNA의 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 방법이며,
    a) 상기 샘플을 제6항의 DNA 분자인 DNA 프로브와 접촉시키는 단계,
    b) 상기 샘플과 DNA 프로브가 엄격한 혼성화 조건을 받도록 하는 단계, 및
    c) 상기 샘플에서 DNA 분자에 대한 상기 DNA 프로브의 혼성화를 검출하는 단계
    를 포함하며,
    상기 DNA 분자에 대한 상기 DNA 프로브의 혼성화는 DNA의 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 나타내는 것인 방법.
  12. 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 DNA의 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 방법이며,
    a) 상기 샘플을 제8항의 한 쌍의 DNA 분자와 접촉시키는 단계,
    b) 서열번호:10, 서열번호:9, 서열번호:8, 서열번호:7, 서열번호:6, 서열번호:5, 서열번호:4, 서열번호:3, 서열번호:2, 및 서열번호:1로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 앰플리콘을 생산하기에 충분한 증폭 반응을 수행하는 단계, 및
    c) 상기 DNA 앰플리콘의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하며,
    상기 DNA 앰플리콘의 존재는 상기 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 나타내는 것인 방법.
  13. 옥수수 식물, 옥수수 종자, 또는 옥수수 세포로부터 유래된 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 방법이며,
    a) 상기 샘플을 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체와 접촉시키는 단계, 및
    b) 상기 샘플에서 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하며,
    상기 단백질에 대한 상기 항체의 결합은 상기 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 나타내는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 적어도, 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 제2 단백질에 대해 특이적인 제2 항체를 더 포함하는 방법.
  15. 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하기 위한 키트이며,
    서열번호:10에 특이적인 DNA 프로브,
    옥수수 이벤트 MON87429에 대해 진단하는 앰플리콘을 생산하는 한 쌍의 DNA 프라이머, 또는
    옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질에 대해 특이적인 적어도 하나의 항체
    를 포함하는 키트.
  16. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 및 서열번호:10으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 식물.
  17. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 및 서열번호:10으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 종자.
  18. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 및 서열번호:10으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 식물 세포.
  19. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 및 서열번호:10으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 식물 일부분.
  20. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 및 서열번호:10으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 상품(commodity product).
  21. 제16항에 있어서, 상기 식물이 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하는 식물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 식물이 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트에 대해 내성인 식물.
  23. 제17항에 있어서, 상기 종자가 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하는 종자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 종자가 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트에 대해 내성인 종자.
  25. 제18항에 있어서, 상기 식물 세포가 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하는 식물 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 식물 세포가 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트에 대해 내성인 식물 세포.
  27. 제19항에 있어서, 상기 식물 일부분이 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하는 식물 일부분.
  28. 제27항에 있어서, 상기 식물 일부분이 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트에 대해 내성인 식물 일부분.
  29. 작물-성장 지역에서 잡초를 방제하는 방법이며,
    a) 상기 작물-성장 지역에 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하여 옥수수를 심는 단계, 및
    b) 상기 옥수수를 손상시키지 않으면서 상기 지역에서 잡초를 방제하기 위해, 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소　(EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제의 유효량을 상기 작물-성장 지역, 또는 이것의 임의의 부분에 적용하는 단계
    을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 적어도 하나의 제초제의 유효량을 적용하는 것이 성장 시즌에 걸쳐 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2종 이상의 제초제를 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 적어도 하나의 제초제의 유효량을 적용하는 것이 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 제초제를 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 디캄바의 유효량이 성장 시즌에 걸쳐 디캄바 약 0.5 lb ae/에이커 내지 약 2 lb ae/에이커인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 글루포시네이트의 유효량이 성장 시즌에 걸쳐 약 0.4 lb ai/에이커 내지 약 1.59 lb ai/에이커인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 2,4-D의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.75 lb ae/에이커 내지 1.0 lb ae/에이커인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 퀴잘로포프의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.034 lb ai/에이커 내지 약 0.083 lb ai/에이커인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 할록시포프의 유효량은 성장 시즌에 걸쳐 약 0.018 ai/에이커 내지 약 0.07 lb ai/에이커인 방법.
  37. 지역에서 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자생 옥수수를 방제하는 방법이며, 적어도 하나의 사이클로헥산디온 (DIM) 제초제의 제초적 유효량을 적용하는 것을 포함하고, 상기 제초제 적용은 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 옥수수의 성장을 방지하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 적어도 하나의 사이클로헥산디온 (DIM) 제초제의 제초적 유효량을 적용하는 것이 클레소딤, 세톡시딤, 및 트랄콕시딤으로 구성되는 군으로부터 선택된 사이클로헥산디온 (DIM) 제초제를 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  39. 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하는 식물을 생산하는 방법이며,
    a) 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 식물을 그 자체 또는 제2 식물과 교배하여 종자를 생산하는 단계, 및
    b) 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 것이,
    a) 자손 식물을 생산하도록 자손 종자를 성장시키는 단계,
    b) 자손 식물을 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제의 유효량으로 처리하는 단계, 및
    c) 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대해 내성인 자손 식물을 선택하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 것이 상기 자손 종자로부터 유래된 샘플에서 옥수수 이벤트 MON87429의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 옥수수 이벤트 MON87429를 포함하는 자손 종자를 동정하는 것이 상기 자손 종자로부터 유래된 샘플에서의 옥수수 이벤트 MON87429에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  43. 잡종 종자를 생산하는 방법이며,
    a) 서열번호:10을 포함하는 식물을 성장시키는 단계,
    b) 상기 식물의 웅성 생식 조직의 발달 이전에 또는 그 동안에 유효량의 글라이포세이트를 적용함으로써 상기 식물에서 웅성-불임을 유도하는 단계,
    c) 상기 식물을 제2 식물로부터의 꽃가루로 수정시키는 단계, 및
    d) 상기 식물로부터 잡종 종자를 수확하는 단계
    를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 유효량의 글라이포세이트를 적용하는 것이 약 0.5 lb ae/에이커 내지 약 2.5 lb ae/에이커의 유효량으로 상기 발달 이전에 또는 그 동안에 글라이포세이트의 적용을 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 유효량의 글라이포세이트를 적용하는 것이 옥수수 식물 발달의 V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, 및 V14 단계로 구성되는 군으로부터 선택된 발달 단계에서 상기 글라이포세이트를 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  46. 제43항의 방법에 의해 생산되며, 서열번호:10을 포함하는 잡종 종자.
  47. 옥수수 이벤트 MON87429에 대한 식물의 접합형식을 결정하는 방법이며,
    a) 식물로부터 유래된 DNA를 포함하는 샘플을,
    옥수수 이벤트 MON87429의 존재에 대해 진단하는 제1 앰플리콘 및
    옥수수 이벤트 MON87429를 포함하지 않는 야생형 옥수수 게놈 DNA에 대해 진단하는 제2 앰플리콘
    을 생성할 수 있는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계,
    b) 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계, 및
    c) 상기 제1 앰플리콘 및 상기 제2 앰플리콘을 검출하는 단계이며,
    상기 앰플리콘 둘 모두의 존재는 상기 샘플이 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 이종접합성임을 나타내고,
    제1 앰플리콘 단독의 존재는 상기 샘플이 옥수수 이벤트 MON87429에 대해 동종접합성임을 나타내는 것인
    단계
    를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 프라이머 세트가 서열번호:11 및 서열번호:12를 포함하는 것인 방법.
  49. 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하는, 옥수수 식물에서의 내성을 개선하는 방법이며,
    a) 4개의 발현 카세트를 포함하는 DNA 작제물을 수득하는 단계이며,
    i) 제1 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) 에리안서스 라벤나에로부터의 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론,
    (II) 포스피노트리신 N-아세틸전달효소 코딩 서열, 및
    (III) 세타리아 이탈리카로부터의 푸룩토스-비스포스페이트 알돌라아제 3' UTR
    을 포함하고,
    ii) 제2 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) 코익스 라크리마-요비로부터의 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론,
    (II) 아라비돕시스 탈리아나로부터의 알비노 및 옅은 녹색 6 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열,
    (III) 디캄바 모노옥시게나제 코딩 서열, 및
    (IV) 오리자 사티바로부터의 메탈로티오네인-유사 단백질 3' UTR
    을 포함하고,
    iii) 제3 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) 아룬도 도낙스로부터의 유비퀴틴 프로모터, 리더, 및 인트론,
    (II) 아라비돕시스 탈리아나로부터의 말레이트 탈수소효소 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열,
    (III) FT_T 단백질 코딩 서열, 및
    (IV) 오리자 사티바로부터의 무 정단 분열조직 단백질 3' UTR
    을 포함하고,
    iv) 제4 발현 카세트는 작동가능한 연결로
    (I) CaMV 35S 프로모터 및 리더,
    (II) 트리티쿰 아에스티범으로부터의 클로로필 a/b-결합 단백질 리더,
    (III) 오리자 사티바로부터의 액틴 1 인트론,
    (IV) 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ShkG 엽록체 전달 펩타이드 코딩 서열,
    (V) 아그로박테리움 sp 균주 CP4로부터의 글라이포세이트 내성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 코딩 서열,
    (VI) 지아 메이스로부터의 웅성 조직 특이적 siRNA 표적, 및
    (VII) 오리자 사티바로부터의 글리신-풍부 RNA 결합 단백질 3' UTR
    을 포함하는 것인 단계,
    b) 상기 DNA 작제물을 옥수수 세포의 게놈에 삽입하는 단계,
    c) 상기 옥수수 세포를 옥수수 식물로 재생시키는 단계, 및
    d) 상기 DNA 작제물을 포함하는 옥수수 식물을 선택하는 단계
    를 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 선택이 퀴잘로포프, 할록시포프, 디캄바, 2,4-D, 글루포시네이트, 및 글라이포세이트로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제의 유효량으로 상기 옥수수 식물을 처리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  51. 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하고, 제49항의 방법에 의해 얻을 수 있으며, 상기 DNA 작제물을 포함하는 옥수수 식물.
  52. 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하고, 제49항의 방법에 의해 얻을 수 있으며, 상기 DNA 작제물을 포함하는 옥수수 종자.
  53. 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOP) 그룹 중 아세틸 CoA 카복실라제 (ACCase)의 억제제, 합성 옥신, 글루타민 합성효소의 억제제, 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제초제에 대한 내성을 포함하고, 제49항의 방법에 의해 얻을 수 있으며, 상기 DNA 작제물을 포함하는 옥수수 세포.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS61292B1 (sr) 2011-07-01 2021-02-26 Monsanto Technology Llc Postupci i jedinjenja za selektivnu regulaciju ekspresije belančevina
WO2017015043A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression
EP3751987A4 (en) 2018-02-15 2021-11-10 Monsanto Technology LLC IMPROVED HYBRID CORN SEED PRODUCTION PROCESSES
UY38097A (es) 2018-02-15 2019-10-01 Monsanto Technology Llc Gestión mejorada de maíz a través de sistemas semienanos

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120246763A1 (en) 2011-03-25 2012-09-27 Stanislaw Flasinski Plant regulatory elements and uses thereof
US20130031672A1 (en) 2010-01-14 2013-01-31 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2738474C (en) 2008-09-29 2020-05-12 Monsanto Technology Llc Soybean transgenic event mon87705 and methods for detection thereof
ES2866126T3 (es) 2009-09-17 2021-10-19 Monsanto Technology Llc Evento transgénico de soja MON 87708 y procedimientos de uso del mismo
RU2764586C2 (ru) 2009-11-23 2022-01-18 Монсанто Текнолоджи Ллс Трансгенное событие mon 87427 маиса и относительная шкала развития
CN103597079B (zh) 2011-03-30 2017-04-05 孟山都技术公司 棉花转基因事件mon88701及其使用方法
RS61292B1 (sr) 2011-07-01 2021-02-26 Monsanto Technology Llc Postupci i jedinjenja za selektivnu regulaciju ekspresije belančevina
WO2013169923A2 (en) * 2012-05-08 2013-11-14 Monsanto Technology Llc Corn event mon 87411
PE20161403A1 (es) 2014-03-20 2016-12-29 Monsanto Technology Llc Evento de maiz transgenico mon 87419 y metodos para su uso
AU2015333935B2 (en) 2014-10-15 2019-12-05 Monsanto Technology Llc Herbicide tolerance genes and methods of use thereof
WO2017015043A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130031672A1 (en) 2010-01-14 2013-01-31 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
US20120246763A1 (en) 2011-03-25 2012-09-27 Stanislaw Flasinski Plant regulatory elements and uses thereof

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