KR102249981B1

KR102249981B1 - 단클론성 항-gpc-1 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102249981B1
Application number: KR1020177013513A
Authority: KR
Inventors: 더글러스 캠벨; 아이린 저스티니아노 푸엔마요르; 알린 노콘; 줄리 순; 콰 트루옹; 브래들리 월시; 산드라 위스뮬러
Original assignee: 미노믹 인터내셔널 리미티드
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2021-05-11
Also published as: JP6749901B2; KR20170085051A; WO2016061608A1; EP3209686B1; US20180072803A1; CA2964179C; CN107108734B; EP3209686A1; CN107108734A; DK3209686T3; CA2964179A1; EP3209686A4; AU2014409558B2; WO2016061608A8; ES2778100T3; US10577418B2; SG11201703006QA; JP2017531442A; AU2014409558A1; AU2014409558A8

Abstract

본 출원은, BLCA 38 항체가 실질적으로 2개의 개별 단클론성 항체를 포함하는 항체 집단이라는 발견에 기초한 발명에 관한 것이다. 청구항은, 특이적 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 의하여 획정된 제1 항체 및/또는 항원-결합 단편을 포함하는 단리된 항체 집단을 획정하며, 상기 항체 집단은 특이적 경쇄 가변 영역에 의하여 획정된 제2 항체를 함유하지 않는다. 청구항은 또한, 상기 항체 집단을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포, 상기 항체 집단을 포함하는 조성물, 이의 상기 항체, 벡터, 숙주 세포를 암호화하는 핵산 분자 및 본 발명의 항체 집단을 생산하기 위한 방법을 획정한다.

Description

단클론성 항-GPC-1 항체 및 이의 용도{MONOCLONAL ANTI-GPC-1 ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 일반적으로 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 단클론성 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

암은 사망 원인의 대부분을 차지하는 폐, 유방암, 대장암, 위암 및 전립선암으로 전 세계의 주요 사망 원인이다. 전립선암은 남성에게 가장 흔하게 발생하는 종양이며 사망률이 폐암에 이어 두 번째이다. 전립선암이 조기에 진단되면 수술 및/또는 방사선 치료를 통한 치료가 많은 환자에서 성공적이다. 그러나 진행성 질환을 앓고 있는 많은 환자 및 전립선암 환자의 상당 부분이 결국 국소 치료 후에 전이성 질환으로 발전한다.

항체(Ab)는 결합 특이성/친화성 및 동종 항원과의 상호 작용시 작동자 특성에 대한 가능성으로 인해 표적 치료 및 진단 분야의 주요 도구이다. 많은 Ab들이 의학적 용도로 승인되었고 많은 것들이 임상 평가 중이다. 항체는 전립선암과 같은 질환의 소지가 있는 환자를 확인하고/하거나 이러한 전립선암을 진단하는 데 효과적인 진단 방법이 될 수 있다. 또한, 일부 항체의 치료적 사용은 종양 크기를 감소시키고 감염 환자의 생존을 연장시키는 것으로 나타났다.

US 5,622,836(워커(Walker) 등)은 BLCA-38(BLCA-"방광암")이라는 항체를 개시하고 있다. 이 문헌은 BLCA-38이 방광암 세포에서 발현되는 미지의 항원에 특이적인 단클론성 항체임을 교시한다. BLCA-38은 또한 인간의 난소와 대장암 세포주뿐만 아니라 일부 흑색종 세포주에 대한 특이성을 보이지만 림프계(T 림프계 또는 B 림프계) 및 백혈병 세포주에 대해서는 그러하지 않음을 교시하고 있다.

이어서, 러셀(Russell) 등은 2004년에 "전립선암에 대한 멜리틴-유사 펩티드 101을 함유하는 면역접합체의 세포독성: 시험관내 및 생체내 연구"를 발표했다. 문헌[Cancer Immunol Immunother 2004: 53(5): 411-421]은 BLCA-38을 사용하여 전립선암 세포에 대한 세포독성 펩티드를 표적으로 하는 연구를 발표했다. 이 문헌의 저자들은 BLCA-38이 사람의 방광암 세포주인 UCRU-BL-17CL에 대해 생성된 마우스 단클론성 항체임을 시사한다.

러셀 등은 2004년에 "전립선암 검출을 위한 단클론성 항체 BLCA38의 면역조직화학적 특성"에 대해 추가로 발표했다. 문헌[Cancer Immunol Immunother 2004: 53: 995-1004]은 또한 BLCA-38이 방광암 세포, 전립선암 세포 및 외음부 표피 세포에 결합할 수 있지만 유방암 세포에는 결합할 수 없는 인간 방광 세포주에 대해 생성된 마우스 단클론성 항체임을 교시한다. 이 문헌은 BLCA-38이 특성화하거나 동정하기 어려운 약 30 kDa 크기의 항원에 특이적임을 지적했다.

카터(Carter) 등은 2004년에 "새로운 전립선암 지향 항체인 BLCA38의 손상되지 않은 단클론성 항체 및 단편의 생체분포"에 대해 발표했다. 문헌[Cancer Immunol Immunother 2004: 53:533-542]은 BLCA-38을 사용하여 치료제를 전립선암 세포에 표적화하기 위한 타이밍 및 투약량을 분석하였으며, 이는 또한 세포 표면 및 세포질 상에 발현되는 약 30 kDa의 항원을 표적으로 하는 마우스 단클론성 항체임을 나타낸다. 이 문헌의 저자들은 상기 항원의 성질이 파악하기 어려우며 방광 및 전립선암 세포에서 발현되는 것을 언급하고 있다.

카트리(Khatri) 등은 2010년에 "전립선암에 대한 조직-특이적 유전자 전달을 위한 표적화 항체로서의 BLCA38의 유망성"에 대해 발표했다. 문헌[Austral-Asian J. Cancer 2010: 9(3): 195-203]은 BLCA-38이 전립선암 세포에 특이적인 마우스 단클론성 항체임을 재확인했다. 이 문헌의 저자들은 BLCA-38이 항원과의 결합시 내재화되지 않았지만, 바이러스와의 접합으로 항체의 내재화를 촉진하여 리포터 유전자의 발현을 증가시키는 것을 밝혀냈다.

항체가 진단 및 치료제로서 유망함에도 불구하고, 전립선암을 비롯한 다양한 형태의 암을 진단 및/또는 치료하는 더욱 효과적인 약제에 대한 필요성은 계속 존재하고 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 상기 종래 기술에서 언급되고 사용된 BLCA-38 항체가 지적한 바와 같이 이산형(discrete) 단클론성 항체가 아니라, 혼합된 집단에서 2개의 뚜렷한 단클론성 항체의 조합이라는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 BLCA-38 항체를 생성하는 데 사용된 하이브리도마(이의 대표적인 샘플이 미국 조직유형 배양 컬렉션(American Tissue Type Culture Collection)에 수탁 번호 HB11785로 기탁되어 있음)가 적어도 2개의 이산형 항체 종을 생성하는 하이브리도마 세포들의 혼합 집단이라고 결정하였다. 이들 항체 종들 중 하나만이 암세포의 일부 형태상에 존재하는 관련 표적 항원에 결합할 수 있지만, 두 번째 종은 결합할 수 없다.

종래 기술에서 언급된 바와 같은 BLCA-38이 혼합된 하이브리도마/항체 집단을 나타낸다는 예상치 못한 결정은 다양한 형태의 암에서 표적 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체의 단일 집단을 생성할 수 있는 단클론성 하이브리도마의 생성을 촉진시켰다. 무효 항체의 불필요한 생성 및 적용을 회피하는 것 외에, 본 명세서의 실시예에 제공된 데이터는 본 발명에 따른 단클론성 하이브리도마/단일 단클론성 항체의 사용이 동등한 양의 항체가 적용되는 경우 종래 기술의 혼합 집단에 비해 더 강한 신호의 생성을 가능하게 할 수 있음을 나타낸다.

제1 구현예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 (a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 3의 위치 50 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 3의 위치 69 내지 85에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 3의 위치 118 내지 126에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고; (b) 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 4의 위치 44 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 4의 위치 70 내지 76에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 4의 위치 109 내지 117에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.

단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호: 3의 잔기 20 내지 49, 서열 번호: 3의 잔기 55 내지 68, 서열 번호: 3의 잔기 86 내지 117 및/또는 서열 번호: 3의 잔기 127 내지 137 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 서열에 의해 정의되는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역) 및/또는 (b) 서열 번호: 4의 잔기 21 내지 43, 서열 번호: 4의 잔기 55 내지 69, 서열 번호: 4의 잔기 77 내지 108 및/또는 서열 번호: 4의 잔기 118 내지 127 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 서열에 의해 정의되는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역)을 추가로 포함할 수 있다.

단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호: 3의 위치 138 내지 461으로 정의된 중쇄 불변 도메인 서열; (b) 서열 번호: 4의 위치 128 내지 234에 의해 정의된 경쇄 불변 도메인 서열; (c) 힌지(hinge) 영역 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다.

항체는 IgG 이소타입(isotype) 항체일 수 있다. 이 항체는 IgG1 이소타입 항체일 수 있다. 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.

검출 가능한 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 비오틴 또는 아비딘 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

항체는 단클론성 항체, 인간화 항체, 키메라(chimeric) 항체, 다량체(multimeric) 항체 및/또는 합성 항체 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

항체는 이중-특이적 항체, 항체, 아비바디(avibody), 디아바디(diabody), 트리바디(tribody), 나노바디(nanobody), 단일 도메인 항체, VHH 도메인, 인간 항체, 완전 인간화 항체, 부분적으로 인간화된 항체, 안티칼린(anticalin), 애넥틴(adnectin) 또는 아피바디(affibody)일 수 있다.

항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 키메라 항체일 수 있으며, 여기서, (a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 9의 위치 50 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 9의 위치 69 내지 85에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 9의 위치 118 내지 126에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고; (b) 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 10의 위치 44 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 10의 위치 70 내지 76에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 10의 위치 109 내지 117에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.

항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 키메라 항체일 수 있으며, 여기서, (a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 9의 위치 50 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 9의 위치 69 내지 85에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 9의 위치 118 내지 126에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고; (b) 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 10의 위치 44 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 10의 위치 70 내지 76에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 10의 위치 109 내지 117에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.

항체는 (a) 서열 번호: 9의 잔기 20 내지 467에 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄; 및 (b) 서열 번호: 10의 잔기 21 내지 234에 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄를 포함하는 키메라 항체일 수 있다.

항체는 (a) 서열 번호: 9의 잔기 20 내지 467에 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄; 및 (b) 서열 번호: 10의 잔기 21 내지 234에 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄를 포함하는 키메라 항체일 수 있다.

키메라 항체는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 비오틴 또는 아비딘 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

항원 결합 단편은 단일 쇄 가변 단편(scFv), 가변 도메인(Fv) 단편, 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab)2 단편, 펩티드 또는 에피토프 결합 영역을 함유하는 단백질분해성 단편 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

항체는 서열 번호: 3의 위치 20 내지 461에 의해 정의된 중쇄 서열 및 서열 번호: 4의 위치 21 내지 234에 의해 정의된 경쇄 서열을 포함할 수 있다.

제2 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예에서 정의된 바와 같은 변이체 또는 유도체 및 항체가 동일한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 제1 구현예에서 정의된 항체의 단리된 항원 결합 변이체 또는 항체의 유도체를 제공한다.

변이체 또는 유도체의 임의의 하나 이상의 중쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 아미노산 서열 및/또는 변이체 또는 유도체의 임의의 하나 이상의 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 아미노산 서열은, 제1 구현예에서 정의된 항체에 존재하는 아미노산의 달리 상응하는 CDR 서열에 의해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다.

단리된 변이체 또는 유도체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서, (a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 3의 위치 50 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 3의 위치 69 내지 85에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 3의 위치 118 내지 126에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고; (b) 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 4의 위치 44 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1); 서열 번호: 4의 위치 70 내지 76에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2); 서열 번호: 4의 위치 109 내지 117에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.

변이체 또는 유도체는 (a) 서열 번호: 3의 잔기 20 내지 49와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성; 서열 번호: 3의 잔기 55 내지 68과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성; 서열 번호: 3의 잔기 86 내지 117과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역 FR로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역); 및/또는 (b) 서열 번호: 4의 잔기 21 내지 43과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성; 서열 번호: 4의 잔기 55 내지 69와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성; 서열 번호: 4의 잔기 55 내지 69와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성; 서열 번호: 4의 잔기 77 내지 108과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성; 서열 번호: 4의 잔기 118 내지 127과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 FR로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역)을 포함할 수 있다.

변이체 또는 유도체는 (a) 서열 번호: 3의 위치 138 내지 461에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 불변 도메인 서열; (b) 서열 번호: 4의 위치 128 내지 234에 의해 정의된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 불변 도메엔 서열; (c) 힌지 영역 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 변이체 또는 유도체는 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다.

상기 변이체 또는 유도체는 IgG 이소타입 항체일 수 있다. 단리된 항체 변이체 또는 유도체는 IgG1 이소타입 항체일 수 있다.

변이체 또는 유도체는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.

변이체 또는 유도체는 단클론성 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다량체 항체 및/또는 합성 항체 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

제3 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예에서 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제2 구현예에서 정의된 바와 같은 항원 결합 변이체 또는 유도체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포를 제공한다.

하이브리도마 세포는 2014년 8월 22일 호주 세포 은행(Cellbank)에 기탁되어 수탁 번호 CBA20140026으로 할당된 세포일 수 있다.

제4 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예에서 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단일 종 또는 제2 구현예에서 정의된 항원 결합 변이체 또는 유도체의 단일 종을 생성할 수 있는 하이브리도마 세포의 단일 종을 포함하는 세포 배양물을 제공한다.

하이브리도마 세포는 수탁 번호 CBA20140026 하에 호주 세포 은행에 기탁될 수 있다.

제5 구현예에서, 본 발명은 다수 종의 하이브리도마 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하며, 여기서, (a) 세포 배양물은 제3 구현예에서 정의된 바와 같은 하이브리도마 세포를 포함하고; 및 (b) 세포 배양물은 하기 중 임의의 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 포함하지 않는다:

서열 번호: 6의 위치 48 내지 58에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 1(CDR1);

서열 번호: 6의 위치 74 내지 80에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 2(CDR2);

서열 번호: 6의 위치 113 내지 121에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 3(CDR3).

세포 배양물은 서열 번호: 6의 잔기 25 내지 47, 서열 번호: 6의 잔기 81 내지 112; 서열 번호: 6의 122 내지 131 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 서열에 의해 정의된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역)을 포함하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 포함하지 않을 수 있다.

세포 배양물 중의 하이브리도마 세포의 다수 종은 각각 제1 구현예에서 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단일 종 또는 제2 구현예에서 정의된 항원 결합 변이체 또는 유도체의 단일 종을 생성할 수 있다.

제6 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예에서 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단일 종, 또는 제2 구현예에서 정의된 항원 결합 변이체 또는 유도체의 단일 종을 포함하는 조성물을 제공한다.

제7 구현예에서, 본 발명은 상이한 항체 종 또는 이의 항원 결합 단편의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, (a) 상기 조성물은 제1 구현예에서 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단일 종, 또는 제2 구현예에서 정의된 항원 결합 변이체 또는 유도체의 단일 종을 포함하고; (b) 상기 조성물은 하기 중 임의의 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하지 않는다:

상이한 항체 종 또는 이의 항원 결합 단편의 혼합물은 각각 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다.

제8 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예에서 정의된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제2 구현예에서 정의된 항원 결합 변이체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

핵산 분자는 서열 번호: 1에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

핵산 분자는 서열 번호: 2에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 변이체 또는 유도체는 각각 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다.

제9 구현예에서, 본 발명은 제8 구현예에서 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

제10 구현예에서, 본 발명은 제9 구현예에서 정의된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

제11 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예에서 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제2 구현예에서 정의된 바와 같은 항원 결합 변이체 또는 유도체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 방법은 적절한 조건하에서 배양 배지에서 제3 구현예에서 정의된 바와 같은 하이브리도마 세포 또는 제10 구현예에서 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 변이체 또는 유도체를 제조하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 배양물로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 변이체 또는 유도체를 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

제12 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예에서 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제2 구현예에서 정의된 바와 같은 항원 결합 변이체 또는 유도체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 방법은 적절한 조건하에서 제4 또는 제5 구현예에서 정의된 바와 같은 세포 배양물을 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 변이체 또는 유도체를 생성하는 단계를 포함한다.

제13 구현예에서, 본 발명은 제11 또는 제12 구현예에서 정의된 바와 같은 방법으로부터 수득되거나 수득가능한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 변이체 또는 유도체를 제공한다.

항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 변이체 또는 유도체는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.

제14 구현예에서, 본 발명은 혼합된 하이브리도마 집단으로부터 제3 구현예에서 정의된 바와 같은 하이브리도마 세포를 수득하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 혼합된 하이브리도마 집단으로부터 하이브리도마 세포의 적어도 일부를 단리하는 단계를 포함한다.

상기 단리는 혼합된 하이브리도마 집단의 개별적인 하이브리도마 세포를 클로닝하고, 클론 자손이 제1 구현예에서 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제2 구현예에서 정의된 바와 같은 항원 결합 변이체 또는 유도체를 생성할 수 있는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

혼합된 하이브리도마 집단은 ATCC에 수탁 번호 HB11785로 기탁될 수 있다.

제15 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항원 결합 변이체 또는 유도체, 키메라 항체 또는 하이브리도마 세포 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다.

하이브리도마 세포는 호주 세포 은행에 수탁 번호 CBA20140026으로 기탁될 수 있다.

키트는 단편화된 키트 또는 조합된 키트일 수 있다. 키트는 세포 배양용 시약, 기준 샘플, 완충액, 표지 및 키트의 성분을 사용하여 분석을 수행하기 위한 서면 지시사항으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다.

제16 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항원 결합 변이체 또는 유도체, 키메라 항체 또는 하이브리도마 세포 중 임의의 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

제17 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 GPC-1의 발현을 검출 및/또는 정량하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 대상체로부터 세포, 조직 샘플 및/또는 체액 샘플을 수득하는 단계; (b) 세포, 조직 샘플 및/또는 체액 샘플을 본 발명에 따른 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 변이체, 항체 유도체 또는 키메라 항체와 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키메라 항체의 상기 대상체의 세포, 조직 샘플 또는 체액 샘플에 대한 결합을 결정 및/또는 정량화하는 단계를 포함한다.

대상체로부터 수득한 세포, 조직 및/또는 체액 샘플에서 검출된 GPC-1 발현 수준을 대조군 세포 샘플 또는 GPC-1 발현 수준의 샘플 집단 참조군과 비교할 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군 또는 참조군과 비교하여 대상체에서의 증가된 GPC-1 발현을 결정하는 것은 대상체에서 질환의 진단 또는 질환을 유발할 가능성이 증가된 것일 수 있다. 질환은 전립선암일 수 있다.

검출용 GPC-1은 세포 표면상에 존재하고/하거나 내부적으로 발현될 수 있다. 체액은 소변, 혈액 또는 이들의 성분(예를 들어, 혈청 또는 혈장)일 수 있다. 세포 또는 조직 샘플은 전립선 세포 또는 전립선 조직일 수 있다.

항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키메라 항체는 본 발명에 따른 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다. 하이브리도마 세포는 수탁 번호 CBA20140026하에 호주 세포 은행에 기탁될 수 있다.

제18 구현예에서, 본 발명은 잠재적으로 GPC-1을 함유할 수 있는 세포, 조직 샘플 또는 체액 샘플에 적용될 수 있는 GPC-1에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론성 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키메라 항체의 단일 종을 포함하는 용액을 제공한다. 단일 종은 호주 세포 은행에 수탁 번호 CBA20140026으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다.

제19 구현예에서, 본 발명은 잠재적으로 GPC-1을 함유할 수 있는 세포, 조직 샘플 또는 체액 샘플에 적용될 수 있는 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키메라 항체의 다수 종을 포함하는 용액을 제공하며, 여기서, 상기 용액 중의 다수 종의 적어도 1종은 GPC-1에 특이적으로 결합할 수 있다. GPC-1에 특이적으로 결합할 수 있는 종은 호주 세포 은행에 수탁 번호 CBA20140026으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다. 다수 종을 포함하는 용액은 하기 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하지 않을 수 있다:

서열 번호: 6의 48 내지 58에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 1(CDR1);

서열 번호: 6의 74 내지 80에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 2(CDR2);

서열 번호: 6의 113 내지 121에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 3(CDR3).

본 발명은 또한 하기 구현예에 관한 것이다:

구현예 1: 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단리된 항체 집단으로서, 제1 항체는,

(a) 서열 번호: 3의 위치 50 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 1(CDR1);

서열 번호: 3의 69 내지 85에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 2(CDR2);

서열 번호: 3의 위치 118 내지 126에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)

을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) 서열 번호: 4의 44 내지 54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 1(CDR1);

서열 번호: 4의 위치 70 내지 76에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 2(CDR2);

서열 번호: 4의 위치 109 내지 117에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 3(CDR3)

을 포함하는 경쇄 가변 영역

을 포함하고,

상기 항체 집단은,

서열 번호: 6의 113 내지 121에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 3(CDR3)

을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항체를 함유하지 않는다.

구현예 2: 구현예 1에 있어서, 항체 집단이 제2 항체의 항원-결합 단편을 함유하지 않는, 항체 집단.

구현예 3: 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는, 항체 집단.

구현예 4: 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이 IgG1 이소타입(isotype)인, 항체 집단.

구현예 5: 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이 단클론성(monoclonal) 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다량체 항체 및/또는 합성 항체 중 임의의 하나 이상인, 항체 집단.

구현예 6: 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 항원 결합 단편이 단일 쇄 가변 단편(scFv), 가변 도메인(Fv) 단편, 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab)2 단편, 펩티드 또는 에피토프 결합 영역을 함유하는 단백질분해성 단편 중 임의의 하나 이상인, 항체 집단.

구현예 7: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이,

(a) 서열 번호: 3의 잔기 20 내지 49, 서열 번호: 3의 잔기 55 내지 68, 서열 번호: 3의 잔기 20 86 내지 117, 서열 번호: 3의 잔기 127 내지 137 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 서열에 의해 정의된 하나 이상의 중쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역); 및/또는

(b) 서열 번호: 4의 잔기 21 내지 43, 서열 번호: 4의 잔기 55 내지 69, 서열 번호: 4의 잔기 77 내지 108, 서열 번호: 4의 잔기 118 내지 127 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 서열에 의해 정의된 하나 이상의 경쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역)을 추가로 포함하는, 항체 집단.

구현예 8: 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이,

(a) 서열 번호: 3의 위치 138 내지 461에 의해 정의된 중쇄 불변 도메인 서열;

(b) 서열 번호: 4의 위치 128 내지 234에 의해 정의된 경쇄 불변 도메인 서열;

(c) 힌지 영역

중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하는, 항체 집단.

구현예 9: 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 제1 항체가 서열 번호: 3의 위치 20 내지 461에 의해 정의된 중쇄 서열 및 서열 번호: 4의 위치 21내지 234에 의해 정의된 경쇄 서열을 포함하거나 이로 구성된, 항체 집단.

구현예 10: 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 집단을 생성할 수 있는 하이브리도마 세포.

구현예 11: 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 집단을 생성할 수 있는 단일 종의 하이브리도마 세포를 포함하는 세포 배양물로서, 상기 항체 집단이 하나의 종의 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편만을 함유하는, 세포 배양물.

구현예 12. 하이브리도마 세포가 수탁 번호 CBA20140026하에 호주 세포 은행에 기탁된, 구현예 9에 따른 하이브리도마 세포 또는 구현예 10에 따른 세포 배양물.

구현예 13. 다수 종의 하이브리도마 세포를 포함하는 세포 배양물로서,

(a) 세포 배양물이 구현예 10 또는 구현예 12에 따른 하이브리도마 세포를 포함하고;

(b) 세포 배양물이,

서열 번호: 6의 위치 113 내지 121에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상보성 결정 영역 3(CDR3)

중 임의의 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 포함하지 않는, 세포 배양물.

구현예 14: 구현예 13에 있어서, 세포 배양물이 서열 번호: 6의 잔기 25 내지 47, 서열 번호: 6의 잔기 59 내지 73, 서열 번호: 6의 잔기 81 내지 112, 서열 번호: 6의 잔기 122 내지 131 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 서열에 의해 정의된 바와 같은 하나 이상의 경쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역)을 포함하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 포함하지 않는, 세포 배양물.

구현예 15: 항체 집단이 하나의 종의 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편만을 함유하는, 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 집단을 포함하는 조성물.

구현예 16: 항체 집단이 다수 종의 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는, 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 집단을 포함하는 조성물.

구현예 17: 다수 종의 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 구현예 16에 따른 조성물.

구현예 18: 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자.

구현예 19: 핵산 분자가 서열 번호: 1에 정의된 서열을 포함하거나 이로 구성되는 구현예 18에 따른 핵산 분자.

구현예 20: 핵산 분자가 서열 번호: 2에 정의된 서열을 포함하거나 이로 구성되는 구현예 18 또는 구현예 19에 따른 핵산 분자.

구현예 21: 구현예 18 내지 20 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.

구현예 22: 구현예 21에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.

구현예 23: 구현예 10 또는 12에 따른 하이브리도마 세포 또는 구현예 22에 따른 숙주 세포를 적합한 조건하에 배양 배지에서 배양하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법.

구현예 24: 구현예 11 내지 14 중 어느 하나의 세포 배양물을 적합한 조건하에 배양하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성시키는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법.

구현예 25: 구현예 23 또는 24에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 배양물로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

구현예 26: 구현예 23 내지 25 중 어느 하나에 따른 방법으로부터 수득되거나 수득가능한 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

구현예 27: 혼합된 하이브리도마 집단으로부터 구현예 10 또는 구현예 12에 따른 하이브리도마 세포를 수득하는 방법으로서, 상기 혼합된 하이브리도마 집단으로부터 하이브리도마 세포의 적어도 일부를 단리하는 단계를 포함하는 방법.

구현예 28: 구현예 27에 있어서, 상기 단리하는 단계가, 혼합된 하이브리도마 집단의 개별적인 하이브리도마 세포를 클로닝하고, 클론 자손이 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 항체 집단을 생성할 수 있는지를 결정하는 것을 포함하는, 방법.

구현예 29: 구현예 27 또는 28에 있어서, 혼합된 하이브리도마 집단이 ATCC에 수탁 번호 HB11785로 기탁되는, 방법.

구현예 30: 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이 키메라성인, 구현예 5에 따른 항체 집단.

구현예 31: 구현예 5 또는 30에 있어서, 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편이,

(a) 서열 번호: 9의 잔기 138 내지 467에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 불변 영역; 및

(b) 서열 번호: 10의 128 내지 234에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 불변 영역

을 포함하는 키메라성 항체인, 항체 집단.

구현예 32: 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 제1 항체 및/또는 이의 단편이 검출 가능한 표지를 포함하는, 항체 집단.

구현예 33: 구현예 32에 있어서, 검출가능한 표지가 형광 표지, 방사성 표지, 비오틴 또는 아비딘 중 임의의 하나 이상인, 항체 집단.

본 발명의 바람직한 구현예는 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 기술될 것이다.
도 1은 DU-145, C3 및 CA-HPV-10 세포주의 추출물에 대한 다양한 출처의 MIL-38 항체를 사용한 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 결과를 보여준다. 화살촉은 MIL-38 항원과 상이한 항체 제제의 동등한 반응성을 나타낸다. 화살표는 각각의 세 가지 제조 과정에서 중쇄와 경쇄의 이중 띠를 나타낸다. 약어: 37A = 인-하우스 MIL-38 항체 제제; "본래"(1-0) = ATCC 하이브리도마 세포(HB11785)로부터의 MIL-38 항체 제제; 40A = 인-하우스 하이브리도마 세포로부터의 MIL-38 항체 제제; 사이프로(Sypro) = 사이프로® 루비 단백질 젤 오염. 레인: 1(MW 마커); 2(DU145 MPEK 16/7/12); 3(C3 MPEK 20/4/12); 4(CA-HPV-10 MPEK 28/3/12); 5(-); 6(MW 마커); 7(DU145 MPEK 16/7/12); 8(C3 MPEK 20/4/12); 9(CA-HPV-10 MPEK 28/3/12); 10(MW 마커); 11(DU145 MPEK 16/7/12); 12(C3 MPEK 20/4/12); 13(CA-HPV-10 MPEK 28/3/12); 14(-); 15(MIL-38 제제 1 "본래"); 16(MIL-38 제제 40A); 17(MIL-38 제제 37A); 18(MW 마커).
도 2는 인-하우스 하이브리도마 스톡(AusMab(AusMAb) 하이브리도마 세포 클론 1)으로부터 유래된 MIL-38 항체 제제 또는 ATCC로부터의 본래 HB11785 하이브리도마 스톡(AusMab 하이브리도마 라인 3, 4 및 5)으로부터 재-클로닝된 세포로부터 유래된 MIL-38 항체 제제와 인-하우스 MIL-38 항체 제제 33A를 비교한 것이다. 도 2a는 SDS-PAGE 전기영동에 의한 각 항체 제제 중 중쇄 및 경쇄 성분의 분리를 도시한다. 레인: 1(매직 마커(Magic Marker)); 2(AusMab 1); 3(AusMab 3); 4(AusMab 4); 5(AusMab 5); 6(MIL-38 제제 33A); 7(블루 플러스 2 참조); 도 2b는 DU-145 및 C3 세포주로부터의 추출물에 대한 다양한 제제로부터의 MIL-38 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다.
도 3은 인-하우스에서 생성 및 저장되는 다양한 MIL-38 항체 제제의 비교를 보여준다(16A, 16B, 16C, 17B, 23A-1, 23A-2, 24A, 25A, 25B, 26B, 30A, 31A, 31B, 31C, 31D, 32B, 32C, 33A, 33B, 33C, 33D, 34A, 34B, 35A, 35C, 35D, 40A, 40B, AM-3, AM-4). 도 3a는 SDS-PAGE 전기영동에 의한 각 MIL-38 항체 제제 중 중쇄 및 경쇄 성분의 분리를 도시한다. 도 3b는 DU-145 세포 추출물 상의 각 제제로부터의 MIL-38 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다.
도 4는 MIL-38 항체 집단 분석의 결과를 나타낸다. 도 4a는 DU-145 및 C3 세포로부터의 추출물에 대한 본래 IIA, Alfio I, Alfio II, 36A 및 AusMAb 4(AM-4) MIL-38 항체 제제를 사용한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 도 4b SDS-PAGE 전기영동에 의한 MIL-38 항체 제제(원래의 IIA, Alfio I, Alfio II, 36A 및 AusMAb 4(AM-4))의 중쇄 및 경쇄 성분의 분리를 설명하는 환원성 사이프로겔(Syprogel)을 나타낸다. 본래 IIA = ATCC 수탁 번호 HB11785(뮤린 하이브리도마 BLCA-38)의 스톡으로부터 유도된 인-하우스 제제; Alfio I = ATCC 수탁 번호에서 유래된 혼합된 MIL-38 항체 집단. HB11785; Alfio II = ATCC 수탁 번호 Hb11785의 혼합된 집단으로부터 유도된 단일 항체 집단.
도 5는 MIL-38 항체의 다양한 제제를 사용한 면역형광 분석법으로부터의 이미지를 보여준다. 특히, 도 5a는 DU-145 세포상의 MIL-38 항체의 다양한 제제를 사용한 면역형광 분석법으로부터의 이미지를 보여준다. 파트 A, D, G, J 및 M은 염색된 세포의 명시야 이미지를 보여준다. 파트 B(AM-4), E(Alfio I), H(Alfio II) 및 K(본래 IIA)는 DU145 세포에 MIL-38 항체 제제의 결합을 나타낸다; 파트 N은 DU-145 세포에 대한 2차 항체 대조군을 보여준다. 파트 C, F, I, L 및 O는 세포의 DAPI 염색을 보여준다. 특히, 도 5b는 C3 세포상의 MIL-38 항체의 다양한 제제를 사용한 면역형광 분석법으로부터의 이미지를 보여준다. 파트 A, D, G, J 및 M은 염색된 세포의 명시야 이미지를 보여준다. 파트 B(AM-4), E(Alfio I), H(Alfio II) 및 K(본래 IIA)는 C3 세포에 MIL-38 항체 제제의 결합을 나타낸다; 파트 N은 C3 세포에 대한 2차 항체 대조군을 보여준다. 파트 C, F, I, L 및 O는 세포의 DAPI 염색을 보여준다.
도 6은 상이한 항체 제제를 포획 항체로서 사용하는 비교용 샌드위치 ELISA 결과를 나타낸다. 도 6a는 AM-3 및 AM-4를 포획 항체로 사용하는 비교용 샌드위치 ELISA를 나타낸다. 도 6b는 혼합된 제제(34A) 또는 클론성 집단(AM-4 1F5)을 포획 항체로 사용하는 비교용 샌드위치 ELISA를 나타낸다.
도 7은 키메라 MIL-38 항체의 SDS-PAGE(도 7a) 및 웨스턴 블롯(도 7b) 분석을 나타낸다. 레인 M = 단백질 마커; 레인 1 = 환원 조건; 레인 2 = 비-환원 조건; 레인 P = 인간 IgG1, 카파(Kappa)(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 15154)(양성 대조군).
도 8은 DU-145 세포상의 키메라 MIL-38 항체 및 대조군을 사용한 면역형광 분석법으로부터의 이미지를 보여준다. 도 8a-d는 염색된 세포의 결합된 명시야와 DAPI 이미지를 보여준다. 도 8e-h는 MIL-38 제제 33A(8E, 양성 대조군), 키메라 MIL-38(8F), 세툭시맙(8G, 인간 IgG1k에 대한 양성 대조군) 및 음성 대조군(8H, 번호 1˚ 항체)을 갖는 DU-145 세포의 염색을 보여준다.
도 9는 키메라 MIL-38 항체의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 9a는 뮤린 MIL-38의 DU-145 MPEK 추출물, C3 MPEK 추출물 및 NS0 생성 재조합 GPC-1 항원과의 반응성을 나타낸다. 도 9b는 키메라 MIL-38의 DU-145 MPEK 추출물, C3 MPEK 추출물 및 NS0 생성 재조합 GPC-1 항원과의 반응성을 나타낸다. 도 9c는 도 9b와 동등한 조건하에서 뮤린 MIL-38의 DU-145 MPEK 추출물, C3 MPEK 추출물 및 NS0 생성 재조합 GPC-1 항원과의 반응성을 나타낸다.

정의

본원에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "항체"라는 문구는 또한 다중 항체를 포함한다.

본원에 사용된 "포함하는"이라는 용어는 "등을 포함하는"을 의미한다. "포함하는"이라는 단어의 변형은 "포함한다" 및 "포함하는"과 같이 상응하는 의미가 다양하다. 따라서, 예를 들어 항체 A를 "포함하는" 샘플은 항체 A만으로 구성될 수 있거나 또는 하나 이상의 추가 성분(예를 들어, 항체 B)을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "다중"이라는 용어는 둘 이상을 의미한다. 특정 측면 또는 구현예에서, 다중이라는 용어는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51개 또는 그 이상 및 이에서 유도 가능한 임의의 정수 및 여기에서 유추할 수 있는 임의의 범위를 의미할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgM 및 IgY, 전체 항체 예를 들어 단일-쇄 전체 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 항원-결합 항체 단편은 비-제한적으로 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-쇄 Fvs(scFv), 단일-쇄 항체, 디설파이드-결합된 Fvs(sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 항체는 임의의 동물 기원 또는 적절한 생산 숙주로부터 유래될 수 있다. 단일-쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 영역을 단독으로 또는 힌지 영역 CH1, CH2 및 CH3 도메인의 전체 또는 부분과 조합하여 포함할 수 있다. 또한, 가변 영역/힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합이 포함된다. 항체는 생물학적 분자에 특이적으로 결합하는 단클론성, 폴리클로날, 키메라성, 다중 특이성, 인간화 및 인간 단클론성 및 폴리클로날 항체일 수 있다. 항체는 이중 특이적 항체, 아비바디, 디아바디, 트리바디, 테트라바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, VHH 도메인, 인간 항체, 완전 인간화된 항체, 부분적으로 인간화된 항체, 안티칼린, 애넥틴 또는 어피바디일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단클론성 항체"는 단일 항원성 에피토프를 인식하고, 동일한 항원성 에피토프에 특이적으로 결합하고 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지며, 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이의 잠재적 예외와 동일하다.

본원에 사용된 용어 "인간화(된) 항체"는 인간 항체뿐만 아니라 비-인간 항체(예를 들어, 뮤린 항체)로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 나타낸다. 예를 들어, 인간화 항체는 실질적으로 모두 하나 이상의 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 모든/실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든/실질적으로 모든 FR 부위는 인간 면역글로불린 서열로부터 기원한다. 인간화 항체는 임의로 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것일 수 있는 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "키메라(성) 항체"는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체를 지칭하고, 경쇄 및/또는 중쇄의 일부가 주어진/특정 종에서 유래된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체를 지칭하고, 나머지 쇄들은 다른 상이한 종으로부터 유래된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다. 예를 들어, 키메라 항체는 제1 종으로부터 유래하고 제2 종으로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 가변 영역을 포함할 수 있다. 키메라 항체는 예를 들어 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 단편으로부터 유전자 조작에 의해 제조될 수 있다.

본원에 사용된 "하이브리도마"라는 용어는 단일 결합 특이성의 단클론성 항체를 생성할 수 있는 불멸 세포(예를 들어, 다발성 골수종 세포) 및 항체-생성 세포(예를 들어, B 림프구)의 융합에 의해 생성된 세포를 의미한다.

본원에 사용된 항체, 항체 변이체, 항체 유도체, 항원 결합 단편 등과 관련된 용어 "특이적으로 결합하는"은 다른 비-표적 분자들보다 우선적으로 주어진 표적 분자에 결합하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 항체, 항체 변이체, 항체 유도체 또는 항원 결합 단편("분자 A")이 주어진 표적 분자("분자 B")에 "특이적으로 결합"할 수 있는 경우, 분자 A는 분자 B와 임의의 다른 잠재적인 대안적 결합 파트너를 구별할 수 있는 능력을 갖는다. 따라서, 잠재적인 결합 파트너와는 상이한 그러나 동일하게 접근가능한 복수의 분자에 노출될 때, 분자 A는 분자 B에 선택적으로 결합할 것이고, 다른 대안적인 잠재적인 결합 파트너는 분자 A에 실질적으로 결합되지 않을 것이다. 일반적으로, 분자 A는 분자의 다른 잠재적 결합 파트너보다 적어도 10배 이상, 바람직하게는 50배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상, 가장 바람직하게는 100배 이상 분자 B에 결합할 것이다. 분자 A는 약하고 검출 가능한 수준으로 분자 B가 아닌 분자에 결합할 수 있다. 이것은 일반적으로 배경 결합으로 알려져 있으며 예를 들어 적절한 대조군의 사용에 의해 분자 B-특이적 결합으로부로 쉽게 식별할 수 있다.

본원에 사용된 "대상체"란 용어는 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하여 경제적, 사회적 또는 연구가 중요한 모든 동물을 포함한다. 따라서, "대상체"는 예를 들어 인간 또는 비인간 포유동물과 같은 포유동물일 수 있다.

본원에 사용된 생물학적 분자(예를 들어 항체)와 관련하여 사용된 용어 "단리(된)"은 자연적으로 발생하는 성분의 적어도 일부가 없는 생물학적 분자이다.

본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 각각 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 구성된 중합체를 지칭하며 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는 전장 단백질 또는 전장 단백질의 일부를 구성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 염기, 리보뉴클레오타이드 염기, 공지된 유사체 또는 천연 뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물의 단일 또는 이중 가닥 중합체를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "키트(kit)"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 의미한다. 이러한 전달 시스템은 반응 시약의 저장, 운반 또는 전달을 허용하는 시스템(예를 들어, 적절한 용기에 표지, 참조 시료, 지지 물질 등) 및/또는 하나의 위치에서 다른 위치로의 지지 물질(예를 들어, 완충액, 분석 수행을 위한 서면 지시 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트에는 관련 반응 시약 및/또는 지지 물질이 들어 있는 상자와 같은 하나 이상의 인클로저(enclosure)가 포함될 수 있다. "키트"라는 용어는 단편화 키트와 조합 키트를 모두 포함한다. "단편화 키트"는 각각이 전체 키트 성분의 하위 부분을 함유하는 둘 이상의 분리된 용기를 포함하는 전달 시스템을 말한다. 용기는 의도된 수령인에게 함께 또는 개별적으로 전달될 수 있다. 각각이 전체 키트 성분의 하위 부분을 함유하는 둘 이상의 분리된 용기를 포함하는 임의의 전달 시스템은 용어 "단편화 키트"의 의미 내에 포함된다. "조합(된) 키트"는 반응 분석의 모든 성분을 단일 용기(예를 들어, 각각의 원하는 성분을 수용하는 단일 상자)에 함유하는 전달 시스템을 의미한다.

수치 값의 범위를 언급할 때 본원에서 "사이(내지)"라는 용어의 사용은 범위의 각 종점에서의 수치를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 10 내지 20 잔기의 길이를 갖는 폴리펩티드는 10 잔기 길이의 폴리펩티드 및 20 잔기 길이의 폴리펩티드를 포함한다.

본원의 선행 기술 문서 또는 이들 문서에서 파생된 진술은 해당 문서 또는 파생된 진술이 관련 기술의 통상적인 일반 지식의 일부임을 인정하는 것은 아니다. 설명을 위해, 본원에 언급된 모든 문헌은 달리 언급되지 않는 한 그 전체가 본원에 참고 문헌으로 포함된다.

상세한 설명

전립선암과 같은 다양한 형태의 암을 진단 및/또는 치료하기 위한 보다 효과적인 방법 및 약제에 대한 요구가 계속 존재하고 있다. 항체는 암에 유용한 진단 및 치료제이며, 혈액학적 악성 종양 및 고형 종양을 가진 환자를 진단하고 치료하는 데 성공적이고 중요한 수단이 되었다. 종양 특이적 항원을 표적으로 하는 새로운 관련 항체의 동정은 암 환자의 진단 및/또는 치료 결과를 향상시킬 수 있는 하나의 잠재적 수단을 제공한다. 이러한 결과가 향상될 수 있는 또 다른 방법은 기존의 항체 기반 진단 및/또는 치료법의 개선을 통한 것이다.

"BLCA-38 항체"는 방광암과 전립선암을 포함한 암의 진단 및/또는 치료에 대한 이전 연구의 주제였다. 종래 기술에서, "BLCA-38 항체"는 대략 30kDa 크기의 미지의 항원을 표적으로 하는 뮤린 단클론성 항체로서 지속적으로 언급된다¹ ^-5. 본 발명자들은 놀랍게도 종래 기술에서 개시되고 사용된 BLCA-38 항체가 이전에 지시된 바와 같은 단일 단클론성 항체 집단이 아니라 혼합 집단에서의 두 개의 상이한 단클론성 항체의 조합이라는 것을 확인하였다. 이것은 수탁 번호 HB11785로 ATTCC에 기탁된 대표적인 샘플인 BLCA-38 항체를 생성하는 데 사용된 하이브리도마가 두 개의 분리된 항체 종의 혼합물을 생성하는 하이브리도마 세포의 이클론성(biclonal)(단클론성이 아닌) 집단이라는 본 발명자의 결정에 기인한다. 이들 항체 종 중 하나만 전립선암 세포의 관련 항원에 결합할 수 있지만 제2 종은 전립선암 세포에 결합할 수 없다. 또한, 이 항체가 결합하는 항원은 종래 기술³ ^-4에서 나타낸 30kDa보다 상당히 크다.

이러한 예기치 않은 발견은 표적 항원에 대해서만 결합 특이성을 갖는 항체의 단일 집단을 생성할 수 있는 단클론성 하이브리도마의 생성을 용이하게 하였다. 비효율적인 항체(즉, 종래 기술의 혼합 집단에 존재하는 제2 단클론성 항체 집단)의 불필요한 생산 및 적용을 회피하는 것 외에도, 본 발명에 따른 단클론성 하이브리도마/단일 항체를 사용하면 동등한 양의 항체가 이용될 때 종래 기술의 혼합 집단과 비교하여 더 강한 신호를 제공한다.

따라서, 본 발명의 특정 구현예는 클론성 하이브리도마 세포로부터 유래된 단클론성 항체 집단의 제공에 관한 것으로, 항체 집단의 각 구성원은 특정 암세포(예를 들어, 방광 및 전립선암 세포) 상에 존재하는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명은 또한 이들 항체의 항원 결합 단편뿐만 아니라 동일한 결합 특이성을 유지하는 항체의 유도체 및 변이체를 제공한다.

본 발명의 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마도 제공된다. 이러한 하이브리도마의 한 예는 2014년 8월 22일 호주 NSW 2145 웨스트메드의 214 호크스베리 로드에 있는 호주 세포 은행의 부다페스트 조약에 따라 수탁 번호 CBA20140026으로 기탁되었다.

본 발명의 항체를 생산 및/또는 단리하는 방법 및 상기 항체를 사용하는 검출/진단 방법이 추가로 제공된다.

단클론성 항체

본 발명은 단클론성 항체, 상기 항체의 유도체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 항원성 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. GPC-1 단백질은 인간 글리피칸-1 단백질일 수 있다(예를 들어, 하기 중 임의의 하나에 개시된 서열: NCBI 참조 서열 수탁 번호 NP_002072.2, 젠뱅크 수탁 번호 AAH51279.1, 젠뱅크 수탁 번호 AAA98132.1, 젠뱅크 수탁 번호 EAW71184.1 또는 유니프로트케이비(UniProtKB)/스위스-프로트(Swiss-Prot) 수탁 번호 P35052.2). 일부 구현예에서, GPC-1 단백질은 신호 펩티드 및/또는 프로펩티드를 포함하지 않을 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 단클론성 항체, 유도체 및 항원 결합 단편은 GPC-1 변이체(예를 들어, GPC-1 이소형태(isoform), 스플라이스 변이체 또는 알로타입(allotype))에 존재하는 항원성 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.

비-제한적인 예로서, 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 중쇄 및/또는 경쇄, 이들의 조합 또는 이들의 구성요소를 포함할 수 있다.

중쇄 또는 이의 구성요소는 중쇄 초가변(HV) 영역으로 당 업계에 공지된 하나, 둘 또는 세 개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 CDR1은 서열 번호: 3의 잔기 50-54에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 중쇄 CDR2는 서열 번호: 3의 잔기 69-85에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 중쇄 CDR3은 서열 번호: 3의 잔기 118-126에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

부가적으로 또는 대안적으로, 중쇄 가변 영역은 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함할 수 있다. 중쇄 FR1은 서열 번호: 3의 잔기 20-49에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 중쇄 FR2는 서열 번호: 3의 잔기 55-68에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 중쇄 FR3은 서열 번호: 3의 잔기 86-117에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 중쇄 FR4는 서열 번호: 3의 잔기 127-137에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

부가적으로 또는 대안적으로 중쇄 가변 영역은 리더(leader) 서열을 포함할 수 있다. 중쇄 리더 서열은 서열 번호: 3의 잔기 1-19에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 당업자는 리더 서열이 새로 합성된 중쇄를 소포체로 수송하는 것을 용이하게 하는 신호 서열이고, 일반적으로 최종 조립 형태의 단클론성 항체의 중쇄에 존재하지 않는다는 것을 인식할 것이다.

부가적으로 또는 대안적으로, 경쇄 또는 이의 구성요소는 경쇄 초가변(HV) 영역으로 당 업계에 공지된 하나, 둘 또는 세 개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 CDR1은 서열 번호: 4의 잔기 44-54에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 경쇄 CDR2는 서열 번호: 4의 잔기 70-76에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 경쇄 CDR3은 서열 번호: 4의 잔기 109-117에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

부가적으로 또는 대안적으로, 경쇄 가변 영역은 1, 2, 3 또는 4개의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3, FR4)을 포함할 수 있다. 경쇄 FR1은 서열 번호: 4의 잔기 21-43에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 경쇄 FR2는 서열 번호: 4의 잔기 55-69에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 경쇄 FR3은 서열 번호: 4의 잔기 77-108에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 경쇄 FR4는 서열 번호: 4의 잔기 118-127에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

부가적으로 또는 대안적으로 경쇄 가변 영역은 리더 서열을 포함할 수 있다. 경쇄 리더 서열은 서열 번호: 4의 잔기 1-20에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 당업자는 리더 서열이 새로 합성된 경쇄를 소포체로 수송하는 것을 용이하게 하는 신호 서열이고, 일반적으로 최종 조립 형태의 단클론성 항체의 경쇄에 존재하지 않는다는 것을 인식할 것이다.

부가적으로 또는 다르게는, 중쇄는 하나, 둘 또는 세 개의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 3의 잔기 138-461에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

부가적으로 또는 다르게는, 경쇄는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 4의 잔기 128-234에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 잔기 20-137에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 하나 또는 두 개의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 서열 번호: 4의 잔기 21-127에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 하나 또는 두 개의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 잔기 20-137을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 4의 잔기 21-127을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 두 개의 중쇄 가변 영역과 두 개의 경쇄 가변 영역의 조합을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 잔기 20-461에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄를 포함할 수 있다. 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 하나 또는 두 개의 중쇄를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 서열 번호: 4의 잔기 21-234에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함할 수 있다. 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 하나 또는 두 개의 경쇄를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 서열 번호: 3의 잔기 20-461에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 및 서열 번호: 4의 잔기 21-234에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 경쇄를 포함할 수 있다. 단클론성 항체, 변이체, 유도체 및 항원 결합 단편은 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄의 조합을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 단클론성 항체, 상기 항체의 변이체 및 유도체 및 이의 항원 결합 단편은 어느 특정의 이소타입(isotype)에 제한되지 않으며, 따라서 IgA(IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 또는 IgM 이소타입일 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 IgG1 이소타입이다.

2014년 8월 22일 호주 NSW 2145 웨스트메드의 214 호크스베리 로드에 있는 호주 세포 은행의 부다페스트 조약에 따라 수탁 번호 CBA20140026으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론성 항체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 하이브리도마는 글리피칸-1 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(GPC-1)에 존재하는 에피토프에 특이적인 결합을 갖는 단일 항체 종을 생산하는 클론성 집단이다.

항체 단편, 유도체 및 변이체

본원에 기재된 항체의 "단편"은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 일반적으로, 단편은 그들이 유래된 또는 이들을 기반으로 하는 모 항체와 동일한 항원/에피토프(예를 들어, GPC-1)에 특이적으로 결합할 수 있다는 점에서 "항원 결합 단편"이다. 전형적으로, 항원 결합 단편은 모 항체의 항원/에피토프 결합능의 적어도 10%, 또는 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%(또는 그 이상)의 모 항체의 항원/에피토프 결합능을 나타낸다. 본원에 기재된 항체의 항원 결합 단편은 그의 항원/에피토프 결합 특이성/용량을 실질적으로 변경시키지 않는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있음이 고려된다(예를 들어, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%(또는 그 이상)의 항원/에피토프 결합 특이성/용량이 유지될 수 있다).

항원 결합 단편의 비-제한적 예로는 Fab, Fab', F(ab)₂, F (ab')₂, F(ab)₃, Fv, 단일-쇄 Fv(scFv), dsFv, Fd 단편, dAB 단편 Fse, VH, VL, VhH 및 V-NAR 도메인, 파라토프, CDR 영역, 단일-쇄 항체 분자(예를 들어, sc-Fv), 미니바디, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 카파 바디, 선형 항체, 다중 특이성 항체, 항체 단편으로부터 형성된 도메인 항체, 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 단편, 및 관련 항원/에피토프(예를 들어 GPC-1)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분 또는 펩티드 서열을 포함한다.

본원에 기재된 항체의 "유도체"가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 항체의 "유도체"는 추가 성분을 혼입시키거나 변경된 기존 성분을 갖도록 변형되지만 유래한 모 항체와 동일한 항원/에피토프(예를 들어, GPC-1)에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 기재된 항체를 의미한다. 전형적으로, 본원에서 고려되는 항체 유도체는 모 항체의 항원/에피토프 결합능의 적어도 10%, 또는 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%(또는 그 이상)의 모 항체의 항원/에피토프 결합능을 나타낸다.

항체 유도체를 형성하기에 적합한 변형의 비-제한적인 예는 아미드화, 글라이코실화, 인산화, 페길화, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 아세틸화 등을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 유도체는 하나 이상의 비-통상적인 아미노산을 함유할 수 있다.

항체 유도체는 예를 들어 방사성 요오드, 인듐, 황, 탄소, 삼중 수소 등으로 표지된 단클론성 항체; 아비딘 또는 비오틴과 접합된 단클론성 항체, 효소(예를 들어, 양고추냉이, 글루코오스 6-포스페이트 탈수소효소 글루코스 옥시다아제, 베타-D-갈락토시다아제, 알칼리성 포스파타아제, 글루코아밀라아제, 아세틸콜린 에스테라제, 카르복실산 탈수효소, 말산 탈수소효소, 리소자임 또는 과산화효소)와 접합된 단클론성 항체, 및 화학발광제(예를 들어, 아크리딘 에스테르), 생물발광제(예를 들어, 루시퍼라제) 또는 형광제(예를 들어, 피코빌리프로타인)와 접합된 단클론성 항체와 같은 표지된 항체를 포함할 수 있다. 항체 유도체의 추가의 예는 2가지 상이한 항원성 기를 (예를 들어, 재조합 기술 또는 가교 결합에 의해) 인식하는 2개의 분리된 항체의 부분을 결합함으로써 생성된 이중 특이성 항체와 같은 2작용성 항체를 포함한다.

항체 유도체는 예를 들어 항체의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 제제와 반응시킴으로써 본원에 기재된 항체의 공유 결합 변형으로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 2작용성 제제로 유도체화하는 것은 항체 또는 그의 단편을 수-불용성 지지체 매트릭스와 같은 고분자 담체에 가교 결합시키기에 유용한 수단이다. 본원에서 고려된 바와 같은 항체 유도체는 생체 내에서 그의 반감기를 증가시킬 수 있는 (예를 들어, 혈류로부터 제거되기까지의 시간의 길이를 연장시킬 수 있는) 기저 항체 또는 그의 단편에 부착된 제제를 가질 수 있다. 이러한 기술의 비-제한적 예는 PEG 모이어티의 첨가를 포함한다.

특정 구현예에서, 항체 유도체는 각 단량체가 (i) 본원에 기재된 바와 같은 항-GPC-1 항체의 항원-결합 영역 또는 (예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환과 같은 것에 의해) 이로부터 유도된 폴리펩티드 영역을 포함하는 하나 이상의 단량체, 및 (ii) 항체 유도체가 GPC-1에 특이적으로 결합하는 다량체(예를 들어, 동종이량체)를 형성하도록 다량체화(예를 들어, 이량체화) 폴리펩티드 영역을 포함하는 하나 이상의 단량체를 포함하는 이량체와 같은 다량체일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항-GPC-1 항체의 항원 결합 영역 또는 이로부터 유래된 폴리펩티드 영역은 이종 단백질과 재조합 또는 화학적으로 융합될 수 있으며, 여기서 이종 단백질은 이량체화 또는 다량체화 도메인을 포함한다. 유도체는 동종이량체 또는 이종이량체의 형성을 허용하는 조건하에 놓일 수 있다. 이종이량체는 동일한 이량체화 도메인을 포함하지만 상이한 항-GPC-1 항원 결합 영역, 동일한 항-GPC-1 항원-결합 영역이지만 상이한 이량체화 도메인, 또는 상이한 항-GPC-1 항원 결합 영역 및 상이한 이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 적합한 이량체화 도메인은 전사 인자(예를 들어, 염기성 부위 루신 지퍼), 염기성-영역 나선-루프-나선 단백질 및 면역글로불린 불변 영역(예를 들어, 중쇄 불변 영역 또는 이의 도메인, 예컨대 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인)으로부터 유래하는 것들을 포함한다.

다른 구현예에서, 항체 유도체는 제2 항체에 접합된 본원에 기재된 항-GPC-1 항체("항체 헤테로컨쥬게이트")일 수 있다.

또한, 본원에 기재된 항체의 인간화 유도체가 본원에 고려된다. 본원에서 고려되는 "인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 예를 들어, 인간화 항체는 수혜자의 CDR 영역으로부터의 잔기가 비인간 종(공여자 항체)(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 또는 GPC-1 항원/에피토프에 대해 원하는 특이성 및 친화성을 갖는 비인간 영장류)의 CDR 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로블린(수혜자 항체)일 수 있다. 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 또한 (임의로) 상응하는 비인간 잔기로 대체될 수 있고, 일부 경우, 인간화 항체는 항체 성능을 향상시키기 위해 수혜자 항체 또는 공여자 항체에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다.

본원에서 더욱 고려된 것은 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 본원에 기재된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이며, 쇄의 나머지가 다른 상이한 종으로부터 유래되거나 다른 상이한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 유도체이다. 예를 들어, 본원에서 고려되는 키메라 항체는 본원에 기재된 바와 같은 항-GPC-1 단클론성 항체로부터 유래된 가변 영역 및 제2 종으로부터 유래된 불변 영역을 포함할 수 있다. 키메라 항체는 예를 들어 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 단편의 유전자 조작에 의해 생성될 수 있다.

비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 키메라 항체는 키메라 마우스 인간 CH1-CH3 쇄 서열 마우스 VH-인간 CH1-CH3 쇄(중쇄) 및/또는 마우스 인간 카파 쇄 서열 마우스 VK-인간 CK 서열 MIL-38 마우스 VK(경쇄)를 포함할 수 있다. 키메라 항체의 중쇄는 서열 번호: 9의 잔기 20-467에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 키메라 항체의 경쇄는 서열 번호: 10의 잔기 21-234에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 9의 위치 50-54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1) 및/또는 서열 번호: 9의 위치 69-85에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2)을 포함할 수 있다. 서열 번호: 9의 위치 118-126에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 10의 위치 44-54에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1) 및/또는 서열 번호: 10의 위치 70-76에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2)을 포함할 수 있다. 서열 번호: 10의 위치 109-117에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키메라 항체는 이 키메라 항체의 "변이체"일 수 있다.

본원에 기재된 항체의 "변이체"는 본 발명의 범위 내에 포함된다. "변이체" 항체는 모 항체 서열에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 "모" 항-GPC-1 항체 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 항체를 의미한다. 예를 들어, 변이체 항체는 모 항체의 하나 이상의 CDR 및/또는 프레임워크 영역에서의 1개 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 모 항체의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 및/또는 프레임워크 영역에서의 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환)을 포함할 수 있다. 항체 변이체는 모 항체의 상응하는 가변 도메인과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 아미노산 서열 상동성(즉, 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및/또는 경쇄 가변 도메인 서열 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

두 서열 간의 서열 상동성 또는 동일성은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에 모 항체 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 서로 비교할 두 서열이 길이가 다른 경우, 서열 동일성은 더 긴 서열의 아미노산 잔기와 동일한 짧은 서열의 아미노산 잔기의 백분율과 관련된다. 서열 동일성은 베스트핏(Bestfit) 프로그램(문헌[Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wis. 53711] 및/또는 프로그램["fasta20u66" (version 2.0u66, September 1998 by William R. Pearson and the University of Virginia](또한 문헌[W. R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98] 참조)과 같은 컴퓨터 프로그램의 사용으로 통상적으로 결정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 변이체 항체는 가변 항체의 서열에서의 보존적 아미노산 변화에 의해 모 항체와 다를 수 있다. "보존적 변화"는 실질적으로 항원성 또는 형태학적으로 중성이고, 변이체 항체의 3차 구조에서 최소한의 변화를 생성하거나, 변이체 항체의 항원 결정기에서 모 항체와 비교하여 최소한의 변화를 일으키는 변형을 의미하며, 이는 모 항체와 같은 GPC-1에서의 동일한 에피토프에 결합할 수 없는 유도체를 제공하지 않는다. 보존적 아미노산 변화의 비제한적인 예는 소수성 아미노산의 치환 및 물리화학적으로 유사한 아미노산의 치환을 포함한다. 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진자는 입체적 및 항원성 중립성을 유지하면서 주어진 아미노산 치환이 이루어질 수 있는지를 일상적으로 또한 어려움 없이 평가할 수 있다(예를 들어, 문헌[Berzofsky, (1985) Science 229:932-940; Bowie et al. (1990) Science 247:1306-1310] 참조). 단백질 형태의 변형은 마이크로상보적 고정 방법(문헌[Wasserman et al. (1961) J. Immunol. 87:290-295; Levine et al. (1967) Meth. Enzymol. 11:928-936] 참조) 및 형태-의존적 단클론성 항체를 이용한 결합 연구(문헌[Lewis et al. (1983) Biochem. 22:948-954])를 포함하지만 이에 한정되지 않는 잘 알려진 분석을 사용하여 달성될 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 모 항체의 하나 이상의 CDR 및/또는 프레임워크 영역에서의 1개 이상(예를 들어, 모 항체의 하나 이상의 CDR 및/또는 프레임워크 영역에서의 1 내지 10, 2 내지 5, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 치환)에서 일어날 수 있다.

일반적으로, 본원에서 고려되는 인간화, 키메라, 유도체, 단편 및 변이체 항체는 이들이 유래하거나 또는 이들의 성분을 함유하는 모 항체와 동일한 항원/에피토프(예를 들어, GPC-1)에 여전히 특이적으로 결합할 수 있다. 전형적으로, 이들은 모 항체의 항원/에피토프 결합능의 적어도 10%, 또는 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%(또는 그 이상)의 모 항체의 항원/에피토프 결합능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 이들은 모 항체에 비해 강한 결합 친화도 및/또는 결합 특이성을 가질 수 있다.

모 항체(즉, GPC-1 항원/에피토프)에 의해 표적화되는 항원/에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 단편, 유도체 또는 변이체의 용량은 예를 들어 면역흡착분석(ELISA), 면역침전 분석, "샌드위치" 면역분석, 면역확산분석, 침전 반응, 단백질 A 면역분석, 형광 면역분석, 겔 확산 침강 반응, 보체-고정 분석, 면역방사선측정 분석, 응집 분석 등을 포함하는 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 시험될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 4th ed. 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999)] 참조).

특히, 항체(키메라 항체를 포함함) 및 본원의 특정 서열에 의해 정의된 항원 결합 단편, 및 수탁 번호 CBA20140026하에 2014년 8월 22일 호주 웨스트메드 NSW 2145 214 호크스베리 로드에 있는 호주 세포 은행의 부다페스트 조약에 따라 제출된 하이브리도마를 포함한 하이브리도마에 의해 생성된 항체를 포함하나 이에 한정되지는 않는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.

하이브리도마

본 발명은 단클론성 항체, 상기 항체의 유도체 및 변이체, 및 이의 항원 결합 단편을 생성할 수 있는 하이브리도마 세포를 제공한다.

일부 구현예에서, 하이브리도마는 "단클론성 항체"라는 표제의 상기 섹션에 기재된 바와 같이 단클론성 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편을 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 하이브리도마는 "항체 단편, 유도체 및 변이체"라는 표제의 상기 섹션에 기재된 바와 같이 본원에 기재된 단클론성 항체의 단편, 유도체 및/또는 변이체를 생성할 수 있다.

단클론성 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포의 제조 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 비제한적인 예는 하이브리도마 방법(문헌[Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256:495-497; Coligan et al. section 2.5.1-2.6.7 in Methods In Molecular Biology (Humana Press 1992)] 및 [Harlow and LaneAntibodies: A Laboratory Manual, page 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988)]), 인간 단클론성 항체 생성을 위한 EBV-하이브리도마 방법(문헌[Cole, et al. 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]), 인간 B-세포 하이브리도마 기술(문헌[Kozbor et al. 1983, Immunology Today 4:72]), 및 트리오마(trioma) 기술을 포함한다.

요약하면, 본 발명의 단클론성 항체는 근유 또는 야생형 마우스(예를 들어, BALB/c 또는 C57BL/6 마우스), 토끼, 랫트 또는 다른 동물 종, 또는 천연 또는 인간 항체를 생성할 수 있는 형질전환 마우스에 대상 면역원(항원)(즉, GPC-1)을 복강 내 주사에 의해 투여함으로써 제조될 수 있다. 면역 반응을 유도하기 위해, 면역원은 예를 들어 보조제와 혼합되거나, 단독으로 투여되거나, 벡터에 의해 발현되거나, DNA로서 투여되거나, 융합 단백질로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 동물을 적어도 두 번 증강시킬 수 있으며, 이어서 비장 세포를 면역화된 동물로부터 수확할 수 있다. 하이브리도마는 감작된 비장 세포를 골수종 세포주(예를 들어, 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein) 및 할로우(Harlow) 및 레인(Lane)에서 개시된 방법론을 사용한 뮤린 SP2/O 골수종 세포)와 융합시킴으로써 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 GPC-1 항원 구조물(예를 들어, 약학적으로 허용가능한 형태의 GPC-1 항원 구조물을 포함하는 백신 조성물)은 반복 투여량(예를 들어, 1 내지 15회, 2 내지 10회, 3 내지 7회, 4 내지 6회 투여량)으로 적절한 간격(예를 들어, 1 내지 10주, 1 내지 6주, 1 내지 4주 또는 2 내지 3주) 동안 적절한 동물에게 투여될 수 있다. 동물의 면역 반응은 증강 후 적절한 시점(예를 들어, 증강 후 3 내지 10일, 증강 후 4 내지 8일, 증강 후 5 내지 6일)에 혈청 샘플을 채취하고, 공지의 기술(예를 들어 ELISA에 의해)을 사용하여 항원 구조물의 면역원성을 결정함으로써 모니터링할 수 있다. 이런 식으로 면역화하면 동물에게 면역 반응을 일으킬 수 있다. 치료 역가(titre)를 갖는 동물은 일반적으로 적절한 희석(예를 들어, 1:4000 내지 1:6000, 1:4500 내지 1:5500 또는 1:5000)으로 ELISA에 의한 양성 결과를 제공하는 동물이다. 치료 역가를 갖는 동물은 항체-생산 세포(B- 림프구)와 연속 재생/불멸 세포주(예를 들어, 골수종 세포주)의 융합을 위해 선택될 수 있다. 세포는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 제제를 사용하여 융합되도록 유도될 수 있다. 이어서, 생성된 하이브리드 세포를 통상적인 방식으로(예를 들어, 한계 희석을 사용하여) 클로닝하고, 생성된 클론을 배양물에서 원하는 항-GPC-1 단클론성 항체를 생산하는 능력에 대해 시험한다. 하이브리도마는 하이폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)을 포함하는 선별 배지에서 세포를 플레이팅함으로써 화학적으로 선택될 수 있다. 하이브리도마는 단클론성 항체를 생산하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있고, 이어서 양성 하이브리도마가 클로닝되고, 팽창되고, 저장될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 하이브리도마는 GPC-1에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항체 종을 생성할 수 있는 단클론성 세포 집단이다. 이러한 단클론성 항체의 비제한적인 예는 "단클론성 항체" 및 "항체 단편, 유도체 및 변이체"라는 표제의 상기 섹션에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 하이브리도마는 2014년 8월 22일 호주 NSW 2145 웨스트메드의 214 호크스베리 로드에 있는 호주 세포 은행의 부다페스트 조약에 따라 수탁 번호 CBA20140026으로 기탁된 하이브리도마일 수 있다. 본 발명에 따른 단클론성 항체를 생산하기 위한 이들 하이브리도마 세포의 배양 및 증식 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명의 하이브리도마 세포를 포함하는 세포 배양물이 고려된다.

일부 구현예에서, 세포 배양물은 GPC-1에 특이적으로 결합하는 단일 종의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생성할 수 있는 단일(단클론성) 종의 하이브리도마 세포를 포함한다. 이러한 단클론성 항체의 비제한적인 예는 "단클론성 항체" 및 "항체 단편, 유도체 및 변이체"라는 표제의 상기 섹션에 개시되어 있다. 하이브리도마 세포의 단일(단클론성) 종은 수탁 번호 CBA20140026하에 호주 세포 은행에서 부다페스트 조약의 조건하에 기탁될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포 배양물은 다수 종의 하이브리도마 세포(즉, 혼합 하이브리도마 세포 집단)를 포함한다. 하이브리도마 세포의 혼합 집단은 GPC-1에 특이적으로 결합하는 단일 종의 항체를 생성할 수 있는 단일(단클론성) 종의 하이브리도마 세포를 포함할 수 있다. 이러한 단클론성 항체의 비제한적인 예는 "단클론성 항체" 및 "항체 단편, 유도체 및 변이체"라는 표제의 상기 섹션에 개시되어 있다. 하이브리도마 세포의 단일(단클론성) 종은 수탁 번호 CBA20140026하에 호주 세포 은행에서 부다페스트 조약의 조건하에 기탁될 수 있다. 하이브리도마 세포의 혼합 집단은 ATCC에서 수탁 번호 HB11785하에 기탁된 하이브리도마 세포 및/또는 하기를 포함하는 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포를 포함하지 않을 수 있다:

다음 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역:

서열 번호: 6의 위치 48-58에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1);

서열 번호: 6의 위치 74-80에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2);

서열 번호: 6의 위치 113-121에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3);

및/또는

서열 번호: 6의 잔기 25-47, 서열 번호: 6의 잔기 59-73, 서열 번호: 6의 잔기 81-112, 서열 번호: 6의 잔기 122-131 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 서열에 의해 정의되는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역).

항체 제조 방법

단클론성 항체, 이의 유도체 및 변이체, 및 이의 항원 결합 단편의 제조 방법은 당업자가 용이하게 이용 가능하고 어려움 없이 수행될 수 있다.

콜러(Kohler) 등(1975)의 하이브리도마 방법 및 "하이브리도마"라는 표제의 상기 섹션에서 상술한 것과는 별도로, 이용될 수 있는 또 다른 비제한적인 방법은 재조합 DNA 기술이다(예를 들어, 미국 특허 제 4816567 호 참조). 예를 들어, 단클론성 항체, 이의 유도체 및 변이체 및 이의 항원 결합 단편은 비제한적으로 배큘로바이러스, 효모(예를 들어, 피키아(Pichia) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속) E-콜라이, 포유동물 세포, 식물 또는 형질 전환 동물을 포함하는 임의의 잘-확립된 발현 시스템에서 재조합적으로 생산될 수 있다(문헌[Breitling and Dubel, 1999, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pp. 119-132] 참조).

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 단클론성 항체, 그의 유도체 및 변이체, 및 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열은 재조합 DNA 기술에 기초한 제조 방법에서 사용될 수 있다. 비제한적 예는 서열 번호: 1에 정의된 바와 같은 중쇄 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체 또는 단편 및/또는 서열 번호: 2에 정의된 경쇄 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함한다.

"변이체" 폴리뉴클레오타이드는 본원에서 모 또는 참조 폴리뉴클레오타이드와 서열이 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 분열은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 첨가와 같은 돌연변이 변화에 기인할 수 있다. 이러한 각각의 변화는 주어진 서열에서 1회 이상 단독으로 또는 조합하여 발생할 수 있다. "변이체" 폴리뉴클레오타이드는 모 또는 참조 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 유사한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 일반적으로, 두 서열이 동일한 백분율(서열 "상동성" 또는 서열 "동일성"의 백분율)을 갖는 특정 백분율을 갖는 경우, 두 서열은 "실질적으로 유사"하다. 두 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 서열 상동성 또는 동일성은 본원에서 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에 모/참조 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일한 후보("변이체") 서열에서의 뉴클레오타이드의 백분율로 정의된다. 서로 비교할 두 서열이 길이가 다른 경우, 서열 동일성은 더 긴 서열의 뉴클레오타이드와 동일한 짧은 서열의 뉴클레오타이드의 백분율과 관련된다. 서열 동일성은 베스트핏(Bestfit) 프로그램(문헌[Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wis. 53711] 및/또는 프로그램["fasta20u66" (version 2.0u66, September 1998 by William R. Pearson and the University of Virginia](또한 문헌[W. R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98] 참조)과 같은 컴퓨터 프로그램의 사용으로 통상적으로 결정될 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오타이드와 참조/모 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 상동성/동일성의 정도는 예를 들어 적어도 75%, 80%, 83% 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 "단편"은 구성요소를 암호화하거나 큰 모/참조 폴리뉴클레오타이드의 구성요소인 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 일반적으로, 단편은 본 발명의 항체의 단편을 암호화할 것이며, 이러한 단편은 GPC-1에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명에 따라 생성된 단클론성 항체, 그의 유도체 및 변이체 및 이의 항원 결합 단편은 비제한적으로 면역글로불린-결합 분자(예를 들어, 단백질 A, L, G 또는 H), 항체 또는 항체 단편에 작동 가능하게 연결된 태그(예를 들어, His-태그, c-myc 태그), 친화성 크로마토그래피 등을 포함하는 적합한 방법을 사용하여 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다.

본원에 기재된 단클론성 항체, 이의 유도체 및 변이체 및 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 상기 "하이브리도마" 표제에 기재된 것들을 포함하는 하이브리도마의 단일 또는 혼합 집단을 포함하는 하이브리도마 및/또는 세포 배양물에 의해 제조하고, 이어서 공지의 기술을 사용하여 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 호주 세포 은행에서 부다페스트 조약의 조건하에 수탁 번호 CBA20140026하에 기탁되고 배양물로부터 단리된 단일(단클론성) 종의 하이브리도마 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다.

하이브리도마 세포주의 제조 및 배양 및 생성된 항체의 단리 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 표준 절차이다.

조성물 및 키트

본원에서 "단클론성 항체" 및 "항체 단편, 유도체 및 변이체"라는 표제의 상기 섹션에서 기술된 것을 포함하여 본 발명에 따른 단클론성 항체, 이의 유도체 및 변이체 및 이의 항원 결합 단편은 키트 및/또는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)의 성분으로 포함될 수 있다.

비제한적인 예로서, 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체, 키메라 항체 또는 하이브리도마 세포 중 임의의 하나 이상을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 하이브리도마 세포는 수탁 번호 CBA20140026하에 호주 세포 은행에 기탁될 수 있다.

키트는 추가로 세포 배양용 시약, 참조 샘플, 완충액, 표지 및 키트의 성분들을 사용하여 검출 검정을 수행하기 위한 서면 지시사항을 포함하는 임의의 개수의 추가 구성요소들을 포함할 수 있다.

키트는 단편화되거나 조합된 키트일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체, 키메라 항체 또는 하이브리도마 세포 중 임의의 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.

비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체, 키메라 항체 또는 하이브리도마 세포 중 임의의 하나 이상을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 하이브리도마 세포는 수탁 번호 CBA20140026하에 호주 세포 은행에 기탁될 수 있다.

상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 약학 조성물은 당업자에게 공지된 바와 같이 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 및/또는 담체를 포함할 수 있다. 약학 조성물을 제조하기 위해, 포함되는 성분을 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제와 혼합할 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)] 참조). 치료제 및 진단제의 제형은 예를 들어 수용액 또는 현탁액, 동결 건조된 분말, 슬러리의 형태로 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다(문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.; Avis et al. (eds.) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY] 참조).

검출 방법

본 발명은 대상체(예를 들어, 대상체의 세포)에서의 GPC-1 단백질의 발현을 검출 및/또는 정량하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체로부터 세포, 조직 샘플 및/또는 체액 샘플을 수득하는 단계, 세포, 조직 및/또는 체액 샘플을 본 발명에 따른 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키메라 항체("단클론성 항체" 및 "항체 단편, 유도체 및 변이체"라는 표제의 상기 섹션에서 기술된 것)와 접촉시키는 단계, 및 상기 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키메라 항체와 대상체의 세포, 조직 샘플 또는 체액 샘플에 대한 결합을 결정 및/또는 정량화하는 단계를 포함한다.

검출용 GPC-1은 세포 표면상에 존재하고/있거나 내부적으로 발현될 수 있다. 체액은 소변일 수 있다. 세포 또는 조직 샘플은 전립선 세포 또는 전립선 조직일 수 있다. GPC-1 발현의 검출 및/또는 정량화는 예를 들어 유동세포 계측법 및/또는 ELISA를 포함하는 당 업계의 임의의 공지된 수단을 사용하여 수행될 수 있다.

일부 구현 예에서, 본 방법에 사용되는 항체, 항체 변이치, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키마이라 항체는 본 발명에 따른 하이브리도마(예를 들어, "하이브리도마"라는 표제의 상기 섹션에 기술된 하이브리도마)에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 항체는 호주 세포 은행에 수탁 번호 CBA20140026로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론성 항체이다.

일부 구현예에서, GPC-1을 검출할 수 있는 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 키메라 항체의 단일 종을 포함하는 용액을 잠재적으로 GPC-1을 함유할 수 있는 세포, 조직 및/또는 체액 샘플에 적용한다. 단일 종은 호주 세포 은행에 수탁 번호 CBA20140026로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다.

대안적으로, 다수 종의 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 항체 유도체 및/또는 키메라 항체를 포함하는 용액을 GPC-1을 함유할 수 있는 세포, 조직 및/또는 체액 샘플에 적용할 수 있으며, 여기서 용액 중의 적어도 1종은 GPC-1을 검출할 수 있다. GPC-1을 검출할 수 있는 종은 호주 세포 은행에 수탁 번호 CBA20140026로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성될 수 있다. 이러한 구현예에서, 다수의 종을 포함하는 용액은 ATCC에 수탁 번호 HB11785로 기탁된 하이브리도마 세포 및/또는 하기를 포함하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체를 포함하지 않는다:

다음 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역:

및/또는

일부 구현예에서, 대상체로부터 수득한 세포, 조직 및/또는 체액 샘플에서 검출된 GPC-1 발현 수준을 대조군 세포 샘플 또는 GPC-1 발현 수준의 샘플 집단 참조군과 비교할 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군 또는 참조군과 비교하여 대상체에서 증가된 GPC-1 발현을 측정하는 것은 대상체에서의 질환의 진단 또는 증가된 발병 가능성일 수 있다. 상기 질환은 전립선암일 수 있다.

광범위하게 기재된 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 특정 구현예들에 개시된 바와 같이 본 발명에 대한 많은 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에 의해 인식될 것이다. 따라서, 본 실시양태들은 모든 면에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.

실시예

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 참조하여 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: MIL-38 하이브리도마 집단으로부터의 항체 분석

1.1 물질 및 방법

- MIL-38 항체 제조

제제 MIL-38 항체 하이브리도마는 다음 공급처로부터 얻었다:

(i) BLCA-38 하이브리도마의 인-하우스 세포 스톡을 사용하여 16A, 16B, 16C, 17B, 23A-1, 23A-2, 24A, 25A, 25B, 26B, 30A, 31A, 31B, 31C, 31D, 32B, 32C, 33A, 33B, 33C, 33D, 34A, 34B, 35A, 35C, 35D, 40A, 40B로 명명된 일련의 MIL-38 항체 제제를 생성시켰다.

(ii) 인-하우스 스톡의 한 세포 배치(batch)를 사용하여 MIL-38 하이브리도마 제제 AusMAb 1 및 2(AM-1 및 AM-2)를 생성시켰다.

(iii) BLCA-38 하이브리도마의 본래 침착물의 바이알을 ATCC(수탁 번호 HB11785: 뮤린 하이브리도마 BLCA-38)로부터 회수하였다. 이를 배양하고 인-하우스 스톡을 제조하였다. 이러한 본래 스톡으로부터의 항체 제제를 "본래"(1-O) 및 "본래 IIA"로 지정하였다;

(iv) "본래" 세포의 바이알을 사용하여 항체 제제 AusMAb 3(AM-3) 및 이어서 항체 제제 AusMAb 4 및 5(AM-4, AM-5)를 생성하였다. AusMAb3를 생성하는 데 사용된 세포 및 AusMAb 4 및 5를 생성하는 데 사용된 세포를 두 개의 배치로 개별적으로 동결시켰다.

(v) 이들 동결 세포로부터, AM-4 및 AM-5를 제조하는 데 사용된 세포 스톡으로부터 "Alfio I"라고 하는 제제를 만들었고 AM-3를 생성하는 데 사용된 세포 스톡으로부터 "Alfio II"라고 하는 제제를 만들었다.

(vi) BLCA-38 하이브리도마(HB11785)의 본래 침착물로부터의 세포의 조기 통과(<6) 동결은 단일 세포 클로닝을 수행하고 특징화할 다수의 클론을 제공하는 데 사용하였다. MIL-38 1F5 클론을 선택하여 수탁 번호 CBA20140026으로 호주 세포 은행에 기탁하였다.

상기 (i) 내지 (ⅵ)에 기술된 제제를 생성하기 위한 기제로서 사용된 하이브리도마 스톡을 워커(Walker) 등의 미국 특허 제 5,002,303 호¹에 기재된 바와 같이 제조하였다(상기 특허 문헌의 전체 내용을 본원에 상호 참조로 인용한다).

MIL-38 항체를 정제하기 위해, 냉동 세포 스톡을 신속히 해동하여 RPMI 1640 배지에 재현탁하고 37℃에서 5% CO₂로 24시간 동안 성장시켰다. 세포를 순차적인 과정으로 팽창, 분할 및 스케일-업하였다. 각 단계에서, 세포를 신선한 배지에 재현탁하고 5% CO₂와 함께 37℃에서 배양했다. 스케일-업 후, 세포를 멸균 무혈청 배지에 옮기고 사멸 단계가 시작될 때까지 성장시켰다. 상등액을 수거하여 MIL-38 항체를 수집하고 멸균 여과하였다. 항체 상등액은 필요할 때까지 -80℃에서 보관했다. 항체는 피어스(Pierce) 단백질 G를 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 정제했다.

AusMab 클론 AM-1 내지 AM-5를 생성하는 데 사용된 세포는 다음과 같이 제조하였다. 세포를 DMEM+10% FCS에서 재생시켰다. 잘 성장하면, 이들을 클로닝하고(아래 참조), 팽창시키고 동결시켰다. 그런 다음, 세포를 FCS에서 위닝(weaning)을 제거하고 Gibco HSFM 무혈청 배지로 옮겼다(위닝은 전형적으로 5일이 걸렸다).

세포를 생물 반응기에 파종하기 전에, 수정된 계대 희석을 수행하여 96 웰 플레이트에서 웰당 단일 세포를 수득하였다. 컨니셔닝된 배지를 단일 세포 성장을 촉진시키는 데 사용하였다. 각 웰을 플레이팅 3일 후에 관찰하고 웰당 4 내지 8개 세포 콜로니의 수를 세었다. 단일 콜로니를 함유하는 웰만이 팽창을 위해 선택하였다. 팽창 이전에 항체의 발현이 확인되었다.

팽창 후, 세포의 일부를 인테그라(Integra) 2-구획 생물 반응기로 옮기고, 나머지 세포는 동결시켰다. 세포를 제조업자의 지침에 따라 생물 반응기에서 성장시켰다. 수확 후, 표준 기술을 사용하여 항체를 정제하였다.

- 웨스턴 블롯 및 사이프로 겔 분석

단백질 추출: 표준 조직 배양 기술에 따라 DU-145(MIL-38 항원 양성) 또는 C3(MIL-38 항원 음성) 세포를 배양하였다. 세포막 단백질은 제조업체의 지침에 따라 메르크 밀리포어 프로테오익스트랙트 네이티브 멤브레인 프로타인 익스트랙션 키트(Merck Millipore ProteoExtract Native Membrane Protein Extraction Kit; MPEK)를 사용하여 농축시켰다.

전달: 트랜스블롯 터보 시스템(Transblot Turbo system)(바이오래드(Biorad))을 사용하여 겔을 2.5A 및 최대 25V에서 10분 동안 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였다.

웨스턴 블롯: 간략하게, 전달 후, PBS-트윈(Tween)(0.1%) 중의 5% 탈지유로 실온에서 2시간 동안 막을 블로킹하였다. 일차 항체(5% 탈지유 - PBS-트윈(0.1%) 중 1μg/ml)를 적용하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척(3x10 분 PBS-트윈(0.1%))한 후, 막을 2차 항체(5% 탈지유 - PBS-트윈(0.1%) 중 1:2000 양-항-마우스 HRP-표지)로 배양하였다. 세척(3x 10분 PBS-트윈(0.1%))후, 항원을 ECL 검출 키트(바이오래드)를 사용하여 검출하고 LAS4000 mini(지이 라이프 사이언스(GE Life Science))로 조영하였다.

사이프로 겔: 사이프로(Sypro®)루비 프로타인 스테인(Ruby Protein Stain)으로 옮기기 전에 겔을 2시간 동안 고정 용액(10% 에탄올, 7% 아세트산)에 고정시키고 암실에서 실온에서 밤새 배양했다. 조영화 전에, 겔을 세정하고 최소 2시간 동안 탈색 용액(10% 에탄올, 7% 아세트산)으로 세척하였다. 조영은 파로스(Pharos) X 스캐너를 사용하여 수행하였다.

- 면역형광 분석( IFA )

IFA: 세포를 75% 융합될 때까지 커버 슬립상에서 성장시키고 6 웰 플레이트에 두었다. 세포를 PBS로 세척한 후 아세톤으로 고정시켰다. 세포를 다시 PBS로 세척한 후 TBS로 배양한 다음 5% 탈지유가 들어 있는 PBS로 블로킹시켰다. 그런 다음, 세포를 MIL-38, 키메라 MIL-38 또는 세툭시맙과 함께 암실에서 배양한 다음, FITC 또는 Alexa488로 표지된 염소 항-마우스 또는 염소 항-인간 항체와 함께 배양하였다. 두 항체는 차후 1% 탈지유가 함유된 PBS에서 제조하였다. PBS로 세척하는 것은 1차 및 2차 항체 배양 사이에서 수행하였다. 2차 배양 후, 세포를 DAPI를 함유하는 PBS로 세척하고 녹색 형광(MIL-38 양성)에 대해 시각화하였다.

- SDS-PAGE 전기영동

SDS-PAGE: 샘플을 비-환원성 SDS-함유 샘플 완충액과 혼합하고 4 내지 15% 프리캐스트(precast) 폴리아크릴아미드 겔(크라이테리온 티쥐엑스(Criterion TGX); 바이오래드) 상에 로딩하였다. 겔을 트리스-글리신 작동 완충액에서 80V에서 10분 동안 그리고 200V에서 추가로 50분 동안 작동시켰다.

1.2 결과

- 웨스턴 블롯

다음의 공급원으로부터 유래된 MIL-38 항체의 제조를 나란히 비교하였다:

(i) ATCC의 하이브리도마 세포(제제 1-O, "본래");

(ii) 신청 회사에 의해 유지되는 하이브리도마 세포로부터 생산된 항체의 두 가지 분리된 제제(제제 37A 및 40A);

동등한 웨스턴 블롯 반응성을 세 가지 제제 모두에서 관찰하였다(도 1). 세 가지 제제 모두 비-클론성 집단을 제시하는 중쇄 및 경쇄 모두에 대해 이중 밴드를 제공했다.

- 면역형광 분석( IFA )

다양한 세포주에서 사용된 다양한 항체 제제("1-본래"(1-O), 40A 및 37A)는 동등한 IFA 반응성을 제공하였다(표 1).

표 1: 다양한 세포주 상에서의 상이한 항체 MIL-38 제제의 IFA 반응성

NB: - 제제 1 -O ("1-본래") 유래의 항체, 40A 및 37A은 세포주 범위 상에서 IFA 내 사용되었음

비교가능 IFA 반응성이 모든 3개 제제에 대해 관찰되었음

- 다양한 MIL-38 항체 제제의 분석

AM-1 내지 AM-5(AusMAb Pty Ltd에 의해 생성됨) 및 인-하우스 MIL-38 항체 제제 33A로부터 유래된 MIL-38 항체 제제의 크기 및 반응성을 SDS-PAGE(도 2a) 및 웨스턴 블롯(도 2b)으로 비교하였다.

항체의 인-하우스 MIL-38 제제는 비-클론성 집단을 제시하는 중쇄 및 경쇄 모두에 대해 이중 밴드를 나타냈다(도 2a 참조). AusMAb MIL-38 항체 제제(AusMab 1, AusMab 3, AusMab 4, AusMab 5)는 중쇄 및 경쇄 모두에 단일 밴드를 나타내었다. MIL-38 항체 제제 33A는 비-클론성 집단을 제시하는 중쇄 및 경쇄 모두에 대해 이중 밴드를 보였다. 주목할 만하게, AusMAb 3 밴드는 공급원 1-O 스톡에서 두 개의 별개의 클론성 집단의 존재를 시사하는 AusMab 1, AusMab 4, AusMab 5 및 33A보다 더 높은 분자량을 나타내었다.

AUSMAb 3(AM-3) 항체는 또한 MIL-38 항원과 반응하지 않은 반면, AusMab 1, AusMab 4, AusMab 5 및 제제 33A 항체는 반응하였다(도 2b).

- 추가적인 인-하우스 MIL-38 제제의 분석

SDS-PAGE 전기영동을 사용하여 BLCA-38 하이브리도마 스톡으로부터 생성되고 인-하우스에 저장된 다양한 다른 MIL-38 항체 제제의 중쇄 및 경쇄 MW를 분석하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 이중 밴드가 모든 제제에서 관찰되었다(도 3a). 대조적으로, AusMab 4(AM-4) 항체 제제는 중쇄 및 경쇄 모두를 위한 단일 밴드를 나타냈다.

DU-145 MPEK 추출물에 대한 다양한 인-하우스 MIL-38 항체 제제의 웨스턴 블롯 반응성은 제제를 통해 일관되게 나타났다. AusMab 3(AM-3)은 DU-145 MPEK 추출물에 반응성이 없었던 반면, AusMab 4(AM-4)는 DU-145 MPEK 추출물에 반응하였다(도 3b).

1.1 논의

이러한 결과로부터, 인-하우스 및 ATCC 스톡 모두로부터의 MIL-38 하이브리도마 스톡이 혼합된 세포 집단을 함유한다는 것이 명백하다. 동정가능한 두 집단(AusMab 집단)을 클로닝하면 분자량이 다른 두 개의 항체가 생성된다. 이 두 항체 종 중 하나는 MIL-38 항원에 대해 비-반응성이고 다른 항체는 혼합된 집단으로부터 생성된 MIL-38에 대해 동등한 반응성을 보인다.

실시예 2: 추가적인 MIL-38 항체 집단의 분석

2.1 물질 및 방법

- MIL-38 항체의 제조

AusMab 3(AM-3) 또는 AusMab 4(AM-4) 및 AusMab 5(AM-5)로부터 유도된 동결 하이브리도마 세포 집단을 제조하였다. AM-3의 유도에 사용된 세포를 "Alfio II"라고 명명했다. AM-3이 DU-145 MPEK 추출물에 비-반응성이었음을 나타내는 스크리닝 후에, 초기 통과 스톡을 조사하여 양성 클론을 확인하였다. 이들 초기 통과 세포를 사용하여 AM-4를 유도하고 "Alfio I"라고 명명했다. 두 가지 세포 스톡을 저장을 위해 보관하고 MIL-38 항체의 인-하우스 생산을 허용했다.

본래 IIA, Alfio I 및 Alfio II의 MIL-38 배치 제조를 위해, 스톡을 신속히 해동하여 RPMI 1640 배지에 재현탁하고 37℃에서 5% CO₂로 24시간 동안 성장시켰다. 세포를 순차적인 과정으로 팽창, 분할 및 스케일-업하였다. 각 단계에서, 세포를 신선한 배지에 재현탁하고 5% CO₂와 함께 37℃에서 배양했다. 스케일-업 후, 세포를 멸균 무혈청 배지에 옮기고 사멸 단계가 시작될 때까지 성장시켰다. 상등액을 수확하여 MIL-38 항체를 수집하고 멸균 여과하였다. 항체 상등액은 필요할 때까지 -80℃에서 보관했다. 항체는 피어스(Pierce) 단백질 G를 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 정제했다.

- 웨스턴 블롯 및 사이프로 겔

웨스턴 블롯 및 사이프로 겔의 제조는 본질적으로 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행하였다 (섹션 1.1 참조).

웨스턴 블롯은 다음 조건에 따라 수행하였다:

4-12% 비스-트리스 겔

블로킹: 밤새

웨스턴 블롯 방식: 막 조각당 1차 항체 1시간, 10μg

3X10분 세척

2차 항체 1시간, 2차 항체 1/2000 염소-마우스 HRP

세포: DU-145 및 C3 MPEK 추출물에 대해 시험

- 면역형광 분석

면역형광 분석은 본질적으로 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행하였다 (섹션 1.1 참조).

2.2 결과

- 웨스턴 블롯

Alfio I, Alfio II, 36A, AusMAb 및 "본래 IIA"(ATCC HB11785의 하이브리도마 세포로부터 제조된 MIL-38 제제)의 웨스턴 블롯 반응성을 DU-145 및 C3 MPEK 세포 추출물에서 시험하였다.

Alfio II의 웨스턴 블롯 반응성은 AM-3의 반응성과 유사했다(도 4a). 본래 IIA 및 Alfio는 제제 36A(인-하우스 이클론성)와 유사했다(도 4a).

- 사이프로 겔 분석

분리된 중쇄 분획의 이중 밴드는 이전에 관찰된 것만큼 명확하지 않았지만, 분리된 경쇄 분획의 이중 밴드는 명확하게 구별될 수 있었다. 본래 IIA, Alfio I 및 36A MIL-38 항체 제제의 분리된 경쇄 분획은 모두 2개의 밴드를 함유하였다. 대조적으로, Alfio II의 분리된 경쇄 분획은 보다 높은 MW(즉, AM-3 MIL-38 항체 제제와 같은)를 갖는 단일 경쇄 종을 함유하였다. 보다 많은 Alfio II 항체가 다른 항체보다 겔에 로딩되어 경쇄 종에 대해 더 넓은 밴드를 생성한다는 것에 유의해야 한다. AM-4 MIL-38 항체로부터 분리된 중쇄 및 경쇄 분획은 이클론성 또는 AM-3-형과 명확하게 구별되었다(도 4b).

- 면역형광 분석

웨스턴 블롯 결과와 일치되게, DU-145 세포에 대한 IFA 분석 결과, AMF-4, Alfio I 및 IIA가 IFA 반응성이 좋았으며 Alfio Ii(웨스턴 블롯에서 AM-3에 해당)는 IFA에서 반응성을 나타내지 않았다(도 5a). 모든 제제의 반응성은 음성 대조군 세포주 C3에서 관찰되지 않았다(도 5b).

2.3. 논의

이러한 분석은 Alfio I이 이클론성 MIL-38 항체 집단인 반면에 Alfio II는 AM-3-유사(단클론성) 항체 집단이라는 것을 확인했으며 MIL-38 항체 제제 AM-4가 단클론성 항체 집단이라는 것을 추가로 확인하였다.

따라서 Alfio I과 같은 이클론성 MIL-38 항체 집단은 별개의 AM-3 및 AM-4 단클론성 항체 집단의 혼합물을 함유한다는 것이 명백하다.

실시예 3: ELISA 분석용 MIL-38 항체 집단의 비교

3.1 물질 및 방법

96-웰 플레이트를 카보네이트 완충액 pH 9.5에서 밤새 MIL-38 제제 AM-3 또는 AM-4(1㎍/웰)로 코팅하였다. 플레이트를 5% 탈지유 함유 PBS-트윈(0.1%)으로 37℃에서 블로킹하고 세척하였다. 항원(NS0 세포로부터 제조된 재조합 인간 GPC-1)을 완충액 II(20mM HEPES pH 7.5, 0.5mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100)로 희석하고 150mM NaCl을 첨가하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 검출은 바이오티닐화 AM-4로 수행한 후 아비딘 HRP(1㎍/mL)로 검출하였다. TMB(시그마(Sigma) 카탈로그 번호 T0440)를 첨가하고 TMB 정지 용액(시그마 S5814)으로 정지시켰다. 흡광도는 450nm로 판독되었다. 결과는 도 6a에 나타내었다.

두 번째 실험에서, 96개의 웰 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS pH 7.2에서 MIL-38 제제 34A 또는 AM-4(2.5 μg/웰)로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-트윈(0.05%) 중 블로커 카제인(Blocker Casein)(써모(Thermo))로 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 세척 후, 항원(GPC-1 NS0)을 50 mM 트리신(Tricine) 및 150 mM NaCl을 함유하는 TBS pH 7.2로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 검출은 바이오티닐화 AM-4 클론 1F5로 수행한 후 아비딘 HRP(1㎍/mL)로 검출하였다. TMB(시그마(Sigma) 카탈로그 번호 T0440)를 첨가하고 TMB 정지 용액(시그마 S5814)으로 정지시켰다. 흡광도는 450nm로 판독되었다. 결과는 도 6b에 나타내었다.

3.2.1 결과

상술한 첫 번째 ELISA는 재조합 NS0-생성 GPC-1(즉, MIL-38 항원)을 포획하기 위해 MIL-38을 사용하여 전개하였다. 이 실험은 단클론성 AM-3 MIL-38과 단클론성 AM-4 MIL-38을 포획을 위해 비교했다. AM-3은 샌드위치 ELISA 분석에서 포획제(capture agent)로 기능하지 못했다(도 6a).

제2 ELISA를 MIL-38(34A)의 혼합 집단이 단클론성 AM-4-1F5 클론으로부터 수득된 것과 비교시 얻어진 ELISA 신호와 비교하였다. AM-4 1F5를 포획제로 사용하는 것은 혼합된 34A 항체 집단을 사용하는 것보다 더 높은 ELISA 신호를 제공했다(도 6b).

3.2.1 논의

샌드위치 ELISA 결과는 단클론성 MIL-38 항체의 AM-4-유사 형태만이 포획제로서 항원을 검출하는 데 유용하고 단클론성 집단을 함유하는 포획제가 혼합된 집단으로 구성된 것에 비해 월등한 ELISA 신호를 제공한다는 사실이 밝혀졌다.

실시예 4: MIL-38 항체 집단의 서열 분석

4.1 물질 및 방법

- 중쇄 및 경쇄 시퀀싱(DNA)

세 번의 분리 시퀀싱 작업을 수행했다. 첫 번째 작업(224945로 코드화됨)은 1-O 제제에서 바이-클로날 하이브리도마 세포를 사용했다. 두 번째 작업(449295-1로 코드화됨)은 AM-4를 생성하는 데 사용된 하이브리도마 스톡인 Alfio I의 세포를 사용했다. 세 번째 작업(449295-5로 코드화됨)은 AM-3을 생성하는 데 사용된 하이브리도마 스톡인 Alfio II의 세포를 사용했다.

시퀀싱 작업 224945(1-O) 및 449295-1(Alfio I)에 대해, 냉동된 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하고, RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 그런 다음, PCR을 수행하여 가변 영역(중쇄 및 경쇄) 및 항체의 불변 영역을 증폭시킨 다음 표준 클로닝 벡터에 별도로 클로닝하고 시퀀싱하였다.

총 RNA는 트리졸(TRIzol®) 플러스 RNA 정제 시스템의 기술 매뉴얼에 따라 하이브리도마 세포에서 분리하였다. 총 RNA를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다.

수퍼스크립트(SuperScript^TM) III 퍼스트-스트랜드 신써시즈 시스템(First-Strand Synthesis System)의 기술 매뉴얼에 따라 이소타입-특이적 항-센스 프라이머 또는 범용 프라이머를 사용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. VH, VL, CH 및 CL의 항체 단편은 젠스크립트(GenScript)의 RACE의 표준 조작 절차에 따라 증폭시켰다.

증폭된 항체 단편을 표준 분자 클로닝 절차를 사용하여 표준 클로닝 벡터에 개별적으로 클로닝하였다.

콜로니 PCR 스크리닝은 정확한 크기의 인서트가 있는 클론을 동정하기 위해 수행하였다. 정확한 크기의 인서트를 가진 5개 이상의 단일 콜로니가 각각의 항체 단편에 대해 시퀀싱되었다.

VH 및 VL 플라스미드는 항체의 전장 가변 영역 및 CH1 및 CL의 일부를 암호화하였다. CH 플라스미드는 CH1 및 전장 CH2 및 CH3의 일부를 암호화하였다. CL 플라스미드는 CL의 일부를 암호화하였다. 전장 불변 영역 또는 중쇄/경쇄를 얻기 위해, VH 및 VL 플라스미드에 의해 암호화된 불변 영역 부분 및 CH 및 CL 플라스미드에 의해 암호화된 불변 영역 부분을 PCR에 의해 개별적으로 증폭시킨 후 오버랩 신장 PCR을 사용하여 전장 DNA를 수득했다. 정확한 VH, VL, CH 및 CL 인서트 크기를 갖는 5개의 단일 콜로니를 시퀀싱을 위해 보냈다.

시퀀싱 작업 449295-5(Alfio II)는 예상된 IgG1 중쇄 서열에 상응하는 서열을 얻는 데 어려움을 겪었다. 두 가지 RNA를 제조하였다. 제1 세포 배치에 대해, 올리고-dT 프라이머 및 CDS III의 프라이머를 역전사(RT)에 사용하였다. VH/CH 및 VK/CK는 IgG1 및 IgK 특이적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고 부분적인 마우스 β-액틴 유전자를 양성 대조군으로서 증폭하였다. 일반적인 경쇄 밴드가 쉽게 얻어졌으며 약한 VH만 겔에서 관찰되었다. 정확한 VK 및 CK 인서트 크기를 갖는 5개의 개별 콜로니가 시퀀싱을 위해 보내졌다. 5개의 상이한 클론의 VK 및 CK 유전자는 거의 동일함이 밝혀졌다. Alfio II 하이브리도마의 공통 경쇄 서열을 하기에 열거한다. 하나의 비생산적인 중쇄 서열은 아래에 나타낸 바와 같이 무작위로 서열된 8개의 VH 양성 클론으로부터 수득하였다. 무작위로 서열된 CH 양성 클론(1개의 IgG₁CH, 1개의 IgG_2aC_H 및 8개의 IgG_2bC_H)으로부터 3가지 중쇄 불변 영역 서열을 수득하였다. 잠재적인 클래스 전환의 영향을 피하기 위해, IgM 특이적 프라이머를 사용하여 CH의 증폭이 수행되었지만, 표적 PCR 산물은 수득되지 않았다. 중쇄 FR1 변성 프라이머를 사용하여 전장 중쇄(W_H-C_H)를 증폭시켰을 때 표적 PCR 산물도 없었다.

여러 번 시도한 후에도 생산적인 중쇄를 얻을 수 없었으므로, Alfio II 세포의 두 번째 바이알에서 중쇄 서열을 분리하려고 시도했다. 세포의 두 번째 바이알에 대해, 올리고- dT 프라이머는 초기 역전사에 사용되었다. IgG1, IgG2b, IgM, IgA 특이적 프라이머 및 IgG 변성 프라이머를 각각 사용하여 V_H를 증폭하고 IgK 특이적 프라이머를 사용하여 VK를 증폭시켰다. 이전의 결과와 동일한 생산적인 경쇄 및 비생산적인 중쇄가 얻어졌다. 랜덤 6량체 프라이머를 이용한 역전사 역시 성공하지 못했다.

요약하면, 경쇄 및 중쇄 서열을 분리하려는 여러 시도가 이루어졌다. 하나의 재배열된 경쇄 서열은 두 배치의 세포에 대한 상이한 시도 후에 일관되게 수득되었다. 그러나, 약한 VH 타겟 PCR 산물만 관찰되었고 시퀀싱은 일관된 중쇄 서열을 초래하지 않았다.

결과

- 시퀀스 요약 표

하기 표 2는 연구된 항체의 중쇄 및 경쇄 핵산 및 단백질 서열의 개요를 제공하며, 다양한 내부 영역의 위치를 나타낸다.

표 2: 항체 서열 및 내부 영역의 검토

주석: HFR = 중쇄 프레임워크 영역; HCDR = 중쇄 상보성 결정 영역; CH = 중 쇄 불변 영역

LFR = 경쇄 프레임워크 영역; LCDR = 경쇄 상보성 결정 영역; CL = 경쇄 불변 영역

회색 박스는 서열 번호에 의한, 칼럼 1 내 획정된 서열 내 위치를 나타냄

- 시퀀싱(DNA)

1.5% 아가로오스/GelRedTM 겔에서 DNA 마커(마커 III - 트안젠(TIANGEN), 카탈로그 번호: MD103)와 함께 샘플의 단리된 전체 RNA를 수행했다.

1.5% 아가로오스/GelRedTM 겔에서 DNA 마커(마커 III)와 함께 각 샘플의 PCR 산물 4 마이크로리터를 실행했다. PCR 산물을 정제하고 추후 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.

5개의 다른 클론의 VH, VL, CH 및 CL 유전자는 거의 동일했다. 하기에 열거된 컨센서스 서열은 단클론성 하이브리도마 집단(AM-4)에 의해 생성된 항체의 서열로 결정되었다.

AM-4 MIL-38 마우스 IgG1 중쇄 DNA 공통 서열 ( 서열 번호: 1 )

마우스 중쇄 암호화 서열의 개개의 영역은 음영/ 비음영이 교대로 강조 표시되어 있다. 위치: 1-57 = 리더 서열; 58-147 = 프레임워크 영역( HFR1 ); 148-162 = 상보성 결정 영역(HCDR1); 163-204 = HFR2 ; 205-255 = HCDR2 ; 256-351 = HFR3 ; 352-378 = HCDR3; 379-411 = HFR4 ; 412-1383 = 불변 영역(CH1-CH3); 703-741 = 힌지 영역(밑줄); 1384-1386 = 정지 코돈.

AM-4 MIL-38 마우스 카파 경쇄 DNA 공통 서열 ( 서열 번호: 2 )

마우스 경쇄 암호화 서열의 개개의 영역은 음영/ 비음영이 교대로 강조 표시되어 있다. 위치: 1-60 = 리더 서열; 61-129 = 프레임워크 영역 ( LFR1 ); 130-162 = 상보성 결정 영역 ( LCDR1 ); 163-207 = LFR2 ; 208-228 = LCDR2 ; 229-324 = LFR3 ; 325-351 = LCDR3; 352-381 LFR4; 382-702 = 불변 영역 (CK); 703-705 = 정지 코돈.

상기 중쇄 및 경쇄 AM-4 MIL-38 공통 DNA 서열은 하기 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열로 번역된다:

AM-4 MIL-38 마우스 IgG1 중쇄 아미노산 공통 서열 ( 서열 번호: 3)

마우스 IgG1 중쇄 서열의 개별 영역은 상기 아미노산 서열에 표시된다. 위치 1-19 = 리더 서열; 20-49 = 프레임워크 영역 ( HFR1 ); 50-54 = 상보성 결정 영역 1 ( HCD1 ); 55-68 = HFR2 ; 69-85 = HCDR2 ; 86-117 = HFR3 ; 118-126 = HCDR3 ; 127-137 = HFR4 ( 또한 결합 영역 또는 J-영역으로 지칭됨); 138-461 = IgG1 쇄 불변 영역 (CH1 - CH3) & 정지 코돈 (*). 힌지 영역 - 은 상기 서열 내에서 밑줄로 표시됨..

AM-4 공통 MIL-38 경쇄 아미노산 공통 서열 ( 서열 번호: 4)

경쇄 아미노산 서열의 개별 영역은 다음 표지된 바와 같이 표시됨: 위치 1-20 = 리더 서열; 21-43 = 프레임워크 영역 ( LFR1 ); 44-54 = 상보성 결정 영역 1 ( LCDR1 ); 55-69 = LFR2 ; 70-76 = LCDR2 ; 77-108 = LFR3 ; 109-117 = LCDR3 ; 118-127 = LFR4 ; 128-234 = 카파 불변 영역 (CK) & 정지 코돈(*)

시퀀싱 작업 224945(1-O)와 449295-1(Alfio I) 사이의 공통 서열의 비교는 경쇄 및 중쇄의 서열이 동일함을 보여주었다(하기 서열 순서 참조). 이들 서열은 이클론성 집단(1-O)과 AM-4-유사 Alfio I 집단 사이에서 일치하기 때문에 위와 같이 "AM-4 공통 서열"이라고 명명했다.

1. 경쇄 정렬: 이클론성 vs AM-4( Alfio I) vs AM-3( Alfio II) 정렬

2. 경쇄 정렬: 이클론성 vs AM- 4(Alfio 1). AM -3( Alfio 2,)의 번역된 서열을 결정할 수 없었다

AM-3 공통 서열

AM-3-유사 Alfio II 세포에서 일정한 중쇄 서열을 얻을 수 없었다. 시퀀싱 작업 449295-5(Alfio II)로부터 얻은 경쇄 서열은 일관되게 얻어졌으며 상기 정렬에서 보여지는 바와 같이 다른 두 시퀀싱 작업에 대한 서열에 비해 프레임워크 영역 및 상보성-결정 영역 모두에서 명백한 차이를 나타내었다("1. 경쇄 정렬" 참조).

AM-3 MIL-38 카파 경쇄 DNA 공통 서열 ( 서열 번호: 5)

* 경쇄 암호화 서열의 개개의 영역은 음영/ 비음영이 교대로 강조 표시되어 있다. 위치: 1-72 = 리더 서열; 73-141= 프레임워크 영역 ( LFR1 ); 142-174= 상보성 결정 영역 ( LCDR1 ); 175-219= LFR2 ; 220-240 = LCDR2 ; 241-336 = LFR3 ; 337-363 = LCDR3 ; 364-393 = LFR4 ; 394-714 = 불변 영역 (CK); 715-717 = 정지 코돈

AM-3 MIL-38 경쇄 아미노산 공통 서열 ( 서열 번호: 6 )

경쇄 아미노산 서열의 개별 영역은 다음 표지된 바와 같이 표시됨: 위치 1-24 = 리더 서열; 25-47 = 프레임워크 영역 ( LFR1 ); 48-58 = 상보성 결정 영역 1 ( LCDR1 ); 59-73 = LFR2 ; 74-80 = LCDR2 ; 81-112 = LFR3 ; 113-121 = LCDR3 ; 122-131 = LFR4 ; 132-238 = 카파 불변 영역 (CK) & 정지 코돈(*)

실시예 5: 키메라성 MIL-38 항체의 제조 및 시험

5.1 물질 및 방법

- 키메라성 항체의 제조

클로닝 목적으로 두 개의 최적화된 cDNA 서열을 개발하였다. 이들은 실시예 4에서 상기 확인된 AM-4 중쇄 및 경쇄 공통 서열에 기초하였다.

첫 번째로 최적화된 cDNA 서열은 마우스-인간 키메라성 중쇄 서열의 생성에 사용하였다:

CHO 코돈 최적화된 cDNA 서열 #1 - 마우스-인간 키메라 중쇄 1404 bp ( 서열 번호 : 7)

마우스-인간 키메라 중쇄 암호화 서열의 개개의 영역은 음영/ 비음영이 교대로 강조 표시되어 있다. 위치: 1-57 = 리더 서열; 58-147 = 프레임워크 영역 (FR1); 148-162 = 상보성 결정 영역 ( CDR1 ); 163-204 = FR2; 205-255 = CDR2 ; 256-351= FR3; 352-378 = CDR3 ; 379-411 = FR4; 412-1401= 인간 불변 영역 (CH1-CH3); 706-750 = 힌지 영역 ( 밑줄로 표시됨 ); 1402-1405 = 정지 코돈.

두 번째로 최적화된 cDNA 서열은 마우스-인간 키메라성 중쇄 서열의 생성에 사용하였다:

CHO 코돈 최적화된 cDNA 서열 #2 - 마우스-인간 키메라 경쇄 705 bp ( 서열 번호 : 8)

마우스-인간 키메라 경쇄 암호화 서열의 개별 영역은 음영/ 비음영이 교대로 강조 표시되어 있다. 위치: 1-60 = 리더 서열; 61-129 = 프레임워크 영역 (LFR1); 130-162 = 상보성 결정 영역 ( LCDR1 ); 163-207 = LFR2 ; 208-228 = LCDR2; 229-324 = LFR3 ; 325-351= LCDR3 ; 352-381 = LFR4 ; 382-702 = 인간 불변 영역 (CK); 703-705 = 정지 코돈.

키메라성 MIL-38 마우스 인간 CH1-CH3 쇄를 무혈청 배지를 사용하여 현탁액 CHO-3E7 세포에서 일시적으로 발현시키고, 이어서 1-단계 정제를 수행하였다.

CHO-3E7 세포를 무혈청 프리스타일(FreeStyleTM) CHO 발현 배지(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 성장시켰다. 오비탈 진탕기(브이더블유알 사이언티픽(VWR Scientific)(펜실베니아주 체스터)에서 5% CO₂로 37℃에서 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크(코닝 인코포레이티드(Corning Inc.)(메사추세츠주 액턴)에서 세포를 유지시켰다. 형질전환 당일에 DNA와 PEI(폴리사이언시스(Polysciences), 독일 에펠하임)를 최적의 비율로 혼합한 다음 세포를 형질주입할 준비가 된 플라스크에 넣었다. 6일째에 수집된 상등액을 추가 정제에 사용하였다.

세포 배양액을 원심 분리한 후 여과하였다. 여과된 상등액을 3.0 ml/분으로 5 ml 단백질 A CIP 칼럼(젠스크립트(GenScript), 카탈로그 번호 L00433)에 로딩하였다. 적절한 완충액으로 세척하고 용출시킨 후, 분획을 수집하고 1M 트리스-HCl(pH 9.0)로 중화시켰다. 정제된 단백질을 분자량, 수율 및 순도 측정을 위한 표준 프로토콜을 사용하여 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

- 키메라성 MIL-38 항체 분석(슬라이드 면역형광 )

MIL-38 키메라성 항체는 DU-145 세포를 이용한 면역형광 분석에 사용하였다. 뮤린 MIL-38 제제 33A를 GPC-1 항원 염색의 양성 대조군으로 사용하고, 세툭시맙(EGFR을 표적으로 하는 키메라성 항체)을 인간 IgG 불변 영역의 염색에 양성 대조군으로 사용하였다. 1차 항체가 없는 슬라이드를 음성 대조군으로 사용하였다. 염색은 본질적으로 2차 항체가 알렉사플루오르(Alexafluor) 488로 표지되고 항-인간 항체가 키메라 및 세툭시맙 샘플을 염색하기 위해 사용되었다는 것을 제외하고는 섹션 1.1에서 기술한 바와 같이 수행하였다.

- 키메라성 MIL-38 웨스턴 블롯

DU-145 및 C3 MPEK 추출물뿐만 아니라 재조합 NS0-생성 GPC-1 항원에 대한 키메라성 MIL-38 및 뮤린 MIL-38의 반응성을 웨스턴 블롯으로 시험하였다. 웨스턴 블롯은 뮤린 MIL-38 또는 키메라성 MIL-38에 의해 조사하였다. 키메라성 MIL-38은 염소 항-인간 2차 항체 및 이어서 양-항-염소 HRP 항체에 의해 검출되었다. 대조군으로서, 뮤린 MIL-38은 염소 항-마우스 2차 항체 및 이어서 양-항-염소 HRP 항체에 의해 검출되었다. 동등한 조건에서 검출하는 경우 키메라성 MIL-38 및 뮤린 MIL-38이 동등한 반응성을 나타내었다. 도 9a는 뮤린 MIL-38로 탐침된 웨스턴 블롯에 이어서, 항-마우스 HRP 2차 항체를 나타낸다. 도 9b는 키메라성 MIL-38로 탐침된 웨스턴 블롯에 이어서, 염소 항-인간 2차 항체를 나타낸다. 복합체는 양-항-염소 HRP 항체를 사용하여 검출되었다. 도 9c는 뮤린 MIL-38로 탐침된 웨스턴 블롯에 이어서, 염소 항-인간 마우스 항체 나타낸다. 복합체는 양-항-마우스 HRP 항체를 사용하여 검출되었다.

5.2 결과

- 키메라성 항체 서열의 발현

키메라성 MIL-38 마우스 인간 CH1-CH3 사슬의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 재조합 플라스미드를 현탁 CHO-3E7 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다. 표적 단백질은 프로타인 A CIP 5 ml 칼럼으로 세포 배양 상등액에서 포획한 후 완충액을 교체하였다. 정제된 단백질을 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 3 ㎍의 샘플을 SDS-PAGE에 로딩시키고 0.3 ㎍의 총 단백질을 웨스턴 블롯에 로딩하였다. 웨스턴 블롯의 1차 항체는 염소 항-인간 IgG-HRP(젠스크립트, 카탈로그 번호 A00166)였다.

- 키메라성 항체 서열

키메라 MIL-38 마우스 인간 CH1-CH3 쇄 서열 마우스 VH -인간 CH1-CH3 쇄 ( 중 쇄) ( 서열 번호: 9 )

마우스-인간 키메라 중쇄 서열의 개별 영역은 상기 아미노산 서열에 표시됨: 위치 1-19 = 리더 서열; 20-49 = 프레임워크 영역 ( HFR1 ); 50-54 = 상보성 결정 영역 1 ( HCD1 ); 55-68 = HFR2 ; 69-85 = HCDR2 ; 86-117 = HFR3 ; 118-126 = HCDR3 ; 127-137 = HFR4 ( 또한 결합 영역 또는 J-영역으로 지칭됨); 138-467 = IgG1 쇄 불변 영역 (CH1-CH3), & 정지 코돈 (*). 힌지 서열 - 상기 인간 IgG1 중쇄 힌지 서열은 밑줄로 표시됨.

최적화된 cDNA 서열 #1(서열 번호: 7)을 사용하여 하기 아미노산 서열을 갖는 키메라성 MIL-38 항체 중쇄를 생성시켰다:

키메라 MIL-38 마우스-인간 카파 경쇄 서열: 마우스 VK -인간 CK 서열 ( 서열 번호: 10 )

마우스-인간 키메라 경쇄 아미노산 서열의 개별 영역은 상기 아미노산 서열에 표시됨: 위치 1-20 = 리더 서열; 21-43 = 프레임워크 영역 ( LFR1 ); 44-54 = 상보성 결정 영역 1 ( LCDR1 ); 55-69 = LFR2 ; 70-76 = LCDR2 ; 77-108 = LFR3 ; 109-117 = LCDR3;118 -127 = LFR4; 128-234 = 카파 불변 영역 (CK) & 정지 코돈(*)

최적화된 cDNA 서열 #2(서열 번호: 8)을 사용하여 하기 아미노산 서열을 갖는 키메라성 MIL-38 항체 경쇄를 생성시켰다:

- 키메라성 MIL-38 항체 분석(슬라이드 면역형광 )

도 8a-d는 세포의 명시야 이미지를 도시한다. 도 8e는 33A 양성 대조군의 염색을 도시한다. 도 8e는 MIL-38 항체의 염색을 도시한다. 도 8g는 상용 키메라성(마우스/인간) 단클론성 항체(세툭시맙) 양성 대조군을 사용하는 염색을 도시하고, 도 8h는 1차 항체 음성 대조군 염색을 나타내지 않는다. 도 8e, f 및 g에서 강한 염색이 관찰되었고, 도 8h에서는 염색이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 키메라성 MIL-38 항체가 IFA에서 DU-145 세포에 성공적으로 결합함을 나타내며, 이는 모 뮤린 MIL-38 항체의 결합 특이성이 유지되었음을 나타낸다.

- 키메라성 MIL-38 항체 분석( 웨스턴 블롯 )

도 9a는 뮤린 MIL-38로 탐침된 웨스턴 블롯에 이어서, 항-마우스 HRP 2차 항체를 나타낸다. 도 9a에 도시된 웨스턴 블롯에 대한 노출 시간은 30초이었다. 도 9b는 키메라성 MIL-38로 탐침된 웨스턴 블롯에 이어서, 염소 항-인간 2차 항체를 나타낸다. 복합체는 양-항-염소 HRP 항체를 사용하여 검출되었다. 도 9b에 도시된 웨스턴 블롯에 대한 노출 시간은 30분이었다. 도 9c는 뮤린 MIL-38로 탐침된 웨스턴 블롯에 이어서, 염소 항-마우스 항체 나타낸다. 복합체는 양-항-염소 HRP 항체를 사용하여 검출되었다. 도 9c에 도시된 웨스턴 블롯에 대한 노출 시간은 30분이었다.

뮤린 MIL-38 항-마우스는 DU-145 용해물과 재조합 GPC-1 NS0에서 항원을 인식한다. 반응성은 예상대로 C3 용해물에서 관찰되지 않았다(도 9a).

키메라성 MIL-38과 DU-145 및 C3 추출물뿐만 아니라 재조합 NS0 GPC-1의 반응성을 시험하기 위해 3가지 항체 검출 방법이 필요하였다(도 9b). 3가지 항체 검출 방법을 사용하는 대조군 웨스턴 블롯을 또한 뮤린 MIL-38으로 수행하였다(도 9c). 3가지 항체 검출 방법을 사용하는 경우, 표준 2가지 항체 방법을 사용하는 것보다 검출이 훨씬 덜 민감했다(도 9a 및 c에 도시된 웨스턴 블롯에 대해, 도 9a에 사용된 노출 시간은 30초이었지만, 도 9c에 사용된 노출 시간은 30분이었다).

도 9b에 도시된 바와 같이, 키메라성 MIL-38은 재조합 GPC-1 NS0 항원을 인식하고, 이 방법을 사용하여 검출하는 경우 뮤린 MIL-38과 비교할만한 반응성을 나타낸다(도 9b 및 c 비교).

5.3. 논의

키메라성 MIL-38 항체는 현탁 CHO-3E7 세포에서 성공적으로 발현되고 정제되었다. 표적 항체의 H 및 L 쇄는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 기초하여 약 55 kDa(Cal.M.W. 약 52 kDa) 및 28 kDa (Cal.M.W. 약 26 kDa)의 추정 분자량으로 검출되었다.

키메라성 MIL-38과 뮤린 모 간의 동등한 반응성이 IFA 및 웨스턴 블롯팅에서 관찰되었으며, 이는 결합 특이성이 키메라성 항체의 제조에서 유지되었다는 것을 나타낸다.

호주 세포 은행

CBA20140026

20140822

<110> Minomic International Ltd <120> Monoclonal Anti-GPC-1 Antibodies and Uses Thereof <130> P107105C <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1386 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggctgctg cccaaagtat ccaagcacag 60 atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctggttatgc cttcacagac tattcaatga actgggtgaa gcaggctcca 180 ggaaagggtt taaggtggat gggctggata aacactgaga ctggtgagcc aacatataca 240 gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctttttg 300 cagatcaaca acctcagaaa tgaagacacg gctacatatt tctgtgctag acactatgat 360 tacggggggt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg 420 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg 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Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg His Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 225 230 235 240 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 305 310 315 320 Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 325 330 335 Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 355 360 365 Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 370 375 380 Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 385 390 395 400 Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly 405 410 415 Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 420 425 430 Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 435 440 445 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 4 <211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 35 40 45 Val His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 165 170 175 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 195 200 205 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 5 <211> 717 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 atgggcatca agatggagtc acagactcag gtctttgtat acatgttgct gtggttgtct 60 ggtgttgatg gagacattgt gatgacccag tctcaaaagt tcatgtccac atcaatagga 120 gacagggtca gcgtcacctg caaggccagt cagaatgtgg gttctcatgt agcctggttt 180 cagcagaaac cagggcaatc tcctaaagca ctgatttact cggcatccta ccggtacagc 240 ggagtcactg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcaac 300 aatgtgcagt ctgaagactt ggcagagtat ttctgtcagc aatataacag ttttccattc 360 acgttcggtt cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga 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Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 7 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric Antibody Sequence <400> 7 atggcttggg tgtggacact gctgttcctg atggctgctg cccagagtat tcaggctcag 60 attcagctgg tccagagcgg tcccgagctg aagaagccag gcgagaccgt gaagatctcc 120 tgcaaggcca gcggctacgc tttcacagac tattctatga actgggtgaa gcaggcccca 180 ggcaagggcc tgaggtggat gggctggatc aataccgaga caggcgagcc cacctacaca 240 gacgatttca agggccggtt cgctttttcc ctggagacct ctgcctccac agcttttctg 300 cagatcaaca atctgagaaa cgaggacacc gccacatact tctgcgctag gcactacgat 360 tatggcggct ttccttattg gggccagggc accctggtga cagtgtccag cgcctctacc 420 aagggcccat ccgtgtttcc actggctccc tcttccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480 gctctgggct gtctggtgaa ggattacttc ccagagcccg tgacagtgtc ttggaactcc 540 ggcgccctga cctccggagt gcatacattt cccgctgtgc tgcagagctc tggcctgtac 600 agcctgtcca 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<223> Chimeric Antibody Sequence <400> 8 atgagcgtgc tgacccaggt gctggccctg ctgctgctgt ggctgaccgg agcccgttgc 60 gacatccaga tgacccagtc ccctgcctct ctgtccgcca gcgtgggcga gaccgtgaca 120 atcacctgca gagcctctgg caacgtgcac aattacctgg cttggtatca gcagaagcag 180 ggcaagtccc cacagctgct ggtgtacaca gccaagaccc tggctgacgg cgtgcccagc 240 aggttctctg gctccggcag cggcacacag tatagcctga agatcaactc tctgcagcct 300 gaggattttg gcacctacta ttgccagcat ttctggtcta atccatggac atttggcggc 360 ggcaccaagc tggagatcaa gaggacagtg gccgctccct ccgtgttcat ctttccccct 420 agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgct tccgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 480 cctcgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagtctgg caattcccag 540 gagagcgtga cagagcagga ctctaaggat tccacctata gcctgtccag cacactgacc 600 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtatgctt gtgaggtcac tcaccagggg 660 ctgtcaagtc cagtcacaaa gtccttcaat aggggggaat gctga 705 <210> 9 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric Antibody Sequence <400> 9 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg His Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 10 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric Antibody Sequence <400> 10 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 35 40 45 Val His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230

Claims

제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단리된 단일클론항체 집단으로서, 상기 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 중쇄 가변 영역 및 (b) 경쇄 가변 영역을 포함하고,
(a) 하기 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역:
서열 번호 3의 50 내지 54번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1);
서열 번호 3의 69 내지 85번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2);
서열 번호 3의 118 내지 126번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3), 및
(b) 하기 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역:
서열 번호 4의 44 내지 54번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1);
서열 번호 4의 70 내지 76번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2);
서열 번호 4의 109 내지 117번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3),
상기 단일클론항체 집단은 하기 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항체를 함유하지 않는, 단리된 단일클론항체 집단:
서열 번호 6의 48 내지 58번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 1(CDR1);
서열 번호 6의 74 내지 80번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 2(CDR2);
서열 번호 6의 113 내지 121번으로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 상보성 결정 영역 3(CDR3).
청구항 1에 있어서, 상기 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편은 이소형 IgG1인, 단일클론항체 집단.
청구항 1에 있어서, 상기 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체, 키메라 항체, 다량체성 항체 및/또는 합성 항체 중 임의의 하나 이상인, 단일클론항체 집단.
청구항 1에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 단쇄가변분절(scFv), 가변 도메인(Fv) 단편, 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab)2 단편, 펩타이드 또는 에피토프 결합 영역을 함유하는 단백질분해성 단편 중 임의의 하나 이상인, 단일클론항체 집단.
청구항 1에 있어서, 상기 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는, 단일클론항체 집단:
(a) 서열 번호 3의 20 내지 49번 잔기, 서열 번호 3의 55 내지 68번 잔기, 서열 번호 3의 86 내지 117번 잔기, 및 서열 번호 3의 127 내지 137번 잔기 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 서열로 정의되는, 하나 이상의 중쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역); 및/또는
(b) 서열 번호 4의 21 내지 43번 잔기, 서열 번호 4의 55 내지 69번 잔기, 서열 번호 4의 77 내지 108번 잔기, 및 서열 번호 4의 118 내지 127번 잔기 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 서열로 정의되는, 하나 이상의 경쇄 가변 영역 FR(프레임워크 영역).
청구항 1에 있어서, 상기 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 하기 (a) 내지 (c) 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 단일클론항체 집단:
(a) 서열 번호 3의 138 내지 461번으로 정의되는 중쇄 불변 도메인 서열;
(b) 서열 번호 4의 128 내지 234번으로 정의되는 경쇄 불변 도메인 서열; 및
(c) 힌지 영역.
청구항 1에 있어서, 상기 제1 항체가 서열 번호 3의 20 내지 461번으로 정의되는 중쇄 서열 및 서열 번호 4의 21 내지 234번으로 정의되는 경쇄 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 단일클론항체 집단.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 단일클론항체 집단을 생산할 수 있는 하이브리도마 세포.
청구항 8에 있어서, 하이브리도마 세포는 호주 세포 은행에 수탁 번호 CBA20140026로 기탁된, 세포.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 적어도 하나를 암호화하는, 핵산 분자.
청구항 10에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 정의되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 핵산 분자.
단일클론항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서,
상기 방법은 청구항 8의 하이브리도마 세포를 적합한 조건하에 배양 배지에서 배양하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
혼합된 하이브리도마 집단으로부터 하이브리도마 세포의 적어도 일부를 단리시키는 단계를 포함하는, 혼합된 하이브리도마 집단으로부터 청구항 8의 하이브리도마 세포를 수득하는 방법으로서,
상기 혼합된 하이브리도마 집단이 ATCC(American Tissue Type Culture Collection)에 수탁 번호 HB11785로 기탁된, 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 제1 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편은 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 키메라 항체인, 단일클론항체 집단:
(a) 서열 번호 9의 138 내지 467번 잔기로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 불변 영역; 및
(b) 서열 번호 10의 128 내지 234번 잔기로 정의되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 불변 영역.
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