CN113544156B - 抗Claudin18.2抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及抗Claudin18.2抗体及其应用。具体地，本发明涉及一种抗Claudin18.2抗体；包含所述抗Claudin18.2抗体CDR的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体及其抗原结合片段，以及其作为药物的用途。特别地，本公开涉及一种抗Claudin18.2抗体在制备用于治疗Claudin18.2阳性疾病或病症的药物中的用途。

Description

抗Claudin18.2抗体及其应用
本申请要求2019年4月1日提交的中国专利申请201910257853.6的优先权，其全部内容通过引用并入此处。
技术领域
本公开涉及抗体药物领域。具体地，本公开涉及Claudin18.2抗体以及其应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
密蛋白18(Claudin-18，CLDN18)是一种在人类中由Claudin18基因编码的蛋白质，属于细胞紧密连接蛋白家族。Claudin-18可以控制层细胞之间的分子流动。
Claudin-18蛋白结构中包括四个跨膜区域、两个细胞外环，其N末端和C末端在胞浆内。Claudin-18具有两个剪接变体，分别为Claudin 18.1和Claudin 18.2，两者序列之间仅在第一个细胞外环有八个氨基酸的差异。Claudin 18.1和Claudin 18.2的表达分布有所不同，Claudin 18.1在正常肺的细胞中选择性表达，Claudin 18.2在正常细胞中表达高度受限，但在多种肿瘤(胃癌、肺癌和胰腺癌等)中频繁异位激活和过表达。Claudin18.2被认为是胃癌和其他癌症类型的潜在治疗靶点，此靶点的发现也为胃癌的治疗提供了一种新的选择。
发明内容
本公开提供一种抗Claudin18.2抗体。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
i)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：3所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
ii)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：5所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
iii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQID NO：14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
iv)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本领域技术人员应当理解，项目编号，例如i)、ii)、a)、b)等，其目的仅在于使所列举的技术方案或要素更加清晰、有条理，但是对跟随其后的技术方案或要素不具有任何方面的约束性。当使用相同的项目编号时，不代表跟随其后的技术方案或要素是相同的。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其中所述抗Claudin18.2抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(v)所述重链可变区与SEQ ID NO:3或24所示的重链可变区有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性，和所述轻链可变区与SEQ ID NO:4或21所示轻链可变区有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性；或
(vi)所述重链可变区与SEQ ID NO:5或31所示重链可变区有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性，和所述轻链可变区与SEQ ID NO:6或28所示轻链可变区有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(1)所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或与其有至少90％同一性，和所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或与其有至少90％同一性；
(2)所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示或与其有至少90％同一性，和所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示或与其有至少90％同一性；
(3)所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示或与其有至少90％同一性，和所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示或与其有至少90％同一性；或
(4)所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示或与其有至少90％同一性，和所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示或与其有至少90％同一性。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其中所述抗Claudin18.2抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包含来源自人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有至多10个氨基酸的回复突变。
在一些实施方案中，所述人抗体的重链框架区与氨基酸序列SEQ ID NO:24所示重链可变区的框架区相同，或所述人抗体的轻链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO:21所示轻链可变区的框架区相同；或所述人抗体的重链框架区与氨基酸序列SEQ ID NO:31所示重链可变区的框架区相同，或所述人抗体的轻链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO:28所示轻链可变区的框架区相同。
在一些实施方案中，优选地，所述框架区变体包含选自以下(a)或(b)所述的突变：
(a)所述轻链可变区中包含22S、85I或87H中的一个或多个氨基酸回复突变，和/或所述重链可变区中包含选自48I、82T和69M中的一个或多个氨基酸回复突变；或
(b)所述轻链可变区中包含选自4L和22S一个或多个氨基酸回复突变，和/或所述重链可变区中包含38K、40R、48I、66K、67A、69L、71L和73K中的一个或多个氨基酸回复突变。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，所述框架区变体包含选自以下(a-1)或(b-1)所述的突变：
(a-1)所述轻链可变区中包含22S、85I和87H的氨基酸回复突变，和所述重链可变区中包含48I和82T的氨基酸回复突变；或
(b-1)所述轻链可变区中包含选自4L的氨基酸回复突变。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其中：
(vii)所述重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：4所示；或
(viii)所述重链可变区序列如SEQ ID NO:24、25、26或27所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：21、22或23所示；或
(ix)所述重链可变区序列如SEQ ID NO:5所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：6所示；或
(x)所述重链可变区序列如SEQ ID NO:31、32、33或34所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：28、29或30所示。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其中：所述抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
(xi)所述重链可变区序列如SEQ ID NO:31所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO:29所示；或
(xii)所述重链可变区序列如SEQ ID NO:26所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO:23所示。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其中：轻链可变区和重链可变区可以为如下表格所示的轻重链可变区的组合：
表1.mAb1901人源化抗体轻重链可变区组合
可变区 VH1 VH2 VH3 VH4
VL1 VH1VL1 VH2VL1 VH3VL1 VH4VL1
VL2 VH1VL2 VH2VL2 VH3VL2 VH4VL2
VL3 VH1VL3 VH2VL3 VH3VL3 VH4VL3
表2.mAb1902人源化抗体轻重链可变区组合
可变区 VH11 VH12 VH13 VH14
VL11 VH11VL11 VH12VL11 VH13VL11 VH14VL11
VL12 VH11VL12 VH12VL12 VH13VL12 VH14VL12
VL13 VH11VL13 VH12VL13 VH13VL13 VH14VL13
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其中所述抗体进一步包含抗体恒定区。在一些具体的实施方案中，所述抗体的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其变体，所述抗体的轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其变体。在一些具体的实施方案中，所述抗体包含序列如SEQ ID NO:7所示的重链恒定区和序列如SEQ ID NO:8所示的轻链恒定区。在一些具体的实施方案中，所述抗体包含：与SEQ ID NO:35或42所示氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的重链，和与SEQ ID NO:36或39所示氨基酸序列有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的轻链；或
与SEQ ID NO:37或49所示氨基酸序列具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:38或46所示氨基酸序列有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的轻链。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其包含：
(c)序列如SEQ ID NO:35所示的重链和/或序列如SEQ ID NO：36所示的轻链；
(d)序列如SEQ ID NO:42、43、44或45所示的重链和/或序列如SEQ ID NO：39、40或41所示的轻链；
(e)序列如SEQ ID NO:37所示的重链和/或序列如SEQ ID NO：38所示的轻链；或
(f)序列如SEQ ID NO:49、50、51或52所示的重链和/或序列如SEQ ID NO：46、47或48所示的轻链。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，所述抗体与前述的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段竞争性结合人Claudin18.2。
在一些实施方案中，如前所述抗Claudin18.2抗体，其包含:
氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的重链，和序列如SEQ ID NO:41所示的轻链；或
氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的重链，和序列如SEQ ID NO:47所示的轻链。
本公开的另一方面还提供一种核酸分子，其编码如前所述的抗Claudin18.2抗体。
本公开的另一方面还提供一种表达载体，其包含如前所述的核酸分子。
本公开的另一方面还提供一种宿主细胞，其包含如如前所述的核酸分子或如前所述的表达载体，优选所述细胞为细菌细胞、真菌细胞、昆虫动物细胞或哺乳动物细胞。
本公开的另一方面还提供一种抗体药物偶联物，其为由根据如前所述的抗Claudin18.2抗体与细胞毒性药物偶联形成的抗体药物偶联物。
本公开的另一方面还提供一种抗体药物偶联物，其包含或由以下组成：共价结合有细胞毒性药物的前述抗Claudin18.2抗体。
在一些实施方案中，本公开提供一种如前所述的Claudin18.2抗体的制备方法。
在一些实施方案中，本公开提供一种如前所述的Claudin18.2抗体药物偶联物的制备方法。
在一些实施方案中，本公开提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据如前所述的抗Claudin18.2抗体，或根据如前所述的核酸分子，或如前所述的抗体药物偶联物，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
在一些实施方案中，本公开提供一种用于免疫检测或测定Claudin18.2的方法，所述方法包括用如前所述的抗Claudin18.2抗体接触待测样本的步骤。
在一些实施方案中，本公开提供如前所述的抗Claudin18.2抗体在制备免疫检测人Claudin18.2的试剂中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供一种用于免疫检测或测定Claudin18.2的如前所述的抗Claudin18.2抗体。
在一些实施方案中，本公开提供一种试剂盒，其包含根据如前所述的抗Claudin18.2抗体。
在一些实施方案中，本公开提供如前所述的抗Claudin18.2抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的抗体药物偶联物或如前所述的药物组合物在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途，其中所述癌症或肿瘤优选Claudin18.2阳性癌症或恶性肿瘤，更优选头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经***癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、膀胱癌、***癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。
在一些实施方案中，本公开提供一种治疗与Claudin18.2相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的抗Claudin18.2抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的抗体药物偶联物或如前所述的药物组合物，其中所述疾病优选为癌症或肿瘤；更优选的Claudin18.2阳性癌症或恶性肿瘤，更优选选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经***癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、膀胱癌、***癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌。更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。
在一些实施方案中，所述治疗有效量为单位剂量的组合物中含有0.1mg至3000mg或1mg至1000mg如前所述的抗Claudin18.2抗体或如前所述的抗体药物偶联物。
在一些实施方案中，本公开提供一种用于治疗与Claudin18.2相关的疾病如前所述的抗Claudin18.2抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的抗体药物偶联物或如前所述的药物组合物，其中所述疾病优选为癌症或肿瘤；更优选的Claudin18.2阳性癌症或恶性肿瘤，更优选选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经***癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、膀胱癌、***癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌。更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。
在一些实施方案中，所述癌症为胃癌、食道癌、肺癌、胰腺癌。
在一些实施方案中，如前所述抗体、抗体药物偶联物可以在Claudin18.2高表达、中表达、低表达的如前所述癌症中发挥治疗作用。
本公开提供的Claudin18.2抗体及抗体药物偶联物具有与细胞表面抗原良好的亲和力，良好的细胞内吞效率和很强的肿瘤抑制效率，并且具有更宽的药物应用窗口，适于临床的药物应用。
附图说明
图1：在细胞水平上，人源化抗体与人Claudin18.2结合的FACS检测结果。
图2：人源化抗体的NUGC4细胞内吞实验。
图3A至图3C：在不同Claudin18.2表达程度的NUGC4细胞中，抗体的ADCC效应检测。图3A为抗体在野生型NUGC4细胞(Claudin18.2低表达)中的ADCC效应检测；图3B为抗体在Claudin18.2中等表达NUGC4细胞中的ADCC效应检测；图3C为抗体在Claudin18.2高表达NUGC4细胞中的ADCC效应检测。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“细胞毒性药物”是指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。包括毒素、化疗药物等能用于杀伤细胞的化合物。
术语“毒素”是指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质，可以是来自细菌、真菌、植物或动物的小分子毒素及其衍生物，包括喜树碱类衍生物如伊沙替康，美登木素生物碱及其衍生物(CN101573384)如DM1、DM3、DM4、奥利斯他汀F(AF)及其衍生物，如MMAF、MMAE、3024(WO 2016/127790 A1，化合物7)、白喉毒素、外毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、modeccin、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
术语“化疗药物”是可用于***的化合物。该定义还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的抗激素剂，且常常是***或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。化疗药物实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)；环磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸脂如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶和甲基蜜胺(methylamelamine)包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚胺嗪(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素(authramycin)，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(calicheamicin)，carabicin，洋红霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin,嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶吟，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；喋吟类似物氟达拉滨(f1udarabine)，6-巯基蝶呤，硫咪蝶呤，硫鸟蝶呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxitluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类如二***(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内脂；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
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雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2'，2"-三氯二乙胺(trichlorrotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌溴烷坑(pipobroman)；gacytosine；***糖苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉烷，如紫杉醇(
Figure GDA0003789392030000082
Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)和docetaxel(
Figure GDA0003789392030000083
Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷航胶；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜磷酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸esperamicins；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗***制剂包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，雷洛昔芬(keoxifene)，LY117018，奥那斯酮(onapristone)，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。
本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的针对人Claudin18.2的单克隆抗体。制备时用Claudin18.2或其表位作为抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后***表达载体中，最后在真核***或原核***中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的Claudin18.2嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(例如L234A和/或L235A突变，和/或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将非人物种的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由酵母菌展示对CDR进行亲和力成熟突变后的人源化抗体。
在本公开一个的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段，可进一步包含人源或鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区；优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(例如L234A和/或L235A突变、和/或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
本公开中所述人抗体的重链恒定区和人抗体的轻链恒定区的“变体”是指现有技术已公开的来源于人的不改变抗体可变区结构和功能的重链恒定区或轻链恒定区的变体。示例性变体包括对重链恒定区进行定点改造和氨基酸替换的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区变体；具体替换如现有技术已知的YTE突变、L234A和/或L235A突变、S228P突变、和/或获得knob-into-hole结构的突变(使抗体重链具有knob-Fc和hole-Fc组合)，这些突变已被证实使得抗体具有新的性能，但不改变抗体可变区的功能。
“人抗体”(HuMAb)、“人源抗体”、“全人抗体”、“完全人抗体”可以互换使用，可以是源于人的抗体或者是从一种转基因生物体中获得的抗体，该转基因生物体经“改造”以响应于抗原刺激而产生特异性人抗体，并且可以通过本领域已知的任何方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座元件引入到源于胚胎干细胞系的细胞株中，这些细胞株中的内源性重链和轻链基因座遭到靶向破坏。转基因生物可以合成对人抗原特异的人抗体，并且该生物可以用于产生分泌人抗体的杂交瘤。人抗体还可以是一种抗体，其中重链和轻链是由源于一个或多个人DNA来源的核苷酸序列编码的。完全人抗体还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，或者由体外活化的B细胞构建，所有的这些都是本领域已知的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、“完全抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，与下文定义的抗原结合片段相区分。该术语特别指在轻链和重链中包含恒定区的抗体。本公开“抗体”包含“全长抗体”及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的全长抗体包括由以下表中轻重链可变区组合中的轻链可变区与轻链恒定区连接和重链可变区与重链恒定区连接后所形成的全长抗体。本领域技术人员可以根据实际需要选择不同的抗体来源的轻链恒定区、重链恒定区，例如人抗体来源的轻链恒定区和重链恒定区。
术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指保持特异性结合抗原(例如，Claudin18.2)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL经链间二硫键形成的抗原结合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的双抗体、双特异性抗体和多特异性抗体。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
Fab是通过用木瓜蛋白酶相同活性的酶处理IgG抗体分子所获得的片段中具有抗原结合活性的抗体片段。
F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶相同活性的酶消化IgG，而获得的具有抗原结合活性的抗体片段。
Fab'是通过切割上述F(ab')2而获得的具有抗原结合活性的抗体片段。
此外，可以通过将编码Fab'片段的DNA***到表达载体中，并将载体导入到宿主中来生产所述Fab'。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有通用结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。可用于本公开的其他接头由以下文献描述，例如但不限于：Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731；Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106；Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061；Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.。
双抗体是其中scFv或Fab被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。
双特异性抗体和多特异性抗体是指能结合两个或多个抗原或抗原决定簇的抗体。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(例如ProteinEngineering，7，697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
术语“氨基酸差异”或“氨基酸突变”是指相较于原蛋白质或多肽，变体蛋白质或多肽存在氨基酸的改变或突变，包括在原蛋白质或多肽的基础上发生1个、2个、3个或多个氨基酸的***、缺失或替换。
术语“抗体框架”或“FR区”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“互补决定区”、“CDR”或“高变区”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体所结合的部位(例如，Claudin18.2分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M或10-9M的解离平衡常数(KD)结合Claudin18.2或其表位，例如，在本公开中抗体与细胞表面抗原的亲和力采用FACS法测定KD值。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如Claudin18.2抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold SpringHarbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，优选是双链DNA或单链mRNA或修饰的mRNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
氨基酸序列“同一性”指在比对氨基酸序列时(必要时引入间隙)，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“表达载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人Claudin18.2或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、293细胞和NS0细胞。
本公开的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染宿主细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人Claudin18.2特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种抗体或抗原结合片段的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。
表3.示例性氨基酸保守取代
Figure GDA0003789392030000151
Figure GDA0003789392030000161
“有效量”或“有效剂量”指指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶抗原相关病症的进展。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。
“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。通常，当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同一性。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS):Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish，W.等人，(1993)NatureGenet.3:266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7:649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑传代数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
“分离的”指分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”并不意图指完全不存在这些材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以显著干扰如本文所述的化合物的实验或治疗用途的量存在。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
此外，本公开包括用于治疗与目标抗原(例如Claudin18.2)阳性细胞相关的疾病的药剂，所述药剂包含本公开的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
本公开中与Claudin18.2相关的疾病没有限制，只要它是与Claudin18.2相关的疾病即可，例如，本公开的分子诱导的治疗反应包括：(1)通过结合人类Claudin18.2，阻遏Claudin18.2与其受体/配体的结合，或(2)杀伤过表达Claudin18.2的肿瘤细胞。因此，当处于适于治疗应用的制备物和制剂中时，本公开的分子对这样一些人是非常有用的，他们患有肿瘤或癌症，优选黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、膀胱癌等。
此外，本公开涉及用于免疫检测或测定目标抗原(例如Claudin18.2)的方法、用于免疫检测或测定目标抗原(例如Claudin18.2)的试剂、用于免疫检测或测定表达目标抗原(例如Claudin18.2)的细胞的方法和用于诊断与目标抗原(例如Claudin18.2)阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本公开的特异性识别目标抗原(例如人Claudin18.2)并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的抗体或抗体片段作为活性成分。
在本公开中，用于检测或测定目标抗原(例如Claudin18.2)的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
上述与Claudin18.2阳性细胞相关的疾病可以通过用本公开的抗体或抗体片段检测或测定表达Claudin18.2的细胞来诊断。
为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS***(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中，对用于检测或测定目标抗原(例如Claudin18.2)的待测样品没有特别限制，只要它具有包含表达目标抗原(例如Claudin18.2)的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
在以上说明书中提出了本发明一种或多种实施方式的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本发明，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本发明的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。这些实施例不应以任何方式理解为限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书限定。
实施例
实施例1：构建高表达Claudin18.2的细胞株
用Lipofectamine 3000转染试剂，将pCDH-hClaudin18.2慢病毒表达载体质粒与pVSV-G,pCMV-dR8.91慢病毒***包装载体转染至病毒包装细胞293T中；收集含有病毒的培养基上清，过滤并进行超高速离心；使用浓缩后的病毒感染人胃印戒细胞癌细胞株NUGC4，经puromycin筛选两至三周，再进行FACS单细胞分选。
根据肿瘤IHC评分来区分Claudin18.2表达程度。与肿瘤IHC评分为3分的肿瘤Claudin18.2表达水平相当的细胞为高表达细胞，与肿瘤IHC评分为2分的肿瘤Claudin18.2表平水平相当的细胞为中等表达细胞。根据通过FACS检测慢病毒感染的NUGC4细胞表面的Claudin18.2表达，挑选出Claudin18.2表达量高的NUGC4/hClaudin18.2单克隆细胞株。同时通过FACS检测野生型NUGC4细胞表面的Claudin18.2表达，挑选出Claudin18.2表达量中等的NUGC4克隆细胞株，野生型NUGC4为Claudin18.2低表达量细胞。
将挑选出的单克隆细胞株扩大培养，冻存备库以便后续实验。
Claudin18.2序列Genbank:NP_001002026：(SEQ ID NO:1)
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKAST G F G S N T K N K K I Y D G G A R T E D E V Q S Y P S K H D Y V。
Claudin18.2 DNA序列：(SEQ ID NO:2)
Figure GDA0003789392030000181
Figure GDA0003789392030000191
实施例2：抗人claudin18.2单克隆抗体产生
1免疫
通过免疫小鼠产生抗人Claudin18.2单克隆抗体。
实验用SJL白小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为huClaudin18.2-HEK293细胞(转染人Claudin18.2质粒的HEK-293稳转细胞株)。
免疫方案：首次免疫细胞前，用
Figure GDA0003789392030000201
Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)0.1ml/只注射小鼠腹膜内(IP)；半小时后每只小鼠腹膜内(IP)注射0.1ml生理盐水稀释至1×108/ml浓度的细胞液。细胞吹散均匀后进行接种，时间为第0、14、28、42、56天。于第21，35，49，63天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在第4-5次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射1×107细胞。
2脾细胞融合
采用PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure GDA0003789392030000202
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。杂交瘤细胞以0.5-1×106/ml的密度用完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI的IMDM培养基)重悬，100μl/孔种于96孔板中，37℃，5％CO2孵育3-4天后，补充HAT完全培养基100μl/孔，继续培养3-4天至形成克隆。去除上清，加入200μl/孔的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的IMDM培养基)，37℃，5％CO2培养3天后进行ELISA检测。
3杂交瘤细胞筛选
根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法检测培养上清。选择与huClaudin18.2-HEK293细胞结合能力强，同时与HEK293细胞没有结合的细胞，及时进行扩增冻存；经过二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。
每次亚克隆细胞均需进行细胞结合实验。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。
实施例3：鼠源抗体的人源化
挑选出体外活性高的单克隆杂交瘤细胞株mAb1901，mAb1902；克隆其中的单克隆抗体序列，再进行人源化、重组表达和活性评价。
从杂交瘤中克隆序列的过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)并进行反转录(PrimeScriptTMReverse Transcriptase，Takara,cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-PrimerSet(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增，送测序公司测序。得到的DNA序列对应的氨基酸序列SEQ ID NO:3-6所示：
mAb1901鼠源重链可变区(SEQ ID NO:3)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSS。
mAb1901鼠源轻链可变区(SEQ ID NO:4)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELK。
mAb1902鼠源重链可变区(SEQ ID NO:5)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSS。
mAb1902鼠源轻链可变区(SEQ ID NO:6)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIK。
上述鼠源重链可变区和轻链可变区，分别与下述人IgG1抗体的重链恒定区和人源κ轻链恒定区连接，形成嵌合抗体ch1901和ch1902。
恒定区选自以下序列：
人IgG1抗体的重链恒定区：(SEQ ID NO:7)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
人源κ轻链恒定区：(SEQ ID NO:8)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
如本领域许多文献公示的方法，对鼠源单克隆抗体进行人源化。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种系抗体序列，进行CDR移植。本发明选择活性好的候选分子进行人源化，结果如下。
1.鼠源抗体的CDR区
表4中VH/VL CDR的氨基酸残基由Kabat编号***确定并注释。
鼠源抗体的CDR序列如表4所述：
表4.鼠源抗体的CDR序列
抗体 mAb1901
HCDR1 DYGIH(SEQ ID NO:9)
HCDR2 YISRGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO:10)
HCDR3 GGYDTRNAMDY(SEQ ID NO:11)
LCDR1 KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:12)
LCDR2 GASTRAS(SEQ ID NO:13)
LCDR3 QNDLYYPLT(SEQ ID NO:14)
抗体 mAb1902
HCDR1 SYWMH(SEQ ID NO:15)
HCDR2 MIHPNSGSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)
HCDR3 LKTGNSFDY(SEQ ID NO:17)
LCDR1 KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:18)
LCDR2 WASTRES(SEQ ID NO:19)
LCDR3 QNAYTYPFT(SEQ ID NO:20)
2.选择人种系FR区序列
在所获得的鼠源抗体VH/VLCDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与抗体Germline数据库比较，获得同源性高的人种系模板。其中人类种系轻链框架区来自人κ轻链基因。
2.1mAb1901的人源化改造和回复突变设计
选择适当的人抗体种系，对mAb1901鼠源抗体进行人源化改造，将鼠源抗体mAb1901的CDR区移植到选择的人源化模板上，得到人源化可变区，其人源化重链可变区序列为SEQ ID NO:24和轻链可变区序列为SEQ ID NO:21；再与IgG恒定区重组，形成完整抗体。同时，对人源化抗体的V区中FR区进行回复突变，示例性回复突变方式及组合如下：
表5.mAb1901人源化抗体及回复突变*
Figure GDA0003789392030000221
*表格中所有氨基酸位置编号为Kabat编号规则的编号，重链可变区的N82T中，82为Kabat规则的第82A位。
表6.mAb1901人源化抗体轻链可变区和重链可变区序列
Figure GDA0003789392030000222
Figure GDA0003789392030000231
上表中对应重链可变区可与SEQ ID NO：7所示的人IgG1重链恒定区连接形成全长抗体的重链，轻链可变区与SEQ ID NO：8所示的人κ轻链恒定区连接形成全长抗体的轻链。在其他实施方案中，重链可变区和轻链可变区也可与其他重链恒定区和轻链恒定区分别连接形成全长抗体。
2.2mAb1902的人源化改造和回复突变设计
选择适当的人抗体种系，对mAb1902鼠源抗体进行人源化改造，将鼠源抗体mAb1902的CDR区移植到选择的人源化模板上，得到人源化可变区，其人源化重链可变区序列为SEQ ID NO:31和轻链可变区序列为SEQ ID NO:28；再与IgG恒定区重组，形成完整抗体。同时，对人源化抗体的V区中FR区进行回复突变，示例性回复突变方式及组合如下：
表7.mAb1902人源化抗体及其回复突变设计*
Figure GDA0003789392030000232
*表格中所有氨基酸位置编号为Kabat编号规则的编号。
表8.mAb1902人源化抗体轻链可变区和重链可变区序列
Figure GDA0003789392030000233
Figure GDA0003789392030000241
上表中对应重链可变区与SEQ ID NO：7所示的人IgG1重链恒定区连接形成全长抗体的重链，轻链可变区与SEQ ID NO：8所示的人κ轻链恒定区连接形成全长抗体的轻链。
示例性的，抗体全长序列如下：
嵌合抗体ch1901：
ch1901重链：(SEQ ID NO:35)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
ch1901轻链(SEQ ID NO:36)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
嵌合抗体ch1902：
ch1902重链(SEQ ID NO:37)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
ch1902轻链(SEQ ID NO:38)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
表9.mAb1901人源化抗体
Figure GDA0003789392030000251
全长抗体轻重链序列如下所示：
表10.mAb1901人源化抗体轻链和重链序列
Figure GDA0003789392030000252
Figure GDA0003789392030000261
表11.mAb1902人源化抗体
Figure GDA0003789392030000262
全长抗体轻重链序列如下所示：
表12.mAb1901人源化抗体轻链和重链序列
Figure GDA0003789392030000263
Figure GDA0003789392030000271
本公开阳性对照抗体为IMAB-362(来自WO2016166122)：
IMAB-362重链(SEQ ID NO:53)
Figure GDA0003789392030000272
Figure GDA0003789392030000281
IMAB-362轻链(SEQ ID NO:54)
Figure GDA0003789392030000282
用常规的基因克隆、重组表达的方法分别克隆、表达、纯化上述抗体。
体外活性生物学评价
测试例1：Cell水平ELISA结合实验
基于细胞的ELISA实验被用来检测Claudin18.2抗体的结合特性。将稳转表达Claudin18.2的NUGC4细胞培养于96孔细胞板(Corning，3599)中，待生长至90％密度时加入4％多聚甲醛固定细胞1小时，用PBST缓冲液(pH 7.4PBS含0.05％Tween-20)洗板3次后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板3次后，加入50μl/孔用样品稀释液(pH7.4 PBS含1％脱脂乳)稀释的不同浓度待测抗体，放于37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research,109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL,52-00-03)，于室温孵育10-15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用MD Versa Max TM酶标仪在450nm处读取吸收值，计算Claudin18.2抗体对Claudin18.2的结合EC50值(结果见下表)。
表13.抗体的结合活性
抗体 IMAB362 ch1901 ch1902
Emax 1.175 1.399 1.272
EC50(nM) 0.108 0.098 0.074
表14-1.mAb1901人源化抗体的结合活性
抗体 Emax EC50(nM)
IMAB362 1.115 0.086
h1901-2 1.039 0.076
h1901-3 1.1055 0.22
h1901-4 0.986 0.201
h1901-6 0.937 0.091
h1901-7 0.921 0.166
h1901-8 1.047 0.091
h1901-11 1.44 0.076
h1901-12 1.22 0.116
表14-2.mAb1902人源化抗体的结合活性
抗体 Emax EC50(nM)
IMAB362 0.88 0.187
h1902-1 0.87 0.113
h1902-2 0.88 0.107
h1902-3 0.84 0.175
h1902-4 0.82 0.087
h1902-5 0.9 0.098
h1902-6 0.78 0.141
h1902-7 0.75 0.121
h1902-8 0.89 0.132
h1902-9 0.75 0.137
h1902-10 0.89 0.133
测试例2：抗体细胞水平结合实验
将稳转表达Claudin18.2的NUGC4细胞用FACS缓冲液(2％胎牛血清(Gibco，10099141)pH7.4 PBS(Sigma,P4417-100TAB))制备成1×106/ml的细胞悬液，100μl/孔加入96孔圆底板(Corning，3795)中。离心去除上清后加入50μl/孔用FACS缓冲液稀释的不同浓度待测Claudin18.2抗体，放于4℃冰箱中避光孵育1小时。以FACS缓冲液300g离心洗涤3次后，加入工作浓度的Alexa Fluor 488包被的抗人IgG(H+L)(invitrogen,A-11013)，放于4℃冰箱中避光孵育40分钟。以FACS缓冲液300g离心洗涤3次后，在BD FACS CantoII流式细胞仪上检测几何平均数荧光强度，计算Claudin18.2抗体对稳转表达Claudin18.2的NUGC4细胞的结合EC50值，结果见图1。
测试例3：抗体内吞实验
将预标记了DyLight 488NHS Ester(thermofisher，46403)的待测Claudin18.2抗体，以5μg/ml终浓度加入1×106/ml稳转表达Claudin18.2的NUGC4细胞中，放于冰上避光孵育1小时，以预冷的FACS缓冲液(pH7.4 PBS，2％胎牛血清)离心洗涤3次，去上清后加入预热的完全培养基，放入37℃5％CO2细胞培养箱。分别在0、0.5、1、2、4小时后取出细胞，放置于冰上避光保存。待样品全部收集后，300g低温离心去除上清，加入洗脱缓冲液(pH1.7 0.05M甘氨酸，0.1M氯化钠)后，室温孵育7分钟，以FACS缓冲液300g离心洗涤1次，在BD FACSCantoII流式细胞仪上检测几何平均数荧光强度，计算Claudin18.2抗体对稳转表达Claudin18.2的NUGC4细胞的内吞效率。结果显示(见图2)，人源化抗体具有良好的细胞内吞效率。
测试例4：基于流式细胞技术测定抗体亲和力
实验当天收集HEK293/hClaudin18.2细胞于U底96孔板中，每孔1×105至2×105个细胞。加入起始浓度5μg/ml，2×梯度稀释(12个浓度点)的Claudin18.2抗体，4℃孵育1小时，阳性对照为IMAB362，同时设置不加抗体的阴性对照。离心去除抗体，再加入100μl/孔FITC抗人IgG Fc抗体(200×)，4℃避光孵育30分钟，用PBS+2％FBS清洗两遍后准备进行流式细胞检测。启动BD FACS CantoII，预热完成后打开BD FACSDiva软件，建立一个新的实验，检测HEK293/hClaudin18.2阴性对照样品，调节FSC及SSC电压至适当的数值并保存。根据QuantumTM FITC-5MESF Kit说明书，分别检测空白样品B及标准曲线1，调节FITC电压至适当的数值并保存。在保存的电压下检测U底96孔板中的样品，记录数据。使用Flowjo软件分析实验数据得到Geo Mean数值，根据QuantumTMFITC-5MESF Kit说明书拟合MESF-Geo Mean标准曲线，根据FITC抗人IgG Fc抗体的浓度荧光值计算出与HEK293/hClaudin18.2细胞结合的Claudin18.2抗体的摩尔浓度及游离抗体浓度，利用Scatchard作图法计算抗体的Bmax和解离常数KD。结果见表15。
表15.人源化抗体细胞水平亲和力
抗体 IMAB362 h1901-11 h1902-5
KD(nM) 10.2 6.8 1.64
测试例5：抗体的ADCC效应评价
消化各种NUGC4细胞(高中低表达Claudin18.2)，1000rpm离心后，重悬计数。将细胞以3×105细胞/ml的密度重悬在添加10％FBS(新西兰超低IgG胎牛血清，Gibco,1921005PJ)的无酚红RPMI 1640中(Gibco,11835-030)。在96孔板(Corning,3903)中，每孔加入25μl细胞(7500个/孔)。将抗体稀释在上述无酚红培养基中，配制成3×的抗体稀释液，向细胞板中加入25μl/孔的抗体。在37℃、5％CO2培养箱中孵育0.5小时。
收集效应细胞(FcrR3A-V158-NFAT-RE-Jurkat细胞)，1000rpm离心后，重悬计数。将细胞以3×106细胞/ml的密度重悬在添加10％FBS(新西兰超低IgG胎牛血清)的无酚红RPMI 1640中，在实验板中每孔加入25μl细胞(7.5×104个细胞/孔)。在37℃、5％CO2培养箱中孵育6小时。
向实验板的每个孔中加入75μl/孔的Bright-Glo(Promega,E2610)，用酶标仪(PerkinElmer,VITOR3)检测化学发光(luminescence)。
结果显示(见表16和图3A-图3C)，在低中高不同程度Claudin18.2表达的NUGC4细胞中，抗体h1901-11和h1902-5均显示出很强的ADCC活性。
表16.抗体在Claudin18.2不同表达程度的NUGC4细胞中的ADCC效应
Figure GDA0003789392030000301
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司
上海恒瑞医药有限公司
<120> 抗Claudin18.2抗体及其应用
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<223> Claudin18.2蛋白
<400> 1
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 2
<211> 3350
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<223> Claudin18.2
<400> 2
agaattgcgc tgtccacttg tcgtgtggct ctgtgtcgac actgtgcgcc accatggccg 60
tgactgcctg tcagggcttg gggttcgtgg tttcactgat tgggattgcg ggcatcattg 120
ctgccacctg catggaccag tggagcaccc aagacttgta caacaacccc gtaacagctg 180
ttttcaacta ccaggggctg tggcgctcct gtgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240
gccggggcta cttcaccctg ctggggctgc cagccatgct gcaggcagtg cgagccctga 300
tgatcgtagg catcgtcctg ggtgccattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat 360
gcatccgcat tggcagcatg gaggactctg ccaaagccaa catgacactg acctccggga 420
tcatgttcat tgtctcaggt ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacatgc 480
tggtgactaa cttctggatg tccacagcta acatgtacac cggcatgggt gggatggtgc 540
agactgttca gaccaggtac acatttggtg cggctctgtt cgtgggctgg gtcgctggag 600
gcctcacact aattgggggt gtgatgatgt gcatcgcctg ccggggcctg gcaccagaag 660
aaaccaacta caaagccgtt tcttatcatg cctcaggcca cagtgttgcc tacaagcctg 720
gaggcttcaa ggccagcact ggctttgggt ccaacaccaa aaacaagaag atatacgatg 780
gaggtgcccg cacagaggac gaggtacaat cttatccttc caagcacgac tatgtgtaat 840
gctctaagac ctctcagcac gggcggaaga aactcccgga gagctcaccc aaaaaacaag 900
gagatcccat ctagatttct tcttgctttt gactcacagc tggaagttag aaaagcctcg 960
atttcatctt tggagaggcc aaatggtctt agcctcagtc tctgtctcta aatattccac 1020
cataaaacag ctgagttatt tatgaattag aggctatagc tcacattttc aatcctctat 1080
ttcttttttt aaatataact ttctactctg atgagagaat gtggttttaa tctctctctc 1140
acattttgat gatttagaca gactccccct cttcctccta gtcaataaac ccattgatga 1200
tctatttccc agcttatccc caagaaaact tttgaaagga aagagtagac ccaaagatgt 1260
tattttctgc tgtttgaatt ttgtctcccc acccccaact tggctagtaa taaacactta 1320
ctgaagaaga agcaataaga gaaagatatt tgtaatctct ccagcccatg atctcggttt 1380
tcttacactg tgatcttaaa agttaccaaa ccaaagtcat tttcagtttg aggcaaccaa 1440
acctttctac tgctgttgac atcttcttat tacagcaaca ccattctagg agtttcctga 1500
gctctccact ggagtcctct ttctgtcgcg ggtcagaaat tgtccctaga tgaatgagaa 1560
aattattttt tttaatttaa gtcctaaata tagttaaaat aaataatgtt ttagtaaaat 1620
gatacactat ctctgtgaaa tagcctcacc cctacatgtg gatagaagga aatgaaaaaa 1680
taattgcttt gacattgtct atatggtact ttgtaaagtc atgcttaagt acaaattcca 1740
tgaaaagctc actgatccta attctttccc tttgaggtct ctatggctct gattgtacat 1800
gatagtaagt gtaagccatg taaaaagtaa ataatgtctg ggcacagtgg ctcacgcctg 1860
taatcctagc actttgggag gctgaggagg aaggatcact tgagcccaga agttcgagac 1920
tagcctgggc aacatggaga agccctgtct ctacaaaata cagagagaaa aaatcagcca 1980
gtcatggtgg cctacacctg tagtcccagc attccgggag gctgaggtgg gaggatcact 2040
tgagcccagg gaggttgggg ctgcagtgag ccatgatcac accactgcac tccagccagg 2100
tgacatagcg agatcctgtc taaaaaaata aaaaataaat aatggaacac agcaagtcct 2160
aggaagtagg ttaaaactaa ttctttaaaa aaaaaaaaaa gttgagcctg aattaaatgt 2220
aatgtttcca agtgacaggt atccacattt gcatggttac aagccactgc cagttagcag 2280
tagcactttc ctggcactgt ggtcggtttt gttttgtttt gctttgttta gagacggggt 2340
ctcactttcc aggctggcct caaactcctg cactcaagca attcttctac cctggcctcc 2400
caagtagctg gaattacagg tgtgcgccat cacaactagc tggtggtcag ttttgttact 2460
ctgagagctg ttcacttctc tgaattcacc tagagtggtt ggaccatcag atgtttgggc 2520
aaaactgaaa gctctttgca accacacacc ttccctgagc ttacatcact gcccttttga 2580
gcagaaagtc taaattcctt ccaagacagt agaattccat cccagtacca aagccagata 2640
ggccccctag gaaactgagg taagagcagt ctctaaaaac tacccacagc agcattggtg 2700
caggggaact tggccattag gttattattt gagaggaaag tcctcacatc aatagtacat 2760
atgaaagtga cctccaaggg gattggtgaa tactcataag gatcttcagg ctgaacagac 2820
tatgtctggg gaaagaacgg attatgcccc attaaataac aagttgtgtt caagagtcag 2880
agcagtgagc tcagaggccc ttctcactga gacagcaaca tttaaaccaa accagaggaa 2940
gtatttgtgg aactcactgc ctcagtttgg gtaaaggatg agcagacaag tcaactaaag 3000
aaaaaagaaa agcaaggagg agggttgagc aatctagagc atggagtttg ttaagtgctc 3060
tctggatttg agttgaagag catccatttg agttgaaggc cacagggcac aatgagctct 3120
cccttctacc accagaaagt ccctggtcag gtctcaggta gtgcggtgtg gctcagctgg 3180
gtttttaatt agcgcattct ctatccaaca tttaattgtt tgaaagcctc catatagtta 3240
gattgtgctt tgtaattttg ttgttgttgc tctatcttat tgtatatgca ttgagtatta 3300
acctgaatgt tttgttactt aaatattaaa aacactgtta tcctacagtt 3350
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1901鼠源抗体重链可变区
<400> 3
Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Met Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1901鼠源抗体轻链可变区
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr His Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1902鼠源抗体重链可变区
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Pro Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1902鼠源抗体轻链可变区
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 7
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> DOMAIN
<223> 人IgG1抗体的重链恒定区
<400> 7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> DOMAIN
<223> 人源抗体κ轻链恒定区
<400> 8
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1901 HCDR1
<400> 9
Asp Tyr Gly Ile His
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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<400> 10
Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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<400> 11
Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1901 LCDR1
<400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1901 LCDR2
<400> 13
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser
1 5
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1901 LCDR3
<400> 14
Gln Asn Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1902 HCDR1
<400> 15
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1902 HCDR2
<400> 16
Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1902 HCDR3
<400> 17
Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1902 LCDR1
<400> 18
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> mAb1902 LCDR2
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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
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<220>
<221> DOMAIN
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<400> 20
Gln Asn Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VL1
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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100 105 110
Lys
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VL2
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VL3
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr His Cys Gln Asn
85 90 95
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100 105 110
Lys
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH1
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH2
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH3
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH4
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VL11
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VL12
<400> 29
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20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VL13
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH11
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH12
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH13
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> VH14
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> ch1901重链
<400> 35
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1 5 10 15
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Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Met Gly Leu Glu Trp Ile
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65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Thr Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
<210> 36
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> ch1901轻链
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr His Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Leu Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
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Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
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Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
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Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 48
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> L13
<400> 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 49
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> H11
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 50
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> H12
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 51
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> H13
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 52
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> H14
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 53
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> IMAB-362重链
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 54
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> CHAIN
<223> IMAB-362轻链
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220

Claims (21)

1.一种抗Claudin18.2抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，
所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗Claudin18.2抗体，其是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求2所述的抗Claudin18.2抗体，其为人源化抗体，所述人源化抗体包含来源自人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有1至10个回复突变。
4.根据权利要求3所述的抗Claudin18.2抗体，其中所述轻链可变区中包含选自4L和22S中的一个或多个回复突变，和/或所述重链可变区中包含选自38K、40R、48I、66K、67A、69L、71L和73K中的一个或多个回复突变。
5.根据权利要求2所述的抗Claudin18.2抗体，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
所述重链可变区序列如SEQ ID NO:5所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：6所示；或
所述重链可变区序列如SEQ ID NO:31、32、33或34所示和所述轻链可变区序列如SEQID NO：28、29或30所示。
6.根据权利要求5所述的抗Claudin18.2抗体，其中所述抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
所述重链可变区序列如SEQ ID NO:31所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO: 29所示。
7.根据权利要求6所述的抗Claudin18.2抗体，其进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
8.根据权利要求7所述的抗Claudin18.2抗体，其中所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4恒定区或其变体。
9.根据权利要求8所述的抗Claudin18.2抗体，其中所述轻链恒定区选自人抗体κ、λ链恒定区或其变体。
10.根据权利要求9所述的抗Claudin18.2抗体，其中所述抗Claudin18.2抗体包含SEQID NO:7所示的重链恒定区和SEQ ID NO:8所示的轻链恒定区。
11.根据权利要求10所述的抗Claudin18.2抗体，其包含：
SEQ ID NO:37所示的重链和SEQ ID NO：38所示的轻链；或
SEQ ID NO:49、50、51或52所示的重链和SEQ ID NO：46、47或48所示的轻链。
12.根据权利要求11所述的抗Claudin18.2抗体，其包含:
SEQ ID NO:49所示的重链，和SEQ ID NO:47所示的轻链。
13.一种核酸分子，其编码权利要求1至12任一项所述的抗Claudin18.2抗体。
14.一种宿主细胞，其包含如权利要求13所述的核酸分子。
15.一种抗体药物偶联物，其为由根据权利要求1至12任一项所述的抗Claudin18.2抗体与细胞毒性药物偶联形成的抗体药物偶联物。
16.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至12任一项所述的抗Claudin18.2抗体，或权利要求15所述的抗体药物偶联物，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
17.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至12任一项所述的抗Claudin18.2抗体。
18.权利要求1至12任一项所述的抗Claudin18.2抗体，或权利要求15所述的抗体药物偶联物或权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗与Claudin18.2相关的疾病的药物中的用途，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1至12任一项所述的抗Claudin18.2抗体，或权利要求15所述的抗体药物偶联物或权利要求16所述的药物组合物。
19.根据权利要求18所述的用途，所述疾病为肿瘤。
20.根据权利要求18或19所述的用途，所述疾病选自：头和颈癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌和卵巢癌。
21.根据权利要求20所述的用途，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
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