KR20230117183A - 새로운 종양 인게이저 치료 약물의 개발 및 이의 용도 - Google Patents

새로운 종양 인게이저 치료 약물의 개발 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230117183A
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Abstract

본 개시내용은 새로운 종양 인게이저 치료 약물의 개발 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 치료 약물은 GPC3 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 함유하고, 여기서 상기 이중특이적 항체는 표적 세포의 표면 상의 GPC3에 결합하는 제1 결합 도메인 및 T 세포의 표면 상의 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인을 함유한다. 상기 이중특이적 항체는 매우 낮은 용량으로 종양 성장을 억제하고 면역 재구성 마우스에서 이식 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 사이노몰구스 원숭이에서 수행된 독성학 연구도 또한 동물들이 이중특이적 항체에 대해 우수한 내성을 가지며 이중특이적 항체의 효능 및 안전성이 유사한 항체들보다 우수함을 보여준다.

Description

새로운 종양 인게이저 치료 약물의 개발 및 이의 용도
본 개시내용은 이중특이적 항체 및 이의 용도, 특히 새로운 종양 인게이저 치료 약물의 개발 및 이의 용도에 관한 것이다.
글리피칸-3(GPC3, 또한 DGSX, GTR2-2, MXR7, OCI-5, SDYS, SGB, SGBS 또는 SGBS1으로도 알려져 있음)은 포스파티딜이노시톨 프로테오글리칸으로, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG) 계열에 속하며, 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI)에 의해 세포막의 외부 표면에 고정되어 있다. GPC3 단백질의 코어는 580개의 아미노산으로 구성되며, 분자량이 약 65 kDa이다. 프로테아제 퓨린(Furin)은 358Arg-359Ser(355R-356Q-357Y-358R-359S) 사이를 절단하여 2개의 서브유닛을 형성한다. 2개의 헤파란 설페이트 폴리사카라이드 쇄는 세포외 기질의 중요한 성분인 막-근위 C-말단 서브유닛에 연결되어 있으며, Wnt, Hh(고슴도치) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)와 같은 다중 신호전달 경로를 통해 세포의 활성화에 관여할 수 있다(문헌[Li N et al, Glypicans as Cancer Therapeutic Targets, Trends Cancer. 2018]). GPC3은 다양한 태아 조직(간, 폐, 신장 및 태반)에서 발현된다. 출생 후, GPC3 유전자는 DNA 메틸화 변형으로 인해 더 이상 발현되지 않지만, 간세포 암종의 66 내지 90%, 폐 편평상피 암종의 54 내지 65%, 소세포 폐암의 16 내지 64%, 소화관 종양(식도암, 위암, 심장암) 및 일부 다른 유형의 암세포의 20 내지 30%와 같이 많은 종양 조직에서 GPC3 유전자가 발현을 재개한다(문헌[Kawaida M et al, Diffuse and canalicular patterns of glypican-3 expression reflect malignancy of hepatocellular carcinoma, Pathol Int. 2019 Mar;69(3):125-134]; 문헌[Yu X et al, Differential expression of glypican-3 (GPC3) in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma and its clinical significance, Genet Mol Res. 2015 Aug 28;14(3):10185-92]; 문헌[Ishiguro T et al, An anti-glypican 3/CD3 bispecific T cell-redirecting antibody for the treatment of solid tumors, Sci Transl Med. 2017 Oct 4;9(410):eaal4291]; 및 문헌[Baumhoer D et al, Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples, Am J Clin Pathol. 2008 Jun;129(6):899-906]). 병리적 부분에서 GPC3의 확산 발현은 HCC 세포의 낮은 분화 및 질병 예후와 상관관계가 있다. 최근의 보고에서는 GPC3이 GPC3-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)를 통해 마우스에서 종양 줄기세포를 효과적으로 사멸하고 종양 성장을 억제할 수 있는 종양 줄기세포 마커인 것으로 밝혀졌다(문헌[Okada M et al, Selective elimination of undifferentiated human pluripotent stem cells using pluripotent state-specific immunogenic antigen Glypican-3, Biochem Biophys Res Commun. 2019 Apr 9;511(3):711-717]).
T-세포 이중특이적 항체(또는 T-세포 어댑터)는 한쪽 말단에서 표적 세포 표면 항원(항원 암)을 인식하고 다른 쪽 말단에서 T-세포 CD3 수용체(CD3 아암)에 결합하는 특이적으로 구성된 항체 분자이다. CD3의 ε 쇄를 표적으로 하는 항체를 사용하여, T 세포상의 CD3은 TCR/펩티드/HLA와 유사한 방식으로 응집되어 T 세포를 활성화하고 종양을 사멸시킨다. BCMA x CD3 이중특이적 분자는 골수종 세포에서 발현되는 BCMA 및 T 세포에 존재하는 CD3ε 쇄(CD3e)를 표적으로 하는 T-세포 이중특이적(TCB) 항체이다. BCMA x CD3 이중특이적 분자의 작용 기전은 BCMA + 골수종 세포 및 CD3 + T 세포 둘 다에 대한 결합을 수반하여, T 세포 활성화 및 T 세포-매개 세포 사멸을 초래한다.
코드리투주맙(Codrituzumab)은 GPC3를 표적으로 하는 최초의 치료용 단일클론 항체이며 마우스 종양 모델에서 상당한 항종양 활성을 나타내었다. 그러나, 2상 임상시험(NCT01507168)에서, 코드리투주맙은 대조군에 비해 질병의 진행 및 전체 생존율에서 유의한 차이를 나타내지 않았다(문헌[Abou-Alfa GK et al, Randomized phase II placebo controlled study of codrituzumab in previous Treated Patients with Advanced Hepatocellular carcinoma, J Hepatol.2016 Aug;65(2):289-295]). 연구에 따르면 코드리투주맙은 종양에서 GPC3 발현이 높거나 CD16 친화성 돌연변이가 높은 환자에게 임상적 이점을 가져올 수 있는 것으로 밝혀졌다(문헌[Chen G et al,Combining expression of GPC3 in tumors and CD16 on NK cells from peripheral blood to identification patients responding to codrituzumab, Oncotarget 2018 Jan 2;9(12):10436-10444]). ERY974는 단일클론 항체보다 우수한 활성으로 T세포-매개 살해 효과를 통해 다양한 GPC3 양성 종양세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 항-GPC3/CD3 이중특이적 항체이다. 그러나, 강력한 부작용으로 인해, 2018년에 임상 연구가 중단되었고; 2019년에 1상 임상 시험이 재개된 후, 사이토카인 방출 증후군을 피하기 위해 IL-6 항체 토실리주맙(Tocilizumab)의 조합이 사용되었다.
선행 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 개시내용은 GPC3 단백질에 대한 높은 친화성을 갖는 새로운 GPC3 항체를 제공한다. 또한, 본 개시내용은 GPC3 항체 및 CD3 항체에 의해 형성된 새로운 GPC3-CD3 κλ 이중특이적 항체를 제공한다. GPC3 항체는 표적 세포에 대한 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있고, GPC3 항체는 GPC3-유도성 내포작용을 억제할 수 있다. GPC3-CD3 κλ 이중특이적 항체는 전장 IgG 구성을 취한다. 전하 및 친화성 최적화를 도입함으로써, κλ 이중특이적 항체는 우선적으로 GPC3+ 종양 조직으로 국소화된다. 상기 항체는 낮은 농도에서, 활성화된 T 세포를 동원하고 표적 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있지만, 표적 세포의 부재하에서는 T 세포를 활성화시키지 않는다. 동시에, κλ 이중특이적 항체는 FcγRI, Fcγ RIIA 및 Fcγ RIIIA와 같은 수용체에 결합하지 않아서 사이토카인 폭풍의 위험을 감소시킨다. 약력학적 시험은 새로운 GPC3-CD3 κλ 이중특이적 항체가 매우 낮은 용량에서 종양의 성장을 억제할 수 있고 면역 재구성 마우스에서 이식된 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주었다. 사이노몰구스 원숭이에서 수행된 독성학 연구도 또한 동물이 새로운 GPC3-CD3 κλ 이중특이적 항체에 대해 우수한 내성을 가지며 새로운 GPC3-CD3 κλ 이중특이적 항체의 효능 및 안전성이 유사한 항체보다 우수함을 보여주었다.
한 양태에서, 본 개시내용은 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 이전 양태에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 이전 양태에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 이전 양태에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분이 인간화된, 이전 양태들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
한 양태에서, 본 개시내용은 전술한 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학 조성물 또는 키트를 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 전술한 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 치료 모이어티에 공유적으로 부착되는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 함유하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 치료 효과량의, 전술한 양태들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, GPC3-관련 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 포유동물에서 GPC3-관련 질병을 치료하기 위한약물 또는 키트의 제조에 있어서 전술한 양태들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 항체는 GPC3 단백질의 검출, 및 GPC3-관련 질병의 진단, 치료 또는 예방과 같은 다양한 용도에 사용될 수 있다.
도 1은 재조합 GPC3 단백질에 대한 비환원 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 2는 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 3은 재조합 CD3εγ-Fc 단백질에 대한 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 4는 GPC3 항체 및 인간 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
도 5는 상이한 종의 GPC3 항원에 대한 항체 49G8의 결합을 보여준다.
도 6은 항체 49G8에 의해 매개되는 ADCC 효과를 보여준다.
도 7은 GPC3 항원에 대한 인간화 항체의 결합을 보여준다.
도 8은 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 인간화 항체의 결합을 보여준다.
도 9는 인간화 항체에 대한 Octet 친화성 분석을 보여준다.
도 10은 인간화 항체에 대한 SPR 친화성 분석을 보여준다.
도 11은 인간화 항체의 내포작용 결과를 보여준다.
도 12는 인간 CD3 εγ 항원에 대한 CD3 인간화 항체의 결합을 보여준다.
도 13은 Jurkat 세포에 대한 CD3 인간화 항체의 결합을 보여준다.
도 14는 인간 및 원숭이 CD3 εγ 항원에 대한 CD3 인간화 항체의 친화성을 비교한 것을 보여준다.
도 15는 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합을 보여준다.
도 16은 HepG2 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합을 보여준다.
도 17은 Jurkat 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합을 보여준다.
도 18은 말초혈 T 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합을 보여준다.
도 19는 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체에 의해 매개되는 TDCC 효과를 보여주며, 이때 도 19a는 HepG2 세포의 사멸을 보여주고 도 19b는 T 세포의 활성화를 보여준다.
도 20은 T 세포 NFAT 신호전달 경로에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 효과를 보여준다.
도 21은 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체에 의한 PBMC의 활성화를 보여준다.
도 22는 FcγR 활성화 수용체에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합을 보여준다.
도 23은 면역 재구성 마우스 HepG2 이종이식 모델에서 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 억제 효과를 보여준다.
도 24는 CD3 인간화 뮤린 Hepa1-6/hGPC3 이종이식 모델에서 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 억제 효과를 보여준다.
I. 정의
본 개시내용에서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본원에서 사용된 단백질 및 핵산 화학, 분자 생물학, 세포 및 조직 배양, 미생물학, 및 면역학 관련 용어 및 실험실 절차는 해당 분야에서 널리 사용되는 용어 및 통상적인 절차이다. 한편, 본 개시내용을 더 잘 이해시키기 위해, 관련 용어에 대한 정의 및 설명을 하기에 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "GPC3"은 동물 및 바람직하게는 인간에 함께 존재하는 GPC3 자체 및 이의 임의의 변이체, 동형 및 이원체(paralog)의 개념을 지칭할 수 있다.
"인간 GPC3"이라는 용어는 인간 기원의 GPC3을 지칭한다.
"항-GPC3 항체" 및 "GPC3-결합 항체"라는 용어는 항체가 GPC3을 진단제 및/또는 치료제로 표적화하는데 유용하도록 충분한 친화성하에 GPC3에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-GPC3 단백질에 대한 항-GPC3 항체의 결합 능력은, 예를 들어, 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정되는 GPC3에 대한 항체의 결합 능력의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, GPC3-결합 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-GPC3 항체는 상이한 종으로부터의 GPC3 사이에 보존된 GPC3 에피토프에 결합한다.
"CD3"은, 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간), 비-인간 영장류(예를 들어, 게잡이 원숭이(Macaca fascicularis)) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 기원의 임의의 천연 CD3을 지칭한다. 상기 용어는 "전장", 처리되지 않은 CD3, 및 세포로부터의 처리된 CD3의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 스플라이스 변이체 및 대립유전자 변이체와 같은 CD3의 천연 변이체를 포함한다. 하나의 실시양태에서, CD3은 인간 CD3, 특히 인간 CD3의 엡실론 서브유닛(CD3ε)이다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 UniProt(www.uniprot.org) 등록번호 P07766(버전 144) 또는 NCBI(www.ncbi.nlm. nih.gov/) RefSeq NP_000724.1에 나와 있다. 사이노몰구스 원숭이[Macaca fascicularis] CD3ε의 아미노산 서열은 NCBI GenBank NO. BAB71849.1에 나와 있다.
"세포 표면"이라는 용어는 당해 분야에서 이의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 다른 분자와의 결합을 통해 접근할 수 있는 세포 외부를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약" 또는 "대략적인"은 주어진 값 또는 범위의 ±10% 이내를 의미한다. 정수가 필요한 경우, 상기 용어는 주어진 값 또는 범위의 ±10% 이내에서 가장 가까운 정수로 반올림 또는 내림하는 것을 의미한다.
항체 쇄 폴리펩티드 서열과 관련하여, 실질적으로 동일한이란 어구는 참조 폴리펩티드 서열에 대한 항체 쇄의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성으로 이해해야 한다. 핵산 서열과 관련하여, 상기 용어는 참조 핵산 서열에 대한 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성보다 큰 것으로 이해해야 한다.
서열 "동일성"은 당해 분야에서 인식되는 의미를 가지며, 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 분자 또는 영역 사이의 서열 동일성의 백분율은 개시된 기술에 의해 계산될 수 있다. 서열 동일성은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드 또는 분자 영역의 전체 길이를 따라 측정할 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 많은 방법이 있지만, 동일성이라는 용어는 숙련자에게 잘 알려져 있다(문헌[Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)]).
"치환" 변이체는 천연 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 제거하고 동일한 부위에 다른 아미노산을 삽입하여 수득된 변이체를 지칭한다. 상기 치환은 분자 내 하나의 아미노산만이 치환되는 단일 치환일 수 있거나, 또는 상기 치환은 동일한 분자 내 2개 이상의 아미노산이 치환되는 다중 치환일 수 있다, 다중 치환은 연속 부위에 존재할 수 있다. 유사하게, 아미노산은 다수의 잔기로 치환될 수 있고, 따라서 이와 같은 변이체는 치환 및 삽입을 포함한다. 삽입 변이체는 아미노산에 바로 인접한 하나 이상의 아미노산을 천연 서열의 특정 부위에 삽입하여 수득된 변이체이다. 아미노산에 바로 인접한다는 것은 아미노산의 α-카복실 또는 α-아미노 작용기와의 연결을 의미한다. "결실" 변이체는 천연 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 제거하여 수득된 변이체를 지칭한다. 통상적으로, 결실 변이체는 그 분자의 특정 영역에 1개 또는 2개의 아미노산 결실을 갖는다.
항체의 가변 도메인과 관련하여, "가변"이라는 용어는 항체들 사이에 광범위한 서열 차이를 가지며 이의 특이적 표적에 대한 특이적 항체에 대한 특이적 인식 및 결합에 사용되는 관련 분자의 특정 부분을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 내에 위치한 상보성-결정 영역(CDR; 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 초가변 영역으로 알려진 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인 내의 보다 보존적인 부분은 프레임워크 영역(FR) 또는 프레임워크 서열로 지칭된다. 천연 중쇄 또는 경쇄의 각각의 가변 도메인은, 주로 β-접힘 구조를 취하고 3개의 CDR을 통해 서로 연결되는 4개의 FR을 포함하며, 상기 CDR은 루프를 형성하고, 루프는 β-접힘 구조와 연결되어 특정 경우에 β- 접힌 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 CDR은 통상적으로 FR 영역에 의해 인접하게 연결되며 다른 쇄의 CDR로 인해 항체의 표적 결합 부위(에피토프 또는 결정기)의 형성에 기여한다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역글로불린의 아미노산 잔기의 번호는 달리 명시되지 않는 한 카밧 등(Kabat et al.)에 의해 개발된 면역글로불린의 아미노산 잔기의 번호 시스템을 기반으로 한다. CDR은 동족 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체의 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 전장 항체보다 짧고, 적어도 항원에 결합하는 항체의 부분 가변 영역(예를 들어, 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 항체 결합 부위)을 함유하며 따라서 전장 항체의 결합 특이성 및 적어도 부분적인 특이적 결합 능력을 유지하는 전장 항체의 임의의 부분을 지칭한다. 그러므로, 항원-결합 단편은 항체 단편이 유래된 항체와 동일한 항원에 결합하는 항원-결합 부분을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편은 전장 항체의 효소 처리에 의해 생성된 항체 유도체, 및 재조합 유도체와 같은 합성 유도체를 포함한다. 항체는 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-가닥 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중 항체, Fd 및 Fd' 단편, 및 변형된 단편을 포함한 기타 단편을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 단편은, 예를 들어, 다이설파이드 결합 및/또는 펩티드 어댑터를 통해 서로 연결된 다중 쇄를 포함할 수 있다. 항체 단편은 일반적으로 적어도 또는 약 50개의 아미노산, 전형적으로 적어도 또는 약 200개의 아미노산을 함유한다. 항원-결합 단편은 항원에 (즉, 약 107 내지 108 M-1의 결합 상수 Ka하에) 특이적으로 결합하는 항체를 수득하기 위해 (예를 들어, 상응하는 영역을 대체함으로써) 항체 프레임워크에 삽입되는 임의의 항체 단편을 포함한다. "기능성 단편" 또는 "항-GPC3 항체의 유사체"는 리간드에 결합하거나 신호 전달을 개시하는 수용체의 능력을 방해하거나 실질적으로 감소시키는 단편 또는 유사체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 기능성 단편은 일반적으로 항체 단편과 동일한 의미를 가지며, 항체와 관련하여, 상기 기능성 단편은 수용체가 리간드에 결합하거나 신호 전달을 개시하는 능력을 방해하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 단편, 예를 들면, Fv, Fab, F(ab')2 등을 지칭할 수 있다. Fv 단편은 중쇄의 가변 도메인과 경쇄의 가변 영역의 비-공유 결합에 의해 형성된 이량체(VH-VL 이량체)로 이루어진다. 상기 구성에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은, 온전한 항체의 경우에서와 같이, 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상의 표적 결합 부위를 한정한다. 6개의 CDR은 함께 온전한 항체에 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 3개의 표적-특이적 CDR만 함유하는 Fv의 절반)도 여전히 표적을 인식하고 그에 결합하는 능력을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "이중특이적 항체(BsAb)"라는 용어는 2개의 상이한 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및/또는 항원-결합 분자를 지칭하며, 통상적으로 이중특이적 항체 및/또는 항원-결합 분자는 그 각각이 상이한 항원 결정기에 특이적인 2개의 항원-결합 부위를 함유한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체 및/또는 항원-결합 분자는 동시에 2개의 항원 결정기, 특히 2개의 상이한 유형의 세포에서 발현되는 2개의 항원 결정기에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "단일클론 항체"는 동일한 항체의 집단을 지칭하며, 이는 단일클론 항체 집단의 각각의 개별 항체 분자가 다른 항체 분자와 동일함을 의미한다. 이러한 특성은 다양한 상이한 서열을 가진 항체를 함유하는 항체의 다중클론 집단의 특성과 대조된다. 단일클론 항체는 많은 공지된 방법으로 제조할 수 있다(문헌[Smith et al. (2004) J.Clin. Pathol.57, 912-917]; 및 문헌[Nelson et al., J Clin Pathol (2000), 53, 111-117]). 예를 들어, 단일클론 항체는 B 세포를 불멸화시킴으로써, 예를 들어, 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포주를 생산하거나 B 세포를 EBV와 같은 바이러스로 감염시킴으로써 제조할 수 있다. 재조합은 또한 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드의 인공 서열을 운반하는 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 숙주 세포의 클론 집단으로부터 시험관내에서 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하이브리도마" 또는 "하이브리도마 세포"는 항체를 생성하는 림프구를 항체를 생성하지 않는 암세포와 융합시켜 생성된 세포 또는 세포주(통상적으로 골수종 또는 림프종 세포)를 지칭한다. 당해 분야의 통상의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같이, 하이브리도마는 증식하고 특정 단일클론 항체를 지속적으로 공급 및 생성할 수 있다. 하이브리도마를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 용어 "하이브리도마" 또는 "하이브리도마 세포"가 언급될 때, 이는 또한 하이브리도마의 서브클론 및 자손 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 전장 항체는 2개의 전장 중쇄(예를 들어, VH-CH1-CH2-CH3 및 VH-CH1-CH2-CH3-CH4), 2개의 전장 경쇄(VL-CL), 및 힌지 영역을 갖는 항체, 예를 들면, 항체-분비 B 세포에 의해 자연적으로 생성되는 항체 및 동일한 도메인을 갖는 합성 항체이다.
용어 "키메라 항체"는 한 종으로부터 유래된 가변 영역 서열 및 또 다른 종으로부터 유래된 불변 영역 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된다.
"인간화" 항체는, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 부분서열)인 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체 형태를 지칭한다. 바람직하게, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수용 항체)이고, 수용 항체의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기는 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는, 마우스, 래트, 및 토끼와 같은 비-인간 종의 CDR 잔기로 치환된다.
또한, 인간화시, 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)을 개선하기 위해, VH 및/또는 VL의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킬 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어, PCR-매개 돌연변이를 수행함으로써 도입될 수 있으며, 항체 결합 또는 다른 기능적 특성에 대한 그 영향은 본원에 기술된 시험관내 또는 생체내 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 통상적으로, 보존적 돌연변이가 도입된다. 상기 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 통상적으로 CDR 내에는 1개 또는 2개 이하의 돌연변이가 존재한다. 그러므로, 본 개시내용의 인간화 항체는 CDR이 1개 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 함유하는 항체도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 상보성-결정 영역을 지칭하며, 공지된 항체 분자의 각각의 중쇄 또는 경쇄는 3개의 CDR을 갖는다. CDR은 항체의 각각의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역에 존재하는 초가변 영역으로도 지칭되며, CDR의 1차 구조는 가변성이 매우 높은 부위를 갖는다. 상기 설명에서, 중쇄의 CDR은 중쇄의 아미노-말단 서열의 아미노-말단으로부터 유래된 CDR1, CDR2 및 CDR3로 나타내고, 경쇄의 CDR은 경쇄의 아미노-말단 서열의 아미노-말단으로부터 유래된 CDR1, CDR2 및 CDR3로 나타낸다. 이들 부위는 3차 구조에서 서로 인접하여 항체가 결합하는 항원의 특이성을 결정한다.
본원에 사용된 바와 같이, "에피토프"라는 용어는 항체의 파라토프가 결합하는 항원 상의 임의의 항원 결정기를 지칭한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 아미노산 및 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 유형을 함유하며, 통상적으로 특정한 3차원 구조적 특성 및 특정한 전하 특성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 "특이적 결합" 또는 "면역특이적 결합"은 본원에서 상호교환가능하며, 항체와 항원의 항체-결합 부위의 비공유적 상호작용을 통해 동일한 항원과 하나 이상의 비공유 결합을 형성하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 능력을 지칭한다. 항원은 분리된 항원이거나 종양 세포에 존재할 수 있다. 통상적으로, 항원에 면역특이적으로 결합하는(또는 특이적으로 결합하는) 항체는 약 1 x 107 M-1 또는 1 x 108 M-1 이상의 친화 상수 Ka(또는 1 x 107 M 또는 1 x 108 M 이하의 해리 상수(Kd))로 항원에 결합한다. 친화 상수는 면역분석, 표면 플라즈몬 공명(SPR)(문헌[Rich and Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54]; 및 문헌[Englebienne (1998) Analyst. 123:1599]), 등온 적정 열량계(ITC), 또는 당해 분야에 공지된 다른 동역학적 상호작용 분석과 같은 항체 반응에 대한 표준 동역학 방법에 의해 측정할 수 있다.(항체의 결합 친화성을 계산하기 위한 예시적인 SPR 및 ITC 방법을 기술하고 있는 특허 제7,229,619호). 결합 속도를 실시간으로 검출하고 모니터링하기 위한 기기 및 방법은 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다(문헌[Malmqvist (2000) Biochem.Soc.Trans. 27:335] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산 분자"는 통상적으로 포스포다이에스터 결합을 통해 서로 연결되는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하여 적어도 2개의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 함유하는 올리고머 또는 고분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. DNA 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며, cDNA일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 분리된 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자는 재조합에 의해 제조될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학적 성분이 실질적으로 없을 수 있다. 본원에서 제공되는 예시적인 분리된 핵산 분자는 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열, 영역, 요소 또는 도메인의 "작동 가능하게 연결되는"은 핵산 영역이 서로 기능적으로 관련되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 핵산의 전사를 조절하거나 매개하도록 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원의 서열 목록에 있는 서열의 "보존적 서열 변형", 즉 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 항원에 대한 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 변형도 또한 제공된다. 이러한 보존적 서열 변형은 보존적 뉴클레오타이드 및 아미노산 치환, 뉴클레오타이드 및 아미노산 부가 및 결실을 포함한다. 예를 들어, 당해 분야에 공지된 표준 기술(예를 들어, 부위-지향 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발)에 의해 본원의 서열 목록에 변형이 도입될 수 있다. 보존적 서열 변형은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 아미노산 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에 정의되어 있다. 상기 계열에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 및 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌 및 메티오닌), β 분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린 및 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)이 포함된다. 그러므로, 항-GPC3 항체에서 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 계열로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 항원에 대한 결합을 제거하지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)]; 문헌[Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)]; 문헌[Burks et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94: 412-417 (1997)]에 언급됨).
또 다른 선택지로서, 또 다른 실시양태에서, 돌연변이는, 예를 들어, 포화 돌연변이유발에 의해 항-GPC3 항체 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 수득된 변형된 항-GPC3 항체는 개선된 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역에 의해 폴리펩티드를 생성하는 과정을 지칭한다. 폴리펩티드의 발현 수준은, 예를 들어, 숙주 세포에 의해 생성된 폴리펩티드의 양을 측정하는 방법을 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다. 이와 같은 방법으로는 ELISA에 의한 세포 용해물 내 폴리펩티드의 정량화, 겔 전기영동 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색, 로리(Lowry) 단백질 분석 및 브래드포드(Bradford) 단백질 분석이 포함될 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 벡터를 수용, 유지, 복제 및 증폭하기 위한 세포이다. 숙주 세포는 또한 벡터에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 숙주세포가 분열하면, 벡터에 함유된 핵산이 복제되어 증폭된다. 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 CHO 세포, 다양한 COS 세포, HeLa 세포, 및 HEK 293 세포와 같은 HEK 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는, 벡터가 적절한 숙주 세포로 형질전환될 때 하나 이상의 이종 단백질이 발현될 수 있는 복제가능한 핵산이다. 벡터는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 통상적으로 제한효소 절단 및 접합에 의해 도입될 수 있는 벡터를 포함한다. 벡터는 또한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터를 포함한다. 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여 핵산을 증폭하거나 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현/표시하는 데 사용된다. 벡터는 통상적으로 자유롭지만 유전자 또는 그 일부를 게놈의 염색체에 통합할 수 있도록 설계될 수 있다. 효모 인공 벡터 및 포유동물 인공 염색체와 같은 인공 염색체용 벡터도 고려된다. 이와 같은 매개체의 선택 및 사용은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스 벡터는 외인성 유전자를 세포 내로 (중간체 또는 셔틀로서) 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함하고, DNA는 상기 DNA 단편의 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 이와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종결자 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택성 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 통상적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나 둘 다의 요소를 함유할 수 있다. 그러므로, 발현 벡터는, 적절한 숙주 세포에 도입되었을 때 클로닝된 DNA를 발현하는 재조합 DNA 또는 RNA 구조물, 예를 들면, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 및 기타 벡터를 지칭한다. 적절한 발현 벡터는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제될 수 있는 발현 벡터, 자유 발현 벡터 및 숙주 세포의 게놈으로의 통합을 위한 발현 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 개인의 질병 또는 질병 상태의 "치료"는 개인의 증상이 부분적으로 또는 완전히 완화되거나 치료 후에도 변화되지 않고 유지되는 것을 의미한다. 그러므로, 치료는 예방, 치료 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 근본적인 질병의 예방 및/또는 증상 악화 또는 질병 발전의 예방을 지칭한다. 치료는 또한 임의의 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 본원에 제공된 조성물의 임의의 약학적 사용을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 효과"는 질병 또는 질병 상태의 증상을 변경, 통상적으로 개선 또는 완화시키거나 질병 또는 질병 상태를 치료하는 개인의 치료로부터 발생하는 효과를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 효과량" 또는 "치료 효과 용량"은 대상에게 투여시 적어도 치료 효과를 발생하기에 충분한 물질, 화합물, 재료, 또는 화합물을 함유하는 조성물의 양을 지칭한다. 그러므로, 상기 치료 효과량은 질병 또는 질환의 증상을 예방, 치유, 개선, 저지 또는 부분적으로 저지하는 데 필요한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방 효과량" 또는 "예방 효과 용량"은 대상에게 투여시 원하는 예방적 효과, 예를 들면, 질병 또는 증상의 시작 또는 재발을 예방 또는 지연시키고 질병 또는 증상의 시작 또는 재발 가능성을 감소시키는 물질, 화합물, 재료, 또는 화합물을 함유하는 조성물의 양을 지칭한다. 완전한 예방 효과 용량은 1개의 용량을 투여함으로써 발생해야 하는 것은 아니며, 일련의 용량을 투여한 후에만 발생할 수도 있다. 그러므로, 예방 효과량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "환자"라는 용어는 인간과 같은 포유동물을 지칭한다.
상세한 설명
한 양태에서, 본 개시내용은
(a) 표적 세포의 표면에 결합하는 GPC3 항원 또는 이의 항원-결합 단편의 제1 항원-결합 부분; 및
(b) T 세포의 표면 상의 CD3 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편
을 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하며, 이때 상기 제1 항원-결합 부분이 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 부분이 제1 항원에 결합하는 제1 결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13, 21, 32, 33, 64, 65, 66, 72, 73, 79, 80, 81, 101, 106의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR, 및/또는 서열번호 16, 17, 18, 26, 29, 38, 39, 46, 47, 48, 51, 54, 57, 60, 61, 69, 92, 95, 98의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부분이 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부분이 제2 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다.
이전 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 32, 64, 79의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 12, 21, 33, 65, 72, 80, 101, 106의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR2, 서열번호 13, 66, 73, 81의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하고/하거나; 상기 제1 결합 도메인은 서열번호 16, 38, 46, 60의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열번호 17, 47의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR2, 서열번호 18, 26, 29, 39, 48, 51, 54, 57, 61, 69, 76의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함한다.
이전 양태들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분에서, 제1 결합 도메인의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 32, 33, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 64, 65, 66의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 72, 73의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 79, 80, 81의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 101, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택되고; 제1 결합 도메인의 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열은 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 26의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 29의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 38, 17, 39의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 46, 47, 48의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 51의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 54의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 57의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 60, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 69의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 76의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 92, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 95, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 98, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 26의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 29의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 32, 33, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 38, 17, 39의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 46, 47, 48의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 51의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 54의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 57의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 60, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 64, 65, 66의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 69의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 72, 73의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 76의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 79, 80, 81의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 69의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 60, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 92, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 95, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 98, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
임의의 이전 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9, 19, 30, 40, 62, 70, 77, 99, 102, 104, 107, 109, 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나 서열번호 14, 22, 24, 27, 34, 36, 42, 44, 49, 52, 55, 58, 67, 74, 82, 84, 86, 88, 90, 93, 96의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 27의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 34의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 42의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 44의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 49의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 55의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 58의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 62의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 67의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 74의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 77의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 86의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 88의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 90의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 93의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 결합 도메인은 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 96의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함한다.
임의의 이전 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 134, 135, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 155의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR로부터 선택되고/되거나; 서열번호 115, 116, 117, 122, 123, 128, 131의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함한다
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 134, 139, 154의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 CDR1, 서열번호 135, 155의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 CDR2, 서열번호 136, 142, 145, 148, 151의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호 115, 122의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 CDR1, 서열번호 116, 123, 131의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 CDR2, 서열번호 117, 128의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열은 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 142의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 145의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 148의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 151의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 154, 155, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택되고; 제2 결합 도메인의 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열은 서열번호 115, 116, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 122, 123, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 115, 116, 128의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 115, 131, 128의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 및 서열번호 115, 116, 128의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 및 서열번호 115, 116, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 및 서열번호 122, 123, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 132, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 156, 158, 160의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나, 서열번호 113, 118, 120, 124, 126, 129의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 132의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 126의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 156의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 113의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 156의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 126의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 113의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 118의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 120의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 도메인은 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 126의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이전 양태들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄는 카파형 경쇄이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄는 람다형 경쇄이다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄 가변 영역은 Gln43Lys 돌연변이(VκGPC3: Gln43Lys)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역은 Gln39Glu(VHGPC3: Gln39Glu) 돌연변이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄 가변 영역은 Gln40Glu 돌연변이(VλCD3: Gln40Glu)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역은 Gln39Lys 돌연변이(VHCD3: Gln39Lys)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체의 제1 항원-결합 부분 및 제2 항원-결합 부분의 Fc 부분은 놉-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 취한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 인간 IgG4 놉-인투-홀 구조를 취한다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄는 서열번호 164, 172 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄를 포함하고, 제1 경쇄는 서열번호 162, 170 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 중쇄는 서열번호 164 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄를 포함하고, 제1 경쇄는 서열번호 162 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 중쇄는 서열번호 172 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄를 포함하고, 제1 경쇄는 서열번호 170 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 중쇄는 서열번호 168의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 제2 경쇄는 서열번호 166의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 항체의 제1 중쇄는 서열번호 164의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 이중특이적 항체의 제1 경쇄는 서열번호 162의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함하며; 제2 중쇄는 서열번호 168의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 제2 경쇄는 서열번호 166의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 중쇄는 서열번호 172의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 이중특이적 항체의 제1 경쇄는 서열번호 170의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함하며; 제2 중쇄는 서열번호 168의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 제2 경쇄는 서열번호 166의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하며, 상기 항체는 전술한 제1 항원-결합 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 임의의 이전 양태의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
한 양태에서, 본 개시내용은 이전 양태들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산, 또는 그에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 제공한다..
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10, 20, 31, 41, 63, 71, 78, 100, 103, 105, 108, 110, 112의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고/되거나; 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 15, 23, 25, 28, 35, 37, 43, 45, 50, 53, 56, 59, 68, 75, 83, 85, 87, 89, 91, 94, 97의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 35의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 41의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 45의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 50의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 53의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 59의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 63의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 68의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 71의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 75의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 78의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 83의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 87의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 89의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 91의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 94의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 97의 뉴클레오타이드 서열이다.
바람직하게, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 165, 173의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고/되거나; 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 163, 171의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 165의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 163의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 173의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 171의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 133, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 157, 159, 161의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고/되거나; 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 114, 119, 121, 125, 127, 130의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 133의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 127의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 157의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 114의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 157의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 127의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 114의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 119의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 121의 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 127의 뉴클레오타이드 서열이다.
바람직하게, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체이고/이거나; 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 항체의 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 165의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 163의 뉴클레오타이드 서열이며; 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열이다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 항체의 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 173의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 171의 뉴클레오타이드 서열이며; 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 전술한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 전술한 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 전술한 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 핵산, 벡터 및/또는 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 치료 모이어티에 공유적으로 부착된 전술한 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
바람직하게, 치료 모이어티는 세포독성 모이어티, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제제, 면역자극제, 용해 펩티드 및 방사성 동위원소로부터 선택된다.
본 개시내용의 항체는 GPC3이 불리하게 발현되거나 발견되는 다양한 질병에 대한 치료 또는 진단 도구로 사용된다.
GPC3-관련 질병의 한 실시양태에서, GPC3의 발현은 건강한 조직 또는 장기에서의 상태에 비해 병든 조직 또는 장기의 세포에서 증가된다. 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 훨씬 더 이상의 증가를 지칭한다. 한 실시양태에서, 발현은 병에 걸린 조직에서만 발견되고, 상응하는 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 개시내용에 따르면, GPC3-관련 질병은 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 GPC3 양성 암, 예를 들어, GPC3 양성 간암, GPC3 양성 간세포 암종, GPC 양성 췌장암, GPC 양성 폐암, GPC 양성 결장암, GPC 양성 유방암, GPC 양성 전립선암, GPC 양성 백혈병, 또는 GPC 양성 림프종이다.
일부 실시양태에서, 치료제는 활성화된 T-세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 함유한다.
한 실시양태에서, 치료제는 CD3, 특히 CD3ε에 특이적으로 결합하는 항체를 함유한다.
본 개시내용의 이중특이적 항체로 질병 또는 질환을 치료하는 방법은 전술한 양태들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 세포 또는 약학 조성물 치료 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은, 적어도 40 ㎍/mL의 혈청 수준을 제공하도록 GPC3에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 항체는 적어도 50 ㎍/mL, 적어도 150 ㎍/mL, 적어도 300 ㎍/mL, 적어도 400 ㎍/mL, 또는 적어도 500 ㎍/mL의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 다른 실시양태에서, 항체는 800 ㎍/mL, 700 ㎍/mL, 600 ㎍/mL, 550 ㎍/mL 또는 500 ㎍/mL 이하의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 한 실시양태에서, 제공된 혈청 수준은 40 μg/mL 내지 700 μg/mL, 바람직하게는 40 μg/mL 내지 600 μg/mL, 바람직하게는 50 μg/mL 내지 500 μg/mL, 예를 들면, 150 μg/mL 내지 500 μg/mL, 및 300 μg/mL 내지 500 μg/mL이다. 상기 설명에서 사용된 바와 같은 "혈청 수준"이라는 용어는 혈청에서 해당 물질의 농도를 지칭한다. 한 실시양태에서, 혈청 수준은 적어도 7일 또는 적어도 14일 동안 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 항체를 적어도 300 mg/m2, 예를 들면, 적어도 600 mg/m2, 바람직하게는 1500 mg/m2 이하, 1200 mg/m2 이하, 또는 1000 mg/m2 이하의 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 환자에게 GPC3에 결합할 수 있는 항체를 적어도 300 mg/m2, 예를 들면, 적어도 600 mg/m2, 및 바람직하게는 1500 mg/m2 이하, 1200 mg/m2 이하 또는 1000 mg/m2 이하의 용량으로 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 GPC3에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 환자의 암세포의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%는 GPC3에 대해 양성이고/이거나 환자의 암세포의 적어도 40%, 바람직하게는 50% 또는 60%는 GPC3의 표면 발현에 대해 양성이다. 이러한 양태에서, 본 개시내용은 또한 다음의 단계를 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다: a. GPC3-양성 암세포의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90% 및/또는 암세포의 적어도 40%, 바람직하게는 50% 또는 60%가 GPC3의 표면 발현에 대해 양성인 환자를 확인하고; b. GPC3에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 투여하는 단계. 한 실시양태에서, 환자의 암세포의 적어도 95% 또는 적어도 98%가 GPC3에 대해 양성이다. 한 실시양태에서, 환자의 암세포의 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 GPC3의 표면 발현에 대해 양성이다.
본원에 기술된 임의의 양태의 방법의 한 실시양태에서, 암 치료의 결과는 질병 안정화를 달성하는 것이다. 한 실시양태에서, 질병 안정화는 적어도 2개월, 적어도 3개월 또는 적어도 6개월 동안 달성된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 GPC3에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 환자의 질병 안정화를 달성하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 질병 안정화는 적어도 2개월, 적어도 3개월 또는 적어도 6개월 동안 달성된다.
본원에 기술된 임의의 양태의 방법의 한 실시양태에서, 항체는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 GPC3에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 다중 용량으로 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 개시내용에 따라 항체를 다중 용량으로 투여하는 경우, 항체는 바람직하게는 적어도 3개 용량, 적어도 4개 용량, 적어도 5개 용량, 적어도 6개 용량, 적어도 7개 용량, 적어도 8개 용량, 적어도 9개 용량, 또는 적어도 10개 용량, 및 바람직하게는 30개 용량, 25개 용량, 15개 용량 또는 10개 용량까지로 투여된다. 항체의 용량은 바람직하게는 적어도 7일, 적어도 10일, 적어도 14일 또는 적어도 20일의 간격으로 투여된다. 항체의 용량은 바람직하게는 7 내지 30일 또는 10 내지 20일, 바람직하게는 약 14일의 간격으로 투여된다.
한 실시양태에서, 항체는 적어도 40 ㎍/mL의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 다른 실시양태에서, 항체는 적어도 50 ㎍/mL, 적어도 150 ㎍/mL, 적어도 300 ㎍/mL, 적어도 400 ㎍/mL, 또는 적어도 500 ㎍/mL의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 다른 실시양태에서, 항체는 800 ㎍/mL, 700 ㎍/mL, 600 ㎍/mL, 550 ㎍/mL, 또는 500 ㎍/mL 이하의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 하나의 실시양태에서, 제공된 혈청 수준은 40 ㎍/ml 내지 700 ㎍/ml, 바람직하게는 40 ㎍/ml 내지 600 ㎍/ml, 바람직하게는 50 ㎍/ml 내지 500 ㎍/ml, 예를 들면, 150 ㎍/ml 내지 500 ㎍/ml 또는 300 ㎍/ml 내지 500 ㎍/ml이다. 한 실시양태에서, 혈청 수준은 적어도 7일 또는 적어도 14일 동안 제공된다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 항체를 적어도 300 mg/m2, 예를 들면, 적어도 600 mg/m2, 바람직하게는 최대 1500 mg/m2, 최대 1200 mg/m2 또는 최대 1000 mg/m2의 용량으로 투여하는 것을 포함한다.
포유동물에서 GPC3-관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 전술한 양태 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 핵산 또는 벡터 또는 세포 또는 약학 조성물의 용도가 제공된다.
전술한 양태 중 어느 하나에 따라, 선택적으로, 항체는 표지된 접합체 또는 세포독성 접합체와 같은 다른 약물에 접합된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 또한 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 표지된 접합체 또는 세포독성 접합체, 항체 설명서, 특정 유형의 세포를 사멸시키는 접합체 등과 같은 본 개시내용의 항체 또는 이의 단편 또는 동족체 또는 유도체를 포함한다. 설명서는 상기 항체, 접합체 등을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 항체는 액체 또는 고체 형태일 수 있으며, 통상적으로 동결건조된다. 이 키트는 완충제, 재구성 용액 및 의도된 용도에 필요한 기타 성분과 같은 기타 적절한 시약을 함유할 수 있다. 미리 정해진 용량으로 포장된 시약 조합 및 그 사용 설명서가 고려되며, 그 용도는, 예를 들어, 치료적 사용 또는 진단 분석이다. 항체가, 예를 들어, 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 필요한 기질 및 보조인자(예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 완충제(예를 들어, 차단 완충제 및 용해 완충제)와 같은 기타 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 사용자 유연성, 공간 절약, 시약 절약 등을 달성하는 시약 용액의 농축물이 제공되도록 다양할 수 있다. 이들 시약은 또한 용해되었을 때 시약 용액을 적절한 농도로 제공할 수 있는, 부형제를 포함한, 건조 분말 형태로, 통상적으로 동결건조된 형태로 제공될 수 있다.
GPC3에 대한 결합을 억제하기 위한 시약의 제조에서 전술한 양태 중 어느 하나의 항체 또는 기능성 단편 또는 핵산 또는 벡터 또는 세포 또는 약학 조성물 또는 키트의 용도가 제공된다.
게다가, 본 개시내용의 항체는 또한 면역분석, 정제 방법, 및 면역글로불린 또는 이의 단편을 사용하는 기타 방법에 사용될 수 있다. 이와 같은 사용은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
상응하게, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항-GPC3 항체 또는 이의 단편을 함유하는 조성물을 제공하며, 항체는 당해 분야의 통상적인 관행에 따라 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 편리하게 조합된다.
"약학 조성물"이라는 용어는 다양한 제제의 제조를 지칭한다. 치료 효과량의 다가 항체를 함유하는 제제는 선택적으로 안정화제 또는 부형제를 함유하는 멸균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조 형태이다.
본 개시내용의 항체는 단독으로 투여되는 조성물로 사용될 수 있거나, 또는 다른 활성제와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 인간화 항체는 치료 모이어티(즉, 약물)에 접합된다. 치료 모이어티는, 예를 들어, 세포독소, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제 약물, 면역자극제, 용해 펩티드 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 이와 같은 접합체는 본원에서 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 항체는 세포독성 모이어티에 접합된다. 세포독성 모이어티는, 예를 들어, 파클리탁셀; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 에티디움 브로마이드; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테니포시드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜히친; 독소루비신; 다우노루비신; 다이하이드록시 안트렌디온; 메이탄신 및 이의 유사체 또는 유도체와 같은 튜불린 억제제; 모노메틸 오리스타틴 E 및 F 및 이의 유사체 또는 유도체와 같은 항유사분열제; 아플리시아톡신 10 및 15 및 이의 유사체; 이리노테칸 및 이의 유사체; 미토잔트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-데하이드로테스토스테론; 글루코코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리케아미신 및 이의 유사체 또는 유도체; 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데칸디진, 하이드록시카바미드, 아스파라기나제, 겜시타빈, 및 클라드리빈과 같은 항대사물질; 다이클로로메틸다이에틸아민, 티오퓨린, 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 미토브로니톨, 스트렙토조토신, 다카바진(DTIC), 프로카바진 및 미토마이신 C와 같은 알킬화제; 시스플라틴 또는 카보플라틴과 같은 백금 유도체; 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 SA, 라파마이신(CC-1065), 및 이의 유사체 또는 유도체; 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 포토마이신, 미토마이신, 미토잔트론, 페리마이신 및 디아제팜(AMC)과 같은 항생제; 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(PDB); 디프테리아 독소, 및 디프테리아 A 쇄 및 이의 활성 단편 및 하이브리드 분자와 같은 관련 분자, 리신 A 및 탈글리코실화 리신 A 쇄 독소와 같은 리신, 콜레라 독소, SLT I, SLT II 및 SLT IIV와 같은 시가(Shiga)-유사 독소 , LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, 아롤린, 사포린, 아데니아 헤테로필라(Adenia heterophylla) 뿌리 독소, 젤솔린, 아브린 A 쇄, 아데니아 헤테로필라 뿌리 A 쇄, α-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 카리오필린 단백질, PAPI, PAPII 및 PAP-S와 같은 피톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토마이신, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I 및 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) 내독소 A; 피톨라카 아시노사(Phytolacca acinosa) 항바이러스 단백질; 및 디프테리아 독소 및 슈도모나스 내독소로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 오리스타틴 또는 이의 펩티드 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 오리스타틴은 미세소관 동역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하고, 항암 및 항진균 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 오리스타틴 E는 p-아세틸벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 오리스타틴 유도체는 AFP, 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF) 및 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)를 포함한다. 적절한 오리스타틴 및 이의 유사체, 유도체 및 전구약물 뿐만 아니라 오리스타틴을 Ab에 접합시키기 위한 적절한 어댑터는, 예를 들어, 미국 특허 제5,635,483호, 제5,780,588호 및 제6,214,345호뿐 아니라, 국제 특허 출원 공개 WO02088172호, WO2004010957호, WO2005081711호, WO2005084390호, WO2006132670호, WO03026577호, WO200700860호, WO2 07011968호 및 WO205082023호에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(PDB) 또는 이의 펩티드 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 적절한 PDB 및 PDB 유도체뿐 아니라 관련 기술은, 예를 들어, 문헌[Hartley J. A. et al., Cancer Res 2010; 70(17):6849-6858]; 문헌[Antonow D. et al, Cancer J 2008; 14(3):154-169]; 문헌[Howard P.W. et al, Bioorg Med Chem Lett 2009; 19:6463-6466] 및 문헌[Sagnou et al, Bioorg Med Chem Lett 2000; 10(18):2083-2086]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 안트라사이클린, 메이탄신, 칼리케아미신, 듀오카마이신, 라파마이신(CC-1065), 아플리시아톡신 10, 아플리시아톡신 15, 이리노테칸, 모노메틸 오리스타틴 E, 모노메틸 오리스타틴 F, PDB, 또는 이의 임의의 유사체, 유도체 또는 전구약물의 세포독성 모이어티에 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체는 안트라사이클린, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 메이탄신, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 칼리케아미신, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 듀오카마이신, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 라파마이신(CC-1065), 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 아플리시아톡신 10, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 아플리시아톡신 15, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노메틸 오리스타틴 E, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노메틸 오리스타틴 F, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 이리노테칸 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체는 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL -23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스틴 및 TNFα)에 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체는 방사성 동위원소 또는 방사성 동위원소를 함유하는 킬레이트에 접합된다. 예를 들어, 항체는, 항체가 방사성 동위원소와 복합체화되도록 하는 킬레이트 어댑터(예를 들어, DOTA, DTPA 및 티아세탐)에 접합될 수 있다. 항체는 또한 또는 선택적으로 하나 이상의 방사성 표지된 아미노산 또는 다른 방사성 표지된 분자를 함유할 수 있거나, 또는 방사성 표지된 아미노산 또는 방사성 표지된 분자에 접합된다. 방사성 동위원소의 비제한적 예는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 131I, 186Re, 213Bi, 225Ac 및 227Th를 포함한다. 치료 목적으로, 베타 또는 알파 입자 방사선을 방출하는 방사성 동위원소, 예를 들면, 131I, 90Y, 211At, 212Bi, 67Cu, 186Re, 188Re 및 212Pb를 사용할 수 있다.
분자를 항체에 접합시키는 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 통상적으로, 핵산 분자는 N-하이드록시숙신이미드 부식제 또는 말레이미드 작용기를 통해 항체상의 리신 또는 시스테인에 공유 결합된다. 접합체의 동질성은 조작된 시스테인을 사용하거나 비천연 아미노산을 통합시키는 접합 방법에 의해 개선될 수 있는 것으로 보고되어 있다. 특히, 당해 분야의 숙련자는 아실 공여체로 작용하는 글루타민을 함유하는 태그(예를 들어, Gin 펩티드를 함유하는 태그 및 Q-태그) 또는 폴리펩티드 조작(예를 들어, 폴리펩티드 상에서의 아미노산 결실, 삽입, 치환 및 돌연변이)을 이용하여 반응성 내인성 글루타민 조작된 Fc-함유 폴리펩티드를 생성하는 것을 예상할 수 있다. 이어서, 트랜스글루타미나제는 아민 공여체(예를 들어, 반응성 아민을 함유하거나 이에 연결된 소분자)와 공유적으로 가교결합되어 안정하고 균질하게 조작된 Fc-함유 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있으며, 상기 접합체에서 아민 공여체는 아실 공여 태그 또는 접근가능한/노출된/반응성 내인성 글루타민 부위로 작용하는 글루타민을 함유하는 태그를 통해 Fc-함유 폴리펩티드에 특이적으로 접합된다(WO2012059882호).
기술된 실시양태에 따른 치료제는 적절한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 개선된 운반, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제제에 혼입된 다른 시약과 함께 투여될 것임을 이해해야 한다. 모든 의약 화학자들에게 알려진 약전: [Remington's Pharmaceutical Sciences (the 15th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975)], 특히 그 안의 블라우그 및 세이무어(Blaug and Seymour)의 챕터 87에서 다수의 적절한 제제를 찾을 수 있다. 이러한 제제로는, 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 겔, 왁스, 오일, 지질, 지질-함유 (양이온 또는 음이온) 담체(예를 들면, 리포펙틴(Lipofectin)™), DNA 접합체, 무수 슬러리, 수중유적형 및 유중수적형 유화액, 유화액 폴리에틸렌 글리콜(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 반고체 혼합물이 포함된다. 임의의 상기 혼합물은 제제의 활성 성분이 제제에 의해 불활성화되지 않고 제제가 생리적으로 적합하고 투여 경로를 견디는 조건하에서 본 개시내용에 따른 치료 또는 요법에 적용가능하다.
한 실시양태에서, 항체는 치료제로 사용될 수 있다. 이와 같은 치료제는 통상적으로 대상에서 비정상적인 GPC3 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질병 또는 병리를 치료, 완화 및/또는 예방하는데 사용된다. 비정상적인 GPC3 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질병 또는 질환과 같은 GPC3-관련 증상을 앓고 있는(또는 발병 위험이 있는) 인간 환자와 같은 대상을 식별함으로써 표준 방법을 사용하여 치료 요법을 실행할 수 있다. 항체 제제, 바람직하게는 이의 표적 항원에 대한 높은 특이성 및 높은 친화성을 갖는 항체 제제는 대상에게 투여되고 일반적으로 표적에 대한 이의 결합으로 인해 효과를 발생할 것이다. 투여된 항체는 표적(예를 들어, GPC3)의 발현, 활성 및/또는 신호 전달 기능을 제거하거나 억제하거나 방해할 수 있다. 투여된 항체는 그것이 자연적으로 결합하는 내인성 리간드에 대한 표적(예를 들어, GPC3)의 결합을 제거하거나 억제하거나 방해할 수 있다. 예를 들어, 항체는 표적에 결합하고, 다른 방식으로 GPC3의 발현, 활성 및/또는 신호 전달을 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 및/또는 방해한다. 일부 실시양태에서, 비정상적인 GPC3 발현-관련 질병 또는 질환을 치료하기 위해, 중쇄 및 경쇄 CDR을 갖는 항체를 대상에게 투여할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, GPC3에 대한 항체는 GPC3 국소화 및/또는 정량화(예를 들어, 적절한 생리적 샘플에서 GPC3 및/또는 GPC3 수준의 측정, 진단 방법 및 단백질 영상화)와 관련된 당해 분야에 공지된 방법에서 사용될 수 있다. 주어진 실시양태에서, GPC3 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체에 대한 특이성을 가지며 항체로부터 유래된 항원-결합 도메인을 함유하는 항체는 약학적 활성 화합물(이하에서 "치료제"로 지칭됨)로 사용된다.
또 다른 실시양태에서, GPC3에 대한 특이성을 갖는 항체는 면역친화성, 크로마토그래피 및 면역침전과 같은 표준 기술을 통해 GPC3 폴리펩티드를 분리하는데 사용된다. GPC3 단백질에 대한 항체(또는 이의 단편)는 생물학적 샘플에서 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 GPC3의 검출은, 예를 들어, 주어진 치료 요법의 효능을 측정하기 위해 사용되는 임상 시험 절차의 일부로서 사용될 수 있다. 항체를 검출 가능한 물질에 접합(즉, 물리적으로 연결)시킴으로써 검출이 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 및 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결분자단의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트리아진 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시페라제, 플루오레세인 및 에쿠오린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 샘플 내 GPC3 또는 이의 단백질 단편의 존재를 검출하기 위한 시약으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 검출가능한 표지를 함유한다. 항체는 다중클론 항체, 또는 보다 바람직하게는 단일클론 항체이다. 전항체 또는 단편(예를 들어, Fab, scFv 및 F(ab')2)을 사용한다. 항체와 관련하여 "표지"라는 용어는 검출가능한 물질을 항체에 접합(즉, 물리적으로 연결)시킴으로써 항체를 직접 표지하는 것, 및 또 다른 직접 표지된 시약과의 반응에 의해 항체를 간접적으로 표지하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 간접 표지화의 예로는 형광-표지된 2차 항체로 1차 항체를 검출하는 것, 및 형광-표지된 스트렙타비딘으로 검출할 수 있도록 항체를 비오틴으로 말단-표지화하는 것이 포함된다. "생물학적 샘플"이라는 용어는 대상으부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 체액뿐만 아니라 대상에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하는 것으로 의도된다. 그러므로, 사용된 "생물학적 샘플"이라는 용어는 혈액, 및 혈청, 혈장 및 림프를 포함한 혈액의 분획물 또는 성분을 포함한다. 즉, 실시양태의 검출 방법은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 생물학적 샘플에서 분석물 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물 mRNA 시험관내 검출 기술은 노던(Nothern) 하이브리드화 및 제자리 하이브리드화를 포함한다. 분석물 단백질 시험관내 검출 기술은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴(Western) 블롯팅, 면역침전 및 면역형광을 포함한다. 분석물 게놈 DNA 시험관내 검출 기술은 서던(Southern) 하이브리드화를 포함한다. 면역분석 절차는, 예를 들어, 문헌["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", vol. 42, J. R. Crowther (ed.) Human Press, Totowa, N. J. 1995]; 문헌["immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc. San Diego, Calif, 1996]; 및 문헌["Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기술되어 있다. 또한, 분석물 단백질 생체내 검출 기술은 표지된 항-분석물 단백질 항체를 대상에게 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 방사성 표지로 표지될 수 있으며, 대상에서 방사성 표지의 존재 및 위치는 표준 영상화 기술에 의해 검출된다.
본원에 기술된 항체 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 및 동족체는 투여에 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 이와 같은 조성물의 제조에 관련된 원리 및 고려사항, 및 성분을 선택하기 위한 지침은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
이와 같은 조성물은 통상적으로 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 항체 단편을 사용하는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역을 기반으로, 표적 단백질의 서열에 결합하는 능력을 유지하는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이와 같은 펩티드는 화학적 합성에 의해서 및/또는 DNA 재조합에 의해 가능하다(예를 들어, 문헌[Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893(1993)] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 약학적 투여와 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 당해 분야의 표준 참조 연구이며 본원에 참조로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기술되어 있다. 상기 담체 또는 희석제의 바람직한 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 고정화 오일과 같은 리포좀 및 비-수성 담체도 사용할 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 시약의 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 항체와의 부적합성을 제외하고, 조성물에서 임의의 통상적인 매질 또는 시약의 사용이 고려된다.
전술한 실시양태의 약학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제조된다. 투여 경로의 예는 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막 및 직장 투여와 같은 비경구 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 투여용 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 물, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 기타 합성 용매와 같은 주사용 멸균 희석액; 벤질알콜 및 메틸파라벤과 같은 항균제; 아스콜브산 및 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 및 포스페이트와 같은 완충제; 및 염화나트륨 및 덱스트로스와 같은 삼투압을 조절하는 시약. pH는 염산 및 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절할 수 있다. 비경구 투여는 앰플, 1회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱 다용량 바이알에 포장될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(본원에서는 수용성) 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 일반 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, 뉴저지주 파시패니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균성이어야 하고 주입이 용이할 정도로 유동적이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염을 방지해야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올 및 폴리올(예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 분산액의 경우, 레시틴과 같은 코팅을 통해 필요한 입자 크기를 유지하고 계면활성제를 통해 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 미생물의 작용은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스콜브산 및 티메로살과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 통해 예방할 수 있다. 많은 경우에, 조성물은 바람직하게는 사카라이드, 폴리올(예를 들면, 만니톨 및 솔비톨) 및 염화나트륨과 같은 등장화제를 함유한다. 주사용 조성물의 흡수는 조성물 중에 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연용 시약을 첨가함으로써 연장될 수 있다.
필요에 따라, 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 (필요에 따라) 조합과 함께 적합한 용매에 필요한 양의 항체를 혼입하고, 여과하고, 멸균함으로써 멸균 주사액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 알칼리성 분산 매질 및 상기 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 담체에 항체를 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조하여 전술한 상기 성분들의 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가 목적 성분을 함유하는 분말을 수득하는 것이다.
흡입 투여의 경우, 화합물은 가압 용기 또는 디스펜서, 또는 적절한 추진제, 예를 들면, 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 분무기로부터 에어로졸 스프레이로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 경로를 통해 수행될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 제제에 장벽 침투에 적합한 침투제를 사용한다. 이와 같은 침투제는 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여를 위한 세제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여의 경우, 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 하나 이상의 항체를 페이스트, 연고, 겔 또는 크림으로 제조할 수 있다.
화합물은 또한 직장을 통한 전달을 위한 좌약(예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 베이스를 사용) 또는 정체 관장의 형태로 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 이식물 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함한 서방성/방출 조절 제제와 같이, 신체로부터 신속하게 제거되는 것으로부터 항체를 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터, 및 폴리락트산과 같은 생분해성 또는 생체적합성 고분자를 사용할 수 있다. 이와 같은 제제의 제조 방법은 당해 분야의 숙련자에게 자명하다.
투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 용량 단위 형태로 비경구 조성물을 제조하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용량 단위 형태는 치료될 대상에 단위 용량으로 적합한 물리적으로 분리가능한 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약물 담체와 함께 사용할 때 목적하는 치료 효과를 달성하도록 계산된 미리 결정된 양의 하나 이상의 항체를 포함한다. 실시양태의 용량 단위 형태에 대한 사양은 항체의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 개인의 치료를 위한 상기 항체의 제형화 기술에 내재된 제한에 의해 영향을 받고 이에 직접적으로 의존한다.
약학 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 넣을 수 있다.
본원에 기술된 제제는 또한 하나보다 많은 항체, 바람직하게는 치료될 특정 상태에 따라 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 항체를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은, 예를 들어, 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제 및 성장 억제제와 같은, 기능을 향상시키는 약제를 함유할 수 있다. 상기와 같은 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절하게 함께 존재한다. 예를 들어, 분자는 키트에 함께 존재하거나 함께 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 항체는 병용 치료로 투여될 수 있다, 즉 치료제(다양한 형태의 암, 자가면역 질환 및 염증성 질병과 같은 병리학적 상태 또는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있음)와 같은 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 여기서 "조합"이라는 용어는 시약의 실질적으로 동시적, 동시의 또는 순차적 투여를 지칭한다. 순차적 투여의 경우, 두 번째 화합물의 투여가 시작될 때 두 화합물 중 첫 번째 화합물이 바람직하게는 유효 농도로 치료 부위에서 여전히 검출된다. 하나의 경우에, "조합"은 또한 키트가 본 개시내용의 항체와 다른 치료제를 모두 함유하는 것일 수도 있다.
예를 들어, 병용 치료는 본원에 기술된 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 추가 치료제(예를 들어, 하기에서 더 상세히 기술되는 바와 같이, 하나 이상의 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제, 대사 억제제, 효소 억제제, 및/또는 세포독소 또는 세포증식억제제)의 병용제제 및/또는 병용투여를 포함할 수 있다. 이와 같은 병용 치료는 투여되는 치료제의 보다 낮은 용량을 유리하게 이용할 수 있으므로, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
한 실시양태에서, 항-GPC3 항체를 투여하지 않는 상응하는 치료 요법과 비교하여, 치료 요법은 T 세포 활성화 치료제의 투여와 관련된 대상에서의 사이토카인 방출을 효과적으로 감소시킨다.
명확성 및 설명의 간결함을 위해, 특징들은 본원에서 동일하거나 별도의 실시양태의 일부로서 설명된다. 그러나, 본 발명의 범위는 기술된 특징의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 일부 실시양태를 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1. 안정하게 형질감염된 세포의 항원 발현 및 구축
인간 GPC3의 세포외 도메인(25-563)을 인간 GPC3(Sino Biological, HG10088)을 주형으로 사용하여 PCR로 증폭한 다음, HEK 293E 세포에 형질감염시켜 재조합 인간 GPC3 단백질(서열번호 1)을 발현시켰다. 또는 막-근위 서열(aa 524-563)을 pGEX3X 벡터의 EcoRI 부위에 깁슨(Gibson) 조립 방법으로 삽입하였다. 플라스미드를 에스케리키아 콜라이(E. coli) BL21(DE3)에 형질감염시켰다. 재조합 GST-인간 GPC3 줄기 단백질(서열번호 2)을 IPTG-유도 발현에 의해 수득하였다. 재조합 GST-사이노몰구스 원숭이 GPC3 줄기 단백질(서열번호 3) 및 재조합 GST-마우스 GPC3 줄기 단백질(서열번호 4)을 동일한 방식으로 발현시켰다. 도 1은 재조합 GPC3 단백질에 대한 비환원 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
인간 및 레서스 GPC3의 전장 서열을 함유하는 렌티 벡터 및 패키징 플라스미드(Genecoepia)를 HEK293T 세포에 동시-형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 슈도바이러스를 함유하는 배양 배지의 상등액을 수집하였다. 10 μL의 배양 배지 상등액을 사용하여 1 x 106 CHO 세포를 감염시키고, 내성 선별을 위해 퓨로마이신을 첨가하였다. 마지막으로, 인간 또는 레서스 GPC3의 발현이 높은 안정하게 형질감염된 세포 CHO-hGPC3(클론 2B10) 및 CHO-cynoGPC3(클론 4D6)을 단리하였다. 도 2는 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 유세포분석 결과를 보여준다.
인간 또는 원숭이 CD3 εγ 이종이량체의 구축: 인간 CD3γ(UniProt P09693, Gln23-Asn116) 및 CD3ε(UniProt P07766, Gln23-Asp126)의 세포외 영역의 뉴클레오타이드 서열을 합성하였다. C-말단을 인간 IgG Fc 홀 또는 Fc 놉과 각각 융합시켰다. 발현에 의해 인간 CD3εγ-Fc 이종이량체를 형성하였다(인간 CD3γ IgG Fc(홀)의 아미노산 서열은 서열번호 5로 나타내었고, 인간 CD3ε IgG Fc(놉)의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 나타내었다). 사이노몰구스 원숭이 CD3 γ(UniProt Q95LI7, Gln23-Asn110) 및 CD3ε(UniProt Q95LI5, Gln22-Asp117)도 합성하였다. C-말단을 사이노몰구스 원숭이 IgG Fc 홀 또는 Fc 놉에 융합시켰다. 사이노몰구스 원숭이 CD3εγ-Fc 이종이량체를 발현에 의해 형성하였다. 사이노몰구스 원숭이 CD3γ IgG Fc(홀)의 아미노산 서열은 서열번호 7에 나타내었고, 사이노몰구스 원숭이 CD3γ IgG Fc(놉)의 아미노산 서열은 서열번호 8에 나타내었다. CD3γ-Fc 및 CD3ε-Fc를 발현하는 재조합 플라스미드를 3 mg/mL의 PEI(Polysciences, # 24765-2)와 혼합하고 HEK 293E 세포(배양 배지 OPM-293 CD03 DPM)에 동시-형질감염시켰다. 37℃, 120 rpm, 5% CO2에서 7일간 배양한 후, 배양 배지의 상등액을 수집하고 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하여 95%보다 높은 SDS-PAGE 순도를 갖는 재조합 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 CD3 εγ-Fc 단백질을 수득하였다(도 3).
실시예 2. 동물 면역화 및 GPC3 항체의 제조
1. GPC3 항체 스크리닝
4 내지 6주령의 암컷 Balb/C 마우스를 선택하였다. 인간 GPC3 세포외 도메인(aa 524-563)의 전장 또는 막-근위 서열을 사용하여 일시적 발현 플라스미드를 구축하였다. 마우스를 주 1회 20 μg 플라스미드/마우스로 유전자 총에 의해 DNA로 면역화시켰다. 8회 면역화 후에 혈청 역가를 측정하였다. CHO-hGPC3으로 안정하게 형질감염된 세포(5 x 106 세포/마우스)를 부스트 면역화에 사용했다. 3일 후, 마우스를 경추 탈구로 죽이고, 마우스의 비장 및 말초 림프절을 수집하였다. 분쇄 및 원심분리 후 전체 RNA를 추출하였다. 역전사 후, 경쇄 및 중쇄 특이적 프라이머를 각각 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 cDNA 라이브러리를 수득하였다. 파지 항체 라이브러리 디스플레이 기술을 사용하여, 사상 파지 M13을 기반으로 하는 GPC3 면역 라이브러리를 후속 파지 패닝(panning)을 위해 구축하였다.
전통적인 패닝 방식을 사용하여, 인간 재조합 GPC3 단백질을 Immuno 튜브에 코팅하고, 배양 및 패닝을 위해 1 mL의 GPC3 파지 면역 라이브러리를 추가하였다. 고친화성 Fab를 나타내는 파지를 용출시키고 TG1 세균으로 감염시켰다. 다음 번의 패닝을 위해 파지를 다시 준비하였다. 2 회의 패닝 및 스크리닝 후에, 단일 클론을 IPTG 유도 발현을 위해 96-웰 U자형 플레이트에 접종하였다. ELISA를 위해 배양 배지의 상등액을 취하였다. 인간 GPC3 세포외 영역의 막-근위 말단을 인식하는 총 323개의 양성 클론을 수득하였다.
서열분석에 의해 부분 클론을 선택하였다. 경쇄 및 중쇄 유전자를 각각 항체 경쇄 불변 영역 또는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 CH1-CH3을 함유하는 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하고, HEK293E 세포에 동시-형질감염시켰다. 37℃, 120 rpm, 5% CO2에서 5 내지 6일간 배양한 후, 배양 배지의 상등액을 수집하고 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로 정제하여 IgG 항-GPC3 키메라 항체를 수득하였다. 대조군 항체 GC33을 문헌[Nakano K et al. (2009)]에 따라 합성하고, 인간 IgG1 키메라 항체(GC33으로 약칭)로 발현시켰다.
GPC3 항체 가변 영역 서열을 하기에 나타내었다:
GPC3 뮤린 항체 가변 영역 서열
GPC3
뮤린 항체		 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
아미노산 서열 뉴클레오타이드 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 뉴클레오타이드 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 아미노산 서열
5D6 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
29A10 19 20 11 21 13 22 23 16 17 18
34H1 9 10 11 12 13 24 25 16 17 26
19F1 9 10 11 12 13 27 28 16 17 29
30B7 30 31 32 33 13 34 35 16 17 18
28G4 19 20 11 21 13 36 37 38 17 39
30A4 40 41 11 21 13 42 43 16 17 18
38D2 9 10 11 12 13 44 45 46 47 48
39G4 9 10 11 12 13 49 50 16 17 51
41F1 9 10 11 12 13 52 53 16 17 54
41H1 9 10 11 12 13 55 56 16 17 57
49G8 9 10 11 12 13 58 59 60 17 61
46C3 62 63 64 65 66 67 68 16 17 69
42A1 70 71 11 72 73 74 75 16 17 76
47B6 77 78 79 80 81 82 83 16 17 69
5D6
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 14에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 15에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 18에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
29A10
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 19에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 20에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 21, 13에 나타내었다.
핵산 서열
GAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGC
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 22에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 23에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 18에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
34H1
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 24에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 25에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 18에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTATACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
19F1
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 27에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 28에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 29에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATATTCCCACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGCTGAAA
30B7
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 30에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 31에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 32, 33 및 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAGGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 34에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 35에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 18에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
28G4
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 19에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 20에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
GAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 36에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 37에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 38, 17, 39에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTACAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
30A4
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 40에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 41에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 21, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACGCATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 42에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 43에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 18에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
38D2
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 44에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 45에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 46, 47, 48에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTAGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
39G4
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 49에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 50에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 51에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGGTGACTCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAGGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
41F1
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 52에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 53에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 54에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAATACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
41H1
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 55에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 56에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 57에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAGGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACGTGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
49G8
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 9에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 10에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 12, 13에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAGTGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAATCAGACGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTATTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 58에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 59에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 60, 17, 61에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCCTCCAAGTTACACATGTCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
46C3
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 62에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 63에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 64, 65, 66에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTACTATATAAACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGCGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCCGAGGACACTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGGGGGCGCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 67에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 68에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 69에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTCGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGCTGAAA
42A1
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 70에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 71에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 72, 73에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTTGGGCTACACATTTGCTGACTATGAAATACACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTCATCCAGGAAGTGGTGGTACTGCCTACAGTCAGACGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCACCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGATACTTTTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 74에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 75에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 76에 나타내었다.
핵산 서열
GATGTTGTGGTGACTCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGCTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAGACTGGAAATAAAA
47B6
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 77에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 78에 나타내었고; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 79, 80, 81에 나타내었다.
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCGAGGGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 82에 나타내었으며; 이의 암호화 핵산은 서열번호 83에 나타내었고; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 16, 17, 69에 나타내었다.
핵산 서열
GATATTGTGATGACGCAGGCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
인간 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 항체의 결합을 FACS로 검출하였다. 대수 증식기의 실시예 1에서 제조된 CHO-인간 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포를 4% 송아지 혈청(Hyclone, SH30626.06)으로 5 x 105 세포/ml로 조정하였다. 100 μl/웰의 세포 현탁액을 96-웰 U-플레이트에 첨가하고, 300 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 폐기하였다. 100 μL의 구배 희석된 항체(초기 농도 200 nM, 3배 희석, 12개 구배)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 45분 동안 배양하였다. 2차 항체 Alexa Fluro647 표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 50 μL/웰로 첨가하고, 얼음 위에서 45분 동안 배양하고, 유세포분석으로 검출하였다. 도 4는 키메라 항체 및 인간 GPC3-CHO로 안정하게 형질감염된 세포의 유세포분석 검출 결과를 보여준다.
BLI 기술(Octet)을 사용하여, 시험할 항체를 단백질 A 프로브 상에 포획하였다. 인간 GPC3 단백질과의 결합 능력(초기 농도로서 10 μg/ml, 2배 구배, 총 5개 농도 포인트)을 검출하였다. 결합율 및 해리율에 따라 친화 상수 KD를 얻었다.
FACS 및 Octet의 결과에 기반하여, 세포막 상의 GPC3 수용체를 높은 친화성하에 인식하고 재조합 GPC3 단백질에 결합할 수 있는 양성 단일클론 항체 총 15개를 수득하였다. 표 2는 인간 GPC3에 대한 단일클론 항체의 친화 상수를 보여준다.
인간 GPC3에 대한 단일클론 항체의 결합 활성
항체 FACS Octet
EC50(nM) KD (nM) kon(1/Ms) kdis(1/s)
5D6 3.73 27.7 1.05E+05 2.92E-03
29A10 3.39 19.8 1.42E+05 2.81E-03
34H1 2.1 12.9 1.71E+05 2.21E-03
19F1 3.59 18.3 1.16E+05 2.13E-03
30B7 2.78 10.9 7.17E+04 7.83E-04
28G4 2.87 11.3 9.89E+04 1.12E-03
30A4 3.68 19.9 1.30E+05 2.58E-03
38D2 3.35 11.3 7.34E+04 8.32E-04
39G4 2.79 26.2 7.95E+04 2.08E-03
41F1 0.91 18.5 9.79E+04 1.81E-03
41H1 1.07 25 1.06E+05 2.64E-03
49G8 1.18 3.32 6.94E+04 2.31E-04
46C3 0.46 24.3 6.36E+04 1.54E-03
42A1 6.69 40.5 6.00E+04 2.43E-03
47B6 0.38 48.2 3.08E+04 1.49E-03
GC33 2.74 4.17 5.49E+04 2.29E-04
2. GPC3 후보 항체의 인간화
2.1 후보 항체의 종 교차반응성
재조합 인간, 사이노몰구스 원숭이, 마우스 GPC3 전장 단백질, 및 재조합 인간 GPC3 세포외 도메인 막-근위 단백질에 대한 결합 활성을 검출하기 위해 고친화성 양성 클론 49G8을 선택하였다. 상기에서 언급한 단백질 1 μg/ml를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 차단한 후, 49G8 키메라 항체(초기 농도 200 nM, 3배 구배 희석, 총 12개 농도)를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 HPR-표지된 염소 항-인간 IgG Fc를 첨가하였다. TMB 용액으로 전개시킨 후, 진한 황산으로 반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. ELISA 결과는 도 5에 나타내었다. 49G8 항체는 전장 인간 및 사이노몰구스 원숭이 GPC3 단백질 및 인간 GPC3의 세포외 영역의 막-근위 말단에 대조군 항체보다 약간 더 높은 친화성 및 마우스 GPC3 단백질에 대한 약한 친화성하에 결합할 수 있다(표 3).
49G8 및 상이한 종의 GPC3 전장 단백질 및 인간 GPC3 막-근위 단백질의 ELISA 결과
인간 GPC3 사이노몰구스 원숭이 GPC3 마우스 GPC3 GST-인간 GPC3-줄기
49G8 0.072 nM 0.120 nM 약간 약함 0.074 nM
GC33 0.074 nM 0.160 nM 약간 약함 0.060 nM
2.2 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)
GPC3(HepG2)을 발현하는 인간 간암 세포를 표적 세포로 사용하였다. 표적 세포의 밀도는 5 x 104 세포/웰로 조정하였고, 효과기 세포 NK92MI-CD16a는 1 x 105 세포/웰로 조정하였다. 구배-희석된 항체(초기 농도로서 66.7 nM, 10배 구배, 총 6개 희석)를 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. LDH의 방출을 검출하기 위해 상등액을 취하였다. 결과는 도 6에 나타내었다. 49G8 키메라 항체는 표적 세포 HepG2에 대한 ADCC 효과를 매개할 수 있다.
2.3 49G8 항체의 인간화
마우스 항체 49G8 가변 영역 서열을 CDR 그래프팅 및 점 돌연변이에 의해 인간화하였다. Mab 49G8 뮤린 항체 경쇄는 마우스 IMGT_mVK1-110이다. 그 프레임워크 영역과 최고의 상동성을 갖는 인간 IMGT_hVK2-28을 CDR 이식을 위해 선택하고, 최고 상동성을 갖는 인간 IGKJ4*01을 FM4를 위해 선택하였다; 뮤린 항체의 중쇄는 IGHV1-15였다. CDR 이식을 위해 인간 생식계열 유전자 IMGT_hVH1-69를 선택하였고, FM4를 위해 최고 상동성을 갖는 인간 IGHJ4*01을 선택하였다. 총 6개의 중쇄 가변 영역 및 6개의 경쇄 가변 영역 인간화 변이체를 합성하기 위해 역돌연변이를 설계하였다. 조합 및 페어링 후, 이들을 HEK 293E 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 37℃, 120 rpm, 5% CO2에서 5 내지 6일간 배양한 후, 배양 배지의 상등액을 수집하고 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로 정제하여 인간화 항-GPC3 항체를 수득하였다.
인간 및 사이노몰구스 원숭이 GPC3 전장 단백질에 대한 49G8 인간화 항체의 결합 활성을 ELISA 방법으로 측정하였다. 인간 GPC3-CHO로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 49G8 인간화 항체의 결합을 유세포분석으로 검출하였다. ELISA 결과는 도 7에 나타내었다. 49G8 인간화 항체는 재조합 인간 및 사이노몰구스 원숭이 GCP3 단백질 둘 다에 고친화성하에 결합할 수 있다. FACS 결과는 도 8에 나타내었고, 인간 GPC3-CHO로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 49G8 인간화 항체의 친화성은 인간화전 마우스 항체의 친화성과 필적하고 대조군 항체의 친화성보다 약간 더 높았다. 인간화 항체 중쇄/경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
인간화 GPC3 항체의 경쇄 가변 영역 서열
GPC3 인간화 항체 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
아미노산 서열 뉴클레오타이드 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 아미노산 서열
h49G8VKv1 84 85 60 17 61
h49G8VKv2 86 87 60 17 61
h49G8VKv3 88 89 60 17 61
h49G8VKv4 90 91 92 17 61
h49G8VKv5 93 94 95 17 61
h49G8VKv6 96 97 98 17 61
h49G8VKv1
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 84에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 85에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 60, 17, 61에 나타내었다.
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC RSSQSIVHSNYNTYLE WYQQRPGQSPRLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC LQVTHVPLT FGQGTKLEIK
핵산 서열
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGACAGCCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACTACAACACATACCTGGAATGGTATCAGCAGAGGCCTGGCCAGTCTCCTAGACTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGTCTCCAGGTCACACACGTGCCCCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h49G8VKv2
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 86에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 87에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 60, 17, 61에 나타내었다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSIVHSNYNTYLE WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC LQVTHVPLT FGQGTKLEIK
핵산 서열
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACTACAACACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGTCTCCAGGTCACACACGTGCCCCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h49G8VKv3
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 88에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 89에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 60, 17, 61에 나타내었다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC LQVTHVPLT FGQGTKLEIK
핵산 서열
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACGGCAACACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGTCTCCAGGTCACACACGTGCCCCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h49G8VKv4
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 90에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 91에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 92, 17, 61에 나타내었다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSIVHSNSNTYLE WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC LQVTHVPLT FGQGTKLEIK
핵산 서열
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACAGCAACACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGTCTCCAGGTCACACACGTGCCCCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h49G8VKv5
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 93에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 94에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 95, 17, 61에 나타내었다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSIVHSNTNTYLE WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC LQVTHVPLT FGQGTKLEIK
핵산 서열
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACACAAACACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGTCTCCAGGTCACACACGTGCCCCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
h49G8VKv6
경쇄 VK의 아미노산 서열은 서열번호 96에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 97에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 98, 17, 61에 나타내었다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSIVHSNANTYLE WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFC LQVTHVPLT FGQGTKLEIK
핵산 서열
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACGCCAACACATACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTTCTGTCTCCAGGTCACACACGTGCCCCTGACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
인간화 GPC3 항체의 중쇄 가변 영역 서열
GPC3 인간화 항체 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3
아미노산 서열 뉴클레오타이드 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 아미노산 서열
h49G8VHv1 99 100 11 101 13
h49G8VHv2 102 103 11 101 13
h49G8VHv3 104 105 11 106 13
h49G8VHv4 107 108 11 101 13
h49G8VHv5 109 110 11 101 13
h49G8VHv6 111 112 11 106 13
h49G8VHv1
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 99에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 100에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 101, 13에 나타내었다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTF ADYEIH WVRQAPGQGLEWMG AIHPGSGGTAYNQKFQG RVTLTADKSSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR YYSFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCGCCGACTACGAGATCCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGCTATCCATCCTGGCTCTGGCGGCACAGCTTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGTACTACAGCTTCGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTCAGCTCT
h49G8VHv2
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 102에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 103에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 101, 13에 나타내었다.
QVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCKASGYTF ADYEIH WVRQAPGQGLEWMG AIHPGSGGTAYNQKFQG RVTLTADKSSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR YYSFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAACTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCGCCGACTACGAGATCCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGCTATCCATCCTGGCTCTGGCGGCACAGCTTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGTACTACAGCTTCGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTCAGCTCT
h49G8VHv3
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 104에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 105에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 106, 13에 나타내었다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTF ADYEIH WVRQAPGQGLEWMG AIHPGSGGTAYAQKFQG RVTLTADKSSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR YYSFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCGCCGACTACGAGATCCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGCTATCCATCCTGGCTCTGGCGGCACAGCTTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGTACTACAGCTTCGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTCAGCTCT
h49G8VHv4
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 107에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 108에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 101, 13에 나타내었다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTF ADYEIH WVRQAPGQGLEWMG AIHPGSGGTAYNQKFQG RVTLTADESSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR YYSFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCGCCGACTACGAGATCCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGCTATCCATCCTGGCTCTGGCGGCACAGCTTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACGAGTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGTACTACAGCTTCGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTCAGCTCT
h49G8VHv5
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 109에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 110에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 101, 13에 나타내었다.
QVQLVQSGAELKKPGSSVKVSCKASGYTF ADYEIH WVRQAPGQGLEWMG AIHPGSGGTAYNQKFQG RVTLTADESSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR YYSFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAACTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCGCCGACTACGAGATCCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGCTATCCATCCTGGCTCTGGCGGCACAGCTTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACGAGTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGTACTACAGCTTCGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTCAGCTCT
h49G8VHv6
중쇄 VH의 아미노산 서열은 서열번호 111에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 112에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 11, 106, 13에 나타내었다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTF ADYEIH WVRQAPGQGLEWMG AIHPGSGGTAYAQKFQG RVTLTADESSTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR YYSFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCGCCGACTACGAGATCCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGCTATCCATCCTGGCTCTGGCGGCACAGCTTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACGAGTCTAGCACCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCCGGTACTACAGCTTCGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACAGTCAGCTCT
2.3 인간화 항체의 친화성
1) 생물층 간섭계(BLI)
BLI 기술(Octet)을 사용하여, 시험할 항체를 단백질 A 프로브 상에 포획하였다. 인간 GPC3 단백질과의 결합 능력(초기 농도 10 μg/ml, 2배 구배, 총 5개 농도 포인트)을 검출하였다. 결합율 및 해리율에 따라 친화 상수 KD를 얻었다. 결과는 도 9에 나타내었다. 49G8 인간화 항체는 재조합 GPC3 단백질에 고친화성하에 결합한다. 친화성 데이터는 표 6에 나와 있다.
BLI 분석에 의한 49G8 인간화 항체와 인간 GPC3 전장 단백질의 친화성 결과
KD (nM) kon(1/Ms) kd (1/s)
h49G8VHv6VKv2 2.00 9.36E+04 1.87E-04
h49G8VHv6VKv3 1.42 9.48E+04 1.34E-04
h49G8VHv6VKv4 2.28 8.99E+04 2.05E-04
h49G8VHv6VKv5 2.15 9.00E+04 1.93E-04
h49G8VHv6VKv6 2.38 9.24E+04 2.20E-04
49G8 1.17 7.97E+04 9.35E-05
GC33 1.35 8.26E+04 1.11E-04
2) 표면 플라즈몬 공명(SPR)
더 높은 친화성을 갖는 인간화 항체를 선택하고, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 GPC3에 대한 결합에 대해 비교하였다. 인간화 항체 h49G8VHv6VKv3은 단백질 A 칩(GE healthcare)으로 포획하였다. 구배(초기 농도로서 5 μg/ml, 2배 구배, 총 5개의 농도 포인트)로 희석된 인간 및 사이노몰구스 원숭이 GPC3의 재조합 단백질을 150초의 결합 시간 및 600초의 해리 시간하에 30 μL/분의 유량으로 칩에 관류시켰다. 동역학 상수는 랑뮤어(Langmuir) 1:1 동역학 모델과 함께 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 적합화시켰다. 결과는 도 10에 나타내었다. 인간화 항체 h49G8VHv6VKv3은 고친화성하에 인간 및 사이노몰구스 원숭이 GPC3에 결합한다. 인간 GPC3에 대한 결합의 친화성은 1.39 nM이고, 사이노몰구스 원숭이 GPC3에 대한 결합의 친화성은 2.10 nM로, 필적한다. 친화성 데이터는 표 7에 나와 있다.
SPR 분석에 의한 인간 및 사이노몰구스 원숭이 GPC3 전장 단백질에 결합하는
후보 항체의 친화성 결과
인간 GPC3 사이노몰구스 원숭이 GPC3
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
GC33 1.81E+05 1.85E-04 1.03 6.72E+04 4.29E-04 6.38
h49G8VHv6VKv3 2.53E+05 3.51E-04 1.39 1.19E+05 2.50E-04 2.10
2.4 인간화 항체의 내포작용
대수 증식기의 HepG2 세포를 취하여 예열된 배양 배지로 1회 세척하였다. 세포를 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 상등액을 폐기하였다. 무혈청 배양 배지를 첨가하여 세포를 1 x 106 세포/mL로 재현탁하였다. 세포를 200 μL/튜브로 EP 튜브에 피펫팅하고 예냉된 0.5% BSA/PBS 500 μL를 첨가하였다. 원심분리는 1000 rpm에서 3분 동안 수행하였다. 상등액을 폐기하였다. 10 μg/mL GPC3 시험 항체를 첨가하고 4℃ 또는 37℃에서 각각 60분, 120분, 240분, 120분, 180분 및 240분 동안 배양하였다. 각 시점에서 1차 항체의 배양이 종료된 후, 예냉된 0.5% BSA/PBS 500 μL를 첨가하여 2회 세척하였다. 이어서, 1:300 희석된 2차 항체 AF647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc를 45분 동안 배양하기 위해 직접 첨가하였다. 2차 항체 배양 종료 시, 0.5% BSA/PBS 500 μL를 첨가하여 2회 세척하였다. FACS 검출을 위해 세포를 200 μL로 재현탁시켰다. 도 11에 나타난 바와 같이. GPC3 인간화 항체는 37℃ 및 4℃에서 유의한 내포작용을 나타내지 않았다.
실시예 3. GPC3 x CD3 이중특이적 항체의 구축
1. CD3 인간화 항체의 구축
뮤린 하이브리도마 CD3 항체(문헌[EMBO J.1985.4(2): 337-344; J.Immunol.1986,137(4):1097-100]; 문헌[J.Exp.Med.1991,174: 319-326; J.Immunol. 1991,147(9): 3047-52])는 인간 및 원숭이 CD3 수용체를 인식하며, 그 서열은 다음과 같다:
항-CD3 뮤린 단일클론 항체 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 174에 나타내었다:
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCR SSTGAVTTSNYAN WVQQKPDHLFTGLIG GTNKRAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCA LWYSNLWV FGGGTKLTVL
항-CD3 뮤린 단일클론 항체 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 175에 나타내었다:
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVAR IRSKYNNYATYYADS VKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
항-CD3 마우스 단일클론 항체를 인간화하였다. 상동성이 가장 높은 인간 생식계열 유전자 IMGT_hVL7-43을 경쇄 CDR 이식을 위해 선택하였고, 인간 IGLJ3*02를 FM4로 선택하였다. 인간 IMGT_hVH3-73을 중쇄 CDR 이식을 위해 선택하였고, 인간 IGHJ4*01을 FM4로 선택하였다. 상이한 중쇄 및 경쇄 변이체를 설계하고 수득하였다(표 8 및 9 참조).
CD3 인간화 항체의 경쇄 가변 영역 서열
CD3 인간화 항체 서열번호: 113 내지 131
LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
아미노산 서열 뉴클레오타이드 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 아미노산 서열
hVL1 113 114 115 116 117
hVL2 118 119 115 116 117
hVL3 120 121 122 123 117
hVL4 124 125 122 123 117
hVL5 126 127 115 116 128
hVL6 129 130 115 131 128
hVL1의 아미노산 서열은 서열번호 113에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 114에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 115, 116, 117에 나타내었다.
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
핵산 서열
CAGGCTGTGGTCACACAAGAGCCTAGCCTGACAGTGTCTCCTGGCGGCACAGTGACCCTGACCTGTAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCTAATTGGGTGCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTAGAGGACTGATCGGCGGAACAAACAAGAGAGCCCCTTGGACACCCGCCAGATTCTCTGGATCTCTGCTCGGCGGAAAGGCCGCTCTGACACTTTCTGGTGCTCAGCCTGAGGACGAGGCCGAGTACTATTGTGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAACTGACAGTTCTG
hVL2의 아미노산 서열은 서열번호 118에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 119에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 115, 116, 117에 나타내었다.
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLI GGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
핵산 서열
CAGGCTGTGGTCACACAAGAGCCTAGCCTGACAGTGTCTCCTGGCGGCACAGTGACCCTGACCTGTAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCTAATTGGGTGCAGGAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTAGAGGACTGATCGGCGGAACAAACAAGAGAGCCCCTTGGACACCCGCCAGATTCTCTGGATCTCTGCTCGGCGGAAAGGCCGCTCTGACACTTTCTGGTGCTCAGCCTGAGGACGAGGCCGAGTACTATTGTGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAACTGACAGTTCTG
hVL3의 아미노산 서열은 서열번호 120에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 121에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 122, 123, 117에 나타내었다.
EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC ESSDGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLIG GTNKEAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
핵산 서열
GAGGCTGTGGTCACACAAGAGCCTAGCCTGACAGTGTCTCCTGGCGGCACAGTGACCCTGACCTGTGAGTCTTCTGACGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCTAATTGGGTGCAGGAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTAGAGGACTGATCGGCGGAACAAACAAGGAGGCCCCTTGGACACCCGCCAGATTCTCTGGATCTCTGCTCGGCGGAAAGGCCGCTCTGACACTTTCTGGTGCTCAGCCTGAGGACGAGGCCGAGTACTATTGTGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAACTGACAGTTCTG
hVL4의 아미노산 서열은 서열번호 124에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 125에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 122, 123, 117에 나타내었다.
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC ESSDGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLI GGTNKEAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
핵산 서열
CAGGCTGTGGTCACACAAGAGCCTAGCCTGACAGTGTCTCCTGGCGGCACAGTGACCCTGACCTGTGAGTCTTCTGACGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCTAATTGGGTGCAGGAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTAGAGGACTGATCGGCGGAACAAACAAGGAGGCCCCTTGGACACCCGCCAGATTCTCTGGATCTCTGCTCGGCGGAAAGGCCGCTCTGACACTTTCTGGTGCTCAGCCTGAGGACGAGGCCGAGTACTATTGTGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAACTGACAGTTCTG
hVL5의 아미노산 서열은 서열번호 126에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 127에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 115, 116, 128에 나타내었다.
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLI GGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL
핵산 서열
CAGGCTGTGGTCACACAAGAGCCTAGCCTGACAGTGTCTCCTGGCGGCACAGTGACCCTGACCTGTAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCTAATTGGGTGCAGGAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTAGAGGACTGATCGGCGGAACAAACAAGAGAGCCCCTTGGACACCCGCCAGATTCTCTGGATCTCTGCTCGGCGGAAAGGCCGCTCTGACAATCACTGGTGCTCAGGCTGAGGACGAGGCCGAGTACTATTGTGTGCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAACTGACAGTTCTG
hVL6의 아미노산 서열은 서열번호 129에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 130에 나타내었으며; 이의 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 각각 서열번호 115, 131, 128에 나타내었다.
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WFQEKPGQAPRGLI YGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQAEDEAEYYC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL
핵산 서열
CAGGCTGTGGTCACACAAGAGCCTAGCCTGACAGTGTCTCCTGGCGGCACAGTGACCCTGACCTGTAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCTAATTGGTTCCAGGAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTAGAGGACTGATCTACGGAACAAACAAGAGAGCCCCTTGGACACCCGCCAGATTCTCTGGATCTCTGCTCGGCGGAAAGGCCGCTCTGACACTTTCTGGTGCTCAGGCTGAGGACGAGGCCGAGTACTATTGTGTCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAACTGACAGTTCTG
CD3 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 서열
CD3 인간화 항체 서열번호: 132 내지 161
HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3
아미노산 서열 뉴클레오타이드 서열 아미노산 서열 아미노산 서열 아미노산 서열
hVH1 132 133 134 135 136
hVH2 137 138 139 135 136
hVH3 140 141 139 135 142
hVH4 143 144 139 135 145
hVH5 146 147 139 135 148
hVH6 149 150 139 135 151
hVH7 152 153 154 155 136
hVH8 156 157 134 135 136
hVH9 158 159 134 135 136
hVH10 160 161 134 135 136
hVH1의 아미노산 서열은 서열번호 132에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 133에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 134, 135, 136에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRQAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCTATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH2의 아미노산 서열은 서열번호 137에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 138에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 139, 135, 136에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH3의 아미노산 서열은 서열번호 140에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 141에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 139, 135, 142에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGESYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCGAGAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH4의 아미노산 서열은 서열번호 143에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 144에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 139, 135, 145에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGQSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCCAGAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH5의 아미노산 서열은 서열번호 146에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 147에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 139, 135, 148에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGDSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCGACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH6의 아미노산 서열은 서열번호 149에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 150에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 139, 135, 151에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGTSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCACCAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH7의 아미노산 서열은 서열번호 152에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 153에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 154, 155, 136에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SDYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVED RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCGACTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGGAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH8의 아미노산 서열은 서열번호 156에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 157에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 134, 135, 136에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRKAPGKGLEWVGR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGGAAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH9의 아미노산 서열은 서열번호 158에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 159에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 134, 135, 136에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRKAPGKGLEWVGR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCT
TCACCTTCAACACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGGAAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
hVH10의 아미노산 서열은 서열번호 160에 나타내었고; 이의 암호화 핵산은 서열번호 161에 나타내었으며; 이의 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 각각 서열번호 134, 135, 136에 나타내었다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRKAPGKGLEWVAR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
핵산 서열
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGCCAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCT
경쇄 및 중쇄 인간화 변이체를 각각 전체 서열 합성하고, 항체 람다 경쇄 불변 영역 또는 인간 IgG4 중쇄 불변 영역 CH1-CH3을 함유하는 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하였다. 이들을 HEK293E 세포에 동시 형질감염시키고, 37℃, 120 rpm 및 5% CO2에서 5 내지 6일 동안 배양하였다. 배양 배지의 상등액을 수집하고, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다.
2. 인간화 CD3 항체의 친화성
인간 CD3 εγ 단백질을 4℃에서 밤새 코팅하였다. 2% 탈지유로 차단한 후, CD3 항체의 다른 희석액을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 2차 항체 HPR-표지된 염소 항-인간 IgG Fc를 첨가하였다. TMB 용액으로 전개시킨 후, 진한 황산으로 반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(결과는 도 12 및 표 8에 나타냄). 도 12는 인간 CD3 εγ 단백질에 결합하는 항-CD3 인간화 항체(aCD3-hVH8/VL1, aCD3-hVH9/VL1, aCD3-hVH9/VL2, aCD3-hVH9/VL3, aCD3-hVH1/VL5, aCD3-hVH8/VL5, aCD3-hVH9/VL5 포함)와, 재조합 CD3 εγ 단백질에 높은 친화성하에 결합하는 CD3 인간화 항체와의 조합을 보여준다.
3. CD3 인간화 항체에 의한 Jurkat T 세포의 인식
대수 증식기의 Jurkat 세포를 취하고, 3% BSA로 30분 동안 차단하고, 웰당 5 x 104 세포로 96-웰 U-플레이트에 첨가하였다. 상등액은 원심분리 후에 폐기하였다. 웰당 50 μL의 구배 희석된 항체를 첨가하고(항체 농도: 30 μg/mL부터, 5개의 구배에 대해 3배 희석), 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1차 항체를 세척한 후, 2차 항체 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc를 1:300 희석(Jackson ImmunoResearch, 109-606-170)하에 첨가하고 4℃에서 45분 동안 배양하였다. 세척 후, 웰당 50 μL PBS를 첨가하여 FACS(iQue, intellicyt) 분석을 위한 재현탁을 수행하였다(결과는 도 13 및 표 10에 나와 있음).
CD3 인간화 항체의 친화성
ELISA (CD3εγ) FACS Jurkat
aCD3-hVH1/VL5 0.60 nM 10 nM
aCD3-hVH8/VL1 0.65 nM 15 nM
aCD3-hVH8/VL5 0.74 nM 약간 약함
aCD3-hVH9/VL1 0.49 nM 7 nM
aCD3-hVH9/VL2 0.44 nM 25 nM
aCD3-hVH9/VL3 0.70 nM 약함
aCD3-hVH9/VL5 0.42 nM 20 nM
OKT3-hIgG1 ND 0.27 nM
KLH-hIgG4 - -
ND: 검출되지 않음
-: 결합 없음
도 13은 Jurkat 세포에 결합하는 항-CD3 인간화 항체의 조합을 보여주며, 여기서 CD3 인간화 항체 hVH9/VL5(aCD3-hVH9/VL5) 및 hVH9/VL2(aCD3-hVH9/VL2)는 둘 다 대조군 항체 OKT3보다 상당히 약하여, 적당한 친화성하에 Jurkat 세포에 결합한다.
4. 인간 및 원숭이 CD3 εγ 항원과 CD3 인간화 항체의 교차-인식
인간 CD3 εγ 단백질 및 원숭이 CD3 εγ 단백질을 별도로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 2% 탈지유로 차단한 후, CD3 항체의 다양한 희석액을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 2차 항체 HPR-표지된 염소 항-인간 IgG Fc를 첨가하였다. TMB 용액으로 전개시킨 후, 진한 황산으로 반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 도 14는 CD3 인간화 항체 hVH9/VL5(aCD3-hVH9/VL5) 및 hVH9/VL2(aCD3-hVH9/VL2)가 둘 다 인간 CD3 εγ 및 원숭이 CD3 εγ 단백질 둘 다에 결합하는 것을 보여준다
5. 인간화 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 구축
인간화 항체 49G8VHv6VKv3, 및 λ 경쇄를 함유하는 인간화 CD3 항체 hVH9/VL5(aCD3-hVH9/VL5)를 사용하여 천연 IgG 구성을 갖는 새로운 GPC3-CD3κλ 인간화 이중특이적 항체를 구축하였다. 동시에, GPC3 항원 아암 및 CD3 아암을 전하 변이체(Vκ GPC3: Gln`Lys; VHGPC3: Gln39Glu; VλCD3: Gln`Glu; VHCD3: Gln39Lys)와 함께 도입하였다(표 11). 이중특이적 항체의 Fc 부분은 이종이량체 페어링을 달성하기 위해 인간 IgG4 놉-인투-홀 구조를 취한다(문헌[Atwell et al. 1997]). 돌연변이 Ser228Pro, Leu235Glu 및 Pro329Ala를 통해, Fcγ 수용체 및 C1q와의 상호작용을 완전히 제거하면서 힌지 영역이 안정적으로 유지되었다.
상응하는 항체 단편을 암호화하는 플라스미드를, 카파 경쇄:λ 경쇄:중쇄 1:중쇄 2 = 2:2:1:1의 비로 혼합하였다. 혼합물을 3 mg/mL PEI와 혼합하고, CHO-S 세포에 동시-형질감염시키고, 37℃, 5% CO2 및 150 rpm에서 500 mL CD CHO AGT 배지(Gibco # 12490-001)에서 배양하였다. 4% CHO Feed C+ 보충제(Gibco #A25031-05)를 즉석 형질감염 2일, 4일 및 6일차에 각각 첨가하였다. 세포 생존율이 약 85%로 감소했을 때, 발효액을 수확하고, 여과하고, 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. SEC-HPLC 단량체 함량은 92%보다 높았다. 단량체 함량은 부틸 HP 소수성 크로마토그래피 및 Capto Q 음이온 크로마토그래피에 의해 99.5% 이상으로 더 증가하였다(표 12).
GPC3-CD3 κλ 인간화 이중특이적 항체
GPC3 아암 경쇄 GPC3 아암 중쇄 CD3 아암 경쇄 CD3 아암 중쇄
GPC3 x CD3 κλ002 서열번호 162 서열번호 164 서열번호 166 서열번호 168
GPC3 x CD3 κλ003 서열번호 170 서열번호 172 서열번호 166 서열번호 168
GPC3 x CD3 κλ002：
GPC3 아암 경쇄 서열번호 162
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GPC3 v CD3 κλ003
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GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCTATGAACTGGGTCCGAAAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGGAAGAATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTCCAGAGCAGCGGACTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCTTCCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCGAGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGGCCAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCTTGTCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAG
GPC3-CD3 인간화 이중특이적 항체의 정제
HPLC 검출 HPLC-SEC (단백질 A 후) HPLC-SEC (음이온 크로마토그래피 후)
다량체 단량체 단편 다량체 단량체 단편
GPC3 x CD3 κλ002 2.6% 94.2% 3.1% 0.0% 100.0% 0.0%
GPC3 x CD3 κλ003 2.2% 93.2% 4.5% 0.1% 99.5% 0.4%
실시예 4. 이중특이적 항체 GPC3 x CD3 κλ의 결합 활성
재조합 GPC3 단백질, 과발현된 안정하게 형질감염된 세포 또는 GPC3+ 종양 세포 각각에 대한 결합을 측정함으로써 이중특이적 항체 GPC3 항원 아암의 친화성을 측정하였다. 이중특이적 항체 CD3 아암의 친화성은 Jurkat 세포에 대한 결합을 측정함으로써 측정하였다.
1. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 GPC3에 대한 친화성 측정
1 μg/ml 농도의 항체를 단백질 A 칩(GE healthcare) 상에 포획하였다. 분석물로서 상이한 농도의 재조합 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 GPC3 단백질(초기 농도로서 5 μg/ml, 2배 구배, 총 6개의 농도 포인트)을 120초의 결합 시간 및 400초의 해리 시간하에 30 μL/분의 유량으로 칩에 관류시켰다. 단백질의 결합 및 해리 동안 SPR 신호의 변화를 기록하였다. 동역학 상수는 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델로 적합화시킴으로써 수득하였다.
인간 또는 원숭이 CD3 εγ 재조합 항원을 10 μg/mL로 CM5 칩(GE healthcare)에 아미노 커플링에 의해 결합시켰으며, 항원-결합 능력을 약 200 RU로 조절하였다. 기준선이 안정된 후에, 구배 희석된 항체(처음에는 10μg/mL, 2배 희석, 7개 구배)를 350초의 결합 시간 및 600초의 해리 시간 하에 30μL/분의 유량으로 칩에 관류시켰다. 동역학 상수는 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델로 적합화시켜 수득하였다. 친화성 측정 결과는 표 13에 나타내었다.
GPC3 및 CD3 재조합 항원에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 친화성
KD (nM) 인간 GPC3 원숭이 GPC3 인간 CD3εγ 원숭이 CD3εγ
GPC3 x CD3 κλ002 1.35 1.60 15.9 23.9
GPC3 x CD3 κλ003 2.11 1.91 12.1 17.8
2. GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
대수 증식기의 CHO-인간 GPC3 및 CHO-사이노몰구스 원숭이 GPC3으로 안정하게 형질전환된 세포를 취하고, 4% 송아지 혈청(Hyclone, SH30626.06)을 사용하여 5 x 105 세포/ml로 조정하고, 96-웰 U자형 플레이트에 100 μl/웰 세포 현탁액으로 첨가하였다. 300 g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 상등액을 폐기하였다. 100 μL의 구배 희석된 항체(초기 농도: 1800 nM, 3배 희석, 10개 구배)를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 60분 동안 배양하였다. 2차 항체 Alexa Fluro647 표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 50 μL/웰로 첨가하고 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 1회 세척 후, 요오드화프로피듐 용액(1:300)을 50 μL/웰로 첨가하였다. 5분 동안 배양을 수행한 후 유세포분석으로 검출하였다. 도 15 및 표 14는 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체가 세포 GPC3 수용체에 높은 친화성하에 결합할 수 있고, 원숭이 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 친화성이 인간 GPC3으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 친화성에 필적하는 것을 보여준다.
안정하게 형질감염된 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
EC50 (nM) 인간 GPC3-CHO 원숭이 GPC3-CHO
GPC3 x CD3 κλ002 2.8 3.0
GPC3 x CD3 κλ003 2.9 3.0
KLH x CD3 - -
3. GPC3+ 종양 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
대수 증식기의 HepG2 세포를 취하고, 200 μg/mL의 뮤린 IgG(Jackson ImmunoResearch, 115-005-03)를 첨가하고, 얼음욕에서 30분 동안 차단하였다. 세포를 4% 송아지 혈청으로 5 x 105 세포/mL로 조정하고, 96-웰 U자형 플레이트에 100 μl/웰로 첨가하였다. 300 g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 상등액을 폐기하였다. 100 μL의 구배 희석된 항체(초기 농도: 1800 nM, 3배 희석, 10개 구배)를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 60분 동안 배양하였다. 1차 항체를 세척하고, Alexa Fluro647 표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석) 50 μL/웰을 첨가하고, 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 1회 세척 후, PI 용액을 50 μL/웰로 첨가하였다. 5분 동안 배양을 수행한 후 유세포분석으로 검출하였다. 검출 결과는 도 16 및 표 15에 나타내었다. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체는 GPC3+ 종양 세포 HepG2에 높은 친화성하에 결합할 수 있다.
GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체 및 GPC3+ 종양 세포의 결합
EC50 (nM) HepG2
GPC3 x CD3 κλ002 2.1
GPC3 x CD3 κλ003 2.5
KLH x CD3 -
4. Jurkat 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
대수 증식기의 Jurkat 세포를 취하고, 200μg/mL의 뮤린 IgG(Jackson ImmunoResearch, 115-005-03)를 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 4% 송아지 혈청으로 5 x 105 세포/mL로 조정하고, 96-웰 U자형 플레이트에 100 μl/웰로 첨가하였다. 300 g에서 원심분리를 수행하였다. 상등액을 폐기하였다. 100 μL의 구배 희석된 항체(초기 농도: 1800 nM, 3배 희석, 10개 구배)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 60분 동안 배양하였다. 2차 항체 Alexa Fluro647 표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 50 μL/웰로 첨가하고 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 1회 세척 후, PI 용액을 50 μL/웰로 첨가하였다. 5분 동안 배양을 수행한 후 유세포 분석기(BD C6)로 검출하였다. 도 17 및 표 16에 나타난 바와 같이, GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체는 약 20 내지 40 nM의 EC50 하에 인간 백혈병 T 세포주 Jurkat 세포에 적당한 친화성으로 결합할 수 있다.
Jurkat 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
EC50 (nM) Jurkat
GPC3 x CD3 κλ002 36
GPC3 x CD3 κλ003 26
KLH x CD3 27
5. 말초혈 T 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
신선한 인간 말초혈을 채취하고 PBMC를 Ficoll-Paque Plus(GE, 17-1440-03)로 단리하였다. PBMC를 4% 송아지 혈청(Hyclone, SH30626.06)으로 5 x 105 세포/mL로 조정하고, 100 μL/웰로 96-웰 U-플레이트에 첨가하였다. 원심분리한 상등액을 폐기하였다. 100 μL의 구배 희석된 항체(초기 농도: 1800 nM, 3배 희석, 11개 구배)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 60분 동안 배양하였다. 2차 항체 Alexa Fluro647 표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 50 μL/웰로 첨가하고 얼음욕에서 20분 동안 배양하였다. 1회 세척 후, PI 용액을 50 μL/웰로 첨가하였다. 5분 동안 배양을 수행한 후 유세포 분석기(BD Celesta)로 검출하였다. 검출 결과는 도 18에 나타내었다. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체는 인간 말초혈 T 세포에 낮은 친화성하에 결합할 수 있다.
말초혈 T 세포에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
EC50 (nM) CD4+ T 세포 CD8+ T 세포
GPC3 x CD3 κλ002 65 65
GPC3 x CD3 κλ003 56 69
KLH x CD3 77 84
실시예 5. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체-매개 TDCC 효과
새로 단리된 PBMC를 표적 세포인 HepG2 세포와 각각 대수 증식기에서 효과기/표적 세포 비 = 10:1로 혼합하였다. 50 μL의 구배 희석된 항체(처음에 66.7 nM의 항체 농도, 10배 희석, 7개 구배)를 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 시, 50 μL의 상등액을 새로운 흑색 ELISA 플레이트로 옮겼다. 50 μL/웰의 LDH 검출 기질을 첨가하였다. 10분 후에 반응을 정지시키고 LDH 방출을 검출하였다; 웰에 잔류하는 세포를 4% 송아지 혈청으로 2회 세척하고, 100 μg/mL 인간 IgG를 첨가하고 10분 동안 배양하였다. T-세포 활성화 검출 항체(CD25-BV421, CD4-FITC, CD69-BV605 및 CD8-APC)를 첨가하고, 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 세척 후, 상등액을 폐기하였다. PI를 60 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 얼음 위에서 5분 동안 배양하고 유세포분석으로 검출하였다. 도 19는 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체가 시험관내 활성 연구에서 대조군 항체보다 HepG2 세포의 약간 더 높거나 동등한 최대 사멸을 야기할 수 있음을 보여주지만(도 19a), TDCC 동안 T 세포의 CD69(초기 활성화) 및 CD25(늦은 활성화)의 변화는 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체가 대조군 항체보다 더 약하게 T 세포를 활성화할 수 있음을 시사하였다.
실시예 6. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화 경로의 활성화
대수 증식기의 표적 세포, CHO-인간 GPC3을 수확하고 원심분리하였다. 상등액을 폐기하였다. 세포를 2 x 105 세포/ml로 재현탁시켰다. 표적 세포를 96-웰 플레이트에 50 μl/웰로 접종하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 대수 증식기의 Jurkat-NFAT-luc 리포터 세포를 취하여 300 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 폐기하였다. 세포를 4 x 106 세포/ml로 재현탁시켰다. 96-웰 플레이트를 꺼내고 상등액을 폐기하였다. Jurkat-NFAT-luc 리포터 세포를 96-웰 플레이트에 25 μL/웰로 접종하였다. 25 μL 구배 희석된 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체 또는 대조군 항체 KLH x CD3(초기 농도: 20 μg/ml, 3배 희석, 10개 구배)를 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 6 시간동안 배양하였다. 배양 후, 마이크로플레이트 판독기(MD SpectraMax i 3x)에서의 검출을 위해 ONE-Glo 루시페라제 분석 시스템 지침에 따라 100 μL의 검출 시약을 각 웰에 첨가하였다. 검출 결과는 도 20에 나타내었다. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체가 CHO-hGPC3를 표적 세포로 사용하는 경우, 상기 항체는 T 세포의 NFAT 신호전달 경로를 활성화할 수 있으며, 이때 활성화 정도는 대조군 항체보다 약간 낮다.
실시예 7. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체에 의한 PBMC의 비특이적 활성화
새로 단리된 PBMC에 100 μL의 항체(10 μg/mL)를 첨가하고, 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 웰 내의 세포를 4% 송아지 혈청으로 2회 세척하고, 100 μg/mL 인간 IgG를 첨가하고, 10분 동안 배양하였다. T-세포 활성화 검출 항체(CD25-BV421, CD4-FITC, CD69-BV605 및 CD8-APC)를 첨가하고, 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 세척 후, 상등액을 폐기하였다. PI를 60 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 얼음 위에서 5분 동안 배양하고 유세포분석으로 검출하였다. 결과는 도 21에 나타내었다. 표적 세포가 없는 경우, GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체는 음성 대조군 KLH x CD3에 필적하게 말초혈 T 세포의 활성화를 나타내지 않았다.
실시예 8. Fc 수용체에 대한 GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 결합
50 μg/mL His-Tag 항체를 아미노기를 통해 CM5 칩에 접합시키고, His 태그(Sino Biological, #10256-H08H/10374-H08H1/10389-H08H1)를 갖는 재조합 단백질 FcγRI, FcγRIIAH131 및 FcγRIIIAV158을 각각 10 μL/분의 유량으로 40초의 포획시간 동안 포획하였다. 기준선이 안정된 후, 구배-희석된 항체(초기 농도 37.5 μg/mL, 2배 희석)를 120초의 결합 시간 및 200초의 해리 시간하에 30 μL/분의 유량으로 칩에 관류시켰다. 친화 상수는 Biacore 평가 소프트웨어로 적합화시켜 수득하였다. 도 22에서, GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체가 FcγRI, FcγRIIAH131 및 FcγRIIIAV158에 대한 결합이 없음을 볼 수 있다; 야생형 IgG4 대조군 항체는 높은 친화성하에 FcγRI에 결합할 수 있고, Fcγ RIIAH131에는 약하게 결합할 수 있다.
실시예 9. 피하 HepG2 이식 종양의 면역 재구성된 마우스 모델
6 내지 8주령의 암컷 B-NGD 마우스(Biocytogen)를 선택하고 HepG2 세포(7 x 106/마우스)로 피하 접종하였다. 종양이 60 내지 100 mm3까지 자란 후에, 마우스를 무작위로 3.0 mg/kg 투여군, 1.0 mg/kg 투여군, 0.3 mg/kg 투여군, 및 음성 대조군KLH x CD3, 3 mg/kg으로 각각 설정된 군으로 나누었다. 1 x 107 PBMC 세포를 꼬리 정맥을 통해 각각의 마우스에 주입하였다. 마우스는 3일 후에 처음 투여하였다. 투여는 5일에 1회, 총 2회 실시하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 모니터링하였다. 실험이 완료된 후, 마우스를 목 탈구로 죽였다. 종양을 꺼내고, 계량하고, 기록하였다. 결과는 도 23에 나타내었다. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체의 생체 내 효능은 용량-관련되었고, 종양 억제율(저용량에서 고용량까지)은 76.7%, 81.3%, 및 95.9%였다. 종양이 있는 마우스는 체중 감소와 같은 부작용 없이 상기의 용량을 잘 허용하였다.
실시예 10. CD3 인간화 뮤린 Hepa1-6/hGPC3 이종이식 모델
6주령의 암컷 C57/BL6-hCD3 마우스(Biocytogen Co. Ltd.)를 선택하고, Hepa1-6/hGPC3(6 x 106/마우스)을 피하 접종하였다. 종양 부피가 60 내지 100 mm3에 도달하면, 마우스를 무작위로 군으로 나누었다. 용량 군은 각각 10 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg, 및 음성 대조군 KLH x CD3 10 mg/kg으로 설정하였다. 투여 간격은 총 3개 용량 동안 3일에 1회 투여하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 모니터링하였다. 실험이 완료된 후, 마우스를 목 탈구로 죽였다. 종양을 꺼내고, 계량하고, 기록하였다. 결과는 도 24에 나타내었다. GPC3 x CD3 κλ 이중특이적 항체는 Hepa1-6/hGPC3 종양 성장을 유의하게 억제하고 CD3 인간화 뮤린 모델에서 종양-보유 부피를 감소시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Keymed Biosciences Co.,Ltd <120> Development of new tumor engager therapeutic drug and use thereof <130> MTPIJP20181 <140> PCT/CN2021/135153 <141> 2021-12-02 <150> CN 202011402162.X <151> 2020-12-02 <160> 175 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 552 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser 1 5 10 15 Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro 20 25 30 Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys 35 40 45 Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn 50 55 60 Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile 65 70 75 80 Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg 85 90 95 His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser 100 105 110 Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val 115 120 125 Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn 130 135 140 Glu Leu Phe Asp 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actgcagaca aatcctccac cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct attactgtac aagatactat 300 tcctttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Ala Asp Tyr Glu Ile His 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Thr Phe Glu 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr 1 5 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly 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gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr 1 5 <210> 52 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 53 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 53 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaaatac acatgttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Ser Gln Asn Thr His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 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atcaggtcca agtacaacaa ctacgccacc 180 tactacgccg acagcgtgaa ggacagattc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgagagcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgtcaga 300 cacggcaact tcggcgacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcacactg 360 gtcacagtta gctct 375 <210> 148 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 149 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Thr Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 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agctgaccgt ggacaagtcc agatggcagg agggcaacgt cttcagctgc 1260 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgag cctgagcctg 1320 ggcaag 1326 <210> 166 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 167 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 caggctgtgg tcacacaaga gcctagcctg acagtgtctc ctggcggcac agtgaccctg 60 acctgtagat cttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgctaattg ggtgcaggag 120 aagcccggcc aggctcctag aggactgatc ggcggaacaa acaagagagc cccttggaca 180 cccgccagat tctctggatc tctgctcggc ggaaaggccg ctctgacaat cactggtgct 240 caggctgagg acgaggccga gtactattgt gtgctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300 ggcggaggca ccaaactgac agttctgggt cagcccaagg cggcgccctc ggtcactctg 360 ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 420 gacttctatc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 480 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 540 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600 gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca 645 <210> 168 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Ala Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys 450 <210> 169 <211> 1356 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcta tgaactgggt ccgaaaggcc 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgggaaga atcaggtcca agtacaacaa ctacgccacc 180 tactacgccg acagcgtgaa ggacagattc accatcagca gggacgacag caagaacagc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgtcaga 300 cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcacactg 360 gtcacagtta gctctgctag caccaagggc cccagcgtgt tccccctggc cccttgcagc 420 agaagcacca gcgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag 480 cccgtgaccg tgtcctggaa cagcggcgct ctgaccagcg gcgtgcatac cttccccgcc 540 gtgctccaga gcagcggact gtactccctg agcagcgtgg tgaccgtgcc ttccagcagc 600 ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac 660 aagagagtgg agagcaagta cggccctccc tgcccccctt gccctgcccc cgagttcgag 720 ggcggaccta gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagcaga 780 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccagg aggaccccga ggtccagttt 840 aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcat aacgccaaga ccaagcccag agaggagcag 900 ttcaacagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 960 ggcaaggaat acaagtgcaa ggtctccaac aagggcctgg ccagcagcat cgagaagacc 1020 atcagcaagg ccaagggcca gccacgggag ccccaggtct acaccctgcc accttgtcaa 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg tggtgtctgg tgaaaggctt ctatcccagc 1140 gatatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1200 cctgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 1260 agatggcagg agggcaacgt cttcagctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1320 tacacccaga agtccctgag cctgagcctg ggcaag 1356 <210> 170 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Lys Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys 115 120 125 Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 171 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 gacgtggtca tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga cacctggcga acctgccagc 60 atcagctgta gaagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacacata cctggagtgg 120 tatctgaaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acaaggtgtc caacagattc 180 agcggcgtgc ccgacagatt ctctggctct ggatctggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tacttctgtc tccaggtcac acacgtgccc 300 ctgacatttg gccagggcac caagctggaa atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga taagaaattg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657 <210> 172 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Glu Ile His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Tyr Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Glu Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Ala Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 173 <211> 1326 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 173 caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ctagcggcta caccttcgcc gactacgaga tccactgggt ccgagaggct 120 ccaggacagg gacttgaatg gatgggcgct atccatcctg gctctggcgg cacagcttac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccctg accgccgacg agtctagcac caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcac ccggtactac 300 agcttcgcct actggggaca gggaaccctg gtcacagtca gctctgctag caccaagggc 360 cccagcgtgt tccccctggc cccttgcagc agaagcacca gcgagagcac agccgccctg 420 ggctgcctgg tggaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa cagcggcgct 480 ctgaccagcg gcgtgcatac cttccccgcc gtgctccaga gcagcggact gtactccctg 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ttccagcagc ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg 600 gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac gagagagtgg agagcaagta cggccctccc 660 tgcccccctt gccctgcccc cgagttcgaa ggcggaccta gcgtgttcct gttccccccc 720 aagcccaagg acaccctgat gatcagcaga acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 780 gtgtcccagg aggaccccga ggtccagttt aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcat 840 aacgccaaga ccaagcccag agaggagcag ttcaacagca cctacagagt ggtgtccgtg 900 ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggaat acaagtgcaa ggtctccaac 960 aagggcctgg ccagcagcat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gccacgggag 1020 ccccaggtct gcaccctgcc acctagccaa gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1080 agctgtgccg tgaaaggctt ctatcccagc gatatcgccg tggagtggga gagcaacggc 1140 cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 1200 ctggtttcca agctgaccgt ggacaagtcc agatggcagg agggcaacgt cttcagctgc 1260 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgag cctgagcctg 1320 ggcaag 1326 <210> 174 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 174 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 175 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 175 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Claims (16)

  1. (a) 표적 세포의 표면에 결합하는 GPC3 항원 또는 이의 항원-결합 단편의 제1 항원-결합 부분; 및
    (b) T 세포의 표면 상의 CD3 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서,
    상기 제1 항원-결합 부분이 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 부분이 제1 항원에 결합하는 제1 결합 도메인을 포함하고, 상기 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13, 21, 32, 33, 64, 65, 66, 72, 73, 79, 80, 81, 101, 106의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR, 및/또는 서열번호 16, 17, 18, 26, 29, 38, 39, 46, 47, 48, 51, 54, 57, 60, 61, 69, 92, 95, 98의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하고,
    상기 제2 항원-결합 부분이 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부분이 제2 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는,
    이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 결합 도메인이 서열번호 11, 32, 64, 79의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열번호 12, 21, 33, 65, 72, 80, 101, 106의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR2, 서열번호 13, 66, 73, 81의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하고/하거나; 제1 결합 도메인이 서열번호 16, 38, 46, 60의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열번호 17, 47의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR2, 서열번호 18, 26, 29, 39, 48, 51, 54, 57, 61, 69, 76의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 결합 도메인의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 32, 33, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 64, 65, 66의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 72, 73의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 79, 80, 81의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 101, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택되고; 제1 결합 도메인의 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열이 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 26의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 29의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 38, 17, 39의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 46, 47, 48의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 51의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 54의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 57의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 60, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 69의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 16, 17, 76의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 92, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 95, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 98, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택되고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 26의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 29의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 32, 33, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 38, 17, 39의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 21, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 18의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 46, 47, 48의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 51의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 54의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 57의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 12, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 60, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 64, 65, 66의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 69의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 72, 73의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 76의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 79, 80, 81의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 16, 17, 69의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 60, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 92, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 95, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 11, 106, 13의 아미노산 서열의 제1 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열 및 서열번호 98, 17, 61의 아미노산 서열의 제1 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는,
    이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 결합 도메인이 서열번호 9, 19, 30, 40, 62, 70, 77, 99, 102, 104, 107, 109, 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나, 서열번호 14, 22, 24, 27, 34, 36, 42, 44, 49, 52, 55, 58, 67, 74, 82, 84, 86, 88, 90, 93, 96의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 27의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 30의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 34의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 40의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 42의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 44의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 49의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 55의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 58의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 62의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 67의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 74의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 77의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 86의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 88의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 90의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 93의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 서열번호 111의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 96의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 결합 도메인이 서열번호 134, 135, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 155의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄 CDR로부터 선택되고/되거나; 서열번호 115, 116, 117, 122, 123, 128, 131의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄 CDR을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 134, 139, 154의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 CDR1, 서열번호 135, 155의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 CDR2, 서열번호 136, 142, 145, 148, 151의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호 115, 122의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 CDR1, 서열번호 116, 123, 131의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 CDR2, 서열번호 117, 128의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 CDR3을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열이 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 142의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 145의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 148의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 139, 135, 151의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 154, 155, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택되고; 제2 결합 도메인의 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열이 서열번호 115, 116, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 122, 123, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 115, 116, 128의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 115, 131, 128의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열로부터 선택되고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 115, 116, 128의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 115, 116, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 134, 135, 136의 아미노산 서열의 제2 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열, 서열번호 122, 123, 117의 아미노산 서열의 제2 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 132, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 156, 158, 160의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고/하거나, 서열번호 113, 118, 120, 124, 126, 129의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 132의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 126의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 156의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 113의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 156의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 126의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 113의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 118의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 120의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 126의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄가 카파형 경쇄이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄가 람다형 경쇄이고;
    바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄 가변 영역이 Gln43Lys 돌연변이(VκGPC3: Gln43Lys)를 갖고; 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역이 Gln39Glu(VHGPC3: Gln39Glu) 돌연변이를 갖고;
    바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄 가변 영역이 Gln40Glu 돌연변이(VλCD3: Gln40Glu)를 갖고; 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역이 Gln39Lys 돌연변이(VHCD3: Gln39Lys)를 갖고;
    바람직하게는, 이중특이적 항체의 제1 항원-결합 부분 및 제2 항원-결합 부분의 Fc 부분이 놉-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 취하고; 바람직하게는, 인간 IgG4 놉-인투-홀 구조를 취하는,
    이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 중쇄가 서열번호 164, 172 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄를 포함하고, 제1 경쇄가 서열번호 162, 170 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 중쇄가 서열번호 164 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄를 포함하고, 제1 경쇄가 서열번호 162 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 중쇄가 서열번호 172 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 중쇄를 포함하고, 제1 경쇄가 서열번호 170 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택된 경쇄를 포함하는,
    이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 결합 도메인이 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 126의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 중쇄가 서열번호 168의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 제2 경쇄가 서열번호 166의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 이중특이적 항체의 제1 중쇄가 서열번호 164의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 이중특이적 항체의 제1 경쇄가 서열번호 162의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함하고; 제2 중쇄가 서열번호 168의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 제2 경쇄가 서열번호 166의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 중쇄가 서열번호 172의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 이중특이적 항체의 제1 경쇄가 서열번호 170의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함하고; 제2 중쇄가 서열번호 168의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 중쇄를 포함하고, 제2 경쇄가 서열번호 166의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 변이체의 경쇄를 포함하는,
    이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 제1 항원-결합 부분을 포함하고 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 제9항에 따른 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산으로서,
    바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10, 20, 31, 41, 63, 71, 78, 100, 103, 105, 108, 110, 112의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고/되거나; 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 15, 23, 25, 28, 35, 37, 43, 45, 50, 53, 56, 59, 68, 75, 83, 85, 87, 89, 91, 94, 97의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 35의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 41의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 45의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 50의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 53의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 59의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 63의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 68의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 71의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 75의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 78의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 83의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 87의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 89의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 91의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 94의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 112의 뉴클레오타이드 서열이고; 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 97의 뉴클레오타이드 서열이고;
    바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 165, 173의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고/되거나; 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 163, 171의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 165의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 163의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 173의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 171의 뉴클레오타이드 서열이고;
    바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 133, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 157, 159, 161의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고/되거나; 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 114, 119, 121, 125, 127, 130의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 133의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 127의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 157의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 114의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 157의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 127의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 114의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 119의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 121의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 159의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 서열번호 127의 뉴클레오타이드 서열이고;
    바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체이고/이거나; 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 임의의 변이체이고;
    보다 바람직하게는, 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 이중특이적 항체의 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 165의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 163의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열이고;
    보다 바람직하게는, 이중특이적 항체의 제1 항원-결합 부분의 제1 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 173의 뉴클레오타이드 서열이고, 제1 항원-결합 부분의 제1 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 171의 뉴클레오타이드 서열이고; 제2 항원-결합 부분의 제2 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 169의 뉴클레오타이드 서열이고, 제2 항원-결합 부분의 제2 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 167의 뉴클레오타이드 서열인, 핵산.
  11. 제10항에 따른 핵산을 함유하는 벡터.
  12. 제9항에 따른 핵산 또는 제11항에 따른 벡터를 함유하는 세포.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제9항에 따른 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제10항에 따른 핵산, 제11항에 따른 벡터, 및/또는 제12항에 따른 세포를 포함하는 조성물.
  14. 치료 모이어티에 공유적으로 부착된, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 제9항에 따른 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-약물 접합체로서,
    바람직하게는, 치료 모이어티가 세포독성 모이어티, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제제, 면역자극제, 용해 펩티드 및 방사성 동위원소로부터 선택되고;
    바람직하게는, 세포독성 모이어티가 파클리탁셀; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 에티디움 브로마이드; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테니포시드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜히친; 독소루비신; 다우노루비신; 다이하이드록시 안트렌디온; 메이탄신 및 이의 유사체 또는 유도체와 같은 튜불린 억제제; 모노메틸 오리스타틴 E 및 F 및 이의 유사체 또는 유도체와 같은 항유사분열제; 아플리시아톡신 10 및 15 및 이의 유사체; 이리노테칸 및 이의 유사체; 미토잔트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-데하이드로테스토스테론; 글루코코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리케아미신 및 이의 유사체 또는 유도체; 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데칸디진, 하이드록시카바미드, 아스파라기나제, 겜시타빈 및 클라드리빈과 같은 항대사물질; 다이클로로메틸다이에틸아민, 티오퓨린, 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 미토브로니톨, 스트렙토조토신, 다카바진(DTIC), 프로카바진 및 미토마이신 C와 같은 알킬화제; 시스플라틴 또는 카보플라틴과 같은 백금 유도체; 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 SA, 라파마이신(CC-1065), 및 이의 유사체 또는 유도체; 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 포토마이신, 미토마이신, 미토잔트론, 페리마이신 및 디아제팜(AMC)과 같은 항생제; 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(PDB); 디프테리아 독소, 및 디프테리아 A 쇄 및 이의 활성 단편 및 하이브리드 분자와 같은 관련 분자, 리신 A 및 탈글리코실화 리신 A 쇄 독소와 같은 리신, 콜레라 독소, SLT I, SLT II 및 SLT IIV와 같은 시가-유사 독소 , LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 아롤린, 사포린, 아데니아 헤테로필라 뿌리 독소, 젤솔린, 아브린 A 쇄, 아데니아 헤테로필라 뿌리 A 쇄, α-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 카리오필린 단백질, PAPI, PAPII 및 PAP-S와 같은 피톨라카 아메리카나 단백질, 모모르디카 카란티아 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토마이신, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I 및 스태필로코커스 오레우스 내독소 A; 피톨라카 아시노사 항바이러스 단백질; 및 디프테리아 독소 및 슈도모나스 내독소로부터 선택되고;
    바람직하게는, 사이토카인이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스틴 및 TNFα로부터 선택되고;
    바람직하게는, 방사성 동위원소가 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 225Ac 및 227Th로부터 선택되는,
    항체-약물 접합체.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제9항에 따른 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 벡터, 제12항에 따른 세포, 제13항에 따른 조성물 및/또는 제14항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 키트.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제9항에 따른 GPC3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제10항에 따른 핵산 분자, 제11항에 따른 벡터, 제12항에 따른 세포, 제13항에 따른 조성물 및/또는 제14항에 따른 항체-약물 접합체의 GPC3-관련 질병의 진단, 치료 또는 예방을 위한 약제 또는 키트의 제조에서의 용도로서,
    바람직하게는, GPC3-관련 질병이 종양을 포함하고;
    바람직하게는, 종양이 암이고; 보다 바람직하게는, 암이 GPC3 양성 암, 예를 들어, GPC3 양성 간암, GPC3 양성 간세포 암종, GPC 양성 췌장암, GPC 양성 폐암, GPC 양성 결장암, GPC 양성 유방암, GPC 양성 전립선암, GPC 양성 백혈병 또는 GPC 양성 림프종인, 용도.
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