CN113784987A - 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法 - Google Patents

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开描述了特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1(GPC1)的单克隆抗体。还描述了基于GPC1特异性抗体的嵌合抗原受体(CAR)T细胞、免疫毒素和其他抗体偶联物。所公开的CAR T细胞、免疫毒素、GPC1特异性抗体及其偶联物可用于例如诊断或治疗GPC1阳性胰腺癌和其他癌症。

Description

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用 方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2019年1月22日提交的美国临时申请No.62/795,415的权益，在此通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本公开涉及以高亲和力特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1，GPC1)的单克隆抗体以及该单克隆抗体的用途，例如用于诊断和治疗表达GPC1的肿瘤。
政府支持的承认
本发明是在美国国立卫生研究院授予的项目编号Z01 BC010891的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖是细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，具有通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)键锚定到细胞质膜的膜相关蛋白核心。翻译后，HSPG通过两个或更多个线性多糖硫酸乙酰肝素链的共价连接进行修饰(Davies et al.,Clin Cancer Res 10:5178-5186,2004)。已在哺乳动物中鉴定出六种磷脂酰肌醇蛋白聚糖，称为GPC1至GPC6。GPC家族的几个成员与癌症的发展或进展有关。GPC1在多种不同的癌症中过度表达，包括胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、结直肠癌和卵巢癌。
胰腺癌是美国第四大癌症死亡原因。这种致命疾病的总体5年生存率不到5％。虽然嵌合抗原受体(CAR)T细胞的免疫疗法在某些血液恶性肿瘤中显示出前景，但它们对实体肿瘤(包括胰腺癌)的疗效仍然难以捉摸。因此，仍然迫切需要为胰腺癌和其他类型的癌症患者鉴定和验证CAR T细胞治疗的新靶点。
发明内容
本公开描述了小鼠单克隆抗体和骆驼单域单克隆抗体，两者均靶向GPC1。该GPC1特异性抗体，称为HM2和D4，以高亲和力特异性结合GPC1。由所公开的抗体组成的嵌合抗原受体(CAR)T细胞能够在体外和体内有效地杀死GPC1阳性肿瘤细胞。
本文提供结合例如特异性结合GPC1的单克隆抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体包括HM2或D4的互补决定区(CDR)序列。本文还提供了包括所公开的单克隆抗体的偶联物。在一些实例中，提供了包括本文公开的单克隆抗体的CAR(和表达CAR的T细胞和自然杀伤细胞)、免疫偶联物(例如免疫毒素)、多特异性抗体(例如双特异性T细胞接合物)、抗体药物偶联物(ADC)、抗体-纳米颗粒偶联物、抗体-放射性同位素偶联物(例如用于癌症诊断和免疫PET成像)和的融合蛋白。
本文还提供了经修饰以使其能够与通用CAR***一起使用的GPC1特异性单克隆抗体。在一些实施方案中，该GPC1特异性单克隆抗体与特异性结合对的一个组分融合。在一些实例中，该单克隆抗体与亮氨酸拉链、生物素或分选酶识别基序融合。
本公开还提供了包括GPC1特异性单克隆抗体和药学上可接受的载体的组合物。
本文还提供了编码本文公开的GPC1特异性单克隆抗体、CAR、免疫偶联物(例如免疫毒素)、多特异性抗体和融合蛋白的核酸分子和载体。
进一步提供了编码GPC1特异性CAR和截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸构建体。所编码的CAR包括与细胞外铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号传导结构域融合的GPC1特异性单克隆抗体。该huEGFRt包括两个EGFR胞外结构域(结构域III和结构域IV)和EGFR跨膜域，但缺少两个膜远端胞外结构域和所有胞内结构域。在一些实施方案中，该核酸分子以5'至3'方向包括编码第一信号序列的核酸；编码GPC1特异性抗体的核酸；编码胞外铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码胞内共刺激结构域的核酸；编码胞内信号传导结构域的核酸；编码自切割2A肽的核酸；编码第二信号序列的核酸；以及编码huEGFRt的核酸。还提供了包括本文公开的核酸分子的载体，例如病毒载体。还公开了共表达所公开的CAR和huEGFRt的分离的细胞，例如T淋巴细胞。
还提供了治疗受试者中GPC1阳性癌症的方法，以及抑制受试者中GPC1阳性癌症的肿瘤生长或转移的方法。在一些实施方案中，这些方法包括以本文公开的单克隆抗体向该受试者给药，或以包括本文公开的单克隆抗体的CAR(或CAR T细胞或CAR NK细胞)、免疫偶联物(例如免疫毒素)、ADC、多特异性抗体、抗体-纳米颗粒偶联物或融合蛋白向该受试者给药。
本文进一步提供了检测样品中GPC1表达的方法。在一些实施方案中，该方法包括将样品与本文公开的单克隆抗体接触，并检测该抗体与样品的结合。
还提供了将受试者诊断为患有GPC1阳性癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括使从受试者获得的样品与本文公开的单克隆抗体接触，并检测该抗体与样品的结合。在一些实例中，该样品是含有外泌体的血清样品。
从以下参照附图进行的详细描述中，本公开的前述和其他目的和特征将变得更加明显。
附图说明
图1A-1B:通过噬菌体展示分离GPC1特异性骆驼单域单克隆抗体。(图1A)来自每轮淘选的输出噬菌体的多克隆噬菌体ELISA。HuGPC1：人GPC1。(图1B)GPC1结合物D4与小鼠GPC1(MsGPC1)和人磷脂酰肌醇蛋白聚糖的交叉反应性的单克隆噬菌体ELISA分析。
图2:使用D4抗体对细胞表面GPC1表达进行流式细胞术分析。评估了D4与过表达GPC1的2B9 KLM胰腺癌细胞、过表达GPC1的H8表皮样癌细胞和GPC1阴性A431细胞的结合。白色峰代表用同种型对照抗体染色的细胞表面，阴影峰代表用GPC1特异性D4抗体染色的细胞表面。D4以5μg/ml的浓度使用。
图3:对D4抗体和人GPC1之间相互作用的
Figure BDA0003172735260000031
动力学分析。D4对人GPC1的亲和力计算为KD＝1.3nM。
图4:HM2抗GPC1单克隆抗体与GPC1和其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的结合通过ELISA进行评估。HM2特异性结合GPC1。
图5:使用HM2抗体对细胞表面GPC1表达进行流式细胞术分析。评估了HM2与过表达GPC1的2B9 KLM胰腺癌细胞、过表达GPC1的H8表皮样癌细胞、GPC1阳性T3M4胰腺癌细胞和GPC1阴性A431细胞的结合。白色峰代表用同种型对照抗体染色的细胞表面，阴影峰代表用GPC1特异性HM2抗体染色的细胞表面。HM2以10μg/ml的浓度使用。
图6:HM2抗体和人GPC1之间相互作用的
Figure BDA0003172735260000032
动力学分析。HM2对人GPC1的亲和力计算为KD＝1.2nM。
图7:GPC1在人胰腺肿瘤中的表达。通过免疫组织化学测定的GPC1在正常胰腺(i至iii)和胰腺肿瘤(iv至vi)中的表达。组织用1μg/ml HM2抗体标记。
图8A-8B:靶向GPC1的CAR T细胞的生成。(图8A)使用T2A核糖体跳跃序列表达靶向GPC1的CAR以及截短的人EGFR(huEGFRt)的慢病毒构建体的示意图。(图8B)使用流式细胞术通过检测huEGFRt表达来分析用慢病毒颗粒转导的人T细胞上的靶向GPC1的CAR表达。
图9A-9D:HM2和D4CAR T细胞的体外细胞溶解活性。将表达荧光素酶的2B9(图9A)、H8(图9B)、T3M4(图9C)和A431(图9D)细胞与空白(mock)、HM2或D4CAR转导的T细胞以指定的E：T比共培养20小时，并使用基于发光的细胞溶解试验测量特异性裂解。
图10A-10C:当与GPC1阳性肿瘤细胞共培养时，基于D4或HM2的CAR T细胞会诱导细胞因子的释放。GPC1阳性和GPC1阴性肿瘤细胞与靶向GPC1的CAR T细胞以E:T比为10共培养20小时。收集培养上清液以通过ELISA测量IL-2(图10A)、IFN-γ(图10B)和TNF-α(图10C)分泌。
图11A-11E:靶向GPC1的CAR T细胞在荷载有人类胰腺肿瘤的小鼠中表现出强有力的活性。(图11A)实验示意图。2B9荷瘤NSG小鼠在肿瘤细胞接种后第11天接受空白T细胞或30×106CAR T细胞腹膜注射处理。通过生物发光成像监测肿瘤负荷。(图11B)HM2和D4 CART细胞显示出强有力的抗肿瘤活性并介导2B9异种移植肿瘤的根除。(图11C)图11B中经处理的小鼠中生物发光的定量。(图11D)图11B中经处理的小鼠的体重。(图11E)显示空白-处理的、HM2处理的和D4处理的小鼠的脾脏中CAR T细胞的百分比的图。从选定小鼠的脾脏中提取基因组DNA并通过液滴数字PCR(ddPCR)进行分析以量化CAR载体阳性细胞。
图12A-12B:产生抗GPC1免疫毒素。(图12A)基于HM2和D4抗体的抗GPC1免疫毒素的示意图。LR：截短的假单胞菌外毒素A(缺少结构域II)。(图12B)D4-LR和HM2-LR的还原和非还原SDS-PAGE凝胶图像。
图13A-13B:抗GPC1免疫毒素对GPC1保持高亲和力。(图13A)显示HM2-LR和D4-LR对GPC1抗原的结合亲和力的Octet测定的图。(图13B)显示KD、Kon和Kdis的具体值的表。
图14A-14D:抗GPC1免疫毒素在体外杀死GPC1+癌细胞。孵育3天后，使用WST-8试剂对GPC1阳性细胞系H8(图14A)、2B9(图14B)和T3M4(图14C)以及GPC1阴性细胞系A431(图14D)进行细胞毒性测定。D4-LR和HM2-LR免疫毒素有效杀死过表达GPC1的H8和2B9细胞系，IC50值范围为14至31ng/ml。然而，两种免疫毒素对天然胰腺癌细胞系T3M4的细胞杀伤能力较差，其GPC1表达水平相对较低。两种免疫毒素都不能杀死GPC1阴性A431细胞，表明免疫毒素对表达GPC1的细胞具有特异性。
图15A-15B:二价D4免疫毒素的产生。(图15A)二价D4-D4-LR免疫毒素：D4-AAA-D4-LR和D4-GGS-D4-LR的示意图。(图15B)D4-D4-LR免疫毒素的还原和非还原SDS-PAGE凝胶图像。
图16A-16C:重新设计的二价D4-D4-LR免疫毒素表现出增强的GPC1结合活性。显示了Octet(图16A)、ELISA(图16B)和FACS分析(图16C)的结果。
图17A-17D:抗GPC1免疫毒素的细胞杀伤曲线。对GPC1阳性(H8、2B9和T3M4)和阴性(A431)细胞系进行细胞毒性测定。与D4-LR免疫毒素相比，二价D4免疫毒素对过表达GPC1的细胞系H8(图17A)和2B9(图17B)显示出相似的功效，但增强了对天然胰腺癌细胞系T3M4(图17C)的细胞毒性。所有免疫毒素对GPC1阴性细胞系A431(图17D)几乎没有细胞杀伤能力，表明了免疫毒素的杀伤特异性。
图18A-18D:抗GPC1免疫毒素显著抑制体内肿瘤生长。五周龄的雌性无胸腺裸鼠在右背侧注射5x106个细胞。在黑箭头指定的日期，通过尾静脉注射，用D4-LR(5mg/kg)、D4-AAA-D4-LR(3mg/kg)或HM2-LR(5mg/kg)对小鼠进行共9次处理。实验组包含5只小鼠。(图18A)每只小鼠的肿瘤体积。(图18B)每个实验组的平均肿瘤体积。(图18C)实验处理期间小鼠的平均体重。(图18D)经免疫毒素处理的小鼠的存活曲线。
序列表
随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用如37 C.F.R.1.822所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示。每个核酸序列仅显示一条链，但是任何提及显示的链时，互补链应理解为包括在内。序列表以ASCII文本文件提交，创建于2019年12月30日，34.0KB，通过引用在此加入本文。在随附的序列表中：
SEQ ID NO:1为HM2抗体的VH结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2为HM2抗体的VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为HM2抗体的VL结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4为HM2抗体的VL结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为D4抗体的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6为D4抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7为示例性GMCSFRss氨基酸序列。
SEQ ID NO:8为示例性CD8α铰链区氨基酸序列。
SEQ ID NO:9为示例性CD8α跨膜区氨基酸序列。
SEQ ID NO:10为示例性4-1BB氨基酸序列。
SEQ ID NO:11为示例性CD3ζ氨基酸序列。
SEQ ID NO:12为示例性自剪切T2A肽氨基酸序列。
SEQ ID NO:13为示例性huEGFRt氨基酸序列。
SEQ ID NO:14为编码D4-LR免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15为D4-LR免疫毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16为编码HM2-LR免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17为HM2-LR免疫毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18为编码D4-AAA-D4-LR免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19为D4-AAA-D4-LR免疫毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20为编码D4-GGS-D4-LR免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21为D4-GGS-D4-LR免疫毒素的氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写词
ADC 抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate)
ADCC 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)
CAR 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)
CDR 互补决定区(complementarity determining region)
CTL 细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte)
E:T 效应：靶比例(effector to target)
EGF 表皮生长因子(epidermal growth factor)
EGFR 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)
ELISA 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay)
FACS 荧光激活细胞分选(fluorescence activated cells sorting)
GMCSFRss 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(granulocyte-macrophagecolony stimulating factor receptor signal sequence)
GPC1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1)
GPI 糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol)
HSPG 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan)
huEGFRt 人截短的表皮生长因子受体(human truncated epidermal growthfactor receptor)
Ig 免疫球蛋白(immunoglobulin)
NK 自然杀伤细胞(natural killer)
PE 假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)
PET 正电子发射断层扫描(positron emission tomography)
II.术语概述
除非另有说明，技术术语按照常规用法使用。对分子生物学中常见术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes X,Jones&Bartlett Publishers出版,2009；和Meyers et al.(eds.),The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine,Wiley-VCH出版，第16卷，2008以及其他类似参考文献中找到。如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”既指单数也指复数，除非上下文另有明确说明。例如，术语“an antigen”包括单个或多个抗原，并且可以被认为等同于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包括(comprises)”指“包括(includes)”。还应理解，除非另有说明，为核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子重量或分子质量值都是近似值，并且出于描述目的提供。尽管可以使用与本文所述的那些相似或等效的许多方法和材料，但本文描述了特别适合的方法和材料。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。为了便于查看各种实施方案，提供了以下术语解释：
4-1BB:由T细胞受体(TCR)激活的淋巴细胞和其他细胞(包括自然杀伤细胞)表达的共刺激分子。4-1BB的连接诱导信号级联反应，导致细胞因子的产生、抗凋亡分子的表达和增强的免疫反应。4-1BB的示例性氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:10列出。
给药:通过任何有效途径向受试者提供或给予药剂，例如本文提供的抗GPC1抗体。示例性的给药途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌内、皮内、腹膜内、静脉内和瘤内)、舌下、直肠、经皮、鼻内、***和吸入途径。
抗体：一种多肽配体，包含至少一个识别并结合(例如特异性识别和特异性结合)抗原表位的可变区。哺乳动物免疫球蛋白分子由重(H)链和轻(L)链组成，每条链都具有可变区，分别称为可变重(VH)区和可变轻(VL)区。VH区和VL区一起负责结合抗体识别的抗原。哺乳动物免疫球蛋白有五种主要的重链类别(或同种型)，它们决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在哺乳动物中未发现的抗体同种型包括IgX、IgY、IgW和IgNAR。IgY是鸟类和爬行动物产生的主要抗体，在功能上与哺乳动物IgG和IgE相似。IgW和IgNAR抗体由软骨鱼产生，而IgX抗体则存在于两栖动物中。
抗体可变区包含“框架”区和称为“互补决定区”或“CDR”的高变区。CDR主要负责结合抗原表位。抗体的框架区用于在三维空间中定位和排列CDR。给定CDR的氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的编号方案中的任何一种来容易地确定，包括Kabat等(Sequencesof Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and HumanServices,1991；“Kabat”编号方案)、Chothia等(参见Chothia and Lesk,J Mol Biol 196:901-917,1987；Chothia et al.,Nature 342:877,1989；和Al-Lazikani et al.,JMB 273,927-948,1997；“Chothia”编号方案)、Kunik等(参见Kunik et al.,PLoS Comput Biol 8:e1002388,2012；和Kunik et al.,Nucleic Acids Res 40(Web Server issue):W521-524,2012；“Paratome CDRs”)以及ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(参见Lefranc,Nucleic AcidsRes 29:207-9,2001；“IMGT”编号方案)中描述的那些。Kabat、Paratome和IMGT为在线维护的。
“单域抗体”指具有能够在不存在其他抗体结构域的情况下特异性结合抗原或抗原表位的单个结构域(可变结构域)的抗体。单域抗体包括例如VH结构域抗体、VNAR抗体、骆驼科VHH抗体和VL结构域抗体。VNAR抗体是由软骨鱼类产生的，如护士鲨、沃贝贡鲨(wobbegong sharks)、白斑角鲨(spiny dogfish)和竹鲨。骆驼科VHH抗体由若干物种产生，包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和原驼(guanaco)，它们产生天然不含轻链的重链抗体。
“单克隆抗体”是由单个淋巴细胞克隆或由已转染进单个抗体的编码序列的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过已知方法产生。单克隆抗体包括人源化的单克隆抗体。
“嵌合抗体(chimeric antibody)”具有来自一个物种(例如人)的框架残基和来自另一物种的CDR(通常赋予抗原结合)。
“人源化”抗体是包括人框架区和来自非人(例如小鼠、兔、大鼠、鲨鱼或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，人源化免疫球蛋白中所有CDR都来自供体免疫球蛋白。恒定区不必存在，但如果存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，例如约95％或更高同一性。因此，可能除了CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化或其他单克隆抗体可具有额外的保守氨基酸替换(substitution)，这些替换对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。
抗体药物偶联物(ADC):一种分子，包括与诸如细胞毒性剂的药物偶联(例如共价连接)的抗体(或抗体的抗原结合片段)。通过抗体与细胞表面表达的肿瘤抗原的特异性结合，ADC可用于将药物特异性靶向癌细胞。与ADC一起使用的示例性药物包括抗微管剂(例如美登素类(maytansinoids)、auristatin E和auristatin F)和链间交联剂(例如，吡咯苯并二氮杂卓类；PDB)。在一些情况下，ADC是双特异性ADC，它由与药物偶联的两种单克隆抗体或其抗原片段组成，每个抗体都针对不同的抗原或表位。
抗微管剂：一类通过阻止有丝***来阻止细胞生长的药物。抗微管剂，也称为“抗有丝***剂”，用于治疗癌症。
结合亲和力：抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力是通过Frankel等，Mol.Immunol.,16:101-106,1979对Scatchard的方法的改良来计算的。在另一个实施方案中，结合亲和力通过抗原/抗体解离速率来测量。在另一个实施方案中，高结合亲和力是通过竞争性放射免疫测定法测量的。在另一个实施方案中，结合亲和力通过ELISA测量。在其他实施方案中，抗体亲和力通过流式细胞术或通过表面等离子体参照来测量。“特异性结合”抗原(如GPC1)的抗体是一种以高亲和力结合该抗原且不显著结合其他无关抗原的抗体。
在一些实例中，抗体或其片段(例如本文提供的抗GPC1抗体)以一结合常数与靶标(例如GPC1)特异性结合，该结合常数比与样品或受试者中其他分子的结合常数至少大103M-1、大104M-1的或大105M-1。在一些实例中，抗体(例如单克隆抗体)或其片段具有10nM或更小，例如9nM或更小、8.1nM或更小、8nM或更小、7nM或更小、6nM或更小、6.5nM或更小、6.3nM或更小、5nM或更小、4.3nM或更小、4nM或更小、3nM或更小、2nM或更小、1.5nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、或1.2nM或更小的平衡常数(Kd)。例如，抗体或其片段以至少约0.1x10-8M、至少约0.3x10-8M、至少约0.5x10-8M、至少约0.75x10-8M、至少约1.0x10-8M、至少约1.3x10-8M、至少约1.5x10-8M、或至少约2.0x10-8M、至少约2.5x10-8、至少约3.0x10-8、至少约3.5x10-8、至少约4.0x10-8、至少约4.5x10-8、至少约5.0x10-8M、至少约1x10-9M、至少约1.3x10-9M、至少约1.5x10-9M、至少约2x10-9M、至少约3x10-9M、至少约4x10-9M、至少约4.3x10-9M、至少约5x10-9M、至少约6x10-9M、至少约6.3x10-9M、至少约6.9x10-9M、至少约7x10-9M、至少约8x10-9M、至少约8.1x10-9M、或至少约10x10-9M的结合亲和力结合靶标，例如GPC1。在某些实施方案中，与其靶标结合的特异性结合剂具有≤100nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6.9nM、≤6.5nM、≤6.3nM、≤5nM、≤4nM、≤4.5nM、≤3nM，≤2nM，≤1.5nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M或更少，例如从10-8M到10-13M，例如，从10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在一个实施方案中，Kd通过用感兴趣抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)测量(参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.293:865-881,1999)。在另一个实例中，采用表面等离子共振测定法，使用BIACORES-2000或BIACORES-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)在25℃下使用固定抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)测量Kd。
双特异性抗体：一种重组蛋白，包括两种不同单克隆抗体的抗原结合片段，从而能够结合两种不同的抗原。在一些实施方案中，双特异性抗体通过同时靶向例如CTL(例如CTL受体组分，例如CD3)或效应自然杀伤(NK)细胞和肿瘤抗原(例如GPC1)来用于癌症免疫疗法。类似地，多特异性抗体是包含至少两种不同单克隆抗体，例如两种、三种或四种不同单克隆抗体的抗原结合片段的重组蛋白。
乳腺癌：一种在乳腺组织中形成的癌症，通常是导管和小叶。乳腺癌的类型包括例如原位导管癌、浸润性导管癌、三阴性乳腺癌、炎性乳腺癌、转移性乳腺癌、髓样癌、管状癌和粘液癌。三阴性乳腺癌是指癌细胞不表达***受体、孕激素受体或显著水平的HER2/neu蛋白的一类乳腺癌。三阴性乳腺癌也称为ER阴性PR阴性HER2/neu阴性乳腺癌。
化疗剂：在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中具有治疗作用的任何化学试剂。此类疾病包括肿瘤、赘生物和癌症。在一个实施方案中，化疗剂是用于治疗GPC1阳性肿瘤的试剂。在一个实施方案中，化疗剂是放射性化合物。可用于本文提供的方法的示例性化疗剂为在Slapak and Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter 86 in Harrison'sPrinciples of Internal Medicine,14th edition；Perry et al.,Chemotherapy,Ch.17in Abeloff,Clinical Oncology 2nd ed.,
Figure BDA0003172735260000091
2000 Churchill Livingstone,Inc；Baltzer,L.,Berkery,R.(eds.):Oncology Pocket Guide to Chemotherapy,2nd ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer,D.S.,Knobf,M.F.,Durivage,H.J.(eds):The CancerChemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1993)中有公开。联合化疗是以一种以上的试剂给药来治疗癌症。一个例子是结合GPC1的抗体与放射性或化学化合物组合使用来给药。在一个实例中，化疗剂是生物制剂，例如治疗性抗体(例如治疗性单克隆抗体)，例如本文提供的抗GPC1抗体，以及其他抗癌抗体，例如抗PD1或抗-PDL1(例如，pembrolizumab和nivolumab)、抗EGFR(例如，西妥昔单抗)或抗VEGF(例如，贝伐单抗)。
嵌合抗原受体(CAR)：一种嵌合分子，包括抗原结合部分(例如单链抗体或单域抗体)和信号传导结构域，例如来自T细胞受体的信号传导结构域(例如CD3ξ)。典型地，CAR由抗原结合部分、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞内结构域通常包括具有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导链，例如CD3ξ或Fc RI。在一些情况下，该胞内结构域进一步包括至少一个额外共刺激结构域的细胞内部分，例如CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、OX40(CD134)、CD27和/或DAP10。在一些实例中，该CAR是多特异性(如双特异性)或双顺反子的(bicistronic)。多特异性CAR是由至少两个抗原结合结构域(例如单链抗体和/或单域抗体)组成的单个CAR分子，该至少两个抗原结合结构域每个结合不同的抗原或相同抗原上的不同表位(例如，参见US 2018/0230225)。例如，双特异性CAR是指具有两个抗原结合结构域的单个CAR分子，每个抗原结合结构域结合不同的抗原。双顺反子CAR是指两个完整的CAR分子，每个分子包含结合不同抗原的抗原结合部分。在某些情况下，双顺反子CAR构建体表达两个完整的CAR分子，这些分子通过可切割接头连接。表达双特异性或双顺反子CAR的T细胞或NK细胞可结合表达这二种抗原(结合部分所针对的)的细胞(参见，例如，Qin等，Blood130:810,2017；和WO/2018/213337)。
结肠直肠癌：一种发生在结肠或直肠的癌症。最常见的结直肠癌类型是结直肠腺癌，约占所有结直肠癌的95％。腺癌在结肠和/或直肠内壁的细胞中发展。其他类型的结直肠癌包括胃肠道类癌肿瘤(gastrointestinal carcinoid tumor)、转移性结直肠癌、原发性结直肠淋巴瘤(一类非霍奇金淋巴瘤)、胃肠道间质瘤(归类为肉瘤，起源于Cajal的***)、平滑肌肉瘤(起源于平滑肌细胞)和结直肠黑色素瘤。
互补决定区(CDR)：定义抗体结合亲和力和特异性的高变氨基酸序列区域。哺乳动物免疫球蛋白的轻链和重链各有三个CDR，分别命名为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。单域抗体包含三个CDR，在本文中称为CDR1、CDR2和CDR3。
偶联物：在本公开的上下文中，“偶联物”是与效应分子或第二蛋白质(例如第二抗体)共价连接的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。该效应分子可例如为药物、毒素、治疗剂、可检测标签、蛋白质、核酸、脂质、纳米颗粒、光子吸收剂、碳水化合物或重组病毒。抗体偶联物通常被称为“免疫偶联物”。当偶联物包含与药物(例如细胞毒性剂)连接的抗体时，该偶联物通常被称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”。其他抗体偶联物包括例如多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体和嵌合抗原受体(CAR)。
保守变体：含有保守氨基酸替换(amino acid substitution)的蛋白质，该保守氨基酸替换基本上不影响或降低蛋白质的亲和力，例如抗体对GPC1的亲和力。例如，特异性结合GPC1的单克隆抗体可包括至多约1个、至多约2个、至多约5个、至多约10个、或至多约15个保守替换并且特异性结合GPC1多肽。术语“保守变体”还包括使用替换的氨基酸代替未替换的亲本氨基酸，前提是抗体特异性结合GPC1。非保守替换是那些降低活性或与GPC1结合的替换。
提供功能相似的氨基酸的保守氨基酸替换表是本领域普通技术人员众所周知的。以下六组是被认为是彼此保守替换的氨基酸的例子：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
接触：安置为直接物理关联；包括固体和液体两种形式。
细胞毒剂：杀细胞的任何药物或化合物。
细胞毒性：相对于对生物体其余部分的细胞，分子(例如免疫毒素)对旨在靶向的细胞的毒性。相比之下，术语“毒性”指免疫毒素对免疫毒素靶向部分旨在靶向的那些细胞以外的细胞的毒性，而术语“动物毒性”指通过免疫毒素对免疫毒素旨在靶向的那些细胞以外的细胞的毒性产生的免疫毒素对动物的毒性。
诊断：确定病理状况的存在或性质，例如GPC1阳性癌症。诊断方法的灵敏度和特异性不同。诊断测定的“灵敏度”是检测呈阳性的患病个体百分比(真阳性的百分比)。诊断检测的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率被定义为那些没有疾病但检测呈阳性的人的比例。虽然特定的诊断方法可能无法提供对病症的明确诊断，但如果该方法提供有助于诊断的阳性指示就足够了。“预后”是病理状况(例如间皮瘤)的发展(例如严重程度)的可能性。
诊断性肿瘤成像：将抗体及其衍生物与用于正电子发射断层扫描(PET)的正电子发射放射性核素偶联是一个通常称为免疫PET(immunoPET)的过程。虽然全长抗体可用作免疫PET试剂，但它们的生物半衰期可能需要在成像前等待几天，从而导致非靶辐射剂量的增加。较小的单域抗体具有适合当天成像的生物半衰期。
药物：用于治疗、改善或预防受试者的疾病或状况的任何化合物。在本文的一些实施方案中，该药物是抗癌剂，例如细胞毒性剂，例如抗有丝***剂或抗微管剂。
效应分子：嵌合分子中旨在对嵌合分子所靶向的细胞产生期望作用的部分。效应分子也称为效应部分(EM)、治疗剂、诊断剂或类似术语。治疗剂(或药物)包括诸如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、光子吸收剂、脂质、碳水化合物或重组病毒之类的化合物。核酸治疗和诊断部分包括反义核酸、用于与单链或双链DNA共价交联的衍生寡核苷酸以及三链形成寡核苷酸。或者，与靶向部分例如抗GPC1抗体连接的分子可以是封装***，例如包含治疗组合物例如药物、核酸(例如反义核酸)的脂质体或胶束，或另一可避免直接暴露于循环***的治疗部分。制备附着于抗体或其他治疗剂的脂质体的方法是已知的(参见，例如，美国专利No.4,957,735；和Connor et al.,Pharm Ther 28:341-365,1985)。诊断试剂或部分包括放射性同位素和其他可检测标签。可用于该目的的可检测标签包括放射性同位素，例如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I、荧光团、化学发光剂和酶。
子宫内膜癌：一种在子宫内膜(子宫内壁组织)中形成的癌症。大多数子宫内膜癌是腺癌，其起源于子宫内膜的上皮细胞。
表位：抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性(引发特定免疫反应)的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽(例如GPC1)上的特定抗原表位。
框架区：介于CDR之间的氨基酸序列。免疫球蛋白分子的框架区包括可变轻和可变重框架区。
融合蛋白：包含两种不同(异源)蛋白质的至少一部分的蛋白质。
神经胶质瘤：一种大脑和脊髓的癌症，起源于神经胶质细胞，它们是围绕和支持神经细胞的细胞。神经胶质瘤根据产生肿瘤的神经胶质细胞的类型进行分类。胶质瘤的类型包括星形细胞瘤(包括胶质母细胞瘤)、室管膜瘤和少突胶质细胞瘤，分别起源于星形胶质细胞、室管膜细胞和少突胶质细胞。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(Glypican-1，GPC1)：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的六成员磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员，通过GPI锚附着到细胞表面(Filmus et al.,GenomeBiol 9:224,2008)。研究报道GPC1在某些类型的癌症中过度表达，例如胰腺癌(Kleeff etal.,J Clin Invest 102:1662-1673,1998)，例如胰腺导管腺癌(Frampton et al.,Oncotarget 9:19006-19013,2018；Kayed et al.,Int J Oncol 29:1139-1148,2006),神经胶质瘤(Su et al.,Am J Pathol 168:2014-2026,2006),乳腺癌(Matsuda et al.,Cancer Res 61:5562-5569,2001),卵巢癌(Davies et al.,Clin Cancer Res 10:5178-5186,2004),和结直肠癌(Li et al.,Oncotarget 8:101189-101202,2017)。GPC1基因组、mRNA和蛋白质序列是公开可获得的(例如，参见NCBI Gene ID 2817)。
GPC1阳性癌症：表达或过表达GPC1的癌症。GPC1阳性癌症的实例包括但不限于胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和乳腺癌。
头颈癌：在鳞状细胞中形成的癌症，鳞状细胞排列在头颈部内的粘膜表面，例如口腔、鼻和喉内。头颈癌通常被称为头颈鳞状细胞癌。
异源的：源自不同的遗传来源或物种。
免疫反应：免疫***的细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的反应。在一个实施方案中，该反应对特定抗原具有特异性(“抗原特异性反应”)。在一个实施方案中，免疫反应是T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方案中，该反应是B细胞反应，并导致产生特异性抗体。
免疫偶联物：效应分子与抗体或其功能片段的共价连接。效应分子可例如为可检测标签、光子吸收剂(例如IR700)或毒素(以形成免疫毒素，例如包含假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或其变体的免疫毒素)。毒素的具体非限制性实例包括但不限于相思子毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE，例如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或其修饰的毒素，或其他直接或间接抑制细胞生长或杀细胞的毒性剂。例如，PE和DT是剧毒化合物，通常通过肝毒性导致死亡。然而，PE和DT可以通过去除毒素的天然靶向成分(例如PE的结构域Ia和DT的B链)并用不同的靶向部分如抗体替换它来修饰成用作免疫毒素的形式。在一个实施方案中，抗体与效应分子连接。在另一个实施方案中，与效应分子连接的抗体进一步与脂质或其他分子连接，例如以增加其在体内的半衰期。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗体部分和效应分子之间的反应产生了在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽接头(短肽序列)可以任选地包括在抗体和效应分子之间。由于免疫偶联物最初是由两个具有不同功能的分子(例如抗体和效应分子)制备的，因此它们有时也被称为“嵌合分子”。因此，本文所用的术语“嵌合分子”指与效应分子缀合(偶联)的靶向部分，例如配体或抗体。术语“缀合”或“连接”指将两个多肽制成一个连续的多肽分子。
免疫脂质体：一种脂质体，其表面偶联有抗体或抗体片段。免疫脂质体可携带细胞毒性剂或其他药物到抗体靶向细胞，如肿瘤细胞。
链间交联剂：一种能够在两条DNA链之间共价结合，从而阻止DNA复制和/或转录的细胞毒性药物。
分离的：“分离的”生物成分，例如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器，已与该成分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物成分，例如其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器，基本分离或纯化出来。已“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸和蛋白质。
标签：直接或间接与另一种分子(例如抗体或蛋白质)偶联的可检测化合物或组合物，以便于检测该分子。标签的具体的非限制性实例包括荧光标签、酶连接和放射性同位素。在一个实例中，“标记的抗体”是指在抗体中并入另一种分子。例如，标签是可检测的标志物，例如放射性标记的氨基酸的并入或可被标记的亲和素(例如，含有可通过光学或比色方法检测的荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素化部分与多肽的附着。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标签的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核苷酸(例如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I)、荧光标签(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系元素荧光粉)、酶标签(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标志物、生物素化基团、被二级报告分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)或磁性剂(例如钆螯合物)。在一些实施方案中，标签通过各种长度的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻。
接头：在一些情况下，接头是抗体结合片段(例如Fv片段)内的肽，用于将可变重链间接结合到可变轻链。“接头”还可以指用于将靶向部分(例如抗体)连接至效应分子(例如细胞毒素或可检测标签)的肽。术语“偶联(conjugating)”、“连接(joining)”、“结合(bonding)”或“连接(linking)”是指将两个多肽制成一个连续的多肽分子，或将放射性核素或其他分子共价附着至多肽，例如抗体。连接可以通过化学或重组方式进行。“化学方法”是指抗体部分与效应分子之间的反应，使得两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
肝癌：发生在肝组织中的任何类型的癌症。最常见的肝癌类型是肝细胞癌(HCC)，它发生在肝细胞中。其他类型的肝癌包括在胆管中发生的胆管癌；肝血管肉瘤，这是一种罕见的肝癌，起源于肝脏的血管；以及肝母细胞瘤，这是一种非常罕见的肝癌，最常见于儿童。
肺癌：任何在肺部形成的癌症。大多数起源于肺癌的癌症是癌(carcinoma)。肺癌的两种主要类型是小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC的亚类包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，在同一阅读框中。
卵巢癌：在卵巢组织中形成的癌症。大多数卵巢癌是卵巢上皮癌(始于卵巢表面细胞的癌症)或恶性生殖细胞肿瘤(始于***的癌症)。另一种类型的卵巢癌是基质细胞癌，它起源于释放激素并连接卵巢不同结构的细胞。
胰腺癌：一种在胰腺组织中发现恶性细胞的疾病。根据癌症的细胞来源，胰腺肿瘤可以是外分泌肿瘤或神经内分泌肿瘤。绝大多数(～94％)胰腺癌是外分泌肿瘤。外分泌癌包括例如腺癌(最常见的外分泌肿瘤类型)、腺泡细胞癌、导管内***状黏液性肿瘤(IPMN)和黏液性囊腺癌。在一些实例中，胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。胰腺神经内分泌肿瘤，也称为胰岛细胞肿瘤，根据它们产生的激素类型进行分类。示例性神经内分泌肿瘤包括胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤、生长抑素瘤、VIPoma(血管活性肠肽)和无功能性胰岛细胞瘤。
药学上可接受的载体：所使用的药学上可接受的载体是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15thEdition,1975描述了适用于药学上递送本文公开的抗体和其他组合物的组合物和制剂。通常，载体的性质将取决于所采用的特定给药方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射流体，该可注射流体包括药学上和生理上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为载体。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体外，待给药的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨醇酐单月桂酸酯。
光免疫疗法(Photoimmunotherapy)：一种靶向癌症疗法，利用抗原特异性抗体-光吸收剂偶联物，可通过近红外光激活以杀死靶细胞。光子吸收剂通常基于酞菁染料，例如近红外(NIR)酞菁染料(例如，
Figure BDA0003172735260000141
700DX，也称为IR700)。抗体(例如，GPC1特异性抗体)与适当的细胞表面抗原(例如GPC1)结合，光活化染料在近红外光照射后会诱导对细胞膜的致命损伤。近红外光照射(690nm)可在几分钟内诱导高度选择性的坏死癌细胞死亡，而不会损坏相邻细胞(例如，参见美国申请No.2018/0236076)。因此，本文提供的是与IR700缀合的公开的抗体(例如，HM2和D4，或其片段)。
预防、治疗或缓解疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后缓解其体征或症状的治疗干预，例如减少肿瘤负荷或减少转移灶的数量或大小。“缓解”是指疾病(例如癌症)的体征或症状的数量或严重程度的减少。
启动子：指导核酸(例如编码本文提供的抗体或抗体片段的序列)转录的一系列核酸控制序列。启动子包括靠近转录起始位点的必要核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏元件，其可位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。示例性启动子包括组成型和可激活启动子。
纯化的：术语纯化的不需要绝对的纯度；相反，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽制品是其中的肽或蛋白质比肽或蛋白质在其细胞内的自然环境中更富集的制品。在一个实施方案中，纯化制品，使得蛋白质或肽代表制品的总肽或蛋白质含量的至少50％。基本上纯化表示从其它蛋白质或细胞成分中纯化。基本上纯化的蛋白质的纯度至少为60％、70％、80％、90％、95％或98％。因此，在一个特定的非限制性实例中，基本上纯化的蛋白质(例如抗体或抗体片段)90％不含其它蛋白质或细胞成分。
吡咯苯并二氮杂卓(PBD)：最初在链霉菌属(Streptomyces)物种中发现的一类序列选择性DNA小沟结合交联剂。DBs明显比全身化疗药物更有效。PBD的作用机制与其在DNA小沟中形成加合物的能力有关，从而干扰DNA加工。在本公开的上下文中，PBD包括天然产生和分离的PBD、化学合成的天然存在的PBD和化学合成的非天然存在的PBD。PBD还包括单体、二聚体和杂合PBD(有关评论，请参见Med Res Rev 32(2):254-293,2012)。
重组：重组核酸或蛋白质是一种具有非天然存在的序列或具有由两个原本分开的序列片段人工组合而成的序列的核酸或蛋白质。这种人工组合通常通过化学合成或通过人工操作分离的核酸节段来完成，例如通过基因工程技术。
样品(或生物样品)：从受试者获得的包含基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白质或其组合的生物标本。实例包括但不限于外周血、组织、细胞、尿液、唾液、组织活检、细针抽出物、手术标本和尸检材料。在一个实例中，样品包括肿瘤活检。在一个实例中，样品包括细针抽出物。
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性是用序列之间的相似性来表示的，亦称为序列同一性。序列同一性经常用百分比同一性(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，多肽或核酸分子的同源物或变体将具有较高程度的序列同一性。
用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151,1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881,1988；以及Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988.Altschul et al.,Nature Genet.6:119,1994，提出了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403,1990)可从包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网上的多个来源获得，以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。有关如何使用此程序来确定序列同一性的说明可从互联网上的NCBI网站上获得。
特异性结合GPC1多肽的抗体的同源物和变体通常特征在于具有至少约75％，例如至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，该序列同一性是使用NCBIBlast 2.0在与抗体的氨基酸序列的全长比对中计数的，空位blastp设置为缺省参数。为了比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，采用Blast 2序列功能，使用设置为缺省参数(空位存在罚分为11，每个残基空位罚分为1)的默认BLOSUM62矩阵。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用Blast 2序列功能进行比对，采用设置为缺省参数(空位9，延伸空位1罚分)的PAM30矩阵。当通过这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质将显示出增加的百分比同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。当比较少于整个序列的序列同一性时，同源物和变体将通常在10-20个氨基酸的短窗口上具有至少80％的序列同一性，并且取决于它们与参考序列的相似性，可能具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性。在这样的短窗口上确定序列同一性的方法可在互联网上的NCBI网站上获得。本领域技术人员将理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能获得超出所提供范围的非常显著的同源物。
小分子：通常具有小于约1000道尔顿或在一些实施方案中小于约500道尔顿的分子量的分子，该分子能够在一定的可测量程度上调节靶分子的活性。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，该类别包括人类和兽医受试者，包括人和非人哺乳动物。
合成的：在实验室中通过人工方式生产的，例如合成的核酸或蛋白质(例如抗体)可以在实验室中化学合成。
治疗有效量：足以在接受处理的对象中实现期望效果的特定物质的量。例如，这可以是抑制或遏制肿瘤生长所需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是消除、减小肿瘤大小或预防肿瘤转移所需的量，例如与处理前的大小/体积/数量相比，例如将肿瘤大小和/或体积减小至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至100％，和/或将转移的数量和/或大小/体积减少至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至100％。当给药于受试者时，通常使用的剂量将达到已显示达到期望体外效果的靶组织浓度(例如，在肿瘤中)。
甲状腺癌：一类在甲状腺组织中形成的癌症。甲状腺癌根据组织病理学特征分类，包括甲状腺***状癌、滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌、低分化甲状腺癌、未分化甲状腺癌、甲状腺淋巴瘤、鳞状细胞甲状腺癌和甲状腺肉瘤。
毒素：对细胞具有细胞毒性的分子。毒素包括相思子毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、皂草素、限制毒素(restrictocin)或白树毒素(gelonin)，或其修饰毒素。例如，PE和DT是剧毒化合物，通常通过肝毒性导致死亡。然而，PE和DT可以通过去除毒素的天然靶向成分(例如PE的结构域Ia或DT的B链)并用不同的靶向部分如抗体替换它来修饰成用作免疫毒素的形式。
载体：被引入宿主细胞中的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或更多个选择性标记基因和本领域已知的其它遗传元件。在一些实施方案中，该载体为病毒载体，例如慢病毒载体或AAV载体。
III.特异于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)的单克隆抗体
本文描述了两种以高亲和力结合GPC1的单克隆抗体。一种单克隆抗体是小鼠抗体(HM2)，另一种是单域(VHH)骆驼抗体(D4)。本文公开了抗体D4特异性结合人和小鼠GPC1，并且两种抗体均以高亲和力结合人GPC1。由所公开的抗体组成的嵌合抗原受体(CAR)T细胞能够在体外和体内有效地杀死GPC1阳性肿瘤细胞。HM2和D4的核苷酸和氨基酸序列提供如下。表1A、1B和2列出了每种抗体的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸位置，如使用Kabat、IMGT或Paratome或所有三者的组合确定的。本领域技术人员可以使用替代编号方案如Chothia编号方案容易地确定CDR边界。
HM2 VH DNA(SEQ ID NO:1)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCTCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTCGTAGCTCCGTAGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
HM2 VH蛋白(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0003172735260000171
(下划线＝Kabat CDRs；粗体＝IMGT CDRs；斜体＝Paratome CDRs)
HM2 VL DNA(SEQ ID NO:3)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACTTATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGAACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATAAAA
HM2 VL蛋白(SEQ ID NO:4)
Figure BDA0003172735260000172
(下划线＝Kabat CDRs；粗体＝IMGT CDRs；斜体＝Paratome CDRs)
表1A.CDR在HM2 VH结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的位置
编号方案 CDR1 CDR2 CDR3
Kabat 31-35 50-66 99-103
IMGT 26-33 51-58 97-103
Paratome 27-35 47-61 97-103
组合的 26-35 47-66 97-103
表1B.CDR在HM2 VL结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:4)中的位置
编号方案 CDR1 CDR2 CDR3
Kabat 24-39 55-61 94-102
IMGT 27-37 55-57 94-101
Paratome 28-39 51-61 94-102
组合的 24-39 51-61 94-102
D4 DNA(SEQ ID NO:5)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCCGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATACAGCTACAGTATTGGTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGAAAGGAGCGCGCGTGGGTCGCGTCTCGATATACTGGTGACGGTGGCGCAGTCTTTGACGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCCAAGAGAGTGCCGGGAACACGTTCGATTTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTATTGCGCAGCGAAAGGGCCCGGTTTCGGGCGGTGGGAGTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
D4蛋白(SEQ ID NO:6)
Figure BDA0003172735260000181
(下划线＝Kabat CDRs；粗体＝IMGT CDRs；斜体＝Paratome CDRs)
表2.CDR在D4氨基酸序列(SEQ ID NO:6)中的位置
编号方案 CDR1 CDR2 CDR3
Kabat 31-35 50-66 99-109
IMGT 26-33 51-58 97-108
Paratome 27-33 47-61 97-108
组合的 26-35 47-66 97-108
本文提供结合(例如，特异性结合)GPC1，例如细胞表面或可溶GPC1的单克隆抗体。在一些实例中，GPC1单克隆抗体具有10nM或更小的Kd，例如0.1nM至10nM。在一些实施方案中，该GPC1是人GPC1、小鼠GPC1或人和小鼠GPC1。在一些实施方案中，该单克隆抗体包括可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域。在一些实例中，该单克隆抗体包括本文作为SEQ IDNO:2和/或SEQ ID NO:4列出的氨基酸序列的至少一部分，例如来自SEQ ID NO:2和/或SEQID NO:4的一个或更多个(例如所有三个)CDR序列，如通过任何编号方案确定的，例如IMGT、Kabat、Paratome或Chothia，或其任何组合。在其他实施方案中，单克隆抗体是单域抗体。在一些实例中，单克隆抗体包括本文中作为SEQ ID NO:6列出的氨基酸序列的至少一部分，例如来自SEQ ID NO:6的一个或更多个(例如所有三个)CDR序列，如通过任何编号方案确定的，例如IMGT、Kabat、Paratome或Chothia，或其任何组合。
在一些实施方案中，单克隆抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:2的CDR1、CDR2和CDR3序列和/或单克隆抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:4的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实例中，使用IMGT、Kabat、Paratome或Chothia编号方案或其组合确定CDR序列。在特定实例中，CDR序列是使用Kabat、IMGT和Paratome的组合确定的。
在一些实施方案中，单克隆抗体的VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3序列包含SEQ IDNO：2的残基31-35、50-66和99-103；SEQ ID NO:2的第26-33、51-58和97-103位残基；SEQ IDNO:2的第27-35、47-61和97-103位残基；或SEQ ID NO:2的残基26-35、47-66和97-103。在一些实施方案中，单克隆抗体的VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3序列包含SEQ ID NO:4的残基24-39、55-61和94-102；SEQ ID NO:4的残基27-37、55-57和94-101；或SEQ ID NO:4的残基28-39、51-61和94-102。
在一些实例中，单克隆抗体的VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性和/或单克隆抗体的VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:4有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在特定的非限制性实例中，单克隆抗体的VH结构域的序列包含或由SEQ ID NO：2组成，和/或单克隆抗体的VL结构域的序列包含或由SEQ ID NO：4组成。
在一些实施方案中，单克隆抗体包含选自Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链可变片段(scFv)和二硫键稳定的可变片段(dsFv)的抗原结合片段。
在一些实施方案中，单克隆抗体是IgG，例如IgG1。
在一些实施方案中，单克隆抗体是小鼠抗体。在其他实施方案中，单克隆抗体是人源化抗体。在其他实施方案中，单克隆抗体是嵌合抗体。
在一些实施方案中，单域单克隆抗体包含SEQ ID NO：6的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施例中，使用IMGT、Kabat、Paratome或Chothia编号方案或其组合确定CDR序列。在特定实例中，CDR序列是使用Kabat、IMGT和Paratome的组合确定的。
在一些实施方案中，单域单克隆抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列包含SEQ ID NO:6的残基31-35、50-66和99-109；SEQ ID NO:6的残基26-33、51-58和97-108；SEQ ID NO:6的残基27-33、47-61和97-108；或SEQ ID NO:6的残基26-35、47-66和97-108。在一些实例中，单克隆抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:6有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在特定的非限制性实例中，单克隆抗体的序列包含由SEQ ID NO:6组成。
在一些实施方案中，单克隆抗体是骆驼抗体。在其他实施方案中，单克隆抗体是人源化抗体。在其他实施方案中，单克隆抗体是嵌合抗体。
本文还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包括本文公开的单克隆抗体(例如单域抗体或scFv)。在一些实施方案中，该CAR进一步包括铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导部分、信号传导结构域或其任何组合。在具体的非限制性实例中，铰链区包含CD8α铰链区，跨膜结构域包含CD8α跨膜域，共刺激信号传导部分包含4-1BB信号传导部分和/或信号传导结构域包含CD3ξ信号传导结构域。
本文还提供了经过修饰以使其能够与通用CAR***一起使用的GPC1特异性单克隆抗体。在一些实施方案中，该GPC1特异性单克隆抗体与特异性结合对的一个组分融合。在一些实例中，该单克隆抗体与亮氨酸拉链或生物素融合。
进一步提供了表达GPC1特异性CAR的细胞。在一些实例中，该细胞是T淋巴细胞，例如CTL。CAR和表达CAR的T细胞在部分IV中进一步描述。
本文还提供了包括本文公开的单克隆抗体和效应分子的免疫偶联物。在一些情况下，免疫偶联物包括抗体二聚体(例如两个D4 VHH)。在一些实施方案中，效应分子是毒素，例如但不限于假单胞菌外毒素或其变体，例如PE38或PE-LR。在一些实例中，PE是具有SEQID NO:15的残基121-363的氨基酸序列的PE-LR。在具体的非限制性实施方案中，免疫偶联物的氨基酸序列与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在具体实例中，免疫毒素的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21组成。在其他实施例中，效应分子是可检测标签，例如但不限于荧光团、酶或放射性同位素。在其他实施例中，效应分子是光子吸收剂，例如IR700。包含光子吸收剂的免疫偶联物可用于光免疫疗法。免疫偶联物在部分V中进一步描述。
本文进一步提供了抗体-药物偶联物(ADC)，其包括与本文公开的单克隆抗体偶联的药物。在一些实施方案中，该药物是小分子，例如抗微管剂、抗有丝***剂和/或细胞毒性剂。ADC将在部分VI中进一步描述。
本文还提供了多特异性抗体，其包括本文公开的单克隆抗体和至少一种额外的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该多特异性抗体是双特异性抗体。在其他实施方案中，该多特异性抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，该至少一种额外的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合T细胞受体或自然杀伤(NK)细胞活化受体的组分。多特异性抗体在部分VII中进一步描述。
本文进一步提供了抗体-纳米颗粒偶联物，其包括与本文公开的单克隆抗体偶联的纳米颗粒。在一些实施方案中，该纳米颗粒包括聚合物纳米颗粒、纳米球、纳米胶囊、脂质体、树枝状聚合物、聚合物胶束或类脂质体(niosome)。在一些实施方案中，纳米颗粒包括细胞毒性剂。抗体-纳米颗粒偶联物在部分VIII中进一步描述。
本文还提供了融合蛋白，其包括本文公开的单克隆抗体和异源蛋白或肽。在一些实施方案中，该异源蛋白质是Fc蛋白。在一些实例中，该Fc蛋白是小鼠Fc或人Fc蛋白。
还提供了编码本文公开的单克隆抗体的核酸分子。在一些实施方案中，该核酸分子与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实例中，该核酸分子包括或由核苷酸序列SEQ ID NO:1或其简并变体组成；包括或由SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其简并变体组成；包括或由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其简并变体组成；或包括或由SEQ ID NO：5的核苷酸序列或其简并变体组成。进一步提供了编码本文公开的CAR、免疫偶联物、多特异性抗体或融合蛋白的核酸分子。在一些实例中，该免疫偶联物包含PE-LR，并且编码LR的核酸序列包含SEQ ID NO:14的核苷酸361-1089。在具体实例中，核酸分子编码免疫毒素并且该免疫毒素的核酸序列与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在具体实例中，该免疫毒素的核酸序列包含或由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20或其简并变体组成。在一些实施方案中，该核酸分子与启动子可操作地连接。本文进一步提供了包括该核酸分子的载体。
本文进一步提供了表达CAR和截短的人EGFR(huEGFRt)的核酸构建体。在一些实施方案中，该核酸以5'到3'方向包含：编码第一粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)的核酸；编码本文公开的GPC1特异性单克隆抗体的核酸；编码细胞外铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码细胞内共刺激结构域的核酸；编码细胞内信号传导结构域的核酸；编码自切割2A肽的核酸；编码第二GMCSFRss的核酸；以及编码截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸。在一些实例中，该核酸在编码第一GMCSFRss的核酸的5'端进一步包括人延伸因子1α(EF1α)启动子序列。在一些实例中，铰链区包括CD8α铰链区。在一些实例中，跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域。在一些实例中，共刺激信号传导部分包括4-1BB信号传导部分。在一些示例中，信号传导结构域包括CD3ξ信号传导结构域。在一些实例中，GPC1特异性单克隆抗体的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。在其他实例中，GPC1特异性单克隆抗体的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6。还提供了包含该核酸构建体的载体。在一些实施方案中，该载体是慢病毒载体。
还提供了共表达本文公开的GPC1特异性CAR和huEGFRt的分离的细胞。在一些实例中，该细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
本公开进一步提供了组合物，其包含药学上可接受的载体和本文公开的单克隆抗体、CAR、分离的细胞(例如表达CAR的细胞，例如CAR T细胞或CAR NK细胞)、免疫偶联物、ADC、多特异性抗体、抗体-纳米颗粒偶联物或融合蛋白。组合物及其用途在部分IX中进一步描述。
IV.嵌合抗原受体(CAR)
所公开的单克隆抗体还可用于生产CAR(也称为嵌合T细胞受体、人工T细胞受体或嵌合免疫受体)和/或经工程改造以表达CAR的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或自然杀伤(NK)细胞。通常，CAR包括结合部分、细胞外铰链和间隔元件、跨膜区和执行信号传导功能的胞内结构域(Cartellieri et al.,J Biomed Biotechnol 2010:956304,2010；Dai et al.,JNatlCancer Inst 108(7):djv439,2016)。在许多情况下，结合部分是单克隆抗体的抗原结合片段，如scFv或单域抗体。间隔区/铰链区通常包括来自IgG亚类的序列，例如IgG1、IgG4、IgD和CD8结构域。跨膜结构域可以来源于多种不同的T细胞蛋白，例如CD3ξ、CD4、CD8或CD28。几种不同的胞内结构域已被用于生成CAR。例如，胞内结构域可以由具有ITAM的信号传导链组成，例如CD3ξ或FcεRIγ。在一些情况下，胞内结构域还包括至少一个额外的共刺激结构域的细胞内部分，例如CD28、4-1BB(CD137、TNFRSF9)、OX-40(CD134)、ICOS、CD27和/或DAP10。
表达CAR的CTL、NK细胞(或其他免疫细胞)可用于靶向特定细胞类型，例如GPC1阳性肿瘤细胞。因此，本文公开的单克隆抗体可用于工程化表达包含GPC1特异性单克隆抗体的CAR的CTL或NK细胞，从而将工程化的CTL或NK细胞靶向表达GPC1的肿瘤细胞。工程化T细胞先前已用于某些类型癌症的过继疗法(参见，例如，Park et al.,Mol Ther 15(4):825-833,2007)。使用表达CAR的T细胞比标准的基于CTL的免疫疗法更普遍，因为表达CAR的CTL不受HLA限制，因此可用于任何患有表达靶抗原的肿瘤的患者。
本公开还考虑了多特异性(例如双特异性)或双顺反子CAR。在一些实施方案中，该多特异性或双特异性CAR包括特异于GPC1的单克隆抗体(例如HM2或D4)(或其抗原结合片段)和特异于不同抗原例如T细胞抗原的单克隆抗体。类似地，双顺反子CAR包括从同一构建体表达的两个CAR分子，其中一个CAR分子是GPC1靶向的CAR，第二个CAR靶向第二个抗原。参见，例如，Qin et al.,Blood 130:810,2017；和WO/2018/213337。
因此，本文提供包括GPC1特异性抗体例如单域抗体或scFv的CAR。还提供了编码CAR(包括双特异性和双顺反子CAR)的分离的核酸分子和载体，以及表达CAR、双特异性CAR或双顺反子CAR的宿主细胞，例如CTL或NK细胞。表达由GPC1特异性单克隆抗体组成的CAR的CTL或NK细胞可用于治疗表达GPC1的癌症。在本文的一些实施方案中，该CAR是双特异性CAR。在本文的其他实施方案中，该CAR是双顺反子CAR。
在一些实施方案中，该CAR包括信号肽序列，例如，在抗原结合结构域的N末端。该信号肽序列可以是任何合适的信号肽序列，例如来自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GMCSFR)、免疫球蛋白轻链κ或IL-2的信号序列。虽然信号肽序列可以促进CAR在细胞表面上的表达，但信号肽序列在表达的CAR中的存在对于CAR发挥功能并不是必需的。在细胞表面表达CAR后，信号肽序列可从CAR上切下。因此，在一些实施方案中，该CAR缺乏信号肽序列。
在一些实施方案中，本文公开的CAR从也表达截短形式的人EGFR(huEGFRt)的构建体(例如来自慢病毒载体)表达。CAR和huEGFRt被自切割肽序列(例如T2A)隔开，因此在转导的细胞中表达后，CAR从huEGFRt上切割下来。
在本文公开的一些实施方案中，该CAR构建体在N-末端到C-末端的方向上编码以下氨基酸序列：
GMCSFRss:MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:7)
NdeI:HM
抗原结合:a GPC1-特异性抗体(例如HM2或D4)
SpeI:TS
CD8α铰链:TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:8)
CD8αTM:IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:9)
4-1BB:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:10)
CD3ζ:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:11)
T2A:EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:12)
GMCSFRss:MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:7)
huEGFRt:
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM(SEQ ID NO:13)
人表皮生长因子受体由四个胞外结构域、跨膜结构域和三个胞内结构域组成。EGFR结构域按以下N端到C端的顺序发现：结构域I–结构域II–结构域III–结构域IV–跨膜(TM)结构域–近膜结构域–酪氨酸激酶结构域–C末端尾部。结构域I结构和域III是参与配体结合的富含亮氨酸结构域。结构域II和结构域IV是富含半胱氨酸的结构域，不与EGFR配体接触。结构域II介导形成同二聚体或与来自其他EGFR家族成员的类似结构域形成异源二聚体，结构域IV可以与结构域II形成二硫键。EGFR TM结构域单次穿过细胞膜并可能在蛋白二聚化中起作用。胞内结构域包括近膜结构域、酪氨酸激酶结构域和C末端尾部，它们介导EGFR信号转导(Wee and Wang,Cancers 9(52),doi:10.3390/cancers9050052；Ferguson,Annu Rev Biophys 37:353-373,2008；Wang et al.,Blood 118(5):1255-1263,2011)。
人EGFR的截短形式，本文称为“huEGFRt”仅包括结构域III、结构域IV和TM结构域。因此，huEGFRt缺乏结构域I、结构域II和所有三个胞内结构域。huEGFRt不能结合EGF并且缺乏信号活性。然而，该分子保留结合特定EGFR特异性单克隆抗体的能力，例如FDA批准的西妥昔单抗(PCT公开No.WO 2011/056894，通过引用将其并入本文)。
用编码huEGFRt和本文公开的肿瘤抗原特异性CAR的构建体(例如慢病毒载体)转导T细胞(或NK细胞)允许使用标记的EGFR单克隆抗体西妥昔单抗(ERBITUXTM)选择经转导的T细胞。例如，西妥昔单抗可以用生物素标记，并且可以使用抗生物素磁珠选择经转导的T细胞，这些磁珠是可商购的(例如来自Miltenyi Biotec)。共表达huEGFRt还允许在体内追踪过继转移的表达CAR的T细胞(或NK细胞)。此外，西妥昔单抗与表达huEGFRt的T细胞的结合会诱导ADCC效应细胞的细胞毒性，从而提供一种在体内消除经转导T细胞的机制(Wang etal.,Blood 118(5):1255-1263,2011)，例如在治疗完成时。
本文还提供了经过修饰以使其能够与通用CAR***一起使用的GPC1特异性单克隆抗体。通用CAR***的开发是为了增加CAR的灵活性并将其应用扩展到其他抗原。目前，对于每位接受CAR T细胞治疗的患者，必须培养、扩增和修饰自体T细胞以表达抗原特异性CAR。这个过程既漫长又昂贵，限制了它的使用。通用CAR基于一个***，其中CAR的信号传导成分与分子的抗原结合部分分离，但使用“锁钥匙”***带到一起。例如，生物素结合免疫受体(BBIR)CAR由融合到包含亲和素的胞外域的胞内T细胞信号传导结构域组成。生物素化的抗原特异性(例如GPC1特异性)单克隆抗体然后可以结合BBIR，将T细胞引导至表达肿瘤抗原的细胞。另一个例子是拆分、通用和可编程(SUPRA)CAR***。在SUPRA***中，CAR包括与胞外亮氨酸拉链融合的胞内信号传导结构域，它与与同源(cognate)亮氨酸拉链融合的抗原特异性单克隆抗体配对。有关通用CAR***的综述，请参见，例如，Zhao et al.,J HematolOncol 11(1):132,2018；and Cho et al.,Cell 173:1426-1438,2018。在本文的一些实施方案中，GPC1特异性单克隆抗体与特异性结合对的一个组分融合。在一些实例中，单克隆抗体与亮氨酸拉链或生物素融合。
另一种类型的通用CAR可以使用分选酶(sortase enzyme)生成。分选酶是一种原核酶，它通过识别和切割羧基末端分选信号来修饰表面蛋白。分选酶催化分选酶识别基序和分选酶受体基序之间的转肽作用。因此，抗原特异性CAR可以通过将融合到分选酶识别基序的抗原特异性抗体与包括胞内信号传导结构域、跨膜区和包含分选酶受体基序的胞外部分的CAR分子的一部分接触来产生。在分选酶存在下，这两种成分共价连接以形成完整的抗原特异性CAR。因此，在本文的一些实施方案中，GPC1特异性单克隆抗体被修饰以包括分选酶识别基序(参见例如PCT公开No.WO 2016/014553)。
V.免疫偶联物
所公开的单克隆抗体可以偶联至治疗剂或效应分子。免疫偶联物包括但不限于其中治疗剂与抗体共价连接的分子。治疗剂是具有针对特定靶分子或带有靶分子的细胞的特定生物活性的药剂。本领域技术人员会理解，治疗剂可以包括各种药物，例如长春碱、道诺霉素等，细胞毒素，例如天然或修饰的假单胞菌外毒素或白喉毒素，含有药理成分的包封剂(例如脂质体)、放射性试剂例如125I、32P、14C、3H和35S，光子吸收剂，例如IR700，以及其他标签、靶部分和配体。
特定治疗剂的选择取决于特定的靶分子或细胞，以及所期望的生物效应。因此，例如，治疗剂可以是用于导致特定靶细胞(例如肿瘤细胞)死亡的细胞毒素。相反，当需要引起非致死性生物反应(例如用于检测)时，治疗剂可以与非致死性药理剂或含有非致死性药理剂的脂质体偶联。
使用本文所描述的治疗剂和抗体，技术人员可以容易地构建多种含有功能上等效的核酸的克隆，例如序列不同但编码相同效应部分或抗体序列的核酸。因此，本公开提供了编码抗体和偶联物及其融合蛋白的核酸。
效应分子可以使用多种方式与感兴趣的抗体连接。可以使用共价和非共价连接方式。将效应分子连接到抗体的程序根据效应子的化学结构而变化。多肽通常含有多种官能团；例如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，它们可用于与抗体上的合适官能团反应以导致效应分子的结合。或者，衍生抗体以暴露或连接额外的反应性官能团。衍生化可能涉及许多已知接头分子中的任何一种的连接。接头可以是用于将抗体连接到效应分子的任何分子。接头能够与抗体和效应分子形成共价键。合适的接头是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体和效应分子是多肽时，接头可以通过它们的侧基(例如通过与半胱氨酸的二硫键连接)连接到组成氨基酸上或与末端氨基酸的α碳氨基和羧基连接。
在一些情况下，当免疫偶联物到达其靶位点时，期望从抗体释放效应分子。因此，在这些情况下，免疫偶联物将包含在靶位点附近可切割的连接。可通过酶活性或免疫偶联物在靶细胞内或靶位点附近经受的条件促进接头的裂解以从抗体释放效应分子。
鉴于已报道的将各种放射诊断化合物、放射治疗化合物、标签(例如酶或荧光分子)、药物、毒素和其他试剂连接到抗体的大量方法，本领域技术人员将能够确定将给定试剂连接到抗体或其他多肽的合适方法。
本文公开的抗体可以衍生化或连接至另一分子(例如另一肽或蛋白质)。通常，抗体或其部分被衍生化，而与靶抗原的结合不会受到衍生化或标记的不利影响。例如，抗体可以功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)至一个或多个其他分子实体，例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、检测剂、光子吸收剂、药剂和/或可以介导抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白或肽。
一种类型的衍生抗体是通过交联两种或更多种抗体(相同类型或不同类型，例如产生双特异性抗体)而产生的。合适的交联剂包括异双功能交联剂，其具有由合适的间隔基(例如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)隔开的两个有区别的反应性基团，或同双功能交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这些接头是可商购的。
抗体可以与可检测标记物偶联；例如，能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(例如计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层扫描(CAT)扫描、磁共振成像(MRI)、核磁共振成像NMRI)、磁共振断层扫描(MTR)、超声、光纤检查和腹腔镜检查)检测的可检测标记物。可检测标记物的具体、非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促键(enzymatic linkage)、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。还可以使用生物发光标记物，例如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体或抗原结合片段也可以与用于检测的酶偶联，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶结合时，可以通过添加额外的试剂进行检测，该酶使用这些试剂产生可识别的反应产物。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺会产生有色反应产物，该产物可目视检测。抗体或抗原结合片段也可以与生物素偶联，并通过亲和素或链霉亲和素结合的间接测量来检测。应当注意的是，亲和素本身可以与酶或荧光标签偶联。
抗体可以用磁性剂标记，例如钆。抗体也可以用镧系元素(如铕和镝)和锰标记。顺磁性颗粒如超顺磁性氧化铁也可用作标签。抗体也可以用二级报告子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)标记。在一些实施方案中，标签通过不同长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻。
抗体也可以用放射性标记的氨基酸进行标记。放射性标签可用于诊断和治疗目的。例如，放射性标签可用于通过X射线、发射光谱或其他诊断技术检测靶抗原的表达。多肽标签的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
本文公开的抗体还可以与光子吸收剂偶联。在一些实施方案中，光子吸收剂是酞菁染料，例如但不限于
Figure BDA0003172735260000261
700DX(也称为“IR700”)。抗体-光吸收剂偶联物可用于光免疫疗法。
抗体也可以用化学基团如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团衍生。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期或增加组织结合。
毒素可与本文描述的单克隆抗体一起使用以产生免疫毒素。示例性毒素包括蓖麻毒素、相思子毒素、白喉毒素及其亚单位，以及肉毒杆菌毒素A至F。这些毒素可容易地从商业来源(例如，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)获得。所考虑的毒素还包括本文描述毒素的变体(参见，例如，美国专利Nos.5,079,163和4,689,401)。在一个实施方案中，毒素是假单胞菌外毒素(PE)(美国专利No.5,602,095)。如本文所用，“假单胞菌外毒素”指全长天然(天然存在的)PE或经修饰的PE。此类修饰可包括但不限于结构域Ia的去除、结构域Ib、II和III中的各种氨基酸缺失、单个氨基酸替换以及在羧基末端添加一个或更多个序列(例如，参见Siegall et al.,J.Biol.Chem.264:14256-14261,1989)。
与本文所描述的单克隆抗体一起使用的PE可包括天然序列、天然序列的细胞毒性片段和天然PE的保守修饰变体及其细胞毒性片段。PE的细胞毒性片段包括在靶细胞中经过或不经过蛋白水解或其他加工后具有细胞毒性的片段。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38和PE35。对于PE及其变体的其他描述，参见例如美国专利Nos.4,892,827；5,512,658；5,602,095；5,608,039；5,821,238；and 5,854,044；美国专利申请公开No.2015/0099707；PCT公开Nos.WO 99/51643和WO 2014/052064；Pai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3358-3362,1991；Kondo et al.,J.Biol.Chem.263:9470-9475,1988；Pastan et al.,Biochim.Biophys.Acta 1333:C1-C6,1997。
本文还考虑了蛋白酶抗性PE变体和免疫原性降低的PE变体，例如但不限于PE-LR、PE-6X、PE-8X、PE-LR/6X和PE-LR/8X(参见，例如，Weldon et al.,Blood 113(16):3792-3800,2009；Onda et al.,Proc Natl Acad Sci USA 105(32):11311-11316,2008；以及PCT公开Nos.WO 2007/016150,WO 2009/032954和WO 2011/032022，通过引用将它们并入本文)。
在一些实例中，PE是对溶酶体降解具有抗性的变体，例如PE-LR(Weldon et al.,Blood 113(16):3792-3800,2009；PCT公开No.WO 2009/032954)。在其他实例中，PE是命名为PE-LR/6X的变体(PCT公开No.WO 2011/032022)。在其他实例中，该PE变体是免疫原性降低的PE。在其他实例中，PE是命名为PE-LR/8M的变体(PCT公开No.WO 2011/032022)。
PE的修饰可以发生在任何先前描述的变体中，包括PE的细胞毒性片段(例如，PE38、PE-LR和PE-LR/8M)。修饰的PE可以包括任何替换，例如针对PE的一个或更多个T细胞表位和/或B细胞表位内的一个或更多个氨基酸残基，或一个或更多个T细胞和/或B-细胞表位的缺失(参见，例如，美国专利申请公开No.2015/0099707)。
预期形式的PE还包括去免疫化(deimmunized)形式的PE，例如删除结构域II的版本(例如，PE24)。去免疫化形式的PE描述于例如PCT公开Nos.WO 2005/052006、WO 2007/016150、WO 2007/014743、WO 2007/031741、WO 2009/32954、WO 2007/016150、WO 2009/32904、WO 21205/3205和WO 2012/170617中。
在本文的一些实施方案中，免疫偶联物包括D4或HM2抗体和PE-LR。在一些实例中，D4的二聚体存在于免疫偶联物中。在特定的非限制性实施方案中，免疫偶联物的氨基酸序列与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在具体实例中，免疫毒素的氨基酸序列包括或由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21组成。
本文描述的抗体还可用于将任何数量的不同诊断或治疗化合物靶向在其表面表达肿瘤抗原的细胞。因此，本公开的抗体可以直接或通过接头连接至待直接递送至表达细胞表面抗原的细胞的药物。这可以用于治疗、诊断或研究目的。治疗剂包括诸如核酸、蛋白、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、光子吸收剂、脂质、碳水化合物或重组病毒的化合物。核酸治疗和诊断部分包括反义核酸、用于与单链或双链DNA共价交联的衍生化寡核苷酸和三链形成寡核苷酸。
或者，与抗体连接的分子可以是包封***，例如纳米颗粒、脂质体或胶束，其包含治疗组合物，例如药物、核酸(例如反义核酸)或另一种优选避免直接暴露于循环***的治疗部分。制备附着于抗体的脂质体的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，美国专利No.4,957,735；Connor et al.,Pharm.Ther.28:341-365,1985)。
本文描述的抗体也可以与可检测标签共价或非共价连接。适用于此类用途的可检测标签包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学手段检测的任何组合物。有用的标签包括磁珠、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射标签(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)，以及比色标签，如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)微珠。
检测此类标签的方法是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，放射标签可以使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标记物可以使用光检测器检测发射光来检测。通常通过为酶提供底物并检测酶对底物的作用产生的反应产物来检测酶学标签，并且通过简单地观察有色标签来检测比色标签。
VI.抗体药物偶联物(ADC)
ADC是由肿瘤抗原特异性抗体(例如单域抗体或免疫球蛋白的抗原结合片段)和药物(通常是细胞毒性剂，例如抗微管剂或交联剂)组成的化合物。由于ADC能够特异性靶向癌细胞，因此该药物比用于标准化疗的药物更有效。目前与ADC一起使用的最常见的细胞毒性药物的IC50比常规化疗剂的效力高100至1000倍。常见的细胞毒性药物包括抗微管药物，例如美登素类和澳瑞他汀类(例如澳瑞他汀E和澳瑞他汀F)。与ADC一起使用的其他细胞毒素包括吡咯苯并二氮杂卓类(PDB)，它与DNA的小沟共价结合以形成链间交联。在许多情况下，ADC包含1:2至1:4的抗体与药物比例(Bander,Clinical Advances in Hematology&Oncology 10(8；suppl 10):3-7,2012)。
抗体和药物可以通过可切割或不可切割的接头连接。然而，在某些情况下，需要具有在循环中稳定的接头以防止可能导致显著脱靶毒性(off-target toxicity)的细胞毒性药物的全身释放。不可切割的接头可在ADC被靶细胞内化之前阻止细胞毒性剂的释放。一旦进入溶酶体，溶酶体蛋白酶对抗体的消化导致细胞毒性剂的释放(Bander,ClinicalAdvances in Hematology&Oncology 10(8；suppl 10):3-7,2012)。
将药物与单克隆抗体进行位点特异性和稳定偶联的一种方法是通过聚糖工程。单克隆抗体在每条重链CH2结构域的Asn297残基处具有一保守的N连接寡糖链(Qasba etal.,Biotechnol Prog 24:520-526,2008)。使用突变的β1,4-半乳糖基转移酶(Y289L-Gal-T1；美国专利申请公开Nos.2007/0258986和2006/0084162，通过引用将它们并入本文)，将2-酮-半乳糖转移至抗体重链上游离的GlcNAc残基，提供了用于偶联的化学处理。
附着至单克隆抗体的寡糖链可根据末端半乳糖残基分为三组—完全半乳糖基化(两个半乳糖残基；IgG-G2)、一个半乳糖残基(IgG-G1)或完全去半乳糖基化(IgG-G0)。用β1,4-半乳糖苷酶处理单克隆抗体会将抗体转化为IgG-G0糖型。突变体β1,4-半乳糖基转移酶能够将2-酮半乳糖或2-叠氮半乳糖从它们各自的UDP衍生物转移到IgG-G1和IgG-G0糖型上的GlcNAc残基。转移糖上的化学处理使各种分子能够通过聚糖残基与单克隆抗体偶联(Qasba et al.,Biotechnol Prog 24:520-526,2008)。
本文提供的ADC包括与结合(例如特异性结合)GPC1的单克隆抗体偶联的药物(例如细胞毒性剂)。在一些实施方案中，药物是小分子。在一些实例中，药物是交联剂、抗微管剂和/或抗有丝***剂，或适合介导杀死肿瘤细胞的任何细胞毒性剂。示例性细胞毒性剂包括但不限于PDB、auristatin、美登素类、多拉司他汀、卡利奇霉素(calicheamicin)、奈莫柔比星(nemorubicin)及其衍生物、PNU-159682、蒽环类、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢霉烯、CC1065、喜树碱、依利萘法德、康普瑞汀(combretastain)、多拉司他汀、倍癌霉素(duocarmycin)、烯二炔、格尔德霉素、吲哚并苯二氮卓二聚体、嘌呤霉素、tubulysin、hemiasterlin、剪接抑制素或pladienolide，以及具有细胞毒性的立体异构体、等排体、类似物和衍生物活动。
在一些实施例中，ADC包括吡咯苯并二氮杂卓(PBD)。天然产物蒽霉素(一种PBD)于1965年首次报道(Leimgruber et al.,J Am Chem Soc,87:5793-5795,1965；Leimgruberet al.,J Am Chem Soc,87:5791-5793,1965)。从那时起，已经报道了许多PBD，包括天然存在的和合成的类似物(Gerratana,Med Res Rev 32(2):254-293,2012；以及美国专利Nos.6,884,799；7,049,311；7,067,511；7,265,105；7,511,032；7,528,126；和7,557,099)。作为一个实例，PDB二聚体识别并结合特定的DNA序列，并且已被证明可用作细胞毒性剂。PBD二聚体已与抗体偶联，所得ADC显示出具有抗癌特性(参见，例如，US 2010/0203007)。PBD二聚体上的示例性连接位点包括五元吡咯环、PBD单元之间的系链(tether)和N10-C11亚胺基团(参见WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US2011/0256157；和WO 2011/130598)。
在一些实施方案中，ADC包含与一个或更多个美登素类分子偶联的抗体。美登素类是美登素的衍生物，是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝***抑制剂。美登素首先从东非灌木Maytenus serrata中分离出来(美国专利No.3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登素类，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登素类例如在美国专利Nos.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中有描述。
在一些实施方案中，ADC包括与多拉司他汀或澳瑞他汀或其类似物或衍生物(参见美国专利Nos.5,635,483；5,780,588；5,767,237；和6,124,431)偶联的抗体。澳瑞他汀是海洋软体动物化合物dolastatin-10的衍生物。多拉司他汀和澳瑞他汀已被证明会干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞***(Woyke et al.,Antimicrob Agents and Chemother45(12):3580-3584,2001)并具有抗癌(美国专利No.5,663,149)和抗真菌活性(Pettit etal.,Antimicrob Agents Chemother 42:2961-2965,1998)。示例性多拉司他汀和澳瑞他汀包括但不限于多拉司他汀10、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、澳瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基澳瑞他汀D或单甲基多拉司他汀10)、MMAF(单甲基澳瑞他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-多拉丙氨酸-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基澳瑞他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-去甲麻黄碱)、5-苯甲酰戊酸-AE酯(AEVB)和其他澳瑞他汀(参见例如，美国公开No.2013/0129753)。
在一些实施方案中，ADC包含与一个或更多个卡利奇霉素分子偶联的抗体。卡利奇霉素家族的抗生素及其类似物能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂(Hinman et al.,Cancer Res 53:3336-3342,1993；Lode et al.,Cancer Res 58:2925-2928,1998)。在美国专利Nos.5,712,374；5,714,586；5,739,116；和5,767,285中描述了用于制备具有卡利奇霉素药物部分的ADC的示例性方法。
在一些实施方案中，ADC包含蒽环类。蒽环类是显示细胞毒性活性的抗生素化合物。据信，蒽环类可以通过多种不同的机制杀细胞，包括将药物分子嵌入细胞的DNA中，从而抑制依赖于DNA的核酸合成；诱导自由基的产生，然后自由基与细胞大分子发生反应，对细胞造成损害；和/或药物分子与细胞膜的相互作用。非限制性的示例性蒽环类包括多柔比星、表柔比星、伊达比星、道诺霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星和米托蒽醌，以及它们的衍生物。例如，PNU-159682是奈莫柔比星的有效代谢物(或衍生物)(Quintieri et al.,Clin Cancer Res 11(4):1608-1617,2005)。奈莫柔比星是多柔比星的半合成类似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉代基团(Grandi et al.,Cancer Treat Rev 17:133,1990；Ripamonti et al.,Br J Cancer 65:703-707,1992)。
在一些实施方案中，ADC还可包括接头。在一些实例中，接头是双功能或多功能部分，其可用于将一个或更多个药物部分连接至抗体以形成ADC。在一些实施方案中，使用具有用于共价连接至药物和抗体的反应性官能团的接头制备ADC。例如，抗体的半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。
在一些实例中，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的功能性。具有此类反应功能性的示例性接头包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、活化酯类例如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
在一些实例中，接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的功能性。这种亲电子基团的实例包括但不限于醛和酮羰基。在一些情况下，接头的反应功能性的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。非限制性实例包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)和芳基酰肼(arylhydrazide)。
在一些实例中，接头是可切割的接头，其有助于药物的释放。可切割接头的实例包括酸不稳定接头(例如，包含腙)、蛋白酶敏感接头(例如，肽酶敏感的)、光不稳定接头和含二硫化物接头(Chari et al.,Cancer Res 52:127-131,1992；U.S.Patent No.5,208,020)。
本文公开的ADC可以单独或与另一种治疗剂组合和/或与用于治疗癌症的任何标准疗法(例如肿瘤的手术切除、化学疗法或放射疗法)组合用于治疗GPC1阳性癌症治疗。
VII.多特异性抗体
多特异性抗体是由两种或更多种单克隆抗体(如单域抗体)或两种或更多种不同单克隆抗体的抗原结合片段组成的重组蛋白。例如，双特异性抗体由两种不同单克隆抗体的抗原结合片段组成。因此，双特异性抗体结合两种不同的抗原，而三特异性抗体结合三种不同的抗原。多特异性抗体可通过同时靶向例如CTL(例如CTL受体成分，例如CD3)或效应自然杀伤(NK)细胞和至少一种肿瘤抗原来用于癌症免疫治疗。本文公开的GPC1特异性单克隆抗体可用于产生靶向GPC1和CTL或靶向GPC1和NK细胞的多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体，从而提供治疗表达GPC1的癌症的手段。在一个实例中，本文公开的GPC1特异性单克隆抗体用于产生靶向GPC1和PD1、PDL1、EGFR或VEGF的多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体，从而提供治疗表达GPC1癌症的手段。
双特异性T细胞接合物(BiTE)是一种双特异性单克隆抗体，其为靶向肿瘤抗原(如GPC1)的第一单克隆抗体(如scFv或单域抗体)和结合T细胞(例如T细胞上的CD3)的第二单克隆抗体的融合物。在本文的一些实施方案中，BiTE的结合部分之一对GPC1具有特异性。
双特异性杀伤细胞接合物(BiKE)是一种双特异性单克隆抗体，其为靶向肿瘤抗原(例如GPC1)的第一单克隆抗体(例如scFv或单域抗体)和结合NK细胞激活受体如CD16的第二scFv的融合物。
本文提供了包含GPC1特异性单克隆抗体的多特异性，例如三特异性或双特异性单克隆抗体。在一些实施方案中，该多特异性单克隆抗体进一步包含特异性结合T细胞受体的组分例如CD3的单克隆抗体。在其他实施方案中，该多特异性单克隆抗体进一步包含特异性结合NK细胞活化受体例如CD16、Ly49或CD94的单克隆抗体。还提供了编码该多特异性抗体的分离的核酸分子和载体，以及包含该核酸分子或载体的宿主细胞。包含GPC1特异性抗体的多特异性抗体可用于治疗表达GPC1的癌症。因此，本文提供了通过选择患有表达GPC1的癌症的受试者并用治疗有效量的靶向GPC1的多特异性抗体向该受试者给药来治疗患有癌症的受试者的方法。
VIII.抗体纳米颗粒偶联物
本文公开的单克隆抗体可以与多种不同类型的纳米颗粒偶联，通过抗体与肿瘤细胞表面表达的GPC1的结合，将细胞毒性剂或其他抗癌剂直接递送至肿瘤细胞。纳米颗粒的使用减少了脱靶副作用，还可以提高药物的生物利用度并减少达到治疗效果所需的药物剂量。可以定制纳米颗粒制剂以适合待携带或封装在纳米颗粒内的药物。例如，疏水性分子可以掺入纳米颗粒的核内，而亲水性药物可以携带在由聚合物或脂质壳保护的水性核内。纳米颗粒的实例包括但不限于纳米球、纳米胶囊、脂质体、树枝状聚合物(dendrimer)、聚合物胶束、类脂质体(noisome)和聚合物纳米颗粒(Fay and Scott,Immunotherapy 3(3):381-394,2011)。
脂质体是目前用于药物递送的最常见的纳米颗粒类型之一。与脂质体偶联的抗体通常被称为“免疫脂质体(immunoliposome)”。免疫脂质体的脂质体成分通常是一个或更多个同心磷脂双层的脂质囊泡。在一些情况下，磷脂由亲水性头部基团和两条疏水链组成，从而能够封装疏水性和亲水性药物。常规脂质体通过网状内皮***(RES)的巨噬细胞迅速从循环中清除。为了产生长循环脂质体，可以调节脂质体的组成、大小和电荷。脂质体的表面也可以被修饰，例如用糖脂或唾液酸。例如，包含聚乙二醇(PEG)会显著增加循环半衰期。用作药物递送剂的脂质体，包括用于制备免疫脂质体的脂质体，在本领域中已有描述(参见，例如，Paszko and Senge,Curr Med Chem 19(31)5239-5277,2012；Immordino et al.,IntJ Nanomedicine 1(3):297-315,2006；美国专利申请公开Nos.2011/0268655；2010/00329981)。
类脂质体是基于非离子表面活性剂的囊泡，其结构类似于脂质体。类脂质体的膜仅由非离子表面活性剂组成，例如聚甘油-烷基醚或N-棕榈酰葡糖胺。类脂质体的范围从小的单层颗粒到大的多层颗粒。这些纳米颗粒是单分散的、水溶性的、化学稳定的、毒性低、可生物降解和非免疫原性的，并提高了封装药物的生物利用度。
树枝状聚合物包括一系列支化聚合物复合物。这些纳米颗粒是水溶性的、生物相容的，并且对于人类使用具有足够的非免疫原性。通常，树枝状聚合物由引发剂核组成，周围是接枝到核上的一层选定的聚合物，形成支化的大分子复合物。树枝状聚合物通常使用聚合物如聚(酰胺-胺)或聚(L-赖氨酸)生产。树枝状聚合物已用于各种治疗和诊断应用，包括用于递送DNA、RNA、生物成像造影剂和化学治疗剂。
聚合物胶束由组装成疏水核的两亲性共聚物(由亲水性和疏水性单体单元组成)的聚集体组成，被暴露于水性环境的亲水性聚合物链冠包围。在许多情况下，用于制备聚合物胶束的聚合物是异双功能共聚物，由PEG亲水嵌段、聚乙烯吡咯烷酮和形成颗粒核心的疏水性聚(L-丙交酯)或聚(L-赖氨酸)的组成。聚合物胶束可用于携带溶解度差的药物。这些纳米颗粒已被用于封装多种抗癌药物，包括多柔比星和喜树碱。还开发了阳离子胶束以携带DNA或RNA分子。
聚合物纳米颗粒包括纳米球和纳米胶囊。纳米球由聚合物的固体基质组成，而纳米胶囊包含水性核。选择的制剂通常取决于待携带/包封的治疗剂的溶解度；水溶性差的药物更容易封装在纳米球中，而水溶性和不稳定的药物，如DNA和蛋白质，更容易封装在纳米胶囊中。用于生产这些纳米颗粒的聚合物包括，例如，聚(丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(氰基丙烯酸烷基酯)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
抗体(或其片段)可以根据本领域已知的标准方法与适合的纳米颗粒偶联。例如，偶联可以是共价的或非共价的。在纳米颗粒是脂质体的一些实施方案中，抗体通过PEG链连接到空间稳定的长循环脂质体。抗体或抗体片段与脂质体的结合还可涉及硫酯键，例如通过硫醇和马来酰亚胺基团的反应。交联剂可用于产生巯基以将抗体连接到纳米颗粒上(Paszko and Senge,Curr Med Chem 19(31)5239-5277,2012)。
IX.组合物和使用方法
提供的组合物包括载体中的一种或更多种所公开的单克隆抗体，所述单克隆抗体结合(例如特异性结合)GPC1。还提供了包含ADC、CAR(和包含CAR的CTL)、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体和免疫偶联物的组合物。组合物可以以单位剂型制备用于向受试者给药。给药的量和时间由治疗临床医生决定以达到期望的结果。抗体、ADC、CAR、CTL、多特异性抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体或免疫偶联物可以配制为用于全身或局部(例如肿瘤内)给药。在一个实例中，该抗体被配制用于肠胃外给药，例如静脉内给药。
用于给药的组合物可以包括抗体、ADC、CAR、CTL、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体或免疫偶联物在药学上可接受的载体(例如水性载体)中的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不想要的物质。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中抗体的浓度可以广泛变化，并且将主要基于流体体积、粘度、体重等根据所选择的特定给药模式和受试者的需要进行选择。
用于静脉内给药的典型药物组合物包括每个受试者每天约0.1至10mg抗体(或ADC、CAR、多特异性抗体、抗体-纳米颗粒偶联物或免疫偶联物)。可以使用每名受试者每天0.1至约100mg的剂量，特别是如果将药剂施用于隔离位点(secluded site)而不是进入循环或淋巴***，例如进入体腔或进入器官的管腔。制备可给药组合物的实际方法对本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且在诸如Remington's PharmaceuticalScience,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA(1995)等出版物中有更详细的描述。
本文公开的单克隆抗体也可以通过其他途径给药，包括通过吸入、口服、局部或眼内给药。在一些实例中，单克隆抗体(或其偶联物)通过细针给药。
抗体(或其他治疗分子)可以冻干形式提供并在给药前用无菌水再水化，尽管它们也以已知浓度的无菌溶液提供。然后将抗体溶液加入含有0.9％氯化钠(USP)的输液袋中，在某些情况下，以0.5至15mg/kg体重的剂量给药，例如1至10mg/kg或1至5mg/kg。自1997年RITUXANTM获批以来已在美国上市的抗体药物的给药在本领域已有相当多的经验。抗体、ADC、CAR、多特异性(如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体或免疫偶联物可以通过缓慢输注给药，而不是静脉推注或团注。在一个实例中，给予较高的负荷剂量，随后以较低的水平给予维持剂量。例如，初始负荷剂量3至5mg/kg可在约90分钟内输注，然后4-8周的每周维持剂量为在30分钟内输注1至2mg/kg，如果先前的剂量耐受性良好。
控释肠胃外制剂可制成植入物、油性注射剂或微粒***。对于蛋白质递送***的广泛概述，参见Banga,A.J.,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995)。微粒***包括例如微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有作为中心核心的治疗性蛋白，例如细胞毒素或药物。在微球中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊一般分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径约为5μm，因此只能静脉注射纳米颗粒。微粒的直径通常约为100μm，可通过皮下或肌肉注射给药。参见，例如，Kreuter,J.,Colloidal Drug Delivery Systems,J.Kreuter,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.219-342(1994)；和Tice&Tabibi,Treatise onControlled Drug Delivery,A.Kydonieus,ed.,Marcel Dekker,Inc.New York,NY,pp.315-339,(1992)。
聚合物可用于本文公开的基于抗体的组合物的离子控制释放(ion-controlledrelease)。用于受控药物递送的各种可降解和不可降解聚合物基质是本领域已知的(Langer,Accounts Chem.Res.26:537-542,1993)。例如，嵌段共聚物polaxamer 407在低温下以粘稠但可移动的液体存在，但在体温下形成半固体凝胶。它已被证明是重组白细胞介素2和脲酶的配制和持续递送的有效载体(Johnston et al.,Pharm.Res.9:425-434,1992；and Pec et al.,J.Parent.Sci.Tech.44(2):58-65,1990)。或者，羟基磷灰石已被用作蛋白的控制释放的微载体(Ijntema et al.,Int.J.Pharm.112:215-224,1994)。在另一方面，脂质体用于脂质包封药物的控制释放以及药物靶向(Betageri et al.,Liposome DrugDelivery Systems,Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。用于治疗性蛋白的控制递送的许多另外的***是已知的(参见美国Nos.5,055,303；5,188,837；4,235,871；4,501,728；4,837,028；4,957,735；5,019,369；5,055,303；5,514,670；5,413,797；5,268,164；5,004,697；4,902,505；5,506,206；5,271,961；5,254,342和5,534,496)。
A.治疗方法
可以用本文公开的抗体、组合物、CAR(和表达CAR的CTL)、ADC、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体和免疫偶联物给药以减缓或抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿瘤细胞的转移，如GPC1阳性癌症。在这些应用中，将治疗有效量的组合物以足以抑制癌细胞的生长、复制或转移，或抑制癌症的迹象或症状的量向受试者给药。合适的受试者可以包括被诊断患有表达GPC1的癌症的那些，例如但不限于胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌或卵巢癌。在一些实例中，例如与治疗前的体积相比，该方法使肿瘤(例如转移瘤)的体积减少至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％，或甚至100％。在一些实例中，例如与治疗前的数量相比，该方法使肿瘤的肿瘤细胞数量减少至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％，或甚至100％。在一些实施例中，例如与治疗前的大小相比，该方法将肿瘤(例如转移瘤)的大小减小至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或甚至100％。在一些实例中，例如与治疗前的数量相比，该方法减少转移瘤的数量至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或甚至100％。在一些实例中，例如与治疗前的数量相比，该方法增加受试者的预后，例如将受试者的寿命延长至少4个月、至少6个月、至少8个月、至少9个月、至少12个月、至少24个月、至少36个月或至少60个月。在一些实施例中，实现了这些效果的组合。
本文提供了一种在受试者中治疗GPC1阳性癌症的方法，其通过以治疗有效量的本文公开的GPC1特异性抗体、免疫偶联物、CAR(或表达CAR的CTL)、ADC、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体或组合物向受试者给药来进行。本文还提供了一种抑制受试者中GPC1阳性癌症的肿瘤生长或转移的方法，其通过以治疗有效量的本文公开的GPC1特异性抗体、免疫偶联物、CAR(或表达CAR的CTL)、ADC、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体或组合物向受试者给药来进行。在一些实施方案中，该GPC1阳性癌症是胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌或卵巢癌。
本文公开的GPC1特异性抗体、ADC、CAR(例如表达CAR的CTL)、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、免疫偶联物、免疫脂质体或组合物的治疗有效量将取决于疾病的严重性、疾病的类型以及患者健康的一般状态。治疗有效量的基于抗体的组合物是提供症状的主观缓解或由临床医生或其他有资格的观察者注意到的客观可识别的改善的量。
本文公开的GPC1特异性抗体、ADC、CAR、免疫偶联物、多特异性抗体、抗体-纳米颗粒偶联物、免疫脂质体和组合物的给药也可以伴随其他抗癌剂的给药或治疗性处理(例如手术切除肿瘤)。任何适合的抗癌剂都可以与本文公开的抗体、组合物和免疫偶联物组合给药。示例性抗癌剂包括但不限于化学治疗剂，例如有丝***抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalating antibiotic)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素(例如抗雄激素)和抗血管生成剂。其他抗癌处理包括放射疗法和其他专门靶向癌细胞的抗体(例如抗PD1、抗PDL1、抗VEGF和抗EGFR抗体)。
烷化剂的非限制性实例包括氮芥(例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸盐(例如白消安)、亚硝基脲(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素或达卡巴嗪)。
抗代谢物的非限制性实例包括叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如5-FU或阿糖胞苷)和嘌呤类似物，例如巯嘌呤或硫鸟嘌呤。
天然产物的非限制性实例包括长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱或长春地辛)、表鬼臼毒素(例如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(例如更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素或丝裂霉素C)，以及酶(如L-天冬酰胺酶)。
其他药剂的非限制性实例包括铂配位络合物(例如顺式二胺二氯铂II，也称为顺铂)、取代脲(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(例如丙卡巴肼)和肾上腺皮质抑制剂(例如米托坦和氨鲁米特)。
激素和拮抗剂的非限制性实例包括肾上腺皮质激素类(例如***)、孕激素(例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸magestrol)、***(例如己烯雌酚和乙炔***)、抗***(例如和他莫昔芬)和雄激素(如丙酸睾酮和氟***)。最常用的化疗药物的例子包括阿霉素、Alkeran、Ara-C、BiCNU、白消安、CCNU、卡铂、顺铂、Cytoxan、柔红霉素、DTIC、5-FU、氟达拉滨、Hydrea、伊达比星、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇(或其他紫杉烷类，如多西紫杉醇)、Velban、长春新碱、VP-16，而一些较新的药物包括吉西他滨(Gemzar)、赫赛汀、伊立替康(Camptosar、CPT-11)、Leustatin、Navelbine、Rituxan STI-571、Taxotere、拓扑替康(Hycamtin)、Xeloda(Capecitabine)、Zevelin和骨化三醇。
可以使用的免疫调节剂的非限制性实例包括AS-101(Wyeth-Ayerst Labs.)、溴匹立明(Upjohn)、γ干扰素(Genentech)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；GeneticsInstitute)、IL-2(Cetus或Hoffman-LaRoche)、人免疫球蛋白(Cutter Biological)、IMREG(来自Imreg of New Orleans,La.)、SK&F 106528和TNF(肿瘤坏死因子；Genentech)。
某些类型癌症的另一种常见治疗方法是手术处理，例如手术切除癌症或其一部分。另一个处理的例子是放射疗法，例如向肿瘤部位施用放射性物质或能量(例如外照射疗法)以帮助根除肿瘤或在手术切除之前缩小肿瘤。
B.诊断和检测方法
本文提供了用于体外或体内检测GPC1蛋白的方法。例如，所公开的单克隆抗体可用于体内肿瘤成像。为了将所公开的抗体用作体内诊断试剂，抗体用可检测部分标记，例如放射性同位素、荧光标签或正电子发射放射性核素。作为一个例子，本文公开的单克隆抗体可以与正电子发射放射性核素偶联以用于正电子发射断层扫描(PET)；这种诊断过程通常被称为免疫PET。虽然全长抗体可以制成良好的免疫PET试剂，但它们的生物半衰期可能需要在成像前等待几天，这会增加相关的非靶辐射剂量。较小的单域抗体/纳米抗体具有适合当天成像的生物半衰期。
在其他情况下，在生物样品中检测GPC1表达。样品可以是任何样品，包括但不限于来自活组织检查、尸体解剖和病理标本的组织。生物样品还包括组织切片，例如，为组织学目的而取的冷冻切片。生物样品还包括体液，例如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿液。在一些实例中，样品是含有外泌体的血清样品。生物样品通常获自哺乳动物，例如人或非人灵长类动物。
外泌体是脂质双层封闭的细胞外囊泡，含有所有细胞分泌蛋白和核酸并在血液中循环。已经证明胰腺癌患者在他们的血液中循环有GPC1阳性、癌症衍生的外泌体(Melo etal.,Nature 523(7559):177-182,2015)。因此，血清中GPC1阳性外泌体的检测可用作诊断受试者患有GPC1阳性癌症例如胰腺癌的手段。因此，本文提供了一种诊断受试者患有GPC1阳性癌症(例如胰腺癌)的方法，其通过将来自受试者的血清样品与本文公开的GPC1特异性单克隆抗体接触；并检测抗体与样品中外泌体的结合来进行。在一些实例中，外泌体在与GPC1特异性抗体接触之前从血清样品中分离。表达GPC1的外泌体的检测可以使用任何合适的测定法进行，例如通过使用本文公开的GPC1特异性抗体的流式细胞术。
本文提供了一种确定受试者是否患有GPC1阳性癌症的方法，其通过将来自受试者的样品与本文公开的GPC1特异性单克隆抗体接触；并检测抗体与样品的结合来进行。与抗体与对照样品的结合相比，抗体与样品结合的增加将受试者鉴定为患有GPC1阳性癌症。
在另一个实施方案中，提供了一种证实对受试者中GPC1阳性癌症的诊断的方法，其通过将来自被诊断患有GPC1阳性癌症的受试者的样品与本文公开的GPC1特异性单克隆抗体接触；并检测抗体与样品的结合来进行。与抗体与对照样品的结合相比，抗体与样品结合的增加证实了对受试者中GPC1阳性癌症的诊断。
在所公开方法的一些实例中，该单克隆抗体为直接标记的。
在其他实例中，该方法还包括将特异性结合该单克隆抗体的第二抗体(检测抗体)与样品接触；并检测该第二抗体的结合。与第二抗体与对照样品的结合相比，第二抗体与样品结合的增加检测受试者中的GPC1阳性癌症或核实对受试者中GPC1阳性癌症的诊断。
在一些情况下，该癌症是胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌或卵巢癌。
在一些实例中，对照样品是来自没有癌症的受试者的样品。在特定实例中，样品是血液或组织样品。
在诊断和检测方法的一些实施方案中，结合(例如特异性结合)GPC1的抗体用可检测标签直接标记。在另一个实施方案中，结合(例如，特异性结合)GPC1的抗体(第一抗体)是未标记的，而可以结合该特异性结合GPC1的抗体的第二抗体或其他分子被标记。如本领域技术人员公知的，选择能够特异性结合第一抗体的特定物种和类别的第二抗体。例如，如果第一抗体是人IgG，则第二抗体可以是抗人IgG。可与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，两者均可商购获得。
适合于抗体或第二抗体的标签包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。合适酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。适合的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。非限制性的示例性发光材料是鲁米诺；非限制性的示例性磁性剂是钆，非限制性的示例性放射性标签包括125I、131I、35S或3H。
在另一个实施方案中，可以通过竞争免疫测定法利用用可检测物质标记的GPC1蛋白质标准品和特异性结合GPC1的未标记抗体来测定生物样品中的GPC1。在该测定中，将生物样品、标记的GPC1蛋白质标准品和特异性结合GPC1的抗体混合，并测定与未标记抗体结合的标记GPC1蛋白标准品的量。生物样品中GPC1的量与与特异性结合GPC1的抗体结合的标记GPC1蛋白标准品的量成反比。
本文公开的免疫测定和方法可用于多种目的。在一个实施方案中，特异性结合的抗体可用于检测细胞培养物中的细胞中GPC1的产生。在另一个实施方案中，抗体可用于检测生物样品例如组织样品或血液或血清样品中GPC1的量。在一些实例中，该GPC1是细胞表面GPC1。在其他实例中，该GPC1蛋白是可溶的(例如，在细胞培养物上清液或体液样品如血液或血清样品中)。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测生物样品例如血液样品或组织样品中的GPC1的试剂盒。例如，为了证实受试者的癌症诊断，可以进行活组织检查以获得用于组织学检查的组织样本。用于检测GPC1的试剂盒通常包含与GPC1特异性结合的单克隆抗体，例如本文公开的任何单克隆抗体，并且还可包含可与抗GPC1抗体特异性结合的标记第二抗体。在一个具体实施方案中，试剂盒中的抗GPC1抗体本身被标记(例如，用荧光、放射性或酶标签)。
在一个实施方案中，试剂盒包括说明材料，其公开了结合GPC1的抗体的使用方法。说明材料可以以电子形式(例如计算机软盘或光盘)或视觉形式(例如视频文件)编写。该试剂盒还可以包括附加组件以促进试剂盒所设计的特定应用。因此，例如，该试剂盒可以另外包含检测标签的工具(例如用于酶标签的酶底物、检测荧光标签的过滤器组、适当的第二标签例如第二抗体等)。试剂盒还可包括缓冲液和其他常规用于特定方法的实施的试剂。
在一个实施方案中，该诊断试剂盒包括免疫测定。尽管免疫测定的细节可能因所采用的特定形式而异，但检测生物样品中GPC1的方法通常包括将生物样品与抗体接触的步骤，该抗体在免疫反应条件下与GPC1发生特异性反应。使抗体在免疫反应条件下特异性结合形成免疫复合物，并直接或间接检测免疫复合物(结合的抗体)的存在。
本文公开的抗体还可用于免疫测定，例如但不限于放射免疫测定(RIA)、ELISA或免疫组织化学测定。该抗体还可用于荧光激活细胞分选(FACS)。FACS采用多个颜色通道、低角度和钝角光散射(low angle and obtuse light-scattering)检测通道以及阻抗通道，以及其他更复杂的检测水平，以分离或分选细胞(参见美国专利No.5,061,620)。如本文所公开的，结合GPC1的任何单克隆抗体均可用于这些测定中。因此，抗体可用于常规免疫测定，包括但不限于ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白质印迹或免疫沉淀。
提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方案。这些实例不应被解释为将本公开限制为所描述的特定特征或实施方案。
实施例
实施例1:GPC1特异性单克隆抗体的分离和表征
本实施例描述从噬菌体展示文库和小鼠杂交瘤分离的两种GPC1特异性单克隆抗体。小鼠单克隆抗体HM2(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4)结合GPC1靠近细胞表面的C叶(C-lobe)，骆驼单域抗体D4(SEQ ID NO:6)识别GPC1蛋白核心中的构象表位。
三轮淘选后，从骆驼单域(VHH)噬菌体文库分离出抗体D4(图1A)。D4的单克隆噬菌体ELISA分析证明D4特异性结合人和小鼠GPC1，但不表现出对人GPC2、GPC3、GPC5或GPC6的任何显著结合(图1B)。通过流式细胞术评估D4与表达GPC1的肿瘤细胞的结合。D4表现出与过表达GPC1的2B9 KLM胰腺癌细胞和过表达GPC1的H8表皮样癌细胞的显著结合，但不与GPC1阴性A431细胞结合(图2)。使用
Figure BDA0003172735260000391
动力学分析，D4对人GPC1的亲和力计算为KD＝1.3nM(图3)。
按照先前描述的方案(Phung et al.,mAbs 4(5):592-599,2012)，从用重组GPC1片段免疫的小鼠中分离抗体HM2，并在GPC1阳性细胞上进行筛选。ELISA证明HM2特异性结合人GPC1，但不结合人GPC2、GPC3、GPC5或GPC6(图4)。通过流式细胞术评估HM2与表达GPC1的肿瘤细胞的结合。HM2表现出与过表达GPC1的2B9 KLM胰腺癌细胞、过表达GPC1的H8表皮样癌细胞和GPC1阳性T3M4胰腺癌细胞的显著结合，但不与GPC1阴性A431细胞结合(图5)。使用
Figure BDA0003172735260000392
动力学分析，HM2对人GPC1的亲和力计算为KD＝1.2nM(图6)。
使用抗体HM2(1μg/ml)，通过免疫组织化学评估GPC1在人胰腺肿瘤中的表达。如图7所示，相对于正常组织(插图i至iii)，通过免疫组织化学测定，GPC1的表达在胰腺肿瘤(图7的插图iv至vi)中显著增加。
HM2和D4用于生成靶向GPC1的CAR T细胞。产生了表达包含HM2 scFv或VHH抗体D4以及截短的人EGFR(huEGFRt)的CAR的慢病毒构建体(图8A；也参见上文部分IV)。为了确认成功的载体转导和CAR在T细胞中的表达，将流式细胞术用于检测huEGFRt的表达。如图8B所示，D4 CAR和HM2 CAR在原代T细胞中的转导效率分别为86％和58％。
在体外测试了HM2和D4 CAR T细胞的细胞溶解活性。表达荧光素酶的2B9(GPC1阳性)、H8(GPC1阳性)、T3M4(GPC1阳性)和A431(GPC1阴性)细胞与空白对照(mock)、HM2或D4CAR转导的T细胞以E:T比例范围从1.1:1到30:1共培养20小时。使用基于发光的细胞溶解试验测量特异性裂解。如图9A-9C所示，靶向GPC1的CAR T细胞以剂量依赖性方式诱导所有表达GPC1的细胞系的有效裂解。相比之下，在GPC1阴性细胞系A431中观察到最小的细胞裂解(图9D)。
还进行了其他研究以评估靶向GPC1的CAR T细胞诱导的细胞因子产生。GPC1阳性(H8和2B9)和GPC1阴性(A431)肿瘤细胞与靶向GPC1的HM2或D4 CAR T细胞以E:T比为10共培养20小时。收集培养物上清液以通过ELISA测量IL-2(图10A)、IFN-γ(图10B)和TNF-α(图10C)分泌。D4和HM2 CAR T细胞导致两种GPC1阳性细胞系中IL-2、IFN-γ和TNF-α的产生增加，但在GPC1阴性A431细胞中则不然。尽管HM2和D4 CAR T细胞在体外显示出相似的溶细胞活性，但与GPC1阳性肿瘤细胞共培养时，D4 CAR T细胞诱导的细胞因子比HM2 CAR T细胞多2至4倍。
在胰腺癌的腹膜播散异种移植小鼠模型(peritoneal dissemination xenograftmouse model)中评估了基于抗体HM2或D4的靶向GPC1的CAR T细胞。在肿瘤细胞接种后第11天用mock T细胞或CAR T细胞的腹膜注射处理2B9荷瘤NSG小鼠(图11A)。通过生物发光成像监测肿瘤负荷。HM2和D4 CAR T细胞显示出有效的抗肿瘤活性并介导根除2B9异种移植肿瘤(图11B和11C)。三组处理动物之间的小鼠体重没有显著差异(图11D)。为了确定CAR载体阳性的脾细胞比例，进行了液滴数字PCR(ddPCR)。从选择的小鼠(742、759、746、743、788、745和747；参见图11B)的脾脏中提取基因组DNA并通过ddPCR分析以量化CAR载体阳性细胞。mock处理的、HM2处理的和D4处理的小鼠脾脏中CAR T细胞的百分比显示在图11E中。结果表明，靶向GPC1的CAR T细胞即使在处理后5周仍能在小鼠体内持续存在，并且CAR T细胞的数量与肿瘤负荷呈负相关。这些发现表明，靶向GPC1的CAR T细胞疗法是治疗胰腺癌和其他表达GPC1的癌症的有效方法。
实施例2:基于D4和HM2抗体的免疫毒素
本实施例描述由D4或HM2抗体和缺少结构域II的假单胞菌外毒素A的截短形式(本文称为“LR”)组成的免疫毒素的产生和测试。
免疫毒素序列
产生了四种不同的免疫毒素：D4-LR、HM2-LR、D4-AAA-D4-LR和D4-GGS-D4-LR。后两种免疫毒素包括由三氨基酸接头(AAA或GGS)分隔的D4二聚体。下面提供了四种免疫毒素的核苷酸和氨基酸序列。LR编码序列(对于核苷酸序列)和氨基酸序列的LR部分用下划线标出。
D4-LR核苷酸序列(SEQ ID NO:14)
ATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCCGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATACAGCTACAGTATTGGTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGAAAGGAGCGCGCGTGGGTCGCGTCTCGATATACTGGTGACGGTGGCGCAGTCTTTGACGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCCAAGAGAGTGCCGGGAACACGTTCGATTTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTATTGCGCAGCGAAAGGGCCCGGTTTCGGGCGGTGGGAGTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAAAGCTTAAAGCAAGCGG CGGTCGCCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAGCTGGGCGGTGGCGGTGGCAGCCCCACCGGTGCCGAGTTCCTGG GCGACGGTGGCGATGTGTCCTTTAGCACCCGTGGTACCCAGAACTGGACGGTAGAGCGCCTGCTGCAGGCACATCGT CAGCTGGAAGAGCGTGGCTATGTATTCGTTGGCTACCACGGCACTTTTCTGGAAGCAGCTCAGTCCATCGTGTTTGG TGGTGTCCGTGCCCGTTCTCAAGACCTGGATGCGATTTGGCGTGGTTTCTACATTGCAGGCGATCCAGCGCTGGCAT ACGGTTATGCGCAGGACCAGGAACCGGATGCTCGTGGTCGCATTCGTAATGGTGCGCTGCTGCGCGTATATGTGCCG CGTTCCAGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACTAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGTGAAGTGGAACGTCT GATTGGTCATCCTCTGCCTCTGCGCCTGGATGCCATCACCGGCCCAGAGGAGGAGGGCGGTCGTCTGGAAACCATTC TGGGCTGGCCGCTGGCTGAACGTACGGTCGTTATTCCGAGCGCGATTCCTACCGATCCTCGTAACGTTGGCGGCGAT CTGGACCCATCTTCTATTCCAGATAAGGAGCAGGCAATCTCCGCGCTGCCGGATTATGCAAGCCAACCGGGTAAACC ACCTCGTGAAGATCTGAAATAA
D4-LR氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
MQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGYSYSIGYMAWFRQAPGKERAWVASRYTGDGGAVFDDAVKGRFTTSQESAGNTFDLQMDSLKPEDTAMYYCAAKGPGFGRWEYWGRGTQVTVSSKLKASGGRHRQPRGWEQLGGGGGSPT GAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAG DPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGG RLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
HM2-LR核苷酸序列(SEQ ID NO:16)
ATGGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCTCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTCGTAGCTCCGTAGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGCGGAGGCGGATCAGGTGGTGGCGGATCTGGAGGTGGCGGAAGCGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACTTATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGAACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATAAAAAAGCTTAAAGCAAGCGGCGGTCGCCATCGCCAGCCG CGCGGCTGGGAACAGCTGGGCGGTGGCGGTGGCAGCCCCACCGGTGCCGAGTTCCTGGGCGACGGTGGCGATGTGTC CTTTAGCACCCGTGGTACCCAGAACTGGACGGTAGAGCGCCTGCTGCAGGCACATCGTCAGCTGGAAGAGCGTGGCT ATGTATTCGTTGGCTACCACGGCACTTTTCTGGAAGCAGCTCAGTCCATCGTGTTTGGTGGTGTCCGTGCCCGTTCT CAAGACCTGGATGCGATTTGGCGTGGTTTCTACATTGCAGGCGATCCAGCGCTGGCATACGGTTATGCGCAGGACCA GGAACCGGATGCTCGTGGTCGCATTCGTAATGGTGCGCTGCTGCGCGTATATGTGCCGCGTTCCAGCCTGCCGGGCT TCTACCGCACTAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGTGAAGTGGAACGTCTGATTGGTCATCCTCTGCCT CTGCGCCTGGATGCCATCACCGGCCCAGAGGAGGAGGGCGGTCGTCTGGAAACCATTCTGGGCTGGCCGCTGGCTGA ACGTACGGTCGTTATTCCGAGCGCGATTCCTACCGATCCTCGTAACGTTGGCGGCGATCTGGACCCATCTTCTATTC CAGATAAGGAGCAGGCAATCTCCGCGCTGCCGGATTATGCAAGCCAACCGGGTAAACCACCTCGTGAAGATCTGAAATAA
HM2-LR氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
MEVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTRSSVGYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQRTHVPYTFGGGTKLEIKKLKASGGRHRQPRGWEQLGGGGGSPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQ LEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPR SSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDL DPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
D4-AAA-D4-LR核苷酸序列(SEQ ID NO:18)
ATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCCGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATACAGCTACAGTATTGGTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGAAAGGAGCGCGCGTGGGTCGCGTCTCGATATACTGGTGACGGTGGCGCAGTCTTTGACGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCCAAGAGAGTGCCGGGAACACGTTCGATTTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTATTGCGCAGCGAAAGGGCCCGGTTTCGGGCGGTGGGAGTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCGGCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCCGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATACAGCTACAGTATTGGTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGAAAGGAGCGCGCGTGGGTCGCGTCTCGATATACTGGTGACGGTGGCGCAGTCTTTGACGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCCAAGAGAGTGCCGGGAACACGTTCGATTTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTATTGCGCAGCGAAAGGGCCCGGTTTCGGGCGGTGGGAGTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAAAGCTTAAAGCAAGCGGCGGTCGCCATCGCCAGCCG CGCGGCTGGGAACAGCTGGGCGGTGGCGGTGGCAGCCCCACCGGTGCCGAGTTCCTGGGCGACGGTGGCGATGTGTC CTTTAGCACCCGTGGTACCCAGAACTGGACGGTAGAGCGCCTGCTGCAGGCACATCGTCAGCTGGAAGAGCGTGGCT ATGTATTCGTTGGCTACCACGGCACTTTTCTGGAAGCAGCTCAGTCCATCGTGTTTGGTGGTGTCCGTGCCCGTTCT CAAGACCTGGATGCGATTTGGCGTGGTTTCTACATTGCAGGCGATCCAGCGCTGGCATACGGTTATGCGCAGGACCA GGAACCGGATGCTCGTGGTCGCATTCGTAATGGTGCGCTGCTGCGCGTATATGTGCCGCGTTCCAGCCTGCCGGGCT TCTACCGCACTAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGTGAAGTGGAACGTCTGATTGGTCATCCTCTGCCT CTGCGCCTGGATGCCATCACCGGCCCAGAGGAGGAGGGCGGTCGTCTGGAAACCATTCTGGGCTGGCCGCTGGCTGA ACGTACGGTCGTTATTCCGAGCGCGATTCCTACCGATCCTCGTAACGTTGGCGGCGATCTGGACCCATCTTCTATTC CAGATAAGGAGCAGGCAATCTCCGCGCTGCCGGATTATGCAAGCCAACCGGGTAAACCACCTCGTGAAGATCTGAAATAA
D4-AAA-D4-LR氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
MQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGYSYSIGYMAWFRQAPGKERAWVASRYTGDGGAVFDDAVKGRFTTSQESAGNTFDLQMDSLKPEDTAMYYCAAKGPGFGRWEYWGRGTQVTVSSAAAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGYSYSIGYMAWFRQAPGKERAWVASRYTGDGGAVFDDAVKGRFTTSQESAGNTFDLQMDSLKPEDTAMYYCAAKGPGFGRWEYWGRGTQVTVSSKLKASGGRHRQPRGWEQLGGGGGSPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQ LEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPR SSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDL DPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
D4-GGS-D4-LR核苷酸序列(SEQ ID NO:20)
ATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCCGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATACAGCTACAGTATTGGTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGAAAGGAGCGCGCGTGGGTCGCGTCTCGATATACTGGTGACGGTGGCGCAGTCTTTGACGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCCAAGAGAGTGCCGGGAACACGTTCGATTTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTATTGCGCAGCGAAAGGGCCCGGTTTCGGGCGGTGGGAGTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCCGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATACAGCTACAGTATTGGTTACATGGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGAAAGGAGCGCGCGTGGGTCGCGTCTCGATATACTGGTGACGGTGGCGCAGTCTTTGACGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCTCCCAAGAGAGTGCCGGGAACACGTTCGATTTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTATTGCGCAGCGAAAGGGCCCGGTTTCGGGCGGTGGGAGTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAAAGCTTAAAGCAAGCGGCGGTCGCCATCGCCAGCCG CGCGGCTGGGAACAGCTGGGCGGTGGCGGTGGCAGCCCCACCGGTGCCGAGTTCCTGGGCGACGGTGGCGATGTGTC CTTTAGCACCCGTGGTACCCAGAACTGGACGGTAGAGCGCCTGCTGCAGGCACATCGTCAGCTGGAAGAGCGTGGCT ATGTATTCGTTGGCTACCACGGCACTTTTCTGGAAGCAGCTCAGTCCATCGTGTTTGGTGGTGTCCGTGCCCGTTCT CAAGACCTGGATGCGATTTGGCGTGGTTTCTACATTGCAGGCGATCCAGCGCTGGCATACGGTTATGCGCAGGACCA GGAACCGGATGCTCGTGGTCGCATTCGTAATGGTGCGCTGCTGCGCGTATATGTGCCGCGTTCCAGCCTGCCGGGCT TCTACCGCACTAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGTGAAGTGGAACGTCTGATTGGTCATCCTCTGCCT CTGCGCCTGGATGCCATCACCGGCCCAGAGGAGGAGGGCGGTCGTCTGGAAACCATTCTGGGCTGGCCGCTGGCTGA ACGTACGGTCGTTATTCCGAGCGCGATTCCTACCGATCCTCGTAACGTTGGCGGCGATCTGGACCCATCTTCTATTC CAGATAAGGAGCAGGCAATCTCCGCGCTGCCGGATTATGCAAGCCAACCGGGTAAACCACCTCGTGAAGATCTGAAATAA
D4-GGS-D4-LR氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
MQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGYSYSIGYMAWFRQAPGKERAWVASRYTGDGGAVFDDAVKGRFTTSQESAGNTFDLQMDSLKPEDTAMYYCAAKGPGFGRWEYWGRGTQVTVSSGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGYSYSIGYMAWFRQAPGKERAWVASRYTGDGGAVFDDAVKGRFTTSQESAGNTFDLQMDSLKPEDTAMYYCAAKGPGFGRWEYWGRGTQVTVSSKLKASGGRHRQPRGWEQLGGGGGSPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQ LEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPR SSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDL DPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
生成和测试靶向GPC1的免疫毒素
HM2-LR免疫毒素由通过(G4S)3接头连接到HM2 VL结构域的HM2 VH结构域和偶联到VL结构域的截短假单胞菌外毒素A(LR)组成。D4-LR免疫毒素由与LR偶联的D4VHH单域抗体组成。两种免疫毒素的示意图显示在图12A中。HM2-LR和D4-LR的纯度和分子量见图12B。
使用Octet分析测试HM2-LR和D4-LR对GPC1的亲和力(图13A-13B)。结果表明，两种免疫毒素都保留了对GPC1的高亲和力，KD为6.9nM(HM2-LR)和6.3nM(D4-LR)。
还测试了免疫毒素在体外杀死GPC1阳性癌细胞的能力。孵育三天后，使用WST-8试剂对GPC1阳性细胞系H8、2B9和T3M4以及GPC1阴性细胞系A431进行细胞毒性测定。D4-LR和HM2-LR免疫毒素以14至31ng/ml范围内的IC50值有效杀死过表达GPC1的H8和2B9细胞系(图14A和14B)。然而，两种免疫毒素对天然胰腺癌细胞系T3M4表现出较差的细胞杀伤能力(图14C)，该细胞系具有相对较低的GPC1表达水平。两种免疫毒素都不能杀死GPC1阴性A431细胞(图14D)，表明免疫毒素对表达GPC1的细胞具有特异性。
为了增强D4免疫毒素的杀伤能力，产生并测试了两种二价D4免疫毒素(D4-AAA-D4-LR和D4-GGS-D4-LR)。两种D4-D4-LR免疫毒素的示意图显示在图15A中。这些免疫毒素的纯度和分子量显示在图15B中。
D4-D4-LR免疫毒素对GPC1的结合亲和力使用三种不同的测定法评价：Octet(图16A)、ELISA(图16B)和FACS分析(图16C)。结果表明，与D4-LR免疫毒素相比，免疫毒素表现出与GPC1结合的改善。
进行细胞毒性测定以确定D4-D4-LR免疫毒素杀死表达GPC1的肿瘤细胞的能力。对GPC1阳性(H8、2B9和T3M4)和阴性(A431)细胞系进行了检测。与D4-LR免疫毒素相比，二价D4免疫毒素对过表达GPC1的细胞系H8(图17A)和2B9(图17B)显示出相似的功效，并且对天然胰腺癌细胞系T3M4具有增强的细胞毒性(增加约5倍)(图17C)。所有免疫毒素对GPC1阴性细胞系A431几乎没有细胞杀伤能力(图17D)，表明免疫毒素的杀伤特异性。
在小鼠H8/A431皮下异种移植模型中测试了D4-LR、D4-AAA-D4-LR和HM2-LR免疫毒素对肿瘤生长的影响。五周龄的雌性无胸腺裸鼠在右背侧注射了5x106个细胞。在接种后第5、7、9、11、13、15、17、19和21天通过尾静脉注射D4-LR(5mg/kg)、D4-AAA-D4-LR(3mg/kg)或HM2-LR(5mg/kg)，共处理小鼠9次。每个实验组包含5只小鼠。每只小鼠的肿瘤体积和每个实验组的平均值显示分别在图18A和图18B中。实验处理期间小鼠的平均体重显示在图18C中。免疫毒素处理小鼠的存活曲线显示在图18D中。结果表明，用三种GPC1特异性免疫毒素中的任何一种进行处理都能显着降低肿瘤体积，同时对小鼠体重几乎没有影响。
鉴于本公开的原理可以应用于许多可能的实施方案，应当认识到，所示出的实施方案仅是示例并且不应被视为限制本公开的范围。相反，本公开的范围由所附权利要求书限定。
序列表
<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）
<120> 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法
<130> 4239-101892-02
<150> US 62/795,415
<151> 2019-01-22
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 1
gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt taacattaaa gacgactata tgcactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtga tactgaatat 180
gcctcgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtac tcgtagctcc 300
gtaggctact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽 (HM2 VH)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Ser Val Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 3
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 3
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cttatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagaac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggag ataaaa 336
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽 (HM2 VL)
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Arg
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 5
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ccggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggata cagctacagt attggttaca tggcctggtt ccgccaggcc 120
ccaggaaagg agcgcgcgtg ggtcgcgtct cgatatactg gtgacggtgg cgcagtcttt 180
gacgacgccg tgaagggccg attcaccacc tcccaagaga gtgccgggaa cacgttcgat 240
ttgcaaatgg acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actattgcgc agcgaaaggg 300
cccggtttcg ggcggtggga gtactggggc cgggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽 (D4 mAb)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Ile Gly
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Trp Val
35 40 45
Ala Ser Arg Tyr Thr Gly Asp Gly Gly Ala Val Phe Asp Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Gln Glu Ser Ala Gly Asn Thr Phe Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Gly Pro Gly Phe Gly Arg Trp Glu Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 8
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 10
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 12
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 13
<211> 335
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 14
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 14
atgcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc agcccggggg gtctctgaga 60
ctctcctgtg tagcctctgg atacagctac agtattggtt acatggcctg gttccgccag 120
gccccaggaa aggagcgcgc gtgggtcgcg tctcgatata ctggtgacgg tggcgcagtc 180
tttgacgacg ccgtgaaggg ccgattcacc acctcccaag agagtgccgg gaacacgttc 240
gatttgcaaa tggacagcct gaaacctgag gacactgcca tgtactattg cgcagcgaaa 300
gggcccggtt tcgggcggtg ggagtactgg ggccggggga cccaggtcac cgtctcctca 360
aagcttaaag caagcggcgg tcgccatcgc cagccgcgcg gctgggaaca gctgggcggt 420
ggcggtggca gccccaccgg tgccgagttc ctgggcgacg gtggcgatgt gtcctttagc 480
acccgtggta cccagaactg gacggtagag cgcctgctgc aggcacatcg tcagctggaa 540
gagcgtggct atgtattcgt tggctaccac ggcacttttc tggaagcagc tcagtccatc 600
gtgtttggtg gtgtccgtgc ccgttctcaa gacctggatg cgatttggcg tggtttctac 660
attgcaggcg atccagcgct ggcatacggt tatgcgcagg accaggaacc ggatgctcgt 720
ggtcgcattc gtaatggtgc gctgctgcgc gtatatgtgc cgcgttccag cctgccgggc 780
ttctaccgca ctagcctgac cctggccgcg ccggaggcgg cgggtgaagt ggaacgtctg 840
attggtcatc ctctgcctct gcgcctggat gccatcaccg gcccagagga ggagggcggt 900
cgtctggaaa ccattctggg ctggccgctg gctgaacgta cggtcgttat tccgagcgcg 960
attcctaccg atcctcgtaa cgttggcggc gatctggacc catcttctat tccagataag 1020
gagcaggcaa tctccgcgct gccggattat gcaagccaac cgggtaaacc acctcgtgaa 1080
gatctgaaat aa 1092
<210> 15
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 15
Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Ile
20 25 30
Gly Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Trp
35 40 45
Val Ala Ser Arg Tyr Thr Gly Asp Gly Gly Ala Val Phe Asp Asp Ala
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Gln Glu Ser Ala Gly Asn Thr Phe
65 70 75 80
Asp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Lys Gly Pro Gly Phe Gly Arg Trp Glu Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Lys Ala Ser Gly Gly Arg
115 120 125
His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser
145 150 155 160
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His
165 170 175
Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr
180 185 190
Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg
195 200 205
Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp
210 215 220
Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg
225 230 235 240
Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser
245 250 255
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu
260 265 270
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg
275 280 285
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr
290 295 300
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala
305 310 315 320
Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser
340 345 350
Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
355 360
<210> 16
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 16
atggaggttc agctgcagca gtctggggct gagcttgtga ggccaggggc ctcagtcaag 60
ttgtcctgca cagcttctgg ctttaacatt aaagacgact atatgcactg ggtgaagcag 120
aggcctgaac agggcctgga gtggattgga tggattgatc ctgagaatgg tgatactgaa 180
tatgcctcga agttccaggg caaggccact ataacagcag acacatcctc caacacagcc 240
tacctgcagc tcagcagcct gacatctgag gacactgccg tctattactg tactcgtagc 300
tccgtaggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcaggcgg aggcggatca 360
ggtggtggcg gatctggagg tggcggaagc gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc 420
ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta 480
cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag 540
ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt 600
ggatcaggga cttatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt 660
tatttctgct ctcaaagaac acatgttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggag 720
ataaaaaagc ttaaagcaag cggcggtcgc catcgccagc cgcgcggctg ggaacagctg 780
ggcggtggcg gtggcagccc caccggtgcc gagttcctgg gcgacggtgg cgatgtgtcc 840
tttagcaccc gtggtaccca gaactggacg gtagagcgcc tgctgcaggc acatcgtcag 900
ctggaagagc gtggctatgt attcgttggc taccacggca cttttctgga agcagctcag 960
tccatcgtgt ttggtggtgt ccgtgcccgt tctcaagacc tggatgcgat ttggcgtggt 1020
ttctacattg caggcgatcc agcgctggca tacggttatg cgcaggacca ggaaccggat 1080
gctcgtggtc gcattcgtaa tggtgcgctg ctgcgcgtat atgtgccgcg ttccagcctg 1140
ccgggcttct accgcactag cctgaccctg gccgcgccgg aggcggcggg tgaagtggaa 1200
cgtctgattg gtcatcctct gcctctgcgc ctggatgcca tcaccggccc agaggaggag 1260
ggcggtcgtc tggaaaccat tctgggctgg ccgctggctg aacgtacggt cgttattccg 1320
agcgcgattc ctaccgatcc tcgtaacgtt ggcggcgatc tggacccatc ttctattcca 1380
gataaggagc aggcaatctc cgcgctgccg gattatgcaa gccaaccggg taaaccacct 1440
cgtgaagatc tgaaataa 1458
<210> 17
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 17
Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp
20 25 30
Asp Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys
50 55 60
Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Arg Ser Ser Val Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser
130 135 140
Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser
210 215 220
Gln Arg Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Lys Leu Lys Ala Ser Gly Gly Arg His Arg Gln Pro Arg Gly
245 250 255
Trp Glu Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr Gly Ala Glu Phe
260 265 270
Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn
275 280 285
Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg
290 295 300
Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln
305 310 315 320
Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala
325 330 335
Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly
340 345 350
Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr
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Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly
405 410 415
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu
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450 455 460
Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro
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<210> 18
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 18
atgcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc agcccggggg gtctctgaga 60
ctctcctgtg tagcctctgg atacagctac agtattggtt acatggcctg gttccgccag 120
gccccaggaa aggagcgcgc gtgggtcgcg tctcgatata ctggtgacgg tggcgcagtc 180
tttgacgacg ccgtgaaggg ccgattcacc acctcccaag agagtgccgg gaacacgttc 240
gatttgcaaa tggacagcct gaaacctgag gacactgcca tgtactattg cgcagcgaaa 300
gggcccggtt tcgggcggtg ggagtactgg ggccggggga cccaggtcac cgtctcctca 360
gcggcggcgc aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tggtgcagcc cggggggtct 420
ctgagactct cctgtgtagc ctctggatac agctacagta ttggttacat ggcctggttc 480
cgccaggccc caggaaagga gcgcgcgtgg gtcgcgtctc gatatactgg tgacggtggc 540
gcagtctttg acgacgccgt gaagggccga ttcaccacct cccaagagag tgccgggaac 600
acgttcgatt tgcaaatgga cagcctgaaa cctgaggaca ctgccatgta ctattgcgca 660
gcgaaagggc ccggtttcgg gcggtgggag tactggggcc gggggaccca ggtcaccgtc 720
tcctcaaagc ttaaagcaag cggcggtcgc catcgccagc cgcgcggctg ggaacagctg 780
ggcggtggcg gtggcagccc caccggtgcc gagttcctgg gcgacggtgg cgatgtgtcc 840
tttagcaccc gtggtaccca gaactggacg gtagagcgcc tgctgcaggc acatcgtcag 900
ctggaagagc gtggctatgt attcgttggc taccacggca cttttctgga agcagctcag 960
tccatcgtgt ttggtggtgt ccgtgcccgt tctcaagacc tggatgcgat ttggcgtggt 1020
ttctacattg caggcgatcc agcgctggca tacggttatg cgcaggacca ggaaccggat 1080
gctcgtggtc gcattcgtaa tggtgcgctg ctgcgcgtat atgtgccgcg ttccagcctg 1140
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cgtctgattg gtcatcctct gcctctgcgc ctggatgcca tcaccggccc agaggaggag 1260
ggcggtcgtc tggaaaccat tctgggctgg ccgctggctg aacgtacggt cgttattccg 1320
agcgcgattc ctaccgatcc tcgtaacgtt ggcggcgatc tggacccatc ttctattcca 1380
gataaggagc aggcaatctc cgcgctgccg gattatgcaa gccaaccggg taaaccacct 1440
cgtgaagatc tgaaataa 1458
<210> 19
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 19
Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Ile
20 25 30
Gly Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Trp
35 40 45
Val Ala Ser Arg Tyr Thr Gly Asp Gly Gly Ala Val Phe Asp Asp Ala
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Gln Glu Ser Ala Gly Asn Thr Phe
65 70 75 80
Asp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Lys Gly Pro Gly Phe Gly Arg Trp Glu Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Ile Gly Tyr Met Ala Trp Phe
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Trp Val Ala Ser Arg Tyr Thr
165 170 175
Gly Asp Gly Gly Ala Val Phe Asp Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Thr Ser Gln Glu Ser Ala Gly Asn Thr Phe Asp Leu Gln Met Asp Ser
195 200 205
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Gly Pro
210 215 220
Gly Phe Gly Arg Trp Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Leu Lys Ala Ser Gly Gly Arg His Arg Gln Pro Arg Gly
245 250 255
Trp Glu Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr Gly Ala Glu Phe
260 265 270
Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn
275 280 285
Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg
290 295 300
Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln
305 310 315 320
Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala
325 330 335
Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly
340 345 350
Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr
370 375 380
Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly
405 410 415
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu
420 425 430
Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg
435 440 445
Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln
450 455 460
Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro
465 470 475 480
Arg Glu Asp Leu Lys
485
<210> 20
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 20
atgcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc agcccggggg gtctctgaga 60
ctctcctgtg tagcctctgg atacagctac agtattggtt acatggcctg gttccgccag 120
gccccaggaa aggagcgcgc gtgggtcgcg tctcgatata ctggtgacgg tggcgcagtc 180
tttgacgacg ccgtgaaggg ccgattcacc acctcccaag agagtgccgg gaacacgttc 240
gatttgcaaa tggacagcct gaaacctgag gacactgcca tgtactattg cgcagcgaaa 300
gggcccggtt tcgggcggtg ggagtactgg ggccggggga cccaggtcac cgtctcctca 360
ggcggcagcc aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tggtgcagcc cggggggtct 420
ctgagactct cctgtgtagc ctctggatac agctacagta ttggttacat ggcctggttc 480
cgccaggccc caggaaagga gcgcgcgtgg gtcgcgtctc gatatactgg tgacggtggc 540
gcagtctttg acgacgccgt gaagggccga ttcaccacct cccaagagag tgccgggaac 600
acgttcgatt tgcaaatgga cagcctgaaa cctgaggaca ctgccatgta ctattgcgca 660
gcgaaagggc ccggtttcgg gcggtgggag tactggggcc gggggaccca ggtcaccgtc 720
tcctcaaagc ttaaagcaag cggcggtcgc catcgccagc cgcgcggctg ggaacagctg 780
ggcggtggcg gtggcagccc caccggtgcc gagttcctgg gcgacggtgg cgatgtgtcc 840
tttagcaccc gtggtaccca gaactggacg gtagagcgcc tgctgcaggc acatcgtcag 900
ctggaagagc gtggctatgt attcgttggc taccacggca cttttctgga agcagctcag 960
tccatcgtgt ttggtggtgt ccgtgcccgt tctcaagacc tggatgcgat ttggcgtggt 1020
ttctacattg caggcgatcc agcgctggca tacggttatg cgcaggacca ggaaccggat 1080
gctcgtggtc gcattcgtaa tggtgcgctg ctgcgcgtat atgtgccgcg ttccagcctg 1140
ccgggcttct accgcactag cctgaccctg gccgcgccgg aggcggcggg tgaagtggaa 1200
cgtctgattg gtcatcctct gcctctgcgc ctggatgcca tcaccggccc agaggaggag 1260
ggcggtcgtc tggaaaccat tctgggctgg ccgctggctg aacgtacggt cgttattccg 1320
agcgcgattc ctaccgatcc tcgtaacgtt ggcggcgatc tggacccatc ttctattcca 1380
gataaggagc aggcaatctc cgcgctgccg gattatgcaa gccaaccggg taaaccacct 1440
cgtgaagatc tgaaataa 1458
<210> 21
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 21
Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Ile
20 25 30
Gly Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Trp
35 40 45
Val Ala Ser Arg Tyr Thr Gly Asp Gly Gly Ala Val Phe Asp Asp Ala
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Gln Glu Ser Ala Gly Asn Thr Phe
65 70 75 80
Asp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Lys Gly Pro Gly Phe Gly Arg Trp Glu Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Val Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Ile Gly Tyr Met Ala Trp Phe
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Trp Val Ala Ser Arg Tyr Thr
165 170 175
Gly Asp Gly Gly Ala Val Phe Asp Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Thr Ser Gln Glu Ser Ala Gly Asn Thr Phe Asp Leu Gln Met Asp Ser
195 200 205
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Gly Pro
210 215 220
Gly Phe Gly Arg Trp Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Leu Lys Ala Ser Gly Gly Arg His Arg Gln Pro Arg Gly
245 250 255
Trp Glu Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr Gly Ala Glu Phe
260 265 270
Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn
275 280 285
Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg
290 295 300
Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln
305 310 315 320
Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala
325 330 335
Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly
340 345 350
Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr
370 375 380
Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly
405 410 415
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu
420 425 430
Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg
435 440 445
Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln
450 455 460
Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro
465 470 475 480
Arg Glu Asp Leu Lys
485

Claims (69)

1.一种特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)的单克隆抗体，其中：
(i)所述单克隆抗体包括可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域，其中所述VH结构域包括SEQ ID NO:2的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3序列并且所述VL结构域包括SEQ IDNO:4的CDR1、CDR2和CDR3序列；或者
(ii)所述单克隆抗体为包括SEQ ID NO:6的CDR1、CDR2和CDR3序列的单域抗体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述CDR序列为采用Kabat、IMGT或Paratome编号方案或Kabat、IMGT和Paratome编号方案的组合确定的。
3.根据权利要求1(i)或权利要求2所述的单克隆抗体，其中所述VH结构域CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括：
SEQ ID NO:2的残基31-35、50-66和99-103；
SEQ ID NO:2的残基26-33、51-58和97-103；或
SEQ ID NO:2的残基27-35、47-61和97-103。
4.根据权利要求1(i)、权利要求2或权利要求3所述的单克隆抗体，其中所述VL结构域CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括：
SEQ ID NO:4的残基24-39、55-61和94-102；
SEQ ID NO:4的残基27-37、55-57和94-101；或
SEQ ID NO:4的残基28-39、51-61和94-102。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的单克隆抗体，其中：
所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2有至少90％同一性并且包括SEQ ID NO:2的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及
所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:4有至少90％同一性并且包括SEQ ID NO:4的CDR1、CDR2和CDR3序列。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的单克隆抗体，其中：
所述VH结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成；以及
所述VL结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体包括选自Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、单链可变片段(scFv)和二硫化物稳定的可变片段(dsFv)的抗原结合片段。
8.根据权利要求3-6中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体为IgG。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为小鼠抗体。
10.根据权利要求3-8中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为人源化抗体。
11.根据权利要求3-8中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为嵌合抗体。
12.根据权利要求1(ii)或权利要求2所述的单克隆抗体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列各自包括：
SEQ ID NO:6的残基31-35、50-66和99-109；
SEQ ID NO:6的残基26-33、51-58和97-108；或者
SEQ ID NO:6的残基27-33、47-61和97-108。
13.根据权利要求12所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的氨基酸序列与SEQ IDNO:6有至少90％同一性并且包括SEQ ID NO:6的CDR1、CDR2和CDR3序列。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的氨基酸序列包括或由SEQ ID NO:6组成。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为骆驼抗体。
16.根据权利要求12-14中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为人源化抗体。
17.根据权利要求12-14中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为嵌合抗体。
18.一种嵌合抗原受体(CAR)，包括权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体。
19.根据权利要求18所述的CAR，还包括铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导部分、信号传导结构域、或其任何组合。
20.根据权利要求19所述的CAR，其中所述铰链区包括CD8α铰链区。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的CAR，其中所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的CAR，其中所述共刺激信号传导部分包括4-1BB信号传导部分。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的CAR，其中所述信号传导结构域包括CD3ξ信号传导结构域。
24.一种分离的细胞，表达权利要求18-23中任一项所述的CAR。
25.根据权利要求24所述的分离的细胞，其为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或自然杀伤(NK)细胞。
26.一种免疫偶联物，包括权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体和效应分子。
27.根据权利要求26所述的免疫偶联物，其中所述效应分子为毒素。
28.根据权利要求27所述的免疫偶联物，其中所述毒素为假单胞菌外毒素或其变体。
29.根据权利要求28所述的免疫偶联物，其中所述假单胞菌外毒素变体为PE-LR。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物的氨基酸序列包括SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21。
31.根据权利要求26所述的免疫偶联物，其中所述效应分子为光子吸收剂或可检测标签。
32.根据权利要求31所述的免疫偶联物，其中所述可检测标签包括荧光团、酶或放射性同位素。
33.一种抗体药物偶联物(ADC)，包括与权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体偶联的药物。
34.根据权利要求33所述的ADC，其中所述药物为小分子。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的ADC，其中所述药物为抗微管剂、抗有丝***剂和/或细胞毒性剂。
36.一种多特异性抗体，包括权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体和至少一种另外的单克隆抗体或其抗原结合片段。
37.根据权利要求36所述的多特异性抗体，其为双特异性抗体。
38.根据权利要求36所述的多特异性抗体，其为三特异性抗体。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的多特异性抗体，其中所述至少一种另外的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合T细胞受体或自然杀伤(NK)活化受体的组分。
40.一种抗体-纳米颗粒偶联物，包括与权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体偶联的纳米颗粒。
41.根据权利要求40所述的抗体-纳米颗粒偶联物，其中所述纳米颗粒包括聚合物纳米颗粒、纳米球、纳米胶囊、脂质体、树枝状聚合物、聚合物胶束、或类脂质体。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的抗体-纳米颗粒偶联物，其中所述纳米颗粒包括细胞毒性剂。
43.一种融合蛋白，包括权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体和异源蛋白或肽。
44.根据权利要求43所述的融合蛋白，其中所述异源蛋白为Fc蛋白或亮氨酸拉链。
45.一种分离的核酸分子，编码权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体、权利要求18-23中任一项所述的CAR、权利要求26-29中任一项所述的免疫偶联物、权利要求36-39中任一项所述的多特异性抗体或权利要求43或权利要求44所述的融合蛋白。
46.根据权利要求45所述的分离的核酸分子，包括
SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其简并变体；
SEQ ID NO:3的核苷酸序列，或其简并变体；
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列，或它们的简并变体；或者
SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或其简并变体。
47.根据权利要求45所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码免疫偶联物并包括：
SEQ ID NO:14，或其简并变体；
SEQ ID NO:16，或其简并变体；
SEQ ID NO:18，或其简并变体；或者
SEQ ID NO:20，或其简并变体。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的分离的核酸分子，被可操作地连接至启动子。
49.一种载体，包括权利要求45-48中任一项所述的核酸分子。
50.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，以5'至3'方向包括：
编码第一粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)的核酸；
编码权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体的核酸；
编码胞外铰链区的核酸；
编码跨膜结构域的核酸；
编码胞内共刺激结构域的核酸；
编码胞内信号传导结构域的核酸；
编码自剪切2A肽的核酸；
编码第二GMCSFRss的核酸；以及
编码截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸。
51.根据权利要求50所述的核酸分子，还在编码所述第一GMCSFRss的核酸的5'包括人延长因子1α(EF1α)启动子序列。
52.一种载体，包括权利要求50或权利要求51所述的核酸分子。
53.根据权利要求52所述的载体，其中所述载体为慢病毒载体。
54.一种分离的宿主细胞，包括权利要求45-48、50和51中任一项所述的核酸分子，或权利要求49、52和53中任一项所述的载体。
55.一种组合物，包括药学上可接受的载体和权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体、权利要求18-23中任一项所述的CAR、权利要求24、25和54中任一项所述的分离的细胞、权利要求26-32中任一项所述的免疫偶联物、权利要求33-35中任一项所述的ADC、权利要求36-39中任一项所述的多特异性抗体、权利要求40-42中任一项所述的抗体-纳米颗粒偶联物或权利要求43或权利要求44所述的融合蛋白。
56.一种在受试者中治疗GPC1阳性癌症的方法，包括以权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体、权利要求18-23中任一项所述的CAR、权利要求24、25和54中任一项所述的分离的细胞、权利要求26-32中任一项所述的免疫偶联物、权利要求33-35中任一项所述的ADC、权利要求36-39中任一项所述的多特异性抗体、权利要求40-42中任一项所述的抗体-纳米颗粒偶联物、权利要求43或权利要求44所述的融合蛋白或权利要求55所述的组合物向所述受试者给药。
57.一种在受试者中抑制GPC1阳性癌症的肿瘤生长或转移的方法，包括以权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体、权利要求11-16中任一项所述的CAR、权利要求1-17中任一项所述的分离的细胞、权利要求18-23中任一项所述的CAR、权利要求24、25和54中任一项所述的分离的细胞、权利要求26-32中任一项所述的免疫偶联物、权利要求33-35中任一项所述的ADC、权利要求36-39中任一项所述的多特异性抗体、权利要求40-42中任一项所述的抗体-纳米颗粒偶联物、权利要求43或权利要求44所述的融合蛋白或权利要求55所述的组合物向所述受试者给药。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的方法，其中所述GPC1阳性癌症为实体瘤。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述GPC1阳性癌症为胰腺癌、结直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌或卵巢癌。
60.一种检测样品中GPC1的表达的方法，包括：
将所述样品与权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体接触；以及
检测所述抗体与所述样品的结合，由此检测所述样品中的GPC1的表达。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述单克隆抗体为直接标记的。
62.根据权利要求60所述的方法，还包括：
将所述单克隆抗体与检测抗体接触，并且
检测所述检测抗体与所述单克隆抗体的结合，由此检测所述样品中的GPC1的表达。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中所述样品自怀疑患有GPC1阳性癌症的受试者获得。
64.根据权利要求60-63中任一项所述的方法，其中所述样品为肿瘤组织活检。
65.一种将受试者诊断为患有GPC1阳性癌症的方法，包括：
将获得自所述受试者的样品与权利要求1-17中任一项所述的单克隆抗体接触；以及
检测所述抗体与所述样品的结合，由此将所述受试者诊断为患有GPC1阳性癌症。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述单克隆抗体为直接标记的。
67.根据权利要求65所述的方法，还包括：
将所述单克隆抗体与检测抗体接触，并且
检测所述检测抗体与所述单克隆抗体的结合，由此将所述受试者诊断为患有GPC1阳性癌症。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述样品为肿瘤组织活检。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的方法，其中所述GPC1阳性癌症为胰腺癌、结直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌或卵巢癌。
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