KR102193363B1

KR102193363B1 - 신규 살비아놀산 화합물 t, 그 제조 방법, 및 용도

Info

Publication number: KR102193363B1
Application number: KR1020167005423A
Authority: KR
Inventors: 슈이핑 조우; 웨이 리; 위엔펑 진; 싱싱 리; 샤오후이 마; 웨이 조우; 민 한; 슈밍 리
Original assignee: 타슬리 파마슈티컬 그룹 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2020-12-22
Also published as: ZA201601937B; KR20160048093A; RU2016106144A3; CN104418744A; WO2015027891A1; US10626077B2; CN104418744B; CA2932187C; JP6517206B2; AU2014314827A1; EP3040328A1; EP3040328A4; RU2668955C2; US20160200661A1; JP2016534119A; CA2932187A1; RU2016106144A; EP3040328B1; CA2921757A1; AU2014314827B2

Abstract

본 발명은 의약 분야, 특히 구조식 (I)로 나타내는 살비아놀산 T, 이의 키랄 이성질체, 제조 방법, 약학 조성물, 항산화제, 및 자유 라디칼 소거제 및 상기 화합물의 용도에 관한다.
[화학식]

Description

신규 살비아놀산 화합물 T, 그 제조 방법, 및 용도 {NEW SALVIANOLIC ACID COMPOUND T, PREPARATION METHOD THEREFOR, AND USE THEREOF}

본 발명은 의약 분야에 관한 것으로, 특히 신규 살비아놀산 화합물, 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)은 꿀풀과 샐비어(Salvia)속 식물의 뿌리로, 쓴 맛을 가지며, 약간 차며, 정체를 제거하여 통증을 멈추는 작용으로 심장과 간의 채널에 작용하고, 심장을 청소하여 혈액의 흐름을 활성화하고, 불안을 완화한다. 현대 약리학적 연구 결과, 단삼은 관상 동맥을 확장시키고, 미세 순환을 개선하고, 심장 보호 효과를 가지며, 혈소판 응집을 저해하고 제거하고, 신체의 무산소증 내성의 능력 및 항-간염, 항-종양, 및 항-바이러스 등의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 2001년에 Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College에서는 단삼 및 동일속 식물에 수용성 활성 성분으로 살비아놀산(salvianolic acid) A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, 리토스펌산(lithospermic acid), 로스마린시산(rosmarinci acid), 및 이소살비아놀산(isosalvianolic acid) C 등 13종의 페놀산 화합물이 존재함을 보고하였으며, 이들 13종의 페놀산 화합물의 약리 작용이 또한 개시되었다. 2002년에 레나 카시무 등은 살비아놀산 K의 화학 구조를 보고하였다(Rena. Kasimu et al., Journal of Xinjiang Medical University, 2002, Vol. 25(3)) 외국의 연구자들은 또한 단삼의 수용성 활성 성분에 대하여 연구하였다. 1999년에 조지 워싱턴 대학은 항 HIV 인테그라아제 및 기타 바이러스에 대한 13종의 살비아놀산 화학 구조의 효과에 관하여 미국 특허를 출원하고 최종적으로 허가를 받았는데, 이는 단삼이 큰 잠재력을 가지며 개발의 가치가 높은 약용 식물 자원임을 시사하는 것이다.

본 발명의 상기 살비아놀산 T는, 대규모 스크리닝 과정에서 단삼에 발견된 신규 화합물이다. 지금까지 이 화합물에 관련된 구조 및 약리 효과는 아직 보고된 바 없다.

본 발명의 목적은 구조식 (I)의 살비아놀산 화합물 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 살비아놀산 T의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 살비아놀산 T를 포함하는 약학 조성물, 항산화제, 자유 라디칼 소거제(free radical scavenger)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 급성 심근경색 및 급성 심근허혈을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 살비아놀산 T의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 폐섬유증 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 살비아놀산 T의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 항산화제의 제조에 있어서 살비아놀산 T의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 급성 심근경색, 급성 심근허혈, 또는 폐섬유증 질환을 치료하기 위해 살비아놀산 T를 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 노쇠(senility)를 지연하기 위해 살비아놀산 T를 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 항산화를 위해 살비아놀산 T를 사용하는 것이다.

구체적으로, 본 발명은 다음의 [1]-[45]에 관한 것이다.

[1] 구조식 (I)로 나타내는 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르.

[2] 하기 단계를 포함하는, 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T의 제조 방법:

(1a) 추출: 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 생약 또는 단삼과 기타 생약과의 혼합물을 물로 추출하고, 여액을 농축하여 물 추출물을 수득한 후, 알코올을 첨가하여 침전시키고, 상청액을 수득하고, 상기 상청액을 농축하여 알코올 추출물을 수득하는 단계;

(1b) 분리: 상기 단계 (1a)의 상기 알코올 추출물을 물에 희석하고, 매크로다공성 흡착 수지상에 적용하고, 상기 수지를 산성 수용액으로 세척하여 불순물을 제거한 후, 상기 수지를 에탄올로 용리하여 에탄올 용리액을 수득하고, 상기 에탄올 용리액을 농축하여 추출물을 수득하는 단계; 또는

상기 단계 (1a) 및 (1b)를 다음의 단계 (1)로 대체하고,

(1) 합성: 수용액에 살비아놀산 B를 용해하고, 가열하는 단계;

(2) 정제: 상기 단계 (1)에서 수득한 반응액의 pH를 산성으로 조정하거나, 또는 상기 단계 (1b)에서 수득한 상기 추출물을, 크로마토그래프 패킹으로 C18 역상 실리카겔 컬럼을, 용리액으로 아세토니트릴-물-포름산을 사용하여 등용매 용리 또는 경사 용리를 수행하는, 검출 파장 280nm인 분취 고압 액체 크로마토그래프에 의해 정제하고; 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상기 용리 과정을 모니터링하고, 살비아놀산 T를 함유하는 용리액을 수집하고; 농축하여 상기 살비아놀산 T를 수득하는 단계.

[3] 하기 단계를 포함하는, 상기 [1]의 살비아놀산 T의 키랄 이성질체의 제조 방법:

(1b) 분리: 상기 단계 (1a)에서 수득한 상기 알코올 추출물을 물에 희석하고, 매크로다공성 흡착 수지상에 적용하고, 상기 수지를 산성 수용액으로 세척하여 불순물을 제거한 후, 상기 수지를 에탄올로 용리하여 에탄올 용리액을 수득하고, 상기 에탄올 용리액을 농축하여 추출물을 수득하는 단계; 또는

상기 단계 (1a) 및 (1b)를 다음의 단계 (1)로 대체하고,

(2) 정제: 상기 단계 (1)에서 수득한 반응액의 pH를 산성으로 조정하거나, 또는 상기 단계 (1b)에서 수득한 상기 추출물을, 크로마토그래프 패킹으로 C18 역상 실리카겔 컬럼을, 용리액으로 아세토니트릴-물-포름산을 사용하여 등용매 용리를 수행하는, 검출 파장 280nm인 분취 고압 액체 크로마토그래프에 의해 정제하고; 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상기 용리 과정을 모니터링하고, 살비아놀산 T를 함유하는 용리액을 합치고; 농축하여 상기 살비아놀산 T를 수득하는 단계;

(3) 키랄 이성질체의 제조: 크로마토그래프 컬럼으로 역상 키랄 컬럼을, 용리액으로 아세토니트릴-물-포름산을 사용하여 등용매 용리 또는 경사 용리를 수행하는, 검출 파장 280nm인 분취 액체 크로마토그래프에 의해 상기 단계 (2)에서 수득한 상기 살비아놀산 T로부터 키랄 이성질체를 분리하고; 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상기 용리 과정을 모니터링하고, (S)-살비아놀산 T 및 (R)-살비아놀산 T를 함유하는 용리액을 별도로 수집하고, 동결 건조하여, (S)-살비아놀산 T 및 (R)-살비아놀산 T의 순수한 생성물을 수득하는 단계.

[4] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1a)에서, 상기 단삼 생약 또는 단삼 생약과 기타 생약과의 혼합물이 탕제 조각, 분쇄 입자 또는 분말이고, 상기 기타 생약이, 단삼과 상용가능한 삼칠(Radix Notoginseng), 황기(Radix Astragali), 또는 삼칠과 황기의 조합인 것인, 제조 방법.

[5] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1a)에서, 상기 물 추출물이, 상기 생약을, 상기 생약의 4-8배 부피의 물로 1.5-4시간 동안 달이고; 여과하고; 여액을 농축하여 상대 밀도 1.10-1.30(80℃)의 물 추출물을 수득하는 것에 의한 것인, 제조 방법.

[6] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1a)에서, 상기 물 추출물이, 상기 생약을, 상기 생약의 6배 부피의 물로 3시간 동안 달이고; 여과하고; 여액을 농축하여 상대 밀도 1.22 (80℃)의 물 추출물을 수득하는 것에 의한 것인, 제조 방법.

[7] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1a)에서, 상기 물 추출시에 알칼리 수용액을 사용하고, 상기 알칼리는 탄산수소나트륨 용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산수소칼륨 용액, 탄산칼륨 용액, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 제조 방법.

[8] 상기 [7]에 있어서, 상기 알칼리 수용액이 농도 0.3%-0.45% (w/v)의 탄산수소나트륨 수용액인 것인, 제조 방법.

[9] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1a)에서, 상기 알코올 침전이, 95% (v/v) 에탄올을 상기 물 추출물에 첨가하여 상기 에탄올 함량이50%-70% (v/v) (25℃)이 될 때까지 침전시키고, 8-36시간 동안 정치하고; 상청액을 수득하고, 감압 조건하에서 에탄올을 회수하고, 농축하여 상대 밀도1.25-1.5(60℃)의 알코올 추출물을 수득하는 것에 의한 것인, 제조 방법.

[10] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계(1a)에서, 상기 알코올 침전이, 95% (v/v) 에탄올을 상기 물 추출물에 첨가하여 상기 에탄올 함량이60% (v/v) (25℃)이 될 때까지 침전시키고, 24시간 동안 정치하고; 상청액을 수득하고, 감압 조건하에서 에탄올을 회수하고, 농축하여 상대 밀도1.32 (60℃)의 알코올 추출물을 수득하는 것에 의한 것인, 제조 방법.

[11] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1b)에서, 상기 매크로포러스 흡착 수지가 비극성 또는 약한 극성의 매크로다공성 흡착 수지인 것인, 제조 방법.

[12] 상기 [11]에 있어서, 상기 비극성 또는 약한 극성의 매크로다공성 흡착 수지가AB-8 타입, HPD450 타입, D101 타입, 또는 X5 타입의 매크로다공성 흡착 수지인 것인, 제조 방법.

[13] 상기 [12]에 있어서, 상기 비극성 매크로다공성 흡착 수지가 AB-8 타입인 것인, 제조 방법.

[14] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1b)에서, 상기 매크로포러스 흡착 수지에 대한 상기 단계 (1a)에 사용된 상기 생약의 중량비가5:1-1:1인 것인, 제조 방법.

[15] 상기 [14]에 있어서, 상기 매크로포러스 흡착 수지에 대한 상기 단계 (1a)에 사용된 상기 생약의 중량비가3:1인 것인, 제조 방법.

[16] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1b)에서, 상기 산성 수용액은, 염산 수용액, 황산 수용액, 질산 수용액, 및 초산 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이거나, 상기 수용액들의 조합이고; 상기 용액의 pH가 1.0-5.0으로 조정되고, 상기 산성 수용액을 사용하여 상기 용리액이 거의 무색이 될 때까지 세척하는 것인, 제조 방법.

[17] 상기 [16]에 있어서, 상기 산성 수용액이 염산 수용액이고; 상기 용액의 pH가 3.0으로 조정되는 것인, 제조 방법.

[18] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1b)에서, 4-10배의 50%-95% (v/v) 에탄올을 사용하여 상기 컬럼을 세척한 후, 상기 용리액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 추출물을 수득하는 것인, 제조 방법.

[19] 상기 [18]에 있어서, 5배의95% (v/v) 에탄올을 사용하여 상기 컬럼을 세척하는 것인, 제조 방법.

[20] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 반응 원료가 살비아놀산 B 또는 그의 염인 것인, 제조 방법.

[21] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 상기 수용액에 대한 상기 살비아놀산 B의 질량비가1:0.1-1:100000이고, 반응 온도는10-150℃이고, 반응 시간은 10분 내지 24시간인 것인, 제조 방법.

[22] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 상기 수용액에 대한 상기 살비아놀산 B의 질량비가1:200이고, 반응 온도는90℃이고, 반응 시간은 1시간인 것인, 제조 방법.

[23] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 상기 수용액이 산성 수용액, 중성 수용액 또는 알칼리 수용액인 것인, 제조 방법.

[24] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 상기 수용액이 알칼리 수용액이고, 상기 알칼리 수용액이 탄산수소나트륨 용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산수소칼륨 용액, 탄산칼륨 용액, 수산화나트륨 수용액, 및 수산화칼륨 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 제조 방법.

[25] 상기 [8]에 있어서, 상기 알칼리 수용액이 농도 0.05%-0.45% (w/v)의 탄산수소나트륨 용액인 것인, 제조 방법.

[26] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 염산 수용액, 황산 수용액, 질산 수용액 및 초산 수용액 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 상기 반응액의 pH를1.0-6.0로 조정하는 것인, 제조 방법.

[27] 상기 [26]에 있어서, 상기 염산 수용액을 사용하여 상기 반응액의 pH를 3.0으로 조정하는 것인, 제조 방법.

[28] 상기 [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 고압 액체 크로마토그래프는 동적 축 고압 액체 크로마토그래프이고, 상기 크로마토그래프 패킹은 C18 역상 실리카겔 컬럼이고, 상기 단계 (1)에서 pH가 조정된 상기 반응액 또는 상기 단계 (1b)에서 수득한 상기 추출물을 이동상으로 용해하고, 상기 이동상은 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(90:10:1)이고; 상기 용리액으로 상기 비율의 상기 이동상을 사용하고, 상기 용리는 등용매 용리 또는 경사 용리이고; 유속은 300mL/분이고; 상기 검출 파장은 280nm이고; 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간 21.2-24.0분의 성분을 수집하고, 건조될 때까지 농축하여, 살비아놀산 T 시료를 수득하는 것인, 제조 방법.

[29] 상기 [28]에 있어서, 상기 이동상이 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(50:50:1)인 것인, 제조 방법.

[30] 상기 [28]에 있어서, 상기 이동상이 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1 인 것인, 제조 방법.

[31] 상기 [28]에 있어서, 상기 용리가, 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1인 이동상을 사용해서 등용매 용리를 수행하는 것인, 제조 방법.

[32] 상기 [3]에 있어서, 상기 단계 (3)에서, 분취 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 키랄 이성질체의 분리를 수행하고, 상기 크로마토그래피 컬럼은 역상 컬럼이고, 상기 단계 (2)에서 수득한 상기 살비아놀산 T 시료을 이동상으로 용해하고, 상기 이동상은 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(90:10:1)이고; 상기 용리액으로 상기 비율의 상기 이동상을 사용하고, 상기 용리는 등용매 용리 또는 경사 용리이고; 유속은 25mL/분이고; 상기 검출 파장은 280nm이고; 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간 19.5-21.1분의 (S)-살비아놀산 T 성분, 체류 시간 23.9-25.3분의 (R)-살비아놀산 T 성분을 별도로 수집하고, 저온에서 농축한 후 동결 건조하여, (S)-살비아놀산 T의 순수한 생성물 및 (R)-살비아놀산 T의 순수한 생성물을 수득하는 것인, 제조 방법.

[33] 상기 [32]에 있어서, 상기 이동상이 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1인 것인, 제조 방법.

[34] 상기 [32]에 있어서, 상기 용리가 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1의 상기 이동상을 사용하여 등용매 용리를 수행하는 것인, 제조 방법.

[35] 상기 [32]에 있어서, 상기 저온이 10-40℃인 것인, 제조 방법.

[36] 상기 [32]에 있어서, 상기 저온이 30℃인 것인, 제조 방법.

[37] 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 포함하는 약학 조성물.

[38] 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 포함하는 항산화제.

[39] 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 포함하는 자유 라디칼 소거제.

[40] 급성 심근경색 및 급성 심근허혈을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르의 용도.

[41] 폐섬유증 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르의 용도.

[42] 항산화제의 제조에 있어서의 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르의 용도.

[43] 급성 심근경색, 급성 심근허혈, 또는 폐섬유증 질환을 치료하기 위해 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 사용하는 방법.

[44] 노쇠를 지연하기 위해 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 사용하는 방법.

[45] 항산화를 위해 상기 [1]의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 사용하는 방법.

도 1은 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의 고분별능 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 2는DMSO를 사용하는 500 MHz에서 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의1H-NMR 도표를 나타낸다.
도 3은 DMSO를 사용하는125 MHz에서 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의¹³C-NMR 도표를 나타낸다.
도 4는 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의DEPT 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의COSY 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의ROESY 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의HSQC 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의HMBC 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 살비아놀산 T, a: (R)-살비아놀산 T; b: (S)-살비아놀산 T의 CD 스펙트럼과 ECD 모의 스펙트럼간의 비교를 나타낸다.
도 11은 급성 심근경색에 대한 (S)-살비아놀산 T의 효과에 관한 연구에서 각 군의 심장 생검 도표를 나타낸다.
도 12는 TGF-β1에 의해 유도된 L929 세포 증식에 대한 (R)-살비아놀산 T 및 (S)-살비아놀산 T의 저해 효과를 나타낸다.

본 발명의 목적은, 구조식 (I)의 살비아놀산 화합물 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물, 및 가수분해성 에스테르를 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 신규의 페놀산 화합물은 물리화학적 특성, 고분별능 질량 분석법(QFT-ESI), 전자 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS), ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HMQC 및 CD (도 1-10)에 의해 동정되었다.

¹H-NMR（수소 스펙트럼）은, δ4.93 (1H, dd, 8.0, 4.5 Hz)에서의 산소에 부착된 메테닐 프로톤 시그널 1개; δ 6.85 (1H, d, 8.5 Hz), δ 7.31 (1H, d, 8.5 Hz), δ 7.41 (1H, d, 15.5 Hz ), δ 6.27 (1H, d, 15.5 Hz), δ 6.62 (1H, s), δ 6.63 (1H, d, 8.0 Hz), δ 6.47 (1H, d, 8.0 Hz), δ 6.44 (1H, d, 2.0 Hz), δ 6.55 (1H, d, 8.5 Hz), δ 6.43 (1H, dd, 8.5, 2.0 Hz), δ 7.69 (1H, s)에서의 방향족 프로톤 시그널 11개; δ 2.89 (2H, ddd, 14.0, 8.0, 4.5 Hz)에서의 지방족 프로톤 시그널 2개를 나타낸다.

¹³C-NMR(탄소 스펙트럼)은, δ 36.0에서의 지방족 탄소 시그널 1개, δ 72.8에서의 산소에 부착된 메테닐 탄소 시그널 1개, δ 166.0, δ 170.6, δ 168.4에서의 카르보닐 탄소 시그널 3개, 및 δ 123.7, δ 126.4, δ 142.9, δ 147.7, δ 115.0, δ 118.4, δ 143.7, δ 113.9, δ 127.1, δ 116.5, δ 143.9, δ 144.8, δ 115.5, δ 120.0, δ 126.0, δ 117.3, δ 144.8, δ 147.2, δ 115.3, δ 122.9, δ 141.1, δ 123.4에서의 이중 결합 탄소 시그널 22개를 포함해서 27개의 탄소 시그널을 나타낸다.

본 발명의 화합물의 2종의 이성질체의 특이적인 회전은 각각 -157.5°, 196.6°이다. 각각, C-8’ 절대 배열이 S/R 배열로 결정된 화합물의 분자 구조를 최적화한 다음, TD-SCF를 포함하는 BPV86 방법을 사용하여 6-31++G(2d, p) 기반 설정에서 계산하되, 계산 결과를 판독하고 본 발명의 화합물의 CD 스펙트럼과 비교하여, 최종 결과가 2가지 배열의 화합물의 계산 결과가 본 발명의 화합물의 실험적인 CD 스펙트럼 다이어그램과 기본적으로 중첩된다는 것을 밝힘으로써 본 발명의 화합물의 2종의 이성질체의 C-8’ 절대 배열이 각각 S 배열 및 R 배열인 것으로 결론지었다(도 10 참조). 본 발명의 화합물의 주요한 HMBC 상관관계는 다음과 같다:

본 발명의 화합물은, 신규한 살비아놀산(salvianolic acid) 화합물로서, “살비아놀산 T”로 명명된다.

추출 과정 중 본 화합물에 발생하는 형태 및 배열의 변화로 인해 화합물의 스펙트럼 데이터에 변화가 생길 수 있다. 하지만, 형태(conformation) 및 배열 변화에 의해 생성되는 다양한 종류의 이성질체들은 본 발명의 보호 범위 내에 포함될 것이다.

또한 본 발명의 살비아놀산 T는, 보편적인 기술적 지식 및 선행 기술에 따라, 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 살비아놀산 T의 약학적으로 허용가능한 염은, 무기 또는 유기 염기로부터 생성된 통상적이고 약학적으로 허용가능한 염(통상적인 염 형성 방법에 의해 생성됨)을 포함한다. 이러한 염의 적합한 예시는, 나트륨 염, 칼륨 염, 리튬 염, 마그네슘 염, 알루미늄 염, 칼슘 염, 아연 염 등, 또는 N,N′-디벤질 에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸 글루코세이민(glucoseimine), 프로카인 및 베르베린(berberine)과 반응시킴으로써 형성된 염을 포함한다. 본 발명의 제2 목적을 기술하기에 앞서, 후술되는 살비아놀산 T는 식 (I)로 나타내는 살비아놀산 T 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 포함한다.

본 발명의 살비아놀산 T는, 한 가지 종류 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합되어, 통상적으로 사용될 수 있는 약학적 조성물의 형태로 적절하게 투여된다. 가능하다면, 본 발명의 살비아놀산 T는, 바람직하게는 활성 성분이 약학적 제제로서 직접적으로 사용되도록 선택된 원료 의약품으로서 치료를 위해 투여될 수 있다. 다른 성분과의 상용성 및 환자에 대한 안전성의 관점에서, 담체는 약학적으로 허용가능해야 한다.

따라서, 본 발명은, 다른 치료적 및/또는 예방적 성분을 가지거나 가지지 않는, 본 발명의 살비아놀산 T 및 한 가지 종류 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 살비아놀산 T의 약학적 제제를 제공한다. 이러한 제제는 경구, (주사 또는 저장소형 정제와 같은 피하, 진피 내, 척추강 내, 저장소형과 같은 근육 내, 및 정맥 내를 포함하는) 비경구, 직장 및 국소(예를 들어, 설하)로 투여될 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 투여의 경로는, 환자의 질환에 좌우된다. 상기 약학적 제제는 단위 제제일 수 있고, 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 방법 모두는 본 발명의 살비아놀산 T를 한 가지 종류 이상의 어쥬번트 성분을 구성하는 담체와 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 말하면, 본 발명의 상기 제제는 다음과 같이 생성된다: 본 발명의 살비아놀산 T를 유체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체 또는 이 둘의 혼합물과 균일하고 긴밀하게(compactly) 조합한 다음, 필요한 경우, 생성물을 원하는 제제로 형성한다.

보통, 일련의 표준 약학적 기술에 기초하여, 살비아놀산 T 및 약학적 담체를 사용하여 본 발명의 약학적 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 기술은 혼합, 과립화 및 압축을 포함한다. 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 특징 및 형태는 혼합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 알려진 인자들에 좌우된다.

본 출원에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는, 조성물과 함께 투여될 수 있는 모든 종류의 유기 또는 무기 담체, 예를 들어, 고체 제제용으로 사용되는 부형제, 윤활제, 결합제, 붕해제 및 코팅제; 또는 착색제 및 감미제와 같은 약학적 첨가제를 지칭한다. 상기 약학적 담체는 당 알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨; 아미노산, 예를 들어, 염산 시스테인, 메티오닌, 글리신; 비타민 C; 디소듐 EDTA, EDTA 칼슘 소듐소듐 피로설페이트; 무기염, 예를 들어, 일가 알칼리 금속의 인산염, 아세트산염, 탄산염 또는 이들의 수용액; 염화 나트륨, 염화 칼륨; 메타중아황산 나트륨, 중아황산 나트륨, 티오황산 나트륨; 탄산 칼슘, 탄산수소칼슘; 스테아르산 염, 예를 들어, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘; 무기산, 예를 들어, 염산, 아세트산, 황산, 인산; 유기산 염, 예를 들어, 젖산 나트륨; 올리고당, 다당, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예를 들어, 말토스, 글루코스, 프룩토스, 덱스트란, 수크로스, 락토스, 사이클로덱스트린(예를 들어, β-사이클로덱스트린), 스타치; 규소 유도체; 알긴산 염; 젤라틴; 폴리비닐피롤리돈; 글리세롤; 아가; 계면활성제, 예를 들어, 트윈-80; 폴리에틸렌글리콜; 인지질 물질; 카올린; 탈크 분말 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

약학적 제제의 형태는 정제, 예를 들어, 당 코팅 정제, 필름 코팅 정제 및 장용 코팅 정제; 캡슐, 예를 들어, 경질 캡슐 및 연질 캡슐; 경구 용액; 구강 정제; 과립제; 끓는 물에 용해한 후 섭취하는 과립제; 환제(pill)`; 분말제; 페이스트제; 펠렛제; 현탁제; 산제; 액제; 주사제; 좌제; 페이스트제, 예를 들어, 연고 및 고약; 크림제; 분무제; 점적제 및 패치제를 포함하는 임의의 약학적으로 허용가능한 투여 형태일 수 있다. 바람직하게, 제제는 경구 투여 형태, 예를 들어 캡슐, 정제, 경구 용액, 과립제, 알약, 분말제, 펠렛제 및 페이스트제이고; 주사제, 예를 들어, 주사용 분말, 주사제 및 수액 등의 형태이다. 가장 바람직하게, 제제는 정제의 형태이다.

상기 경구 제제는 통상적으로 사용되는 부형제, 결합제, 증량제, 희석제, 정제 압축제, 운활제, 붕해제, 착색제, 향미제 및 습윤제를 함유할 수 있고, 필요한 경우, 정제는 코팅될 수 있다.

상기 부형제의 바람직한 예는 락토스, D-만니톨, D-소르비톨, 스타치, 예를 들어, α-스타치, 덱스트린, 결정성 셀룰로오스, 저치환 하이드록시프로필 셀룰로오스, 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 아라비아 고무, 아밀로펙틴, 경질 무수 규산, 합성 알루미늄 실리케이트 또는 마그네슘 알루미늄 실리케이트 등을 포함한다.

상기 윤활제의 바람직한 예시는 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 탈크 분말 및 실리카 겔 등을 포함한다.

상기 결합제의 바람직한 예시는 α-스타치, 수크로스, 젤라틴, 아라비아 고무, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 결정성 셀룰로오스, 자당, D-만니톨, 트레할로스, 덱스트린, 아밀로펙틴, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 피롤리돈 등을 포함한다.

상기 붕해제의 바람직한 예시는 락토오스, 자당, 스타치, 카복시메틸 셀룰로오스, 칼슘 카복시메틸 셀룰로오스, 아미노알킬 소듐, 소듐 카복시메틸 스타치, 경질 무수 규산, 저치환 하이드록시프로필 셀룰로오스 등을 포함한다.

상기 코팅제의 바람직한 예시는 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올 등을 포함한다.

상기 착색제의 바람직한 예시는 수용성 식용 타트라진 착색료(식용 착색료, 예를 들어 식용 적색 제2호 및 제3호, 식용 황색 제4호 및 제5호, 식용 청색 제1호 및 제2호); 불수용성 레이크 안료(예를 들어, 전술된 수용성 식용 타트라진 착색료의 알루미늄 염) 및 천연 착색료(예를 들어, β-카로틴, 엽록소 및 철단) 등을 포함한다.

상기 감미제의 바람직한 예시는 사카린 소듐, 글리시레틴산, 아스파탐 및 스테비오시드 등을 포함한다.

정제를 제조하기 위한 통상적인 방법은 본 발명의 살비아놀산 T를 한 종류 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합한 후, 압축하거나 성형하는 단계를 포함한다.

본 발명의 살비아놀산 T는, 또한, 경구 액체 제제, 예를 들어 수용성 또는 지용성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 등으로 제조될 수 있다. 본 발명의 살비아놀산 T는, 또한, 사용 전에 물 또는 다른 적합한 담체와 재혼합되는 건조 생성물로 제조될 수 있다. 이러한 종류의 액체 제제는 현탁제, 예를 들어 소르비톨 시럽, 메틸셀룰로오스, 글루코스/시럽, 젤라틴, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 겔 또는 수소첨가 식용 지방; 유화제, 예를 들어 레시틴, 소르비탄 모노올리에이트 또는 아라비아 고무; 비수용성 담체(식용 오일을 포함함), 예를 들어 아몬드유, 분획화된 코코넛유, 버터성 에스테르, 프로필렌 글리콜 또는 에탄올; 뿐만 아니라 보존제, 예를 들어 메틸파라벤, 니파솔 또는 소르브산을 포함하는 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다.

비경구로 투여되는 제제는 수용성 및 불수용성 멸균 주사제(이러한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 등장제 등을 함유할 수 있음); 및 수용성 및 불수용성 멸균 현탁액(이러한 제제는 현탁제 및 점증제를 함유할 수 있음)을 포함한다. 이러한 제제는 단일 투여 또는 다중 투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 보존될 수 있는데, 동결 건조(동결감압건조) 조건 하에 저장되고, 이는 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수에 사용 전에 재용해된다.

직장으로 투여되는 제제는 통상적인 좌제 기재, 예를 들어, 코코아 버터, 스테아르산 또는 기타 글리세라이드 또는 에틸렌 글리콜을 함유하는 좌제일 수 있다.

구강 국소로 투여되는 제제, 예를 들어, 협측 또는 설하로 투여되는 제제는 구내정(troch)(활성 성분이 향미 기재, 예를 들어 수크로스 및 아라비아 고무 내에 포매됨); 또한 드롭스(pastille)(활성 성분이 기재, 예를 들어 젤라틴 및 글리세롤, 또는 수크로스 및 아라비아 고무 내에 포매됨)을 포함한다.

본 발명의 살비아놀산 T는, 또한, 저장소형 제제로 제조될 수 있는데, 이러한 지속 방출 제제는 이식(예를 들어, 피하 또는 근육 내 이식) 또는 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 살비아놀산 T는 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능한 오일 내 에멀젼) 또는 이온 교환 수지를 이용하여 제조되거나 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로 제조될 수 있다.

통상적인 기술적 지식 및 선행 기술에 따르면, 본 발명에 관련된 치료는 일정한 질환 또는 증상의 치료 및 예방을 포함한다. 그 외에, 본 발명의 살비아놀산 T의 치료적 유효량은 질환의 성질, 및 환자의 개별적인 상태에 좌우되거나, 의사의 권고에 따른다. 일반적으로, 성인에 대한 치료적 유효량은 하루에 0.02~5000 mg, 바람직하게는 하루에 1~1500 mg의 범위 이내이다. 이러한 양은 단일 투여량 또는 다중 용량일 수 있으며, 이는 환자에 의해 적절한 간격, 예를 들어, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회 이상으로 섭취될 수 있다. 본 발명의 상기 제제는, 정제 및 캡슐의 경우, 0.1~99 wt%, 바람직하게는 30~95 wt%; 그리고 액체 제제의 경우, 바람직하게는 3~50 wt%의 활성 성분을 포함한다.

제2의 목적으로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 상기 살비아놀산 T의 제조 방법에 관한다:

상기 단계 (1a) 및 (1b)를 다음의 단계 (1)로 대체하고,

(2) 정제: 상기 단계 (1)에서 수득한 반응액의 pH를 산성으로 조정하거나, 또는 상기 단계 (1b)에서 수득한 상기 추출물을, 크로마토그래프 패킹으로 C18 역상 실리카겔 컬럼을, 용리액으로 아세토니트릴-물-포름산을 사용하여 등용매 용리(isocratic elution) 또는 경사 용리(gradient elution)를 수행하는, 검출 파장 280nm인 분취(preparative) 고압 액체 크로마토그래프에 의해 정제하고; 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상기 용리 과정을 모니터링하고, 살비아놀산 T를 함유하는 용리액을 수집하고; 농축하여 상기 살비아놀산 T를 수득하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 상기 살비아놀산 T의 키랄 이성질체의 제조 방법에 관한다:

상기 단계 (1a) 및 (1b)를 다음의 단계 (1)로 대체하고,

상기 단계 (1a)에서, 상기 단삼 생약 또는 단삼 생약과 기타 생약과의 혼합물은 탕제 조각(decoction piece), 분쇄 입자(crushed particle) 또는 분말이고, 바람직하게는, 탕제 조각이며; 상기 기타 생약은 단삼과 상용가능한 것으로 당업자에게 잘 알려진 중국 생약일 수 잇으며, 바람직하게는, 삼칠(Radix Notoginseng), 황기(Radix Astragali), 또는 삼칠과 황기의 조합이다.

상기 단계 (1a)에서, 상기 물 추출물은, 상기 생약을, 상기 생약의 4-8배 부피의 물로 1.5-4시간 동안, 바람직하게는 3시간 동안 달이고; 여과하고; 여액을 농축하여 상대 밀도 1.10-1.30(80℃), 바람직하게는1.22(80℃)의 물 추출물을 수득하는 것에 의한다. 추출 효율을 개선하고 페놀산 물질(성분)을 염화하기 위해, 상기 물 추출시에 알칼리 수용액을 사용하는데, 상기 알칼리는 탄산수소나트륨 용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산수소칼륨 용액, 탄산칼륨 용액, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이며, 바람직하게는, 농도 0.3%-0.45% (w/v)의 탄산수소나트륨 수용액이다.

상기 단계 (1a)에서, 상기 알코올 침전은, 95% (v/v) 에탄올을 상기 물 추출물에 첨가하여 상기 에탄올 함량이50%-70% (v/v) (25℃), 바람직하게는60% (v/v) (25℃)이 될 때까지 침전시키고, 8-36시간 동안, 바람직하게는 24시간 동안 정치하고; 상청액을 수득하고, 감압 조건하에서 에탄올을 회수하고, 농축하여 상대 밀도1.25-1.5(60℃)의 알코올 추출물, 바람직하게는 상대 밀도1.32 (60℃)의 알코올 추출물을 수득하는 것에 의한다.

상기 단계 (1b)에서, 상기 매크로포러스 흡착 수지는 비극성 또는 약한 극성의 매크로다공성 흡착 수지로, AB-8 타입, HPD450 타입, D101 타입, 또는 X5 타입의 매크로다공성 흡착 수지로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 AB-8 타입이고; 상기 단계 (1b)에서, 상기 매크로포러스 흡착 수지에 대한 상기 생약의 중량비가5:1-1:1, 바람직하게는 3:1이고; 상기 산성 수용액은, 염산 수용액, 황산 수용액, 질산 수용액, 및 초산 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이거나, 상기 수용액들의 조합, 바람직하게는 염산 수용액이고; 상기 용액의 pH가 1.0-5.0, 바람직하게는 3.0으로 조정되고; 상기 산성 수용액을 사용하여 상기 용리액이 거의 무색이 될 때까지 세척한다. 그 후, 4-10배의 50%-95% (v/v) 에탄올, 바람직하게는5배의95% (v/v) 에탄올을 사용하여 상기 컬럼을 세척하고; 상기 용리액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 추출물을 수득한다.

상기 단계 (1)에서, 반응 원료는 살비아놀산 B 또는 그의 염이다.

상기 단계 (1)에서, 상기 수용액에 대한 상기 살비아놀산 B의 질량비는1:0.1-1:100000, 바람직하게는 1:200이고, 반응 온도는10-150℃, 바람직하게는 90℃이고, 반응 시간은 10분 내지 24시간, 바람지하게는 1시간이다.

상기 단계 (1)에서, 상기 수용액은 산성 수용액, 중성 수용액 또는 알칼리 수용액, 바람직하게는 알칼리 수용액이고, 상기 알칼리 수용액은 탄산수소나트륨 용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산수소칼륨 용액, 탄산칼륨 용액, 수산화나트륨 수용액, 및 수산화칼륨 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이며, 더욱 바람직하게는, 상기 알칼리 수용액이 농도 0.05%-0.45% (w/v)의 탄산수소나트륨 용액이다.

상기 단계 (2)에서, 염산 수용액, 황산 수용액, 질산 수용액 및 초산 수용액 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 상기 반응액의 pH를1.0-6.0으로 조정하고, 바람직하게는 상기 염산 수용액을 사용하여 상기 반응액의 pH를 3.0으로 조정한다.

상기 단계 (2)에서, 상기 고압 액체 크로마토그래프는프랑스 NOVASEP LC80-600과 같은 동적 축 고압 액체 크로마토그래프이고, 바람직하게 상기 크로마토그래프 패킹은 C18 역상 실리카겔 컬럼(10 μm，YMC Company）이고, 상기 단계 (1b)에서 수득한 상기 추출물을 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(90:10:1)), 바람직하게는 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(50:50:1), 더욱 바람직하게는 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1으로 용해하고; 상기 용리액으로 상기 비율의 상기 이동상을 사용하고, 상기 용리는 등용매 용리 또는 경사 용리, 바람직하게는 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1인 이동상을 사용하는 등용매 용리이고; 유속은 300mL/분이고; 상기 검출 파장은 280nm이고; 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간 21.2-24.0분의 성분을 수집하고, 건조될 때까지 농축하여, 살비아놀산 T 시료를 수득한다.

상기 단계 (3)에서, Waters Prep 400분취 액체 크로마토그래프를 사용하여 상기 키랄 이성질체의 분리를 수행하고, 상기 크로마토그래프 컬럼은CHIRALCEL^® OD-RH 역상 컬럼(250×20 mm, 5 μm), 상기 단계 (2)에서 수득한 상기 살비아놀산 T 시료를 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(90:10:1)), 바람직하게는 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1으로 용해하고; 상기 용리액으로 상기 비율의 상기 이동상을 사용하고, 상기 용리는 등용매 용리 또는 경사 용리, 바람직하게는 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1인 이동상을 사용하는 등용매 용리이고; 유속은 25mL/분이고; 상기 검출 파장은 280nm이고; 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간 19.5-21.1분의 (S)-살비아놀산 T 성분, 체류 시간 23.9-25.3분의 (R)-살비아놀산 T 성분을 별도로 수집하고, 저온(10-40℃, 바람직하게는 30℃)에서 농축한 후 동결 건조하여, (S)-살비아놀산 T의 순수한 생성물 및 (R)-살비아놀산 T의 순수한 생성물을 수득한다.

본 발명의 약동력학 시험 결과로부터, 본 발명의 살비아놀산 T가 급성 심근경색 및 급성 심근허혈의 예방 활성, 우수한 자유 라디칼 소거 활성, 및 환원력, 폐섬유증 치료 활성을 가진다는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명은 이하에 관한다:

상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 포함하는 항산화제, 자유 라디칼 소거제.

급성 심근경색 및 급성 심근허혈을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르의 용도.

폐섬유증 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르의 용도.

항산화제의 제조에 있어서의 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르의 용도.

급성 심근경색, 급성 심근허혈, 또는 폐섬유증 질환을 치료하기 위해 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 사용하는 방법.

노쇠를 지연하기 위해 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 사용하는 방법.

항산화를 위해 상기 살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 키랄 이성질체, 용매화물 및 가수분해성 에스테르를 사용하는 방법.

실시예

본 발명의 기술적인 제안을 다음의 제조예들 및 실험예들을 통해 더 예시한다. 그러나, 본 발명의 보호 범위는 이러한 제조예들 및 실험예들로 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다.

제조예 1 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 제조

단삼(Salvia miltiorrhiza) 탕제 조각(decoction piece)을 한방 약탕기에 넣었고, 단삼 탕제 조각의 품질의 6배의 0.3%(w/v) 탄산수소나트륨을 함유하는 물을 첨가하였고, 2시간 동안 달이고, 여과하고, 여액(filtrate)을 농축하여 1.22의 상대 밀도를 가지는 물 추출물을 수득하였다(80℃).

95%(v/v) 에탄올을 위의 추출물에 첨가하여 최종 에탄올 함량이 60%(v/v)가 될 때까지 침전을 수행하고(25℃), 24시간 동안 정치(standing)하였고; 상청액을 수득하고 감압 조건 하에 농축하여 1.37의 상대 밀도를 가지는 에탄올 추출물을 수득하였다(60℃).

위의 에탄올 추출물을 물에 용해한 다음, AB-8 매크로포러스(macroporous) 흡착 수지 컬럼에 적용하였고, 3.0의 pH 값을 가지는 산성 수용액을 사용하여 용리액이 거의 무색이 될 때까지 컬럼을 세척하였고, 그런 다음, 컬럼의 5배의 부피를 가지는 95%(v/v) 에탄올을 사용하여 용리하였고, 용리액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 추출물을 수득하였다. 이전 단계에서 수득한 추출물을 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1)에 용해하였고, 정제를 위해 프랑스 NOVASEP LC80-600 동적 축 고압 액체 크로마토그래프(dynamic axial high pressure liquid chromatograph)를 사용하되, 크로마토그래프 패킹은 C18 역상 실리카 겔 컬럼（10 μm，YMC Company）이었고, 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1를 등용매 용리를 위해 사용하였고; 유속은 300 mL/분이었고; 검출 파장은 280 nm였다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간이 21.2~24.0분인 성분을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 건조상태까지 농축하여, 살비아놀산 T 시료를 수득하였다.

위의 살비아놀산 T 시료를 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1)에 용해하였고, 키랄 이성질체 분리를 위해 분취 액체 크로마토그래프를 사용하되, 크로마토그래피 컬럼은 CHIRALCEL^® OD-RH 역상 컬럼(250×20 mm, 5 μm)이었고, 등용매 용리를 위해 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1를 사용하였고; 유속은 25 mL/분이었고; 검출 파장은 280 nm였다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 용리 과정을 모니터링하고, 19.5~21.1분의 체류 시간을 가지는 (S)-살비아놀산 T 성분, 23.9~25.3분의 체류 시간을 가지는 (R)-살비아놀산 T 성분을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 30℃에서 용리액을 농축한 다음 동결 건조하여 (S)-살비아놀산 T 순수 생성물 및 (R)-살비아놀산 T 순수 생성물을 수득하였다.

고분해능 질량 분석계에 의해 제공된 (S)-살비아놀산 T의 준 분자 이온 피크(quasi-molecular ion peak)는 m/z=537.1033이었고; (R)-살비아놀산 T의 준 분자 이온 피크는 [M-H]- m/z 537.1034였다.

(S)-살비아놀산 T 및 (R)-살비아놀산 T의 핵 자기 공명 스펙트럼 데이터의 특성을 아래의 표에 나타내었다:

제조예 2 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 제조

단삼(Salvia miltiorrhiza) 및 삼칠(Radix Notoginseng) 탕제 조각을 한방 약탕기에 넣었고, 단삼 및 삼칠 탕제 조각의 부피의 4배의 0.45%(w/v) 탄산수소나트륨을 함유하는 물을 첨가하였고, 2시간 동안 달이고, 여과하고, 여과물을 농축하여 1.25의 상대 밀도를 가지는 물 추출물을 수득하였다(80℃).

95%(v/v) 에탄올을 위의 물 추출물에 첨가하여 최종 에탄올 함량이 65%(v/v)가 될 때까지 침전을 수행하고(25℃), 12시간 동안 정치하였고, 상청액을 수득하고 감압 조건 하에 농축하여 1.28의 상대 밀도를 가지는 에탄올 추출물을 수득하였다(60℃).

위의 에탄올 추출물을 물에 용해한 다음, AB-8 매크로포러스 흡착 수지 컬럼에 적용하였고, 2.5의 pH 값을 가지는 산성 수용액을 사용하여 용리액이 거의 무색이 될 때까지 컬럼을 세척하였고, 그런 다음, 컬럼의 4배의 부피를 가지는 95%(v/v) 에탄올을 사용하여 용리하였고, 용리액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 추출물을 수득하였다.

이전 단계에서 수득한 추출물을 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1)에 용해하였고, 정제를 위해 프랑스 NOVASEP LC80-600 동적 축 고압 액체 크로마토그래프를 사용하되, 크로마토그래프 패킹은 C18 역상 실리카 겔（10 μm，YMC Company）이었고, 선형 구배 용리를 위해 다음의 조건을 사용하였다: 0분에서 60분까지 아세토니트릴:물:포름산(부피비)을 15:85:1에서 20:80:1로 변화시켰다; 유속: 300 mL/분; 검출 파장: 280 nm. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간이 29.5~32.1분인 성분을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 건조상태까지 농축하여, 살비아놀산 T 시료를 수득하였다.

위의 살비아놀산 T 시료를 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1)에 용해하였고, 키랄 이성질체 분리를 위해 Waters Prep 400 분취 액체 크로마토그래프를 사용하되, 크로마토그래피 컬럼은 CHIRALCEL^® OD-RH 역상 컬럼(250×20 mm, 5 μm)이었고, 선형 구배 용리를 위해 다음의 조건을 사용하였다: 0분에서부터 45분까지 아세토니트릴:물:포름산(부피비)을 17:83:1에서 22:78:1로 선형으로 변화시켰다; 유속: 20 mL/분, 검출 파장: 280 nm. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 용리 과정을 모니터링하고, 25.2~27.1분의 체류 시간을 가지는 (S)-살비아놀산 T 성분, 32.4~34.2분의 체류 시간을 가지는 (R)-살비아놀산 T을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 30℃에서 용리액을 농축한 다음, 동결 건조하여 (S)-살비아놀산 T 순수 생성물 및 (R)-살비아놀산 T 순수 생성물을 수득하였다.

고분해능 질량 분석계에 의해 제공된 (S)-살비아놀산 T의 준 분자 이온 피크는 m/z=537.1035였고; (R)-살비아놀산 T의 준 분자 이온 피크는 [M-H]- m/z 537.1034였다.

제조예 3 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 제조

살비아놀산 B를 취하여, 살비아놀산 B의 200배(질량비)의 0.3%(w/v)의 탄산수소나트륨을 함유하는 물에 용해하여, 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 90℃에서 1시간 동안 환류하였다.

반응 후, 0.1 mol/L의 염산 수용액을 사용하여 pH를 3.0으로 조정한 다음, 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1)에 용해하였고, 정제를 위해 프랑스 NOVASEP LC80-600 동적 축 고압 액체 크로마토그래프를 사용하되, 크로마토그래프 패킹은 C18 역상 실리카 겔(10 μm, YMC Company)이었고, 등용매 용리를 위해 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1을 사용하였고; 0분에서부터 60분까지 아세토니트릴:물:포름산(부피비)을 15:85:1에서 20:80:1로 변화시켰고; 유속은 300 mL/분이었고, 검출 파장은 280 nm였다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간이 21.2~24.0분인 성분을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 건조상태까지 농축해서, 살비아놀산 T 시료를 수득하였다.

위의 살비아놀산 T 시료를 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1)에 용해하였고, 키랄 이성질체 분리를 위해 Waters Prep 400 분취 액체 크로마토그래프를 사용하되, 크로마토그래프 컬럼은 CHIRALCEL^® OD-RH 역상 컬럼(250×20 mm, 5 μm)이었고, 등용매 용리를 위해 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1을 사용하였고; 유속은 25 mL/분이었고; 검출 파장은 280 nm였다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 용리 과정을 모니터링하고, 19.5~21.1분의 체류 시간을 가지는 (S)-살비아놀산 T 성분, 23.9~25.3분의 체류 시간을 가지는 (R)-살비아놀산 T 성분을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 30℃에서 용리액을 농축한 다음, 동결 건조하여 (S)-살비아놀산 T 순수 생성물 및 (R)-살비아놀산 T 순수 생성물을 수득하였다.

제조예 4 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 제조

마그네슘 살비아놀산 B 염을 수득하였고, 마그네슘 살비아놀산 B 염의 300배(질량비)의 0.05%(w/v)의 탄산수소나트륨을 함유하는 물에 용해하여, 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 90℃에서 2시간 동안 환류하였다.

반응 후, 0.1 mol/L의 염산 수용액을 사용하여 pH를 3.0으로 조정한 다음, 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=15:85:1)에 용해하였고, 정제를 위해 프랑스 NOVASEP LC80-600 동적 축 고압 액체 크로마토그래프를 사용하되, 크로마토그래프 패킹은 C18 역상 실리카 겔(10 μm, YMC Company)이고, 선형 구배 용리를 위해 다음의 조건을 사용하였다: 0분에서부터 60분까지 아세토니트릴:물:포름산(부피비)을 15:85:1에서 20:80:1로 변화시켰다; 유속: 250 mL/분, 검출 파장: 280 nm. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간이 29.5~32.1분인 성분을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 건조상태까지 농축해서, 살비아놀산 T 시료를 수득했다.

위의 살비아놀산 T 시료를 이동상(아세토니트릴:물:포름산(부피비)=17:83:1)에 용해하였고, 키랄 이성질체 분리를 위해 Waters Prep 400 분취 액체 크로마토그래프를 사용하였는데, 크로마토그래피 컬럼은 CHIRALCEL^® OD-RH 역상 컬럼(250×20 mm, 5 μm)이었고, 선형 구배 용리를 위해 다음의 조건을 사용하였다: 0분에서부터 45분까지 아세토니트릴:물:포름산(부피비)을 17:83:1에서 22:78:1로 선형으로 변화시켰다; 유속: 20 mL/분, 검출 파장: 280 nm. 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 용리 과정의 모니터링, 25.2~27.1분의 체류 시간을 가지는 (S)-살비아놀산 T 성분, 32.4~34.2분의 체류 시간을 가지는 (R)-살비아놀산 T 성분을 수집하고, 회전식 증발기에 의해 30℃에서 용리액을 농축한 다음, 동결 건조하여 (S)-살비아놀산 T 순수 생성물 및 (R)-살비아놀산 T 순수 생성물을 수득하였다.

제형예 1 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 정제 제조

제제(조성):

상기 제제를 1000개의 정제로 제조하였다. .

제조 과정:

1. 과립화

살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T 및 제형 내에 열거된 기타 어쥬번트를 각각 100-메쉬 체로 체질하였다. 제형 투여량에 따라, 살비아놀산 T, 아비셀, 스타치 및 소듐 카복시메틸 스타치를, 등량을 점차적으로 증가시키는 방법(equivalent progressively increasing method)에 따라 잘 혼합하였고, 적합한 양의 5%(w/v) PVP 무수 에탄올을 연질 물질을 생성하기 위해 사용하였고, 14-메쉬 체로 과립화하고 50~60℃에서 1시간 동안 건조하였다. 제형 투여량에 따라 스테아르산 마그네슘을 첨가하여, 과립을 14-메쉬 체로 체질하였다.

2. 정제 압축

얻어진 과립을 펀치 다이로 압축하여 정제를 제조하였다.

제형예 2 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 캡슐제 제조

제제(조성):

상기 제제를 1000개의 캡슐로 제조하였다.

제조 공정:

1. 과립화

살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T 및 제형 내에 열거된 기타 어쥬번트를 각각 100-메쉬 체로 체질하였다. 제형 투여량에 따라, 살비아놀산 T, 스타치 및 소듐 카복시메틸 스타치를, 등량을 점차적으로 증가시키는 방법에 따라 잘 혼합하였고, 적합한 양의 5%(w/v) PVP 무수 에탄올을 연질 물질을 생성하기 위해 사용하였고, 14-메쉬 체로 과립화하고 50~60℃에서 1시간 동안 건조하였다. 제형 투여량에 따라 스테아르산 마그네슘을 첨가하여, 과립을 14-메쉬 체로 체질하였다.

2. 캡슐화

얻어진 과립을 캡슐에 적재하였다.

제형예 3 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 주사제 제조

제제:

상기 제제를 1000개의 유닛으로 제조하였다. .

제조 과정:

살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T를 제형 투여량에 따라 취하고, 100 ml의 주사용수에 용해하고, 균일하게 교반하였다; 제형 투여량에 따라 만니톨을 취하고, 500 ml의 주사용수에 용해하고, 전술된 용액에 첨가하고, 균일하게 교반하였고, 여기에 0.5 g의 활성 탄소를 첨가하여 변하지 않는 온도에서 30분 간 교반하고, 여과하였고; 여과물의 pH를 4.5~5.0으로 조정하고, 2500 ml까지 주사용수에 희석하고, 무균 여과하고, 개별적으로 적재하여 생성물을 수득하였다.

제형예 4 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T의 동결건조 분말제 제조

제제:

상기 제제를 1000개의 유닛으로 제조하였다.

제조 과정:

제형 투여량에 따라 살비아놀산 T, (S)-살비아놀산 T, (R)-살비아놀산 T 및 만니톨을 칭량하고, 1500 ml의 주사용수에 교반하여 용해하되, 여기에 0.5 g의 활성 탄소를 첨가하여 20분간 교반함으로써 탈색하였고, 용액을 미세공극 여과 필름(0.45 μm)을 통해 여과하여 탄소를 제거하였고, 2000 ml까지 주사용수에 희석하였다. 얻어진 용액을 무균으로 여과하고, 별도로 포장하고, 동결 건조하여 생성물을 수득하였다.

약동력학 실시예 1 결찰 관상 동맥 급성 심근경색의 예방에 대한 (S)-살비아놀산 T의 효과

물질

1. 대상 물질 및 시약

Tasly Holding Group Academy에 의해 제공된 (S)-살비아놀산 T, 배치 번호: 120301, 아스피린 장용 코팅 정제: 사양: 100 mg/조각, Bayer healthcare Co., Ltd., 배치 번호: BJ07160.

0.9%(w/v)의 염화 나트륨 주사제, Nanjing Xiaoying Pharmaceutical Group Co. Ltd., 배치 번호: 2012051205.

클로랄 수화물: AR, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., 배치 번호: 20100111.

적색 테트라졸린(TTC), Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., 배치 번호: F20040308.

크레아틴 키나제(CK) 검정 키트, 배치 번호: 20120917; 락트산(LD) 검정 키트, 배치 번호: 20120919; 말론디알데하이드(MDA) 검정 키트, 배치 번호: 20120919; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 검정 키트, 배치 번호: 20120918; 크레아틴 키나제 동위효소(CK-MB) 검정 키트, 배치 번호: 20120922；ATP 효소 검정 키트, 배치 번호: 20120921. 모두 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute로부터 제공받았다.

2. 주요 장치:

HX-300 환풍기: Chengdu Taimeng Science and Technology Co., Ltd.

ECG-6511 심전계: Shanghai Photoelectric Medical Electronic Instrument Co., Ltd.

HH-2 디지털 디스플레이 항온 수조: Guohua Electric Appliance Co., Ltd.

BS 224형 전자 저울: Beijing Sartorius Instrument System Engineering Co., Ltd.

BS 110형 전자 저울: Beijing Sartorius Instrument System Engineering Co., Ltd.

3. 실험 동물: SD 랫트, 210~230 g의 체중, 수컷, Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에 의해 SCXK (Su) 2009-0001의 증명 번호로 제공됨.

실험 방법 및 결과

1. 투여 용량의 설계

(S)-살비아놀산 T 동결감압건조 분말의 용량은 20 mg/kg(체중), 10 mg/kg(체중)이었다. 아스피린: 30 mg/kg(체중).

2. 실험 방법

깨끗한 수컷 SD 랫트를 취하여, 체중에 따라 무작위로 군(거짓 수술군(pseudo operation group)(증류수), 모델군(증류수), 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 저용량군, (S)-살비아놀산 고용량군을 포함함)에 넣었는데, 각 군에는 10마리의 랫트가 존재하였다. 10일간 연속으로 1일 1회 위 투여로 각 군의 랫트에 투여하였다. 투여 부피는 1 mL/100 g(체중)이었다. 투여 종료 시점의 1시간 후, 300 mg/kg(체중)의 클로랄 수화물을 복강 내 주사로 주사하고, 마취하고, 등을 고정시키고, 요오드 및 알코올을 연속적으로 이용하여 수술 부위를 멸균한 다음, 3번째 및 4번째 갈비뼈 위치에서 가슴을 열고, 인공 호흡을 하고, 심장을 노출시키고, 의료용 비외상성 봉합 바늘 5/0으로 관상 동맥의 좌전하행지를 결찰시키고, 가슴속을 신속하게 닫고, 통상적으로 멸균하되, 수술 절차에 걸린 시간은 30초 미만이었고, 인공 호흡을 수술 후 1 내지 2분간 계속하였고, 영향을 방지하기 위해 200,000 단위의 페니실린을 근육 내 주사(i.m.)로 제공하였다. ECG의 J 포인트의 변화를 연구하기 위해, 수술 5분 전, 결찰 후 0초, 1분, 5분, 15분, 1시간, 4시간에서의 표준 II 리드(lead) ECG를 기록하였다.

심장을 실험 종료 직후에 꺼내고, 생리 식염수로 혈액을 세척하고, 심방 및 혈관의 아래쪽을 절단하고, 심실의 질량을 칭량하고, 방실홈을 따라 평균 5개의 조각으로 심실을 절단하고 이들을 1%(w/v) TTC 용액에 넣고, 37℃의 일정한 온도의 수조 내에서 5분 간 염색하고, 이들을 꺼낸 후 우선 디지털 사진을 촬영한 다음, 염색되지 않은 부분(즉, 경색부)을 분리하고 칭량하여 총 심실의 질량 중 염색되지 않은 부분의 백분율(심근경색 백분율)을 계산하고, 허혈 모델군과 함께 t-검정을 수행함. 경색 백분율을 계산하기 위한 식은 다음과 같다:

경색 백분율(%) =(흐린 면적의 질량/심실의 질량)×100%

혈액을 2000 rpm에서 25분 간 원심분리한 후, 혈청을 분리해내고, 혈청 크레아틴 키나제(CK), 락테이트 데하이드로게나제(LD), 크레아틴 키나제 동위효소(CK-MB), 말론알데하이드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), ATP아제의 활성 또는 함량을 결정하였다. 결과를 표 5, 6, 7 및 도 11에 나타냈다.

표 5에 나타낸 바와 같이, 관상 동맥 결찰 수술 후 각 군의 랫트의 ECG의 J 포인트는 수술 전 J 포인트보다 명백하게 높았으며（P<0.01), 이는 몰딩(molding)의 성공을 보여주는 것이었다. 모델군과 비교하여, 수술 5분 후, (S)-살비아놀산 T 고용량군은 J 포인트의 상승을 유의하게 저해(P<0.05)할 수 있었고; 수술 15분 후, (S)-살비아놀산 T 고용량군은 J 포인트의 상승을 유의하게 저해（P<0.05）할 수 있었고; 수술 1 시간 및 4시간 후, 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 고용량군 모두 J포인트의 상승을 저해（P<0.05）할 수 있었다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 모델군 및 각 치료제 투여 군의 심근경색률은 모두 거짓 수술군보다 명백하게 높았는데(P<0.01), 이는 몰딩의 성공을 보여주는 것이었다. 모델군과 비교하여, 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 고용량군 모두는 심근경색률을 유의하게 낮췄다(P<0.05).

# P<0.05，## P<0.01，몰딩 전후 각 시점에서 자가 조절(self-control) 전후에 실시함; ▲P<0.05，▲▲P<0.01，모델군과의 비교

#P<0.05，## P<0.01，거짓 수술군과의 비교;▲P<0.05，모델 대조군과의 비교

#P<0.05，## P<0.01，거짓 수술군과의 비교; ▲P<0.05，▲▲P<0.01，모델군과의 비교

표 7에 나타낸 바와 같이, 모델군의 혈청의 MDA, LD, CK,CK-MB 수준은 거짓 수술군보다 명백하게 높은 반면(P<0.01), SOD, Na+-K+-ATPase는 거짓 수술군보다 명백하게 낮았는데(P<0.01), 이는 몰딩의 성공을 나타내는 것이었다. 모델군과 비교하여, 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 저용량군, (S)-살비아놀산 T 고용량군은 심근허혈 랫트의 혈청 내 MDA 및 LD의 함량을 명백하게 낮출 수 있었고（P<0.05）; 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 고용량군은 심근허혈 랫트의 혈청 SOD 활성을 명백하게 증가시킬 수 있었고(각각, P<0.05, P<0.01이었음); 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 저용량군, (S)-살비아놀산 T 고용량군은 심근허혈 랫트의 혈청 내 CK의 활력을 명백하게 낮출 수 있었고(P<0.05, P<0.01）, 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 고용량군은 CK-MB의 활력을 명백하게 낮출 수 있었고(P<0.01); 아스피린군, (S)-살비아놀산 T 저용량군, (S)-살비아놀산 T 고용량군은 Na+-K+-ATPase의 활력을 명백하게 증가시킬 수 있었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, (S)-살비아놀산 T 고용량군 및 아스피린군은 관상 동맥 결찰에 의해 유도되는 급성 심근경색의 예방에 동일한 효과를 가졌다. 추가의 실험은, (S)-살비아놀산 T와 유사하게, (R)-살비아놀산 T 고용량군 및 아스피린군도 또한 관상 동맥 결찰에 의해 유도되는 급성 심근경색의 예방에 동일한 효과를 가졌다는 것을 보여주었다.

약동력학 실험 2 랫트의 실험적인 급성 심근허혈에 대한 (R)-살비아놀산 T의 보호 효과

실험 물질

1. 대상 물질 및 시약: 피투이트린(pituitrin, Pit) 주사는 Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd.에서 070302의 배치 번호로 생산되었다. 생리 식염수는 Tianjin Tian'an Pharmaceutical Co., Ltd.에서 201009231의 배치 번호, 500 ml/병의 사양으로 생산되었다. 95%를 초과하는 순도를 가지는 (R)-살비아놀산 T는 Institute of TASLY HOLDING GROUP.CO.LTD.에 의해 제공되었다.

2. 주요 장치: MedLab 8-채널 생체생리학 기록기는 Nanjing Medease Science and Technology Co., Ltd.에 의해 생산되었다.

3. 동물: SD 랫트(220~250 g의 체중을 가지는 수컷 반과 암컷 반)는 SCXK (Jing) 2007-0001의 증명 번호로 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에 의해 제공되었다. 모든 랫트에게는 12시간 동안 빛이 조사되는 20~25℃의 상온의 동물 사육실 내에서 랫트 특별 식이(Beijing Keaoxieli Diet Co., Ltd.에 의해 생산됨) 및 수돗물이 제공되었다.

실험 방법

1. 투여 용량의 설계

(R)-살비아놀산 T 동결감압건조 분말의 투여 용량은 고용량군에서는 10 mg/kg(체중); 저용량군에서는 5.0 mg/kg(체중)이었다.

2. 군 형성

2.1 동물의 스크리닝: 공식적인 실험 전에, 랫트에 피투이트린(Pit)(1 U/kg)을 미정맥을 통해 주사하였다. 정상적인 ECG 및 주사 5분 후의 ECG를 기록하여 J 포인트 상승 및 T 파동 이상성을 관찰하였다. 주사 전 비정상적인 ECG를 가졌던 동물 또는 Pit에 불응성인 동물들은 불합격시켰다.

2.2 동물의 군 형성: 바람직한 랫트를 각각 ① 모델 대조군, ② (R)-살비아놀산 T 동결건조 분말 저용량군; ③ (R)-살비아놀산 동결건조 분말 고용량군으로 명명된 3개의 군으로 무작위로 분류하였다.

3. 실험 방법: 체중이 220~250 g인 SD 랫트(수컷 반, 및 암컷 반)를 각 군 당 10 마리씩 무작위로 군으로 분류하였다. 치료군 내 랫트는 매일 상이한 시료의 수용성 현탁액에 적신 반면, 모델 대조군 내 랫트는 동일한 부피의 생리 식염수로 적셨다. 모든 동물에게 7일간 연속으로 투여하였다. 마지막 투여 40분 후, 랫트를 마취하고, 리드 II 정상 ECG를 기록하기 위한 장치에 연결하였다. 피투이트린(Pit)을 1 U/kg(체중)의 투여량으로 미정맥을 통해 약 10초 간 일정한 속도로 주사하였다. ECG 변화를 투여 0초, 5초, 10초, 15초, 30초, 45초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분 및 15분 후에 기록하였다. 각 군의 Pit의 주사 전 및 주사 후 사이의 차이뿐 아니라 치료군 및 모델 대조군 사이의 차이도 비교하여 J 포인트 및 T 파동의 변화를 분석하였고, 데이터를 t 검정으로 분석하였다.

실험 결과

1. J 포인트에 대한 효과

표 8의 결과에 나타낸 바와 같이, 모델 대조군과 비교하여, 피투이트린으로 유발된 급성 심근허혈에서 (R)-살비아놀산 T 고용량군의 15초, 30초 및 45초에서의 ECG의 J 포인트의 상승 정도는 더 적으며, 이러한 차이는 본 실험 조건하에 통계적 유의성(P<0.05)을 가졌다. 표 9의 결과에 나타낸 바와 같이, 모델 대조군과 비교하여, (R)-살비아놀산 T 고용량군의 15초, 및 30초에서의 ECG의 T 파동의 상승 정도는 더 적으며, 이러한 차이는 본 실험 조건하에 통계적 유의성(P<0.05)을 가졌다.

*：P<0.05，모델군과의 비교

표 9의 결과에 나타낸 바와 같이, 모델 대조군과 비교하였을 때, (S)-살비아놀산 T 고용량군의 15초 및 30초에서의 ECG의 T 파동의 상승 정도가 보다 적었고, 이러한 차이는 본 실험 조건하에 통계적인 유의성(P<0.05)을 가졌다.

*：P<0.05，모델군과의 비교

결론

모델 대조군과 비교하여, (R)-살비아놀산 T 고용량군에서의 ECG의 J 포인트 및 T 파동의 상승 정도는 15초 및 30초에서 더 적으며, 이러한 차이는 통계적 유의성(P<0.05)을 가졌다. 결과에 나타낸 바와 같이, 본 연구에서, (R)-살비아놀산 T(10.0 mg/kg)는 항-급성 심근허혈의 효과를 가졌다. 추가의 실험은, (R)-살비아놀산 T와 유사하게, (S)-살비아놀산이 유사한 항-급성 심근허혈의 효과를 가졌다는 것을 보여주었다.

약동력학 실험 3 (S)/(R)-살비아놀산 T의 자유 라디칼 포획(trapping) 반응

자유 라디칼은, 이의 직접적이거나 간접적인 산화 효과로 인해, 생리학적이고 병리학적인 과정에 광범위하게 관여하는 것으로 밝혀졌다. 과량의 자유 라디칼의 존재 시, 자유 라디칼은 항상 신체 내 거대분자를 산화시킴으로써 공격한다. 살비아놀산 화합물은, 이들의 항산화 활성에 대한 구조적 기반을 가지는, 페놀성 하이드록실기의 공여자이다. 본 연구에서, 1,1-디페닐-2-피크릴-하이드라질(DPPH) 자유 라디칼 소거 반응 모델이 (S)/(R)-살비아놀산 T의 자유 라디칼 소거 활성을 관찰하기 위해 사용되었다.

1. 시약 및 장치

Tasly Group Academy로부터 제공된 95%를 초과하는 순도를 가지는 (S)/(R)-살비아놀산 T. 비타민 C 및 DPPH는 SIGMA Inc.로부터 구입하였다. 자외선 분광광도계(UV-1800)는 Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.로부터 구입하였다.

2. 실험 방법

총 반응 부피는 2 ml이었다. 80% 메탄올 중 상이한 농도의 1 ml의 시료 용액을 100 μM의 DPPH 메탄올 용액에 첨가하고, 균일하게 혼합하여 용액이 어둠 속에서 25℃에서 20분 간 반응하도록 하였다. 반응 용액의 흡광도를 517 nm에서 측정하였다. 본 연구에서, 비타민 C는 양성 대조군으로 간주되었다. 자유 라디칼 소거율을 다음의 식을 따라 계산하였다:

자유 라디칼 소거율(%)=[1-A_시료/A_대조군)/A_대조군]×100%

여기서, A_시료는 시험된 시료의 흡광도를 의미하고, A_대조군은 블랭크 대조군의 흡광도를 의미한다.

실험 결과

(S)/(R)-살비아놀산 T는 비타민 C보다 훨씬 높은 자유 라디칼 소거를 보였지만, 2종의 이성질체의 자유 라디칼 소거 사이에는 유의한 차이가 없었다（P<0.05）.

약동력학 실험 4 (S)/(R)-살비아놀산 T의 환원력(환원능)의 결정

일정한 정도까지, 예방적인 항산화에 대한 잠재성은 약물의 환원력으로 나타낸다. 본 연구는 본 발명의 (S)/(R)-살비아놀산 T의 환원력에 관하여 수행되었다.

1. 시약 및 장치

95%를 초과하는 순도를 가지는 (S)/(R)-살비아놀산 T는 Tasly Group Academy로부터 제공되었다. 분석적으로 순수한 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide)은 Tianjin No.1 Chemical Reagent Factory로부터 구입하였다. 분석적으로 순수한 트리클로로아세트산은 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.로부터 구입하였다. 분석적으로 순수한 염화제이철은 Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Science and Technology Co., Ltd로부터 구입하였다. 비타민 C는 SIGMA Inc.로부터 구입하였다. 자외선 분광광도계(UV-1800)는 Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.로부터 구입하였다. 냉동 원심분리기(Z323K)는 HEMMLE(독일)로부터 구입하였다.

2. 실험 방법

상이한 농도의 (S)/(R)-살비아놀산 T를 함유하는 0.5 ml의 200 mM 인산 완충액(pH 6.8) 및 0.5 ml의 1.0%(w/v) 페리시안화 칼륨 용액을 각각 빨아들여서, 수조(50℃)에서 20분 간 가열한 다음, 얼음조에서 냉각하였다. 0.5 ml의 10% 트리클로로아세트산 용액을 첨가하였고, 1000 g/분으로 10분 간 원심분리하였다. 생성된 상층액 1.0 ml를 취해서, 그 안에 1.0 ml의 증류수 및 0.2 ml 의 0.1% (w/v) 염산제이철 용액을 첨가하고, 10분 간 정치하였고, 흡광도를 700 nm에서 측정하였다. 한편, 블랭크 실험을 수행하였다. 비타민 C는 강한 환원성 물질로서, 본 연구의 양성 대조군 역할을 수행한다. 시료의 감소능은 시험된 시료의 흡광도로부터 블랭크 대조군의 흡광도를 감하여 나타낸다. 따라서, 흡광도가 높을수록 환원력이 더 강하다는 것을 의미한다.

3. 실험 결과

(S)/(R)-살비아놀산 T의 각각의 환원력은 비타민 C의 환원력보다 훨씬 강했고, 둘 사이의 환원력에 있어서 유의한 차이는 없었다（P<0.05）.

약동력학 실험 5 마우스에서의 (S)/(R)-살비아놀산 T의 항폐섬유증 실험

폐섬유증은 폐 손상 후의 합병증이고 통상적인 반응으로서, 폐섬유증의 병리학적 변화는 미만성 폐포 염증, 섬유모세포병소의 형성 및 세포외 기질의 과도한 침착 및 반복 복구이다. 폐섬유증은 대개 호흡기 기능의 영구적인 소실로 귀결되고, 효과적인 예방 및 치료 수단이 부족하다. 블레오마이신(bleomycin)에 의해 유도된 마우스 폐섬유증은 인간 폐섬유증에 대한 연구를 위해 사용되는 통상적인 모델로서, 이러한 모델에서 블레오마이신에 의해 직간접적으로 생성된 산소 자유 라디칼이 폐섬유증을 촉발하는 기전 중 하나이다.

1. 시약 및 장치

Tasly Group Academy로부터 제공된 95%를 초과하는 순도를 가지는 (S)/(R)-살비아놀산 T. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 키트, 카탈라제(CAT) 키트, 페록시다제(POD) 키트, 말론디알데하이드(MDA) 키트는 모두 Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute로부터 구입하였다. 블레오마이신은 SIGMA로부터 구입하였다.

2. 동물

쿤밍 마우스(모두 암컷, 22~25 g의 체중을 가짐)는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.로부터 제공받았고, 23±2℃의 온도, 65%~75%의 상대 습도, 및 12h:12h의 광 간격의 조건 하에 사육하였다.

3. 실험 방법

40마리의 마우스를 다음의 4개의 군으로 분류하였다: ① 정상대조군, 생리 식염수가 비강 적하(nasal dripping)로 제공됨, 생리 식염수에 적셔짐; ② 모델대조군: 블레오마이신의 비강 적하가 제공됨, 생리 식염수에 적셔짐; ③ (S)-살비아놀산 T군(16 mg/kg): 블레오마이신의 비강 적하가 제공됨, (S)-살비아놀산 T 용액으로 적셔짐; ④ (R)-살비아놀산 T군(16 mg/kg): 블레오마이신의 비강 적하가 제공됨, (R)-살비아놀산 T 용액으로 적셔짐; 각 군 당 10 마리의 마우스.

실험의 첫째 날, 마우스를 클로랄 수화물로 마취시켰고, 각각의 마우스에 50 μg 블레오마이신의 일회용 비강 적하를 제공하여 폐섬유증 모델을 확립하였다. 실험의 둘째 날, 2개의 치료군을 (S)/(R)-살비아놀산 T로 적시고, 모델군 및 정상군을 동일한 부피의 생리 식염수로 적셨다(매일 1회, 3주 연속). 실험 21일째에, TGF-β1을 검출하기 위해 안와정맥으로부터 수집한 혈액으로부터 혈청을 분리하였고, 마우스를 치사시켜서 폐를 채집하고, 이차 증류수(폐와 이차 증류수의 비율은 1:5(w/v)였음)와 함께 조직 균질액이 되도록 갈고, 조직 내 MDA, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라제(CAT), 페록시다제(POD)를 검출하기 위해 원심분리하였다.

통계적 방법: 결과는 모두 통계적 소프트웨어를 사용하여 군간의 일원분산분석으로 분석하여 x±s로 나타내었고, 2개군의 독립 표본 t-검정으로 쌍별 비교를 수행하였다.

4. 실험 결과

마우스에서 블레오마이신에 의해 유도된 폐섬유증에 대한 효과: 정상 마우스와 비교하여, 블레오마이신에 의해 유도된 폐섬유증을 가지는 마우스의 폐에서의 TGF-β1은 9.96배만큼 증가하였고, MDA는 1.83배만큼 증가하였고, 항산화효소 SOD, POD, CAT는 1.5배만큼 감소하였고, 혈청 TGF-β1도 또한 4.44배만큼 증가하였고, 모델이 성공적으로 만들어졌다. (S)/(R)-살비아놀산 T 모두 블레오마이신에 의해 유도된 마우스의 혈청 내 TGF-β1의 증가를 저해할 수 있었고(표 12), 블레오마이신에 의해 유도된 마우스의 폐 내 SOD、POD、CAT의 감소를 예방할 수 있었다(표 13).

*：P<0.05；**：P<0.01，모델군과의 비교

*：P<0.05；**：P<0.01，모델군과의 비교

약동력학 실험 6 TGF-β에 의해 유도된 섬유아세포에 대한 (S)/(R)-살비아놀산 T의 저해 효과

TGF-β에 의해 유도된 섬유아세포의 과도한 증식 및 활성화된 섬유아세포의 근섬유아세포로의 분화는 폐섬유증의 형성에서 중요한 역할을 하는데, TGF-β의 신호 전달을 저해하는 것은 폐 섬유아세포의 증식 및 활성화를 예방할 수 있어서 효과적으로 폐섬유증을 치료하고 예방하기 위한 중요한 수단 중 하나이다.

1. 시약 및 장치

Tasly Group Academy로부터 제공된 95%를 초과하는 순도를 가지는 (S)/(R)-살비아놀산 T. DMEM 배양 배지, MTT, 재조합 TGF-β1은 Sigma 사로부터 구입하였다. CSPC Pharmaceutical Group Limited에 의해 생산된 페니실린 및 스트렙토마이신. Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials institute에 의해 생산된 우태아 혈청. Biocolor 사에 의해 생산된 콜라겐 검정 키트. 라미닌(LN) RIA 키트는 Beijing Beifang Biotechnology Institute로부터 구입하였다.

BIO-TEK사로부터 구입한 EL-800X형 마이크로플레이트 판독기; Thermo사로부터 구입한 CO2 항온배양기; FACS사로부터 구입한 유세포 분석기.

2. 세포주

Cell Institute of Academy of Military Medical Sciences로부터 구입한 L929 세포.

3. 실험 방법

10% 우태아 혈청을 함유하는 DMEM 배양 용액으로 조정된 5×107/L의 세포 군집을 가지는 L929 세포를 96웰 플레이트에 파종하였고, 24시간 동안 배양하였다. 2 μg/L TGF-β1 및 상이한 농도의 (S)/(R)-살비아놀산 T를 함유하는 동일한 배양 배지를 보충하였다. 각 군에는 6개의 구멍이 있었으며, (S)/(R)-살비아놀산 T의 최종 농도는 0, 1, 3, 10, 20, 40, 80, 150 μmol/L로 설정되었다. 72시간 동안 배양 후 배지를 제거하고, MTT 방법으로 세포 활성을 검정하였다.

4. 실험 결과

(S)-살비아놀산 T 및 (R)-살비아놀산 T는 TGF-β1에 의해 유도된 L929 세포의 증식에 대한 저해 효과를 가졌고(도 12), (S)-살비아놀산 T의 IC50은 26.1 μmol/L였고, (R)-살비아놀산 T의 IC50은 26.9 μmol/L이었고, 둘 사이의 유의한 차이는 없었다.

본 발명의 약동력학 시험의 결과는, 본 발명의 살비아놀산 T가 급성 심근경색 및 급성 심근허혈을 예방하는 활성, 우수한 자유 라디칼 소거 및 환원력뿐 아니라, 폐섬유증을 치료하는 활성을 가진다는 것을 보여준다.

Claims

구조식 (I)로 나타내는 (S)-살비아놀산 T 또는 (R)-살비아놀산 T, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 포함하는 폐섬유증 질환 치료용 약학 조성물.
[화학식]
하기 단계를 포함하는, 제1항의 약학 조성물의 제조 방법:
(1a) 추출: 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 생약 또는 단삼과 기타 생약과의 혼합물을 물로 추출하고, 여액을 농축하여 물 추출물을 수득한 후, 알코올을 첨가하여 침전시키고, 상청액을 수득하고, 상기 상청액을 농축하여 알코올 추출물을 수득하는 단계;
(1b) 분리: 상기 단계 (1a)에서 수득한 상기 알코올 추출물을 물에 희석하고, 매크로다공성 흡착 수지상에 적용하고, 상기 수지를 산성 수용액으로 세척하여 불순물을 제거한 후, 상기 수지를 에탄올로 용리하여 에탄올 용리액을 수득하고, 상기 에탄올 용리액을 농축하여 추출물을 수득하는 단계; 또는
상기 단계 (1a) 및 (1b)를 다음의 단계 (1)로 대체하고,
(1) 합성: 수용액에 살비아놀산 B를 용해하고, 가열하는 단계;
(2) 정제: 상기 단계 (1)에서 수득한 반응액의 pH를 산성으로 조정하거나, 또는 상기 단계 (1b)에서 수득한 상기 추출물을, 크로마토그래프 패킹으로 C18 역상 실리카겔 컬럼을, 용리액으로 아세토니트릴-물-포름산을 사용하여 등용매 용리를 수행하는, 검출 파장 280nm인 분취 고압 액체 크로마토그래프에 의해 정제하고; 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상기 용리 과정을 모니터링하고, 살비아놀산 T를 함유하는 용리액을 합치고; 농축하여 상기 살비아놀산 T를 수득하는 단계;
(3) 키랄 이성질체의 제조: 크로마토그래프 컬럼으로 역상 키랄 컬럼을, 용리액으로 아세토니트릴-물-포름산을 사용하여 등용매 용리 또는 경사 용리를 수행하는, 검출 파장 280nm인 분취 액체 크로마토그래프에 의해 상기 단계 (2)에서 수득한 상기 살비아놀산 T로부터 키랄 이성질체를 분리하고; 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 상기 용리 과정을 모니터링하고, (S)-살비아놀산 T 및 (R)-살비아놀산 T를 함유하는 용리액을 별도로 수집하고, 동결 건조하여, (S)-살비아놀산 T 및 (R)-살비아놀산 T의 순수한 생성물을 수득하는 단계.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1a)에서, 상기 단삼 생약 또는 단삼 생약과 기타 생약과의 혼합물이 탕제 조각, 분쇄 입자 또는 분말이고, 상기 기타 생약이, 단삼과 상용가능한 삼칠(Radix Notoginseng), 황기(Radix Astragali), 또는 삼칠과 황기의 조합인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1a)에서, 상기 물 추출물이, 상기 생약을, 상기 생약의 4-8배 부피의 물로 1.5-4시간 동안 달이고; 여과하고; 여액을 농축하여 상대 밀도 1.10-1.30(80℃)의 물 추출물을 수득하는 것에 의한 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1a)에서, 상기 물 추출시에 알칼리 수용액을 사용하고, 상기 알칼리는 탄산수소나트륨 용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산수소칼륨 용액, 탄산칼륨 용액, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1a)에서, 상기 알코올 침전이, 95% (v/v) 에탄올을 상기 물 추출물에 첨가하여 상기 에탄올 함량이50%-70% (v/v) (25℃)이 될 때까지 침전시키고, 8-36시간 동안 정치하고; 상청액을 수득하고, 감압 조건하에서 에탄올을 회수하고, 농축하여 상대 밀도1.25-1.5(60℃)의 알코올 추출물을 수득하는 것에 의한 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1b)에서, 상기 매크로다공성 흡착 수지가 비극성 또는 약한 극성의 매크로다공성 흡착 수지인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1b)에서, 상기 매크로다공성 흡착 수지에 대한 상기 단계 (1a)에 사용된 상기 생약의 중량비가 5:1-1:1인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1b)에서, 상기 산성 수용액은, 염산 수용액, 황산 수용액, 질산 수용액, 및 초산 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이거나, 상기 수용액들의 조합이고; 상기 용액의 pH가 1.0-5.0으로 조정되고, 상기 산성 수용액을 사용하여 상기 용리액이 거의 무색이 될 때까지 세척하는 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1b)에서, 4-10배의 50%-95% (v/v) 에탄올을 사용하여 상기 컬럼을 세척한 후, 상기 용리액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 추출물을 수득하는 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1)에서, 반응 원료가 살비아놀산 B 또는 그의 염이고, 상기 수용액이 산성 수용액, 중성 수용액 또는 알칼리 수용액인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1)에서, 상기 수용액에 대한 상기 살비아놀산 B의 질량비가1:0.1-1:100000이고, 반응 온도는10-150℃이고, 반응 시간은 10분 내지 24시간인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (1)에서, 상기 수용액이 알칼리 수용액이고, 상기 알칼리 수용액이 탄산수소나트륨 용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산수소칼륨 용액, 탄산칼륨 용액, 수산화나트륨 수용액, 및 수산화칼륨 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (2)에서, 염산 수용액, 황산 수용액, 질산 수용액 및 초산 수용액 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 상기 반응액의 pH를1.0-6.0로 조정하는 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (2)에서, 상기 고압 액체 크로마토그래프는 동적 축 고압 액체 크로마토그래프이고, 상기 크로마토그래프 패킹은 C18 역상 실리카겔 컬럼이고, 상기 단계 (1)에서 pH가 조정된 상기 반응액 또는 상기 단계 (1b)에서 수득한 상기 추출물을 이동상으로 용해하고, 상기 이동상은 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(90:10:1)이고; 상기 용리액으로 상기 비율의 상기 이동상을 사용하고, 상기 용리는 등용매 용리 또는 경사 용리이고; 유속은 300mL/분이고; 상기 검출 파장은 280nm이고; 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간 21.2-24.0분의 성분을 수집하고, 건조될 때까지 농축하여, 살비아놀산 T 시료를 수득하는 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (3)에서, 분취 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 키랄 이성질체의 분리를 수행하고, 상기 크로마토그래피 컬럼은 역상 컬럼이고, 상기 단계 (2)에서 수득한 상기 살비아놀산 T 시료를 이동상으로 용해하고, 상기 이동상은 아세토니트릴:물:포름산(부피비)=(10:90:1)-(90:10:1)이고; 상기 용리액으로 상기 비율의 상기 이동상을 사용하고, 상기 용리는 등용매 용리 또는 경사 용리이고; 유속은 25mL/분이고; 상기 검출 파장은 280nm이고; 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 용리 과정을 모니터링하고, 체류 시간 19.5-21.1분의 (S)-살비아놀산 T 성분, 체류 시간 23.9-25.3분의 (R)-살비아놀산 T 성분을 별도로 수집하고, 저온에서 농축한 후 동결 건조하여, (S)-살비아놀산 T의 순수한 생성물 및 (R)-살비아놀산 T의 순수한 생성물을 수득하는 것인, 제조 방법.
제16항에 있어서,
상기 저온이 10-40℃인 것인, 제조 방법.
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