KR102162213B1 - 이미지 형성 세포 계수기 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 낮은 광학 배율에서의 이미지 세포 계수기 분석을 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로, 여기서 분석은 UV 명시야, 암시야 또는 여기 광의 하나 이상의 광원을 이용하는 생체 입자의 검출에 기초한다. 시스템은 조명 수단(11, 112), 샘플 홀더(100), 샘플 장착부(101), 이미징 수단(120), 집속 수단(121), 광 변조 수단(122, 123), 및 액티브 검출 엘리먼트(131)를 가진 검출 수단을 포함한다.
Description
본 발명은 일반적으로 낮은 광학 배율에서의 이미지 세포 계수 분석을 위한 방법 및 시스템에 관한 것으로서, 여기서 분석은 생체 입자의 검출에 기초한다.
현미경은 장기간 동안 생체 물질의 분석에 사용되었다. 현미경으로 물체를보기 위해, 그 물체가 배경의 광학적 속성과 다른 광학적 속성을 표시하는 것이 필요하고, 이러한 차이를 컨트라스트라고 부른다. 생체 입자는 일반적으로 주로 그것들을 자신들의 주변과 본질적으로 유사하게 만드는 세포막 내에 함유된 물로 구성된다. 세포의 내부는 일반적으로 단백질, DNA 및 RNA와 같은 특정 화학 성분에 의해 주변 액체와 상이하고, 이들 중 일부는 예를 들면 세포핵(cell nuclei) 내에 패키징된 DNA와 같이 잠재적으로 시각화될 수 있는 크기인 "구조"를 형성한다. 포유동물 세포, 효모 및 박테리아와 같은 생체 입자는, 일반적으로, 약 20㎛ 직경 미만으로 상대적으로 작고, 이는 일부 진보된 기술들이 적용되지 않는다면 그것들을 현미경에서 보기 어렵게 만들 수 있다. 이러한 기술들 중에서 고 배율, 위상차(phase contrast) 및 UV 현미경이 있고, 디지털 기술의 도입으로, 다수의 이미지 개선 기술이 도입되었다.
고 배율 현미경은 대개 x50 이상의 배율을 이용하고, 이는 생체 입자의 시각화 및 식별을 돕는 소량의 구조를 분리시키는 것을 가능하게 한다. 위상차 현미경은 컨트라스트가 높은 이미지를 생성하도록 굴절율에서 작은 차이를 이용한다. 자외선 현미경은 각각 약 260 및 280nm에서의 광을 흡수하는 단백질과 DNA의 흡광 속성을 이용한다. 광의 흡수는 현미경에 컨트라스트로서 보여진다. 현미경의 최대 해상도가 광의 파장에 따르기 때문에, 더 많은 단 파장의 광이 더 긴 파장의 광을 이용하여 가능한 것보다 더 작은 구조를 분리할 수 있게 한다. 생체 입자에서의 이러한 작은 구조는 일반적으로 핵과 같은 세포의 내부 구조이다.
이미지 세포 계수법에 의한 생체 입자들의 평가에서, 이미지 내의 생체 입자들의 위치를 알고 있는 것이 가장 중요하다. 생체 입자를 분석하는 작업은 샘플 내에서의 입자의 열거이지만 이것이 또한 샘플 및/또는 세포의 다른 특성에 관한 거의 모든 평가에서의 경우일 때 이것이 또한 명백하다. 이미지에서의 물체의 식별을 위한 필수조건은 물체와 주변 배경의 이미지에서 현저한 차이가 있다는 조건을 구축할 수 있다는 것이다.
형광 현미경과 같은 방법은 광의 파장에서의 변이에 기초하고, 일반적으로 물질의 양자 역학적 속성에 의해 발생하는 반면, 일반적인 현미경의 방법은 굴절률, 반사도 또는 감쇠에서의 차이와 같은, 광의 파장을 변경하지 않는 광학 속성에 기초한다.
현미경에서의 이러한 차이는 일반적으로 "컨트라스트"로 지칭된다. 현미경에서 컨트라스트를 산출하는 다수의 방법이 있고, 2개의 기본 방법이 암시야(DF: Dark Field) 및 명시야(BF: Bright Field) 현미경이며, 여기서, "필드" 신호의 선명도는 제시될 수 있는 물체를 분리하는 이미지의 영역인 배경의 선명도를 가리킨다. 따라서, 배경이 밝고 물체의 이미지가 광에서의 감소를 나타내는 BF와는 반대로, DF에서, 배경은 어둡고 물체는 더 높은 선명도(intensity)를 가진다.
생체 세포와 같은 생체 입자의 현미경 분석을 고려할 때, DF 및 BF 현미경 방법은 모두 다소 열화한 컨트라스트의 이미지들을 렌더링한다. 따라서 생체 입자의 분석에 폭넓게 사용되는 추가적인 기술이 있는데, 이는 위상차 및 형광 현미경과 같은 일반적으로 이미지에서 더 큰 컨트라스트를 제공하기 때문이다. 생체 입자의 식별을 위해 그것이 구현될 때, 양 방법은 단점뿐만이 아니라 장점을 가진다. 위상차 현미경은 전용 광학 컴포넌트가 필요한 반면, 형광 현미경은 사용되는 형광 시스템에 의해 정의되는 선택 사항에 의해 한정되고, 이들 중 어느 하나는 입자로 제공되거나 또는 입자에 대해 구속된다.
본 발명은 비슷한 컨트라스트를 가진 생체 입자의 이미지를 기록하기 위한 간단하고 효과적이며, 신뢰할 수 있는 방법을 제안하고, 이는 특히 본 발명에 따른 시스템 및 방법들을 이미지 세포 계수법에서 입자의 식별에 적합하도록 한다.
본 발명은 이미지 세포 계수기(cytometer)를 제공하고, 상기 이미지 세포 계수기는:
- 샘플 영역으로 광을 방출하도록 구성된 제1 광원;
- 평행광(collimated light)을 형성하고, 상기 세포 계수기의 광축을 따라 상기 제1 광원으로부터 상기 평행 광을 지향시키는 포커싱 수단;
- 상기 샘플 영역에 여기 광을 방출하도록 구성된 제1 여기 광원을 포함하는 제2 광원; 및
- 검출 엘리먼트의 어레이 상에 상기 샘플 영역의 적어도 일부의 이미지를 형성하는 이미지 형성 수단;
을 포함하고,
상기 샘플 영역은 상기 포커싱 수단 및 상기 검출 엘리먼트의 어레이 사이에 위치되고,
상기 세포 계수기는 명시야(BF: Bright Field) 모드, 암시야(DF: Dark Field) 모드, 및 형광 모드 사이에서 교체되도록 구성될 수 있고, 및/또는
상기 제1 광원은 400nm이하의 파장을 가진 광을 방출하도록 구성되고, 및/또는
상기 여기 광은 상기 형광 모드를 제공하도록 상기 광축에 대해 일정한 입사각도에 있다.
본 발명은 이미지 세포 계수기용 조명 시스템을 더 제공하고, 상기 조명 시스템은:
- 광을 방출하도록 구성된 제1 광원;
- 상기 이미지 세포 계수기의 광축을 따라 상기 제1 광원으로부터의 상기 광을 상기 샘플 영역으로 지향시키는 포커싱 수단; 및
- 상기 샘플 영역에 여기 광을 방출하도록 구성된 제1 여기 광원을 포함하는 제2 광원;
을 포함하고,
상기 제1 광원으로부터의 상기 광은 400nm이하의 파장을 가진 광을 방출하도록 구성된다.
추가로, 본 발명은, 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터(quantity parameter) 및/또는 적어도 하나의 정성 파라미터(quality parameter)의 평가를 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은:
- 노출 면적을 정의하는 평행한 벽 부분을 가지는 샘플 장착부(compartment)로 다량의 생체 샘플을 적용하는 단계로서, 상기 벽 부분은 청구범위 제1 항 내지 제51 항에 따라 이미지 세포 계수기로부터의 광이 상기 샘플 장착부의 상기 벽 부분을 통과하도록 허용하는 상기 다량의 생체 샘플을 적용하는 단계;
- 상기 제1 광원으로부터의 광을 가지고 상기 샘플 장착부를 조광하고, 액티브 검출 엘리먼트의 2차원 어레이 상으로 상기 샘플 장착부를 통과한 광을 노출시켜, 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록하는 단계;
- 상기 제2 광원으로부터의 여기 광을 가지고 상기 샘플 장착부를 조광하고, 액티브 검출 엘리먼트의 2차원 어레이 상으로 상기 샘플 장착부를 통과한 형광 광을 노출시켜, 형광 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록하는 단계;
- 개별 생체 입자로부터의 광 선명도 정보가 배경으로부터의 광 선명도와 상이한 것으로서 식별되는 방식으로 양 이미지를 처리하는 단계; 및
- 상기 처리의 결과를 상기 생체 샘플에서의 상기 생체 입자의 상기 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 상기 적어도 하나의 정성 파라미터에 상관시키는(correlating) 단계;
를 포함한다.
도 1은 본 발명에 따른 이미지 세포 계수기의 실시예를 도시한다.
도 2a는 관찰된 컨트라스트를 예시하는 그래프를 도시한다.
도 2b 내지 2g는 상이한 광 파장을 이용하여 기록된 명시야 이미지를 예시한다.
도 3은 경사진 광원의 배열과 상기 광의 마스킹 효과를 도시한다.
도 4는 형광 고분자 비드의 선명도를 예시하는 그래프를 도시한다.
도 5는 명시야 이미지에서의 패시브 광 변조의 구성을 도시한다.
도 2a는 관찰된 컨트라스트를 예시하는 그래프를 도시한다.
도 2b 내지 2g는 상이한 광 파장을 이용하여 기록된 명시야 이미지를 예시한다.
도 3은 경사진 광원의 배열과 상기 광의 마스킹 효과를 도시한다.
도 4는 형광 고분자 비드의 선명도를 예시하는 그래프를 도시한다.
도 5는 명시야 이미지에서의 패시브 광 변조의 구성을 도시한다.
일 실시예에 따른 이미지 세포 계수기의 제1 효과는 이미지 세포 계수기가 명시야 모드, 암시야 모드, 및 형광 모드 사이에서 교체되도록 구성될 수 있다는 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 제1 광원은 명시야 모드와 암시야 모드에 대해 단일한 광원만이 요구되도록 명시야 광원과 암시야 광원을 제공할 수 있다. 2개의 모드 사이에서의 교체는 따라서 광원 또는 광학 수단의 교체가 아니라 교체 수단에 의해 획득될 수 있다. 바람직하게는, 제1 광원은 400nm 이하의 파장을 가진 광을 방출하도록 구성된다. 본 도면에서, 제1 광원은 자외선(UV) 명시야 광원으로서 간주될 수 있다. UV 명시야 광원을 이용하는 효과는 400nm보다 더 높은 파장을 가진 광을 방출하는 광원으로부터의 광으로 기록되는 이미지에 비해 이러한 조명이 입자 및/또는 이미지에서의 더 높은 컨트라스트에 대해 보다 상세한 사항을 제공하도록 한다는 것이 알려져 있다.
본 발명에 따르면, 제2 광원은 형광 모드를 제공할 수 있고, 본 발명의 효과는 제2 광원 또는 제2 광원으로부터의 형광 광을 지향시킬 수 있는 부분을 이동시키지 않고 형광 모드가 제공될 수 있다는 것이다. 즉, 형광 모드는 형광 광원 또는 형광 광을 지향시킬 수 있는 부분의 움직임이 없을 수 있기 때문에 급격하게 제공될 수 있다. 바람직하게는, 여기 광은 광축에 대해 일정한 입사각으로 있고, 이미지 세포 계수기의 광축은 형광 모드를 제공하기 위해 샘플 영역과 검출 엘리먼트의 어레이 사이에서 광축에 의해 정의된다. 이러한 설정의 하나의 효과가 검출 엘리먼트 상으로 노출된 여기광의 선명도(intensity)가 현저하게 감소될 수 있다는 것이 알려졌다.
감쇠 수단 및 변조 수단
본 발명의 바람직한 실시예에서, 이미지 세포 계수기는 하나 이상의 미리정의된 파장 대역(들)에서의 광 선명도를 감쇠시키는 것과 같은 광학 필터와 같은 감쇠 수단을 더 포함하고, 바람직하게는, 여기서 감쇠 수단은 광축을 따라서 미리정의된 평면에 배치된다. 추가로, 이미지 세포 계수기는 공간 변조 수단과 같은 변조 수단을 더 포함할 수 있고, 바람직하게는, 여기서 변조 수단은 광축을 따라서 미리정의된 평면에 배치된다. 본 발명의 일부 실시예에서, 감쇠 수단 및/또는 변조 수단은 제1 광원과 샘플 영역 사이의 광 경로에 위치된다. 바람직하게는, 감쇠 수단 및/또는 변조 수단은 샘플 영역과 검출 엘리먼트의 어레이 사이의 광 경로에 위치된다. 보다 바람직하게는, 변조 수단은 광축을 따라서 검출 엘리먼트를 향해 샘플 영역을 통과하여 투과되는 평행 광(collimated light)의 초점 평면에 있거나 또는 그에 인접하여 배치된다.
샘플 영역을 통과하여 투과되는 평행 광의 초점 평면에 또는 그에 인접하여 다수의 변조 수단을 배치시키는 것이 다수의 효과가 있다는 것이 알려져 있다. 무엇보다도, 높은 공간 주파수에서와 같이, 컨트라스트는 이 위치에서 변조 수단이 없는 배열에 비해 개선될 수 있다. 두번째로, 평행 광의 초점 평면은 이미지 형성 장치의 구경 조리개(aperture stop)가 될 수 있기 때문에, 변조 수단은 확장된 심도(depth of field)를 제공할 수 있다. 세번째로, 변조 수단은 샘플 영역 내의 샘플에서의 입자에 의해 굴절 또는 산란된 광만이 검출 엘리먼트에 도달하도록 하여 광원으로부터 직접 방출된 광을 제거할 수 있다. 변조 수단이 샘플 영역을 통과하여 투과된 평행 광의 초점 평면 내에 또는 그에 근접하여 배치되는 배열에 의해, 높은 컨트라스트의 명시야 또는 암시야 이미지의 유연한 기록 또는 단지 적절한 변조를 배치 또는 제거함으로써 2가지를 조합하는 것을 가지는 이미지 세포 계수기를 구현하는 것이 가능할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, 감쇠 수단 및/또는 변조 수단 중 2개 이상이 감쇠 수단 및/또는 변조 수단의 제거 또는 교체를 허용하는 교체 수단에 장착된다. 교체 수단은 예를 들면 필터 휠과 같은 회전 유닛을 포함할 수 있다. 2개 이상의 교체 수단은 동시에 광축을 따라서 1개, 2개 또는 그 이상의 감쇠 수단 및/또는 변조 수단이 배치될 수 있거나, 또는 그 중 어느 것도 배치되지 않을 수 있도록 한다. 2개 이상의 교체 수단을 가지는 효과는 이것들이 변조 수단, 감쇠 수단 또는 양 수단 모두의 조합된 효과를 허용하는 것이다. 또다른 효과는, 예를 들면 이러한 교체 수단이 더 작고, 단일한 교체 수단 보다 더 빨리 회전할 수 있기 때문에, 2개 이상의 교체 수단이 동일한 수의 감쇠 수단 및/또는 변조 수단을 가지는 단일한 교체 수단 보다 더욱 빠르게 감쇠 수단 및/또는 변조 수단을 교체할 수 있다는 것이다.
본 발명의 일부 실시 예에서, 적어도 하나의 변조 수단은, 부분적으로 불투명하거나 또는 부분적으로 투명할 수 있다. 감쇠 수단 및/또는 변조 수단은 유사하게 일부 부분(들)에서 부분적으로 불투명하고 상이한 부분(들)에서 부분적으로 투명하며, 바람직하게는, 이들 부분들 중 하나 이상은 원형 형상이다. 따라서, 적어도 하나의 변조 수단의 부분이 부분적으로 불투명할 수도 있고, 변조 수단의 또 다른 부분은 부분적으로 투명할 수 있다. 바람직하게는, 감쇠 수단은 10-3 미만, 10-4 미만, 10-5 미만, 또는 10-6 미만과 같은 미리정해진 인수 만큼 광을 감쇠시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 변조 수단은, 바람직하게는 실질적으로 샘플 영역을 통과하는 평행 광을 감쇠시키는 암시야 모드를 위해 구성된 장애물(obstruction)을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 변조 수단은, 바람직하게는 실질적으로 샘플 영역으로부터 방출한 비 평행(uncollimated) 광을 감쇠시키는 명시야 모드를 위해 구성된 어퍼처를 포함한다. 명시야 모드와 암시야 모드 사이에서 교체하는 것이 가능하다는 것이 장애물과 어퍼처의 상호 교체에 의해 달성될 수 있다. 명시야 모드와 암시야 모드 사이의 교체는 변조 수단에 의해, 바람직하게는 샘플 영역과 검출 엘리먼트의 어레이 사이에 위치된 변조 수단을 삽입 및/또는 교체함으로써 구현될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 변조 수단은 위상차(phase contrast) 현미경 변조 수단을 포함한다. 따라서, 변조 수단은 위상차 현미경 변조 수단으로 구성될 수 있고, 제1 광원에 의해 방출된 광의 실질적인 파장은 협소한 대역이고, 바람직하게는, 여기서 대역 폭은 50nm 미만이다.
제 1
및
제 2
광원
광학 설정에서, 완벽하게 시준되는 것이 항상 획득가능한 것은 아니며, 제1 광원으로부터의 평행 광은 10°미만, 보다 바람직하게는 5°미만의 편차도(deviation degree)로 평행광으로부터 벗어나 있을 수 있다는 것이 받아들여질 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 제1 광원으로부터의 파장은 200nm 내지 700nm의 사이에 있다. 바람직하게는, 제1 광원으로부터의 파장은 300nm 내지 395nm의 사이일 수 있다. 보다 바람직하게는, 제1 광원으로부터의 파장은 320nm 내지 380nm의 사이일 수 있다. 가장 바람직하게는, 제1 광원으로부터의 파장은 350nm 내지 380nm의 사이일 수 있다.
제2 광원으로부터의 여기 광은 제1 광원으로부터의 광의 파장과 실질적으로 상이한 파장을 가질 수 있다. 바람직하게는, 여기 광의 입사각은 10° 내지 80° 사이, 바람직하게는 20° 내지 60° 사이, 보다 바람직하게는 30° 내지 50°사이일 수 있다. 대안으로, 여기 광의 입사각은 90°일 수 있다. 본 발명의 또다른 실시예에서, 입사각은 110°내지 180° 사이이고, 바람직하게는 120°내지 160° 사이, 그리고 더욱 바람직하게는 130°내지 150°사이이다.
포커싱
수단
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 포커싱 수단은 렌즈를 포함하는 반면, 본 발명의 또 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 포커싱 수단은 곡면 미러를 포함한다.
추가 광원
본 발명의 일부 실시 예에서, 상기 이미지 세포 계수기는 제3, 제4, 제5 또는 제6 광원과 같은 추가적인 광원을 더 포함하고, 바람직하게는, 여기서 추가적인 광원은 여기 광원이다. 광원(들)은 발광 다이오드 및/또는 다이오드 레이저 및/또는 조정가능한 고체 상태 광원(들)과 같은 레이저, 및/또는 조정가능한 발광 다이오드이다. 조정가능한 고체 상태 광원은 조정가능한 레이저 다이오드일 수 있다.
광학 수단 및 검출
엘리먼트
본 발명의 바람직한 실시예에서, 광원(들)은 샘플 영역을 가로질러 및/또는 검출 엘리먼트의 어레이에 의해 촬상된 영역을 가로질러 실질적으로 균일한 선명도를 가진 광을 제공하도록 구성된 광학 수단에 광학적으로 연결된다. 광학 수단은 마이크로 렌즈 어레이를 포함한다. 대안으로, 광학 수단은 바람직하게는 원통형 렌즈의 어레이를 포함하고, 그것은 원통형 렌즈의 실질적으로 직교 방향을 가진 원통형 마이크로 렌즈의 2개의 어레이를 포함할 수 있다. 검출 엘리먼트의 어레이는 CCD 또는 CMOS 센서 엘리먼트의 어레이일 수 있다.
노출
본 발명에 따르면, 광원(들)은 1초 미만, 바람직하게는 0.1 초 미만의 기간내에 광을 방출하도록 구성된다. 바람직하게는, 광원(들)은 0.0001 내지 0.1000초 사이, 바람직하게는 0.0001 내지 0.0500 초 사이의 기간내에 광을 방출하도록 구성된다. 그러나, 형광 이미징에서 고 감도가 요구되는 때와 같은 일부 상황에서는, 광원(들)은 2초 이상동안, 3초 이상 동안, 4초 이상 동안, 5초 이상 동안, 6초 이상 동안, 7초 이상 동안, 8초 이상동안, 9초 이상 동안, 또는 10초 이상 동안과 같은 1초 이상 동안의 기간내에 광을 방출하도록 구성될 수 있다.
광 차단
본 발명의 일 실시예에서, 여기광원으로부터의 광은 여기 광의 광선으로부터 광의 광선을 선택적으로 제거함으로써 이미지 형성 수단의 입구에 도달하는 것으로부터 실질적으로 제거될 수 있다. 광선은 여기광의 광선에 하나 또는 다중 장애물을 배치함으로써 선택적으로 제거될 수 있고, 바람직하게는 여기서 여기 광의 광선은 장애물이 배치된 평면에서 실질적으로 시준된다.
이미지 형성 수단
본 발명의 바람직한 실시예에서, 이미지 형성 수단은 10㎛ 내지 150㎛ 사이와 같은 5㎛ 이상인 심도(depth of field)를 제공하도록 구성된다. 이러한 방식으로, 샘플 영역은 이미지 형성 수단 및/또는 검출 엘리먼트의 어레이가 예를 들면 샘플이 상이한 심도로 위치된 입자를 가질 때 샘플 영역 내의 샘플의 선명한 이미지를 획득하도록 이동될 필요가 없을 수 있도록 하기 위해 심도내의 초점에 있을 수 있다. 그러나, 본 발명의 일부 실시예에서, 이미지 형성 수단 및/또는 검출 엘리먼트의 어레이, 및/또는 샘플 장착부는 이미지 형성 수단 및/또는 검출 엘리먼트의 어레이가 샘플에 대해 최적 위치에 위치될 수 있도록 이동하기 위해 구성될 수 있다. 하나의 샘플 또는 샘플의 부분은 예를 들면 하나의 구성에서 초점 내에 있을 수 있지만, 또다른 샘플 또는 샘플의 다른 부분으로 변할 때, 다른 샘플 또는 샘플의 다른 부분은 그런다음 초점 내에 없을 수 있고, 따라서 이미지 형성 수단 및/또는 검출 엘리먼트의 어레이를 이동시키는 것이 요구될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 예에서, 이미지 형성 수단은 200nm 내지 1000nm 사이의 파장 영역, 더 바람직하게는 350nm 내지 1000nm 사이의 파장 영역, 보다 바람직하게는 350nm 내지 850nm 사이의 파장 영역에서의 광을 투과하도록 구성된다.
본 발명의 다수의 바람직한 실시예에서, 이미지 형성 수단은 현미경 대물렌즈(objective)를 포함한다. 이미지 형성 수단은 샘플의 선형 확대를 제공하도록 구성될 수 있다. 바람직하게는 선형 확대는 20:1 보다 더 작다. 선형 확대는 또한 1:1 내지 20:1, 바람직하게는 1:1 내지 10:1, 보다 바람직하게는 1:1 내지 4:1의 범위에 있을 수 있다.
본 발명의 다수의 바람직한 실시예에서, 이미지 세포 계수기는 2개 이상의 이미지 형성 수단이 이미지 기록 사이에 교체되도록 하는 수단으로 구성된다. 이미지 수단을 교체하는 목적은 바람직하게는 이미지의 선형 배율을 변경하고 및/또는 시야의 심도를 변경하는 것과 같은 이미지 세포 계수기의 광학 속성을 변경하는 것이다. 대개 이미지 수단의 선택은 샘플의 선험적인 공지된 속성에 기초하여 이루어지지만, 본 발명의 다수의 실시예에서, 이미지 수단의 선택은 분석되는 샘플의 평가 결과에 기초하여 이루어진다.
샘플
샘플 영역은 생체 샘플과 같은 샘플을 포함할 수 있다. 샘플은 샘플 장착부 내에 있을 수 있다.
조명 시스템
본 발명에 따르면, 조명 시스템은 이미지 세포 계수기로 요구되는 광원을 제공하기 위한 것일 수 있고, 명시야 광원, 및 형광 광원일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 조명 시스템에 관련하여 포커싱 수단은 제1 광원으로부터의 평행 광을 형성하기 위한 것이다. 추가로, 여기 광은 광축에 대해 일정한 입사각으로 있을 수 있다. 조명 시스템은 추가적으로 상술한 바와 같이 이미지 세포 계수기로부터의 임의의 특징을 가질 수 있다.
세포 계수 방법
본 발명의 하나의 양태에서, 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터(quantity parameter) 및/또는 적어도 하나의 정성 파라미터(quality parameter)의 평가를 위한 방법으로서, 상기 방법은:
노출 면적을 정의하는 평행한 벽 부분을 가지는 샘플 장착부(compartment)로 다량의 생체 샘플을 적용하는 단계로서, 벽 부분은 제1 광원으로부터의 광이 샘플 장착부의 벽 부분을 통과하도록 허용하는 다량의 생체 샘플을 적용하는 단계,
액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 샘플 장착부를 통과한 광을 노출시켜, 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록하는 단계,
개별 생체 입자로부터의 광 선명도 정보가 배경으로부터의 광 선명도 정보와 상이한 것으로서 식별되는 방식으로 이미지를 처리하는 단계, 및
처리의 결과를 액체 샘플 내의 생체 입자의 상기 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 적어도 하나의 정성 파라미터에 상관시키는(correlating) 단계를 포함한다.
본 발명은 샘플의 광학적 상호작용을 포함하는 생체 샘플의 정성 및/또는 정량 파라미터의 평가를 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 샘플과의 광학적 상호작용은 바람직하게는 생체 샘플 또는 상기 생체 샘플 내의 입자와의 상호작용의 결과로서 광의 선명도 및/또는 방향에서의 변화를 가져오고, 바람직한 상호 작용의 일부는 반사, 굴절, 회절, 상호 작용, 산란 또는 흡수 중 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 평가되는 생체 샘플은 샘플 장착부 내에 포함되어있다. 샘플 장착부의 바람직한 속성은 샘플의 경계를 정의하는 것이다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시예는 샘플 장착부의 벽 부분이 개방 용기의 바닥이다. 다수의 실시예에서, 샘플 장착부 경계는 샘플의 바닥 또는 최상부를 정의하는 투명한 벽 부분에 의해 형성되는 반면, 다른 동일하게 바람직한 실시예에서 샘플 장착부는 2개의 투명한 벽 부분에 의해서 형성되고, 여기서 샘플은 평가되는 샘플의 두께를 정의하면서 벽 부분들 사이에 위치된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 평가되는 생체 샘플은 생체 입자의 현탁액이다. 생체 입자들의 이러한 현탁액은 더 큰 샘플 체적의 일부일 수 있고, 여기서 평가의 목적은 더 큰 샘플 체적의 속성을 판정 또는 추정하기 위한 것일 수 있다. 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 생체 샘플은 기판 상에서 성장되거나 및/또는 성장하는 세포의 샘플이다. 대안으로, 샘플은 액체 샘플일 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 기판은 현탁액 내에 있는 반면, 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 이러한 기판은 샘플 장착부의 집적된 부분이거나 또는 집적된 부분이 될 수 있다. 일반적으로, 샘플 장착부 내에 위치된 기판은 실질적으로 투명한 것이 바람직하고, 다수의 바람직한 실시예에서, 투명한 기판 플레이트는 샘플 장착부의 벽 부분이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 적어도 하나의 정성 파라미터의 평가는 개별 세포의 분석이다. 이러한 개별 세포는 대개 현탁액 내에서 또는 기판 상에서 분리되어 있지만, 이러한 개별 세포는 또한 서로 부착해 있는 한 덩어리의 세포로 되어있을 수 있다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시예에서, 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 적어도 하나의 정성 파라미터의 평가는 조직 샘플과 같은 세포 벌크의 분석이다.
본 발명의 다수의 가장 바람직한 실시예에서, 제1 광원은 발광 다이오드 (LED) 및/또는 레이저 다이오드 및/또는 레이저이다. LED와 레이저 다이오드의 특성 중 다수는 작은 물리적 크기 및 전력 효율성과 같은 본 발명에 따른 시스템의 설계 및 동작에서의 실질적인 이점을 제공한다. 본 발명의 다수의 바람직한 실시예에서, 제1 광원으로부터의 광의 파장은 400nm 미만이다. 제1 광원으로부터의 광의 파장은 300nm 내지 395nm와 같은, 200nm 내지 400nm의 사이에 있는 것이 바람직하다. 놀랍게도, 단파장의 광을 이용하는 것은 본 발명에 따른 생체 입자의 평가에서의 실질적인 개선을 제공하고 200nm 내지 250nm, 200nm 내지 300nm, 250nm 내지 350nm, 및 320nm 내지 380nm과 같은 파장 대역에서의 광은 모두 바람직하다.
대개 평가되는 생체 입자는, 그것이 입자의 속성을 변경시킬 수 있는 정도로 광에 대해 민감하고, 광의 효과를 감소시키기 위한 하나의 바람직한 방법은 샘플이 광에 노출되는 시간의 길이를 제한하고, 광원이 샘플 상으로 광을 방출하는 시간을 제한하는 것이고, 바람직하게는, 광원으로부터의 광의 조광의 기간은 1초 미만이고, 보다 바람직하게는 0.1초 미만이다. 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 조명 시간은 0.0001 내지 0.0500 초 사이와 같은 0.0001 내지 0.1000 초 사이이다. 에너지로 표시되면서, 샘플이 노출 동안 100nJ/mm2 이하, 바람직하게는 50nJ/mm2 이하, 20nJ/mm2 이하와 같은 200nJ/mm2 이하로 조광되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 생체 입자들의 평가를위한 하나의 바람직한 방법은, 개별 생체 입자로부터의 신호가 배경으로부터의 광 선명도에 비해 광 선명도 신호가 감쇠된 다량의 샘플로부터의 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록하는 것에 기초한다. 감쇠는 반사, 굴절, 회절, 간섭, 흡수, 산란 중 하나 또는 다수에 의해 발생될 수 있다. 이들 실시예에서, 생체 입자에 관한 광은 배경으로부터의 신호 보다 선명도에서 더 낮고, 이것에 기초하여 개별 세포로부터의 신호 및 배경으로부터의 신호가 서로 상이한 방식으로 이미지를 처리할 수 있고, 바람직하게는 입자로부터의 신호는 실질적으로 배경으로부터의 신호, 입자에 공간적으로 인접하여 있는 배경으로부터의 신호보다 더 적다.
다수의 바람직한 실시예에서, 광의 감쇠는 광의 굴절 및/또는 반사와 같은 프로세스에서 발생하는 산란과 같은 광의 산란에 의해 발생된다. 추가적으로, 이러한 그리고 다른 바람직한 실시예에서, 감쇠는 광의 흡수에 의해 발생하고, 이러한 흡수는 평가하에 있는 생체 입자의 화학 성분 및/또는 의도적으로 샘플에 추가된 다른 화학 성분으로부터 야기된다. 따라서, 흡수는 샘플에 추가된 시약에 의해 야기 될 수 있다. 본 발명에 따른 실시예에서, 배경으로부터의 신호의 선명도에 대한 생체 입자에 연관된 광의 5% 내지 70% 사이의 감쇠가 실현된다. 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 배경으로부터의 광에 대한 생체 입자에 연관된 광의 감쇠는 50% 내지 90% 사이이다.
본 발명의 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 개별 생체 입자로부터의 신호는 예를 들면 배경으로부터의 광 선명도에 대한 광 선명도 신호에서의 증가가 관찰되는 것과 같은 개선이 있다. 이는 일반적으로 광 신호의 포커싱 또는 다른 변경과 조합하여 산란, 간섭, 반사 및 굴절과 같은 프로세스에 의해 발생될 수 있고, 개선은 광의 공간적인 재분포의 결과일 수 있다. 이러한 실시예에서, 생체 입자에 관한 광은 배경으로부터의 신호보다 선명도가 더 높고, 이에 기초하여, 개별 세포로부터의 신호 및 배경으로부터의 신호가 서로 상이한 방식으로 이미지를 처리하는 것이 가능하며, 바람직하게는 입자로부터의 신호는 배경으로부터의 신호, 실질적으로 입자에 공간적으로 근접해 있는 배경으로부터의 바람직한 신호보다 실질적으로 더 높다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 생체 입자로부터의 기록된 이미지의 광 선명도는 생체 입자에 관한 신호를 포함하고, 이러한 이미지는 배경으로부터의 광 선명도에 대한 광 선명도의 감쇠 및 증강의 조합인 광 선명도 정보에서의 변화를 포함한다.
일반적으로 광 선명도 정보의 기록시 컨트라스트를 증가시키는 효과를 갖는 본 발명의 바람직한 방법은 대개 샘플을 통과하여 투과 또는 산란되는 광을 변조하는 것이다. 바람직하게는, 이러한 변조는 광원으로부터 액티브 검출 엘리먼트의 어레이로의 광 경로 내의 미리 정해진 평면에서의 광 속성의 공간적 차이에 대응한다. 이러한 변조는 일반적으로 불투명하거나 또는 실질적으로 불투명하고, 또는 투명한 수단과 같은 변조 수단을 이용하여 발생되고, 바람직하게는, 예를 들면 감쇠와 같은 투명도는 미리정해진 속성이다. 바람직하게는, 이러한 변조 수단은 불투명하고 투명한 수단의 조합으로서 구현되고, 따라서 변조 수단은 미리정해진 위치 또는 영역에서 불투명한 반면, 다른 미리정해진 위치 또는 영역에서 투명하다. 변조의 2개의 바람직한 구현은 먼저 자신의 중심에 구멍을 가진 불투명한 디스크이고, 두번째 광의 평행한 광선의 직경보다 실질적으로 더 작은 직경을 가진 불투명한 디스크이다. 이들 2개의 변조 수단이 조합하여 사용되면, 그런다음 제1 수단에서의 중심 구멍의 치수가 제2 수단에서의 디스크의 치수와 유사하거나 또는 같다. 바람직하게는, 불투명 및/또는 투명 영역의 미리정해진 위치는 변조 수단의 위치에 인접한 광학 평면에서의 광원의 이미지에 대응한다. 바람직하게는, 이러한 변조 수단은 샘플을 통하여 투과되는 광에 대해 상이한 효과를 가지며, 광은 생체 입자를 통하여 투과된다. 변조 수단의 일반적인 바람직한 위치는 이미징 시스템의 집속 대물렌즈로 들어가는 평행한 광의 초점 평면에 근접한다.
일반적으로 변조 수단의 바람직한 속성은 위상 변화, 예를 들면 감쇠와 같은 선명도 변화, 예를 들면 광의 차단과 같은 광의 마스킹과 같은 변조 수단을 통과하는 광을 변경하는 것이다. 변조 수단은 바람직하게는 이들 속성 중 하나 또는 다수를 포함한다.
다수의 바람직한 실시예에서, 변조 수단은 광원과 샘플 사이의 위치에서 광축을 따라서 배치되는 반면, 변조 수단을 샘플과 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 사이의 광축을 따라서 있는 위치에 배치하는 것이 동일하게 바람직하다. 다수의 바람직한 실시예는 광축을 따라서 있는 샘플의 양 측면 상에 변조 수단을 포함한다. 액티브 검출 엘리먼트의 어레이와 샘플 사이의 광축을 따라서 있는 위치에만 변조 수단이 포함되는 실시예에서, 광원으로부터의 광은 실질적으로는 그것이 샘플을 횡단할 때 평행이고, 바람직하게는 이러한 평행 광의 광 선명도는 실질적으로는 액티브 검출 엘리먼트의 어레이에 의해 촬상되는 샘플의 부분을 가로지른다.
렌즈와 같은 광학 컴포넌트가 샘플 장착부로부터의 광을 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 포커싱하는 데에 이용될 때, 샘플 장착부를 통과하여 투과되는 평행 광은 대개 광축을 따라서 있는 평면에서 포커싱된다. 이러한 조건 하에서, 이러한 초점 평면에 또는 그에 인접하여 변조 수단을 배치하는 것이 대개는 바람직하다. 바람직한 실시예에서, 예를 들면 광을 편향시키고, 굴절시키고, 및/또는 산란시키도록 하는 생체 입자와 상호작용하는 광은 이미징 시스템의 집속 대물렌즈(collection objective)로 들어간다. 추가로, 불투명하고, 투명한 속성과 같은 변조 수단의 속성이 실질적으로 이러한 초점 평면내에서의 광원의 이미지 형상을 따르도록 배치되는 것이 대개는 바람직하다. 대개 변조 수단의 바람직한 속성 및 형태는 샘플 장착부를 통과하여 투과하는 광과 생체 샘플을 통과하여 투과하는 광의 전체 효과에서의 차이가 있다.
변조 수단을 포함하는 실시예에서, 미리정해진 대역의 광으로 구성되는 광을 산출하는 광원을 이용하는 것이 일반적으로 바람직하고, 바람직하게는, 여기서 대역은 단지 50nm와 같이, 바람직하게는 30nm 이하, 그리고 20nm 이하의 실질적으로 협소하다. 추가로, 일반적으로 미리정해진 파장의 광을 이용하는 것이 바람직하고, 바람직하게는, 여기서 광의 파장은 대부분 250nm 내지 400nm 사이, 보다 바람직하게는 300nm 내지 390nm 사이와 같은 400nm 이하이다.
본 발명의 바람직한 실시예는 위상차 이미지를 산출하는 방식으로, 그러나 샘플 장착부를 통과하여 투과되는 광의 파장이 400nm 이하인 조건하에서 배열된 변조 수단을 포함한다.
본 발명의 다수의 바람직한 실시예는 광 경로에 배치되거나 또는 광 경로로부터 제거될 수 있는 변조 수단을 포함하고, 대개 바람직하게는 2개 이상의 상이한 변조 수단이 포함된다. 따라서, 2개 이상의 실질적으로 상이한 변조 수단이 적용되는 2개 이상의 이미지의 공간 광 선명도가 기록될 수 있다. 변조 수단을 포함하거나 또는 제외함으로써 광 경로를 변경하는 것이 가능한 이러한 실시예에서, 샘플 장착부를 통과하여 투과되는 광으로부터 2개 이상의 이미지의 광 선명도 정보를 기록하는 것이 바람직하다. 따라서, 제1 광원을 이용하여 기록되는 2개 이상의 이미지의 공간 광 선명도 정보는 광 선명도 정보 처리에 이용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 샘플 장착부의 벽 부분을 통과한 광원으로부터의 광은 벽 부분의 표면에 실질적으로 직교하는 전체적인 방위를 가진다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시예에서, 광원으로부터의 광은 그것이 샘플을 통과할때 실질적으로 평행하다. 본 발명의 또다른 실시예에서, 샘플을 통과한 평행 광은 변조 수단이 실질적으로 초점 평면에 위치되는 검출 엘리먼트의 어레이와 초점 수단 사이에 위치한 평면으로 포커싱된다. 광원으로부터의 광이 바람직하게는 렌즈(들) 및/또는 미러(들)과 같은 하나 이상의 광학 컴포넌트(들)을 사용하여 가이드되면, 이 방향은 광원의 광축으로서 그리고 광원의 광축이 실질적으로 벽 부분의 표면에 직교한다는 측면으로 간주될 수 있다. 추가로, 다수의 실시예에서, 샘플 장착부의 벽 부분은 실질적으로 액티브 검출 엘리먼트의 어레이의 시야 방향에 직교하는 것이 바람직하다. 유사하게, 광이 전체적으로 렌즈(들) 및/또는 미러(들)과 같은 광학 컴포넌트의 사용을 통해 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 포커싱될 때, 이는 검출 엘리먼트의 어레이의 광학 축이 벽 부분에 직교하는 것에 대응한다. 따라서, 본 발명의 다수의 바람직한 실시예는 광원과 검출 엘리먼트의 어레이의 광축이 실질적으로 단일한 축상에 있도록 모두 실질적으로 단일한 축 상에 위치된 광원, 샘플 장착부, 및 액티브 검출 엘리먼트의 어레이를 포함하고, 이 단일한 축은 자신의 벽 부분이 이 공통 축에 실질적으로 직교하도록 샘플 장착부를 통과한다.
본 발명의 다수의 매우 바람직한 실시예는 샘플 조광을 위한 2개 이상의 광원을 포함한다. 2개 이상의 광원은 일반적으로 광축 또는 파장의 배열과 같은 속성에서 차이가 있다. 2개 이상의 광원을 포함하는 본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서는 제2 광원으로부터의 광이 샘플 장착부의 벽 부분을 통과하여 지나고, 제2 광원은 광의 주 방향이 벽 부분으로 들어가서 바람직하게는 수직에 대해 10°내지 80°사이의 각도와 같은 일정한 각도로 샘플 장착부의 노출 면적을 정의하도록 하는 방식으로 배열되도록 한다. 이러한 배열은 일반적으로 2개 이상의 광원이 실질적으로 영구적인 위치에 장착될 때, 특히 2개 이상의 광원이 장착될 때 이점을 제공한다. 추가로, 이러한 각도의 배열이 배경 광 신호의 선명도를 감소시킬 수 있다는 것이 알려졌다. 추가로, 본 발명의 다수의 바람직한 실시예는 샘플 장착부의 벽 부분을 통과하여 광을 조광하고 및/또는 그를 통과하도록 하는 4개의 광원과 같은 3개 이상의 광원을 포함한다. 다른 동일하게 바람직한 실시예는 5개의 광원과 같은 4개 이상의 광원을 포함한다. 광원의 숫자 증가는 생체 입자의 평가를 수행할 가능성을 제공하기 때문에, 여기서 처리는 복수의 광 선명도 정보에 기초하고, 10개의 개별 광원과 같은 6, 7, 또는 8개 이상의 개별 광원을 포함하는 실시예가 바람직하다.
여기서, 그리고 본 개시물의 다른 위치에서, "광의 주 방향"이라는 용어는 "광축"이라는 용어와 교체될 수 있고, 이는 일반적으로 광원, 또는 액티브 검출 엘리먼트의 어레이와 같은 또다른 액티브 컴포넌트를 그것이 시준, 포커싱 또는 분산을 위한 것인지 렌즈(들) 및/또는 미러(들)의 기능에 관계없이, 하나 이상의 렌즈(들) 및/또는 미러(들)과 같은 광학 수단과 조합하여 배열함으로써 형성된다. 이러한 시스템의 광축은 전체적으로 대칭 축을 가진다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 2개 이상의 개별 광원은 예를 들면 파장에 대해, 바람직하게는 2개 이상의 광원이 실질적으로 동조(synchronisation)하여 동작되어 방출되는 전체 광 에너지를 증가시키고 및/또는 샘플 장착부의 조광되는 면적을 확장시키고, 및/또는 샘플 장착부의 적어도 일부분의 보다 균일한 광 선명도 조명을 보장하는 것과 같은 방식으로 실질적으로 동일한 광을 방출한다. 본 발명의 이러한 또한 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 2개 이상의 개별 광원은 예를 들면 파장에 대해, 바람직하게는 이러한 2개 이상의 광원이 독립적으로 한번에 하나의 이러한 광원만이 켜지는 것과 같이 동작되는 것과 같은 방식으로, 또는 이러한 하나의 광원의 광만이 한 번에 샘플 장착부를 조광하도록 실질적으로 상이한 광을 방출한다. 상이한 광을 방출하는 이러한 2개 이상의 광원의 하나의 바람직한 속성은 이러한 광원 중 적어도 하나가 형광을 발생시킨다는 것이고, 바람직하게는 여기서 이러한 형광 선명도 정보가 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 분석 및/또는 적어도 하나의 정성 분석을 평가할 목적으로 감쇠된 광 선명도 정보와 조합하여 사용된다는 것이다.
다수의 바람직한 실시예에서, 모든 광원은 샘플 장착부의 동일한 측면에 위치된다. 이러한 실시 예들에서 종종 이러한 광원은 액티브 검출 엘리먼트의 어레이에서 샘플 장착부의 대향 측에 위치되는 것이 바람직하다.
광원의 광축이 실질적으로 샘플 장착부의 벽 부분에 직교하지 않도록, 형광을 발생시키는 광원이 샘플 장착부의 벽 부분에 일정한 각도로 위치되는 방식으로 2개 이상의 광원이 배열되는 것이 바람직하다. 이러한 배열의 하나의 바람직한 이점은 대개 S/B(Signal to Background)라고 하는, 배경으로부터의 광의 선명도에 대한 생체 입자로부터 방출된 형광 광의 선명도의 비율 증가이다. 배경이 관심있는 임의의 생체 입자의 외부의 광 선명도 정보의 이미지 내부의 영역(들)인 배경으로부터의 광은 일부가 검출 엘리먼트의 어레이의 광축에 대한 광원의 방향과 같은 광원의 속성에 직접 연관된 현상 및/또는 다수의 광원으로부터 발생할 수 있다. 샘플 장착부의 벽 부분에 대해 일정한 각도로 광원을 배열하는 또다른 동일하게 바람직한 이점은 샘플 장착부에 대해 고정된 위치로 다수의 광원을 배치하여 기계적 수단을 사용하지 않고서 2개 이상의 광원으로부터의 광을 가지고 샘플 장착부의 조광을 허용하도록 할 수 있다는 것이다. 이러한 속성의 바람직한 이점은 그 태스크가 순차적으로 2개 이상의 상이한 파장을 가지고 샘플 장착부내의 샘플을 조광하는 것일 때 시스템을 더 빠르게 동작시키는 기능 및/또는 시스템의 구축을 보다 간단하게 하는 것이다. 추가로, 이러한 여기 광원의 배열은 광원의 평평한 표면상으로 방출하는 광으로부터의 내부 반사를 감소시키고, 그렇지 않은 경우 이는 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 다시 반사될 수 있다는 것이 알려졌다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시예는 예를 들면 굴절 및/또는 반사를 통해 광의 감쇠를 기록하기 위해 광원을 사용하는 것이다. 대개 광의 실질적인 부분이 평행하거나 또는 실질적으로 평행하도록 이러한 광원으로부터의 광이 실질적으로 평행한 방식으로 샘플 장착부를 통과하여 투과되는 것이 바람직하다. 놀랍게도, 이러한 실질적으로 평행한 광은 배경 영역 내의 투과된 광의 선명도에 대한 생체 입자에 의한 광의 감쇠 비율인 감쇠의 컨트라스트를 개선시킬 수 있다는 것이 알려졌다. 본 발명의 상기와 같은 그리고 기타의 바람직한 실시예에서, 샘플을 통과하여 투과된 광의 일부는 정확하게 평행하지는 않지만, 바람직하게는 30°미만, 15°미만과 같이 평행에 대해 45°이하의 각도이다. 광축에 대해 단지 5°의 광의 다이버전스와 같은, 10°미만과 같은 더 적은 다이버전스도 바람직하다.
다수의 바람직한 실시예에서, 적당한 다이버전스는 대개 샘플 장착부를 통과하여 투과되고 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출된 광의 선명도를 안정시키는 데에 포지티브하게 기여하면서 시준된 조건 하에서 기록된 고 컨트라스트가 실질적으로 유지될 수 있다는 것이 알려졌다. 대개 이들 실시예의 다수는 실질적으로 샘플 장착부 외부에 있는 렌즈(들) 또는 미러(들)과 같은 광학 컴포넌트에 의해 발생하는 광원의 초점을 가진다.
본 발명의 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 광의 감쇠를 기록하기 위해, 광의 감쇠 기록을 위해 샘플 장착부를 통과하는 광원으로부터의 광이 실질적으로 샘플 장착부 상에 포커싱된다. 바람직하게는, 샘플 장착부를 통과하여 투과된 광의 실질적인 부분은 액티브 검출 엘리먼트에 의해 기록될 수 있다.
매우 바람직한 본 발명의 하나의 특징은, 샘플 장착부를 통과하여 및/또는 그 위로 투과되는 광이 실질적으로 액티브 검출 엘리먼트의 어레이의 시야 전체에서 선명도가 실질적으로 일정하다. 바람직하게는, 예를 들면 평균 선명도에 대한 선명도의 변화의 비율로서 표시된 균일한 조명으로부터의 편차는 25% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 더 바람직하게는 5% 미만이다. 이러한 속성은 일반적으로 실질적으로 조광된 광의 선명도에 종속되는 속성의 표시에서의 더 낮은 변화 결과인 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상에 기록된 바와 같은 샘플의 광학 속성의 변화를 감소시키는 효과를 가진다. 이는 예를 들면 광의 감쇠 및 형광 방출 모두에 대해 명확하다.
어레이로 배열된 다수의 렌즈로 구성된 광학 수단은 샘플 장착부 상으로 및/또는 샘플 장착부를 통과하여 광원의 발광 엘리먼트의 다중 이미지를 실질적으로 포커싱하도록 배열될 수 있다. 이러한 마이크로 렌즈 어레이는 샘플 장착부의 일부를 효과적으로 조광하고, 바람직하게는 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 광이 노출되는 부분만을 실질적으로 조광하는 목적으로 본 발명의 다수의 실시예에서 바람직하다.
마이크로 렌즈의 하나의 바람직한 실시예는 원통형 마이크로 렌즈의 어레이를 포함한다. 바람직하게는 원통형 마이크로 렌즈의 제2 또는 그 이상의 어레이(들)과 조합하여 사용되는 경우 이러한 마이크로 렌즈 어레이는 일반적으로 서로 직교 방향이다. 이러한 배열은 본 발명의 다수의 바람직한 실시예에 포함되고, 주로, 샘플 장착부의 부분을 가로지르는 균일한 조명을 생성하고 및/또는 샘플 장착부의 부분 상으로 광원으로부터 방출된 광의 많은 부분을 투과시킴으로써 조명의 효율을 개선시킨다. 다수의 바람직한 실시예에서, 이러한 원통형 마이크로 렌즈의 2개 이상의 어레이의 속성은 실질적으로 동일한 반면, 다른 대개 바람직한 실시예에서 액티브 검출 엘리먼트의 어레이의 형상으로 형상을 적응시키는 조명을 산출하는 것과 같은 속성들은 실질적으로 상이하다. 이러한 형상을 산출하도록 변화되는 마이크로 렌즈의 어레이들의 속성은 예를 들면 렌즈의 피치 및/또는 초점 길이이다.
바람직하게는, 하나 이상의 렌즈(들) 또는 미러(들)과 같은 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출된 광을 포커싱하는 광학 수단을 포함하는 것이 바람직하고, 여기서 이러한 광학 수단은 대상이 되는 평면 내에서의 초점 심도로서 표현되는 노출된 광 신호를 포커싱하는 기능을 가진다. 본 발명의 다수의 바람직한 실시예에서, 이러한 포커싱 수단은 5㎛ 이상, 바람직하게는 10㎛ 내지 15㎛의 범위의 초점 심도를 가진다.
감쇠된 투과 광과 방출된 형광 광을 모두 기록하기 위한 단일한 광학 수단을 사용하기 위해, 바람직하게는 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출된 광의 포커싱에 사용되는 하나 이상의 렌즈(들)는 실질적으로 200nm 내지 1000nm 사이의 파장 영역의 광에 대해 투명하고, 바람직하게는, 이는 300nm 내지 1000nm 사이의 파장 영역에서 투명하고, 보다 바람직하게는 350nm 내지 850nm 사이의 파장 영역에서 투명하다. 바람직하게는, 포커싱에 사용되는 하나 이상의 렌즈(들)는 영역내에서 보정된 광학 수차가 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 렌즈(들)의 투명도는 광의 감쇠가 영역 내에서 3 OD 미만, 보다 바람직하게는 1 OD 미만이 되도록 한다.
형광 광과 같은 방출된 광이 일반적으로 선명도가 약하지면, 감쇠를 판정하는 데에 이용되는 광과 같은 투과 광은 대개 상당한 선명도이다. 다수의 실시예에서, 따라서 광학적 감쇠 필터(optically dampening filter)를 사용하여 광을 감쇠하는 것이 바람직하고, 바람직하게는, 여기서 샘플 장착부 상으로 방출된 광이 감쇠된다. 바람직하게는, 사용되는 감쇠 필터는 1 OD 이상 만큼 투과 광의 선명도를 감소시키는 속성을 가지고, 바람직하게는 3 OD 만큼 투과 광의 선명도를 감소시킨다.
본 발명의 실시예에서의 액티브 검출 엘리먼트의 어레이는 일반적으로 CCD 또는 CMOS 센서 중 어느 하나이다.
본 발명의 다수의 바람직한 실시예에서, 광 감쇠 이미지에 추가하여, 2개 이상의 형광 광 선명도 이미지가 기록되는 경우, 형광 광이 필터 및/또는 간섭 필터와 같은 파장 제한 수단을 이용하여 필터링되고, 바람직하게는, 이들 필터는 이미지들의 기록 사이에 교체될 수 있다. 이들 필터는 선형 병진 이동(linear translation) 또는 회전에 의한 것과 같이 이동되는 픽스처 상에 장착될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출된 광의 광학 배율은 물체의 크기에 대한 샘플 장착부 내의 물체의 임의의 치수의 사영(projection)의 크기의 비율로서 정의된 20:1미만이다. 다른 동일하게 바람직한 실시예는 1:1 내지 20:1 사이, 바람직하게는 1:1 내지 1:10 사이의 광학 배율을 가진다. 다수의 샘플 장착부가 촬상되는 다수의 실시예에서, 광학 배율은 1:1 내지 4:1의 범위 내와 같이 4:1 미만인 것이 바람직하다.
본 발명의 다수의 실시예는 고정된 광학 배율을 가진 수단을 포함하는 반면, 다수의 동일하게 바람직한 실시예는 예를 들면 낮을 배율에서는 세포의 검출을 수행하고 높은 배율에서는 세포의 후속하는 상세한 분석을 수행하는 데에 이용될 수 있는 2개 이상의 광학 배율로 이미지의 기록을 하도록 하는 수단을 포함한다. 일부 바람직한 실시예는 예를 들면 줌과 같은 가변 광학 배율을 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예들 중 다수는 생체 속성의 특성을 평가하기 위한 목적으로 다수의 광 선명도 이미지를 노출시키는 것을 포함하기 때문에, 샘플 또는 샘플 내의 입자의 임의의 움직임이 제어 하에서 유지되고, 보다 바람직하게는 이러한 움직임은 최소로 유지되어야 하는 것이 바람직하다. 따라서, 다량의 액체 샘플이 노출하는 동안 정지해 있는 것이 바람직하고, 여기서 정지 상태(stand-still)는 하나의 노출 동안 동일한 검출 엘리먼트의 경계 내에 실질적으로 포함되는 생체 입자의 이미지의 적어도 일부분이 더 이상 움직이지 않는 상황으로 정의된다. 추가적으로, 2개 이상의 광 선명도 정보의 이미지 생성 동안 검출 엘리먼트의 어레이 상으로의 광의 하나 이상의 노출시, 정지 상태가 유지되는 것이 바람직하고, 여기서 정지 상태는, 생체 입자가 2번의 노출시간 동안 동일한 검출 엘리먼트의 경계 내에 실질적으로 포함되는, 바람직하게는 생체 입자가 2번 이상의, 3, 4, 5, 또는 6번의 노출시간 동안 동일한 검출 엘리먼트의 경계내에 실질적으로 포함되도록, 생체 입자의 이미지의 적어도 일부분이 더이상 움직이지 않는 상황으로 정의된다. 가장 바람직하게는, 정지 상태는 생체 입자의 속성의 평가 동안 처리되는 광 선명도 정보의 모든 이미지의 노출 동안 유지된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 다량의 액체의 샘플은 노출하는 동안 정지해 있고, 보다 바람직하게는 노출 전후 및 그 사이에 정지해 있다. 정지 상태(stand-still)는 어떤 것도 움직이지 않지만, 액티브 활동 및/또는 제어가 없는 의도하지 않게 샘플 상에 작동하는 힘과 같이 예를 들면 침전 또는 발진을 통해 입자를 포함하는 샘플의 부분을 이동시키도록 하는 중력 또는 운동역학적인 것과 같은 힘이 있을 수 있기 때문에, 생체 입자가 액체 내에서 부유하게 되는(suspended) 때와 같이 이러한 상태는 유체 시스템 내에서 획득하기 어려울 수 있다. 따라서, 의도적인 힘이 샘플, 샘플 장착부 또는 움직임을 일으킬 수 있는 검출 수단에 인가되지 않는 상태인 정지 상태를 정의하는 것이 바람직하다. 또다른 바람직한 정의는 정지 상태가 제1 또는 제2 광원을 가지고 노출하는 시간을 통해서와 같이 광원으로 노출하는 시간 동안 동일한 검출 엘리먼트의 경계 내에서 실질적으로 포함되는 생체 입자의 이미지의 적어도 일부가 더이상 움직이지 않고, 바람직하게는 움직임의 발생이 의도적이지 않는 상황으로서 정의된다.
정지 상태의 또다른 동일하게 바람직한 정의에서, 정지 상태는 광 선명도 정보를 수집하는 동안, 바람직하게는 2번 이상의 노출시간 동안 동일한 검출 엘리먼트의 경계 내에서 실질적으로 포함되는 샘플 내의 생체 입자의 이미지가 더이상 움직이지 않도록 샘플이 액티브 검출 엘리먼트의 어레이에 대해 움직이지 않고, 바람직하게는 움직임의 발생이 의도적이지 않는 상황으로서 정의된다. 정지 상태의 또다른 동일하게 바람직한 정의는, 정지 상태가 광 선명도 정보를 수집하는 동안, 바람직하게는 2번 이상의 노출시간 동안 동일한 검출 엘리먼트의 경계 내에서 실질적으로 포함되는 샘플 내의 생체 입자의 이미지가 더이상 움직이지 않도록 샘플이 액티브 검출 엘리먼트의 어레이에 대해 움직이지 않고, 바람직하게는 움직임의 발생이 의도적이지 않는 상황으로서 정의된다.
정지 상태를 획득하기 위한 하나의 바람직한 방법은, 현탁액 내의 생체 입자가 샘플 장착부의 내부의 하부 및/또는 상부 경계로 침전 및/또는 부유하여, 샘플 장착부에 대해 생체 입자의 정지 상태를 획득하도록, 측정을 시작하기 전에 샘플 및/또는 샘플 장착부의 이동 후 충분한 시간동안 현탁 생체 입자(suspended biological particles)를 가진 샘플이 정지하도록 한다. 바람직하게는, 생체 입자의 침전 및/또는 부유는 240초 미만, 바람직하게는 100초 미만, 바람직하게는 45초 이내의 상대적으로 짧은 시간 내에 구현된다. 보다 바람직하게는 침전 시간은 10초 보다 더 길고, 바람직하게는 10초 내지 240초 사이의 범위이고, 보다 바람직하게는 30초 내지 120초 사이의 범위이다. 정지 상태는 샘플이 샘플 장착부에 대해 움직이지 않는 상황으로 정의될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 정지 상태는 적어도 10초, 적어도 9초, 적어도 8초, 적어도 7초, 적어도 6초, 적어도 5초, 적어도 4초, 적어도 3초, 적어도 2초, 적어도 1초의 기간 동안으로 정의된다. 바람직하게는, 이 기간은 노출 전, 노출 동안 및/또는 노출 이후가 될 수 있다.
분석된 샘플의 크기는 일반적으로 분석되는 개별 입자의 수에 직접 상관되기 때문에, 분석되는 샘플의 체적은 일반적으로 생체 입자의 평가의 통계적 품질에 연관된다. 예를 들면, 생체 입자의 평가가 개별 입자의 카운팅에 관한 것일 때, 카운팅된 입자의 총 수가 결과의 정밀도를 결정한다. 분석되는 샘플의 체적에 대해 영향을 주는 하나의 파라미터는 자신의 벽 부분에 의해 정의되는 샘플 장착부의 두께이고, 따라서 샘플 장착부의 내부가 20㎛ 내지 1000㎛ 사이의 평균 두께를 가지는 본 발명의 다수의 실시예가 바람직하다. 이러한 그리고 다른 바람직한 실시예는 20㎛ 내지 100㎛ 사이의 평균 두께를 가진다. 이상적으로 샘플 장착부의 두께는 균일하지만, 놀랍게도 분석되는 샘플 장착부의 부분의 평균 두께가 알려져 있는 한은 균일한 두께로부터 실질적인 편차가 평가의 결과를 손상시키지 않는다는 것이 알려졌다. 추가로, 생체 입자의 평가가 샘플의 단일한 분석에 대해서만 의도되는 샘플 장착부과 같은 실질적으로 1회용(disposable) 샘플 장착부에서 수행되는 실시예에서, 각각의 샘플 장착부의 평균 두께가 공지되거나, 바람직하게는 시스템에 의해 판정되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 전자기 복사가 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출되는 액체 샘플의 체적은 0.05μL 내지 5μL 사이와 같은 0.01μL 내지 20μL 사이의 범위에 있다. 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출되는 평가되는 샘플의 총 체적이 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출되는 샘플 장착부의 부분의 면적 및 샘플 두께를 포함하는 다수의 요소에 따르기 때문에, 이러한 체적을 판정하기 위해 본 발명의 다수의 특징들을 조합할 수 있지만, 바람직한 실시예의 다수는 0.05μL 내지 1.0μL 사이에서의 단일한 노출로 분석되는 체적을 가져온다. 평가하는 총 체적은 바람직하게는 샘플의 추가적인 부분을 노출시키고, 상이한 부분으로 샘플 장착부 내의 샘플의 부분을 대체하거나 또는 샘플 장착부를 이동시켜 샘플 장착부의 어레이 상으로 샘플 장착부의 상이한 부분을 노출시킴으로써 더 증가될 수 있다. 샘플 또는 샘플의 일부의 배치 또는 대체는 펌프, 플런저와 같은 펌핑 수단으로 샘플 또는 샘플의 일부를 샘플 장착부로 펌핑하거나 및/또는 모세관력 및/또는 중력과 같은 힘에 의해 달성될 수 있다. 샘플 또는 샘플의 일부의 배치 또는 대체 후에, 샘플 또는 샘플의 일부는 샘플 장착부 내부에서 정적이고, 바람직하게는 샘플 또는 샘플의 일부에 대한 힘의 인가와 같은 의도적인 동작이 없는 것에 기인하여 정적이 되고, 그 샘플 장착부는 본 발명에 따라 샘플 또는 샘플의 일부를 분석 및/또는 평가하도록 주변으로 이동될 수 있다.
일반적으로 광 선명도 정보를 노출하는 광학 배열의 가시 영역(view area)에서의 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출되는 샘플의 체적을 판정하는 데에 현저하게 기여하는 하나의 일반적으로 바람직한 실시예는 가시 영역이 실질적으로 고정되는 실시예들을 포함하거나, 또는 동일하게 바람직한 실시예에서 가시 영역이 광학 컴포넌트의 조정에 기초하여 판정될 수 있다. 단일한 노출시 분석되는 체적을 판정하는 하나의 바람직한 실시예는 노출 시스템의 액티브 가시 영역에 관한 정보와 샘플 장착부의 두께에 관한 정보를 조합하는 것이다. 본 발명의 실시예에 따라, 샘플 장착부의 두께는 사용시 샘플 장착부에 대해 개별적으로 판정된다. 추가로, 샘플 장착부는 샘플의 단일한 분석을 의도하고, 다수의 바람직한 실시예에서, 샘플 장착부는 단일한 샘플의 분석에 대해서만 사용될 수 있다.
생체 입자는 유형 및 속성에 있어서 다양하지만, 본 발명의 다수의 실시예에서 평가되는 입자, 파라미터 또는 파라미터들의 크기가 0.1㎛ 내지 100㎛ 사이의 크기인 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 입자의 크기는 일반적으로 입자의 평균 직경이고, 다수의 동일하게 바람직한 실시예에서, 이 생체 입자의 평균 크기는 0.1㎛ 내지 20㎛ 사이이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 크기는 5㎛ 내지 15㎛ 사이이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 크기는 적어도 15㎛m, 적어도 14㎛, 적어도 13㎛, 적어도 12㎛, 적어도 11㎛, 적어도 10㎛, 적어도 9㎛, 적어도 8㎛, 적어도 7㎛, 적어도 6㎛, 적어도 5㎛, 적어도 4㎛, 적어도 3㎛, 적어도 2㎛, 또는 적어도 1㎛과 같이 1㎛ 내지 15㎛ 사이이다.
이러한 입자들의 속성뿐만이 아니라 생체 입자의 차이는 크기 때문에, 본 발명의 실시예는 다수의 생체 샘플 및/또는 생체 샘플의 입자의 정량 파라미터 및/또는 정성 파라미터를 평가하는 데에 이용될 수 있다. 이러한 다수의 바람직한 파라미터 중에는: 액체 샘플의 체적 당 생체 입자의 수, 생체 입자의 직경, 면적, 원주, 대칭성, 원형, 생체 입자의 접착 및/또는 클럼핑 정도의 판정이 있고, 바람직하게는, 여기서 클럼핑 정도는 세포 덩어리 내에서 개별 세포의 수를 실질적으로 판정하도록 한다. 다른 동일하게 바람직한 파라미터는 생체 입자의 종, 생체 입자의 대사(metabolic) 상태, 핵의 수, 크기 및 형상과 같은 세포 내 속성이 있다.
바람직하게는, 평가가 하나의 이미지가 광의 감쇠를 나타내는 2개 이상의 이미지의 공간 광 선명도 정보의 기록을 포함하는, 샘플 내의 생체 입자의 추가적인 하나의 속성은 공간 광 선명도 이미지 내의 생체 입자의 실질적인 위치이다. 이 입자의 위치는 바람직하게는 형광과 같은 다른 광 선명도 정보를 입자에 대해 상관시키도록 사용된다. 이는 예를 들면 복수의 개별 입자들 중에서 일부 입자들이 이러한 다른 광 선명도 정보를 반영하는 반면 다른 입자들이 실질적으로 이 광 선명도 정보를 반영하지 않는 것으로 예측될 수 있을 때 바람직하다. 이러한 광 선명도 정보의 실질적인 부재는 그것이 때때로 배경으로부터 구별될 수 있는 정보를 나타내지 못하기 때문에 광 선명도 정보에만 기초하여 이러한 입자의 존재를 판정하는 것을 어렵게 할 수 있다. 이러한 예시에서, 대개 입자의 위치는 다른 이미지의 공간 이미지 선명도에 기초하여 도출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예는 생체 샘플 및/또는 생체 입자의 속성 평가를 위한 방법을 포함하고, 여기서 이미지의 공간 광 감쇠 정보가 기록된다. 이들 실시예의 다수는 바람직하게는 이미지 정보 처리 단계에 포함되는 추가적인 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록하는 단계를 더 포함하고, 여기서 추가적인 공간 광 선명도 정보는 형광에 관한 정보이다. 다수의 실시예에서, 이러한 추가적인 형광 이미지 정보는 샘플 장착부의 벽 부분을 통과하여 지나는 광원으로부터의 여기 광에 의해 생성되고 감쇠 이미지 정보를 생성하도록 이용되고, 여기서 방출 필터가 채용되어 형광을 산출한다. 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 이러한 추가적인 형광 정보 이미지는 추가적인 광원으로부터의 여기 광에 의해 생성된다. 더 많은 정보가 하나 또는 2개 이상의 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록함으로써 전체적으로 기록되기 때문에, 일반적으로 감쇠 정보의 이미지에 추가하여 2개의 추가적인 형광 정보 이미지가 이미지의 처리 단계에 포함되는 것이 바람직하고, 일반적으로 3, 4 또는 5개의 추가적인 형광 정보 이미지를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 하나의 실시예에 따라, 이미지의 공간 광 선명도 정보가 기록되고, 여기서 공간 광 선명도 정보는 샘플 장착부의 벽 부분을 통과하여 지나는 제2 광원으로부터의 여기 광에 의해 발생하는 형광에 관한 정보이다. 다른 바람직한 실시예에서, 제2 공간 형광 광 선명도 정보는 제3 광원으로부터의 여기 광에 의해 발생된다. 본 발명의 또다른 실시예에서, 제3 이미지의 제3 공간 광 선명도 정보가 기록되고, 여기서 제3 공간 광 선명도 정보는 샘플 장착부의 벽 부분을 통과하여 지나는 제2 또는 제3 광원으로부터의 여기 광에 의해 발생되고, 바람직하게는 제4 또는 후속하는 광원으로부터의 여기 광에 의해 발생되는 형광에 관한 정보이다. 본 발명의 제3 실시예에서, 제4 이미지의 제4 공간 광 선명도 이미지가 기록되고, 여기서 제4 공간 광 선명도 정보는 형광에 관한 정보이다.
생체 샘플 및/또는 생체 입자의 파라미터가 처리 단계에서 포함되는 다중 이미지를 포함하는 본 발명의 실시예에서, 필요한 이미지 정보를 획득하기 위해 2개 이상의 광원을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 일반적으로 2, 3, 4, 또는 5개의 개별 광원인 광원의 수와 속성은 광의 파장 및 선명도, 감쇠 및 산란과 같은 속성을 형광 배경 억제의 경우에 반영한다.
이러한 다중 이미지 처리의 다수의 매우 바람직한 실시예에서, 생체 입자의 위치에 관한 공간 정보가 이미지의 공간 광 선명도 정보 처리의 통합된 특징인 것이 바람직하다.
다중 이미지 정보의 처리를 포함하는 실시예에서, 평가될 수 있는 생체 입자의 파라미터는 바람직하게는 생체 입자의 종의 평가, 생체 입자의 상태 중 하나 또는 다수가 될 수 있고, 바람직하게는, 여기서 생체 입자의 상태는 세포 주기, 생존력, 생명력, 아포토시스, 운동성과 같은 대사 상태이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 제1 공간 광 선명도 이미지 내의 생체 입자의 위치는 생체 입자에 연관된 광 선명도 정보의 또다른 기록된 이미지에서의 광 선명도 정보의 존재를 판정하기 위해 이용되고, 바람직하게는 여기서 다른 광 선명도 정보는 형광이다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시예에서, 생체 입자의 위치는 제1 및 제2 이미지의 공간 광 선명도 정보에서의 정보를 조합함으로써 판정되고, 여기서 이미지는 이미지에 대해 실질적으로 상이한 변조 수단을 적용하고 제1 광원으로부터의 조명을 이용하여 기록되고, 바람직하게는, 여기서 이미지는 암시야 및 명시야 이미지이다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시예에서, 생체 입자의 위치는 3개 이상의 이미지의 공간 광 선명도 이미지 정보 내에서의 정보를 조합함으로써 판정되고, 여기서 이미지는 제1 광원으로부터의 조명을 이용하고 이미지에 대해 실질적으로 상이한 변조 수단을 적용함으로써 기록된다. 생체 입자에 연관된 제2 또는 추가적인 광 선명도 정보의 선명도의 판정은 생체 입자의 종 및/또는 상태의 평가에 이용될 수 있다. 대안으로, 생체 입자에 연관된 제2 또는 추가적인 광 선명도 정보의 선명도의 판정은 바이오 마커(bio marker)를 포함하는 생체 입자의 종 및/또는 상태의 평가를 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 다수의 실시예에서, 사용되는 광원은 조정가능한 고체 상태 광원이다. 조정가능한 광원의 존재는 본 발명에 따른 시스템 설계를 현저하게 간단하게 만들 수 있고, 또한 조정가능한 고체 상태 광원이 형광 광의 여기를 위해 사용될 때와 같이 더 큰 유연성을 허용한다. 바람직하게는, 이러한 조정가능한 고체 상태 광원은 발광 다이오드(LED) 또는 레이저 다이오드 중 하나이다.
예시 1
이미지 세포 계수기
도 1은 본 발명의 다수의 바람직한 실시예들을 포함하는 이미지 세포 계수기의 가능한 구성을 도시한다. 도면은 4개의 주된 컴포넌트 그룹인, 샘플 홀더(100), 조명 수단(110), 이미징 수단(120) 및 검출 수단(130)에 대해 설명한다. 최종적으로는 도 1은 광 컴포넌트의 대부분이 그를 따라서 배열된 이미지 세포 계수기(140)의 주된 광축을 도시한다.
샘플 홀더는 샘플이 이미징 수단을 가지고 초점이 정렬되는 것을 보장하기 위해 이미징 수단에 대해 광축을 따라서 이동될 수 있다. 샘플 장착부(101)은 광 경로 내의 샘플 스테이지(102) 상에 배치된다. 샘플 장착부는 일반적으로 샘플 스테이에 부착되지만, 그것은 이미지 세포 계수기로부터 제거될 수 있고 다시 수동 또는 자동 프로세스를 통해서 대체될 수 있도록 세포 장착부가 샘플 스테이지로부터 해제될 수 있다. 샘플 스테이지는 광축에 대해 직교하는 2개의 방향으로 이동할 수 있다. 이는 세포 장착부 내부의 샘플의 상이한 부분들이 평가되도록 한다.
조명 수단은 샘플 장착부의 원하는 조명을 유지하기 위해 광축을 따라서 이동할 수 있다. 조명 수단은 대개 2개 이상의 광원(3개로 도시됨)을 포함한다. 예시는 대개 명시야 또는 암시야 이미지와 같은 패시브 광 감쇠 및/또는 산란 속성의 이미지를 생성하는 목적일 때만이 샘플의 조명이 검출기를 향한 방향으로 되어있도록 광축(111) 상에 위치된 광원을 도시한다. 추가로, 예시는 2개의 형광 광원(112)을 도시하고, 이는 입자로부터의 신호가 배경으로부터의 신호와 상이한 것으로서 식별되는 조건을 개선하는 것으로 알려진 광축에 대한 일정한 경사로 샘플 장착부를 조광한다. 그것은 단일한 배열로 2개의 발광 다이오드를 배치함으로써 2개의 파장을 방출하는 광원(112b)뿐만이 아니라 단일한 파장을 방출하는 광원(112a)을 더 도시한다.
이미징 수단은 명목 배율(nominal magnification)과 같은 실질적으로 상이한 속성을 가진 2개 이상의 집속 대물렌즈(collection objective)(121a 및 121b)를 교체하는 것이 가능한 배열로 되어있는 집속 대물렌즈(121)를 포함한다. 2개 이상의 집속 대물렌즈는 선형 또는 원형 이동 중 어느 하나에 의해 교체된다. 광 변조 수단은 바람직하게는 2개 이상이고, 필터, 어퍼처, 장애물 또는 위상차 엘리먼트와 같은 각각 Yi(122) 및 Xi(123)로 라벨링된 다수의 광학 액티브 컴포넌트를 포함한다. 광 변조 수단은 광학 컴포넌트의 각각이 집속 대물렌즈로부터 방출되는 광선내에 배치될 수 있도록 광축에 대해 직교하여 이동될 수 있고, 움직임은 선형 또는 원형이 될 수 있다. 각각의 광 변조 수단은 바람직하게는 모든 광 변조 수단이 배열되는 경우 이러한 빈 공간의 위치가 광선 내에 위치되고 변조가 발생하지 않도록 광학 컴포넌트가 없는 위치를 가진다. 이미징 수단은 집속 대물렌즈로부터의 광이 검출기 상으로 포커싱하는 포커싱 수단(124)을 포함한다.
검출 수단은 광 선명도 정보의 포커싱된 이미지를 기록하기 위해 광축을 따라서 이동될 수 있다. 정보는 액티브 검출 엘리먼트의 어레이(131), 광 감지 카메라를 이용하여 수집된다.
이미지 세포 계수기의 작동과 데이터의 수집은 컴퓨터 수단(도시되지 않음)에 의해 제어된다. 컴퓨터 수단은 바람직하게는 생체 입자의 자동 식별 및 평가를 위해 사용될 수 있는 이미지 처리 수단이 장치된다.
예시 2
저 파장 현미경의 속성
본 발명에 따른 명시야 현미경에서의 컨트라스트는 주르카트 세포(인간 백혈병 세포주, 서브 클론 A3, ATCC CRL-2570)의 샘플을 측정하여 조사되었다. 측정은 상이한 파장의 4개의 광원을 이용하여 수행되었다. 광원 중 3개는 단일 색의 협소한 대역의 발광 다이오드(LED)이고 4번째 광원은 광대역의 백색 LED이다. 모든 광원은 방출 광이 샘플을 통과할 때 시준되는 광학 배열로 되어있다.
협소한 대역의 LED로부터의 출력은 변조되지 않고 사용되지만, 백색 LED로부터의 출력은 협소한 대역의 필터를 이용하여 변조되면서 변조되어 사용된다. 백색 LED로부터의 광대역 광은 가시광 현미경의 일반적인 상태를 나타낸다. 측정시 사용되는 협소한 대역의 광의 주된 파장들은 하기의 표 2-1에 나열되어있다:
(표 2-1)
광원의 목록
현탁액 내의 주카르트 세포를 포함하는 샘플은 약 100㎛ 두께의 샘플 장착부로 로딩된다. 샘플 장착부는 광학 시스템 내에 배치되고, 명시야 정보가 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 2x 선형 배율을 이용하여 포커싱된다. 이미지의 각각의 포커스 및 광 선명도는 비슷한 결과를 산출하도록 조정된다.
이미지 내의 정보는 광의 상대적인 감쇠의 측정인 배경의 선명도에 대한 세포의 통합된 선명도의 비율로서 개별 세포의 총 선명도 컨트라스트를 판정함으로써 분석된다. 컨트라스트 판정의 결과가 도 2a의 그래프로 제시되고, 이는 광원의 대역의 함수로서 관측된 컨트라스를 도시한다. 그래프에서, 백색 LED의 광대역 광을 이용할 때 관측된 총 선명도 컨트라스트를 나타내는 400nm으로부터 750nm까지의 파장 범위에서 실선이 그려져있다.
도 2b 내지 2g는 기록된 이미지의 예시를 도시한다. 도 2b는 365nm의 광을 이용하여 기록된 이미지이고, 2c는 400nm의 광을 이용하고, 2d는 백색광을 이용하고, 도 2e는 710nm의 광을 이용하여 기록된 이미지이다. 이미지는 이미지 내의 컨트라스트가 세포의 존재 및 공간 위치의 정확한 식별을 목적으로 생체 입자의 이미지 표시에 매우 큰 영향을 주는 것을 나타낸다.
도 2f 및 2g는 더 고해상도의 집속된 이미지의 섹션들을 도시한다. 도 2f에서는, 365nm 광을 이용하는 이미지이고, 도 2g에서는 710nm 광을 이용하는 이미지이다. 이미지들이 유사한 조건 하에서 집속되더라도, 이미지는 400nm 이하의 파장의 광을 이용하여 장파장의 광을 이용하여 집속된 이미지 보다 더 상세한 것을 도시하는 이미지를 가져온다는 것을 보여준다. 365nm의 광의 이미지는 장파장 이미지에 대한 것보다 형상, 크기 및 상대적 위치에 관해 보다 더 상당한 상세사항을 도시한다.
예시 3
배경에 대한 신호의 개선
생체 샘플의 형광 분석을 수행할 때, 이미지에서 충분한 컨트라스트를 획득하기 위해 여기 및 방출 광을 관리하는 것이 중요하다. 기본적으로 컨트라스트를 개선하는 2가지의 접근 방법이 있는데, 먼저, 형광의 여기에 사용되는 것 보다 더 긴 파장의 광을 감소시키기 위해 여기 필터를 사용하는 것과, 둘째, 액티브 검출 엘리먼트의 어레이에 도달하는 형광 광보다 더 짧은 파장의 광을 감소시키는 방출 필터를 이용하는 것이다.
신호 컨트라스트가 중요한 측면인 고 감도 형광 분석을 수행하기 위해, 수집된 선명도 정보에 영향을 주는 광학 시스템의 모든 측면을 고려할 필요가 있다. 이는 여기 선명도, 시스템의 임의의 컴포넌트의 자가 형광 및 광학 필터의 감쇠와 같은 측면들을 포함한다. 생체 샘플의 형광 공간 선명도 정보 수집시 컨트라스트를 개선하는 태스크에서, 먼저 형광 신호의 선명도를 최적화하고 두번째로 배경 신호를 최소화하는 것이 중요하다. 형광 신호의 선명도는 주로 여기 광의 선명도에 의해 판정된다. 배경 신호의 선명도는 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 여기 광을 노출시키는 것과 광학 컴포넌트의 자가 형광의 선명도와 같은 다수의 측면들에 따른다.
이상적으로 여기 광을 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 노출시키는 것은 무한 감쇠 또는 차단을 하는 방출 필터를 사용하여 제거될 수 있다. 이러한 이상적인 필터는 구현하는 것이 어렵고 필터들은 일반적으로 10-6 내지 10-7과 같이(6 및 7 사이의 차수의 크기의 감쇠) 주어진 파장에서의 일 부분으로 광을 감쇠시키고, 따라서 고 품질 필터에 추가하여 여기 광의 노출에 영향을 주는 다른 측면들을 고려하는 것이 필요하다. 액티브 검출 엘리먼트의 어레이의 시야에 대한 여기 광원의 방향은 검출 엘리먼트 상으로의 여기 광의 노출에 큰 영향을 줄 수 있고, 여기서 검출 엘리먼트의 시야의 축을 따라서 직접적으로 있는 전체적인 방향은 일반적으로 노출된 여기 광을 최상의 선명도까지 상승시킨다. 시야 축으로부터의 여기 광의 전체적인 방향은 검출 엘리먼트 상으로 노출된 여기 광의 선명도를 감소시킬 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 여기 광은 샘플 장착부과 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 사이의 축에 대해 일정한 각도로 샘플 장착부 내의 샘플을 향하여 지향된다. 여기 광의 전체 축이 샘플 장착부과 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 사이의 축에 대해 약 40°로 있는 이러한 실시예가 도 3a에 도시된다. 도 3a는 샘플 장착부의 바닥을 정의하는 투명한 벽 부분(303)과 샘플 장착부의 최상부를 정의하는 또다른 투명한 벽 부분(304)에 의해 정의되는 샘플 장착부로부터의 광을 집속하는 집속 대물렌즈(301)를 도시한다. 대물렌즈는 방출 필터(302)를 통하여 샘플 장착부로부터의 광을 투과시키고, 그것을 액티브 검출 엘리먼트(도시되지 않음)의 어레이 상으로 촬상시킨다.
여기 광은 발광 다이오드(305)에 의해 산출되고, 그로부터의 광이 하나 이상의 렌즈(2개로 도시됨) 및 여기 필터 및 광 산란 엘리먼트와 같은 하나 이상의 광 변조 엘리먼트(2개로 도시됨)로 구성되는 여기 광 모듈(306) 내의 제1 렌즈에 의해 집속된다. 여기 광 모듈로부터의 광은 여기 광(307)의 광선의 경계에 의해 지시되는 바와 같이 샘플 장착부 상으로 포커싱된다. 도면에 도시된 바와 같은 조건하에서, 여기 광의 일부가 산란(도시되지 않음) 또는 여기 광선의 일부가 수광각 이하의 각도로 집속 대물렌즈(307a)의 개구를 통해 들어갈 때 발생할 수 있는 직접 조명 중 어느 하나에 의해 집속 대물렌즈의 시야로 들어갈 수 있는 것이 가능하다. 이 광의 큰 부분은 형광 광이 도달하는 것이 허용되는 동안 그것이 검출 엘리먼트(309)에 도달하기 전에 방출 필터에 의해 제거된다(310). 방출 필터가 크게 감쇠하지만, 그것은 예를 들면 10-7의 인수로 제한되고, 이것은 설사 작을지라도 광의 이러한 부분이 검출 엘리먼트에 도달할 수 있다는 것을 의미한다. 추가적으로, 집속 대물렌즈의 엘리먼트는 방출 필터를 통과하고 검출 엘리먼트 상에 배경 이미지를 산출하는 형광(자가 형광)을 산출할 수 있다.
도 3b는 여기 광 광선(307a)의 부분에 대응하는 집속 대물렌즈의 입구에서의 광 선명도의 예를 제공한다. 여기 모듈의 컴포넌트의 배열로부터, 여기 광 모듈의 어퍼처를 제한함으로써 이러한 광을 감소시키는 것이 가능하지만, 이는 샘플 장착부 상으로 노출된 여기 광의 총 크기를 감소시켜 형광 선명도를 유사하게 감소시킨다. 본 발명의 바람직한 실시예가 도 3c에 도시되고, 여기서 장애물(들)(311)이 여기 광 모듈에 배치되어, 집속 대물렌스의 시야 안으로 들어가는 광선을 상당히 제거하는 여기 광의 광선(312)을 변화시킨다.
도 3d는 여기 광의 변조 광선의 선명도 프로파일을 도시하고, 여기서 일부분이 장애물에 의해 제거된다. 도 3e는 그 결과인 집속 대물렌즈로 들어가는 광선명도를 도시하고, 도 3b와 비교하여 광의 신장이 크게 제거되지만, 추가적으로 본 예시에서 도 3e가 여기 광의 선명도가 효과적으로 감소되었음을 도시하면서 약 x200의 인수만큼 증폭되도록 하기 위해 2개의 이미지가 크기조정되었다는 것에 주의하는것이 중요하다.
하기의 표 3-1은 집속 대물렌즈로 들어가는 여기 광의 선명도 및 여기 조명의 선명도에 대한 장애물의 크기의 효과를 나타낸다. 표는 집속 대물렌즈로 들어가는 여기 광의 광선의 상대적 크기 뿐만이 아니라 샘플 장착부 상으로 노출된 여기 광의 상대적 크기를 나타낸다. 장애물은 여기 광 모듈 내부의 원통형 광선으로 선형 스크린을 배치함으로써 형성되고, 보고된 값은 광선의 직경에 대한 장애물의 삽입이다.
(표 3-1)
여기 광 및 집속 대물렌즈에서의 광
예를 들면 상대적으로 적은 형광색소를 함유한 약 형광 입자의 분석시 효과는 일반적인 조건을 이용하여 하기에서 제시된다. 본 발명의 실시예에서, 0.20의 개구수(NA)를 가진 집속 대물렌즈를 사용한다고 가정해보자. 추가로, 입자의 형광 전환 효율은 2x10-6이고 유사하게 샘플 장착부의 형광 전환 효율은 2x10-7이고, 이 형광은 투명 벽 부분내의 불순물 및/또는 기타 재료로부터 발생한다. 방출 필터는 집속 대물렌즈로 들어가는 대부분의 여기 광을 감쇠시키지만, 집속 대물렌즈로 들어갈 때 광은 집속 대물렌즈 내의 기타 재료뿐만이 아니라 광학 컴포넌트 내의 불순물에 의해 발생되는 실질적인 배경 형광을 증가시킬 수 있고, 이 형광의 실질적인 부분이 방출 필터를 통과한다. 따라서, 집속 대물렌즈로 들어가는 여기 광에 의해 발생되는 방출 필터를 통과하여 검출 엘리먼트로 투과되는 전체 광 선명도가 있고, 방출 필터를 통과하는 산란, 노출, 및 형광 광의 전체 선명도는 5x10- 7으로 가정할 수 있다.
이러한 조건은 생체 입자로부터의 형광 선명도를 평가하는 것이 매우 어려운 시스템을 기술하는데, 배경의 전체 선명도가 입자로부터 관찰되는 형광 선명도의 총 선명도의 약 3배이기 때문이다. 장애물을 여기 광 모듈 내의 여기 광 광선내에 삽입함으로써, 집속 대물렌즈로 들어가는 광의 크기를 감소시켜 배경 신호를 현저하게 억제할 수 있다. 표 3-1에서, 동시에 샘플 장착부로 들어가는 여기 광의 총 크기가 또한 매우 더 적은 정도로 감소되었다는 것을 제시하였다. 이러한 효과는 하기의 표 3-2에서 나타내며, 이는 정규화된 형광 및 배경 신호를 나타낸다.
(표 3-2)
정규화된 형광 및 배경 신호
표 3-2는 총 배경 신호가 신호/배경(S/B) 값에 예시된 형광 선명도 보다 더 빠르게 현저하게 감소되는 것을 보여준다(괄호는 배경 신호에 대한 형광 신호의 비율에서의 상대적 차이이다). 표 3-2의 결과는 이러한 조건하에서 S/B 비율은 광선 직경의 약 25%를 커버하는 여기 광의 광선에 장애물을 배치함으로써 거의 30배(fold) 증가하는 것을 제시한다. 이러한 조건하에서, 형광 광의 선명도는 단지 23%만이 감소되었다.
예시 4
입자의 표준 검출
본 발명에 따른 시스템은 일반적으로 유동 세포 계수기 기기를 교정하는데 사용되는 교정 비드를 식별하고 정량화하기 위해 사용되었다. 비드는 상이한 선명도의 형광을 산출하는 8 그룹을 구비하는 직경 3㎛ 비드의 세트인, Spherotech USA의 레인보우 교정 입자(Rainbow Calibration Particles)(P/N RCP-30-5A)이다.
본 발명의 이미지 세포 계수기는 약 475nm의 협소한 대역의 여기 광으로 샘플을 조광하고 약 536nm의 대역에서의 형광 방출을 검출하도록 설정된다. 샘플 장착부로부터의 광은 0.20의 NA를 가진 4x 집속 대물렌즈를 이용하여 집속되고 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 상으로 포커싱된다. 비드는 공급자에 의해 제공되는 명령에 따라 처리되고 약 100㎛ 두께의 샘플 장착부에 배치된다.
일련의 이미지의 공간 광 선명도 정보가 액티브 검출 엘리먼트의 어레이에 의해 수집되고, 먼저 공간 명시야 광 선명도 정보의 노출이 입자의 위치에 관한 정보 획득 목적으로 수집되고, 두번째로는 공간 형광 광 선명도의 노출이 300ms의 전체 시간을 이용하여 수집된다. 총 35 쌍의 명시야 및 형광 이미지가 샘플 장착부를 이동시킴으로써 샘플의 상이한 부분으로부터 수집되어, 총 70 광 선명도 이미지를 가져온다.
각각의 명시야 이미지는 입자의 위치를 판정하는 데에 이용되고, 이 정보는 그 위치에서의 각각의 입자로부터의 형광 광의 총 선명도를 통합시킨 형광 이미지의 정보를 얻는 데에 이용된다. 총 12,750 입자가 분석되고 그 결과가 관찰된 형광 선명도의 히스토그램을 도시하는 도 4에서 제공된다. 도면은 교정 비드의 공급자에 의해 제공된 스펙에 따라 8개의 상이한 선명도 그룹의 명확한 차이를 도시한다. 이는 본 발명에 따른 이미지 세포 계수기의 감도가 오늘날의 일반적인 흐름 세포 계수기와 유사하다는 것을 나타낸다.
예시 5
명시야/암시야 구성
접착 WeHi-S 세포(뮤린 섬유 육종 세포주)의 샘플이 도 5a에 개략적으로 도시된 본 발명의 이미지 세포 계수기에 배치되고, 약 365nm의 협소한 대역의 광을 방출하는 광원(503)으로 조광된다. 광원은 액티브 검출 엘리먼트의 어레이(509)로부터 2개의 투명한 벽 부분(502 및 503)에 의해 정의된 샘플 장착부로 뻗어있는 광축 상에 위치되고 검출 엘리먼트를 향해 광을 노출시킨다.
노출된 광은 광학 수단(507)을 통과하여 지나서, 그것이 집속 대물렌즈(501)의 광축에 대해 실질적으로 평행인 광 선을 형성하도록 한다. 그 광의 실질적인 부분이 광을 검출 엘리먼트로 포커싱하는 집속 엘리먼트(508)에 의해 멀어지는 방향으로 지향되도록, 사용되는 집속 대물렌즈의 속성은 광원으로부터 방출된 평행 광이 대물 렌즈와 액티브 검출 엘리먼트의 어레이 사이의 광축을 따라서 위치된 평면(506)으로 실질적으로 포커싱되도록 한다. 그 광이 샘플의 입자에 의해 방향이 바뀌고 그런다음 샘플의 그 위치로부터의 광이 광 선명도를 감쇠시켜 입자의 공간 명시야 이미지를 형성하지 않는 한은, 이러한 배열을 사용하여, 광원으로부터 방출되고 집속 대물렌즈를 통과하는 광의 부분은 검출 엘리먼트로 들어가서 균일한 배경 선명도를 형성한다.
입자에 의해 방향이 바뀐 광은 입자의 엘리먼트에 의해 영향을 받는다. 이러한 방향이 바뀐 광은 방향을 변경하고, 다수의 방향으로 방출되고, 상이한 방향의 광의 선명도가 입자 속성에 의해 판정된다. 방향이 바뀐 광의 일부는 집속 대물렌즈로 들어가 입자로부터 발생한 상이한 방향의 광의 다발(505)을 형성한다. 집속 대물렌즈로 들어가는 방향이 바뀐 광은 그것이 집속 엘리먼트 상으로 포커싱되는 집속 엘리먼트에 도달할 때 실질적으로 평행한 광선을 형성한다. 이러한 방향이 바뀐 광은 샘플의 명시야 이미지와 혼합된 공간 이미지의 광 선명도 정보를 형성하며, 그 예시가 도 5d에 제시된다.
도 5b는 집속 대물렌즈와 검출 엘리먼트 사이에 위치된 광원으로부터 방출된 실질적으로 평행인 광의 초점 평면 상에 배치된 장애물(510)을 도시한다. 이 장애물은 디스크 내의 구멍에 의해 형성된 어퍼처이고, 구멍의 치수는 그것이 실질적으로 광원으로부터의 광만이 입자에 의해 산란된 광을 제거하면서 검출 엘리먼트에 도달하는 것을 허용하도록 하는 치수이다. 그의 예시가 도 5e에 제시된 그 결과인 이미지는 명시야 광 정보의 공간 이미지이고, 여기서 컨트라스트는 상술한 상기 어퍼처의 장애물이 없는 배열과 비교하여 실질적으로 개선된다. 이러한 명시야 이미지의 포커싱이 샘플 장착부를 통과하는 광의 시준 정도, 및 장애물의 어퍼처의 크기에 크게 종속되어 실질적으로 큰 초점 심도를 가진 이미지를 가능하게 하기 때문에, 이러한 배열의 추가적인 속성은 이러한 명시야 이미지가 집속 대물렌즈의 포커싱에 상당히 덜 민감하도록 하는 것이다.
도 5c는 집속 대물렌즈와 검출 엘리먼트 사이에 위치된 광원으로부터 방출된 실질적으로 평행인 광의 초점 평면 상에 배치된 장애물(511)을 도시한다. 이러한 장애물은 그것이 입자에 의해 산란된 광만이 광원으로부터 직접 방출된 광을 제거하면서 검출 엘리먼트에 도달하는 것을 허용하도록 위치되고 그러한 치수를 가진다. 그 예시가 도 5f에 제시된 결과인 이미지는 샘플 내의 입자의 암시야 이미지 정보의 공간 이미지이다.
도 5g는 굴절률에 대해 그 속성이 생체 입자의 속성과 유사한 구면 물체와 상호작용하는 광선을 도시한다. 광선이 굴절률에서의 차이에 기인하여 굴절인 입자(521)를 평행 광(520)이 조광할 때, 굴절 정도는 입자의 광학 속성에 의해 판정되는 것이 도시된다. 입자(522) 주위를 지나가는 광은 집속 대물렌즈(도시되지 않음)로 들어가서 여전히 시준된다. 광의 일부는 큰 각도로 산란되어(523), 그것들이 입구 외부의 집속 대물렌즈의 입구의 평면을 조광하여, 검출 엘리먼트의 어레이(도시되지 않음)에 도달하지 못하게 되도록 한다. 다른 광선이 작은 각도로 굴절되어(524), 그것들이 집속 대물렌즈에 들어가 검출 엘리먼트 상에서 촬상되도록 한다.
입자를 통과하는 시준된 광선을 고려하면, 이것들은 입자 이미지의 외부에는 상당한 광 선명도를 가지고 입자 내부에는 작거나 광 선명도를 가지지 않은 검출 엘리먼트 상에 이미지를 형성하여, 입자의 그림자를 형성한다. 입자와 상호작용하는 광선은 상이한 각도로 굴절되고, 이들 중 일부는 0°의 굴절률을 가지는데, 그것들이 수직으로는 입자의 경계를 가로지르는 반면, 다른 것들은 변화하는 각도로 산란을 하기 때문이다. 산란된 광선을 고려하면, 이 광선들은 입자가 발광하는 경우 관찰되는 이미지와 어느 정도 유사하지만 입자의 위치와 일치하지 않는 상이한 포인트의 암시야 초점(525)을 가지는 이미지 입자의 이미지를 형성하고, 초점은 입자의 크기 및 광학 속성에 의해 결정된다.
도 5h 내지 5j는 상이한 발광 조건을 이용하여 기록된 현탁액 내의 CHO 세포의 이미지를 도시한다. 도 5h는 세포의 명시야 이미지인 반면, 도 5i는 어퍼처를 평행 광의 초점 평면(도 5b 참조)에 위치시킴으로써 굴절 광이 차단되는 명시야 이미지이고, 도 5j는 평행 광이 차단되는(도 5c 참조) 암시야 이미지이고, 모든 이미지가 개별적으로 포커싱된다. 마지막으로, 도 5k는 특정한 염색을 도시하는 입자의 형광 이미지이다. 도 5h, 5i, 5j의 이미지는 개별 세포의 위치 및 윤곽, 및 세포의 수를 카운팅하고 세포의 속성을 분류하기 위해 이용되는 개별 세포의 형광 선명도를 추정하기 위해 사용되는 정보를 판정하기 위해 조합하여 이용된다.
집속 대물렌즈의 초점 평면에서의 장애물(들)이 교체가능한 배열에 의해, 적절한 장애물을 배치 또는 제거하는 것만으로, 고 컨트라스트 명시야 또는 암시야, 또는 그 둘의 조합을 기록하는 유연성을 가지는 이미지 세포 계수기 시스템을 구현하는 것이 가능하다.
Claims (125)
- 이미지 세포 계수기(cytometer)로서:
- 샘플 영역으로 광을 방출하도록 구성된 제1 광원;
- 평행 광(collimated light)을 형성하고, 상기 세포 계수기의 광축을 따라 상기 제1 광원으로부터의 상기 평행 광을 상기 샘플 영역으로 지향시키는 포커싱 수단;
- 상기 샘플 영역에 여기 광을 방출하도록 구성된 제1 여기 광원을 구비하는 제2 광원; 및
- 검출 엘리먼트의 어레이 상에 상기 샘플 영역의 적어도 일부의 이미지를 형성하는 이미지 형성 수단;
을 포함하고,
상기 샘플 영역은 상기 포커싱 수단 및 상기 검출 엘리먼트의 어레이 사이에 위치되고, 및
상기 제1 광원은 400nm 미만의 파장을 가진 광을 방출하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기. - 제1 항에 있어서, 상기 세포 계수기는 미리정해진 파장 영역 또는 파장 영역들에 대해 광 선명도를 감쇠시키기 위해 광학 필터와 같은 감쇠 수단을 더 포함하고, 상기 감쇠 수단은 상기 광축을 따라서 있는 미리정해진 평면에 위치되고,
상기 세포 계수기는 공간 변조와 같은 변조 수단을 더 포함하고, 상기 변조 수단은 상기 광축을 따라서 있는 미리정해진 평면에 위치되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기. - 삭제
- 제2 항에 있어서, 상기 감쇠 수단 및/또는 상기 변조 수단은 상기 제1 광원 및 상기 샘플 영역 사이의 광 경로 내에 위치되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 상기 감쇠 수단 및/또는 상기 변조 수단은 상기 샘플 영역 및 상기 검출 엘리먼트의 어레이 사이의 상기 광 경로 내에 위치되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제5 항에 있어서, 상기 변조 수단은 상기 샘플 영역을 통과하여 투과된 평행 광의 초점 평면에 근접하여 위치되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 상기 감쇠 수단 및/또는 상기 변조 수단 중 2개 이상은 상기 감쇠 수단 및/또는 상기 변조 수단의 제거 또는 교체를 허용하는 교체 수단에 장착되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제7 항에 있어서, 상기 교체 수단은 회전 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제7 항에 있어서, 2개 이상의 교체 수단은 감쇠 수단 및/또는 변조 수단이 상기 광축을 따라서 배치되지 않거나, 또는 1개, 2개, 또는 2개 이상의 감쇠 수단 및/또는 변조 수단이 동시에 상기 광축을 따라서 배치될 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 적어도 하나의 변조 수단은 부분적으로 불투명한 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 상기 변조 수단은 부분적으로 투명한 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 상기 감쇠 및/또는 변조 수단은 부분적으로 불투명하고, 부분적으로는 투명하며, 상기 부분들 중 하나는 원형 형상인 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 적어도 하나의 변조 수단의 일부분은 부분적으로 불투명하고, 상기 변조 수단의 또다른 부분은 부분적으로 투명한 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 상기 이미지 세포 계수기는 상기 변조 수단 상의 장애물(obstruction)을 이용하여 명시야 모드와 암시야 모드 사이에서 교체되도록 구성될 수 있고; 상기 장애물은, 상기 샘플 영역을 통과하는 평행 광을 실질적으로 감쇠시키고 및/또는 상기 명시야 모드에 대해 구성된 상기 변조 수단 상의 어퍼처를 이용하여 상기 암시야 모드에 대해, 그리고 미리정해진 파장 영역 또는 파장 영역들에 대해 광 선명도를 감쇠시키는 것과 같은 광학 필터와 같은 감쇠 수단을 이용하여 형광 모드에 대해 구성되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제2 항에 있어서, 상기 변조 수단은 위상차(phase contrast) 현미경 변조 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제14 항에 있어서, 명시야 모드와 암시야 모드 사이의 교체는 변조 수단에 의해, 상기 샘플 영역과 상기 검출 엘리먼트의 어레이 사이에 위치된 변조 수단을 삽입 및/또는 교체함으로써 구현되는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 샘플 영역은 생체 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 샘플 영역은 샘플 장착부(compartment) 내에 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기.
- 이미지 세포 계수기용 조명 시스템으로서:
- 광을 방출하도록 구성된 제1 광원;
- 상기 이미지 세포 계수기의 광축을 따라 상기 제1 광원으로부터의 상기 광을 샘플 영역으로 지향시키는 포커싱 수단; 및
- 상기 샘플 영역에 여기 광을 방출하도록 구성된 제1 여기 광원을 구비하는 제2 광원;
을 포함하고,
상기 제1 광원으로부터의 광은 400nm 미만의 파장을 가진 광을 방출하도록 구성되고, 상기 포커싱 수단은 상기 제1 광원으로부터의 평행 광을 형성하기 위한 것을 특징으로 하는 이미지 세포 계수기용 조명 시스템. - 삭제
- 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터(quantity parameter) 및/또는 정성 파라미터(quality parameter)의 평가를 위한 방법으로서:
노출 면적을 정의하는 평행한 벽 부분을 가지는 샘플 장착부(compartment)로 다량의 생체 샘플을 적용하는 단계로서, 상기 벽 부분은 이미지 세포 계수기로부터의 광이 상기 샘플 장착부의 상기 벽 부분을 통과하도록 허용하는 상기 다량의 생체 샘플을 적용하는 단계;
상기 제1 광원으로부터의 광을 가지고 상기 샘플 장착부를 조광하고, 액티브 검출 엘리먼트의 2차원 어레이 상으로 상기 샘플 장착부를 통과한 광을 노출시켜, 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록하는 단계;
상기 제2 광원으로부터의 여기 광을 가지고 상기 샘플 장착부를 조광하고, 액티브 검출 엘리먼트의 상기 2차원 어레이 상으로 상기 샘플 장착부를 통과한 형광 광을 노출시켜, 형광 이미지의 공간 광 선명도 정보를 기록하는 단계;
개별 생체 입자로부터의 광 선명도 정보가 배경으로부터의 광 선명도 정보와 상이한 것으로서 식별되는 방식으로 양 이미지를 처리하는 단계; 및
상기 처리의 결과를 상기 생체 샘플에서의 생체 입자의 상기 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 상기 적어도 하나의 정성 파라미터에 상관시키는(correlating) 단계;
를 포함하고,
상기 샘플 장착부를 조광하는 상기 광은 평행 광이고, 상기 이미지 세포 계수기는 청구항 제1 항 또는 제2 항에 따른 이미지 세포 계수기인 것을 특징으로 하는 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 정성 파라미터의 평가를 위한 방법. - 제21 항에 있어서, 상기 제1 광원을 이용하여 기록된 2개 이상의 이미지의 공간 광 선명도 정보들이 광 선명도 정보 처리에 이용되는 것을 특징으로 하는 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 정성 파라미터의 평가를 위한 방법.
- 제21 항에 있어서, 상기 생체 샘플은 기판 상에서 성장되거나 및/또는 성장하는 세포의 현탁액인 것을 특징으로 하는 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 정성 파라미터의 평가를 위한 방법.
- 제23 항에 있어서, 상기 기판은 투명 기판이고, 이러한 기판은 상기 샘플 장착부의 통합된 부분이거나 또는 통합된 부분이 될 수 있는 것을 특징으로 하는 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 정성 파라미터의 평가를 위한 방법.
- 제21 항에 있어서, 현탁액 내의 생체 입자가 샘플 장착부의 내부의 하부 또는 상부 경계로 침전 또는 부유하여 광 선명도 정보의 기록이 시작될 때까지 액티브 검출 엘리먼트의 어레이에 대해 샘플 및/또는 샘플 장착부의 움직임의 종료로부터 충분한 시간이 지나가도록 하는 것을 특징으로 하는 생체 샘플의 적어도 하나의 정량 파라미터 및/또는 정성 파라미터의 평가를 위한 방법.
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