KR102149418B1

KR102149418B1 - 신규 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102149418B1
Application number: KR1020180154482A
Authority: KR
Inventors: 홍효정; 김다인; 이찬규; 김희연
Original assignee: 강원대학교 산학협력단; 주식회사 유바이오로직스
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-08-31
Also published as: KR20200067522A

Abstract

본 발명은 CRM₁₉₇에 결합하는 신규한 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 항체 및 이의 용도{A novel antibody and the use thereof}

CRM₁₉₇(Cross-reactive material 197)은 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 균이 분비하는 디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체이다. 디프테리아 독소는 단일 사슬의 58kDa 단백질로, 다이설파이드 결합으로 연결되어 있는 A 및 B의 2개의 단편으로 나누어진다(Valiakina TI et al, 2009. [Production and characteristics of monoclonal antibodies to the diphtheria toxin]. Bioorg Khim. 35: 618-628). 단편 A(21 kDa)는 단백질 합성을 억제하는 촉매 도메인이며, 단편 B(37 kDa)는 숙주세포 수용체에 결합하는 도메인이다. CRM₁₉₇은 촉매 도메인의 52번 아미노산의 글리신이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함한다(Giannini G ett al, 1984. The amino-acid sequence of two non-toxic mutants of diphtheria toxin: CRM45 and CRM197. Nucleic Acids Res. 12: 4063-4069).

한편 백신 시장에서는 다당류 백신의 면역원성 저하 문제를 해결하기 위해 다당류 항원에 면역원성을 증가시켜주는 운반 단백질 (carrier protein)을 접합한 협막다당-단백질 접합백신, 즉 컨쥬게이트 백신이 개발되어 널리 사용되고 있다. CRM₁₉₇은 이러한 컨쥬게이트 백신(conjugate vaccine)의 캐리어 단백질로 주로 사용되며, 특히 주로 외피를 갖는(encapsulated) 박테리아 균인 B형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae type b), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumonia) 및 수막염균(Neisseria meningitides)의 백신에 흔히 사용된다. 백신에 캐리어 단백질을 사용할 경우 아직 면역체계가 완전하지 않은 유아 및 영아에게서 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드 항원의 면역원성을 높일 수 있다. 수십 년간 허용된 CRM₁₉₇-기반 백신들이 계속해서 사용되고 있으며, 이와 같은 CRM₁₉₇ 컨쥬게이트 백신의 특성화 및 유효성 검사를 위해서는 in vitro 및 in vivo에서 백신 농도를 정확히 측정해야 할 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 신규한 항-CRM₁₉₇ 단일클론항체를 개발하였으며, 항원 정량화에 주로 사용되는 방법인 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 이를 적용함으로써 본 발명의 신규한 항체가 CRM₁₉₇및 CRM₁₉₇ 컨쥬게이트 백신의 양을 정확히 정량화하고 특성화할 수 있는 것임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 이를 포함하는 발현벡터; 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 CRM₁₉₇항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 CRM₁₉₇ 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.

알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg, R

아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D

시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E

글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, G

히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I

류신 Leu, L 리신 Lys, K

메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F

프롤린 Pro, P 세린 Ser, S

트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W

티로신 Tyr, Y 발린 Val, V

본 발명의 하나의 양태는 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

상기 CRM₁₉₇의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인은 37kDa에 해당하는 B 도메인일 수 있다.

본 발명에서 용어 "CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)"은 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7 (CRM197; 예컨대 카사미노산(casamino acid) 및 효모 추출물 기제 배지에서 성장)의 배양물로부터 분리된 디프테리아 독소의 무독성 변이체, 즉, 변성독소(toxoid)이다. 본 발명의 CRM197 단백질은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 통해 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7 배양물로부터 정제되거나, 통상적인 방법, 예컨대, 미국 특허 제5,614,382호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 방법을 참조하여 재조합적으로 얻어진 것이거나, 통상의 상업적 구입처에서 구입한 것일 수 있다. CRM₁₉₇은 단일 사슬의 58kDa 단백질이며, 다이설파이드 결합으로 연결되어 있는 A 및 B의 2개의 단편으로 나누어진다. 단편 A는 단백질 합성을 억제하는 촉매 도메인이며, 단편 B는 숙주세포 수용체에 결합하는 도메인으로, 본 발명에서는 용어 "단편 A 또는 B"를 "도메인 A 또는 B"와 상호교환적으로 사용한다. CRM₁₉₇은 촉매 도메인의 52번 아미노산의 글리신이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함한다. 본 발명의 CRM₁₉₇은 분리된 단백질 형태거나 다른 단백질 또는 다당류와 결합된 형태일 수 있고, 구체적으로는 세균 유래 외독소와 결합된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 또한, 상기 용어는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fd, Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 구체적으로는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다.

또한, 상기와 같은 본 발명의 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.

상기 항체는 (a) 서열번호 3의 경쇄 CDR1, 서열번호 4의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 5의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 6의 중쇄 CDR1, 서열번호 7의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 8의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 1로 구성되거나, 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 2로 구성되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 항체는 서열번호 1로 기재된 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있고, 보다 더 구체적으로 상기 항체는 서열번호 서열번호 1로 기재된 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 기재된 중쇄 가변영역으로 구성된 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 구현예에서는 인간 합성 Fab 라이브러리로부터 항-CRM197 파지 Fab를 농축시킨 후 스크리닝하여 가장 항원결합 활성이 높은 4개의 신규한 Fab 3F9, 1E1, 1F3 및 2A9를 선별하였으며, 그 중 대표적으로 3F9의 에피토프를 확인한 결과 CRM197의 B 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 본 출원의 3F9항체는 (a) 서열번호 3의 경쇄 CDR1, 서열번호 4의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 5의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (b) 서열번호 6의 중쇄 CDR1, 서열번호 7의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 8의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 을 포함하는 것일 수 있으며, 서열번호 1로 기재된 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 하나의 양태는, 상기 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 공지의 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파지 디스플레이(phage display) 기술 등을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다클론항체의 제조방법은 공지의 항체 제조기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

파지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파지 디스플레이 기술은 1) 파지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 물질을 처리하는 단계; 4) 상기 물질에 결합된 항체-파지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 항체의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.

본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994)의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파지는, 예를 들어 필라멘트성 파지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 단일클론항체 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 파지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 인간 단일클론항체의 제조 방법은 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에서 상기 인간 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 포함하는, 인간 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 또 하나의 양태는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.

상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 제공하는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우스 멜라노마(Bowes melanoma) 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 CRM₁₉₇ 단백질 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 CRM₁₉₇항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 CRM₁₉₇ 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 검출하는 방법은 컨쥬게이트 백신의 정량에 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 형태일 수 있고, 구체적으로 상기 키트는 전술한 항체를 포획 항체로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 ELISA는 (i) CRM₁₉₇에 결합하는 다클론 항체; (ii) 본 발명의 CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체의 형태인 포획 항체; 및 (iii) 검출표지가 결합된 IgG Fc에 결합된 항체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)"는 효소면역 측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.

본 발명의 CRM₁₉₇ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 이를 포함하는 검출용 조성물; 키트; 및 이를 이용하여 CRM₁₉₇ 단백질을 검출하는 방법을 이용하여 극미량의 CRM₁₉₇ 단백질을 검출할 수 있으며, 검출되는 단백질의 양은 구체적으로 1mg 미만, 100ug 미만일 수 있고, 보다 구체적으로는 10ug 미만, 1ug 미만, 100ng 미만, 10ng 미만, 1ng 미만일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 CRM₁₉₇에 특이적으로 결합하는 3F9 항체를 포획 항체로 이용한 Sandwich ELISA를 수행함으로써 1ng 미만의 CRM₁₉₇ 단백질을 검출할 수 있음을 확인하였으며, 상기 ELISA를 수행하여 컨쥬게이트 백신 역시 검출할 수 있음을 확인하였다.

이와 같이 본 발명의 항체를 이용함으로써 기존의 CRM₁₉₇ 단백질 검출용 키트에 비해 훨씬 적은 양의 CRM₁₉₇ 단백질을 검출할 수 있으므로, 본 발명의 항체를 CRM₁₉₇ 단백질 및 이를 이용한 백신 정량화에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 신규한 항체는 미량의 CRM₁₉₇를 검출할 수 있으며 CRM₁₉₇컨쥬게이트 백신 역시 검출할 수 있으므로, CRM₁₉₇ 및 CRM₁₉₇컨쥬게이트 백신의 정량화에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1A는 정제된 CRM₁₉₇(58 kDa)의 SDS-PAGE 결과이다. M은 사이즈 마커, R은 환원된 샘플, NR은 환원되지 않은 샘플이다. 도 1B는 각 패닝 라운드에서 인풋 및 아웃풋 파지 역가이다. 도 1C는 CRM₁₉₇(대조군으로는 BSA)을 이용한 다클론 파지 Fab의 간접 ELISA 결과 및 항-인간 카파 항체를 이용한 정량적(quantitative) ELISA 결과이다. 도 1D는 간접 및 정량적 ELISA에 의해 측정된 각 Fab 클론의 항원결합 활성이다.
도 2A는 비환원(좌측) 또는 환원(우측)조건에서의 SDS-PAGE 결과이다. 도 2B는 4종류의 단일클론항체에 대해 간접 ELISA로 측정한 항원결합 활성이다.
도 3은 단일클론항체 3F9에 대해 친화도를 측정한 결과이다.
도 4A는 CRM₁₉₇의 구조로 단편 A 및 B를 각각 빨강과 파란색으로 표시하였다. 도 4B는 트립신 처리 시 CRM₁₉₇의 절단을 도식화한 것이다. 도 4C는 트립신 처리(+) 또는 처리하지 않은 경우(-) CRM₁₉₇의 SDS-PAGE 결과이다. 도 4D-4E는 4C의 단백질 밴드를 각각 3F9 및 항-인간 IgG (Fc)-HRP(도 4D), 또는 마우스 항- CRM₁₉₇다클론 항체 및 항-마우스 IgG (Fc)-HRP로 검출한 웨스턴 블럿 결과이다.
도 5A는 3마리의 마우스를 면역화하여 수득한 항-CRM₁₉₇ 다클론항체의 간접 ELISA 결과이다. 도 5B는 샌드위치 ELISA의 개략도이다. 도 5C는 3F9의 샌드위치 ELISA 결과이다.
도 6A는 컨쥬게이트 되지 않은 PnPS 또는 PnPS-CRM₁₉₇의 HPLC-SEC 프로파일이고 도 6B는 CRM₁₉₇-폴리사카라이드 컨쥬게이트에 대한 3F9 및 마우스 항-CRM₁₉₇ 다클론항체의 샌드위치 ELISA결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : CRM ₁₉₇ 결합 활성이 높은 Fab 선별

CRM₁₉₇에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위한 실험을 수행하였다.

실시예 1-1: CRM ₁₉₇ 항원 제조

C. diphtheriae C7 (β197) tox^-균주 발효를 통해 CRM₁₉₇을 제작하였다. 배양 상청액에 분비된 단백질을 원심분리, 여과 및 농축을 통해 회수하였다. 음이온 교환 크로마토그래피 및 수산화 인회석(hydroxylapatite) 크로마토그래피를 이용해 단백질 정제를 수행한 후 농축하여 순도 95% 이상의 CRM₁₉₇을 수득하였다.

실시예 1-2 : 파지 디스플레이된 인간 합성 Fab 라이브러리의 바이오패닝(biopanning)

항-CRM₁₉₇ 파지 Fab를 농축하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조한 CRM₁₉₇에 대해 파지 디스플레이된 인간 합성 Fab 라이브러리(다양성 2×10⁹)를 제조하고, 바이오패닝을 3라운드 수행하였다(도 1A). 인풋 및 아웃풋 파지 역가를 각 라운드마다 측정하였다(도 1B).

그 결과 패닝 3번째 라운드 이후 아웃풋 파지 역가가 크게 증가하였고(도 1B), 다클론 파지 Fab를 이용한 ELISA 분석 결과 항-CRM197 파지 Fab가 농축된 것을 확인할 수 있었다(도 1C).

실시예 1-3 : 패닝으로 선별한 파지 디스플레이된 Fab의 간접(indirect) 및 정량적 ELISA

각각의 항-CRM₁₉₇ Fab 클론을 분석하기 위해 285개 콜로니를 무작위로 선별하고 BSA를 이용한 간접 ELISA 및 정량적 ELISA에 의해 파지 Fab를 스크리닝하였다.

구체적으로, 패닝 각 라운드 이후 각각의 콜로니로 감염시킨 TG1 세포를 패닝 각 라운드 이후 각각의 콜로니로부터 감염된 TG1 세포를 OD₆₀₀ = 0.1 로 접종하고 OD₆₀₀ = 0.5에 도달 할 때까지 2XYT / 카베니실린(carbenicillin)/ 포도당 브로쓰(broth)에서 배양하였다. 세포를 KM13 헬퍼 파지 20 MOI 로 감염시키고, 교반 없이 37℃에서 30분간 둔 후 30분 동안 교반하였다. 감염된 세포를 10분간 2,900×g로 원심분리하여 세포 펠렛을 2XYT / 카베니실린(carbenicillin)/ 포도당 브로쓰(broth)에 재현탁한 후 12시간 동안 30℃에서 교반하면서 배양하였다. 원심분리 후 Fab 파지를 포함하는 상청액을 ELISA로 분석하였다.

간접 ELISA 분석을 위해 파지 Fab를 CRM₁₉₇ 또는 BSA로 각 웰에 코팅하여 1시간동안 인큐베이션하였다. 세척 후 결합되어있는 파지 Fab를 항-M13 항체-HRP로 인큐베이션하였다. 또한 정량적 ELISA 분석을 위해 파지 Fab를 항-인간 kappa 항체로 웰에 코팅하여 인큐베이션 및 세척 후 결합되어 있는 파지를 항-M13 항체-HRP로 인큐베이션하였다. TMB substrate reagent를 가하고 6분간 인큐베이션한 후 황산을 가하여 반응을 정지시켰다.

그 결과 항원결합 활성이 높은 순으로 40개의 클론을 선택하였고, DNA 시퀀싱 결과 13종의 클론을 수득하였다(도 1D). 최종적으로 가장 높은 항원 결합 활성을 갖는 4개의 Fab 클론(3F9, 1E1, 1F3 및 2A9)에 대하여 이후의 실험을 수행하였다.

실시예 2 : IgG로 전환한 Fab의 항원결합 활성 분석

실시예 1에서 선별한 4개의 Fab를 IgG로 전환하여 항원결합 활성을 분석하였다.

구체적으로, 배양 상청액에 분비된 IgG를 Protein A 아가로스 비드를 이용한 친화도 크로마토그래피로 정제하여 단백질 농도를 NANO-DROP 2000 (Thermo Fisher Scientific)으로 확인하였다.

또한 정제된 항체의 Integrity 및 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다(도 2A).

정제된 IgG를 간접 ELISA로 분석하고 항-인간 IgG Fc-HRP (1:8,000 v/v, Thermo Fisher Scientific)를 이용한 샌드위치 ELISA로 분석하여 4개의 단일클론 항체 3F9, 1E1, 1F3 및 2A9 의 항원 결합 활성을 확인하였다.

그 결과 4개의 단일클론항체 3F9, 1E1, 1F3 및 2A9 모두 유사한 항원 결합 활성을 나타냈다(도 2B).

이를 통해, 실시예 1에서 선별한 Fab를 인간 IgG로 전환하여도 CRM₁₉₇에 대한 항원결합 활성이 유지됨을 확인하였으며 그 중 단일클론항체 3F9를 이후의 실험에 사용하였다.

실시예 3 : 3F9의 친화도 결정 및 에피토프 맵핑

제조된 항체 3F9의 특성 분석을 위한 실험을 수행하였다.

CRM₁₉₇에 대한 3F9 항체의 친화도(K _D)를 확인하기 위해, 2배씩 연속으로 희석된(0.1% PBA에 50, 25, 12.5, 6.25, 및 3.13 nM) CRM₁₉₇항원을 제조하였고 Octet Red를 이용하여 친화도를 확인한 결과 4.45nM으로 나타났다(도 3).

다음으로, 3F9의 에피토프를 결정하기 위해 트립신 및 DTT 처리 후 환원조건의 SDS-PAGE 및 웨스턴블럿팅으로 분석하였다.

구체적으로 10 μg CRM₁₉₇ 단백질을 0.1 μg의 트립신과 37℃에서 5분간 반응시킨 후 환원 및 비환원 조건에서 10% SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질 밴드를 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고 막을 3F9 mAb 또는 마우스 항-CRM197 다클론 항체로 인큐베이션하여 서던블롯팅을 수행하였다.

확인 결과, CRM₁₉₇(58 kDa)은 트립신 및 DTT처리 후 2개의 단편(37kDa 및 21kDa)으로 잘렸다(도 4A-4C). 웨스턴 블럿 분석 결과 3F9는 CRM₁₉₇의 B 단편(37kDa)에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다(도 4D). 반면, 마우스 다클론항체는 A 단편 및 B 단편 모두에 결합하였다(도 4E).

종합하면, 이러한 결과는 3F9 항체가 CRM₁₉₇의 B 단편에 특이적으로 높은 친화도로 결합한다는 것을 나타낸다.

실시예 4 : 제조한 항-CRM ₁₉₇ mAb를 이용한 샌드위치 ELISA

생물학적 샘플 내 CRM₁₉₇을 검출하기 위한 툴을 개발하기 위하여, 실시예 1 및 2를 통해 제조한 항-CRM₁₉₇ mAb를 이용한 Sandwich ELISA를 수행하여 그 정확도를 분석하였다.

실시예 4-1 : 마우스-항 CRM ₁₉₇ 다클론 항체 제조

Sandwich ELISA에 사용하기 위한 마우스-항 CRM₁₉₇ 다클론 항체를 제조하였다.

구체적으로 3마리의 마우스를 CRM₁₉₇로 면역화하였다. 최초 주사 이후 2번째 및 3번째 부스터는 각 면역화 7일 이후 수행하였다. 항-CRM₁₉₇ 다클론 항체를 포함한 최종 혈청은 3번째 면역화 7일 이후 수득하였다. 수득한 항-CRM₁₉₇ 마우스의 각각의 항혈청(antiserum) #1 - #3을 점진적으로 희석(1:5,000 - 1:100,000 v/v)시켜 간접 ELISA를 수행하였다.

그 결과 도 5A에 나타난 것과 같이, #2 마우스 항혈청이 가장 높은 결합 활성을 나타냈다. 이를 토대로 #2의 항혈청을 sandwich ELISA에 사용하였다.

실시예 4-2 : 샌드위치 ELISA

다음으로, 제조한 3F9 mAb를 capture antibody로 사용한 sandwich ELISA를 수행하였다.

구체적으로 96-웰 마이크로플레이트(Nunc)를 코팅 버퍼 용액(Na₂CO₃, NaHCO₃, pH 9.6) 내에 2.5μg/ml mAb인 3F9로 4℃ 에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 다음날 마이크로플레이트를 블로킹 용액(2% Skim milk in 0.05% phosphate buffered saline with Tween 20 [PBST])으로 블로킹하였다. 그 후 0.05% PBST, PBA (PBS(phosphate buffered saline)내 0.1% BSA)로 희석된 다양한 농도의 CRM₁₉₇(0 - 20 ng/well)로 2회 세척한 후, PBS (1:10,000 v/v) 내에 실시예 4-1에서 제조한 마우스 항혈청 #2(1:10,000 v/v)를 가하여 마우스 항-CRM₁₉₇ 다클론 항체를 각 웰에 첨가하였다. 4회 세척 후 항-마우스 Ig Fc-HRP(1:5,000 v/v, Thermo Fisher Scientific) 100μl를 각 웰에 첨가하고 인큐베이션을 수행하였다(도 5B). 모든 인큐베이션은 1시간 동안 37℃에서 수행되었다. 최종적으로 TMB substrate reagent를 가하고 5분간 인큐베이션한 후 2.5 M H₂SO₄로 반응을 정지시켰다.

그 결과, 3F9 항체는 높은 항원결합 활성을 나타냈으며, 샌드위치 ELISA는 <1 ng/ml 의 CRM₁₉₇까지 검출할 수 있었다(도 5C). 아울러, 정상 인간 혈청에서 3F9 항체의 CRM₁₉₇에 대한 활성은 PBA에서의 활성과 동일하였다.

종합하면, 본 발명의 항체를 이용한 sandwich ELISA로 매우 미량의 CRM₁₉₇까지 검출할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명의 항체가 CRM₁₉₇을 검출하는 데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 5 : 샌드위치 ELISA를 이용한 CRM ₁₉₇ -폴리사카라이드 컨쥬게이트 검출

실시예 4에서 제조한 3F9를 이용한 sandwich ELISA를 이용하여 컨쥬게이트 항원을 검출할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

실시예 5-1 : CRM ₁₉₇ -폴리사카라이드 컨쥬게이트 제작

Streptococcus pneumoniae 혈청형 9V, 11A, 18C, 19A, 및 19F로부터 발효를 통해 폐렴구균 폴리사카라이드(Pneumococcal polysaccharide; PnPS)를 수득하였다. 수산화 인회석 크로마토그래피 및 초미세여과(ultrafiltration)를 통해 폴리사카라이드를 추가적으로 정제하여 순도 90% 이상의 PnPS를 수득하였다. 미세유동화(microfluidization)를 통해 PnPS를 작은 사이즈로 만들고 ADH(adipic acid dihydrazide) 링커 및 EDAC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 촉매를 이용하여 CRM₁₉₇과 컨쥬게이션시켰다. PnPS-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트를 UF/DF(ultrafiltration/diafiltration) 시스템을 이용한 여과 및 농축으로 회수하였다.

또한 Salmonella typhi Ty2 발효를 통해 Vi 캡슐형 폴리사카라이드(Vi)를 생산하여 순도 95% 이상의 Vi를 수득하였다. ADH 및 EDAC를 이용하여 Vi를 CRM₁₉₇과 컨쥬게이션시켰다. Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트는 UF/DF 시스템을 이용한 여과 및 농축으로 회수하였다.

실시예 5-2 : CRM ₁₉₇ -폴리사카라이드 컨쥬게이트 검출

실시예 5-1에서 제조 및 정제한 Vi-CRM₁₉₇ 1종 및 5종의 PnPS-CRM 컨쥬게이트(혈청형 9V, 11A, 18C, 19A 및 19F) 백신이 3F9에 결합하는지 확인하기 위한 sandwich ELISA를 수행하였다.

그 결과 3F9가 용량 의존적으로 CRM₁₉₇-폴리사카라이드 컨쥬게이트에 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 6A 및 6B).

종합하면, CRM₁₉₇ 컨쥬게이트 백신의 양을 분석하는 데 본 발명의 항체를 이용한 sandwich ELISA가 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation Eubiologics.Co.,LTD <120> A novel antibody and the use thereof <130> KPA181257-KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VL <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Ser Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Val Arg Glu Thr Leu Ser Trp Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VL CDR1 <400> 3 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VL CDR2 <400> 4 Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VL CDR3 <400> 5 Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VH CDR1 <400> 6 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VH CDR2 <400> 7 Ala Ile Ser Ser Ser Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VH CDR3 <400> 8 Leu Gly Val Arg Glu Thr Leu Ser Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VL <400> 9 gacattcaaa tgacgcagag tccctcctca ctgagtgcta gcgtgggcga tcgtgtgaca 60 attacttgtc gcgctagcca gtctatctct aattacctga actggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaggcgc caaaattgct gatttacgca gcatcccgtc tgcagtctgg tgtaccgtcc 180 cgtttctctg gcagcggttc tggtacggat tttaccctga ccatctcaag cctccagcct 240 gaagattttg ccacctatta ttgtcagcaa tcttactctt ttccgtggac gttcgggcag 300 ggaactaaag tggaaattaa a 321 <210> 10 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F9 VH <400> 10 gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60 agctgcgccg cctcgggttt tactttctct gattatgcaa tgtcttgggt tcgtcaggcg 120 ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctcttctt cttctggcaa taaatactat 180 gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240 ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaactgggt 300 gttcgtgaaa ctctgtcttg gtacttcgat ctgtggggtc agggcacttt agtgaccgtc 360 tcatcg 366

Claims

삭제
(a) 서열번호 3의 경쇄 CDR1, 서열번호 4의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 5의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 6의 중쇄 CDR1, 서열번호 7의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 8의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역;
을 포함하는 것인, CRM₁₉₇(Cross Reacting Material 197)의 세포 수용체 결합 도메인인 B 도메인에 특이적으로 결합하는 항체.
제2항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 1로 구성되는 것인, 항체.
제2항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 2로 구성되는 것인, 항체.
제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1로 기재된 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 기재된 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제6항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
제7항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주세포.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, CRM₁₉₇검출용 조성물.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, CRM₁₉₇검출용 키트.
제10항에 있어서, 상기 키트는 ELISA 형태인 것인, 키트.
제11항에 있어서, 상기 항체는 포획 항체인 것인, 키트.
제11항에 있어서, 상기 ELISA는
(i) CRM₁₉₇에 결합하는 다클론 항체;
(ii) 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체의 형태인 포획 항체; 및
(iii) 검출표지가 결합된 IgG Fc에 결합된 항체를 포함하는 샌드위치 ELISA인 것인, 키트.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여 CRM₁₉₇항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 CRM₁₉₇ 단백질을 검출하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 CRM₁₉₇ 단백질의 농도는 1 ng/ml 미만인 것인, 방법.