CN113677702A - 针对利拉鲁肽的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性抗体及其用途,例如用于鉴定和/或量化利拉鲁肽原纤维和/或司美格鲁肽原纤维。
Description
本发明涉及对利拉鲁肽的原纤维或司美格鲁肽的原纤维具有特异性的抗体以及此类抗体的用途。
序列表
本申请含有序列表,该序列表已经通过EFS-Web以ASCII格式电子提交,并且通过引用整体并入本文。创建于2020年3月30日的所述ASCII副本被命名为190042WO01Sequence Listing_ST25.txt,大小为111千字节。
背景
已知人GLP-1(7-37)及其类似物易于在溶液中形成各种类型的聚集体。在本文中称为原纤维(fibril)的特定类型的这类聚集体被认为是不可逆形成的,并且在以液体形式施用于患者的药物产品中应保持最少。迄今为止,用于测定(即鉴定和/或量化)此类原纤维的优选方法是基于硫代黄素T(ThT),ThT是在与原纤维结合时改变发射光谱的荧光团,参见例如本文的试验(V)。通过ThT检测肽原纤维的测定通常涉及首先对样品施加压力以扩增原纤维的量以允许检测,这种压力施加是不希望的且耗时的。需要以更高的灵敏度以及在包含可溶形式的肽的混合物中鉴定此类肽原纤维的手段。
发明内容
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维根据本文的试验(I)制备。在一些实施方案中,本发明涉及与司美格鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维根据本文的试验(II)制备。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,其中所述结合水平是根据试验(III)在至少25μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述检测限是根据本文的试验(VI)在至少1μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少5倍,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述结合水平是根据本文的试验(III-B)在至少30μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述检测限是根据本文的试验(VI-B)在至少0.025μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:115和121,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:37、38和39;SEQ IDNO:43、44和45;SEQ ID NO:49、50和51;SEQ ID NO:55、56和57;SEQ ID NO:61、62和63;SEQID NO:67、68和69;SEQ ID NO:73、74和75;SEQ ID NO:79、80和81;SEQ ID NO:85、86和87;SEQ ID NO:91、92和93;SEQ ID NO:97、98和99;SEQ ID NO:103、104和105;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQID NO:115、116和117;SEQ ID NO:121、122、123;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:40、41和42;SEQID NO:46、47和48;SEQ ID NO:52、53和54;SEQ ID NO:58、59和60;SEQ ID NO:64、65和66;SEQ ID NO:70、71和72;SEQ ID NO:76、77和78;SEQ ID NO:82、83和84;SEQ ID NO:88、89和90;SEQ ID NO:94、95和96;SEQ ID NO:100、101和102;SEQ ID NO:106、107和108;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:118、119和120;SEQ ID NO:124、125和126;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含如前述实施方案中任一项所限定的重链可变区和如本文限定的轻链可变区。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQ ID NO:109和110;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体与选自SEQ ID NO:109和110的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变轻链(VL)序列:SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、111和113;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变重链(VH)序列:SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、112和114;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
在一些实施方案中,本发明涉及如本文限定的抗体用于鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的用途。在一些实施方案中,本发明涉及鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如本文限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。在一些实施方案中,本发明涉及量化利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如本文限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
在一些实施方案中,本发明涉及如本文限定的抗体用于通过去除或减少其原纤维来纯化利拉鲁肽或司美格鲁肽的用途,原纤维的去除或减少是通过将抗体固定到固体表面,例如,创建亲和表面的色谱或膜表面,并将包含原纤维和可溶形式的利拉鲁肽或司美格鲁肽的混合物暴露于该表面,从而导致原纤维或其部分的分离。
附图说明
图1显示了所选抗体变体E、M和N的分析型大小排阻色谱分析。
具体实施方式
本发明涉及与GLP-1受体激动剂利拉鲁肽或司美格鲁肽的原纤维特异性结合的抗体。利拉鲁肽和司美格鲁肽是人GLP-1(7-37)的类似物,并且是以溶液形式市售的治疗性肽。利拉鲁肽或司美格鲁肽的原纤维在药物产品中是不希望的。因此,本发明的抗体将允许将利拉鲁肽或司美格鲁肽的原纤维与其可溶形式区分开来。本发明的此类抗体具有若干技术优势,包括允许任选地在与其可溶形式的混合物中鉴定和/或量化此类原纤维,以及提供确保包含利拉鲁肽或司美格鲁肽的药物产品的足够质量的手段。在一些实施方案中,本发明的抗体允许从可溶性利拉鲁肽的混合物中分离或部分分离利拉鲁肽原纤维。这样的分离可以通过固定到固体表面,例如色谱柱、过滤器或膜上来进行。在一些实施方案中,本发明的抗体允许用于任选地在极大过量的可溶形式的肽的存在下检测极低水平的肽原纤维的灵敏测定。在一些实施方案中,也与特定肽利拉鲁肽或司美格鲁肽有关的术语“原纤维”、“肽原纤维”是指一种类型的聚集体,其可以根据本文中针对利拉鲁肽的试验(I)或根据本文中针对司美格鲁肽的试验(II)获得,使用例如透射电子显微术可以看到这类原纤维呈细线形状。
本发明人惊奇地发现,与ThT测定,例如无振摇的ThT测定,例如本文的试验(V)相比,本发明的抗体检测原纤维的灵敏度高至少100倍,甚至可能至少1000倍。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维根据本文的试验(I)制备。在一些实施方案中,本发明涉及与司美格鲁肽原纤维结合的抗体。在一些实施方案中,本发明涉及与司美格鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维根据本文的试验(II)制备。在一些实施方案中,所述抗体对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍,例如至少100倍或至少1000倍的浓度,所述检测限任选地根据本文的试验(VI)确定。在一些实施方案中,所述抗体与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,例如至少20倍或至少50倍。在一些实施方案中,所述抗体对司美格鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对司美格鲁肽原纤维的检测限低至少10倍,例如至少100倍或至少1000倍的浓度,所述检测限任选地根据本文的试验(VI)确定。在一些实施方案中,所述抗体与司美格鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性司美格鲁肽的结合水平的至少10倍,例如至少20倍或至少50倍。在一些实施方案中,所述结合水平根据本文的试验(IV)来确定。在一些实施方案中,所述结合水平根据本文的试验(III)来确定。在一些实施方案中,所述结合水平根据本文的试验(III-B)来确定。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,其中所述结合水平是根据试验(III)在至少25μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述检测限是根据本文的试验(VI)在至少1μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少5倍,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述结合水平是根据本文的试验(III-B)在至少30μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述检测限是根据本文的试验(VI-B)在至少0.025μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体能够检测溶液中1-1000ppm原纤维浓度的利拉鲁肽原纤维,如1-10ppm原纤维,或者10-100ppm原纤维,或者100-1000ppm原纤维。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:115和121,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:37,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:43,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:49,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:55,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:61,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:67,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:73,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:79,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:85,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:91,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:97,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:103,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQID NO:115,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含以下CDR3序列:SEQ ID NO:121,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:37、38和39;SEQ ID NO:43、44和45;SEQ ID NO:49、50和51;SEQ ID NO:55、56和57;SEQ ID NO:61、62和63;SEQ IDNO:67、68和69;SEQ ID NO:73、74和75;SEQ ID NO:79、80和81;SEQ ID NO:85、86和87;SEQID NO:91、92和93;SEQ ID NO:97、98和99;SEQ ID NO:103、104和105;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ IDNO:115、116和117;SEQ ID NO:121、122、123;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:37、38和39;SEQ IDNO:43、44和45;SEQ ID NO:49、50和51;SEQ ID NO:55、56和57;SEQ ID NO:61、62和63;SEQID NO:67、68和69;SEQ ID NO:73、74和75;SEQ ID NO:79、80和81;SEQ ID NO:85、86和87;SEQ ID NO:91、92和93;SEQ ID NO:97、98和99;SEQ ID NO:103、104和105;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQID NO:SEQ ID NO:115、116和117;SEQ ID NO:121、122、123;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:37、38和39;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:43、44和45;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:49、50和51;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQID NO:55、56和57;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:61、62和63;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:67、68和69;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:73、74和75;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:79、80和81;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:85、86和87;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:91、92和93;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:97、98和99;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:103、104和105;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ IDNO:115、116和117;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:121、122、123;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:40、41和42;SEQ ID NO:46、47和48;SEQ ID NO:52、53和54;SEQ ID NO:58、59和60;SEQ ID NO:64、65和66;SEQ IDNO:70、71和72;SEQ ID NO:76、77和78;SEQ ID NO:82、83和84;SEQ ID NO:88、89和90;SEQID NO:94、95和96;SEQ ID NO:100、101和102;SEQ ID NO:106、107和108;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQID NO:118、119和120;SEQ ID NO:124、125和126;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:40、41和42;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:46、47和48;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:52、53和54;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQID NO:58、59和60;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:64、65和66;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:70、71和72;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:76、77和78;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:82、83和84;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:88、89和90;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:94、95和96;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:100、101和102;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:106、107和108;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:118、119和120;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:SEQ ID NO:124、125和126;或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含如本文限定的重链可变区和如前述实施方案中任一项所限定的轻链可变区。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQ ID NO:109和110;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体与选自SEQ IDNO:109和110的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。在一些实施方案中,所述抗体与本文限定的序列具有至少70%,如至少75%的序列同一性。在一些实施方案中,所述抗体与本文限定的序列具有至少80%,如至少85%或至少90%的序列同一性。在一些实施方案中,所述抗体与本文限定的序列具有至少91%,如至少92%或至少93%的序列同一性。在一些实施方案中,所述抗体与本文限定的序列具有至少94%,如至少95%或至少96%的序列同一性。在一些实施方案中,所述抗体与本文限定的序列具有至少97%,如至少98%或至少99%的序列同一性。
在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变轻链(VL)序列:SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、111和113;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。在一些实施方案中,本发明涉及与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变重链(VH)序列:SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、112和114;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
在一些实施方案中,所述抗体是分离的抗体。在一些实施方案中,所述抗体是单链Fv片段。在一些实施方案中,所述抗体包含Fc结构域。在一些实施方案中,所述抗体是进一步包含Fc结构域的单链Fv片段。在一些实施方案中,所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维和/或司美格鲁肽原纤维。在一些实施方案中,所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维。在一些实施方案中,所述抗体特异性结合所述司美格鲁肽原纤维。
在一些实施方案中,所述与利拉鲁肽结合的抗体具有高于70%,或者高于75%,或者高于80%,或者高于85%,或者高于90%,或者高于95%单体的纯度。在一些实施方案中,所述与利拉鲁肽结合的抗体具有高于70%单体的纯度。在一些实施方案中,所述与利拉鲁肽结合的抗体具有高于75%单体的纯度。在一些实施方案中,所述与利拉鲁肽结合的抗体具有高于80%单体的纯度。在一些实施方案中,所述与利拉鲁肽结合的抗体具有高于85%单体的纯度。在一些实施方案中,所述与利拉鲁肽结合的抗体具有高于90%单体的纯度。在一些实施方案中,所述与利拉鲁肽结合的抗体具有高于95%单体的纯度。在一些实施方案中,与利拉鲁肽原纤维结合的抗体的纯度根据本文在“大小排阻色谱法”部分中描述的方法来确定,随后相对于所有峰的AUC280nm总和,针对单体抗体的峰基于280nm处的吸光度确定曲线下面积(AUC280nm)。
利拉鲁肽和司美格鲁肽
利拉鲁肽和司美格鲁肽是包含共价连接的部分的人GLP-1(7-37)的类似物。本发明的抗体结合利拉鲁肽原纤维和/或司美格鲁肽原纤维。如本文中与利拉鲁肽相关使用的术语“原纤维”是指利拉鲁肽原纤维,而如本文中与司美格鲁肽相关使用的术语“原纤维”是指司美格鲁肽原纤维。在一些实施方案中,本发明的抗体结合利拉鲁肽原纤维。在一些实施方案中,本发明的抗体结合司美格鲁肽原纤维。
利拉鲁肽是Arg34,Lys26-(N-ε-(γ-L-谷氨酰基(N-α-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37),并且可以根据WO98/08871的实施例37所述制备。WO98/08871的实施例37通过引用并入本文。利拉鲁肽的结构也发表在WHO Drug Information Vol.17,No.2,2003中。利拉鲁肽的结构也发表在WHO Drug Information Vol.24,No.1,2010中。利拉鲁肽原纤维可以如本文的试验(I)所述制备。可溶性利拉鲁肽的一个实例是由丹麦Novo Nordisk A/S制造的市售溶液;例如商标
司美格鲁肽是N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)肽,并且可以根据WO2006/097537的实施例4所述制备。WO2006/097537的实施例4通过引用并入本文。司美格鲁肽原纤维可以如本文的试验(II)所述制备。可溶性司美格鲁肽的一个实例是由丹麦Novo Nordisk A/S制造的市售溶液;商标
抗体
在一些实施方案中,本发明涉及一系列抗体中的一种或多种,其特征在于它们的功能性和/或CDR的氨基酸序列、重链可变区、轻链可变区和/或Fc结构域的序列。在一些实施方案中,如本文所用的术语“CDR”是根据Kabat抗体编号方案(Kabat,Elvin A.(1976).Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry.New York,NY,USA:Holt,Rinehart&Winston)确定的。在一些实施方案中,本发明涉及一系列抗体中的一种或多种,其特征在于它们的功能性和/或H-CDR3氨基酸序列。在一些实施方案中,本发明涉及一系列抗体中的一种或多种,其特征在于它们的功能性和/或CDR氨基酸序列(重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3在本文中可被称为H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。类似地,轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3在本文中可被称为L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)。在一些实施方案中,本发明涉及一系列抗体中的一种或多种,其特征在于它们的功能性和/或重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中,本发明涉及一系列抗体中的一种或多种,其特征在于它们的功能性和/或重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列和/或Fc结构域的序列。在一些实施方案中,所述抗体包含H-CDR3。在一些实施方案中,所述抗体包含H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3。在一些实施方案中,所述抗体包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。在一些实施方案中,所述抗体包含L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3。在一些实施方案中,所述抗体包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。在一些实施方案中,所述抗体包含重链可变区和/或轻链可变区。
本发明的抗体可以是任何形式,包括完整抗体和抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链抗体。
在一些实施方案中,所述抗体是单链可变片段(scFv)抗体。在一些实施方案中,所述抗体是与Fc结构域融合的单链可变片段(scFv-Fc)抗体。在一些实施方案中,scFv或scFv-Fc抗体由包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一个氨基酸序列组成;scFv-Fc抗体进一步包含Fc结构域。
在一些实施方案中,所述抗体是包含标准抗体结构域和区域的全长抗体,例如,如本文所述。全长抗体(或完整抗体)包含四条多肽链,即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3这三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域,CL。
重链可变区和轻链可变区各自包含与抗原相互作用的结合域。VH和VL区可进一步细分为超变区,被称为互补决定区(CDR),其中散布有更保守的区域,被称为框架区(FR)。每个VH和VL可包含三个CDR和四个FR,从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,所述宿主组织或因子包括免疫***的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)。
在一些实施方案中,所述抗体是抗体片段,此类片段可使用常规重组或蛋白质工程技术获得。本发明的抗体片段可通过截短,例如通过从多肽的N-末端和/或C-末端去除一个或多个氨基酸来制备。也可以通过一个或多个内部缺失来生成片段。在一些实施方案中,本发明的抗体是,或包含本文所述的任何一种抗体的片段。在一些实施方案中,本发明的抗体是,或包含本文所述抗体之一的抗原结合部分或其变体。例如,本发明的抗体可以是本文所述抗体之一的Fab片段或其变体,或者本发明的抗体可以是衍生自本文所述抗体之一的单链抗体或其变体。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv(一般为抗体单臂的VL和VH)、单链Fv(scFv;参见例如Bird等人,Science 1988;242:42S-426;和Huston等人,PNAS 1988;85:5879-5883)、Fd(一般为VH和CH1)和dAb(一般为VH)片段;VH、VL、VhH和V-NAR;包含单个VH和单个VL链的单价分子;微体(minibodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和κ体(kappa bodies)(参见例如Ill等人,ProteinEng 1997;10:949-57);骆驼IgG;IgNAR;以及一个或多个分离的CDR或功能互补位,其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以缔合或连接在一起,以形成功能性抗体片段。各种类型的抗体片段已在例如Holliger和Hudson,Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136、WO2005040219和已公布的美国专利申请20050238646和20020161201中描述或综述。
当在本文中使用时,术语“互补决定区”(“CDR”)或“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。CDR通常由根据Kabat定义的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3以及重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3和/或来自“高变环”的那些残基组成(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol 1987;196:901-917)。通常,该区域中氨基酸残基的编号通过Kabat等人(同上)描述的方法进行。如本文所用的术语“Kabat”是指重链可变区和/或轻链可变区的编号体系,例如描述于Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242。通过使用Kabat编号体系,肽的实际线性氨基酸序列可含有较少的或额外的氨基酸,这对应于可变区的框架(FR)或CDR的缩短或向其中的***。可通过将抗体序列的同源性区域与“标准的”Kabat编号的序列进行比对,来确定给定抗体的残基的Kabat编号。术语“框架区”或“FR”残基是指如本文定义的不在CDR内的那些VH或VL氨基酸残基。抗体的片段可结晶区(“Fc结构域”)是抗体中能够与被称为Fc受体的细胞表面受体以及补体***的一些蛋白质相互作用的区域。
术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式,如抗体与另一种物质或抗体的缀合物。
术语“抗原”可指用于生成抗体的分子实体。然而,在本文中,术语“抗原”泛指结合或特异性结合抗体的靶分子;因此,包括用来生成抗体的分子实体的片段或模拟物。抗体可以以任何方式生成,包括通过动物免疫或展示筛选,例如噬菌体展示或酵母展示。
如本文所用的术语“表位”在“抗原结合”多肽如抗体或其片段与其相应抗原之间的分子相互作用的背景下来定义。通常,“表位”是指在抗原上的、被抗体结合或特异性结合的区或区域,即与抗体物理接触的区或区域。表位可包含抗原中直接参与与抗体的结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和其他不直接参与结合的氨基酸残基,例如被抗体有效阻断的抗原氨基酸残基(换言之,该氨基酸残基在抗体的“溶剂排除表面”和/或“足迹”内)。给定抗原可包含许多不同的表位,这些表位可包括但不限于:线性肽抗原决定簇、由在天然(成熟)构象中彼此靠近的一个或多个非连续氨基酸组成的构象抗原决定簇、以及全部或部分由共价连接至抗原的分子结构如碳水化合物基团组成的翻译后抗原决定簇。
术语抗体的“结合”、“特异性结合”和“特异性”在本文中用来描述抗体或其抗原结合片段的选择性。本发明的抗体可以特异性地结合利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维,表明该抗体与其他抗原的结合水平显著较低。在一些实施方案中,显著较低是结合水平至少低10倍,例如至少低15倍或至少低20倍。结合水平可根据本文的试验(III)或根据本文的试验(IV)来确定。结合水平可根据本文的试验(III-B)来确定。
如本文所用的术语“序列同一性”是指多肽序列之间的相关性程度,如由两个或更多个氨基酸残基的串之间的匹配数所确定的,并且可以被确定为通过特定数学模型或计算机程序(即,“算法”)得到的具有空位对齐(如果有的话)的两个或更多个序列之间与较小者相同匹配的百分比。可以通过本领域已知的方法容易地计算多肽的序列同一性,包括但不限于以下文献中描述的那些方法:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis ofSequence Data,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M.Stockton Press,NewYork,1991;以及Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。用于确定序列同一性的优选方法被设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。确定序列同一性的方法在可公开获得的计算机程序中描述;这类用于确定两个序列之间的序列同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包,包括GAP(Devereux等人,Nucl.Acid.Res.12,387(1984);GeneticsComputer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源公开获得(BLAST Manual,Altschul等人.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894;Altschul等人,同上)。众所周知的SmithWaterman算法也可用来确定序列同一性。例如,使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.),比对将要确定其序列同一性百分比的两种多肽各自的氨基酸的最佳匹配(“匹配的跨度”“,如通过算法所确定的)。空位开放罚分(其被计算为平均对角(diagonal)的3倍;“平均对角”是使用的比较矩阵的对角的平均值;“对角”是特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数字)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10)以及诸如PAM 250或BLOSUM 62的比较矩阵与该算法结合使用。该算法也使用标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵,参见Dayhoff等人,Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,supp.3(1978);对于BLOSUM 62比较矩阵,参见Henikoff等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA89,10915-10919(1992))。在一些实施方案中,使用以下参数确定序列同一性,例如使用算法GAP:算法:Needleman等人,J.Mol.Biol.48,443-453(1970);比较矩阵:BLOSUM 62,来自Henikoff等人,PNAS USA 89,10915-10919(1992);以及空位罚分:12,空位长度罚分:4,相似性阈值:0,对末端空位没有罚分。
在一些实施方案中,本发明的抗体包含一个或多个氨基酸置换或***。氨基酸置换可以是保守氨基酸置换的形式。“保守氨基酸置换”可涉及用另一个残基置换一个氨基酸残基,使得对该位置的氨基酸残基的极性或电荷没有或几乎没有影响。保守氨基酸置换可在以下氨基酸组内进行:亲水性:Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;脂肪族:Val、Ile、Leu、Met。碱性:Lys、Arg、His;芳香族:Phe、Tyr、Trp;此外,通常任何残基都可以被丙氨酸置换。
在一些实施方案中,一个或多个非天然氨基酸通过置换或***引入本发明的抗体中。此类非天然氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸。
本发明抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的核苷酸变化引入本发明的核酸中,或者通过所需多肽的体外合成来制备。这类变体包括,例如,氨基酸序列内残基的缺失、***或置换。可进行缺失、***和置换的组合以得到最终构建体,条件是最终多肽产物具有期望的特性。可以使用本领域已知的任何技术来制备变异(改变的)多肽。例如,可以对本发明的多核苷酸进行体外诱变。这样的体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适的载体中,将该载体转化到“增变”菌株如大肠杆菌XL-I red(Stratagene)中,并使转化的细菌繁殖合适的代数。可以使用本文所述的技术容易地筛选衍生自突变的/改变的DNA的产物,以确定它们是否具有受体结合和/或抑制活性。在设计氨基酸序列变体时,突变位点的位置和突变的性质将取决于待改变的特性。可以单独地或连续地修饰突变位点,例如,通过(1)首先用保守氨基酸选择进行置换,然后根据所获得的结果用更多的基团选择进行置换,(2)删除目标残基,或(3)与定位的位点相邻地***其他残基。在一些实施方案中,氨基酸序列缺失的范围为约1至15个残基,更优选约1至10个残基,通常约1至5个连续残基。
在一些实施方案中,分子基本上由定义的序列组成。在一些实施方案中,分子由定义的序列组成。在一些实施方案中,所述抗体是分离的抗体。术语“分离的抗体”是指已经从其天然环境中的另一/其他组分中分离和/或回收的抗体,和/或从其天然环境中的组分混合物中纯化的抗体。本发明的抗体可以来自不同物种,包括哺乳动物物种,如小鼠、大鼠、兔、猪或非人灵长类动物。所述抗体可以是啮齿动物抗体,更特别地是小鼠抗体。或者,所述抗体可以来自非哺乳动物物种,如鸡。所述抗体还可以是人源化抗体或人抗体。
本发明的抗体可以根据本领域已知的方法如重组蛋白、细胞培养和免疫学技术制备。这类技术在以下来源的整篇文献中都有描述和解释,例如:J.Perbal,A PracticalGuide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown (编),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编),DNA Cloning:A Practical Approach,第1-4卷,IRL Press(1995和1996),和F.M.Ausubel等人(编),Current ProtocolsinMolecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括迄今为止的所有更新),Ed Harlow和David Lane(编)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),以及J.E.Coligan等人(编)CurrentProtocols in Immunology,John Wiley and Sons(包括迄今为止的所有更新)。
单链抗体,包括scFv或scFv-Fc抗体,可以通过将与其氨基酸序列相对应的DNA序列***宿主细胞中的质粒中,然后通过重组技术,例如细菌细胞培养,使用该宿主细胞表达抗体来制备;这样的方法是本领域公知的。
单克隆抗体通常通过将骨髓瘤细胞与来自已用所需抗原免疫的小鼠的脾细胞融合来制备。人单克隆抗体可以从编码人抗体的转基因动物(例如小鼠或其他合适的物种)获得。或者,可以使用被称为组库(repertoire)克隆或噬菌体展示/酵母展示的技术来制备重组单克隆抗体。重组抗体工程化涉及使用病毒或酵母来产生抗体,而不是小鼠。
抗体的方法和用途
在一些实施方案中,本发明涉及如本文限定的抗体用于鉴定和/或量化利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的用途。在一些实施方案中,本发明涉及如本文限定的抗体用于从包含可溶性利拉鲁肽或可溶性司美格鲁肽的溶液中分离,包括部分分离利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的用途。这样的鉴定和/或量化可以通过将抗体与原纤维结合,然后例如通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结合的抗体来进行。ELISA可以如本领域已知的那样进行。在一些实施方案中,用于ELISA的容器(如微量滴定板)最初是饱和的。饱和可以是用蛋白质如溶菌酶或白蛋白,例如牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白饱和的。在一些实施方案中,与原纤维结合的本发明抗体将与第二抗体结合。如果本发明的抗体包含Fc结构域,则第二抗体可以与该Fc结构域结合。如果第二抗体上存在标记,则第二抗体的检测和/或量化可以是可能的,这样的标记可以是能够通过光谱法鉴定的荧光团。可以使用与本发明抗体结合的原纤维的标准品进行量化。
在一些实施方案中,如本文所用的术语“检测限”是指最低检测极限,其为可与不存在该物质区分开的物质的最低浓度。在一些实施方案中,如本文所用的术语“检测限”是指根据本文的试验(IV)确定的混合物/可溶物特异性比率为3。使用抗体和ThT测定的检测限的比较可以根据本文的试验(VI)进行。使用抗体和ThT测定的检测限的比较可以根据本文的试验(VI-B)进行。在一些实施方案中,如本文中与抗体相关使用的术语“检测限”是指在ELISA,如本文的试验(III)或试验(IV)中使用所述抗体的测定的检测限。在一些实施方案中,如本文中与抗体相关使用的术语“检测限”是指在ELISA,如本文的试验(III-B)中使用所述抗体的测定的检测限。在一些实施方案中,如本文所用的术语“检测限”是一式两份测试的对照样品的标准偏差的三倍;标准偏差可通过Studentt检验来确定。
在一些实施方案中,本发明涉及如本文限定的抗体用于鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的用途。
在一些实施方案中,本发明涉及如本文限定的抗体作为亲和配体从包含(i)利拉鲁肽原纤维和可溶性利拉鲁肽或(ii)司美格鲁肽原纤维和可溶性司美格鲁肽的混合物中去除原纤维的用途。
在一些实施方案中,本发明涉及鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如本文限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
在一些实施方案中,本发明涉及量化利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如本文限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。根据前述实施方案中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:b)检测与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体。在一些实施方案中,所述方法进一步包括以下步骤:c)量化与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体,任选地通过使用所述原纤维的标准品。在一些实施方案中,所述原纤维在溶液中。在一些实施方案中,所述原纤维在进一步包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。在一些实施方案中,所述原纤维在不包含除利拉鲁肽原纤维以外的其他肽或蛋白质并且任选地包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。
在一些实施方案中,所述方法包括:(a)在样品中的一种或多种原纤维被固定在固体支持物上的条件下使固体支持物与样品接触;(b)在抗体与所述一种或多种固定的原纤维结合以形成抗体-原纤维复合物的条件下,使该固体支持物与本文所述的任何一种抗体或其抗原结合片段接触;以及(c)使所述抗体-原纤维复合物与包含可检测标记的第二抗体接触,其中(i)该第二抗体与所述抗体-原纤维复合物特异性结合,并且(ii)检测来自所述可检测标记的信号,表明所述样品中存在一种或多种原纤维。
在一些实施方案中,所述方法包括:(a)使包含原纤维特异性抗体的固体支持物与样品接触,使得原纤维(如果存在于样品中)与该抗体结合并固定到表面以形成复合物;以及(b)检测该复合物。
本领域已知的任何固体支持物均可以在本文所述的方法中使用,包括但不限于由聚合材料制成的呈平面基底或珠子等形式的固体支持物。例如,该固体支持物可以是载玻片、多孔板(例如,96孔板)或珠子,例如乳胶、琼脂糖、sepharose、链霉亲和素、甲苯磺酰基活化的、环氧树脂、聚苯乙烯、氨基珠子、胺珠子、羧基珠子等。在某些实施方案中,该珠子可以是颗粒,例如微粒。术语“珠子”和“颗粒”在本文中可互换使用,是指基本上为球形的固体支持物。术语“微粒”和“微珠”在本文中可互换使用,是指允许占据或沉降在孔阵列中,例如检测模块中的孔阵列中的微珠或微粒。可以使用本领域已知的许多技术将蛋白质或肽附接至固体支持物,如板或微粒。已知多种用于向蛋白质添加反应性部分的技术,例如美国专利5,620,850中描述的方法。将蛋白质附接至表面的方法也描述于,例如,Heller,Acc.Chem.Res.,23:128(1990)。
可以使用本领域已知的任何合适的方法,使固体支持物与一定体积的样品接触。如本文所用的术语“接触”是指使固体支持物与样品中的一种或多种原纤维足够接近的任何类型的组合动作,使得如果样品中存在一种或多种原纤维,则会发生结合相互作用。接触可以通过多种不同方式实现,包括将样品与多孔板或微粒组合。接触可以根据需要重复多次。孵育可以在促进特异性结合相互作用的结合缓冲液,例如白蛋白(例如BSA)、非离子去污剂(吐温-20、Triton X-100)和/或蛋白酶抑制剂(例如,PMSF)中进行。结合相互作用的其他条件,例如温度和盐浓度,也可以凭经验确定,或者可以基于制造商的说明。例如,接触可以在室温(21℃-28℃,例如23℃-25℃)、37℃或4℃下进行。如本文所用的术语“可检测标记”和“标记”是指可产生可通过视觉或仪器手段检测的信号的部分。可检测标记可以是,例如,产生信号的物质,如色原、荧光化合物、酶、化学发光化合物、放射性化合物等。在一个实施方案中,可检测标记可以是荧光化合物,如荧光团。样品中原纤维的存在或量可以使用本领域已知的任何合适的方法来确定(例如,量化)。这类方法包括但不限于免疫测定,例如ELISA。
在一些实施方案中,本发明涉及相对于可溶性和/或单体利拉鲁肽检测利拉鲁肽原纤维的测定,其包括根据本发明的抗体,其中所述抗体能够检测溶液中1-1000ppm原纤维浓度的利拉鲁肽原纤维,如1-10ppm原纤维,或者10-100ppm原纤维,或者100-1000ppm原纤维。
在一些实施方案中,“一”表示“一个(种)或多个(种)”。如本文所用的术语“约”是指从所指值的减10%至加10%的范围。除非在本说明书中另有说明,否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。
本发明的实施方案
本发明的非限制性实施方案包括:
1.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体。
2.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维根据本文的试验(I)制备。
3.与司美格鲁肽原纤维结合的抗体。
4.与司美格鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维根据本文的试验(II)制备。
5.根据实施方案1或2中任一项所述的抗体,其中所述抗体对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍,例如至少100倍或至少1000倍的浓度,所述检测限任选地根据本文的试验(VI)确定。
6.根据实施方案1或2中任一项所述的抗体,其中所述抗体与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,例如至少20倍或至少50倍。
7.根据实施方案1或2中任一项所述的抗体,其中所述抗体对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍,例如至少100倍或至少1000倍的浓度,所述检测限任选地根据本文的试验(VI-B)确定。
8.根据实施方案1或2中任一项所述的抗体,其中所述抗体与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少5倍,如10倍,所述结合水平任选地根据本文的试验(III-B)确定。
9.根据实施方案3或4中任一项所述的抗体,其中所述抗体对司美格鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对司美格鲁肽原纤维的检测限低至少10倍,例如至少100倍或至少1000倍的浓度,所述检测限任选地根据本文的试验(VI)确定。
10.根据实施方案3或4所述的抗体,其中所述抗体与司美格鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性司美格鲁肽的结合水平的至少10倍,例如至少20倍或至少50倍。
11.根据实施方案6或10中任一项所述的抗体,其中所述结合水平是根据本文的试验(IV)确定的。
12.根据实施方案6或10中任一项所述的抗体,其中所述结合水平是根据本文的试验(III)确定的。
13.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
14.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
a.SEQ ID NO:37、38和39;
b.SEQ ID NO:43、44和45;
c.SEQ ID NO:49、50和51;
d.SEQ ID NO:55、56和57;
e.SEQ ID NO:61、62和63;
f.SEQ ID NO:67、68和69;
g.SEQ ID NO:73、74和75;
h.SEQ ID NO:79、80和81;
i.SEQ ID NO:85、86和87;
j.SEQ ID NO:91、92和93;
k.SEQ ID NO:97、98和99;
l.SEQ ID NO:103、104和105;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
15.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
a.SEQ ID NO:40、41和42;
b.SEQ ID NO:46、47和48;
c.SEQ ID NO:52、53和54;
d.SEQ ID NO:58、59和60;
e.SEQ ID NO:64、65和66;
f.SEQ ID NO:70、71和72;
g.SEQ ID NO:76、77和78;
h.SEQ ID NO:82、83和84;
i.SEQ ID NO:88、89和90;
j.SEQ ID NO:94、95和96;
k.SEQ ID NO:100、101和102;
l.SEQ ID NO:106、107和108;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
16.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含如前述实施方案中任一项所限定的重链可变区和如前述实施方案中任一项所限定的轻链可变区。
17.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
18.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。
19.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变轻链(VL)序列:SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、111和113;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
20.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变重链(VH)序列:SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、112和114;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
21.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体是分离的抗体。
22.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体是单链Fv片段。
23.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含Fc结构域。
24.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体是进一步包含Fc结构域的单链Fv片段。
25.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维和/或司美格鲁肽原纤维。
26.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维。
27.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述司美格鲁肽原纤维。
28.如前述实施方案中任一项所限定的抗体用于鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的用途。
29.如前述实施方案中任一项所限定的抗体作为亲和配体从包含(i)利拉鲁肽原纤维和可溶性利拉鲁肽或(ii)司美格鲁肽原纤维和可溶性司美格鲁肽的混合物中去除原纤维的用途。
30.鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如前述实施方案中任一项所限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
31.量化利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如前述实施方案中任一项所限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
32.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:b)检测与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体。
33.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:c)量化与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体,任选地通过使用所述原纤维的标准品。
34.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其中所述原纤维在溶液中。
35.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其中所述原纤维在进一步包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。
36.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其中所述原纤维在不包含除利拉鲁肽原纤维以外的其他肽或蛋白质并且任选地包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。
37.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体
a.与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,例如至少20倍或至少50倍;并且/或者
b.对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍,例如至少100倍或至少1000倍的浓度,所述检测限任选地根据本文的试验(VI)确定。
38.与司美格鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(II)制备,并且所述抗体
c.与司美格鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性司美格鲁肽的结合水平的至少10倍,例如至少20倍或至少50倍;并且/或者
d.对司美格鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对司美格鲁肽原纤维的检测限低至少10倍,例如至少100倍或至少1000倍的浓度,所述检测限任选地根据本文的试验(VI)确定。
39.根据实施方案37或38中任一项所述的抗体,其中所述结合水平是根据本文的试验(IV)确定的。
40.根据实施方案37或38中任一项所述的抗体,其中所述结合水平是根据本文的试验(III)确定的。
41.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、115和121,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
42.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
43.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
a.SEQ ID NO:37、38和39;
b.SEQ ID NO:43、44和45;
c.SEQ ID NO:49、50和51;
d.SEQ ID NO:55、56和57;
e.SEQ ID NO:61、62和63;
f.SEQ ID NO:67、68和69;
g.SEQ ID NO:73、74和75;
h.SEQ ID NO:79、80和81;
i.SEQ ID NO:85、86和87;
j.SEQ ID NO:91、92和93;
k.SEQ ID NO:97、98和99;
l.SEQ ID NO:103、104和105;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
44.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
a.SEQ ID NO:40、41和42;
b.SEQ ID NO:46、47和48;
c.SEQ ID NO:52、53和54;
d.SEQ ID NO:58、59和60;
e.SEQ ID NO:64、65和66;
f.SEQ ID NO:70、71和72;
g.SEQ ID NO:76、77和78;
h.SEQ ID NO:82、83和84;
i.SEQ ID NO:88、89和90;
j.SEQ ID NO:94、95和96;
k.SEQ ID NO:100、101和102;
l.SEQ ID NO:106、107和108;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
45.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含如前述实施方案中任一项所限定的重链可变区和如前述实施方案中任一项所限定的轻链可变区。
46.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
47.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。
48.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体是分离的抗体。
49.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体是单链Fv片段。
50.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含Fc结构域。
51.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体是进一步包含Fc结构域的单链Fv片段。
52.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维和/或司美格鲁肽原纤维。
53.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维。
54.根据前述实施方案中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述司美格鲁肽原纤维。
55.如前述实施方案中任一项所限定的抗体用于鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的用途。
56.如前述实施方案中任一项所限定的抗体作为亲和配体从包含(i)利拉鲁肽原纤维和可溶性利拉鲁肽或(ii)司美格鲁肽原纤维和可溶性司美格鲁肽的混合物中去除原纤维的用途。
57.鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如前述实施方案中任一项所限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
58.量化利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如前述实施方案中任一项所限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
59.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:b)检测与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体。
60.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:c)量化与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体,任选地通过使用所述原纤维的标准品。
61.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其中所述原纤维在溶液中。
62.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其中所述原纤维在进一步包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。
63.根据前述实施方案中任一项所述的方法,其中所述原纤维在不包含除利拉鲁肽原纤维以外的其他肽或蛋白质并且任选地包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。
64.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
m.SEQ ID NO:115、116和117;
n.SEQ ID NO:121、122、123;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
65.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
aa.SEQ ID NO:118、119和120;
bb.SEQ ID NO:124、125和126;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
66.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含如前述实施方案中任一项所限定的重链可变区和如前述实施方案中任一项所限定的轻链可变区。
67.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQ IDNO:109和110;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
68.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述抗体与选自SEQ ID NO:109和110的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。
69.根据实施方案37-68中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变轻链(VL)序列:SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、111和113;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
70.根据实施方案37-68中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含选自下组的可变重链(VH)序列:SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、112和114;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
71.根据实施方案37-70中任一项的抗体,其中所述抗体是分离的抗体。
72.根据实施方案37-71中任一项所述的抗体,其中所述抗体是单链Fv片段。
73.根据实施方案37-72中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含Fc结构域。
74.根据实施方案37-73中任一项所述的抗体,其中所述抗体是进一步包含Fc结构域的单链Fv片段。
75.根据实施方案37-74中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维和/或司美格鲁肽原纤维。
76.根据实施方案37-75中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述利拉鲁肽原纤维。
77.根据实施方案37-76中任一项所述的抗体,其中所述抗体特异性结合所述司美格鲁肽原纤维。
78.根据实施方案37-77中任一项所述的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体
a.与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,其中所述结合水平是根据试验(III)在至少25μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
b.对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述检测限是根据本文的试验(VI)在至少1μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
c.与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少5倍,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述结合水平是根据本文的试验(III-B)在至少30μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
d.对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述检测限是根据本文的试验(VI-B)在至少0.025μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。
79.根据实施方案37-78中任一项所述的抗体,其中所述抗体能够检测溶液中1-1000ppm原纤维浓度的利拉鲁肽原纤维,如1-10ppm原纤维,或者10-100ppm原纤维,或者100-1000ppm原纤维。
80.根据实施方案37-79中任一项所述的抗体,其中所述抗体具有高于70%,或者高于75%,或者高于80%,或者高于85%,或者高于90%,或者高于95%单体的纯度。
81.根据实施方案37-80中任一项所述的抗体,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度。
82.如实施方案37-81中任一项所限定的抗体用于鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的用途。
83.如实施方案37-81中任一项所限定的抗体作为亲和配体从包含(i)利拉鲁肽原纤维和可溶性利拉鲁肽或(ii)司美格鲁肽原纤维和可溶性司美格鲁肽的混合物中去除原纤维的用途。
84.鉴定利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如实施方案37-81中任一项所限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
85.量化利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤:a)使如实施方案37-81中任一项所限定的抗体与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合。
86.根据实施方案84-85中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:b)检测与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体。
87.根据实施方案84-86中任一项所述的方法,其进一步包括以下步骤:c)量化与利拉鲁肽原纤维或司美格鲁肽原纤维结合的抗体,任选地通过使用所述原纤维的标准品。
88.根据实施方案84-87中任一项所述的方法,其中所述原纤维在溶液中。
89.根据实施方案84-88中任一项所述的方法,其中所述原纤维在进一步包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。
90.根据实施方案84-89中任一项所述的方法,其中所述原纤维在不包含除利拉鲁肽原纤维以外的其他肽或蛋白质并且任选地包含可溶性利拉鲁肽的溶液中。
91.相对于可溶性和/或单体利拉鲁肽选择性检测利拉鲁肽原纤维的测定,其包括如实施方案37-81中任一项所限定的抗体,其中所述抗体能够检测溶液中1-1000ppm原纤维浓度的利拉鲁肽原纤维,如1-10ppm原纤维,或者10-100ppm原纤维,或者100-1000ppm原纤维。
实施例
缩写列表
·PBS:磷酸盐缓冲盐水(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4的水溶液,调节至pH 7.4)
·PES:聚醚砜
·scFv-Fc:连接至Fc结构域的单链可变片段
·ThT:硫代黄素T
材料与方法
抗体文库制备,选定的抗体变体的分选和克隆
通过文库分选的两个阶段分离抗体。在分选的第一阶段,通过4D5 scFv的重链CDR3(HCDR3)的多样化生成单链可变片段(scFv)酵母表面展示文库(Julian等人,2019;Stimple等人,2019;Tiller等人,2017)。scFv通过柔性连接体与酵母Aga2蛋白的C末端遗传融合,从而使抗体能够在细胞表面展示。针对与固定在磁珠(Dynabeads M-280Tosylactivated,14203,Invitrogen)上的利拉鲁肽原纤维(和作为对照的可溶性利拉鲁肽)的结合,对酵母展示的抗体文库进行分选。为了制备珠子,首先用1mL无菌PBS洗涤(2x)8x107个珠子。将可溶性利拉鲁肽(100μg,来自药物组合物缓冲液中的6mg/mL储备液)稀释到含有磁珠的PBS(最终体积为800μL)中,并与磁珠偶联过夜(4℃,无搅拌)。对于用纤维状利拉鲁肽包被的珠子,在室温下将100μg利拉鲁肽原纤维与珠子在800μL PBS中偶联过夜,期间颠倒混合。第二天,用补充有10mM甘氨酸的1mL PBS洗涤(2x)珠子,以猝灭珠子上未反应的甲苯磺酰基,然后使用补充有1g/L BSA的1mL PBS(PBS-B)洗涤(2x),之后与酵母孵育。在补充有1%牛奶的PBS-B中,对利拉鲁肽原纤维包被的珠子进行八轮阳性选择。为了分离携带针对利拉鲁肽原纤维的构象特异性抗体的酵母,最后三轮分选结合有在PBS-B中针对用可溶性利拉鲁肽包被的珠子进行的阴性选择,之后是针对利拉鲁肽原纤维的阳性选择。
在文库分选的第二阶段(亲和力成熟),为来自分选第一阶段的最佳克隆之一设计了子文库。第二代文库使LCDR1、LCDR3和HCDR2中的位点多样化。该文库经历四轮针对利拉鲁肽原纤维的选择。前两轮分选结合了针对可溶性利拉鲁肽(固定在磁珠上)的两个连续阴性选择,之后是针对固定的利拉鲁肽原纤维的阳性选择。阴性选择在PBS-B中进行,而阳性选择在补充有1%牛奶的PBS-B中进行。我们还在第3轮和第4轮针对用胰高血糖素原纤维包被的珠子进行了三个连续的阴性选择。用胰高血糖素原纤维包被的珠子如先前所述制备(Stimple等人,2019)。
如先前所述(Stimple等人,2019),将选定的抗体克隆到哺乳动物表达载体抗Notch1_E6-pBIOCAM5中。简而言之,将***片段和骨架质粒用NcoI和NotI消化、纯化,并连接。scFv编码片段的***通过Sanger测序确认。这些质粒表达在抗体的C末端带有6xHis和3xFLAG标签的二价scFv-人Fc融合蛋白。
抗体表达和纯化
用Expi293F表达***(目录号A14635)表达蛋白质。将Expi293F细胞传代培养并扩充,直到细胞达到每mL约3-5百万个活细胞的密度。将质粒(30μg)转染到25mL Expi293细胞中。ExpiFectamine 293和质粒DNA的复合物如制造商指南所述制备。简而言之,将质粒DNA和ExpiFectamine试剂用Opti-MEM培养基稀释,并通过轻轻移液混合。孵育5分钟后,将稀释的转染试剂与稀释的DNA混合。将转染试剂和DNA的复合物在室温下孵育20分钟,然后加入Expi293细胞中。将细胞在37℃和5%CO2下振摇孵育。根据制造商的说明,在(转染后)20小时后将增强剂1和2溶液添加到细胞中。3天后,收集含有分泌的抗体的培养基,并以3400xg离心45分钟以去除细胞和相关联的碎片。
使用蛋白A色谱法纯化抗体。将蛋白A珠子(20334,Thermo Fisher Scientific)用PBS洗涤,并与甘氨酸缓冲液(pH 2.5)一起孵育20分钟。接下来,用PBS洗涤珠子,然后将0.5mL珠子加入到30mL澄清化的培养基中并在4℃下孵育过夜。第二天,将含有蛋白A珠子的培养基加至10mL纯化柱(89898,Thermo Fisher Scientific)。通过真空过滤收集珠子并用PBS(100mL)彻底洗涤。然后将蛋白A珠子与2mL 0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3.0)一起孵育15分钟,并通过离心收集缓冲液(带有洗脱的蛋白质)。然后使用Zeba Spin Desalting Columns(89891,Thermo Fisher Scientific)对洗脱的抗体进行缓冲液交换,交换到PBS中。通过280nm处的吸光度测量(消光系数为168,460-205,360M-1cm-1)测定蛋白质浓度。
大小排阻色谱法
使用Shimadzu Prominence HPLC***进行分析型和制备型大小排阻色谱(SEC)实验。运行缓冲液是137mM氯化钠、2.7mM钠-钾、10mM磷酸氢二钠、1.8mM磷酸二氢钾和200mM精氨酸。柱流速为0.75mL/min。将抗体样品(0.1mg/mL)注入(100μL)柱(GE 28990944,Superdex 200Increase 10/300GL柱,内径10mm,长度300mm)中,并在220和280nm处监测吸光度信号。对于制备型SEC,使用FRC-10A级分收集器分离单体级分。
试验(I):利拉鲁肽原纤维的制备
在药物组合物缓冲液(14.0mg/mL丙二醇、5.5mg/mL苯酚、1.42mg/mL二水合磷酸氢二钠)中制备6mg/mL利拉鲁肽的测试溶液,并在需要时使用NaOH和/或HCl将最终pH调节至8.15,随后进行注射器过滤(0.22μm PES过滤器)。将1mL利拉鲁肽溶液的等分试样分配到微量离心管中,向每个管中添加单个3mm玻璃珠(Sigma Z265926),并将管在热混合器中在37℃下孵育,以300rpm进行轨道振摇15-20天。
通过从管中取出少量测试溶液样品(约75μL),根据本文所述的试验(V)(ThT测定)对其进行分析,使用阳性ThT信号来监测原纤维形成。当样品在本文的试验(V)(ThT测定)中显示出至少5倍于新鲜制备的测试溶液的荧光时,以221,000xg(1小时,4℃)沉降原纤维。在管底部观察到原纤维,例如凝胶状原纤维。从管中取出上清液(保留上清液用于通过本文的试验(VII)(BCA测定)进行分析)。将沉淀物用pH 8.15的药物组合物缓冲液轻轻洗涤一次(不干扰沉淀物),然后重新悬浮在原始体积的pH 8.15药物组合物缓冲液中(考虑取出进行ThT分析的任何体积),并储存于4℃。原纤维的浓度根据本文的试验(VII)进行测定;为了使该计算准确,在离心后以完全相同的总体积重新悬浮原纤维沉淀物是重要的。
试验(II):司美鲁肽原纤维的制备
将6mg/mL司美格鲁肽(任选地含有50mM NaCl)和(需要时使用NaOH和/或HCl)调节至pH 6.9的药物组合物缓冲液(14.0mg/mL丙二醇,5.5mg/mL苯酚,1.42mg/mL磷酸氢二钠二水合物)的测试溶液以1mL的等分试样置于微量离心管中,向每个管中加入单个3mm玻璃珠(Sigma Z265926),并将管在热混合器中在37℃下孵育,以300rpm进行轨道振摇15-20天。
通过从管中取出少量测试溶液样品(约75μL),根据本文所述的试验(V)(ThT测定)对其进行分析,使用阳性ThT信号来监测原纤维形成。当样品在试验(V)(ThT测定)中显示出至少5倍于pH 6.9药物组合物缓冲液中新鲜制备的司美格鲁肽的荧光时,以221,000xg(1小时,4℃)沉降原纤维。在管底部观察到原纤维,例如凝胶状原纤维。从管中取出上清液(保留上清液用于通过试验(VII)(BCA测定)进行分析)。将沉淀物用pH 6.9的药物组合物缓冲液轻轻洗涤一次(不干扰沉淀物),然后重新悬浮在原始体积的pH 6.9药物组合物缓冲液中(考虑取出进行ThT分析的任何体积),并储存于4℃。原纤维的浓度根据本文的试验(VII)进行测定;为了使该计算准确,在离心后以完全相同的总体积重新悬浮原纤维沉淀物是重要的。
试验(III):抗体特异性比率(方法1)
如下确定抗体特异性比率:
1.ELISA板准备(3块板):
a.对于原纤维包被的ELISA板:将根据本文的试验(I)制备的利拉鲁肽原纤维重新悬浮于药物组合物缓冲液中(通过本文的试验(VII)(BCA测定)确定原纤维浓度),约300μL样品在微量离心管中在冰上进行超声处理(3个循环,10秒开启/30秒关闭,100%振幅;FB-120Sonic Dismembrator,Thermo Fisher Scientific)。将溶液在PBS中稀释至25μM利拉鲁肽原纤维,并将100μL样品分配到96孔Nunc MaxiSorp ELISA板(产品编号:439454)的每个孔中。
b.对于可溶性利拉鲁肽包被的板:将6mg/mL利拉鲁肽溶解于在需要时使用NaOH和/或HCl将pH调节至8.15的药物组合物缓冲液(14mg/mL丙二醇,5.5mg/mL苯酚,1.42mg/mL磷酸二钠二水合物)中,并将溶液通过0.22μm PES过滤器过滤。将溶液在PBS中稀释至25μM利拉鲁肽,并将100μL样品分配到96孔Nunc MaxiSorp ELISA板(产品编号:439454)的每个孔中。
i.对于“背景”板:将100μLPBS分配到96孔Nunc MaxiSorp ELISA板(产品编号:439454)的每个孔中。
2.将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在4℃下孵育过夜。
3.第二天,通过向每个孔中加入300μL PBS将板洗涤3次。
4.通过向每个孔中添加补充有0.1%吐温20和10g/L BSA的300μL PBS来封闭板。然后将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育3小时。
5.在封闭板的同时,将抗体样品在离心机中以21,000xg离心5分钟,并根据280nm处的吸光度测量上清液的浓度。每种抗体在补充有0.1%吐温20和1g/L BSA的PBS中连续稀释至5nM。
6.通过向每个孔中加入300μL PBS将板洗涤3次
7.将100μL抗体溶液分配到每个孔中。每种抗体一式两份进行测试(即每块板每种抗体2个孔)。然后将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。
8.第二抗体溶液通过将第二抗体(山羊抗人IgG-Fc HRP缀合物,InvitrogenA18817,储备浓度:在50%甘油中0.5mg/mL)1:1000稀释到补充有0.1%吐温20和10g/L BSA的PBS中而制备。
9.通过向每个孔中加入300μL PBS将板洗涤3次。
10.将100μL第二抗体溶液分配到每个孔中。然后将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。在第二抗体孵育期间,从冰箱中取出1-Step Ultra-TMB ELISA底物(Thermo Fisher Scientific,34208)以将溶液平衡至室温并制备2M(4N)H2SO4。
11.通过向每个孔中加入300μL PBS将板洗涤3次。
12.将100μL Ultra-TMB添加到每个孔中并孵育,直到形成黄色产物(5-10分钟)。
13.通过添加100μL 2M H2SO4猝灭反应。
14.用酶标仪(BioTek Synergy Neo)在450nm处读取每个孔的吸光度。
计算:计算每种抗体针对原纤维包被的板的ELISA信号(450nm处的吸光度)与其针对可溶性利拉鲁肽包被的板以及与背景板的信号的比率。这些比率是本文报告的原纤维/可溶物比率和原纤维/背景比率。例如:如果抗体对于利拉鲁肽原纤维给出的信号为1.5,对于可溶性利拉鲁肽为0.05,对于背景板为0.1,则原纤维/可溶物比率将为1.5/0.05=30,原纤维/背景比率将为:1.5/0.1=15。
试验(III-B):抗体特异性比率(方法1B)
1.在测定前一天晚上:将BSA以1mg/mL溶解于PBS中,然后通过带有30cc luer锁注射器的0.22μm PES过滤器进行过滤除菌,并将150μL溶液分配到Nunc MaxiSorp(产品编号:439454)96孔ELISA板的每个孔中。将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在4℃下孵育过夜。
2.从冰箱中取出ELISA板(用BSA包被),并用300μL PBS洗孔3次。
a.对于原纤维包被的ELISA板:将根据本文的试验(I)制备的利拉鲁肽原纤维重新悬浮于药物组合物缓冲液中(通过本文的试验(VII)(BCA测定)确定原纤维浓度),约300μL样品在微量离心管中在冰上进行超声处理(3个循环,10秒开启/30秒关闭,100%振幅;FB-120Sonic Dismembrator,Thermo Fisher Scientific)。将溶液在PBS中稀释至10μM利拉鲁肽原纤维,并将100μL样品分配到每个孔中。
b.对于可溶性利拉鲁肽包被的板:将6mg/mL利拉鲁肽溶解于在需要时使用NaOH和/或HCl将pH调节至8.15的药物组合物缓冲液(14mg/mL丙二醇,5.5mg/mL苯酚,1.42mg/mL磷酸二钠二水合物)中,并将溶液通过0.22μm PES过滤器过滤。将溶液在PBS中稀释至10μM利拉鲁肽,并将100μL样品分配到每个孔中。
i.对于“背景”板:将100μL PBS分配到96孔Nunc MaxiSorp ELISA板(产品编号:439454)的每个孔中。
3.将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下在不搅拌的情况下孵育3小时。
4.在这3小时过程中,将抗体样品在离心机中以21,000xg离心5分钟,并根据280nm处的吸光度测量上清液的浓度。每种抗体在补充有0.1%吐温20和1g/L BSA的PBS中连续稀释至5nM(除非浓度另外指定)。
5.通过向每个孔中加入300μLPBS将板洗涤3次。
6.将100μL抗体溶液分配到每个孔中。然后将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。
7.第二抗体溶液通过将第二抗体(山羊抗人IgG-Fc HRP缀合物,InvitrogenA18817,储备浓度:在50%甘油中0.5mg/mL)1:1000稀释到补充有0.1%吐温20和10g/L BSA的PBS中而制备。
8.通过向每个孔中加入300μL PBST(补充有0.1%吐温20的PBS)将板洗涤3次。
9.将100μL第二抗体溶液分配到每个孔中。然后将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。在第二抗体孵育期间,从冰箱中取出1-Step Ultra-TMB ELISA底物(Thermo Fisher Scientific,34208)以将溶液平衡至室温并制备2M(4N)H2SO4。
10.通过向每个孔中加入300μL PBST将板洗涤3次。
11.将100μL Ultra-TMB添加到每个孔中并孵育,直到形成黄色产物(5-10分钟)。
12.通过添加100μL 2M H2SO4猝灭反应。
13.用酶标仪(BioTek Synergy Neo)在450nm处读取每个孔的吸光度。
计算:计算每种抗体针对原纤维包被的板的ELISA信号(450nm处的吸光度)与其针对可溶性利拉鲁肽包被的板以及与背景板的信号的比率。这些比率是本文报告的原纤维/可溶物比率和原纤维/背景比率。例如:如果抗体对于利拉鲁肽原纤维给出的信号为1.5,对于可溶性利拉鲁肽为0.05,对于背景板为0.1,则原纤维/可溶物比率将为1.5/0.05=30,原纤维/背景比率将为:1.5/0.1=15。
试验(IV):抗体特异性比率(方法2)
如下确定抗体特异性比率:
在测定前一天晚上:将BSA以1mg/mL溶解于PBS中,然后通过带有30cc luer锁注射器的0.22μmPES过滤器进行过滤除菌,并将150μL溶液分配到Nunc MaxiSorp(产品编号:439454)96孔ELISA板的每个孔中。将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在4℃下孵育过夜。
在测定当天:
1.将利拉鲁肽以60mg/mL溶解于在需要时使用NaOH和/或HCl将pH调节至8.15的药物组合物缓冲液(14mg/mL丙二醇,5.5mg/mL苯酚,1.42mg/mL磷酸二钠二水合物)中,并通过0.22μm PES过滤器过滤。将溶液在PBS中稀释至6mg/mL(1600μM)利拉鲁肽。该溶液被称为“可溶性利拉鲁肽的溶液”。
2.将约300μL样品中,根据本文的试验(I)获得的利拉鲁肽原纤维(下文中:原纤维)重新悬浮在pH 8.15的药物组合物缓冲液中(通过本文的试验(VII)(BCA测定)确定原纤维的浓度),在微量离心管中在冰上进行超声处理(3个循环,10秒开启/30秒关闭,100%振幅;FB-120Sonic Dismembrator,Thermo Fisher Scientific)。该溶液被称为“原纤维溶液”。
3.将超声处理的原纤维溶液稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中,使得原纤维的终浓度为100μM。然后将该溶液进一步连续稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中,得到0.1μM原纤维的样品。使用两个对照:i)PBS(无肽),和ii)无原纤维(仅可溶性利拉鲁肽的溶液)。
4.从冰箱中取出ELISA板(用BSA包被),并用300μLPBS洗孔3次。
5.将100μL来自以上(3)的每个样品或对照分配到刚刚洗涤的板的孔中,将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下在不搅拌的情况下孵育3小时。
6.在以上3小时孵育期间,将约75μL待测抗体(例如scFv-Fc融合蛋白)以21,000xg旋转5分钟以沉降任何颗粒。取出上清液,并测定该上清液的A280nm以计算抗体浓度。将抗体在PBS+0.1%吐温20+1g/L BSA中连续稀释至5nM,并保存在冰上直至使用。
7.在3小时孵育结束时,将板的孔用300μL PBS洗涤3次。
8.将100μL 5nM抗体加入每个孔中。钭板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。
9.以上1小时孵育期间,将第二抗体(山羊抗人IgG-Fc HRP缀合物,InvitrogenA18817,储备浓度:在50%甘油中0.5mg/mL)1:1000稀释到PBS+0.1%吐温20+10g/L BSA中。
10.在1小时孵育结束时,将孔用300μLPBS洗涤3次。
11.将100μL第二抗体溶液加入每个孔中。将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。
12.在第二抗体孵育期间,从冰箱中取出1-Step Ultra-TMB ELISA底物(ThermoFisher Scientific,34208)以将溶液平衡至室温。制备2M(4N)H2SO4。
13.在1小时孵育结束时,将孔用300μL PBS洗涤3次。
14.将100μL Ultra-TMB添加到每个孔中并孵育10分钟。
15.通过添加100μL 2M H2SO4猝灭反应。
16.在酶标仪(BioTek Synergy Neo)中读取450nm处的吸光度。
计算:包含原纤维的孔中每种抗体的ELISA信号除以具有可溶性利拉鲁肽且无原纤维的对照孔中相同抗体的ELISA信号。该比率是混合物/可溶物特异性比率。例如:如果给定抗体对于与可溶性利拉鲁肽混合的0.1μM利拉鲁肽原纤维给出的信号为1.5,而对于可溶性利拉鲁肽(缺乏原纤维)给出的信号为0.05:混合物/可溶物特异性比率将为1.5/0.05=30。
试验(V):ThT测定
在原纤维形成后立即分析肽的测试溶液中原纤维的存在与否。原纤维形成前的肽浓度为6mg/ml。该肽可以是利拉鲁肽或司美格鲁肽。利拉鲁肽原纤维可根据本文的试验(I)制备。司美格鲁肽原纤维可根据本文的试验(II)制备。将75μL测试溶液样品与1.36μL ThT储备溶液(储备浓度:2200μM ThT)混合,以在肽/ThT混合物中达到40μM的最终ThT浓度。对于利拉鲁肽,该混合物中的终浓度为1571μM利拉鲁肽(在原纤维化之前计算)。将50μL肽/ThT混合物样品加入黑色384孔板(Fisherbrand 384孔聚苯乙烯板,12566624,ThermoFisher Scientific)的孔中,5-10分钟后,使用Biotek Synergy Neo酶标仪测量ThT荧光(λex=444nm,λem=482nm)值。
试验(VI):ThT测定与抗体测定的比较
与抗体测定相比,使用ThT检测方法确定与可溶性利拉鲁肽的混合物中利拉鲁肽原纤维的检测。
1.将利拉鲁肽以60mg/mL溶解于在需要时使用NaOH和/或HCl将pH调节至8.15的药物组合物缓冲液(14mg/mL丙二醇,5.5mg/mL苯酚,1.42mg/mL磷酸二钠二水合物)中,并通过0.22μm PES过滤器过滤。将溶液在PBS中稀释至6mg/mL(1600μM)利拉鲁肽。该溶液被称为“可溶性利拉鲁肽的溶液”。
2.将约300μL样品中,根据本文的试验(I)获得的利拉鲁肽原纤维(下文中:原纤维)重新悬浮在pH 8.15的药物组合物缓冲液中(通过本文的试验(VII)(BCA测定)确定原纤维的浓度),在微量离心管中在冰上进行超声处理(3个循环,10秒开启/30秒关闭,100%振幅;FB-120Sonic Dismembrator,Thermo Fisher Scientific)。该溶液被称为“原纤维溶液”。
3.将超声处理的原纤维溶液稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中,使得原纤维的终浓度为100μM。然后将该溶液进一步连续稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中,得到0.001、0.0025、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5、10和25μM原纤维的样品。使用两个对照:i)PBS(无肽),和ii)无原纤维(仅可溶性利拉鲁肽的溶液)。
a.此时,将通过将原纤维溶液稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中获得的溶液(来自步骤3)加入(100μL)到卵清蛋白包被的ELISA板的孔中,并在室温下孵育2小时,之后用本发明的抗体进行ELISA检测。剩余的ELISA方案如试验(IV)所述进行(步骤7以后)。
4.将残留样品(来自步骤3的原纤维与可溶性利拉鲁肽的混合物,以及PBS对照和可溶性利拉鲁肽对照)在室温下在微量离心管中孵育2.5小时。
5.制备浓度为2200μM的硫代黄素T(ThT)储备溶液。将ThT加入样品(最初总肽浓度为1600μM)中至终浓度为40μM,并将50μM的肽/ThT混合物样品加入黑色384孔板(Fisherbrand 384孔聚苯乙烯板,12566624,Thermo Fisher Scientific)的孔中。使用Biotek Synergy Neo酶标仪测量每个样品的ThT荧光(λex=444nm,λem=482nm)值。肽/ThT混合物中的最终(总)肽浓度为1571μM(在原纤维化之前计算)。
6.将包含原纤维的溶液的荧光测量值除以可溶性利拉鲁肽的溶液(无原纤维对照)的荧光测量值,并将该比率报告为混合物/可溶物比率。
试验(VI-B):ThT测定与抗体测定的比较
与抗体测定相比,使用ThT检测方法确定与可溶性利拉鲁肽的混合物中利拉鲁肽原纤维的检测。
1.在测定前一天晚上:将BSA以1mg/mL溶解于PBS中,然后通过带有30cc luer锁注射器的0.22μm PES过滤器进行过滤除菌,并将150μL溶液分配到Nunc MaxiSorp(产品编号:439454)96孔ELISA板的每个孔中。将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在4℃下孵育过夜。
2.在测定当天,将利拉鲁肽混合物固定在BSA包被的板上。
a.将利拉鲁肽以60mg/mL溶解于在需要时使用NaOH和/或HCl将pH调节至8.15的药物组合物缓冲液(14mg/mL丙二醇,5.5mg/mL苯酚,1.42mg/mL磷酸二钠二水合物)中,并通过0.22μm PES过滤器过滤。将溶液在PBS中稀释至6mg/mL(1600μM)利拉鲁肽。该溶液被称为“可溶性利拉鲁肽的溶液”。
b.将约300μL样品中,根据本文的试验(I)获得的利拉鲁肽原纤维(下文中:原纤维)重新悬浮在pH 8.15的药物组合物缓冲液中(通过本文的试验(VII)(BCA测定)确定原纤维的浓度),在微量离心管中在冰上进行超声处理(3个循环,10秒开启/30秒关闭,100%振幅;FB-120Sonic Dismembrator,Thermo Fisher Scientific)。该溶液被称为“原纤维溶液”。
c.将超声处理的原纤维溶液稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中,使得原纤维的终浓度为100μM。然后将该溶液进一步连续稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中,得到0.001、0.0025、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5、10和25μM原纤维的样品。使用两个对照:i)PBS(无肽),和ii)无原纤维(仅可溶性利拉鲁肽的溶液)。
d.将通过将原纤维溶液稀释到可溶性利拉鲁肽的溶液中获得的溶液加入(100μL)到BSA包被的ELISA板的孔中,并在室温下孵育3小时。
3.剩余的ELISA方案如试验(IV)所述进行,具有一些修改。
a.在这3小时过程中,将抗体样品在离心机中以21,000xg离心5分钟,并根据280nm处的吸光度测量上清液的浓度。每种抗体在补充有0.1%吐温20的PBS(PBST)中连续稀释至5nM。
b.通过向每个孔中加入300μL PBS将板洗涤3次。
c.将100μL抗体溶液分配到每个孔中。然后将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。
d.第二抗体溶液通过将第二抗体(山羊抗人IgG-Fc HRP缀合物,InvitrogenA18817,储备浓度:在50%甘油中0.5mg/mL)1:1000稀释到补充有0.1%吐温20和10g/L BSA的PBS中而制备。
e.通过向每个孔中加入300μL PBST将板洗涤3次。
f.将100μL第二抗体溶液分配到每个孔中。然后将板用胶膜覆盖,用铝箔包裹,并在室温下孵育1小时。在第二抗体孵育期间,从冰箱中取出1-Step Ultra-TMB ELISA底物(Thermo Fisher Scientific,34208)以将溶液平衡至室温并制备2M(4N)H2SO4。
g.通过向每个孔中加入300μL PBST将板洗涤3次。
h.将100μL Ultra-TMB添加到每个孔中并孵育,直到形成黄色产物(5-10分钟)。
i.通过添加100μL 2M H2SO4猝灭反应。
j.在酶标仪(BioTek Synergy Neo)中在450nm处读取每个孔的吸光度。
4.将残留样品(来自步骤3的原纤维与可溶性利拉鲁肽的混合物,以及PBS对照和可溶性利拉鲁肽对照)在室温下在微量离心管中孵育2.5小时。
5.制备浓度为2200μM的硫代黄素T(ThT)储备溶液。将ThT加入样品(最初总肽浓度为1600μM)中至终浓度为40μM,并将50μM的肽/ThT混合物样品加入黑色384孔板(Fisherbrand 384孔聚苯乙烯板,12566624,Thermo Fisher Scientific)的孔中。使用Biotek Synergy Neo酶标仪测量每个样品的ThT荧光(λex=444nm,λem=482nm)值。肽/ThT混合物中的最终(总)肽浓度为1571μM(在原纤维化之前计算)。
6.将包含原纤维的溶液的荧光测量值除以可溶性利拉鲁肽的溶液(无原纤维对照)的荧光测量值,并将该比率报告为混合物/可溶物比率。
试验(VII):BCA测定
原纤维(例如利拉鲁肽原纤维)的浓度使用Pierce BCA Protein Assay试剂盒(Thermo Fisher Scientific,23225)测定,以利拉鲁肽作为利拉鲁肽原纤维的标准品,并以司美格鲁肽作为司美格鲁肽原纤维的标准品(而非BSA)。由于来自药物组合物缓冲液的苯酚与BCA试剂反应的程度根据样品稀释度而不同,因此运行对照进行定量,以考虑由苯酚产生的背景信号。通过从原纤维组装期间的初始浓度(6mg/mL)减去上清液(超速离心后)中的肽浓度来确定来自本文的试验(I)或试验(II)的重悬原纤维溶液中原纤维的浓度。如下所述进行利拉鲁肽原纤维的分析:
1.将利拉鲁肽以6mg/mL(6000μg/mL)溶解于pH 8.15的药物组合物缓冲液中。这被称为“可溶性利拉鲁肽的溶液”。
2.对于标准品,将可溶性利拉鲁肽的溶液从(1)稀释到PBS中,浓度为2000、1500、1000、750、500、250、125、25和0μg/mL,并制备“空白”,其含有在PBS(但缺乏肽)中稀释的相同量的药物组合物缓冲液(pH 8.15)。例如,制备600μL 2000μg/mL标准品需要200μL来自(1)的溶液和400μL PBS。为了制备空白,将200μL药物组合物缓冲液(无肽)和400μL PBS混合。
3.将从本文试验(I)获得的超速离心的原纤维(在药物组合物缓冲液(pH 8.15)中)的上清液按以下稀释度稀释到PBS中:1:2、1:4、1:8、1:16、1:32。还为这些样品制备了“空白”,这些空白含有以相同稀释度稀释到PBS中的药物组合物缓冲液(pH 8.15)。
4.向透明(无结合或低结合)平底96孔板的每个孔中加入10μL标准品(和具有相应空白的单独孔)和10μL稀释的样品(和具有相应空白的单独孔)。
5.配制BCA工作试剂,向每个孔中加入225μL,并将板用胶膜覆盖。
6.将板在37℃下孵育,直到有足够的紫色形成(这通常发生得相对较快,并且某些样品中某些颜色通常几乎立即可见)。
7.在酶标仪中在562nm处读取吸光度。
8.从标准品的值中减去标准品的“空白”吸光度值。将标准曲线拟合到通过将肽浓度相对于吸光度作图并拟合二阶多项式而得到的(减去背景的)吸光度。
9.从上清液稀释液的值中减去上清液的“空白”吸光度值。使用来自(8)的标准曲线,确定上清液样品的肽浓度并乘以它们的稀释因子,以计算未稀释的上清液中的利拉鲁肽浓度。计算浓度在约250-1000μg/mL范围内的样品是优选的(这是BCA测定的准确范围的中间值)。
10.由于原纤维以6mg/mL(6000μg/mL)的浓度组装,因此从中减去上清液的肽浓度以获得再悬浮的样品中原纤维的浓度。为了使该计算准确,在离心后以完全相同的总体积重新悬浮试验(I)中的原纤维沉淀物是重要的。
类似的程序可以用于司美格鲁肽原纤维,除了提到的本文的试验(I)应替换为本文的试验(II)之外。
结果
实施例1:抗体
具有表1所列氨基酸序列的抗体(scFv-Fc)通过重组表达来制备并纯化。
表1列出了每种抗体的完整序列;粗体文本显示CDR位置(按L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的顺序显示);根据Kabat抗体编号方案定义CDR。表2列出了表1中抗体的轻链可变区(VL序列)、重链可变区(VH序列)的氨基酸序列。表3列出了表1中的抗体的CDR。
表1.抗体完整序列信息
表2.抗体可变轻链(VL)和可变重链(VH)氨基酸序列
表3.抗体CDR序列
实施例2:抗体的利拉鲁肽原纤维特异性
与背景和/或可溶性利拉鲁肽相比,单独测试实施例1的抗体结合利拉鲁肽原纤维的能力。根据如本文限定的试验(III)或试验(IV)进行测试。结果在表4和表5中示出。
表4.使用25μM利拉鲁肽原纤维浓度,根据本文所述的试验(III)测定的抗体的利拉鲁肽原纤维特异性
表5.使用0.1μM利拉鲁肽原纤维浓度,根据本文所述的试验(IV)在与可溶性利拉鲁肽的混合物中测定的抗体的利拉鲁肽原纤维特异性
表4和表5中的结果显示,所测试的抗体与利拉鲁肽原纤维的结合显著多于与可溶性利拉鲁肽的结合。表4中的结果还显示,所测试的抗体与利拉鲁肽原纤维的结合显著多于背景。表5中的结果显示,当在高浓度的可溶性利拉鲁肽的混合物中测试时,所测试的抗体也能够显著更多地结合利拉鲁肽原纤维。
实施例3:利拉鲁肽原纤维的检测灵敏度-抗体与ThT测定的比较
测试ThT测定在含过量可溶性利拉鲁肽的混合物中结合利拉鲁肽原纤维的能力,以便允许与本发明的抗体进行灵敏度比较。该实验根据本文的试验(VI)进行。结果在表6中示出。
表6.利拉鲁肽原纤维的检测灵敏度;结果被报告为特异性比率(混合物中的利拉鲁肽原纤维/可溶性利拉鲁肽)。
实施例4:利拉鲁肽抗体的浓度依赖性结合分析
如“抗体表达和纯化”部分所述制备抗体。对抗体E、M和N进行两步纯化,产量>20mg/L。纯化的抗体主要是单体,如通过分析型大小排阻色谱法所证明的(对于E、M和N,>95%单体;图1)。通过在第一抗体孵育期间去除BSA,也增强了使用两步纯化的抗体(>95%单体)的测定的灵敏度。这些变化导致改进的试验(III-B)。
对实施例1的抗体E、M和N进行两步纯化(>95%单体),并与背景和/或可溶性利拉鲁肽相比,单独测试它们结合利拉鲁肽原纤维的能力。根据本文的试验(III-B)进行测试。结果在表7(对于聚集的和可溶性利拉鲁肽,原始(减去非背景)抗体结合信号)和表8(抗体的利拉鲁肽原纤维特异性(利拉鲁肽原纤维/单体利拉鲁肽))中示出。进行了三个独立的实验,报告的值为平均值。
表7:对于两步纯化的抗体,对聚集的和可溶性利拉鲁肽的抗体结合信号。
表8:对于两步纯化的抗体,抗体的利拉鲁肽原纤维特异性(利拉鲁肽原纤维/利拉鲁肽单体)。
表7和表8中的结果显示,所测试的抗体与利拉鲁肽原纤维的结合显著多于与可溶性利拉鲁肽的结合。
还观察到,在测定中使用高度纯化的抗体(>95%单体)具有使试验(III-B)比以前使用一步纯化的抗体(>5%抗体聚集体)的试验(III)具有更高再现性的优点,因为在不同批次的两步纯化的抗体(>95%单体)中更容易控制抗体聚集体的量。使用大小排阻色谱法去除抗体聚集体会降低在低抗体浓度下的抗体灵敏度,因为抗体聚集体有助于与利拉鲁肽原纤维的结合。然而,增加的抗体纯度由于背景信号较低,因此允许使用更高的抗体浓度,这使得能够提高检测灵敏度。
实施例5:利拉鲁肽原纤维的检测灵敏度-抗体与ThT测定的比较
如“抗体表达和纯化”部分所述制备抗体。对抗体E、M和N进行两步纯化,产量>20mg/L。纯化的抗体主要是单体,如通过分析型大小排阻色谱法所证明的(对于E、M和N,>95%单体;图1)。通过在第一抗体孵育期间去除BSA和增加抗体浓度(从5nM到50nM),也增强了使用两步纯化的抗体(>95%单体)的测定的灵敏度,从而导致改进的试验(VI-B)。
测试ThT测定在含过量可溶性利拉鲁肽的混合物中结合利拉鲁肽原纤维的能力,以便允许与本发明的抗体M进行灵敏度比较。该实验根据本文的试验(VI-B)进行。结果在表9中示出。
表9.使用试验(VI-B)对于两步纯化的抗体M(>95%单体)检测利拉鲁肽原纤维的灵敏度;结果报告为特异性比率(混合物中的利拉鲁肽原纤维/可溶性利拉鲁肽),ThT浓度=0.4μM。
表9中的结果显示,本发明的抗体检测利拉鲁肽原纤维的灵敏度比ThT测定高若干个数量级。另外,还发现本发明的抗体在ThT测定中未记录到信号的原纤维浓度下检测到利拉鲁肽原纤维。
还观察到,在测定中使用高度纯化的抗体(>95%单体)具有使试验(VI-B)比以前使用一步纯化的抗体(>5%抗体聚集体)的试验(VI)具有更高再现性的优点,因为在不同批次的两步纯化的抗体(>95%单体)中更容易控制抗体聚集体的量。使用大小排阻色谱法去除抗体聚集体会降低在低抗体浓度(例如5nM)下的抗体灵敏度,因为抗体聚集体有助于与利拉鲁肽原纤维的结合。然而,增加的抗体纯度由于背景信号较低,因此允许使用更高的抗体浓度(50nM而不是5nM),这使得能够提高检测灵敏度。
实施例6:纯度>95%单体的抗体的再现性
对实施例1的抗体M进行两步纯化(>95%单体),并测试了与可溶性利拉鲁肽相比,在过量可溶性利拉鲁肽的存在下,其结合利拉鲁肽原纤维的能力。根据本文的试验(VI-B)进行测试。测试了两个不同批次的抗体,并进行了总共四次独立实验。结果在表10中示出。
表10.使用试验(VI-B)对于双分选的抗体M检测利拉鲁肽原纤维的灵敏度;结果报告为特异性比率(混合物中的利拉鲁肽原纤维/可溶性利拉鲁肽),ThT浓度=0.4μM。
表10中的结果显示,在测定中使用高度纯化的抗体(>95%单体)导致重复性非常高的结果。
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征,但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此,应当理解,意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。
Claims (15)
1.与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体
a.与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,其中所述结合水平是根据试验(III)在至少25μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
b.对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述检测限是根据本文的试验(VI)在至少1μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
c.与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少5倍,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述结合水平是根据本文的试验(III-B)在至少30μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
d.对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述检测限是根据本文的试验(VI-B)在至少0.025μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。
2.根据权利要求1所述的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体
a.与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少10倍,其中所述结合水平是根据试验(III)在至少25μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
b.对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述检测限是根据本文的试验(VI)在至少1μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体,其中所述原纤维任选地根据本文的试验(I)制备,并且所述抗体
c.与利拉鲁肽原纤维的结合水平是所述抗体与可溶性利拉鲁肽的结合水平的至少5倍,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述结合水平是根据本文的试验(III-B)在至少30μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的;并且/或者
d.对利拉鲁肽原纤维的检测限比在ThT测定中对利拉鲁肽原纤维的检测限低至少10倍的浓度,其中所述抗体具有高于95%单体的纯度,并且其中所述检测限是根据本文的试验(VI-B)在至少0.025μM的利拉鲁肽原纤维浓度下确定的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体,其中所述抗体具有高于70%,或者高于75%,或者高于80%,或者高于85%,或者高于90%,或者高于95%单体的纯度。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体,其中所述抗体能够检测溶液中1-1000ppm原纤维浓度的利拉鲁肽原纤维,如1-10ppm原纤维,或者10-100ppm原纤维,或者100-1000ppm原纤维。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含CDR3序列,并且所述CDR3序列选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、115和121,或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体,其中所述抗体的重链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
a.SEQ ID NO:37、38和39;
b.SEQ ID NO:43、44和45;
c.SEQ ID NO:49、50和51;
d.SEQ ID NO:55、56和57;
e.SEQ ID NO:61、62和63;
f.SEQ ID NO:67、68和69;
g.SEQ ID NO:73、74和75;
h.SEQ ID NO:79、80和81;
i.SEQ ID NO:85、86和87;
j.SEQ ID NO:91、92和93;
k.SEQ ID NO:97、98和99;
l.SEQ ID NO:103、104和105;
m.SEQ ID NO:115、116和117;
n.SEQ ID NO:121、122、123;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体,其中所述抗体的轻链可变区包含选自下组的CDR1、CDR2和/或CDR3序列:
o.SEQ ID NO:40、41和42;
p.SEQ ID NO:46、47和48;
q.SEQ ID NO:52、53和54;
r.SEQ ID NO:58、59和60;
s.SEQ ID NO:64、65和66;
t.SEQ ID NO:70、71和72;
u.SEQ ID NO:76、77和78;
v.SEQ ID NO:82、83和84;
w.SEQ ID NO:88、89和90;
x.SEQ ID NO:94、95和96;
y.SEQ ID NO:100、101和102;
z.SEQ ID NO:106、107和108;
aa.SEQ ID NO:118、119和120;
bb.SEQ ID NO:124、125和126;
或具有1、2或3个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含如前述权利要求中任一项所限定的重链可变区和如前述权利要求中任一项所限定的轻链可变区。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含选自下组的序列:SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、109和110;或具有至多20个,例如至多15个或至多10个氨基酸置换、缺失或***的任何所述序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体,其中所述抗体与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、109和110的序列具有至少80%,例如至少90%或至少95%的序列同一性。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体,其中所述抗体是单链Fv片段或进一步包含Fc结构域的单链Fv片段。
13.根据权利要求1-12中任一项所限定的抗体用于鉴定利拉鲁肽原纤维和/或作为亲和配体从包含利拉鲁肽原纤维和可溶物的混合物中去除原纤维的用途。
14.鉴定和/或量化利拉鲁肽原纤维的方法,所述方法包括以下步骤
a)使如权利要求1-12中任一项所限定的抗体与利拉鲁肽结合;
b)任选地检测与利拉鲁肽原纤维结合的抗体;
c)任选地量化与利拉鲁肽原纤维结合的抗体,任选地通过使用所述原纤维的标准品。
15.相对于可溶性和/或单体利拉鲁肽检测利拉鲁肽原纤维的测定,其包括如权利要求1-12中任一项所限定的抗体,其中所述抗体能够检测溶液中1-1000ppm原纤维浓度的利拉鲁肽原纤维,如1-10ppm原纤维,或者10-100ppm原纤维,或者100-1000ppm原纤维。
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