CN116284406A - 一种pd-1结合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供了一种PD‑1结合蛋白及其应用，还提供了所述抗原结合蛋白的用途。

Description

一种PD-1结合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种PD-1结合蛋白及其应用。
背景技术
程序性死亡受体1(Programmed Death-1,PD-1)是具有288个氨基酸的I型膜蛋白，主要表达在激活的T细胞表面。PD-1有两个配体，即程序性死亡配体-1(Programmed DeathLigand-1，PD-L1)和PD-L2。PD-1与PD-L1及PD-L2相互作用会下调T细胞的活性，减弱细胞因子的分泌，起到免疫抑制作用。PD-1/PD-L1通路抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，进而抑制肿瘤生长。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对肿瘤抑制有重要的意义。目前，PD-1/PD-L1通路的阻断型抗体药物在临床上仍面临诸多挑战，例如有效性低、耐药性和副作用等，仍有必要继续开发出更有效的抗PD-1抗体及其人源化抗体。
发明内容
本申请提供了一种结合PD-1的抗原结合蛋白，其表现出一种或多种期望的功能特性，例如与PD-L1的高亲和力结合、抑制PD-1与PD-1结合的能力、增强T细胞活化包括增殖能力、IFN-γ和/或IL-2分泌的能力、刺激抗体应答的能力和/或逆转免疫抑制细胞如T调节细胞的抑制功能的能力。在一个实施方式中，本申请还提供了一种scFv-huIgG1 Fc型抗体，方便以自分泌形式与细胞药物联合使用。本申请还提供编码所述的分离的抗原结合蛋白的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于制备所述的分离的抗原结合蛋白的方法。本申请公开的结合PD-1的抗原结合蛋白可以用于(单独或结合其他活性剂或治疗形式)治疗、预防和/或诊断疾病，如癌症疾病(例如，实体和软组织肿瘤)。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:5(YAS)所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；以及所述抗原结合蛋白的重链可变区包含抗体重链可变区VH中的至少一个FR，所述VH包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含抗体重链可变区VH中的至少一个FR，所述VH包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含抗体轻链可变区VL中的至少一个FR，所述VL包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含抗体轻链可变区VL中的至少一个FR，所述VL包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR3包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR3包含SEQ ID NO:42至44中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR2包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:39至40中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR3包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR3包含SEQ ID NO:51至52中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR2包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR2包含SEQ ID NO:49至50中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:46至48中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白还包括抗体重链恒定区。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白包括源自人IgG恒定区的抗体重链恒定区。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白的抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在另一优选例中，所述抗原结合片段选自下组：人源化抗体、嵌合抗体和全人源抗体。
在另一优选例中，所述抗原结合蛋白具有选自以下组的性质中的一种或多种：能够结合人的PD-1、能够阻断PD-1和PD-L1结合、能够阻断PD-1和PD-L2结合、能够刺激免疫细胞中IL-2、TNF-α和/或IFN-γ的分泌、能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖、和能够提高免疫细胞的杀伤能力。
另一方面，本申请提供了一种多肽，其包含所述的分离的抗原结合蛋白，以及任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述的多肽。
另一方面，本申请提供了载体，其包含所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
另一方面，本申请提供了制备所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的分离的抗原结合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，提供了免疫偶联物，其包含所述的分离的抗原结合蛋白，和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
另一方面，本申请提供了所述的分离的抗原结合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的药物组合物和/或所述的免疫偶联物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗PD-1介导的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述PD-1介导的疾病或病症包括癌症或肿瘤。
另一方面，本申请提供了所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述的免疫偶联物在制备用于检测样品中PD-1分子的检测试剂、检测板或检测试剂盒中的用途。
另一方面，本申请提供了检测样品中PD-1蛋白的方法(包括非诊断目的和诊断目的)，所述方法包括步骤：
(1)将样品与所述的分离的抗原结合蛋白和/或所述的免疫偶联物接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-1蛋白。
另一方面，本申请提供了用于非治疗和/或诊断目的的影响靶细胞产生细胞因子的方法，所述方法包括施用所述的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的核酸、所述的载体、和/或表达所述抗原结合蛋白、所述多肽或包含所述核酸和/或所述载体的细胞。
在另一优选例中，所述靶细胞包括免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、外周血单核细胞(PBMC)。
在另一优选例中，所述细胞因子包括IL-2、TNF-α和/或IFN-γ。
另一方面，本申请提供了抑制PD-1与PD-L1结合的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的抗原结合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了抑制PD-1与PD-L2结合的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的抗原结合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了预防、缓解或治疗PD-1介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的抗原结合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述PD-1介导的疾病或病症包括癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括实体瘤和血液肿瘤。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述四价人PD-L1胞外段突变体与PD-1-huIgG1 Fc的亲合力(基于BLI法)检测曲线；
图2显示的是6H6和pembrolizumab的huIgG1抗体对PD-1和PD-L1结合的抑制曲线；
图3显示的是6H6和pembrolizumab的huIgG1抗体与PD-1的结合曲线。
图4显示的是在源于供者A和供者B的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞培养基中加入PD-1抗体后测得的CD107a细胞比例结果图。
图5显示的是在源于供者A和供者B的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞培养基中加入PD-1抗体后测得的细胞因子分泌结果图。其中，A-C显示了源于供者A的肿瘤浸润淋巴细胞分泌细胞因子的情况；D-F显示了源于供者B的肿瘤浸润淋巴细胞分泌细胞因子的情况。
图6显示的是混合淋巴细胞反应(MLR)实验检测PD-1抗体对于T淋巴细胞的刺激结果图。
图7显示的是加入PD-1抗体对TCR-T细胞的杀伤能力增强结果图。
图8显示的是6H6抗体的抗原结合亲和力结果。
图9显示的是6H6-5抗体的抗原结合亲和力结果。
图10显示的是6H6-25抗体的抗原结合亲和力结果。
图11显示的是6H6-29抗体的抗原结合亲和力结果。
图12显示的是，6H6和人源化6H6-5、6H6-25、6H6-29 huIgG1抗体对PD-1和PD-L1结合的半数抑制浓度IC50。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“PD-1”通常是指程序性细胞死亡1，也称为“程序性死亡1”、“CD279”、“分化簇279”、“PD1”、“PDCD1”。PD-1通常在T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、活化的单核细胞和树突细胞(DC)上表达，并参与细胞凋亡。PD-1通常包含一个细胞外IgV结构域，跨膜区和胞内结构域。PD-1可结合两种配体，PD-L1和PD-L2。所述“PD-1”包括任何脊椎动物来源的任何天然PD-1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人和食蟹猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-1以及由细胞加工所产生的任何形式的PD-1。PD-1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。“PD-1”包括完整的PD-1及其片段，还包括PD-1的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与PD-1共同表位的类似物。人PD1的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)，登录号Q15116。
在本申请中，术语“PD-L1”通常是指程序性细胞死亡1配体1，也可称为B7同源物1、B7-H1、分化簇274、(3)274或CD274，其与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌。“PD-L1”包括任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人和食蟹猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-L1以及由细胞加工所产生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。“PD-L1”包括完整的PD-L1及其片段，还包括PD-L1的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与PD-L1共同表位的类似物。PD-L1的基本结构包括4个结构域：胞外Ig样V型结构域和Ig样C2型结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。完整hPD-L1序列可见于GenBank登录号Q9NZQ7下。
在本申请中，术语“分离的”或“纯化的”通常是指至少部分从在其天然状态中通常与其结合的其他分子中分离的分子(例如抗体、核酸等)。“分离的或纯化的多肽”基本上没有其他生物分子，如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、细胞碎片和生长培养基。“分离的或纯化的核酸”至少部分从在其天然状态中通常位于多核苷酸侧翼的核酸分离。因此，在本申请中认为例如由于重组技术，融合它们通常不结合的调节或编码序列的多核苷酸是分离的。即使当存在于例如宿主细胞的染色体中或核酸溶液中，也认为此类分子是分离的。一般地，术语“分离的”和“纯化的”不旨在指此类物质的完全缺失或水、缓冲液或盐的缺失，除非它们以大量干扰分子的实验或治疗用途的量存在。本申请的抗原结合蛋白和编码本申请的抗原结合蛋白的核酸是分离的/纯化的。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”被以其广义使用并且意指包含与抗原或靶标结合的一部分并且任选地包含允许抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构型的构架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；单域抗体(或称为纳米抗体)；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab片段；F(ab’)2片段；IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体以及其片段。抗原结合蛋白可以包括，例如具有移植的CDR或CDR衍生物的替代蛋白构架或人工构架。此类构架包括，但不限于：抗体来源的构架，其包含被引入以便例如使抗原结合蛋白的三维结构稳定的突变；以及完全合成的构架，其包含例如生物相容性聚合物。参见，例如，Korndorfer等，2003，Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics，53(1)：121-129(2003)；Roque等，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。此外，可使用肽抗体模拟物(“PAM”)，也可使用基于抗体模拟物的构架，所述抗体模拟物利用纤连蛋白组分作为构架。
在本申请中，术语“抗体”其以最广泛意义使用，且具体涵盖，但不限于，单克隆抗体(包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人类抗体、嵌合抗体、重链抗体和骆驼化单结构域抗体(如，重链可变结构域抗体)。抗体通常具有免疫球蛋白的结构，可以包含通过二硫键互相连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的蛋白，或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链，ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗体中，各轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为超变性的区域，称为互补决定区(CDR)，其与称为框架区(FR)的较保守的区域交替。各VH和VL包含三个CDR和四个框架区(FR)，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(HFR1，HFR2，HFR3，HFR4，LFR1，LFR2，LFR3，LFR4)，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)结合。
在本申请中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDRs)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDRs一起形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)。在本申请中，使用包含了Kabat定义规则确定可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基(参见表1)。
表1本申请抗体基于Kabat定义规则的CDR定义
Kabat Residues
LCDR1 L24-L34
LCDR2 L50-L56
LCDR3 L89-L97
HCDR1 H31-H35
HCDR2 H50-H66
HCDR3 H99-H107
其中，Laa-Lbb可以指从抗体轻链的N端开始，第aa位至第bb位的氨基酸序列；Haa-Hbb可以指从抗体重链的N端开始，第aa位至第bb位的氨基酸序列。例如，L24-L34可以指从抗体轻链N端开始，第24位至第34位的氨基酸序列；H231-H35可以指从抗体重链N端开始，第31位至第35位的氨基酸序列。
在本申请中，术语“Fab”指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。
在本申请中，术语“Fab′片段”是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“F(ab')2”指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv片段”是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,TrendsBiotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、***、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“参比抗体”通常是指任何可以与抗原(例如，PD-1)结合的抗体。在某些情形中，本申请所述抗原结合蛋白可以与参比抗体竞争结合抗原(例如，PD-1)。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”通常是指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一定组合，其不与在自然界中发现的多核苷酸的全部或一部分缔合，或连接至其在自然界中不连接的多核苷酸。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将***的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是293T细胞细胞。在本申请中，术语“重组细胞”通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子可包括缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合PD-1蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或***而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合PD-1蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”和“大约”应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度在所给出的值或值范围的20百分数(％)范围内，一般在其10％范围内和更一般在其5％范围内。
在本申请中，术语“治疗有效量”是指当施用于人或动物时引起足以在所述人或动物中产生治疗效果的应答的抗体的量。有效量易于由本领域普通技术人员按照常规方法确定。
发明详述
抗原结合蛋白
一方面，本申请提供一种抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:7或9所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。本申请所述的抗体可以为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。本申请所述抗体的抗原结合片段可以为Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
本申请所述的抗原结合蛋白可以与参比抗体竞争结合PD-1。所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5(YAS)所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本申请所述抗原结合蛋白可包含重链互补决定区HCDR1，HCDR2和HCDR3。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本申请所述抗原结合蛋白还可包含重链框架区HFR1，HFR2，HFR3和HFR4。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HFR1可包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述HFR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HFR2可包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，且所述HFR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HFR3可包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，且所述HFR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HFR4可包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，且所述HFR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区(VH)，且所述VH可包含SEQID NO:7或9所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可包含重链恒定区。
在本申请中，所述重链恒定区可包含人IgG的恒定区。在某些情形中，所述重链恒定区可包括人IgG4恒定区和/或人IgG1的重链恒定区。
在一些实施方式中，所述重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
本申请中所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:8或10所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
本申请所述抗原结合蛋白可包含轻链互补决定区LCDR1，LCDR2和LCDR3。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR2包含SEQ ID NO:5(YAS)所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的VH可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的VH可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区，且所述重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区，且所述重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述抗原结合蛋白可包含轻链框架区LFR1，LFR2，LFR3和LFR4。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LFR1可包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且所述LFR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LFR2可包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，且所述LFR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LFR3可包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，且所述LFR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LFR4可包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且所述LFR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连。
在本申请中，所述的抗原结合蛋白可包含VL，且所述VL可包含SEQ ID NO:8或10所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含VH和VL，所述VH可包含SEQ ID NO:7或15所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:8或10所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区，且所述重链恒定区可包含SEQID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5(YAS)和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的HFR1，HFR2，HFR3和HFR4可分别依次包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的LFR1，LFR2，LFR3和LFR4依次可包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列，且所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO:27或SEQID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:5(YAS)所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含抗体重链可变区VH中的至少一个FR，所述VH包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:67所示的抗体重链可变区VH中的至少一个FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的抗体重链可变区VH中的至少一个FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含上述VH中的1个、2个、3个或4个FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含上述VH中的4个H-FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含上述相同或不同的VH的H-FR1至4。
进一步地，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含抗体轻链可变区VL中的至少一个FR，所述VL包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。例如，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含抗体轻链可变区VL中的至少一个FR，所述VL包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:68所示的抗体轻链可变区VL中的至少一个FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的抗体轻链可变区VL中的至少一个FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含上述VL的1个、2个、3个或4个FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含上述VL的4个L-FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含上述相同或不同的VL的L-FR1至4。
例如，本申请的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:67所示的抗体重链可变区VH中的至少一个FR，且包含SEQ ID NO:68所示的抗体轻链可变区VL中的至少一个FR。例如，本申请的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的抗体重链可变区VH中的至少一个FR，且包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的抗体轻链可变区VL中的至少一个FR。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
例如，本申请的H-FR3可以包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
例如，本申请的H-FR3可以包含SEQ ID NO:42至44中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
例如，本申请的H-FR1可以包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
例如，本申请的H-FR1可以包含SEQ ID NO:39至40中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:42至44中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:39至40中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
例如，本申请的L-FR3可以包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
例如，本申请的L-FR3可以包含SEQ ID NO:51至52中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的L-FR2可以包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
例如，本申请的L-FR2可以包含SEQ ID NO:49至50中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的L-FR1可以包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
例如，本申请的L-FR1可以包含SEQ ID NO:46至48中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:51至52中任一项所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:49至50中任一项所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:46至48中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；以及本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:42至44中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:39至40中任一项所示的氨基酸序列；以及本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:51至52中任一项所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:49至50中任一项所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:46至48中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，本申请的L-FR3可以包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区可以包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。例如，本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，且本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的氨基酸序列，且本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，且本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，且本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白的重链可变区包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且本申请的抗原结合蛋白的轻链可变区包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
更进一步地，本申请的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区。例如，本申请的抗原结合蛋白包括源自人IgG恒定区的抗体重链恒定区。例如，本申请的抗原结合蛋白的抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
更进一步地，本申请的抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区。例如，本申请的抗原结合蛋白的抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
例如，本申请的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。例如，本申请的抗体包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。例如，本申请的抗原结合片段选自下组：人源化抗体和全人源抗体。
可通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本申请所述的PD-1抗原结合蛋白的物理/化学特性和/或生物活性。
在一个方面，例如可通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FACS)、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本申请抗原结合蛋白或融合蛋白的抗原结合活性。本申请所述的抗原结合蛋白(例如，PD-1抗体)能够特异性结合PD-1抗原。“特异性结合”PD-1抗原的抗原结合蛋白(例如，PD-1抗体)通常可以结合PD-1，但不结合缺乏PD-1序列的其它蛋白。本申请所述的抗原结合蛋白(例如，PD-1抗体)能够特异性结合PD-1抗原或其标记形式(例如，荧光标记的PD-1抗原)，但不会结合缺乏PD-1表位的其它蛋白。抗原结合蛋白(例如，抗体)是否结合PD-1抗原可使用本领域中已知的任何测定法确定。本领域中已知测定结合亲和力的分析的实例包括生物膜干涉技术(BLI)。
本申请所述的抗原结合蛋白可以结合人PD-1蛋白。在某些情形中，本申请所述的抗原结合蛋白还可以与猴(例如，食蟹猴)的PD-1交叉反应。例如，通过流式分析技术和酶联免疫反应所检测的。在本申请中，“交叉反应”是指抗体与来自其它物种的同源蛋白反应的能力。
在某些情形中，本申请所述抗原结合蛋白与PD-1的结合活性可使用酶联免疫法测定进行检测。例如，在ELISA中，使用人PD-1抗原蛋白，所述PD-1抗原结合蛋白与PD-1的EC50值可以在约0.0001nM至约100nM之间，例如，可以在约0.001nM至约10nM之间，可以在约0.001nM至约5nM之间，可以在约0.001nM至约1nM之间或可以在约0.01nM至约1nM之间。
在另一个方面，本申请所述的抗原结合蛋白能够阻断PD-1与PD-L1和或PD-L2的结合。在某些情形中，所述的抗原结合蛋白阻断PD-1与PD-L1和或PD-L2的结合酶联免疫法ELISA测定。例如，首先将PD-L1和或PD-L2抗原蛋白包被在板上，将递减量的未标记的所述抗原结合蛋白和生物素标记的PD-1蛋白混合后，共同孵育。然后，使用ELISA分析细胞，以证实所述抗原结合蛋白可以阻断PD-1和PD-L1和或PD-L2的结合。
本申请所述抗原结合蛋白能够刺激免疫细胞中表达CD07a细胞的比例。本申请所述抗原结合蛋白能够刺激免疫细胞中IFN-γ、TNF-α和/或IL2的分泌。例如，本申请所述抗原结合蛋白的刺激能力，可以是在本领域已知激活剂(例如CD3抗体、CD28抗体、或包含CD3抗体和CD28抗体的纳米材料TransActTM)激活的基础上，增加对免疫细胞激活的效果。所述免疫细胞可包括淋巴细胞，例如B细胞、T细胞，天然杀伤细胞，髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。例如，所述免疫细胞可以包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。例如，所述免疫细胞可以包含人工修饰的免疫细胞。例如，所述免疫细胞可以包含TCR-T细胞。可用本领域任何技术人员已知的方法测定免疫细胞中细胞因子的分泌，例如，通过酶联免疫法(ELISA)定量测定免疫细胞(例如T细胞)增殖情况或由免疫细胞产生的细胞因子(例如由T细胞产生的IFN-γ或IL-2)。例如，可以通过混合淋巴细胞反应(MLR)实验检测PD-1抗体对于T淋巴细胞的刺激结果。
核酸分子、载体和细胞
另一方面，本申请提供了一种或多种核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
药物组合物
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含本申请所述的抗原结合蛋白和/或所述的核酸分子，所述的载体，所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且可包括缓冲剂，抗氧化剂，防腐剂，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，碳水化合物，成盐反离子，金属络合物，和/或非离子表面活性剂。本申请中的药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述抗原结合蛋白。所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。
制备方法
另一方面，本申请提供了制备所述的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请的抗原结合蛋白。例如，可以用连接或天然存在的PD-1蛋白或其片段，免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的PD-1都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对PD-1特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人PD-1，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本申请中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。可以通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体实现必需恒定结构域序列的优化，以产生所需生物学活性。同样，任一类轻链都可以在本申请的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本申请的化合物和方法中是可以用的。
本申请的抗原结合蛋白或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该核酸分子引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本申请还涉及包含上述的适当核酸分子以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。例如，动物细胞可以包括(但并不限于)：293T细胞。
本申请中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本申请的核酸分子所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。通常，在适合本申请抗原结合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本申请的抗原结合蛋白。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如流式细胞分选技术(FACS)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
方法和用途
另一方面，本申请提供了一种所述抗原结合蛋白在制备药物中的用途。所述抗原结合蛋白可以单独施用或与一种或多种另外的疗法组合施用，另外的疗法例如化疗放射治疗、免疫治疗、手术干预或这些的任何组合。所述药物可用于治疗PD-1介导的疾病或病症，例如，用于治疗癌症，抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。
另一方面，本申请提供的所述抗原结合蛋白，可用于预防或治疗PD-1介导的疾病或病症。所述预防或治疗疾病或病症可以指抑制或延缓疾病或病症的发展或进展。例如，可以用于抑制肿瘤的发展或进展。例如，可以抑制肿瘤增长或肿瘤细胞增殖。
另一方面，本申请提供了用于预防或治疗PD-1介导的疾病或病症的所述的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了抑制PD-1与PD-L1和或PD-L2结合的方法，包括施用本申请所述的抗原结合蛋白。所述方法可以是离体或体外方法。在某些情形中，所述方法可包括使生物样品与本申请所述的抗原结合蛋白和/或PD-L1和或PD-L2在容许所述抗原结合蛋白和/或PD-1结合PD-L1和或PD-L2的条件下接触，检测在所述抗原结合蛋白与PD-1之间是否形成复合物，和检测PD-1与PD-L1和或PD-L2之间是否形成复合物。
另一方面，本申请提供了预防、缓解或治疗PD-1介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请所述的抗体或其抗原结合片段、所述的分子核酸、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。例如，可以用于抑制肿瘤的发展或进展。例如，可以抑制肿瘤增长或肿瘤细胞增殖。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例
实施例1:重组人程序性死亡受体1(PD-1)25位至167位氨基酸序列与人IgG1 Fc区的融合蛋白(PD-1-huIgG1 Fc)的表达载体构建与真核表达
1.PD-1 25位至167位氨基酸区间的基因序列的合成及PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白的表达载体的构建
通过化学合成的方式合成程序性死亡受体1(PD-1)(NCBI accession No.NP_005009.2)的第25位异亮氨酸至第167位谷氨酰胺区间的基因序列(SEQ ID NO:29)，该基因序列编码SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。通过化学合成的方式合成人IgG1重链恒定区的第100位脯氨酸至第330位赖氨酸氨酸区间的基因序列。化学合成含小鼠Igkv3-10信号肽基因序列的上游引物用于表达载体构建。通过分子克隆，将PD-1基因片段与人IgG1 Fc基因片段进行拼接。拼接产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pCDNA3.1(Thermo)中。
2.重组PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白的表达与纯化
以此表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTAexplorer 100(GE)纯化重组PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白。由于糖基化修饰等原因，重组PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白经还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约60k道尔顿。
实施例2:重组人程序性死亡受体1(PD-1)25位至167位氨基酸序列与多聚组氨酸标签融合蛋白(PD-1-his)的表达载体构建与真核表达
1.PD-1 25位至167位氨基酸区间的基因序列的合成及多聚组氨酸标签融合蛋白的表达载体的构建
通过化学合成的方式合成程序性死亡受体1(PD-1)(NCBI accession No.NP_005009.2)的第25位异亮氨酸至第167位谷氨酰胺区间的基因序列。化学合成含小鼠Igkv3-10信号肽基因序列的上游引物和含多聚组氨酸标签(具有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列)基因序列(SEQ ID NO:31)的下游引物用于构建表达PD-1-his的pCDNA3.1载体。
2.重组PD-1-his蛋白的表达与纯化
以此表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTAexplorer 100(GE)纯化重组PD-1-his蛋白。由于糖基化修饰等原因，重组PD-1-his蛋白经还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约40k道尔顿。
实施例3：抗人PD-1抗体(Nivolumab)表达载体构建与真核表达
1.Nivolumab抗体可变区基因的获取及表达载体构建
通过化学合成的方式合成Nivolumab抗体轻重链可变区基因分别为SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，Nivolumab抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，Nivolumab抗体重链可变区具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。以重链可变区基因为模板，PCR扩增重链可变区片段，扩增产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到含人IL-2信号肽基因和人IgG1重链恒定区基因的pFUSEss-CHIg-hG1(invivogen)中。以轻链可变区基因为模板，PCR扩增轻链可变区片段，扩增产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到含人IL-2信号肽基因和人卡帕轻链恒定区基因的pFUSE2ss-CLIg-hK(invivogen)中。
2.Nivolumab抗体的表达与纯化
以此双质粒1:1比例共转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTAexplorer100(GE)纯化Nivolumab抗体。Nivolumab抗体经非还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约150k道尔顿。
实施例4：ELISA检测重组人PD-1(PD-1-huIgG1 Fc或PD-1-his)与Nivolumab抗体结合
利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测重组人PD-1(PD-1-huIgG1 Fc或PD-1-his)与Nivolumab抗体结合，ELISA实验具体操作如下：微孔板中加入上文制备的PD-1-huIgG1Fc或PD-1-his融合蛋白100ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％ BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。100ul PBS洗板后加入100ng/孔Nivolumab嵌合抗体，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100ul 1:5000稀释的HRP-山羊抗人IgG(Fab特异性的)37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。OD450数值可反映Nivolumab抗体与重组人PD-1的结合情况。
实施例5：四价人细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)胞外段突变体的表达及与人PD-1分子的亲合力测定
1.四价人PD-L1胞外段突变体的表达载体的构建
通过化学合成的方式合成由一段柔性肽连接的两个人PD-L1胞外段突变体的基因序列(SEQ ID NO:37)，该基因序列编码SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。通过化学合成的方式合成人IgG1重链恒定区(UniProtKB/Swiss-Prot accession No.P01857.1)的第100位脯氨酸至第330位赖氨酸氨酸区间的基因序列。化学合成含小鼠Igkv3-10信号肽基因序列的上游引物用于表达载体构建。通过分子克隆，将PD-L1胞外段突变体重复结构的基因片段与人IgG1Fc基因片段进行拼接。拼接产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pCDNA3.1(Thermo)中。
2.四价人PD-L1胞外段突变体的表达与纯化
以此表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTAexplorer 100(GE)纯化四价人PD-L1胞外段突变体蛋白。由于糖基化修饰等原因，四价人PD-L1胞外段突变体蛋白经还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约85k道尔顿。
3.PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白的生物素化
应用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo)提供的标准操作程序对PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白进行随机生物素化。用ELISA方法验证生物素化的PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白与Nivolumab抗体的结合活性。
4.测定四价人PD-L1胞外段突变体与PD-1-huIgG1 Fc的亲合力(avidity)
利用Octet K2(ForteBio)分子互作分析仪对四价人PD-L1胞外段突变体与PD-1-huIgG1Fc的亲合力进行测定。依照Octet K2的标准操作流程，配置100nM的生物素化的PD-1-huIgG1Fc融合蛋白并将其固化在SA探针(ForteBio)上，固化高度为1nM。以从50nM浓度起始两倍梯度稀释的四价人PD-L1胞外段突变体作为分析物进行实验，测得四价人PD-L1胞外段突变体与PD-1-huIgG1 Fc的亲合力为9.4nM，亲合力测定结果显示于图1。已知野生型PD-1和PD-L1结合亲和力8.2uM(见Cheng,X.et al.,J.Biol.Chem.,288(17):11771-85,2013)。
实施例6：抗人PD-1鼠源抗体的制备、鼠抗人源化
1.免疫动物
将2mg/mL的实施例1中制备的PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白作为抗原与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合乳化，取10只6周大雌性Balb/c小鼠(进行皮下免疫，每只100ug抗原。在初次免疫后，每十天时间进行一次加强免疫，共执行四次皮下免疫，第五次免疫时直接用PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白进行脾脏冲击免疫。
2.血清效价检测
每次加强免疫前尾静脉取血50uL，离心去除细胞，保留血清。ELISA微孔板中加入PD-1-his(ACRO Biosystems)50ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。加入梯度稀释的小鼠血清，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100ul 1:5000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG(上海翊胜)37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。
3.构建免疫文库
3.1小鼠脾细胞总cDNA获取
在用PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白直接进行腹腔注射方式进行冲击免疫后四天处死小鼠，取脾脏。用70微米细胞筛网(BD)研磨整个脾脏，获取脾脏细胞。用PBS冲洗两遍后，1000g离心10分钟，获取脾脏细胞。使用Trizol RNA提取试剂盒抽提总RNA。
以所述RNA为模板，使用SuperScriptTM IV First-Strand Synthesis System试剂盒合成第一链cDNA。
3.2抗体基因扩增与轻重链拼接
以所述cDNA为模板，参考文献所述的抗体扩增引物(Schaefer J.V.,HoneggerA.,Plückthun A.(2010)Construction of scFv Fragments from Hybridoma or SpleenCells by PCR Assembly.In:Kontermann R.,Dübel S.(eds)AntibodyEngineering.Springer Protocols Handbooks.Springer,Berlin,Heidelberg)，使用重链可变域上游引物和下游引物PCR扩增重链可变域基因，使用轻链可变域上游引物和下游引物引物PCR扩增卡帕链可变域基因。在50uL反应体系中，分别加入25uL phusion mastermix(Thermo)，上游引物2.5uL(25pmol)，下游引物2.5uL(25pmol)，1.5uL DMSO，0.5uL cDNA和18uL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。
使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的VH基因和VL基因。将等量的VH基因和VL基因混合后为模板，利用上游引物scFv-F和下游引物scFv-R通过重叠PCR扩增scFv基因。在50uL反应体系中，分别加入25uL phusion master mix，上游引物2.5uL(25pmol)，下游引物2.5uL(25pmol)，1.5uL DMSO，0.5uL cDNA和18uL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃最终延伸10分钟。
使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的scFv基因片段。
3.3构建免疫文库
分别使用SfiI DNA内切酶消化scFv基因片段和pcomb3XTT载体(美国Scripps研究所)。在50uL反应体系中，分别加入SfiI 2uL，10x缓冲液5uL，DNA3ug，加ddH2O至50uL。充分混匀后，50℃孵育3小时。
使用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的scFv基因片段和pcomb3XTT载体。使用T4连接酶环化酶切后的scFv基因片段和酶切后的pcomb3XTT载体。在50uL反应体系中，分别加入T4连接酶1uL，10x缓冲液5uL，scFv基因100ng，pComb3XTT载体500ng，加ddH2O至50uL。充分混匀后，4℃孵育16小时。取少量产物通过琼脂糖凝胶电泳验证连接效率。
将10uL上述连接环化产物加入自制的TG1电转化感受态中，然后通过电转仪进行电击转化。取出10ul电转化后的细菌通过合理的稀释并在含有氨苄青霉素的平板上划线，以此计数并统计噬菌体抗体文库的大小。剩余的电转化后的细菌加入含100ug/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT培养基，置于加热培养箱培养。培养结束后在4℃以4000G离心10分钟，在沉淀菌中补充适量甘油储存于-80℃作为抗体菌种库。通过多次电转化积累获得超过3E9库容的scFv免疫文库。
4.鼠源免疫抗体噬菌体文库的筛选与鉴定
4.1PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白的生物素化
应用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin提供的标准操作程序对PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白进行随机生物素化。用ELISA方法验证生物素化的PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白与Nivolumab抗体的结合活性。
4.2生物淘选
以PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白为目标蛋白应用生物淘选，对上述鼠源免疫抗体文库进行生物淘选获得与PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白(尤其是PD-1胞外域)结合的抗体。从抗体菌种库中取100OD细菌以起始OD600＝0.1密度复苏并生长至对数期后应用M13KO7辅助噬菌体挽救抗体文库，离心后用含有氨苄青霉素和卡那霉素的2xYT培养基重悬并在30℃过夜扩增。PEG/NaCl沉淀噬菌体，用甘油/PBST溶解噬菌体沉淀获得免疫库噬菌体悬液。酪蛋白封闭的噬菌体投入酪蛋白封闭的生物素化的huIgG1 Fc(ACRO Biosystems)融合蛋白和酪蛋白封闭的Dynabeads M-270链霉亲合素共孵育体系中，收集上清噬菌体悬液。进一步，将收集到的噬菌体悬液投入酪蛋白封闭的生物素化的PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白和酪蛋白封闭的Dynabeads M-270链霉亲合素共孵育体系中，用PBST清洗磁珠去除无法与PD-1-huIgG1Fc融合蛋白结合的噬菌体。在适当的洗脱条件下，应用自制四价PD-L1胞外段突变体对噬菌体进行竞争性洗脱。留取10ul洗脱的噬菌体溶液用于测定输出噬菌体总量，剩余噬菌体溶液用于感染对数增长的TG1，过夜扩增后视为下一轮淘选使用的抗体文库。生物淘选共执行三轮，淘选实验参数详见表2。
表2抗体文库生物淘选实验参数
Figure BDA0004152237690000331
4.3初筛PD-1胞外域特异性结合且具有PD-1-四价PD-L1阻断作用的克隆
将第三轮生物淘选结束后获得的抗体文库进行稀释涂布于含有氨苄青霉素的平板上获得单克隆，挑选单克隆在深孔板中过夜培养。次日将深孔板进行反复三次冻融，离心上清用于后续两类ELISA反应。
检测结合活性的ELISA反应：利用50ng PD-1-his过夜包被，PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。PBS清洗三遍后加入100ul离心上清37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100ul 1:5000稀释的HRP偶联的山羊抗鼠IgG(Fab特异性的)(Thermo)。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。该筛选步骤重复两次独立实验以保证数据准确，选取OD450数均值大于0.15的克隆进入后续分析。
检测阻断活性的ELISA反应：利用PD-1-his过夜包被，PBS清洗三遍，加入1％ BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。PBS清洗三遍后加入100ul离心上清和20ng四价PD-L1混合液37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100ul 1:5000稀释的HRP偶联的山羊抗鼠IgG(Fab特异性的)(Thermo)。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。该筛选步骤重复两次独立实验以保证数据准确，选取OD450数均值小于1的克隆进入后续分析。
进一步，将同时符合以上两个条件的候选克隆进行测序，获取抗体轻链可变域和重链可变域序列。
4.4复筛PD-1胞外域特异性结合且具PD-1-四价PD-L1阻断作用的克隆
将初筛获得的候选克隆用50ml摇菌管(thermo)扩大培养，利用溶菌酶(上海生工)结合三次冻融的方法获取周质腔提取物，并再次用两种ELISA鉴定克隆的结合和阻断活性。利用50ng PD-1-his过夜包被，PBS清洗三遍，加入1％ BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。PBS清洗三遍后加入100ul离心上清37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100ul 1:5000稀释的HRP偶联的山羊抗鼠IgG(Fab特异性的)(Thermo)。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值，以此验证结合活性。利用PD-1-his过夜包被，PBS清洗三遍，加入1％ BSA/PBS，200uL/孔，37℃封闭1小时。PBS清洗三遍后加入100ul离心上清和不同质量的四价PD-L1混合液37℃孵育1小时，PBST清洗三遍后加入100ul 1:5000稀释的HRP偶联的山羊抗鼠IgG(Fab特异性的)(Thermo)。PBST清洗三遍，加入100uL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100uL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值，以此验证阻断活性。选择ELISA读值低的克隆(即阻断作用强)进行测序获得抗体的序列，从中挑选阻断作用最强的6H6进入后续分析，6H6的抗体重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别为序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
4.5表达6H6克隆hIgG1形式抗体
分别将6H6的重链可变区序列克隆至pFUSEss-CHIg-hG1中。分别将6H6轻链可变区序列克隆至pFUSE2ss-CLIg-hK中。分别以此双质粒1:1比例共转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTAexplorer 100(GE)纯化6H6抗体。6H6抗体经非还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约150k道尔顿。
4.6检测各hIgG1抗体(6H6及Nivolumab)分子水平阻断效果
将6H6、Nivolumab与hIgG1同型对照(美国R&D Systems)一同进行竞争ELISA实验。简要步骤为：用每孔100ng的PD-1-huIgG1 Fc融合蛋白过夜包被，依次加入50ul 2ng/ul的不同的hIgG1抗体(6H6、Nivolumab和同型对照抗体)和50ul不同浓度的PD-L1-his(ACROBiosystems)混合液，100ul 1:5000小鼠抗his标签-HRP(Thermo)显色以检测各抗体分子水平阻断效果。该检测步骤均含有三个复孔，ELISA结果的平均值详见表3。6H6分子水平阻断效果优于Nivolumab。
表3 6H6、Nivolumab与hIgG1同型对照抗体分子水平阻断效果
Figure BDA0004152237690000351
5.抗人PD-1鼠源抗体6H6的人源化
鉴于6H6分子较优的分子水平阻断活性，针对6H6进行了人源化。首先开展基于互补决定区移植的抗体人源化，分别选择IGKV6-21*02和IGKJ4*01，IGHV3-23*04和IGHJ4*01人源胚系基因分别替换6H6对应的鼠源轻链和重链的胚系基因。其次预测出对抗体亲和力有贡献的关键氨基酸并完成回复突变：第一类氨基酸残基位于VL和VH结合界面上的残基，对于两个结构域的Packing起到关键作用，第二类氨基酸残基靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的残基，第三类氨基酸残基是与CDR区有直接相互作用的残基，包括疏水相互作用/氢键/盐桥等。基于上述规则构建三个候选分子，并通过体外亲和力测定优选出Hu_6H6分子作为人源化的6H6抗体版本，Hu_6H6的抗体重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别为序列SEQID NO.9和SEQ ID NO.10。
实施例7：抗PD-1鼠抗的初步体外评价
1.huIgG1型PD-1抗体体外中和试验
利用ELISA进行PD-1抗体体外中和试验，验证6H6和pembrolizumab的huIgG1型抗体阻断PD-L1与PD-1结合的能力：四度过夜包被PD-L1-huIgG1 Fc(ACRO Biosystems)1ug/ml100ul每孔，洗板拍干后利用1％ BSA in PBS 200ul/well 37℃孵育1小时进行封闭。0.1％ PBST洗板3次拍干后用加入scFv-huIgG1 Fc型抗体和Biotinylated PD-1-huIgG1Fc(Kactus Biosystems)混合物室温孵育1小时(2ug/ml 50ul的PD-1-huIgG1 Fc与从160ug/ml起始两倍梯度稀释的50ul抗体混合，共八个梯度)。0.1％ PBST洗板3次，加入Streptavidin-HRP(R&D Systems)100ul每孔(1:200稀释)室温孵育1小时。0.1％PBST洗板6次后加入TMB显色液100ul每孔室温孵育10分钟，加入终止液100ul每孔后利用酶标仪进行OD450读数。对数据进行分析处理，计算得6H6h和pembrolizumab的huIgG1抗体对PD-1和PD-L1结合的半数抑制浓度IC50分别为3.605ug/ml和6.662ug/ml，如图2所示。
2.huIgG1型PD-1抗体体外结合试验
利用ELISA进行PD-1抗体亲和力测定，验证6H6和pembrolizumab的huIgG1抗体的亲和力：四度过夜包被PD-1Protein,Human,Recombinant(His Tag)(北京义翘神州)0.5ug/ml100ul每孔，洗板拍干后利用1％BSA in PBS 200ul/well 37℃孵育1小时进行封闭。0.1％PBST洗板3次拍干后用加入scFv-huIgG1 Fc型抗体室温孵育1小时(从10ug/ml起始两倍梯度稀释，共八个梯度)。0.1％PBST洗板3次，加入Goat anti-Mouse IgG F(ab')2Secondary Antibody,HRP(Thermo)/Goat Anti-Human IgG Secondary Antibody(HRP)(北京义翘神州)100ul每孔(1:10000稀释)室温孵育1小时。0.1％PBST洗板6次后加入TMB显色液100ul每孔室温孵育10分钟，加入终止液100ul每孔后利用酶标仪进行OD450读数。对数据进行分析处理，计算得6H6和pembrolizumab的huIgG1抗体与PD-1结合的EC50分别为0.01723ug/ml和0.01106ug/ml，如图3所示。
实施例8：PD-1抗体刺激肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)
通过在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞培养基中加入PD-1抗体验证本申请抗体对TIL细胞的刺激作用。复苏两个批次TIL细胞(供者A和供者B)，在含有IL-2的培养基中培养48小时。培养结束后清洗去除IL-2，以1E5/孔细胞加入到96孔板中，试验组(Transact+PD-1)根据说明书按照按1:1000的比例加入T Cell TransActTM(Miltenyi Biotec)和1μg/ml的6H6 PD-1抗体刺激，对照组只加T Cell TransActTM，孵育过夜后检测表达CD107a细胞比例及细胞因子分泌的结果。
图4中A显示的是在源于供者A的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞培养基中加入PD-1抗体的CD107a细胞比例结果图。图4中B显示的是在源于供者B的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞培养基中加入PD-1抗体的CD107a细胞比例结果。结果显示，本申请的PD-1抗体可以提高表达CD107a的细胞比例。
图5显示的是在源于供者A和供者B的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞培养基中加入PD-1抗体的细胞因子IL-2、TNF-α和/或IFN-γ分泌结果图。结果显示，本申请的PD-1抗体可以提高IL-2、TNF-α和/或IFN-γ的分泌；本申请的PD-1抗体具有激活免疫细胞的能力。
实施例9：混合淋巴细胞反应(MLR)实验检测PD-1抗体刺激T淋巴细胞
利用混合淋巴细胞反应(MLR)实验检测PD-1抗体能够刺激T淋巴细胞分泌IL-2及IFN-γ。将人PBMC调整细胞密度为2E7个/ml，采用CD14 MicroBeads,human(MiltenyiBiotec)分选单核细胞。添加50ng/ml GM-CSF(ACRO Biosystems)和50ng/ml IL-4(ACROBiosystems)培养5天。补加10ng/ml的LPS(Sigma)和20ng/ml的TNF-α(ACRO Biosystems)诱导DC细胞成熟。使用Naive CD4+T Cell Isolation Kit II,human(Miltenyi Biotec)从不同人来源的PBMC中分离CD4+T细胞。96孔板中，每孔250μ1培养液含有1.0E5个分离的T细胞，2E4个诱导成熟的DC细胞以及一系列浓度梯度的pembrolizumab或本申请的PD-1抗体6H6。使用Human IgG1同型对照(Isotype control)作为阴性对照。混合淋巴细胞在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养3天，然后从96孔板中每孔取出100ul培养上清进行IL-2及IFN-γ测定。
图6显示的是混合淋巴细胞反应(MLR)实验检测PD-1抗体对于T淋巴细胞分泌IL-2(A)及IFN-γ(B)的刺激结果图。结果显示，本申请的PD-1抗体具有激活免疫细胞的能力。
实施例10：PD-1抗体增强免疫细胞的杀伤能力
通过在NYESO-1TCR-T细胞对A375细胞的杀伤中加入PD-1抗体验证PD-1抗体是否增强TCR-T杀伤能力。从新鲜分离的人PBMC细胞中经CD3 MicroBeads,human(MiltenyiBiotec130-050-101)分选出CD3阳性T细胞。可以通过任意的转导方法获得TCR-T细胞，例如将携带NY-ESO-1TCR(Kite Pharma)慢病毒用于转导分选出的CD3阳性T细胞，流式检测转导效率可以为40％。A375细胞每孔2E4细胞铺板到96孔板中，加入2E4/孔转导后的NYESO-1TCR细胞，同时加入10μg/ml的6H6抗体及对照抗体pembrolizumab作为试验组，A375细胞中加入等量PBMC细胞作为阴性对照，只有A375细胞作为空白对照，所有组每孔同时加入荧光染料SuperViewTM 488 Caspase-3。将96孔板转入到IncuCyte S3每3小时自动拍照33小时后统计分析杀伤结果。
图7显示的是加入PD-1抗体对TCR-T细胞的杀伤能力增强结果图。结果显示本申请的PD-1抗体可以增强免疫细胞的杀伤能力。
实施例11：抗人PD-1鼠源抗体的人源化
(1)抗体的人源化设计
针对6H6进行了人源化。首先开展基于互补决定区移植的抗体人源化，将6H6鼠抗基因与人源胚系基因进行比对，本申请得到对抗体亲和力有贡献的关键氨基酸并完成回复突变：第一类氨基酸残基位于VL和VH结合界面上的残基，对于两个结构域的Packing起到关键作用，第二类氨基酸残基靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的残基，第三类氨基酸残基是与CDR区有直接相互作用的残基，包括疏水相互作用/氢键/盐桥等。基于上述规则构建候选分子，合成序列并构建表达载体，转染至293F细胞中悬浮表达纯化抗体，并通过体外亲和力测定选出6H6-5、6H6-25、6H6-29抗体分子作为人源化的6H6抗体版本。其中抗体的重链恒定区可以是SEQ ID NO：60所示的序列；其中抗体的轻链恒定区可以是SEQ ID NO：61所示的序列。
Figure BDA0004152237690000381
(2)结合亲和力试验
huIgG1型PD-1抗体的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR)用装备有预先固定的蛋白A传感器芯片的Biacore T200生物传感器测量。将人源化后的抗体(1ug/ml)按照10ul/min注射到Biacore T200生物传感中约24-33秒，已到达期望蛋白质密度(约44-57响应单位。然后将人PD1蛋白(PD-1Protein,Human,Recombinant His Tag)以50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml、3.125ug/ml、1.5625ug/ml的浓度30ul/min注射300秒，检测解离250秒。图8、9、10和11分别显示的是6H6、6H6-5、6H6-25、6H6-29抗体的抗原结合亲和力结果。
抗体 6H6 6H6-5 6H6-25 6H6-29
亲和力(KD) 4.50E-08 1.09E-08 8.07E-09 1.78E-08
(3)抗体体外中和试验
利用ELISA进行人源化6H6抗体体外中和试验，验证人源化后的6H6 huIgG1型抗体阻断PD-L1与PD-1结合的能力：四摄氏度过夜包被PD-L1-huIgG1 Fc(Kactus Biosystems)1ug/ml 100ul每孔，洗板拍干后利用1％BSA in PBS 200ul/well 37℃孵育1小时进行封闭。0.1％PBST洗板3次拍干后用加入scFv-huIgG1 Fc型抗体和Biotinylated PD-1-huIgG1Fc(Kactus Biosystems)混合物室温孵育1小时(2ug/ml 50ul的PD-1-huIgG1 Fc与从160ug/ml起始两倍梯度稀释的50ul抗体混合，共15个梯度)。0.1％PBST洗板3次，加入Streptavidin-HRP(R&D Systems)100ul每孔(1:200稀释)室温孵育1小时。0.1％PBST洗板6次后加入TMB显色液100ul每孔室温孵育10分钟，加入终止液100ul每孔后利用酶标仪进行OD450读数。对数据进行分析处理，计算得6H6和人源化6H6-5、6H6-25、6H6-29 huIgG1抗体对PD-1和PD-L1结合的半数抑制浓度IC50如图12所示。
抗体 6H6 6H6-5 6H6-25 6H6-29
IC50(ug/ml) 2.6477 2.9335 0.8004 1.9073
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (10)

1.一种结合PD-1的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述LCDR2的序列如SEQ ID NO:5(YAS)所示；所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；并且，所述抗原结合蛋白的重链可变区包含抗体重链可变区VH中的FR1至4，所述VH包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；以及所述抗原结合蛋白的轻链可变区包含抗体轻链可变区VL中的FR1至4，所述VL包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区。
3.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:54至56中任一项所示的重链可变区。
4.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:68所示的轻链可变区。
5.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:57至59中任一项所示的轻链可变区。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
7.一种多肽，所述多肽包含权利要求1-6中任一项的抗原结合蛋白。
8.一种核酸，所述核酸编码权利要求1-6中任一项所述的抗原结合蛋白和/或权利要求7所述的多肽。
9.一种细胞，所述细胞表达权利要求1-6中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求7所述的多肽、和/或包含权利要求8所述的核酸。
10.一种用于非治疗和/或诊断目的的影响靶细胞产生细胞因子的方法，所述方法包含施用权利要求1-6中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求7所述的多肽、权利要求8所述的核酸、包含所述核酸的载体、和/或表达所述抗原结合蛋白、所述多肽或包含所述核酸和/或所述载体的细胞。
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