KR102144834B1 - Primer Set for recombinase polymerase amplification reaction and detecting Cucurbitaceae and Method for diagnosing Cucurbitaceae virus disease using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물, 키트 및 진단방법을 이용하는 경우, 기존의 까다롭고 시간이 오래 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, RT-PCR 방법 등에 비하여 보다 간편하고 신속하게 박과 작물 바이러스의 검출 및 박과 작물 바이러스병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a composition for detecting a gourd fruit virus, a diagnostic kit including the same, and a method for diagnosing a gourd crop virus disease using the same.
In the case of using the composition, kit, and diagnostic method of the present invention, since RNA can be amplified immediately without the existing difficult and time-consuming RNA extraction process, it is more convenient and faster than the RT-PCR method. It can be usefully used for detection and diagnosis of gourd crop virus disease.
Description
본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting a gourd crop virus, a diagnostic kit including the same, and a method for diagnosing a gourd crop virus disease using the same, specifically, a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A composition for detecting a gourd crop virus comprising a first primer set consisting of a reverse primer consisting of, a second primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or a mixture thereof , It relates to a diagnostic kit comprising the same, and a method for diagnosing gourd crop virus disease using the same.
전 세계적인 지구 온난화로 인하여 새로운 바이러스의 출현과 피해가 급증하고 있으며, 특히 식물 바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물의 생산량 및 품질 저하와 품종 퇴화 등 농업 생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다.The emergence and damage of new viruses is increasing rapidly due to global warming. In particular, plant viruses cause diseases in many plants and cause serious economic damage throughout agricultural production, such as decrease in production and quality of various crops, and deterioration of varieties. .
식물 바이러스 병은 곰팡이나 세균에 의한 다른 식물 병들과는 다르게 화학적 방제가 불가능하고, 소수의 친환경 방제 법이 있지만 효과는 크지 않은 문제가 있다. 그렇기 때문에 식물 바이러스 병은 방제보다는 신속한 진단으로 작물의 피해를 줄이고 병의 확산을 막는 것이 중요하다.Unlike other plant diseases caused by fungi or bacteria, plant virus disease cannot be chemically controlled, and there are few environmentally friendly control methods, but the effect is not great. Therefore, it is important to reduce damage to crops and prevent the spread of the disease through rapid diagnosis rather than control of plant virus diseases.
한편, 호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV) 및 수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV)는 오이와 같은 박과(Cucurbitaceae) 작물에서 광범위하게 발생하며, 수량과 물질에 미치는 피해가 크다.On the other hand, Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) and Watermelon mosaic virus (WMV) occur widely in Cucurbitaceae crops such as cucumbers, and the damage to yield and material is large.
호박 황화 모자이크 바이러스의 경우 초기에 잎이 얼룩얼룩해지며 후기에는 잎이 뒤틀리고 위축되는 병징과 과실에서는 울퉁불퉁해지고 세로줄 무늬가 생기는 병징이 나타나며, 수박 모자이크 바이러스에 감염된 오이는 잎의 모자이크, 엽맥 녹대 증상 및 과실의 표면에 울퉁불퉁한 기형모양이 형성됨으로써 작물의 품질과 상품성이 저하되는 특징이 있다.In the case of amber yellow mosaic virus, the leaves are stained in the early stage, and the leaves are distorted and contracted in the later stages, and the symptoms are jagged and vertical stripes are formed in the fruit, and the cucumbers infected with the watermelon mosaic virus are leaf mosaic, leaf vein rust symptoms, and There is a characteristic that the quality and marketability of crops are degraded by the formation of uneven deformities on the surface of fruits.
기존에는 이러한 바이러스들을 검출 및 진단하기 위해 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR) 기법을 이용하였다. 그러나 PCR은 특별한 장비가 필요하고, 평균 90 분이라는 오랜 시간이 걸리기 때문에 신속한 검출 및 진단이 어렵다는 문제가 있다.Previously, a polymerase chain reaction (PCR) technique was used to detect and diagnose these viruses. However, since PCR requires special equipment and takes a long time of 90 minutes on average, it is difficult to detect and diagnose quickly.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 및/또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법의 경우, RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made intensive research efforts to develop a method for detecting and diagnosing Cucurbitaceae crop virus more conveniently and quickly. As a result, a first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and/or a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 In the case of the RT-RPA method using a second primer set consisting of a reverse primer consisting of, it was found that RNA can be amplified immediately without an RNA extraction process, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is a first primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A second primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Or it is to provide a composition for detecting a virus of the cucurbitaceae crop comprising a mixture thereof.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 박과 작물 바이러스병 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a first primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A second primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Or it is to provide a kit for diagnosing viral diseases of the cucurbitaceae crops comprising a composition for detecting a virus of the cucurbitaceae crops comprising a mixture thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병의 진단방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing a virus disease of Cucurbitaceae crops.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 및/또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법의 경우, RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능함을 규명하였다.The present inventors have made intensive research efforts to develop a method for detecting and diagnosing Cucurbitaceae crop virus more simply and quickly. As a result, a first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and/or a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 In the case of the RT-RPA method using a second primer set consisting of reverse primers, it was found that RNA can be amplified immediately without the RNA extraction process.
본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting a gourd fruit virus, a diagnostic kit including the same, and a method for diagnosing a gourd crop virus disease using the same, a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A first primer set consisting of, a second primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, or a composition for detection of a gourd crop virus comprising the same It relates to a diagnostic kit and a method for diagnosing viral diseases of gourd crops using the same.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.One aspect of the present invention is a first primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A second primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Or it relates to a composition for detecting a virus of Cucurbitaceae crops containing a mixture thereof.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.In the present invention, the term "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3'hydroxyl group and can form a base pair with a complementary template of a plant nucleic acid, and template strand copying is performed. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as a starting point for.
상기 박과 작물은 오이, 수박, 호박, 참외 또는 멜론일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The gourd crop may be cucumber, watermelon, pumpkin, melon, or melon, but is not limited thereto.
상기 제1 프라이머 세트는 호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV) 검출용 프라이머 세트일 수 있다.The first primer set may be a primer set for detecting Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV).
본 발명에서 용어 "호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV)"는 박과 작물 바이러스병(누른모자이크병)의 원인균 중 하나로, ZYMV에 감염되면 잎맥 주위에 주름이 생기고, 잎맥과 잎맥 사이에 담녹색의 모자이크 병반이 나타나며, 그 외 부분은 황색으로 변한다. 과실에서는 기형과 모자이크 병반이 동반하여 나타난다.In the present invention, the term "Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)" is one of the causative bacteria of gourd crop virus disease (pressed mosaic disease), and when infected with ZYMV, wrinkles are formed around leaf veins, and between leaf veins and leaf veins Pale green mosaic lesions appear, and other parts turn yellow. In fruit, deformities and mosaic lesions appear together.
상기 ZYMV는 본 발명의 제1 프라이머 세트에 의해 증폭되어 199 bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물을 통해 검출될 수 있다.The ZYMV is amplified by the first primer set of the present invention to represent an amplification product of 199 bp, and can be detected through the amplification product.
상기 제2 프라이머 세트는 수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV) 검출용 프라이머 세트일 수 있다.The second primer set may be a primer set for detecting Watermelon mosaic virus (WMV).
본 발명에서 용어 "수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV)"는 박과 작물 바이러스병(모자이크병)의 원인균 중 하나로, WMV에 감염되면 잎에 처음에는 황색반점이 나타나기 시작하여 다음에 새로 나오는 잎은 전면에 많은 황색반점이 나타난다. 병징이 진전되면 엽맥 주위에 주름이 생기고, 잎이 요철상태로 되어 돌출된 부분은 녹색으로 남아있고, 그 외 부분은 황색으로 변한다.In the present invention, the term "Watermelon mosaic virus (WMV)" is one of the causative bacteria of gourd fruit virus disease (mosaic disease). When infected with WMV, yellow spots first begin to appear on the leaves, and then new leaves appear next. Many yellow spots appear on the entire surface of silver. When the symptom progresses, wrinkles are formed around the leaf veins, and the leaves become uneven, so that the protruding part remains green, and the other parts turn yellow.
상기 WMV는 본 발명의 제2 프라이머 세트에 의해 증폭되어 140 bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물을 통해 검출될 수 있다.The WMV is amplified by the second primer set of the present invention to represent a 140 bp amplification product, and can be detected through the amplification product.
상기 증폭은 예를 들어, 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amplification may be performed, for example, by Recombinase polymerase amplification (RPA) or polymerase chain reaction (PCR), but is not limited thereto.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amplification product may be, for example, an amplicon, but is not limited thereto.
본 명세서에서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인 할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단 할 수 있는 장점이 있다.In the present specification, the term "recombinant-polymerase amplification method" refers to a technology that can confirm DNA and RNA amplification, and unlike conventional PCR, it uses a DNA-binding protein and a recombinase to quickly and accurately target sequences (target sequence) can be amplified. Since the RPA method can be amplified even under isothermal conditions using mesophilic polymerase, it has the advantage of being able to detect and diagnose viruses in a short time with only an isothermal device without special equipment.
본 발명의 다른 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 박과 작물 바이러스병 진단용 키트에 관한 것이다.Another aspect of the present invention is a first primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A second primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; Or it relates to a kit for diagnosing a virus disease of a cucurbitaceae crop comprising a composition for detecting a virus of a cucurbitaceae crop comprising a mixture thereof.
본 발명에서 용어 "박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병"은 바이러스의 감염에 의해서 박과 작물에서 발생하는 질병을 의미하며, 구체적으로는 누른모자이크병(Yellow mosaic) 및 모자이크병(Mosaic)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term " Cucurbitaceae crop virus disease" refers to a disease occurring in the cucurbita crop by virus infection, and specifically, the group consisting of Yellow mosaic and Mosaic disease It may be one or more selected from, but is not limited thereto.
상기 제1 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물은 누른모자이크병 진단 용도인 것일 수 있다.The composition for detecting a gourd crop virus comprising the first primer set may be used for diagnosing pressed mosaic disease.
상기 제2 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물은 모자이크병 진단 용도인 것일 수 있다.The composition for detecting a gourd crop virus including the second primer set may be used for diagnosing mosaic disease.
상기 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물은 누른모자이크병 또는 모자이크병 진단 용도인 것일 수 있다.The composition for detecting a gourd crop virus comprising the mixture may be used for diagnosing pressed mosaic disease or mosaic disease.
상기 키트는 시료로부터 박과 작물 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있다.The kit can be used to detect gourd crop virus from a sample.
상기 키트에는 상기 제1 프라이머 세트 및/또는 제2 프라이머 세트뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 및/또는 장치가 포함될 수 있다.The kit may include the first primer set and/or the second primer set as well as one or more other component compositions, solutions, and/or devices suitable for the assay method.
상기 시료는 예를 들어, 박과 작물의 종자(씨), 과실 또는 잎이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The sample may be, for example, seeds (seeds), fruits or leaves of gourd crops, but is not limited thereto.
구체적으로, 상기 키트는 RPA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.Specifically, the kit may be a kit containing the essential elements necessary to perform the RPA analysis, and in addition to each of the primer sets, a test tube or other suitable container, a reaction buffer (various pH and magnesium concentration), deoxynucleotide (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like.
상기 키트가 RPA 분석에 사용되는 경우, 별도로 cDNA를 수득할 필요 없이 시료로부터 바로 RPA 증폭산물을 수득하여 아가로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머 세트에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 배 바이러스병을 진단할 수 있다.When the kit is used for RPA analysis, the RPA amplification product can be obtained directly from the sample without the need to separately obtain cDNA, and can be separated by a method such as agarose gel electrophoresis, and the primer set used By confirming the presence of DNA having a length corresponding to the DNA polymerized by, embryo virus disease can be diagnosed.
특히 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트의 경우, 각각의 프라이머 세트를 사용하는 진단이 별도로 수행될 수도 있고, 다수의 프라이머 세트를 하나의 반응에 혼합 사용하여 진단이 수행될 수도 있다.In particular, in the case of a diagnostic kit including two or more primer sets, diagnosis using each primer set may be performed separately, or diagnosis may be performed using a mixture of a plurality of primer sets in one reaction.
상기 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 용기(예를 들어, 일회용 RPA 튜브 등)에 담겨 있는 동결 건조된(lyophilized) 프라이머 세트를 포함할 수 있다. The kit is not limited to a specific form, and may be implemented in various forms. For example, the kit may include a lyophilized primer set contained in a container (eg, disposable RPA tube, etc.).
상기 키트가 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 경우 다수의 프라이머 세트가 혼합되어 RPA 튜브에 담겨 있을 수도 있고, 각각의 프라이머 세트가 개별적으로 각각의 RPA 튜브에 담겨 있을 수도 있다.When the kit includes two or more primer sets, a plurality of primer sets may be mixed and contained in an RPA tube, or each primer set may be individually contained in each RPA tube.
즉, 2 개의 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트의 경우, 제1 프라이머 세트 또는 제2 프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머 세트가 동결 건조 분말 형태로 담겨 있는 일회용 RPA 튜브가 진단용 키트에 포함될 수 있고, 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트가 동결 건조 분말 형태로 혼합되어 담겨 있는 일회용 RPA 튜브가 진단용 키트에 포함될 수도 있다.That is, in the case of a diagnostic kit including two primer sets, a disposable RPA tube in which one of the first primer set or the second primer set is contained in a freeze-dried powder form may be included in the diagnostic kit, and the first A disposable RPA tube in which the primer set and the second primer set are mixed in a freeze-dried powder form may be included in the diagnostic kit.
본 발명의 다른 일 양태는 하기의 단계를 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병의 진단방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for diagnosing a virus disease of Cucurbitaceae crops comprising the following steps.
상기 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 이용하여 시료로부터 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및An amplification step of obtaining a recombinant-polymerase amplification (RPA) amplification product from a sample using the composition for detecting Cucurbitaceae crop virus; And
RPA 증폭산물을 분석하는 분석 단계.Analysis step to analyze the RPA amplification product.
본 명세서에서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인 할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단 할 수 있는 장점이 있다.In the present specification, the term "recombinant-polymerase amplification method" refers to a technology that can confirm DNA and RNA amplification, and unlike conventional PCR, it uses a DNA-binding protein and a recombinase to quickly and accurately target sequences (target sequence) can be amplified. Since the RPA method can be amplified even under isothermal conditions using mesophilic polymerase, it has the advantage of being able to detect and diagnose viruses in a short time with only an isothermal device without special equipment.
상기 분석 단계에서 199 bp의 증폭산물을 수득한 경우 시료에 ZYMV가 감염되었다고 판정할 수 있고, 140 bp의 증폭산물을 수득한 경우 시료에 WMV가 감염되었다고 판정할 수 있다.In the above analysis step, when a 199 bp amplification product is obtained, it can be determined that the sample is infected with ZYMV, and when a 140 bp amplification product is obtained, it can be determined that the sample is infected with WMV.
상기 시료는 예를 들어, 박과 작물의 종자(씨), 과실 또는 잎이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The sample may be, for example, seeds (seeds), fruits or leaves of gourd crops, but is not limited thereto.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amplification product may be, for example, an amplicon, but is not limited thereto.
상기 제1 프라이머 세트 또는 제2 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함한 박과 작물 바이러스 진단용 키트의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.The overlapping content of the composition for detecting a gourd fruit virus including the first primer set or the second primer set and a kit for diagnosing gourd crop virus including the same will be omitted in consideration of the complexity of the present specification.
한편, 감염된 박과 작물의 조직에는 페놀 화합물, 탄수화물, 안료 및 기타 알려지지 않은 화합물이 풍부하기 때문에, 이로부터 RNA를 분리하는 것은 매우 까다롭다.On the other hand, because the tissues of infected watermelon crops are rich in phenolic compounds, carbohydrates, pigments and other unknown compounds, it is very difficult to isolate RNA from them.
하지만, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법은 기존의 까다롭고 오랜 시간이 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, 식물 잎에서 즙(액)을 내어 바로 반응을 진행함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.However, the RT-RPA method using the primer set of the present invention enables the amplification of RNA directly without the existing difficult and time-consuming RNA extraction process, so by extracting juice (liquid) from plant leaves and proceeding with the reaction , It can be usefully used for more convenient and quick virus detection.
본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting a gourd crop virus, a diagnostic kit including the same, and a method for diagnosing a gourd crop virus disease using the same, specifically, a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A composition for detecting a gourd crop virus comprising a first primer set consisting of a reverse primer consisting of, a second primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or a mixture thereof , It relates to a diagnostic kit comprising the same, and a method for diagnosing gourd crop virus disease using the same.
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법은 기존의 까다롭고 오랜 시간이 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, 식물 잎에서 즙(액)을 내어 바로 반응을 진행함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.The RT-RPA method using the primer set of the present invention enables the amplification of RNA directly without the existing difficult and time-consuming RNA extraction process, so by taking the juice (liquid) from the plant leaf and proceeding directly to the reaction, It can be usefully used for simple and rapid virus detection.
도 1a는 호박 황화 모자이크 바이러스(ZYMV)의 외피 단백질(CP)의 다중서열배치(multiple sequence alignment)를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 및 수박 모자이크 바이러스(WMV)의 외피 단백질의 다중서열배치를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV2F/R 및 WMV2F/R 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다(M: DNA 마커, Negative control: 건전한 오이 잎에서 추출한 RNA template).
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다(M: DNA 마커, Negative control: 건전한 오이 잎에서 추출한 RNA template).
도 3b는 호박 황화 모자이크 바이러스(ZYMV) 및 수박 모자이크 바이러스(WMV)에 감염된 오이 잎의 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용하여, 시간 경과(1, 3, 5, 10, 15, 20 및 30 분)에 따라 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA 반응 및 RT-PCR 반응 결과를 비교한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용하여, 오이 잎 즙(액)에서 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.1A is a graph showing multiple sequence alignment of envelope proteins (CP) of amber yellowed mosaic virus (ZYMV).
1B is a graph showing multiple sequences of envelope proteins of and watermelon mosaic virus (WMV).
2 is a diagram confirming the result of RT-RPA reaction using a ZYMV1F/R and WMV1F/R primer set, and a ZYMV2F/R and WMV2F/R primer set according to an embodiment of the present invention (M: DNA marker, Negative control : RNA template extracted from healthy cucumber leaves).
3A is a diagram confirming the result of RT-RPA reaction using a ZYMV1F/R primer set, a WMV1F/R primer set, and a ZYMV1F/R and WMV1F/R primer set according to an embodiment of the present invention (M: DNA marker, Negative control: RNA template extracted from healthy cucumber leaves).
3B is a photograph of cucumber leaves infected with pumpkin yellowing mosaic virus (ZYMV) and watermelon mosaic virus (WMV).
Figure 4 is a time course (1, 3, 5, 10, 15, using the ZYMV1F / R primer set, WMV1F / R primer set, and ZYMV1F / R and WMV1F / R primer set according to an embodiment of the present invention. 20 and 30 minutes) is a diagram confirming the RT-RPA reaction results.
Figure 5 is a diagram comparing the RT-RPA reaction and RT-PCR reaction results using a ZYMV1F/R primer set, a WMV1F/R primer set, and a ZYMV1F/R and WMV1F/R primer set according to an embodiment of the present invention. .
6 is a result of RT-RPA reaction in cucumber leaf juice (liquid) using a ZYMV1F/R primer set, a WMV1F/R primer set, and a ZYMV1F/R and WMV1F/R primer set according to an embodiment of the present invention. It is a confirmed degree.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
제조예. 프라이머 세트의 제조Manufacturing example. Preparation of primer set
우리나라 전남 나주 지역에서, 전형적인 박과 작물 바이러스병 증상을 보이는 오이를 선별하여 잎 샘플을 채취하였다.In Naju, Jeollanam-do, Korea, cucumbers showing typical gourd and crop virus disease symptoms were selected and leaf samples were collected.
IQeasy+ 식물 RNA 추출 미니 키트(iNtRON, Korea)를 사용하여 잎 조직에서 Total RNA를 추출하였다. 단일 호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV) 또는 수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV) 감염에 대해 양성인 샘플을 선택하여 RT-RPA 분석 템플릿으로 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관하였다.Total RNA was extracted from leaf tissue using an IQeasy+ plant RNA extraction mini kit (iNtRON, Korea). Samples positive for infection with single Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) or Watermelon mosaic virus (WMV) were selected and stored at -80°C for use as an RT-RPA analysis template.
상기 ZYMV 및 WMV 바이러스의 염기 서열(sequence)을 확보하고, 이를 바탕으로 보존되어 있는 염기서열 부분을 확인하였다.The nucleotide sequence of the ZYMV and WMV viruses was obtained, and the conserved nucleotide sequence portion was confirmed based on this.
보다 구체적으로, CBI Basic Local Alignment Search Tool로부터 확보한 ZYMV의 외피 단백질(coat protein; CP)의 염기서열(GenBank KX421104, AY279000, KY495596, KU318687, AB188115, JN861009, AJ420020, KR261951 및 EU561044)의 다중서열배치(multiple sequence alignment, 도 1a) 및 WMV의 외피 단백질의 염기서열(KT992080, JX079685, KP164988, JF273463, FJ823122, EU660579, AB218280, JN831650, JN597238 및 EU660582)의 다중서열배치(도 1b)에서, 고도로 보존된 영역을 선택하고 이를 이용하여 RT-RPA를 위한 프라이머 세트를 제작하였다.More specifically, the nucleotide sequence of the coat protein (CP) of ZYMV obtained from the CBI Basic Local Alignment Search Tool (GenBank KX421104, AY279000, KY495596, KU318687, AB188115, JN861009, AJ420020, KR261951 and EU561044). (multiple sequence alignment, Fig. 1a) and the nucleotide sequence of the coat protein of WMV (KT992080, JX079685, KP164988, JF273463, FJ823122, EU660579, AB218280, JN831650, JN597238 and EU660582) in a multi-sequence arrangement (Fig. 1b), highly conserved A region was selected and a primer set for RT-RPA was constructed using this.
제작한 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.The prepared primer set is shown in Table 1 below.
(Expected amplicon length, nt)Expected amplicon length
(Expected amplicon length, nt)
실험예 1. RT-RPA 반응 가부 확인Experimental Example 1. Confirmation of RT-RPA reaction
상기 제조예에서 제작한 프라이머 세트를 사용하여 RT-RPA(Twist Amp basic RT kit, TwistDx Limited)를 진행하였다.RT-RPA (Twist Amp basic RT kit, TwistDx Limited) was performed using the primer set prepared in Preparation Example.
보다 구체적으로, 마이크로 튜브에 480 nM RT-RPA 프라이머 세트, 280 mM 마그네슘 아세테이트 및 주형가닥 1 μL를 넣고(총 부피 50 μL), 42 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. RPA 생성물은 에티듐 브로마이드(EtBr)를 함유하는 3 % 아가로오스 겔 상에 전기영동 하였다.More specifically, 480 nM RT-RPA primer set, 280 mM magnesium acetate, and 1 μL of template strand were put into a micro tube (total volume 50 μL), and incubated at 42° C. for 30 minutes. The RPA product was electrophoresed on a 3% agarose gel containing ethidium bromide (EtBr).
도 2에서 확인할 수 있듯이, ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV2F/R 및 WMV2F/R 프라이머 세트 모두 증폭 결과물이 정상적으로 생성되었다.As can be seen in Figure 2, the amplification results were normally generated in both the ZYMV1F/R and WMV1F/R primer sets, and the ZYMV2F/R and WMV2F/R primer sets.
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트를 이용하여 추가 실험을 진행하였다.Further experiments were performed using the ZYMV1F/R primer set, the WMV1F/R primer set, and the ZYMV1F/R+WMV1F/R primer set.
보다 구체적으로, 마이크로 튜브에 480 nM RT-RPA 프라이머 세트, 280 mM 마그네슘 아세테이트 및 주형가닥 1 μL를 넣고(총 부피 50 μL), 42 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. RPA 생성물은 에티듐 브로마이드(EtBr)를 함유하는 3 % 아가로오스 겔 상에 전기영동 하였다.More specifically, 480 nM RT-RPA primer set, 280 mM magnesium acetate, and 1 μL of template strand were put into a micro tube (total volume 50 μL), and incubated at 42° C. for 30 minutes. The RPA product was electrophoresed on a 3% agarose gel containing ethidium bromide (EtBr).
도 3a에서 확인할 수 있듯이, ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트 모두 예상된 사이즈에서 증폭 결과물이 정상적으로 생성되었으며, 음성 대조군에서는 증폭 결과물이 생성되지 않았다.As can be seen in Figure 3a, ZYMV1F / R primer set, WMV1F / R primer set, and ZYMV1F / R + WMV1F / R primer set all the amplification products were normally generated at the expected size, the amplification results were not generated in the negative control.
실험예 2. RT-RPA 반응의 최적 시간 확인Experimental Example 2. Checking the optimal time of RT-RPA reaction
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 반응 시간을 1, 3, 5, 10, 15, 20 및 30 분(t)으로 설정하고 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 RT-RPA를 진행하였다.For the ZYMV1F/R primer set, WMV1F/R primer set, and ZYMV1F/R+WMV1F/R primer set, reaction times were set to 1, 3, 5, 10, 15, 20 and 30 minutes (t), and the above experimental example RT-RPA was performed in the same manner as in the method of 1.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 모든 프라이머 세트에서 10 분만 반응하였을 때부터 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다.As can be seen in FIG. 4, it was confirmed that amplification was achieved at the expected size from the reaction for only 10 minutes in all primer sets.
실험예 3. RT-RPA 반응의 민감성 확인Experimental Example 3. Confirmation of sensitivity of RT-RPA reaction
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 기존의 PCR 방법과 RPA 방법을 비교하였다.For the ZYMV1F/R primer set, WMV1F/R primer set, and ZYMV1F/R+WMV1F/R primer set, the conventional PCR method and the RPA method were compared.
보다 구체적으로, ZYMV 및 WMV가 감염된 오이 잎에서 Total RNA를 추출하고, 각각 10 배씩 차례대로 희석하여 RT-PCR 및 RT-RPA 반응을 진행하였다. RT-RPA 반응은 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 진행하였으며, RT-PCR은 다음과 같이 진행되었다: More specifically, total RNA was extracted from cucumber leaves infected with ZYMV and WMV, and each was diluted 10 times in order to carry out RT-PCR and RT-RPA reactions. RT-RPA reaction was carried out in the same manner as in Experimental Example 1, and RT-PCR was carried out as follows:
단계 1, 50 ℃에서 30 분;
단계 2, 95 ℃에서 5 분;
단계 3, 30 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 56 ℃, 40 초 동안 72 ℃의 35 사이클;
단계 4, 72 ℃에서 5 분.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 모든 프라이머 세트에서 RT-RPA 반응(10 분 소요)은 RT-PCR 반응(2 시간 소요)과 비슷한 민감도를 나타냄을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 5, it was confirmed that the RT-RPA reaction (takes 10 minutes) in all primer sets exhibited similar sensitivity to the RT-PCR reaction (takes 2 hours).
이러한 결과는, 본 발명의 RT-RPA 방법의 민감도가 RT-PCR 방법과 유사한 민감도를 보이면서도 시간은 최소 1/12로 단축시킬 수 있음을 의미한다.These results mean that the sensitivity of the RT-RPA method of the present invention can be reduced to at least 1/12 while the sensitivity of the RT-RPA method is similar to that of the RT-PCR method.
실험예 4. 식물 잎의 즙(액)에서 RT-RPA 반응 가부 확인Experimental Example 4. Confirmation of RT-RPA reaction in plant leaf juice (liquid)
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 바이러스에 감염된 식물 잎에서 즙을 내어 바로 RPA 반응을 진행하여 RT-RPA 반응 가부를 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.For the ZYMV1F/R primer set, WMV1F/R primer set, and ZYMV1F/R+WMV1F/R primer set, juice was extracted from the virus-infected plant leaf and immediately proceeded with RPA to confirm the RT-RPA reaction, and the result Is shown in Figure 6.
도 6에서 확인할 수 있듯이, 기존의 복잡하고 시간이 오래 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다.As can be seen in Fig. 6, it was confirmed that the amplification was amplified at the expected size without the existing complicated and time-consuming RNA extraction process.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer Set for recombinase polymerase amplification reaction and detecting Cucurbitaceae and Method for diagnosing Cucurbitaceae virus disease using the same <130> PN180295 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV1F <400> 1 Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV1R <400> 2 Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ala Cys Ala Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Gly Ala Gly Cys 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV1F <400> 3 Gly Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Gly Cys Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Cys Thr Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV1R <400> 4 Gly Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala 1 5 10 15 Gly Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Cys Cys Thr 20 25 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV2F <400> 5 Ala Gly Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Cys Thr Thr Thr Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Ala 20 25 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV2R <400> 6 Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Gly Ala Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV2F <400> 7 Cys Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV2R <400> 8 Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala 20 25 30 <110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer Set for recombinase polymerase amplification reaction and detecting Cucurbitaceae and Method for diagnosing Cucurbitaceae virus disease using the same <130> PN180295 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV1F <400> 1 Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV1R <400> 2 Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ala Cys Ala Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Gly Ala Gly Cys 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV1F <400> 3 Gly Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Gly Cys Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Cys Thr Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV1R <400> 4 Gly Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala 1 5 10 15 Gly Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Cys Cys Thr 20 25 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV2F <400> 5 Ala Gly Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Cys Thr Thr Thr Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Ala 20 25 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZYMV2R <400> 6 Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Gly Ala Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV2F <400> 7 Cys Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WMV2R <400> 8 Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Ala 20 25 30
Claims (11)
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는
이의 혼합물;
을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출을 위한 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA)용 조성물.A first primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
A second primer set consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; or
Mixtures thereof;
Gak family ( Cucurbitaceae ) comprising a recombinant-polymerase amplification method (Recombinase polymerase amplification; RPA) for the detection of crop virus composition.
제 1 항의 조성물을 이용하여 시료로부터 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및
RPA 증폭산물을 분석하는 분석 단계. Cucurbitaceae crop viral disease detection method comprising the following steps:
An amplification step of obtaining a recombinant-polymerase amplification (RPA) amplification product from a sample using the composition of claim 1; And
Analysis step to analyze the RPA amplification product.
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Families Citing this family (1)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017532026A (en) * | 2014-09-11 | 2017-11-02 | アグロフレッシュ インコーポレイテッド | Methods for pathogen detection and disease management on meat, plants or plant parts |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100496012B1 (en) | 2002-11-29 | 2005-06-16 | 대한민국 | Specific Primers for Detection of Cucumber mosaic virus |
| KR100496017B1 (en) * | 2002-11-29 | 2005-06-16 | 대한민국 | Primer Combination for Simultaneous Detection of Five Cucurbit-infecting Viruses |
| KR101928444B1 (en) * | 2012-01-06 | 2019-02-27 | 주식회사 에프앤피 | PCR primers for detecting viruses occurring on cucurbitaceae and method for detceting cucurbitaceae viruses |
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2018
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2017532026A (en) * | 2014-09-11 | 2017-11-02 | アグロフレッシュ インコーポレイテッド | Methods for pathogen detection and disease management on meat, plants or plant parts |
Also Published As
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