KR20190137448A - Primer composition for recombinase polymerase amplification reaction for detecting pear viruses and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 배 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 배 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 배 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting a pear virus, a diagnostic kit comprising the same, and a method for diagnosing a pear virus disease using the same, and specifically, a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A composition for detecting a pear virus comprising a first primer set or a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a second primer set consisting of a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, a diagnostic kit comprising the same, and a method for using the same It relates to a method for diagnosing embryonic virus disease.
전 세계적인 지구 온난화로 인하여 새로운 바이러스의 출현과 피해가 급증하고 있다. 그 중 식물 바이러스 병은 곰팡이나 세균에 의한 다른 식물 병들과는 다르게 화학적 방제가 불가능하고, 소수의 친환경 방제 법이 있지만 효과는 크지 않은 문제가 있다. 그렇기 때문에 식물 바이러스 병은 방제보다는 신속한 진단으로 작물의 피해를 줄이고 병의 확산을 막는 것이 중요하다.Global warming is increasing the emergence and damage of new viruses. Among them, the plant virus disease, unlike other plant diseases caused by fungi or bacteria, is impossible to control chemically, and there are a few eco-friendly control methods, but the effect is not great. Therefore, plant virus disease is important to prevent the spread of the disease and to reduce the damage of crops by rapid diagnosis rather than control.
국내 과수 바이러스 감염률은 30~60 %로 높으며, 감염으로 인해 과수의 생산량 20~40 % 감소, 당도 감소 및 기형과 발생 등으로 품질이 저하되어 경쟁력이 취약하다(농촌진흥청 원예특작과학원). 특히, 개방화가 가속되는 상황에서 바이러스에 감염된 과수는 과수 산업의 경쟁력을 떨어뜨린다. 그 중 특히 배의 바이러스 감염률은 29 %(최저 감염률)이며, 피해도 증가하고 있다. Domestic fruit virus infection rate is high (30-60%), and the quality of the fruit fruit is reduced due to the decrease in fruit production (20-40%), decrease in sugar content, malformation and outbreak, etc. (Rural Development Institute of Horticultural Science). In particular, in the face of accelerating liberalization, virus-infected fruit trees reduce the competitiveness of the fruit industry. Among them, the virus infection rate of the embryo is 29% (the lowest infection rate), and the damage is also increasing.
한편, 우리나라 배에서 발생하는 주요 바이러스는 사과 황화 반점 바이러스(Apple chlorotic leafspot virus; ACLSV), 사과 줄기 구멍 바이러스(Apple stem pitting virus; ASPV) 및 사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV) 등이 있다. The major viruses that occur in Korean pears include apple chlorotic leafspot virus (ACSL), apple stem pitting virus (ASPV), and apple stem grooving virus (ASGV). have.
기존에는 이러한 바이러스들을 검출 및 진단하기 위해 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR) 기법을 이용하였다. 그러나 PCR은 특별한 장비가 필요하고, 평균 90 분이라는 오랜 시간이 걸리기 때문에 신속한 검출 및 진단이 어렵다는 문제가 있다.In the past, polymerase chain reaction (PCR) techniques have been used to detect and diagnose these viruses. However, since PCR requires special equipment and takes a long time of 90 minutes on average, rapid detection and diagnosis are difficult.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 배 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법을 이용하는 경우, RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors earnestly tried to develop a method for detecting and diagnosing embryonic virus more simply and quickly. As a result, the first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 In the case of using the method of RT-RPA using the second primer set consisting of reverse primers, the present invention was completed by clarifying that RNA can be amplified without RNA extraction.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is the first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and It is to provide a composition for detecting embryo virus comprising a second primer set consisting of a reverse primer consisting of a nucleotide sequence.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 배 바이러스병 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a base of SEQ ID NO: 4 It is to provide a kit for diagnosing embryo virus diseases comprising a composition for detecting embryo virus comprising a second primer set consisting of a reverse primer consisting of a sequence.
본 발명의 또 다른 목적은 배 바이러스병의 진단방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing embryonic virus disease.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 배 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법을 이용하는 경우, RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능함을 규명하였다.The present inventors earnestly tried to develop a method for detecting and diagnosing embryonic virus more simply and quickly. As a result, the first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 When using the method of RT-RPA using a second primer set consisting of reverse primers, it was found that RNA can be amplified immediately without RNA extraction.
본 발명은 배 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 배 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 배 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting a pear virus, a diagnostic kit comprising the same, and a method for diagnosing a pear virus disease using the same, the first comprising a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A composition for detecting a pear virus comprising a primer set or a second primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, a diagnostic kit comprising the same, and a pear virus disease using the same It is about a diagnosis method.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.One aspect of the present invention is a first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a base of SEQ ID NO: 4 It relates to a composition for detecting embryo virus comprising a second primer set consisting of a reverse primer consisting of a sequence.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.As used herein, the term "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs of plant nucleic acids, By a short nucleic acid sequence that serves as a starting point for.
상기 제1 프라이머 세트는 사과 줄기 구멍 바이러스(Apple stem pitting virus; ASPV) 검출용 프라이머 세트일 수 있다.The first primer set may be a primer set for detecting an apple stem pitting virus (ASPV).
본 발명에서 용어 "사과 줄기 구멍 바이러스(Apple stem pitting virus; ASPV)"는 배 바이러스병(고접병)의 원인균 중 하나로, ASPV에 감염된 나무는 일반적인 쇠약 증상을 나타내고 잎이 작아지며, 점진적으로 황화, 조기낙엽 등의 증상을 나타낸다. 또한, 꽃이 많이 피고 과실이 작아지며, 줄기를 가로로 잘라보면 방사상으로 고랑이 진 나이테를 볼 수 있다.The term "Apple stem pitting virus (ASPV)" in the present invention is one of the causative agents of pear virus disease (hardwood disease), the ASPV-infected tree shows a general debilitating symptoms, the leaves become smaller, gradually yellowing, early Symptoms such as fallen leaves. In addition, the flowers bloom a lot and the fruit becomes smaller, and if you cut the stem horizontally, you can see the radially furrowed rings.
상기 ASPV는 본 발명의 제1 프라이머 세트에 의해 증폭되어 146 bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물을 통해 검출될 수 있다.The ASPV is amplified by the first primer set of the present invention to represent an amplification product of 146 bp, it can be detected through the amplification product.
상기 제2 프라이머 세트는 사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV) 검출용 프라이머 세트일 수 있다.The second primer set may be a primer set for detecting an apple stem grooving virus (ASGV).
본 발명에서 용어 "사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV)"는 배 바이러스병(배잎검은점병)의 원인균 중 하나로, ASGV에 감염된 나무는 잎에 흑갈색의 작은 반점이 형성되고, 점차 진전되면서 원형 또는 불규칙한 병반이 형성된다. 병반이 오래되면 회색으로 변하고, 간혹 찢어져 지저분하게 되며, 생육 후기에는 여러 가지 점무늬병 또는 검은무늬병과 혼합 발생하여 구분하기가 매우 어렵다.In the present invention, the term "Apple stem grooving virus (ASGV)" is one of the causative agents of pear virus disease (pear leaf black spot disease), ASGV-infected trees are formed with dark brown small spots on the leaves, gradually progress Round or irregular lesions are formed. When the lesion is old, it turns gray, sometimes it is torn and messy, and it is very difficult to distinguish it by mixing with various spot or black pattern disease in the late stage of growth.
상기 ASGV는 본 발명의 제2 프라이머 세트에 의해 증폭되어 143 bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물을 통해 검출될 수 있다.The ASGV is amplified by the second primer set of the present invention to represent an amplification product of 143 bp, it can be detected through the amplification product.
상기 증폭은 당업계에서 증폭 대상(유전자 등)을 증폭하기 위하여 이용되는 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있고, 예를 들어, 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amplification may be performed by any method used to amplify amplification targets (genes, etc.) in the art, for example, may be performed by Recombinase polymerase amplification (RPA). However, the present invention is not limited thereto.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amplification product may be, for example, an amplicon, but is not limited thereto.
본 명세서에서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인 할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단 할 수 있는 장점이 있다.As used herein, the term "recombinant-polymerase amplification method" refers to a technique capable of confirming DNA and RNA amplification, and, unlike conventional PCR, uses a DNA binding protein and a recombinase to quickly and accurately target sequences (target). Sequence amplification technology. RPA method can be amplified even in isothermal conditions using mesophilic polymerase (mesophilic polymerase), there is an advantage that can detect and diagnose the virus in a short time if there is no isothermal device without special equipment.
본 발명의 다른 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 배 바이러스병 진단용 키트에 관한 것이다.Another aspect of the present invention is a first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and The present invention relates to a kit for diagnosing embryonic virus disease, comprising a composition for detecting embryonic virus comprising a second primer set consisting of a reverse primer consisting of a nucleotide sequence.
본 발명에서 용어 "배 바이러스병"은 바이러스의 감염에 의해서 배에서 발생하는 질병을 의미하며, 구체적으로는 고접병(stem pitting) 및 배잎검은점병(black necrotic leaf spot)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "germ virus disease" in the present invention means a disease occurring in the embryo by the infection of the virus, specifically one or more selected from the group consisting of stem pitting (black necrotic leaf spot). May be, but is not limited thereto.
상기 제1 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물은 고접병을 진단하기 위해 사용될 수 있다.A composition for detecting a germ virus comprising the first primer set may be used for diagnosing hyperplasia.
상기 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물은 배잎검은점병을 진단하기 위해 사용될 수 있다.The composition for detecting a pear virus comprising the second primer set may be used to diagnose pear leaf black eye disease.
상기 혼합물을 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물은 고접병 또는 배잎검은점병을 진단하기 위해 사용될 수 있다.A composition for detecting a pear virus comprising the mixture can be used to diagnose a juncture or black leaf disease.
상기 키트는 시료로부터 배 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는데, 특별히 제한되지 않으나, 상기 제1 프라이머 세트 및/또는 제2 프라이머 세트뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.The kit can be used to detect embryonic viruses from a sample, but is not particularly limited but includes one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method as well as the first primer set and / or the second primer set. May be included.
상기 시료는 예를 들어, 배 나무(묘목)의 껍질, 잎, 열매, 줄기 또는 뿌리 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, the bark, the leaves, the fruit, the stem or the root of the pear tree (seedling) may be used, but is not limited thereto.
구체적으로, 상기 키트는 RPA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.Specifically, the kit can be a kit containing the necessary elements necessary to perform the RPA assay, in addition to each of the above primer sets, test tubes or other suitable containers, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water and sterile water, and the like.
상기 키트가 RPA 분석에 사용되는 경우, 별도로 cDNA를 수득할 필요 없이 시료로부터 바로 RPA 증폭산물을 수득하여 아가로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머 세트에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 배 바이러스병을 진단할 수 있다.When the kit is used for RPA analysis, RPA amplification products can be obtained directly from a sample without separate cDNA, and can be separated by agarose gel electrophoresis and the like. The presence of DNA having a length corresponding to the polymerized DNA can be confirmed to diagnose embryonic virus disease.
특히 2 개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트의 경우, 각각의 프라이머 세트를 사용하는 진단이 별도로 수행될 수도 있고, 다수의 프라이머 세트를 하나의 반응에 혼합 사용하여 진단이 수행될 수도 있다.In particular, in the case of a diagnostic kit including two or more primer sets, the diagnosis using each primer set may be performed separately, or the diagnosis may be performed by using a plurality of primer sets mixed in one reaction.
상기 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 용기(예컨대, 일회용 RPA 튜브 등)에 담겨 있는 동결 건조된(lyophilized) 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 2 개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 경우 다수의 프라이머 세트가 혼합되어 RPA 튜브에 담겨 있을 수도 있고, 각각의 프라이머 세트가 개별적으로 각각의 RPA 튜브에 담겨 있을 수도 있다.The kit is not limited to a specific form and may be implemented in various forms. For example, the kit can include a set of lyophilized primers contained in a container (eg, disposable RPA tube, etc.). In the case of including two or more primer sets, multiple primer sets may be mixed and contained in an RPA tube, and each primer set may be individually contained in each RPA tube.
즉, 2 개의 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트의 경우, 제1 프라이머 세트 또는 제2 프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머 세트가 동결 건조 분말 형태로 담겨 있는 일회용 RPA 튜브가 진단용 키트에 포함될 수 있고, 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트가 동결 건조 분말 형태로 혼합되어 담겨 있는 일회용 RPA 튜브가 진단용 키트에 포함될 수도 있다.That is, in the diagnostic kit including two primer sets, the diagnostic kit may include a disposable RPA tube in which the primer set of either the first primer set or the second primer set is contained in the form of lyophilized powder, The diagnostic kit may include a disposable RPA tube containing the primer set and the second primer set mixed in the form of lyophilized powder.
본 발명의 다른 일 양태는 하기의 단계를 포함하는 배 바이러스병의 진단방법에 관한 것이다.Another aspect of the invention relates to a method for diagnosing embryonic virus disease comprising the following steps.
제 1 항의 조성물을 이용하여 시료로부터 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및An amplifying step of obtaining a Recombinase polymerase amplification (RPA) amplification product from a sample using the composition of
RPA 증폭산물을 분석하는 분석 단계.Analytical step to analyze RPA amplification products.
본 명세서에서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인 할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단 할 수 있는 장점이 있다.As used herein, the term "recombinant-polymerase amplification method" refers to a technique capable of confirming DNA and RNA amplification, and, unlike conventional PCR, uses a DNA binding protein and a recombinase to quickly and accurately target sequences (target). Sequence amplification technology. RPA method can be amplified even in isothermal conditions using mesophilic polymerase (mesophilic polymerase), there is an advantage that can be detected and diagnose the virus in a short time if the isothermal device without special equipment.
상기 분석 단계에서 146 bp의 증폭산물을 수득한 경우 시료에 ASPV가 감염되었다고 판정할 수 있고, 143 bp의 증폭산물을 수득한 경우 시료에 ASGV가 감염되었다고 판정할 수 있다.When the 146 bp amplification product is obtained in the analysis step, it can be determined that the sample is infected with ASPV, and when the 143 bp amplification product is obtained, it can be determined that the sample is infected with ASGV.
상기 시료는 예를 들어, 배 나무(묘목)의 껍질, 잎, 열매, 줄기 또는 뿌리 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, the bark, the leaves, the fruit, the stem or the root of the pear tree (seedling) may be used, but is not limited thereto.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The amplification product may be, for example, an amplicon, but is not limited thereto.
상기 제1 프라이머 세트 또는 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함한 배 바이러스 진단용 키트의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락한다.Duplicate contents of the composition for detecting embryo virus comprising the first primer set or the second primer set and kit for diagnosing embryo virus comprising the same are omitted in consideration of the complexity of the present specification.
한편, 감염된 배 조직에는 페놀 화합물, 탄수화물, 안료 및 기타 알려지지 않은 화합물이 풍부하기 때문에, 이로부터 RNA를 분리하는 것은 매우 까다롭다.On the other hand, infected embryonic tissues are rich in phenolic compounds, carbohydrates, pigments and other unknown compounds, which makes it very difficult to isolate RNA from them.
하지만, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법은 기존의 까다롭고 오랜 시간이 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, 식물 잎에서 즙(액)을 내어 바로 반응을 진행함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.However, the method of RT-RPA using the primer set of the present invention can directly amplify the RNA without the conventional and time-consuming RNA extraction process, by proceeding the reaction immediately by taking juice (liquid) from the plant leaves In addition, it can be usefully used for detecting viruses more simply and quickly.
본 발명은 배 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 배 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 배 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting a pear virus, a diagnostic kit comprising the same, and a method for diagnosing a pear virus disease using the same, and specifically, a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A composition for detecting a pear virus comprising a first primer set or a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a second primer set consisting of a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, a diagnostic kit comprising the same, and a method for using the same It relates to a method for diagnosing embryonic virus disease.
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법은 기존의 까다롭고 오랜 시간이 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, 식물 잎에서 즙(액)을 내어 바로 반응을 진행함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.The method of RT-RPA using the primer set of the present invention can directly amplify RNA without a conventional and time-consuming RNA extraction process, so that by directly taking out the juice (liquid) from the plant leaves, It can be usefully used for detecting viruses simply and quickly.
도 1a는 사과 줄기 구멍 바이러스(ASPV)의 외피 단백질(CP)의 다중서열배치(multiple sequence alignment)를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 사과 줄기 홈 바이러스(ASGV)의 외피 단백질(CP)의 다중서열배치(multiple sequence alignment)를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 ASPV(왼쪽) 및 ASGV(오른쪽)에 감염된 배 잎의 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV1F/R 및 ASGV1F/R 프라이머를 이용한 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV2F/R, ASGV2F/R 및 ASGV3F/R 프라이머를 이용한 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV1F/R 프라이머를 이용하여, 시간 경과(1, 3, 5, 10, 15, 20 및 30 분)에 따라 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV1F/R 프라이머를 이용하여, 시간 경과(1, 3, 5, 10, 15, 20 및 30 분)에 따라 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV1F/R 프라이머를 이용한 RT-RPA 반응 증폭산물의 염기서열을 확인한 도이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV1F/R 프라이머를 이용한 RT-RPA 반응 증폭산물의 염기서열을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV1F/R 및 ASGV1F/R 프라이머를 이용한 RT-RPA 반응 및 RT-PCR 반응 결과를 비교한 도이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV1F/R 프라이머를 이용하여, 배 잎의 즙(액)에서 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV1F/R 프라이머 및 ASGV1F/R 프라이머를 이용하여, 배 나무(묘목) 껍질의 즙(액)에서 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASPV1F/R 프라이머를 이용한 RT-RPA 반응 증폭산물의 염기서열을 확인한 도이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV1F/R 프라이머를 이용한 RT-RPA 반응 증폭산물의 염기서열을 확인한 도이다.FIG. 1A is a graph showing multiple sequence alignments of envelope protein (CP) of apple stem pore virus (ASPV). FIG.
1B is a graph showing multiple sequence alignments of envelope protein (CP) of apple stem home virus (ASGV).
2A is a photograph of pear leaves infected with ASPV (left) and ASGV (right).
Figure 2b is a diagram confirming the results of RT-RPA reaction using ASPV1F / R and ASGV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a diagram confirming the RT-RPA reaction results using the ASPV2F / R, ASGV2F / R and ASGV3F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 4a is a diagram confirming the RT-RPA reaction results over time (1, 3, 5, 10, 15, 20 and 30 minutes) using the ASPV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 4b is a diagram confirming the RT-RPA reaction results over time (1, 3, 5, 10, 15, 20 and 30 minutes) using the ASGV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 5a is a diagram confirming the base sequence of the RT-RPA reaction amplification product using the ASPV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 5b is a diagram confirming the nucleotide sequence of the RT-RPA reaction amplification product using ASGV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
6 is a diagram comparing the results of RT-RPA reaction and RT-PCR using the ASPV1F / R and ASGV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 7a is a diagram confirming the RT-RPA reaction results in the juice (liquid) of the pear leaf using the ASPV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 7b is a diagram confirming the results of RT-RPA reaction in the juice (liquid) of the bark (seedling) bark using the ASPV1F / R primer and ASGV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
Figure 8a is a diagram confirming the base sequence of the RT-RPA reaction amplification product using the ASPV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
8b is a diagram illustrating the nucleotide sequence of the RT-RPA reaction amplification product using the ASGV1F / R primer according to an embodiment of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
제조예. 프라이머 세트의 제조Preparation example. Preparation of the primer set
우리나라 배 주산지 5 지역(전남 나주, 충남 천안, 경북 상주, 경남 울산 및 경기도 남양주)을 선발하고, 잎 황백화(leaf chlorosis) 및 괴사성 반점(necrotic spots) 등 전형적인 배 바이러스병 증상을 보이는 158 개의 잎 샘플을 채취하였다.We selected 158 regions of Baeju-san, Korea (Cheonnam Naju, Chungnam Cheonan, Gyeongbuk Sangju, Gyeongnam Ulsan, and Namyangju, Gyeonggi-do), and showed typical symptoms of pear virus such as leaf chlorosis and necrotic spots. Leaf samples were taken.
IQeasy+ 식물 RNA 추출 미니 키트(iNtRON, Korea)를 사용하여 잎 조직에서 Total RNA를 추출하였다. 단일 사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV) 또는 사과 줄기 구멍 바이러스(Apple stem pitting virus; ASPV) 감염에 대해 양성인 샘플을 선택하여 RT-RPA 분석 템플릿으로 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관하였다.Total RNA was extracted from the leaf tissues using IQeasy + Plant RNA Extraction Mini Kit (iNtRON, Korea). Samples positive for single stem grooving virus (ASGV) or Apple stem pitting virus (ASPV) infection were selected and stored at −80 ° C. for use as RT-RPA assay templates.
다음으로, 상기 5 지역별로 분리된 5 개의 ASGV 분리주와 3 개의 ASPV 분리주의 서열(sequence)을 확보하였다. 확보한 ASGV 및 ASPV의 염기서열을 바탕으로, 보존되어 있는 염기서열 부분을 확인하였다.Next, a sequence of five ASGV isolates and three ASPV isolates separated by the five regions was obtained. Based on the obtained nucleotide sequences of ASGV and ASPV, the stored nucleotide sequence was confirmed.
보다 구체적으로, ASPV의 외피 단백질(coat protein; CP)의 염기서열(GenBank LC367338, LC367340, LC367341, AF345893, D21829 및 KF915809)의 다중서열배치(multiple sequence alignment, 도 1a) 및 ASGV의 외피 단백질의 염기서열(MG682506, MG682507, MG682508, MG682509, MG682510, JN792471, LC084659, KX955001, KF735124, LC184610, LC143387, KR185346, KU198289, LC184611, AB004603, KJ579253 및 GQ330294)의 다중서열배치(도 1b)에서, 고도로 보존된 영역을 선택하고, 이를 이용하여 RT-RPA를 위한 프라이머 세트를 제작하였다.More specifically, multiple sequences of the coat protein (CP) of ASPV (GenBank LC367338, LC367340, LC367341, AF345893, D21829 and KF915809) and the base of the coat protein of ASGV In highly conserved regions of the sequences (MG682506, MG682507, MG682508, MG682509, MG682510, JN792471, LC084659, KX955001, KF735124, LC184610, LC143387, KR185346, KU198289, LC184611, AB004603, KJ579253 and GQ330294) (Figure 1b). Was selected and used to prepare a primer set for RT-RPA.
제작한 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.The prepared primer set is shown in Table 1 below.
(Expected amplicon length, nt)Expected Amplicon Length
(Expected amplicon length, nt)
실험예 1. RT-RPA 반응 가부 확인Experimental Example 1. Check RT-RPA reaction
상기 제조예에서 제작한 프라이머 세트를 사용하여 RT-RPA(Twist Amp basic RT kit, TwistDx Limited)를 진행하였다.RT-RPA (Twist Amp basic RT kit, TwistDx Limited) was performed using the primer set prepared in the preparation example.
보다 구체적으로, 마이크로 튜브에 480 nM RT-RPA 프라이머 세트, 280 mM 마그네슘 아세테이트 및 주형가닥(ASPV: 192 ng/μL, ASGV: 47 ng/μL) 1 μL를 넣고(총 부피 50 μL), 42 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. RPA 생성물은 에티듐 브로마이드(EtBr)를 함유하는 3 % 아가로오스 겔 상에 전기영동 하였다.More specifically, 480 nM RT-RPA primer set, 280 mM magnesium acetate and 1 μL of template strand (ASPV: 192 ng / μL, ASGV: 47 ng / μL) were placed in a microtube (
도 2에서 확인할 수 있듯이, ASPV1F/R 및 ASGV1F/R 프라이머 세트는 예상된 사이즈(ASPV: ~146bp, ASGV: ~143bp)에서 ASPV 및 ASGV가 모두 검출되었고, 음성 대조군에서는 증폭 결과물이 생성되지 않음을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 2, the ASPV1F / R and ASGV1F / R primer set was detected both ASPV and ASGV at the expected size (ASPV: ~ 146bp, ASGV: ~ 143bp), the negative control did not produce amplification results I could confirm it.
반면, 도 3에서 확인할 수 있듯이, ASPV2F/R, ASGV2F/R 및 ASGV3F/R 프라이머 세트는 양성 대조군뿐만 아니라 음성 대조군에서도 증폭되었고, 증폭하고자 하는 부분 이외 다른 부분까지 비특이적인 증폭 결과물이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.On the other hand, as can be seen in Figure 3, the ASPV2F / R, ASGV2F / R and ASGV3F / R primer set was amplified not only in the positive control but also in the negative control, and confirmed that the non-specific amplification result is generated to other parts than the portion to be amplified Could.
실험예 2. RT-RPA 반응의 신속성 확인Experimental Example 2. Confirmation of the rapidity of the RT-RPA reaction
상기 실험예 1의 결과를 바탕으로, ASPV1F/R 및 ASGV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 반응 시간을 1, 3, 5, 10, 15, 20 및 30 분(t)으로 설정하고, 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 RT-RPA를 진행하였다.Based on the results of Experimental Example 1, for the ASPV1F / R and ASGV1F / R primer sets, the reaction time was set to 1, 3, 5, 10, 15, 20 and 30 minutes (t), and Experimental Example 1 RT-RPA was carried out in the same manner as in.
도 4a 및 도 4b에서 확인할 수 있듯이, ASPV(도 4a) 및 ASGV(도 4b) 모두 1 분만 반응하였을 때에도 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다.As can be seen in Figures 4a and 4b, it was confirmed that both ASPV (Fig. 4a) and ASGV (Fig. 4b) amplified at the expected size even when only 1 minute reaction.
또한, 추가적으로 이 증폭산물을 T-vector에 클로닝한 후 염기서열을 분석하여 그 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었다.In addition, the amplification products were further cloned into T-vectors, and the nucleotide sequences were analyzed and the results are shown in FIGS. 5A and 5B.
도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, ASPV 1F/R 프라이머 세트로 증폭한 증폭산물은 ASPV의 다른 분리주(isolate)들과 96 %의 상동성을 보이는 것을 확인하였으며, ASGV 1F/R 프라이머 세트로 증폭한 증폭산물은 다른 분리주들과 97 %의 상동성을 보이는 것을 확인하여, ASPV 및 ASGV 바이러스가 맞음을 확인하였다.As can be seen in Figures 5a and 5b, the amplification product amplified by the ASPV 1F / R primer set was confirmed to show 96% homology with other isolates (isolate) of ASPV, amplified by the ASGV 1F / R primer set The amplification product showed 97% homology with other isolates, confirming that the ASPV and ASGV viruses were correct.
실험예 3. RT-RPA 반응의 민감성 확인Experimental Example 3. Confirmation of Sensitivity of RT-RPA Response
ASPV1F/R 및 ASGV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 기존의 PCR 방법과 RPA 방법을 비교하였다.For the ASPV1F / R and ASGV1F / R primer sets, the conventional PCR and RPA methods were compared.
보다 구체적으로, ASPV 및 ASGV가 감염된 배 잎에서 Total RNA를 추출하고, 각각 10 배씩 차례대로 희석하여(ASPV: 192 ng/μL(1), 19.2 ng/μL(2), 1.92 ng/μL(3), 192 pg/μL(4) 및 19.2 pg/μL(5), ASGV: 47 ng/μL(1), 4.7 ng/μL(2), 0.47 ng/μL(3), 47 pg/μL(4) 및 4.7 pg/μL(5)) RT-PCR 및 RT-RPA 반응을 진행하였다. RT-RPA 반응은 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 진행하였으며, RT-PCR은 다음과 같이 진행되었다: More specifically, total RNA was extracted from pear leaves infected with ASPV and ASGV, diluted 10-fold each in turn (ASPV: 192 ng / μL (1), 19.2 ng / μL (2), 1.92 ng / μL (3). ), 192 pg / μL (4) and 19.2 pg / μL (5), ASGV: 47 ng / μL (1), 4.7 ng / μL (2), 0.47 ng / μL (3), 47 pg / μL (4 ) And 4.7 pg / μL (5)) RT-PCR and RT-RPA reactions. RT-RPA reaction proceeded in the same manner as in Experimental Example 1, RT-PCR proceeded as follows:
단계 1, 50 ℃에서 30 분;
단계 2, 95 ℃에서 5 분;
단계 3, 30 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 56 ℃, 40 초 동안 72 ℃의 35 사이클;
단계 4, 72 ℃에서 5 분.
도 6에서 확인할 수 있듯이, RT-RPA 반응은 적어도 192 pg/μL의 RNA(10-4 배 희석)를 함유한 ASPV 감염 샘플 및 적어도 4.7 ng/μL의 RNA(10-2 배 희석)를 함유한 ASPV 감염 샘플에서 일관된 양성 결과가 나타났다. As can be seen in FIG. 6, the RT-RPA response contained an ASPV infected sample containing at least 192 pg / μL of RNA (10 −4 fold dilution) and at least 4.7 ng / μL of RNA (10 −2 fold dilution). Consistent positive results were seen in ASPV infected samples.
반면, RT-PCR 반응은 적어도 1.92 ng/μL의 RNA(10-3 배 희석)를 함유한 ASPV 감염 샘플 및 적어도 4.7 ng/μL의 RNA(10-2 배 희석)를 함유한 ASGV 감염 샘플에서 일관된 양성 결과가 나타났다.On the other hand, RT-PCR reactions are consistent from one ASGV infected samples containing at least 1.92 ng / μL of RNA (10 -3 dilution) a ASPV infection samples, and at least 4.7 ng / μL of RNA (10 -2 dilution) containing A positive result was shown.
이러한 결과는, 특히 ASPV 검출에 있어서, RT-PCR 방법에 비해 RT-RPA 방법의 민감도가 10 배 더 높음을 의미한다.These results indicate that the sensitivity of the RT-RPA method is 10 times higher than the RT-PCR method, especially for ASPV detection.
실험예 4. 식물 잎 및 묘목(껍질)의 즙(액)에서 RT-RPA 반응 가부 확인Experimental Example 4. Confirmation of RT-RPA reaction in the juice (liquid) of plant leaves and seedlings (shells)
상기 실험예 4의 결과를 바탕으로, ASPV1F/R 및 ASGV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 바이러스에 감염된 식물 잎 및 묘목(껍질)에서 즙을 내어 바로 RPA 반응을 진행하여 RT-RPA 반응 가부를 확인하고, 그 결과를 도 7a 및 7b에 나타내었다.Based on the results of Experimental Example 4, the ASPV1F / R and ASGV1F / R primer sets were extracted from virus-infected plant leaves and seedlings (shells) to proceed immediately with RPA reaction to confirm RT-RPA reaction. , The results are shown in FIGS. 7A and 7B.
도 7a 및 7b에서 확인할 수 있듯이, 식물 잎(도 7a, ASPV1F/R 프라이머 세트 한정) 및 껍질(도 7b) 모두에서 기존의 복잡하고 시간이 오래 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다.As can be seen in FIGS. 7A and 7B, both plant leaves (FIG. 7A, limited to ASPV1F / R primer set) and bark (FIG. 7B) were amplified at the expected size without conventional complex and time consuming RNA extraction processes. Confirmed.
이 증폭산물 또한 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 T-vector에 클로닝한 후 염기서열을 확인해본 결과, 각각 다른 분리주들과 96 및 97 %의 상동성을 보이는 것을 확인하여, ASPV 및 ASGV 바이러스가 맞음을 확인하였다(도 8a 및 도 8b 참조).This amplification product was also cloned into the T-vector in the same manner as in Experimental Example 2, and the nucleotide sequence was confirmed. As a result, it was confirmed that the homologous 96 and 97% homology with other isolates, respectively, ASPV and ASGV virus is correct Was confirmed (see FIGS. 8A and 8B).
소결Sintered
상기 내용을 종합한 결과, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용한 RT-RPA 방법은 RT-PCR 방법과 비교하여, ASPV 및 ASGV의 검출에 대한 높은 민감도와 특이성을 나타낸다.In summary, the RT-RPA method using the primer pair of the present invention shows high sensitivity and specificity for the detection of ASPV and ASGV as compared to the RT-PCR method.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer composition for recombinase polymerase amplification reaction for detecting pear viruses and use thereof <130> PN180139 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV1F <400> 1 Thr Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Gly Cys Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV1R <400> 2 Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Gly Cys Ala Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Ala Ala 20 25 30 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV1F <400> 3 Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Cys Thr 1 5 10 15 Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys Cys Cys 35 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV1R <400> 4 Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Ala Gly Thr 1 5 10 15 Gly Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Thr Ala 35 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV2F <400> 5 Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Thr Thr 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Ala Thr Gly Cys 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV2R <400> 6 Thr Thr Ala Ala Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys Cys 1 5 10 15 Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly Ala Ala Cys Ala 20 25 30 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV2F <400> 7 Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr 1 5 10 15 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr 20 25 30 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV2R <400> 8 Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Thr Cys Thr Thr 1 5 10 15 Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Cys 20 25 30 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV3F <400> 9 Gly Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr 20 25 30 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV3R <400> 10 Cys Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys Gly Thr 1 5 10 15 Thr Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys 20 25 30 <110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer composition for recombinase polymerase amplification reaction for detecting pear viruses and use <130> PN180139 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV1F <400> 1 Thr Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Gly Cys Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV1R <400> 2 Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Gly Cys Ala Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Ala Ala 20 25 30 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV1F <400> 3 Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Cys Thr 1 5 10 15 Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys Cys Cys 35 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV1R <400> 4 Ala Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Ala Gly Thr 1 5 10 15 Gly Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly 20 25 30 Gly thr ala 35 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV2F <400> 5 Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Thr Thr 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Ala Thr Gly Cys 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASPV2R <400> 6 Thr Thr Ala Ala Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys Cys 1 5 10 15 Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly Ala Ala Cys Ala 20 25 30 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV2F <400> 7 Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr 1 5 10 15 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr 20 25 30 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV2R <400> 8 Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Thr Cys Thr Thr 1 5 10 15 Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Cys 20 25 30 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV3F <400> 9 Gly Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr 20 25 30 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV3R <400> 10 Cys Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys Gly Thr 1 5 10 15 Thr Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys 20 25 30
Claims (10)
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물.A first primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; or
Composition for detecting a pear virus comprising a second primer set consisting of a forward primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
제 1 항의 조성물을 이용하여 시료로부터 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및
RPA 증폭산물을 분석하는 분석 단계.Method of diagnosing embryonic virus disease comprising the following steps:
An amplifying step of obtaining a Recombinase polymerase amplification (RPA) amplification product from a sample using the composition of claim 1; And
Analytical step to analyze RPA amplification products.
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