KR102144834B1 - 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법 - Google Patents

박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물, 키트 및 진단방법을 이용하는 경우, 기존의 까다롭고 시간이 오래 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, RT-PCR 방법 등에 비하여 보다 간편하고 신속하게 박과 작물 바이러스의 검출 및 박과 작물 바이러스병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법{Primer Set for recombinase polymerase amplification reaction and detecting Cucurbitaceae and Method for diagnosing Cucurbitaceae virus disease using the same}
본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.
전 세계적인 지구 온난화로 인하여 새로운 바이러스의 출현과 피해가 급증하고 있으며, 특히 식물 바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물의 생산량 및 품질 저하와 품종 퇴화 등 농업 생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다.
식물 바이러스 병은 곰팡이나 세균에 의한 다른 식물 병들과는 다르게 화학적 방제가 불가능하고, 소수의 친환경 방제 법이 있지만 효과는 크지 않은 문제가 있다. 그렇기 때문에 식물 바이러스 병은 방제보다는 신속한 진단으로 작물의 피해를 줄이고 병의 확산을 막는 것이 중요하다.
한편, 호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV) 및 수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV)는 오이와 같은 박과(Cucurbitaceae) 작물에서 광범위하게 발생하며, 수량과 물질에 미치는 피해가 크다.
호박 황화 모자이크 바이러스의 경우 초기에 잎이 얼룩얼룩해지며 후기에는 잎이 뒤틀리고 위축되는 병징과 과실에서는 울퉁불퉁해지고 세로줄 무늬가 생기는 병징이 나타나며, 수박 모자이크 바이러스에 감염된 오이는 잎의 모자이크, 엽맥 녹대 증상 및 과실의 표면에 울퉁불퉁한 기형모양이 형성됨으로써 작물의 품질과 상품성이 저하되는 특징이 있다.
기존에는 이러한 바이러스들을 검출 및 진단하기 위해 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR) 기법을 이용하였다. 그러나 PCR은 특별한 장비가 필요하고, 평균 90 분이라는 오랜 시간이 걸리기 때문에 신속한 검출 및 진단이 어렵다는 문제가 있다.
국내 공개특허 제10-2004-0047332호
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 및/또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법의 경우, RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 박과 작물 바이러스병 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병의 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트 및/또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법의 경우, RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능함을 규명하였다.
본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
상기 박과 작물은 오이, 수박, 호박, 참외 또는 멜론일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제1 프라이머 세트는 호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV) 검출용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 용어 "호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV)"는 박과 작물 바이러스병(누른모자이크병)의 원인균 중 하나로, ZYMV에 감염되면 잎맥 주위에 주름이 생기고, 잎맥과 잎맥 사이에 담녹색의 모자이크 병반이 나타나며, 그 외 부분은 황색으로 변한다. 과실에서는 기형과 모자이크 병반이 동반하여 나타난다.
상기 ZYMV는 본 발명의 제1 프라이머 세트에 의해 증폭되어 199 bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물을 통해 검출될 수 있다.
상기 제2 프라이머 세트는 수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV) 검출용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 용어 "수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV)"는 박과 작물 바이러스병(모자이크병)의 원인균 중 하나로, WMV에 감염되면 잎에 처음에는 황색반점이 나타나기 시작하여 다음에 새로 나오는 잎은 전면에 많은 황색반점이 나타난다. 병징이 진전되면 엽맥 주위에 주름이 생기고, 잎이 요철상태로 되어 돌출된 부분은 녹색으로 남아있고, 그 외 부분은 황색으로 변한다.
상기 WMV는 본 발명의 제2 프라이머 세트에 의해 증폭되어 140 bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물을 통해 검출될 수 있다.
상기 증폭은 예를 들어, 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인 할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단 할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 박과 작물 바이러스병 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병"은 바이러스의 감염에 의해서 박과 작물에서 발생하는 질병을 의미하며, 구체적으로는 누른모자이크병(Yellow mosaic) 및 모자이크병(Mosaic)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물은 누른모자이크병 진단 용도인 것일 수 있다.
상기 제2 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물은 모자이크병 진단 용도인 것일 수 있다.
상기 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물은 누른모자이크병 또는 모자이크병 진단 용도인 것일 수 있다.
상기 키트는 시료로부터 박과 작물 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있다.
상기 키트에는 상기 제1 프라이머 세트 및/또는 제2 프라이머 세트뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 및/또는 장치가 포함될 수 있다.
상기 시료는 예를 들어, 박과 작물의 종자(씨), 과실 또는 잎이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 키트는 RPA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 키트가 RPA 분석에 사용되는 경우, 별도로 cDNA를 수득할 필요 없이 시료로부터 바로 RPA 증폭산물을 수득하여 아가로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머 세트에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 배 바이러스병을 진단할 수 있다.
특히 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트의 경우, 각각의 프라이머 세트를 사용하는 진단이 별도로 수행될 수도 있고, 다수의 프라이머 세트를 하나의 반응에 혼합 사용하여 진단이 수행될 수도 있다.
상기 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 용기(예를 들어, 일회용 RPA 튜브 등)에 담겨 있는 동결 건조된(lyophilized) 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 키트가 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 경우 다수의 프라이머 세트가 혼합되어 RPA 튜브에 담겨 있을 수도 있고, 각각의 프라이머 세트가 개별적으로 각각의 RPA 튜브에 담겨 있을 수도 있다.
즉, 2 개의 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트의 경우, 제1 프라이머 세트 또는 제2 프라이머 세트 중 어느 하나의 프라이머 세트가 동결 건조 분말 형태로 담겨 있는 일회용 RPA 튜브가 진단용 키트에 포함될 수 있고, 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트가 동결 건조 분말 형태로 혼합되어 담겨 있는 일회용 RPA 튜브가 진단용 키트에 포함될 수도 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 하기의 단계를 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병의 진단방법에 관한 것이다.
상기 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출용 조성물을 이용하여 시료로부터 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및
RPA 증폭산물을 분석하는 분석 단계.
본 명세서에서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인 할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단 할 수 있는 장점이 있다.
상기 분석 단계에서 199 bp의 증폭산물을 수득한 경우 시료에 ZYMV가 감염되었다고 판정할 수 있고, 140 bp의 증폭산물을 수득한 경우 시료에 WMV가 감염되었다고 판정할 수 있다.
상기 시료는 예를 들어, 박과 작물의 종자(씨), 과실 또는 잎이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 프라이머 세트 또는 제2 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함한 박과 작물 바이러스 진단용 키트의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
한편, 감염된 박과 작물의 조직에는 페놀 화합물, 탄수화물, 안료 및 기타 알려지지 않은 화합물이 풍부하기 때문에, 이로부터 RNA를 분리하는 것은 매우 까다롭다.
하지만, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법은 기존의 까다롭고 오랜 시간이 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, 식물 잎에서 즙(액)을 내어 바로 반응을 진행함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 박과 작물 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA의 방법은 기존의 까다롭고 오랜 시간이 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 바로 RNA의 증폭이 가능하므로, 식물 잎에서 즙(액)을 내어 바로 반응을 진행함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 호박 황화 모자이크 바이러스(ZYMV)의 외피 단백질(CP)의 다중서열배치(multiple sequence alignment)를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 및 수박 모자이크 바이러스(WMV)의 외피 단백질의 다중서열배치를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV2F/R 및 WMV2F/R 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다(M: DNA 마커, Negative control: 건전한 오이 잎에서 추출한 RNA template).
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다(M: DNA 마커, Negative control: 건전한 오이 잎에서 추출한 RNA template).
도 3b는 호박 황화 모자이크 바이러스(ZYMV) 및 수박 모자이크 바이러스(WMV)에 감염된 오이 잎의 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용하여, 시간 경과(1, 3, 5, 10, 15, 20 및 30 분)에 따라 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용한 RT-RPA 반응 및 RT-PCR 반응 결과를 비교한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트를 이용하여, 오이 잎 즙(액)에서 RT-RPA 반응 결과를 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예. 프라이머 세트의 제조
우리나라 전남 나주 지역에서, 전형적인 박과 작물 바이러스병 증상을 보이는 오이를 선별하여 잎 샘플을 채취하였다.
IQeasy+ 식물 RNA 추출 미니 키트(iNtRON, Korea)를 사용하여 잎 조직에서 Total RNA를 추출하였다. 단일 호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV) 또는 수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV) 감염에 대해 양성인 샘플을 선택하여 RT-RPA 분석 템플릿으로 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관하였다.
상기 ZYMV 및 WMV 바이러스의 염기 서열(sequence)을 확보하고, 이를 바탕으로 보존되어 있는 염기서열 부분을 확인하였다.
보다 구체적으로, CBI Basic Local Alignment Search Tool로부터 확보한 ZYMV의 외피 단백질(coat protein; CP)의 염기서열(GenBank KX421104, AY279000, KY495596, KU318687, AB188115, JN861009, AJ420020, KR261951 및 EU561044)의 다중서열배치(multiple sequence alignment, 도 1a) 및 WMV의 외피 단백질의 염기서열(KT992080, JX079685, KP164988, JF273463, FJ823122, EU660579, AB218280, JN831650, JN597238 및 EU660582)의 다중서열배치(도 1b)에서, 고도로 보존된 영역을 선택하고 이를 이용하여 RT-RPA를 위한 프라이머 세트를 제작하였다.
제작한 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 명명 염기서열(5’-3’) 예상 앰플리콘 길이
(Expected amplicon length, nt)		 바이러스
1 ZYMV1F GGAGGCATATATAGAGATGAGAAATGCAGA 199 ZYMV
2 ZYMV1R AAACAACCTTGAAGAAACATTGCTAAGAGC
5 ZYMV2F AGTTTAGCACGATATGCTTTCGACTTCTA 121
6 ZYMV2R CAAACAACCTTGAAGAAACATTGCTAAGAG
3 WMV1F GAATTAGCACGCTATGCTTTTGACTTCTAC 140 WMV2
4 WMV1R GAGATATTGCCATCAAGTCCAAATAACCT
7 WMV2F CTAAGAAATTTGAGAGACAGGGAATTAGCA 185
8 WMV2R CTCTCAGTATTTTCGGAATTGGTCGAGATA
실험예 1. RT-RPA 반응 가부 확인
상기 제조예에서 제작한 프라이머 세트를 사용하여 RT-RPA(Twist Amp basic RT kit, TwistDx Limited)를 진행하였다.
보다 구체적으로, 마이크로 튜브에 480 nM RT-RPA 프라이머 세트, 280 mM 마그네슘 아세테이트 및 주형가닥 1 μL를 넣고(총 부피 50 μL), 42 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. RPA 생성물은 에티듐 브로마이드(EtBr)를 함유하는 3 % 아가로오스 겔 상에 전기영동 하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, ZYMV1F/R 및 WMV1F/R 프라이머 세트, 및 ZYMV2F/R 및 WMV2F/R 프라이머 세트 모두 증폭 결과물이 정상적으로 생성되었다.
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트를 이용하여 추가 실험을 진행하였다.
보다 구체적으로, 마이크로 튜브에 480 nM RT-RPA 프라이머 세트, 280 mM 마그네슘 아세테이트 및 주형가닥 1 μL를 넣고(총 부피 50 μL), 42 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. RPA 생성물은 에티듐 브로마이드(EtBr)를 함유하는 3 % 아가로오스 겔 상에 전기영동 하였다.
도 3a에서 확인할 수 있듯이, ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트 모두 예상된 사이즈에서 증폭 결과물이 정상적으로 생성되었으며, 음성 대조군에서는 증폭 결과물이 생성되지 않았다.
실험예 2. RT-RPA 반응의 최적 시간 확인
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 반응 시간을 1, 3, 5, 10, 15, 20 및 30 분(t)으로 설정하고 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 RT-RPA를 진행하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 모든 프라이머 세트에서 10 분만 반응하였을 때부터 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다.
실험예 3. RT-RPA 반응의 민감성 확인
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 기존의 PCR 방법과 RPA 방법을 비교하였다.
보다 구체적으로, ZYMV 및 WMV가 감염된 오이 잎에서 Total RNA를 추출하고, 각각 10 배씩 차례대로 희석하여 RT-PCR 및 RT-RPA 반응을 진행하였다. RT-RPA 반응은 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 진행하였으며, RT-PCR은 다음과 같이 진행되었다:
단계 1, 50 ℃에서 30 분;
단계 2, 95 ℃에서 5 분;
단계 3, 30 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 56 ℃, 40 초 동안 72 ℃의 35 사이클;
단계 4, 72 ℃에서 5 분.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 모든 프라이머 세트에서 RT-RPA 반응(10 분 소요)은 RT-PCR 반응(2 시간 소요)과 비슷한 민감도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는, 본 발명의 RT-RPA 방법의 민감도가 RT-PCR 방법과 유사한 민감도를 보이면서도 시간은 최소 1/12로 단축시킬 수 있음을 의미한다.
실험예 4. 식물 잎의 즙(액)에서 RT-RPA 반응 가부 확인
ZYMV1F/R 프라이머 세트, WMV1F/R 프라이머 세트 및 ZYMV1F/R+WMV1F/R 프라이머 세트에 대하여, 바이러스에 감염된 식물 잎에서 즙을 내어 바로 RPA 반응을 진행하여 RT-RPA 반응 가부를 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, 기존의 복잡하고 시간이 오래 소요되는 RNA 추출 과정 없이도 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다.
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Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트;
    서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트; 또는
    이의 혼합물;
    을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스 검출을 위한 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA)용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 박과 작물은 오이, 수박, 호박, 참외 및 멜론으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 프라이머 세트는 호박 황화 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus; ZYMV) 검출용 프라이머 세트인 것인, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 프라이머 세트는 수박 모자이크 바이러스(Watermelon mosaic virus; WMV) 검출용 프라이머 세트인 것인, 조성물.
  5. 제 1 항의 조성물을 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병 검출용 키트.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 박과 작물 바이러스병은 누른모자이크병(Yellow mosaic) 및 모자이크병(mosaic)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것인, 키트.
  7. 하기의 단계를 포함하는 박과(Cucurbitaceae) 작물 바이러스병의 검출방법:
    제 1 항의 조성물을 이용하여 시료로부터 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및
    RPA 증폭산물을 분석하는 분석 단계.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 박과 작물은 오이, 수박, 호박, 참외 및 멜론으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 박과 작물 바이러스병의 검출방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 박과 작물 바이러스병은 누른모자이크병(Yellow mosaic) 및 모자이크병(mosaic)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것인, 박과 작물 바이러스병의 검출방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 분석 단계는 RPA 증폭산물 중 199 bp의 증폭산물의 포함여부를 확인하는 것인, 박과 작물 바이러스병의 검출방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 분석 단계는 RPA 증폭산물 중 140 bp의 증폭산물의 포함여부를 확인하는 것인, 박과 작물 바이러스병의 검출방법.
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