KR102108916B1

KR102108916B1 - 피부 생기 부여 및 활력 증대를 위한 식물세포 컴플렉스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102108916B1
Application number: KR1020180133524A
Authority: KR
Inventors: 모상현; 이정훈; 서효현; 김수윤; 김혜인; 박정곤; 류승환
Original assignee: (주)바이오에프디엔씨
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2020-05-13
Also published as: CN111202708B; CN111202708A; KR20200026646A

Abstract

본 발명은 식물세포 배양물 추출물/여과물을 컴플렉스로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물, 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 추출물, 라벤더잎 세포추출물, 중국체이스트트리잎세포 추출물, 연꽃잎세포배양가루, 몰약잎세포추출물, 아라비안자스민잎세포추출물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유함으로써, 피부의 생기부여, 피부의 활력 증진, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 탄력 증진, 개선, 피부 수렴, 피부 장벽 기능 보호, 자외선으로부터의 피부 보호, 아토피, 항염, 항산화, 항노화 등의 기능을 가진 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

피부 생기 부여 및 활력 증대를 위한 식물세포 컴플렉스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Improving Skin Condition Comprising Plant cell complex cultures to improve skin radiance and vitality}

본 발명은 식물세포 컴플렉스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물, 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 피부 생기 부여, 피부 활력 증대, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 탄력 증진, 개선, 피부 수렴, 피부 장벽 기능 보호, 자외선으로부터의 피부 보호, 항산화, 항노화 등의 기능을 가진 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 연구를 통해 일주기 리듬을 관장하는 생체시계(biological clock) 분자 네트워크가 규명되었다. 지구가 자전하며 생기는 낮과 밤의 하루 주기에 맞추어 생물체의 생리 대사 및 신체 리듬과 관련한 유전자들의 발현이 조절된다는 생체시계가 1970년대 이래 점차 자세히 밝혀지면서, 일주기와 관련한 질병 연구도 활발해지고 있다. 제프리 홀(Jeffrey C. Hall) 미국 메인대학 교수, 마이클 로스배시(Micheal Rosbash) 브랜다이스대학 교수, 마이클 영(Michael W. Young) 록펠러대학 교수는 모델동물인 초파리를 통해 낮과 밤의 24시간 주기로 나타나는 일주기성 유전자들의 작동 메커니즘을 규명한 공로를 인정받아 2017년 노벨상 수상의 영예를 얻었다. 이번 수상자들은 생체시계와 관련한 유전자의 존재가 처음 확인된 이후인 1980년대에 관련 유전자들을 잇따라 찾아내어 그 생체시계의 기본 메커니즘을 밝혀냈다. 이들 생체시계 유전자의 분자 네트워크에는 낮과 밤의 변화에 적응하면서 발달한 시계 유전자가 있다. 'CLOCK(Clock circadian regulator)', 'PER1(Period circadian protein)' 등으로 불리는 시계 유전자들은 소뇌나 중뇌, 시상하부 같은 뇌 조직뿐 아니라 심장이나 폐, 지방, 혈관, 신장 같은 장기들에 존재하고 있다.

이들의 연구에 힘입어, 생체주기가 피리오드(period)라는 유전자가 발현하는 단백질(PER)의 농도가 24시간 주기로 변화하면서 일어나는 생물학적인 현상임이 밝혀졌다. 피리오드 유전자에 의해 생성되는 PER 단백질이 늘어나 세포핵 바깥 세포질에 계속 축적되다 보면 PER 단백질은 이제 다른 효소와 결합해 세포핵 안으로 들어가 피리오드 유전자의 발현을 억제한다. 이처럼 생계시계의 주기는 PER 단백질의 농도가 높아졌다가 낮아지는 분자적 진동으로 나타난다는 것이다. 이후에 이런 기본 메커니즘의 안정성과 기능성을 조절하는 또 다른 유전자(단백질)들이 잇따라 발견되면서, 정교하고 세밀하게 조절되는 '생체시계'의 메커니즘이 알려지게 됐다. 이 단계에서 CLOCK과 BMAL1 단백질의 이합체가 전사인자로서 그 하위 단계에 위치하는 피드백 유전자들인 Period (PER) 및 Cryptochrome (CRY) 계열의 유전자들의 발현을 촉발하고, 그 유전자 산물들이 상위 단계 전사 인자들을 불활성화 시키는 일련의 분자적 순환 구조를 이룬다. 이들 분자 네트워크는 하위에 조절 받는 유전자들의 일주기성을 촉발함으로써 다양한 생리과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Stratmann and Schibler, 2006, J Biol Rhythms 21: 494). 즉, CLOCK/PER 단백질의 연관된 피드백을 통해 생체의 리듬이 매일 반복되도록 조절하여 생체시계를 작동시킨다.

피부세포인 각질세포, 멜라닌세포, 섬유아세포에도 독립적인 생체시계 시스템이 존재한다. 피부 생체시계는 피부 생리활성을 조절하는데, 피부세포증식 및 분화, 수화(hydration)와 수분손실(transepidermal water loss, TEWL), 모세혈관 혈류, 피지생성, 온도, 표면 pH, 주름형성이 일주기 리듬을 보인다. 이러한 과정의 리듬이 깨지게 되면, 정확한 시간에 필요한 생리학적 반응을 일으키지 못하게 되면서, 피부의 항상성이 깨지고, 피부노화를 촉진하게 되며, 심각하게는 피부암을 유발할 수도 있다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 된다. 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 트러블이 자주 발생하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

피부 노화 현상이 진행되면 각질형성세포 및 섬유아세포의 분열 감소, 콜라겐 합성의 감소, MMP 생성의 증가, 멜라닌 생성의 신호 전달 증가 등이 발생하게 되고, 이로 인하여 주름은 증가하게 되고 피부의 탄력은 감소하며, 기미, 주근깨 및 검버섯 등은 증가하게 된다. 특히, 40대 전후로 호르몬의 균형이 깨져 세포 재생 능력, 콜라겐의 합성 능력, 피부 보습에 중요한 각질층의 수분 함유량이 유의하게 저하된다. 이는 각질층 지질구성 성분의 감소, 자연보습인자의 감소, 건조피부 임상 glycerol 양의 감소 등이 그 원인으로 제시되고 있다. 결국 노화 피부에서는 하부 표피로부터 각질층까지 공급되는 수분량이 부족하여 피부 건조가 심해지고 이로 인해 염증과 소양증이 쉽게 발생하게 된다. 반면, 피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기안하는데 보통 피부에서 type I 콜라겐의 합성과 그 분해 효소인 MMP-1이 균형을 이루고 있다. 그러나 광노화된 피부에서는 type I, III 콜라겐의 합성이 저하되고, MMP-1의 활성이 증가된다. 이러한 MMPs (matrix metalloproteinases)는 단백분해효소로 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 기능을 나타내며 정상적인 상태에서는 상처치유나 조직재생과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은, 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 주름개선, 피부 재생, 피부 장벽 기능 강화, 주름개선 등 다양한 기능성을 가진 소재를 발굴하고자 예의 노력한 결과, 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물, 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 추출물, 라벤더잎 세포추출물, 중국체이스트트리잎세포 추출물, 연꽃잎세포배양가루, 몰약잎세포추출물, 아라비안자스민잎세포추출물이 생체시계 조절 효과를 가짐을 밝히고, 다양한 기능성 화장료 소재가 될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물, 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 추출물, 라벤더잎 세포추출물, 중국체이스트트리잎세포 추출물, 연꽃잎세포배양가루, 몰약잎세포추출물, 아라비안자스민잎세포추출물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물, 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 추출물, 라벤더잎 세포추출물, 중국체이스트트리잎세포 추출물, 연꽃잎세포배양가루, 몰약잎세포추출물, 아라비안자스민잎세포추출물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물, 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 추출물, 라벤더잎 세포추출물, 중국체이스트트리잎세포 추출물, 연꽃잎세포배양가루, 몰약잎세포추출물, 아라비안자스민잎세포추출물 중 어느 하나 이상 및 이의 제조방법, 상기 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 일 관점에서, 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물, 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 추출물, 라벤더잎 세포추출물, 중국체이스트트리잎세포 추출물, 연꽃잎세포배양가루, 몰약잎세포추출물, 아라비안자스민잎세포추출물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 캘러스 배양물 또는 그 추출물은 그 함량에 제한없으나, 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 유효성분이 되는 각 식물세포들의 각각의 식물에 대한 설명은 다음과 같다.

(1) 에델바이스 캘러스 배양 추출물, Leontopodium Alpinum Callus Culture Extract, 高山火草（LEONTOPODIUM ALPINUM）

에델바이스는 국화과에 속하는 식물로 알프스를 포함한 유럽과 아시아의 고산지대에 서식한다. 높이 10∼20cm 이며, 전체적으로 흰 면모가 덮여 있다. 잎은 뿌리에서 비교적 많이 나오고 줄기에 약간 있으며 선형이다. 줄기 끝에 포가 모여 달려서 사방으로 퍼지고 중앙에 약간의 두상화가 달린다.

(2) 씨사이드에링고 캘러스 배양 여과물, Eryngium Maritimum Callus Culture Filtrate, ERYNGIUM MARITIMUM

씨사이드에링고 속명의 Eryngium은 옛 그리스명 'eryggion'으로 본 속의 어느 종에 붙여진 이름에서 유래했다. 높이 60cm 정도 자라는 2년초 또는 다년초다. 상부의 가지는 많이 갈라진다. 아래쪽 잎은 원상 심장형으로 3~5개로 갈라져 침상 거치(鋸齒)가 있다. 상부의 잎은 엽병(葉柄)이 없으며 줄기를 감싼다. 포는 약 6개가 있고 약간 넓은 난원형으로 거치(鋸齒)가 양측에 2~3개 있다. 끝에 침상으로 된다. 꽃은 여름부터 가을까지 피며 화서(花序)는 둥글고 금속성의 연한 자색이 난다.

(3) 록샘파이어캘러스배양여과물 Crithmum Maritimum Callus Culture Filtrate

록샘파이어는 미나리목 미나리과에 속하는 식용 가능한 야생식물로 주로 유럽 청정 해변가의 바위틈에서 서식하는 특수한 염생 식물로 물보라, 높은 염도, 온도와 바람 등에 대한 저항력을 가지고 있는 극한 식물이다. 꽃은 줄기 끝에 모여서 자라나며 녹황색에 크기가 작고 다섯 개의 꽃잎을 가지고 있다. 식물이 부러졌을 때는 향긋한 레몬향을 맡을 수 있다. 수세기 동안 식재료로는 물론 약용으로도 활용되었는데 씨앗, 뿌리, 잎을 와인에 넣어 마시면 황달과 요로 통증에 도움을 준다고 하였으며, 비타민 C의 부족으로 인한 괴혈병에도 효과가 있어 잎과 씨앗을 피클로 만들어 항해에 가지고 가기도 하였다.

(4) 사과세포배양추출물, Malus Domestica Fruit Cell Culture Extract, MALUS DOMESTICA

쌍떡잎식물 장미목 장미과 낙엽교목 식물인 사과나무의 열매는 지름 5∼정도의 둥근 모양으로 빛깔은 보통 붉거나 노랗다. 원산지는 발칸반도로 알려져 있다. 알칼리성 식품으로, 칼로리가 적고 몸에 좋은 성분이 많이 들어있다. 식이섬유는 혈관에 쌓이는 유해 콜레스테롤을 몸밖으로 내보내고 유익한 콜레스테롤을 증가시켜 동맥경화를 예방해준다.

(5) 포도세포추출물, Vitis Vinifera (Grape) Fruit Cell Extract, 葡萄（VITIS VINIFERA）

포도는 살과 수분이 많고 안에 씨가 있는 장과로, 7~8월에 검은 빛으로 익는다. 원산지는 아시아 서부의 흑해연안과 카프카 지방으로 알려져 있으며, 우리 나라에는 고려 시대의 문집에서 그에 관한 기록이 나타나고 있다.

(6) 사막장미잎세포추출물, Adenium Obesum Leaf Cell Extract, ADENIUM OBESUM

쌍떡잎 상록관목으로 열대 아프리카와 아라비아 지역 등 사막 기후에서 볼 수 있는 다육식물 중 하나이다. 꽃 이름은 자생지의 한 곳인 예멘의 지역 중 아덴(Aden)에서 유래하며, 꽃이 장미처럼 예쁘다고 하여 '사막의 장미(Desert Rose)'라고 한다.

(7) 라벤더잎세포추출물, Lavandula Angustifolia (Lavender) Leaf Cell Extract, 薰衣草（LAVANDULA ANGUSTIFOLIA）

속명의 Lavandula는 "씻다"라는 뜻의 라틴어에서 유래하는데, 이것은 로마 사람들이 목욕이나 세탁시에 라벤더를 물에 넣는 것을 좋아했기 때문이다. 꽃줄기에 자색 별모양의 작은꽃이 피는 꿀풀과의 다년생 식물로 꽃·잎·줄기를 덮고 있는 털들 사이에 향기가 나오는 기름샘이 있어 정유를 생산한다.

(8) 중국체이스트트리잎세포추출물, Vitex Negundo Leaf Cell Extract, VITEX NEGUNDO

유럽 남부산의 마편초속의 관목으로 잎은 털 모양으로 무성하게 나고, 향기 나는 엷은 청자색 꽃이 핀다.

(9) 연꽃잎세포배양가루, Nelumbo Nucifera Leaf Cell Culture Powder, NELUMBO NUCIFERA

연은 아시아 남부와 오스트레일리아 북부가 원산지이다. 진흙 속에서 자라면서도 청결하고 고귀한 식물로, 여러 나라 사람들에게 친근감을 주어 온 식물이다. 뿌리줄기는 굵고 옆으로 뻗어가며 마디가 많고 가을에는 특히 끝부분이 굵어진다. 꽃은 7∼월에 피고 홍색 또는 백색이며 꽃줄기 끝에 1개씩 달리고 지름 15∼이며 꽃줄기에 가시가 있다. 꽃잎은 달걀을 거꾸로 세운 모양이며 수술은 여러 개이다. 꽃받침은 크고 편평하며 지름 10cm 정도이고 열매는 견과이다. 종자가 꽃받침의 구멍에 들어 있다.

(10) 몰약잎세포추출물, Commiphora Myrrha Leaf Cell Extract, COMMIPHORA MYRRHA

몰약은 미르라(myrrha)라고도 한다. 담황색 또는 암갈색의 크고 작은 덩어리 물질로, 몰약은 감람나무과의 몰약수 또는 합지수에서 얻은 고무수지로 한약재이다.

(11) 아라비안자스민잎세포추출물, Jasminum Sambac (Jasmine) Leaf Cell Extract, JASMINUM SAMBAC

인도가 원산지로 중국, 타이완, 필리핀, 인도, 인도네시아 등지에 열대와 아열대 지방에 주로 분포하고 있다. 잎은 마주나거나 개씩 돌려나고 타원형이거나 넓은 달걀 모양이다. 가장자리가 밋밋하고 끝이 뾰족하며 윤이 난다.

본 발명에 있어서, 상기 각각의 시료들은 식물세포 배양물, 추출물, 여과물 등의 형태로 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, '캘러스(callus)'는 식물체에 상처가 났을 때, 세포가 분열 능력을 회복하여 상처를 막고 비대하여 지는 유상조직으로, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상처 부위를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 미분화 조직 또는 세포덩어리를 말하는 것으로서, 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식을 할 수 있다. 이러한 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있으며, 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다. 즉, 식물체내의 세포는 증식하면 즉시 방향이 정해져서 특정한 조직뿐 만 아니라 기관으로 규칙적으로 조립되어 간다. 그러나, 조직배양을 통해 형성된 미분화 세포 덩어리인 캘러스는 외부로부터 다양한 식물 성장 호르몬 등의 자극을 주게 되면 그때까지 유지되어 왔던 통제가 해제되어 세포가 제멋대로 증식하는 것으로 해석된다.

탈분화에 의해 얻어진 캘러스를 같은 조성을 가진 액체배지에 넣어서 진탕 배양하면 세포는 따로 떨어져 현탁 상태로서 증식을 계속한다. 이 캘러스나 배양세포는 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식할 수 있게 되어 완전 식물체가 노화해서 죽어가는 분화세포와는 본질적으로 차이가 있다. 몇 세대 정도 계대 배양한 캘러스 또는 배양세포를 다양한 식물 성장 호르몬을 제거한 고형 배지에 도포해두면 눈과 뿌리가 나와서 개체 식물이 복원된다. 이 재생식물은 한 개의 배양세포의 분열증식에서 유래한 것이며, 그 배양세포의 근원을 말하면 배축이나 수조직에서 유도한 것이다.

본 발명에 있어서, "캘러스"는 식물의 어느 부위로부터 유도된 것이든 모두 가능하나, 일 구체예로, 꽃잎, 꽃받침, 열매, 씨방, 태좌 조직의 일부이거나, 종자의 발아된 유묘로부터 자엽을 절취하여 유도시킨 캘러스일 수 있다.

본 발명에 있어서, "캘러스 배양물" 또는 "식물세포 배양물" 또는 "식물세포 캘러스 배양물"은 캘러스를 배지에 배양시킨 것이다. 상기 배지는 기술분야에서 캘러스 배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부수렴용, 주름개선용, 피부 장벽강화 또는 개선용, 피부 재생, 보습, 탄력 유지, 피부 장벽기능 보호, 개선, 항염, 아토피, 항산화, 항노화, 모공수축, 피지억제, 여드름개선 등 다양한 피부 활성 개선 기능을 포함한다.

본 발명은 식물세포 컴플렉스 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 화장료 조성물의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 각각의 식물 조직으로부터 세포를 분리하여 캘러스 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 각각의 식물세포 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 각각의 식물세포 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 캘러스 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 캘러스 배양물의 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 태좌조직 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 화장료 조성물로써 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 수렴, 피부 장벽 강화, 개선, 주름 개선을 비롯한 항노화에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 화장료 조성물로써 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성, 엘라스틴 증가, 피부수렴, 주름 개선, 피부장벽 강화, 개선, 모공수축, 피지억제, 여드름 개선, 미백, 항염 등의 기능성을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 피부 수렴 작용의 원리는 피부 단백질의 고분자 플라보노이드(flavonoids)와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있으며, 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다. 또한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈의 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과 정도를 판단할 수 있다. 이러한 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하고 그 결과 국소를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 할 수 있다. 이러한 피부에 대한 수렴 작용에는, 화학적 수렴작용과 물리적 수림작용의 두 가지로 구분되며, 화학적 수렴작용은 탄닌과 같이 단백질 응고작용을 하는 물질에 의해 땀샘과 모공이 일시적으로 수축 되는 것을 말한다. 반면에 물리적 수렴작용은 차가운 물을 피부에 사용하거나 에탄올의 휘발로 피부의 온도를 저하시켜 땀샘과 모공을 일시적으로 수축시키는 것을 말한다.

또한, 이러한 피부 수렴은 여름철 같은 경우나 스트레스로 인해서, 피지가 더 많이 생기다보면 피부 트러블이 발생하고, 피부 트러블이 일어난 부위는 점점 더 빨개지게 되는데, 피부 진정이란 이러한 피부 트러블을 완화시키는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 피부 장벽 보호 기능에 있어서, 피부장벽(skin barrier)은 표피의 최외곽 층인 각질층(stratum corneum)은 주로 무핵의 편평한 각질세포(corneocyte)로 이루어져 있다. 정상적인 표피세포의 분열 및 분화과정을 통해 유지되는 피부장벽의 각질세포가 합성하는 세라마이드, 콜레스테롤, 및 지방산과 같은 세포간 지질로 형성된 다층지질막(multi lamella lipid layer)는 피부 내의 수분이 증발하지 않도록 방어막 역할을 한다. 한편, 이들 세포간 지질 중 오메가 히드록시 세라마이드는 각질세포(corneocyte) 외곽층의 단백질인 인볼루크린(involucrin)과 화학적 공유결합으로 연결되어 각질세포지질막(corneocyte lipid envelope, CLE)을 형성함으로써 다층 지질막 형태의 세포간 지질을 물리적으로 안정화시키는 역할을 하여 장벽기능을 강화시키는 역할을 하게 된다.

본 발명의 조성물은 피부도포를 통해 각질층에 전달되어 각질세포의 분화를 촉진시켜, 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 효과가 있을 뿐 아니라, 피부장벽 손상을 회복시키는 효과가 우수하여 피부장벽의 손상에 의해 유발되는 피부질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 상기 피부장벽 손상에 의해 유발되는 피부질환 으로는 아토피 피부염(atopic dermatitis), 피부건조증(xeroderma),건선(psoriasis), 어린선(ichthyosis), 여드름 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 피부 장벽 보호 기전은 밀착연접 구성 단백질인 occludin과 claudin-1의 단백질량 증가를 통해 확인하였다. Filaggrin은 각질형성세포가 분화단계에서 발현시키는 여러 구조 단백질 중 하나로 표피의 기저층으로부터 각질층까지 분화가 이루어지도록 하는데에 관여하며, 피부 조직의 수분유지에 필수적인 천연보습인자(Natural moisture factor, NMF)의 주체를 이루기도 해 피부의 수분 유지 및 피부막기능의 주요한 지표로 사용되는데, 본 발명에 따른 식물세포 컴플렉스 캘러스 배양물은 필라그린의 유전자 발현이 월등히 증가됨에 따라 우수한 피부 장벽 보호, 강화, 개선 기능을 가질 수도 있다.

아울러, 본 발명에 따른 식물세포 컴플렉스 캘러스 배양물 또는 그 추출물은 자외선 조사에 따른 피부 보호용으로도 활용 가능하다.

또한 본 발명에 따른 식물세포 컴플렉스 캘러스 배양물 또는 그 추출물은 엘라스틴 발현 증가능을 가진다. 엘라스틴(Elastin)은 결합조직의 세포외기질에 존재하는 구조물질이며, 피부에 존재하여 탄성을 부여하는 물질이다. 엘라스틴은 트로포엘라스틴(Tropo elastin)이라는 폴리펩타이드로 세포에서 합성된 다음 세포외에서 트로포엘라스틴간의 교차결합으로 생성된다. 따라서 엘라스틴은 트로포엘라스틴의 교차결합에 의하여 2차 또는 3차원적인 탄성을 가지게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 식물세포 컴플렉스 캘러스 배양물 또는 그 추출물은 피부 탄력 증진, 개선용으로 활용 가능하다.

따라서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 특히, 프로콜라겐 증가, 콜라겐 생합성 증가능을 가지고 있어, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선/방지용으로 적용될 수 있으며, 이외에도 엘라스틴 발현 증진에 따른 피부 탄력 증진, 피부장벽 강화, 개선용 으로 적용될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 에델바이스, 씨사이드에링고, 록샘파이어, 사과, 포도, 사막장미잎, 라벤더잎, 중국체이스트트리잎, 연꽃잎, 몰약잎, 아라비안자스민의 각각의 식물 조직으로부터 캘러스를 유도 및 배양하는 단계; 및 (b) 상기 각각의 식물세포 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 식물세포 컴플렉스 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 캘러스 유도 및 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 각각의 캘러스 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 화장료 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 화장료 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 각각의 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나,

(a)단계에서 얻어진 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 유효성분인 캘러스 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

또한, 종래에 잘 알려져 있는 생리활성성분이나 다른 식물세포 배양물 또는 추출물을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌외 또는 수세미 또는 돌외/수세미 잡종의 식물세포 배양물 또는 식물세포 배양 추출물 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 화장료 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 제조할 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 식물세포 컴플렉스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 주름개선, 피부 재생, 피부 장벽 기능 보호, 자외선으로부터의 피부 보호, 아토피, 항염, 항산화, 항노화 등의 기능을 가진 화장료 조성물로써, 다양한 기능성 화장품의 소재로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 식물세포컴플렉스 조성물의 독성 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 식물세포컴플렉스 조성물의 피부 장벽 관련 유전자의 mRNA 발현율을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 식물세포컴플렉스 조성물의 주름개선효과를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 식물세포컴플렉스 조성물의 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 식물세포컴플렉스 조성물의 미백 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 식물세포컴플렉스 조성물의 자외선으로부터의 보호 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 식물세포컴플렉스 조성물의 생체시계 조절 관련 유전자 발현 시험 결과를 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 식물세포 컴플렉스 조성물 제조

실시예 1-1: 식물 시료 11종의 표면소독

본 발명에 따른 세포를 생산을 위하여 에델바이스, 씨사이드에링고, 록샘파이어, 사과, 포도, 사막장미잎, 라벤더잎, 중국체이스트트리잎, 연꽃잎, 몰약잎, 아라비안자스민잎을 준비하고, 표면을 살균하기 위하여, 70 % 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 % 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하였다.

실시예 1-2: 시료 11종으로부터 식물 세포 유도

1) 살균된 에델바이스 잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 1 mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대배양은 2주 간격으로 수행하였다.

2) 살균된 씨사이드에링고 잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 50 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 5 mg/L 제아틴(Zeatin), 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

3) 살균된 록샘파이어 잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 5 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 10 mg/L 제아틴(Zeatin), 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

4) 살균된 사과잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 5 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 10 mg/L 제아틴(Zeatin), 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

5) 살균된 포도 잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 0.1 mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

6) 살균된 사막장미 잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 0.5 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 1 mg/L 제아틴(Zeatin), 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

7) 살균된 라벤더 잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 0.1 mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

8) 살균된 중국체이스트트리잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 0.5 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 1 mg/L 제아틴(Zeatin), 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

9) 살균된 연꽃잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 1 mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3 mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 1/2 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

10) 살균된 몰약잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 0.5 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 1 mg/L 제아틴(Zeatin), 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

11) 살균된 아라비안자스민잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 0.5 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 1 mg/L 제아틴(Zeatin), 3% Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대 배양은 2주 간격으로 수행하였다.

실시예 1-3: 본 발명에 따른 식물세포 배양 및 대량생산

무균적으로 계대 배양을 통하여 배양된 에델바이스, 씨사이드에링고, 록샘파이어, 사과, 포도, 사막장미잎, 라벤더잎, 중국체이스트트리잎, 연꽃잎, 몰약잎, 아라비안자스민잎의 세포는 이후, 생물반응기를 이용하여 agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 습도 70 %, 공기공급량 0.1 vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양 및 증식하여 대량생산하였다.

실시예 1-4: 본 발명에 따른 식물세포 콤플렉스 추출물 제조

배양하여 얻은 11가지 식물세포들은 각각 수확되어 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조하였다. 본 발명에 따른 조성물을 수득하기 위하여 에델바이스 식물세포 40 g, 씨사이드에링고캘러스 20 g, 록샘파이어캘러스 20 g, 사과캘러스 20 g, 포도캘러스 40 g, 사막장미잎캘러스 40 g, 라벤더잎캘러스 40 g, 중국체이스트트리잎캘러스 20 g, 연꽃잎캘러스 40 g, 몰약잎캘러스 20 g 및 아라비안자스민잎캘러스 20 g 들을 정제수로 충분히 세척한 후 혼합하였다. 열탕증류기에서 20 L의 정제수를 이용하여 8~48시간 동안, 80~100℃로 가열하여 캘러스 콤플렉스의 열수 추출물을 수득하였다. 수득된 조성물을 12000 rpm에서 4℃30분간 원심분리하여 불용성 고형분을 제거하고, 상등액을 캘러스 콤플렉스 추출물로 획득하였다.

실험예 1: 세포생존율에 미치는 영향 시험

본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 식물세포 컴플렉스 추출물에 대한 세포의 증식 활성을 알아보았다.

이를 위해, 먼저 HaCaT (human keratinocyte, 각질형성세포)과 Detroit551 (human fibroblast, 섬유아세포)를 10 % FBS가 함유된 DMEM 배지로 96 well plate에 분주하고 5 % CO₂, 37 ℃의 조건인 항온기에서 24 시간 배양하였다. 24시간 후, 식물세포 컴플렉스 추출물의 최종 0.5, 1, 2 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 5 mg/mL MTT 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, spectrophotometer를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

피부 세포의 생존율 정도는 정제수를 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였고, 결과는 도 1과 같이 나타났다.

[수학식 1] 세포생존율(%) = [(실험군 흡광도 - 대조군 흡광도)/대조군 흡광도] × 100

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물은 처리 농도 내 세 종류의 피부세포주에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

실험예 2: 항산화 효과 ( ABTS Radical Scavenging Activity)

ABTS radical을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법을 변형하여 측정하였다.

1.0 mM의 AAPH(2,2'-azo-bis 2-amidinopropanedeihydrochloride)는 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68 ℃의 항온조에서 12분 동안 반응시켰다. 최종농도 0.5, 1, 2, 5 %가 되도록 식물세포 콤플렉스 추출물 20㎕ 와 980㎕ ABTS 용액을 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox 0.1 % 을 사용하였다. ABTS radical 소거능은 다음의 수학식에 따라 계산하였다.

[수학식]

처리 물질	ABTS 라디칼 소거능 ( % )
대조군	0
Trolox 0.1 %	52.67
식물세포 콤플렉스 추출물 0.5 %	31.33
식물세포 콤플렉스 추출물 1 %	34.67
식물세포 콤플렉스 추출물 2 %	47.33

그 결과 상기 표에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물은 처리 농도 내 ABTS 라디칼의 소거능에 따른 항산화 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 3: 피부 장벽 개선 유전자 발현 시험

본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 식물세포 콤플렉스 추출물의 피부 장벽 개선 효능을 살펴보기 위하여, 수분/glycerol 수송체인 AQP3와 자연보습인자로 알려진 FLG의 발현양 변화를 조사하였다.

HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지와 함께 시험 물질인 식물세포 콤플렉스 추출물을 최종 농도 1 %이 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. AQP3와 FLG의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37℃ 15분, 50℃ 5분, 95℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect®primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, AQP3; Cat. QT00212996, FLG; Cat. QT02448138)이며 시료의 AQP3, FLG의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 되어 비교하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 %를 처리한 세포에서는 AQP3과 FLG의 mRNA 발현률이 증가하여 피부 장벽 개선에 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 4: 피부 재생 및 주름 개선 효과 시험

본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 식물세포 콤플렉스 추출물의 피부 재생 및 주름 개선 효과를 살펴보기 위하여, 콜라겐 분해 관련 효소인 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)와 콜라겐의 합성의 전구체인 프로콜라겐(Procollagen Type I C-Peptide, PIP)의 생합성양을 측정하였다.

<4-1> MMP-1 생합성 측정

Detroit551 세포를 48 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지와 함께 시험 물질인 식물세포 콤플렉스 추출물을 최종 농도 1 %이 되도록 세포에 처리하고, 48시간 동안 추가 배양하였다.

상기 과정을 통해 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 100 μL를 취해 MMP-1 Biotrak Activity Assay Kit(Amersham, Cat. RPN2629) 내 MMP-1 표준물질 100 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 25 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 antiserum을 첨가하고 25 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 후 용액을 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 각 well에 첨가하고, 25 ℃에서 1시간 동안 추가 반응시켰다. 또한 용액을 제거한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후, 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 넣은 뒤 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 MMP-1의 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 MMP-1 양을 산정하였다.

<4-2> PIP 생합성 측정

상기 과정을 통해 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA Kit(Takara, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이 후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 PIP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 PIP 양을 산정하였다.

그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 %를 처리한 세포에서는 MMP-1의 양은 감소하고, PIP 양은 증가하여 항주름에 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 5: 항염효과

Raw 264.7 세포주로부터 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-형태로서 Griess시약을 이용하여 측정하였다. 1μg LPS로 활성화된 Raw 264.7 cell에서 NO 생성 억제를 측정하기 위해, 최종농도 1.0 % 농도의 식물세포 콤플렉스 추출물을 함유한 배지을 처리한 실험군과 대조군을 24시간 세포배양 한 후 Griess reagent를 세포배양 상층액 100 μl와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid, 1% α-naphthylamide in H₂O)100μl를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO₂ ^-의 농도는 sodium nitrate를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 얻었다.

그 결과 상기 도 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 %를 처리한 세포에서는 LPS로 유도된 염증반응에서 NO 함량이 감소하여 항염 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 6: 멜라닌 생성 억제 효과미백 효과

B16F1 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 6 well plate에 1×10⁵ cells/well로 2 mL씩 넣고 5% CO2, 37℃의 조건인 항온기에서 24 시간 배양하였다. 배지를 모두 제거한 다음 각 well에 최종농도 1 %가 함유된 식물세포 콤플렉스 추출물 2 ml을 처리하였다. DMEM 배지에 용해시킨 α-MSH를 최종 10 nM가 되도록 처리한 후, 처리된 세포는 5% CO2, 37℃의 조건인 항온기에서 72 시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거하고 PBS (phosphate buffer saline)를 이용하여 3 회 세척한 뒤 protease inhibitor 가 포함된 1X RIPA buffer를 100 μL를 처리하여 세포를 용해시키고 15,000 rpm에서 20 분 동안 원심분리한 다음 상등액은 새로운 용기에 회수하였다. 회수한 상등액을 96 well plate에 50 μL씩 가한다.

단백질의 정량을 위하여, BCA 용액 (A:B=50:1)을 150 μL씩 각각의 well에 가한 후, 37℃의 조건인 항온기에서 30 분동안 반응시킨 후 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 0-1 mg/mL 농도 범위의 albumin을 이용한 표준검량선에 대입하여 단백질양을 구하였다.

마지막으로 멜라닌 정량분석을 위하여, Pellet을 60℃에서 건조하고 10% DMSO가 함유된 1N NaOH 400 μL를 첨가하여 90℃ 항온조에서 반응시켰다. 반응시킨 용액 100 μL를 96 well plate에 넣고 ELISA reader로 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 0-2.5 mg/mL 농도 범위의 멜라닌 표준검량선에 대입하여 멜라닌양을 구하였다.

그 결과 상기 도 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 %를 처리한 세포에서는 멜라닌 생성을 억제함으로써 미백 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 7: 자외선 조사에 의한 세포보호 효과

UV 조사에 사용할 광원으로는 302 nm 파장의 자외선을 방출하는 ultraviolet crosslinker CL-1000 (Ultra-Violet Products, CA)을 사용하였다. 피부각질형성세포인 HaCaT 세포를 1x10⁵cells/ml 농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 인산완충액으로 세척하였다. 인산완충액을 500 μL 첨가한 다음 자외선을 10 mJ/cm²로 조사 후 FBS를 포함하지 않은 신선한 세포배양배지로 교체하고 식물세포 콤플렉스 추출물을 최종농도 1 % 처리한 다음 24시간 추가 배양하였다. 여기에, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ml를 첨가한 후 배양기에서 3시간 배양한 후 형성된 fomazan을 DMSO로 녹이고, 96well plate로 옮긴 후 595 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 자외선 조사 후 시료를 처리하지 않은 대조군과 세포생존율을 비교하였다.

그 결과 상기 도 6에서 나타낸 바와 같이, UVB로 유도된 후 감소된 세포생존률이 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 % 처리에 의해서는 세포보호 효과가 있어 세포생존률이 증가함을 확인하였다.

실험예 8: 생체시계 조절 관련 유전자 발현 시험

본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 식물세포 콤플렉스 추출물의 생체시계 조절효능을 살펴보기 위하여, 관련 유전자인 CLOCK과 PER1의 발현양 변화를 조사하였다.

HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 UVB를 유도한 다음, 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지와 함께 시험 물질인 식물세포 콤플렉스 추출물을 최종 농도 1 %이 되도록 세포에 처리하여 8, 16, 24, 32시간 동안 추가 배양하였다. CLOCK, PER1의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37℃ 15분, 50℃ 5분, 95℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect®primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, CLOCK; Cat. QT00054481, PER1; Cat. QT00069265)이며 시료의 CLOCK, PER1의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 되어 비교하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

그 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이, UVB 자극에 의해 불규칙한 CLOCK과 PER1의 발현 양상이 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 %를 처리한 세포에서는 UVB 자극을 주지 않은 세포의 CLOCK, PER1의 발현 양상이 가깝게 회복되는 것을 확인하였다.

실험예 9: 피부 에너지 활성 증진 효과 시험

본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 식물세포 콤플렉스 추출물의 피부 에너지 활성 증진 효과를 살펴보기 위하여, 세포의 에너지 (ATP)의 활성 정도를 측정하였다.

Detroit551 세포를 12 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지와 함께 시험 물질인 식물세포 콤플렉스 추출물을 최종 0.5, 1, 2 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다.

상기 과정을 통해 배양한 세포의 용해물을 희석한 일부 50 μL를 취해 ATP assay Kit(Abcam, Cat. ab83355) 내 ATP 표준물질 50 μL와 함께 각각 96 well plate에 넣고 50 μL의 ATP reaction mix 용액을 또한 각 well에 첨가하여 차광한 상태에서 30분간 실온 반응시켰다. 이후, 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 ATP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 ATP 양을 산정하였다. 피부 에너지 활성 정도는 정제수를 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였다.

처리 물질	에너지 활성 효과 (%)
대조군	0
식물세포 콤플렉스 추출물 1 %	44.77

그 결과 상기 표에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 %를 처리한 세포에서는 에너지 활성 효과가 뛰어남을 확인하였다.

실험예 10: 피부 활력 증진 효과 시험

본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 식물세포 콤플렉스 추출물의 피부 활력 증진 효과를 살펴보기 위하여, BMI(Body Mass Index)가 21~27인 20~45세의 여성 피험자 20명에게 시험 물질을 12주 동안 하루 1회 샤워 후 마사지와 함께 사용하게 하였으며, 사용 전과 사용 12주 후를 비교한 효과 여부를 판단하였다. 평가 항목은 설문평가를 하여 피부 세포 활성화 및 피부 활력 증진에 대해 효과를 느꼈다고 응답한 피험자 수를 하기 표 3에 표시하였다.

시험 물질	피부 세포 활성화	피부 활력
대조군	2	0
식물세포 콤플렉스 추출물 0.5%	6	5
식물세포 콤플렉스 추출물 1%	11	13
식물세포 콤플렉스 추출물 2%	13	17

그 결과 상기 표에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물은 처리 농도 내 사용감 평가에서 응답자의 대부분이 대조군의 경우에는 12주 동안 사용한 후 피부 세포 활성화 및 피부 활력 증진 효과를 거의 느끼지 못했으나, 식물세포 콤플렉스 추출물에 의하여 피부 세포 활성화와 피부 활력 증진을 느꼈다고 응답함을 확인하였다.

실험예 11 : 여드름 개선 효과

여드름이 발생한 남녀 10명으로 대상으로 화장수를 아침, 저녁으로 4주간 얼굴 전체에 실시예 1에서 제조한 1% 농도의 식물세포 콤플렉스 추출물을 고루 바르도록 하였다. 여드름 개선 효과의 판정은 실험에 참가한 본인이 느끼는 정도에 따라 하기 판정기준을 참고로 1-3점으로 시험전 상태를 평가한 뒤 여드름 치유 효과를 평가하도록 하여 그 결과를 표에 나타내었다.

<시험전 상태의 평가>

1 = 여드름 조금 있음 2 = 여드름 약간 있음 3 = 여드름 심함

<여드름 효과 판정>

- : 효과 거의 없음, + : 약간의 효과 있음, ++ : 많이 완화,

+++: 완전히 치유됨

피험자	시험 전 상태	2주 경과 후	4주 경과 후
피험자 1	1	-	-
피험자 2	3	+	++
피험자 3	1	-	+
피험자 4	2	+	++
피험자 5	1	+	+
피험자 6	2	+	+
피험자 7	2	+	++
피험자 8	2	-	++
피험자 9	1	-	+
피험자 10	3	++	+++

그 결과 상기 표에 나타난 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 1 %가 함유된 유연 화장수를 4주간 사용한 후 대다수 피험자들에서 여드름의 개선 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 12: 피지 억제효과 실험

식물세포 콤플렉스 추출물의 피지억제효과를 확인하기 위하여, 피시험자 10명의 4주 후에 피부 유분 측정기(Sebum meter SM810)를 이용하여 피부의 피지분비량을 측정하였다. 실험은 22±2℃, 40±5％ humidity에서 이루어졌다. 지성 피부인 경우 측정값이 220 ㎍/cm²이상이고, 정상 피부인 경우 100∼220 ㎍/cm²이다. 대조군으로 정제수를 사용하였다.

처리 물질	0일 (사용 전)	28일 (사용 후)
대조군	232	225
식물세포 콤플렉스 추출물 0.5%	231	220
식물세포 콤플렉스 추출물 1%	230	191
식물세포 콤플렉스 추출물 2%	227	180

그 결과 상기 표에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물은 처리 농도 내 4주간 사용 후 피지 분비량이 감소함을 확인하였다.

실험예 13: 모공수축효과 시험 (In vitro Test)

본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물 조성물의 모공 수축 효과를 측정하기 위해 상기 실시예에서 제조된 조성물을 대상으로 피부를 대신할 단백질로 헤모글로빈을 사용하여 모공수축효과를 시험하였다. 0.9% Phosphate Buffer Saline (0.1mM, pH 7.4)으로 헤모글로빈 용액(0.05g/50ml)을 제조하여 헤모글로빈 용액 2 ml에 에델바이스 식물세포 및 부정근 세포배양추출물 2 ml을 가한 후, 30초 동안 진탕 혼합한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상등액 1 ml에 정제수 2 ml을 가하여 407 nm에서 UV-Visible spectrum으로 측정하였다. 대조군으로는 PBS(Phosphate Buffer Saline) 2 ml을 가하였다.

처리 물질	모공 수축 효과 ( % )
대조군	0
식물세포 콤플렉스 추출물 0.5 %	28.78
식물세포 콤플렉스 추출물 1 %	35.74
식물세포 콤플렉스 추출물 2 %	39.15

그 결과 상기 표에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 식물세포 콤플렉스 추출물은 처리 농도 내 모공 수축 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 기능 보호 또는 강화용 화장료 조성물.
에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선 조사에 따른 피부 보호용 화장료 조성물.
에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물.
에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피지 억제용 화장료 조성물.
에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎 세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 유효성분으로 함유하는 모공수축용 화장료 조성물.
다음의 단계를 포함하는 에델바이스 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 씨사이드에링고캘러스 배양물 또는 그 추출물, 록샘파이어캘러스 배양물 또는 추출물, 사과세포 배양물 또는 그 추출물, 포도세포 배양물 또는 그 추출물, 사막장미잎세포 배양물 또는 추출물, 라벤더잎세포 배양물 또는 추출물, 중국체이스트트리잎세포 배양물 또는 추출물, 연꽃잎세포배양물 또는 추출물, 몰약잎세포 배양물 또는 추출물, 및 아라비안자스민잎세포 배양물 또는 추출물을 함유한 제1항, 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화장료 조성물의 제조방법:
(a) 에델바이스, 씨사이드에링고, 록샘파이어, 사과, 포도, 사막장미잎, 라벤더잎, 중국체이스트트리잎, 연꽃잎, 몰약잎, 및 아라비안자스민의 각각의 식물 조직으로부터 캘러스를 유도 및 배양하는 단계; 및 (b) 상기 각각의 식물세포 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계.