KR102099402B1

KR102099402B1 - 타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법

Info

Publication number: KR102099402B1
Application number: KR1020180074868A
Authority: KR
Inventors: 임재열; 신현수; 유종만; 남명옥
Original assignee: 오가노이드사이언스 주식회사
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2020-04-09
Also published as: KR20200001843A

Abstract

본 발명은 타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법에 관한 것으로, 상세하게는 인간 타액선 조직에서 분리한 타액선 줄기세포를 3차원 배양시 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질을 포함한 배양 조성물을 첨가하여 줄기세포 기능을 더욱 강화하는 방법으로, 일반적인 3차원 배양방식에 비해 줄기세포 기능이 더 우수하게 증가하며 R-스폰딘(R-spondin)을 대체할 수 있는 대체 물질로 유용하고 타액선 줄기세포의 스페로이드 형성능, 분화능, 분비능을 증가시키는 배양 방법에 대한 것이다.

Description

타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법{Culture composition for enhancing functions of salivary glandular stem cells and method for enhancing functions of salivary glandular stem cells using same}

본 발명은 타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법에 관한 것으로, 상세하게는 인간 타액선 조직에서 분리한 타액선 줄기세포를 3차원 배양시 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질을 포함한 배양 조성물을 첨가하여 줄기세포 기능을 더욱 강화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있다.

첫째는 수정란으로부터 발생한 배아(배아줄기세포)로부터 얻는 것이고, 둘째는 성인이 된 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다. 상기 세포들은 만능분화능(pluripotency)를 가졌으며, 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들 수 있는 자기재생(self-renewal) 능력을 갖고 있다.

성체줄기세포는 배아줄기세포 만큼 전분화능(totipotency)을 띄지는 않지만 다분화능(multipotency)을 가지고 있고, 또한 난자를 사용하지 않으므로 윤리적인 문제가 없고, 환자 본인의 세포를 추출하여 환자 개개인에 맞게 맞춤형 치료로 사용하기 때문에 면역거부반응도 없다는 점이 가장 큰 장점이다. 대표적인 성체줄기세포로 중간엽(간엽성) 줄기세포가 있으며 골수, 지방, 태반, 탯줄 등에서 분리가 가능하다. 이와 같은 줄기세포는 간엽성 (중간엽성) 조직인 뼈, 연골, 지방 분화가 가능하며 조직 내 생착하여 면역조절 및 다양한 치료인자 분비를 통해 손상된 조직을 치유할 수 있다. 그러나 조직 내 생착률이 낮고 조직 내 구성세포로의 분화가 적은 단점이 있다.

줄기세포 치료제의 한계를 극복하기 위해 줄기세포 기능을 강화하기 위한 기술이 요구되며, 이 중 3차원 스페로이드 배양을 통한 기능강화 방식이 유용할 것으로 전망되고 있다. 그러나 줄기세포 기능 강화된 스페로이드 배양기술은 아직 확립되지 않은 초기 연구 단계 수준으로, 특히 배양 시 첨가 물질이나 효과적인 배양 방법에 대해서는 다양한 연구가 수행되어야 할 필요가 있다. 줄기세포의 기능을 제어하기 위해 줄기세포의 표지자와 연관 신호전달체계를 분석하여 핵심 제어 물질을 발굴할 수 있다. 타액선 조직 내에도 타액선 조직줄기세포가 존재하는데 타액선 줄기세포의 기능이 Wnt/β-catenin pathway의 영향을 받으며 Wnt와 상호작용을 하고 β-catenin을 증진시키는 R-스폰딘(R-spondin)에 의해 기능이 제어됨을 선행연구로 확인하였다. 아울러 유사장기 체외 배양을 위한 배양액에 R-스폰딘(R-spondin)의 첨가가 필수적이다. 그러나 R-스폰딘(R-spondin)은 단백질의 일종으로, 분리 및 정제가 어렵고 배양액에 첨가시 일관된 안정성을 유지하기 어렵다. 뿐만 아니라, R-스폰딘(R-spondin)은 100㎍ 당 300만원에 달하는 고가의 물질이므로, 줄기세포 배양 시 첨가하기에는 경제성이 떨어진다는 단점이 있다. 따라서 임상에 적용하기 위한 줄기세포 기능 강화 스페로이드의 배양시 저렴하고 안정성이 높은 R-스폰딘(R-spondin) 대체 신규 기능강화 물질 발굴이 유용한 기술이 될 것이다.

한국공개특허 제10-2013-0131815호(2013.12.04 공개)

본 발명의 목적은 타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법을 제공하는데 있다. 상세하게는 인간 타액선 조직에서 분리한 타액선 줄기세포를 3차원 배양시 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질을 포함한 배양 조성물을 첨가하여 줄기세포 기능을 더욱 강화시키는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 선줄기세포 기능 강화용 배양 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 포함된 배양액에서 선줄기세포를 3차원 스페로이드 배양하는 단계를 포함하는 선줄기세포 기능 강화 방법을 제공한다.

도 1은 타액선 조직에서 조직줄기세포의 분리 및 3차원 스페로이드 배양을 통한 줄기세포 수획단계 모식도를 나타낸다.
도 2는 타액선 조직에서 분리된 줄기세포를 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 또는 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질인 STK611777 (50 μM)을 처리하여 배양하였을 때 줄기세포 기능 강화된 3차원 스페로이드의 형성하는 것을 현미경적 사진 및 세포의 증식을 생존능(viability)으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 타액선 조직에서 분리된 줄기세포를 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 또는 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질인 STK611777 (50 μM)을 처리하여 배양하였을 때 줄기세포 기능 강화된 3차원 스페로이드 형성을 현미경적 사진 및 세포의 증식을 Live/Dead로 확인한 결과를 나타낸다. 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에 R-스폰딘(R-spondin) 또는 STK611777을 처리하였을 때 차이를 현미경적 사진으로 확인 및 줄기세포능 강화 분석을 위한 PCR 신호와 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 4는 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 또는 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질인 STK611777 (50 μM)을 처리하여 배양하였을 때 형성된 3차원 스페로이드의 줄기세포 분화능 강화 검증을 위한 분화 유도 분석 결과를 염색 결과와 PCR 신호와 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 5는 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 또는 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질인 STK611777 (50 μM)을 처리하여 배양하였을 때 형성된 줄기세포 기능 강화된 3차원 스페로이드의 분화능을 검증하기 위해 형성된 타액선 오가노이드의 분비능을 아밀레이즈 활성과 세포 내 칼슘을 측정 후 분석한 결과를 나타낸다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 선줄기세포 기능 강화용 배양 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

바람직하게는, 상기 선줄기세포는 타액선줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 선줄기세포의 기능강화는 스페로이드 형성능, 줄기세포능, 분화능 또는 분화 유도된 오가노이드 분비능이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 분화 유도된 오가노이드 분비능은 아밀레이즈 활성 또는 세포 내 칼슘 분비능일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 3차원 스페로이드 배양은 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 바닥은 나노섬유 기반의 마이크로 영역, 벽은 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 정사각면체 형태의 패터닝으로 구성된 스케폴드로서, 정사각면체 마이크로패턴의 크기는 100 ~ 500 μm인 것을 특징으로 하며 가장 바람직하게는 200 μm이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드의 바닥은 나노섬유 마이크로 영역으로 제한은 없으나, Polycaprolactone(PCL), polylactic-co-glycolic acid (PLGA), Polylactic acid (PLA) 등으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 PCL을 사용하였다.

상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드의 벽은 하이드로젤 마이크로 영역으로 제한은 없으나, Polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid (HA), alginate 등으로 이루어질 수 있고, 본 발명의 실시예에서는 Polyethylene glycol (PEG)를 사용하였다.

바람직하게는, 상기 3차원 스페로이드 배양은 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 3 내지 7일 동안 배양함으로써 선줄기세포 스페로이드를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화학식 1의 화합물은 선줄기세포 기능 강화를 위한 선줄기세포 배양에 필수적으로 포함되는 Wnt 신호의 활성화 물질을 대체할 수 있다. 선줄기세포가 정상적인 역할을 수행하기 위해서는 Wnt 신호가 중요하며, 이에 따라 선줄기세포 배양에 Wnt 신호의 활성화 물질의 첨가가 필수적으로 요구된다. 현재 선줄기세포를 배양하기 위해 Wnt 신호의 활성화 물질로서 R-스폰딘(R-spondin)이 사용되고 있으며, 선줄기세포 배양에서 상기 화학식 1의 화합물이 R-스폰딘(R-spondin)을 대체할 수 있다는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에서 선줄기세포를 3차원 스페로이드 배양시에는 R-스폰딘(R-spondin)을 포함하지 않을 수 있으며, 또는 일반적으로 선줄기세포 배양에 사용되는 R-스폰딘(R-spondin)의 통상 농도보다 적은 양을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물은 STK611777로도 명명하였다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

“타액(saliva)”은 이하선, 악하선, 설하선 및 구강점막에 존재하는 점액선 등으로부터 분비되는 혼합액이다. 타액은 인체의 핵심 성분으로 타액선에서 생성되어 구강 내로 배출된다. 타액은 인체의 필수 성분으로서, 생체활성단백질, 소화효소, 점액, 면역글로불린, 각종 염류 등이 포함되어 있다.

타액은 구강 내 건강뿐만 아니라 인체의 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 수행한다. 예를 들어 타액의 주요 성분인 뮤신(mucin), 면역글로불린 등은 외부의 감염으로부터 1차적인 방어 역할을 수행하며, 구강 및 치아의 윤활 및 수분 유지, pH 중화 기능을 통하여 구강점막 및 치아를 보호한다. 뿐만 아니라 타액에는 프티알린(ptyalin) 등의 아밀라아제(amylase)와 같은 소화 효소들이 있어 전분을 말토오스 단위까지 분해하는 등 소화를 촉진시키는 기능을 담당한다. 또한 타액의 분비에 의하여 인체의 수분대사 및 체온 조절이 이루어질 수 있으며, 유독물(I, Hg, Pb 등)을 배설하기도 한다.

“타액선(침샘, salivary gland)”은 타액을 생성, 분비하는 기관으로 이하선(귀밑샘, parotid gland), 악하선(턱밑샘, submaxillary gland), 설하선(혀밑샘, sublingual gland)과 같은 주타액선(major salivary gland)과, 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막(mucous membrane of oral cavity)에 존재하는 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막의 여러 부위에 분포하는 소타액선(minor salivary gland)으로 분류된다.

본 발명에 있어서, "스페로이드(spheroid)"란 3차 조직배양을 통하여 만들어지는 작은‘구’체로서, 스페로이드는 일종의 작은‘조직’으로서, 외부와 내부가 구분되어 기능이 나뉘기도 하며, 조직의 기능적 단위를 모사하는 형태를 띤다. 스페로이드 배양은 동물이나 인체 조직이 가지고 있는 고유 형태나 성질이 비슷할 뿐만 아니라, 이를 적용하여 연구에 활용할 수 있는 플랫폼으로 개발되고 있다.

본 발명에 있어서, "오가노이드(organoid)"란 조직에서나 혹은 배아줄기세포에서 유래된 세포를 이용하여 이를 3D 형태로 배양을 하여 마치 인공장기와 같은 형태로 만들 수 있는 것을 의미한다. 오가노이드는 장기의 ‘organ’과 같은 의미를 가진 접미어로 ‘장기와 유사한 것’이라는 말을 지니고 있다. 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통하여 세포와 세포의 기능이 좀 더 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 기능을 지닌다. 오가노이드는 줄기세포연구와 3D 세포배양 등이 개발되고, 다양한 조직으로 분화시킬 수 있는 생장 및 분화 인자의 최적화 연구와 함께 주목을 받고 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 사람 타액선 줄기세포 분리 및 3차원 스페로이드 배양

1. 사람 타액선 줄기세포의 3차원 스페로이드 배양

타액선 조직을 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 타액선 조직의 조각을 콜라게나아제 타입 1 용액에서 37 ℃, 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 시킨 조직을 80 ㎛의 조직 거름망 (Cell Strainers)을 이용하여 조직을 걸러낸 뒤, 상청액만 모아서 원심분리기 1500rpm, 5분간 돌려준다. 원심분리 후에 상청액은 제거하고 세포를 분리하였다. 분리한 세포에 DMEM 배지를 넣고 섞어준 뒤 200 ㎛의 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드(바닥은 PCL 등과 같은 나노섬유, 벽은 PEG 등과 같은 하이드로젤로 마이크로패턴닝하여 제작) 세포지지체 위에 세포를 깔아주었다. 타액선 줄기세포의 3차원 스페로이드를 형성하기 위해 7 일간 200 ㎛의 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에 DMEM 배지 (Dulbecco Modified Eagle Medium)을 이용한 배양 후 광학현미경(microscopy)으로 3차원 스페로이드를 관찰하였다(도 2).

2. 사람 타액선 줄기세포의 기능 강화 배양 및 스페로이드 형성능 증가

사람 타액선 줄기세포의 기능 강화 배양을 위해 7 일간 200 ㎛의 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 또는 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질인 STK611777 (50 μM)를 첨가한 후 배양하여 광학현미경(microscopy) 및 LIVE/DEAD kit를 이용하여 줄기세포 기능이 강화된 3차원 스페로이드를 관찰하였다. Calcein AM (calcein acetoxymethyl ester)과 ethidium homodimer-1 사용하여 형광 현미경을 통해 줄기세포 기능 강화된 3차원 스페로이드 생성 유도시 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰하였다. 3차원 배양법을 이용하여 7 일간 마이크로 웰에 R-스폰딘(R-spondin) 또는 STK611777를 첨가한 후 사람 타액선 줄기세포를 배양한 결과, 줄기세포 기능 강화된 스페로이드가 형성되었음을 확인하였다. LIVE/DEAD 염색법을 통해 이미지를 확인한 결과, 줄기세포 기능 강화된 스페로이드가 내부 괴사 없이 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다(도 3).

< 실시예 2> 새로운 배양 조성물 ( STK611777 , 50 μM ) 처리를 통한 사람 타액선 줄기세포의 줄기세포능 강화 증명

1. 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

Real-time PCR을 위해서 수거된 세포를 세포 용해 용액(Trizol solution)을 처리한 후 완전히 용액 상태로 제작한다. 클로로포름 0.2ml을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm으로 15분간 4℃에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하고 4℃에서 10분 동안 방치 후 다시 원심 분리하였다. 상층액 제거 후 1ml 75% 에탄올에 넣어 4℃, 3분 정도 방치 후 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다.

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응 당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다(도 3). 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열은 표 1과 같다.

α-Amylase (AMY1A)	F	AATTGATCTGGGTGGTGAGC
α-Amylase (AMY1A)	R	CTTATTTGGCGCCATCGATG
Aquaporin 5 (AQP5)	F	ACTGGGTTTTCTGGGTAGGG
Aquaporin 5 (AQP5)	R	GTGGTCAGCTCCATGGTCTT
ZO-1 (TJP1)	F	CAGGATGTGGTGGAGGAC
ZO-1 (TJP1)	R	AACTTGGCACGCTGGTTCT
E-cadherin (CDH1)	F	GGAGGCTGGAGAGCAAAATC
E-cadherin (CDH1)	R	AGTCATCAGCAGCAAGACGG
LGR5	F	TGGAGAGCAACGAGAGGGAG
LGR5	R	CGTGAGCGTCTCGATCTTGG
HSA	F	CGCATTGCCACATACACTCT
HSA	R	TTGGCTGAGGATGGTGTAAG
OCT4 (POU5F1)	F	AAGCGATCAAGCAGCGACTA
OCT4 (POU5F1)	R	GAAGTGAGGGCTCCCATAGC
SOX2	F	CAACATGATGGAGACGGAGC
SOX2	R	GTGCATCTTGGGGTTCTCCT
Nanog	F	CAGAAAAACAACTGGCCGAA
Nanog	R	GGCCTGATTGTTCCAGGATT
CD90 (Thy1)	F	GACAGCCTGAGAGGGTCTTG
CD90 (Thy1)	R	CCCAGTGAAGATGCAGGTTT

2. 타액선 줄기세포의 줄기세포능 강화 분석

마이크로 웰에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 또는 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질인 STK611777 (50 μM)을 첨가한 후 사람 선줄기세포를 배양한 결과 Real-time PCR을 통해 분석을 실시하였다. 3차원 배양을 통해 분리한 선줄기세포는 기존에 분리하던 선줄기세포 분리방법에 비해 POU5F1, Nanog, LGR5, ITGB1, HSA 그리고 THY1 등 줄기세포의 마커가 유의적으로 증가함을 Real-time PCR으로 확인하였다(도 3).

3. 웨스턴 블랏 분석을 통한 타액선 줄기세포능 강화 마커 확인

먼저, 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자염색 (electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고, 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다: α-amylase, AQP5, ZO-1, CK7, CK18 and β-actin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); E-cadherin (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA); anti-CD90, anti-LGR5, anti-Nanog, anti-Krt5, anti-OCT4, anti-SOX2 (Abcam, Cambridge, UK), PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출 (Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, 인간 β-actin의 발현과 비교분석하였다(도 3).

< 실시예 3> 새로운 배양 조성물 ( STK611777 , 50 μM ) 처리 후 타액선 줄기 세포의 분화능 강화 및 오가노이드 분비능 증명

1. 타액선 줄기세포의 기능 강화 증명을 위한 분화 유도 분석

마이크로 웰에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 또는 R-스폰딘(R-spondin) 대체 물질인 STK611777 (50 μM)을 첨가한 후 3차원 줄기세포 기능 강화된 스페로이드 배양 후 기능 강화된 타액선 줄기세포를 타액선 상피세포로 분화를 유도하여 타액선상피세포의 특징을 관찰하였다. 3차원 PCL-마이크로 웰 (PCL-microwell), R-스폰딘 (500 ng/ml) 또는 STK611777 (50 μM)을 첨가한 후 배양하여 분화를 시킨 후, 광학현미경(microscopy)으로 관찰하였고, 줄기세포 기능 강화된 스페로이드를 타액선 상피세포로 분화를 유도하여 타액선상피세포의 특성을 Real-time PCR, western blotting, immunofluorescence assay로 확인하였다(도 4).

2. 분화능 강화 증명을 위한 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

Real-time PCR을 위해서 수거된 세포를 세포 용해 용액 (Trizol solution)을 처리한 후 완전히 용액 상태로 제작한다. 클로로포름 0.2ml 을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm 으로 15분간 4℃에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하고 4℃에서 10분 동안 방치 후 다시 원심 분리하였다. 상층액 제거 후 1ml 75% 에탄올에 넣어 4℃, 3분 정도 방치 후 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다.

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다. 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열을 다음과 같다. 마이크로 웰에 STK611777 (50 μM)을 첨가한 후 분화시켰을 때 마이크로 웰에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml)보다 amylase, AQP5 타액선 상피세포의 마커가 유의적으로 증가하는 것을 Real-time PCR로 확인하였다(도 4).

3. 웨스턴 블랏 분석을 통한 분화능 증명 (타액선 상피세포 마커 확인)

먼저 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자염색(electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다: α-amylase, AQP5, ZO-1 and β-actin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); E-cadherin (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출(Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 마이크로 웰에 STK611777 (50 μM)을 첨가한 후 분화시켰을 때 마이크로 웰에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml) 보다 amylase, AQP5 타액선 상피세포의 마커가 유의적으로 증가하는 것을 western blotting으로 확인하였다(도 4).

4. 면역형광 염색법

면역형광 염색법은 4 % 파라포름 알데하이드 용액에서 세포를 고정 후, 0.01% 트리톤 x-100 용액을 상온에서 10분간 처리한 후 세포 표면에 구멍을 내어준다. 막을 PBS 내 1% 보바인 세럼으로 실온에서 1시간 동안 차단시키고 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다: anti-α-amylase, anti-ZO-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-AQP5 (Alomone Lab, Jerusalem, Israel), anti-E-cadherin (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) PBS로 상온에서 5분씩 세 번 세척한 후, 각 1차 항체에 상응하는 형광-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 PBS로 상온에서 5분씩 세 번 세척 후, 핵을 염색하기 위해 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)로 상온에서 5분간 염색하였다. Slide glass에 fluoresence가 fade되는 것을 막아주는 mounting solution을 떨어뜨려 mounting을 한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 마이크로 웰에 STK611777 (50 μM)를 첨가한 후 분화시켰을 때 마이크로 웰에 R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml)보다 amylase, AQP5 타액선 상피세포의 마커가 유의적으로 증가하는 것을 immunofluorescence assay로 확인하였다(도 4).

5. 분화 유도 후 타액선 오가노이드 분비능 평가: α-amylase 활성 측정

분화 유도 후 형성된 오가노이드의 분비능을 측정하기 위해서 아밀레이즈 활성도를 측정하였다. 오가노이드에 방사선을 조사하여 배양한 스페로이드의 배양액을 모아서 α-amylase activity assay kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 아밀레이즈 활성도를 측정하였다. R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml)을 첨가했을 때 보다 STK611777 (50 μM) 첨가하였을 때 3차원 줄기세포 기능 강화된 스페로이드의 아밀레이즈 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 5).

6. 분화 유도 후 타액선 오가노이드 분비능 평가: 세포 내 칼슘 측정

분화 유도 후 형성된 오가노이드의 기능을 측정하기 위해서 스페로이드에서 세포 내 칼슘을 Fluo-4AM (Molecular Probe, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 형성된 스페로이드에 Fluo-4AM를 넣고 37℃에서 1시간 동안 염색한 후 칼슘 indicator ATP (adenosine triphosphate, 100 μM), TG (thapsigargin, 1 μM) 및 CChol (Carbachol, 10 μM) (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 넣어서 라이브하게 형광현미경으로 형광값을 측정하였다. R-스폰딘(R-spondin) (500 ng/ml)을 첨가했을 때 보다 STK611777 (50 μM) 첨가하였을 때 3차원 줄기세포 기능 강화된 스페로이드의 칼슘 분비가 증가하는 것을 확인하였다(도 5).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 타액선줄기세포 기능 강화용 배양 조성물로서, 상기 타액선줄기세포 기능 강화는 스페로이드 형성능, 줄기세포능, 타액선 상피세포로의 분화능, 분화 유도된 타액선 오가노이드의 아밀레이즈 활성 및 분화 유도된 타액선 오가노이드의 세포 내 칼슘 분비능으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 기능이 강화된 것을 특징으로 하는 타액선줄기세포 기능 강화용 배양 조성물.
[화학식 1]
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하기 화학식 1로 표시되는 화합물이 포함된 배양액에서 타액선줄기세포를 3차원 스페로이드 배양하는 단계를 포함하는 타액선줄기세포 기능 강화 방법으로서, 상기 타액선줄기세포 기능 강화는 스페로이드 형성능, 줄기세포능, 타액선 상피세포로의 분화능, 분화 유도된 타액선 오가노이드의 아밀레이즈 활성 및 분화 유도된 타액선 오가노이드의 세포 내 칼슘 분비능으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 기능이 강화된 것을 특징으로 하는 타액선줄기세포 기능 강화 방법.
[화학식 1]
제5항에 있어서, 상기 3차원 스페로이드 배양은 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드에서 배양하는 것을 특징으로 하는 타액선줄기세포 기능 강화 방법.
제6항에 있어서, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 바닥은 나노섬유 기반의 마이크로 영역, 벽은 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 정사각면체 형태의 패터닝으로 구성된 것을 특징으로 하는 타액선줄기세포 기능 강화 방법.
제7항에 있어서, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 100 내지 500 ㎛의 정사각면체 형태인 것을 특징으로 하는 타액선줄기세포 기능 강화 방법.
제5항에 있어서, 상기 3차원 스페로이드 배양은 3 내지 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 타액선줄기세포 기능 강화 방법.
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