CN111836884B - 源自干细胞的泪腺组织的制作方法 - Google Patents

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Abstract

一种源自干细胞的泪腺组织的制作方法，其特征在于，从由多能干细胞得到的SEAM细胞群(自我形成的外胚层自主性多区细胞群)中分离出SSEA4和CD104双阳性细胞，将所得到的细胞在含有EGF(表皮生长因子)和ROCK抑制剂的培养基中进行三维培养，由此获得表达泪腺的相关蛋白的细胞群。通过本发明，能够由包括iPS细胞的多能干细胞制造泪腺类器官，因此对于利用细胞医疗进行的泪腺相关疾病的再生治疗和与上述疾病相关的研究极其有用。

Description

源自干细胞的泪腺组织的制作方法
技术领域
本发明涉及源自干细胞的泪腺组织的制作方法。更详细而言，涉及由多能干细胞、角膜缘干细胞诱导泪腺组织的方法及其应用。
背景技术
人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞在再生医疗中的应用在世界范围内受到关注。为了将人多能干细胞应用于再生医疗，需要开发出将这些干细胞以高效率稳定地分化诱导为体细胞的技术，对于从人多能干细胞向任意体细胞的选择性分化诱导方法进行了各种研究。
例如，非专利文献1中公开了向人ES细胞中导入在泪腺上皮细胞中丰富存在的转录因子(PAX6、SIX1、FOXC1)而分化诱导泪腺上皮细胞的方法。
另外，作为针对角膜上皮干细胞缺乏症等严重角膜疾病的新型治疗法，本申请的发明人开发了由iPS细胞制作角膜上皮细胞片的技术，并报道了使用动物模型确认了其有效性等的情况(参考专利文献1、非专利文献2、3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/114285号
非专利文献
非专利文献1：Hirayama et al.,Npj Aging and Mechanisms of Disease,3(1),2017
非专利文献2：Hayashi et al.,Nature Protocols,2017,12(4),683-696,doi:10.1038/nprot.2017.007
非专利文献3：Hayashi et al.,Nature.2016Mar 17,531,376-80,doi:10.1038/nature17000
发明内容
发明所要解决的问题
但是，即使依照现有技术能够分化诱导出泪腺上皮细胞，但为了将其应用于再生医疗，也需要由该泪腺上皮细胞形成泪腺组织特征性的由导管细胞、腺泡细胞、肌上皮细胞这三种细胞构成的三维立体结构，从而形成能够在神经***的控制下分泌含有各种功能性成分的泪液的泪腺组织，但这在现阶段尚未得以实现。
本发明涉及能够应用于再生医疗等的源自干细胞的泪腺组织的制作方法及其应用。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，利用FACS从按照非专利文献2中记载的方法得到的同心圆状的带状结构(自我形成的外胚层自主性多区：a self-formed ectodermal autonomous multi-zone；SEAM)中分离特定的细胞，使用基质胶(Matrigel)并组合各种生长因子进行三维诱导，由此首次能够在体外制作表达泪腺相关蛋白的泪腺样组织。
即，本发明涉及以下的[1]～[7]。
[1]一种源自干细胞的泪腺组织的制作方法，其特征在于，从由多能干细胞得到的SEAM细胞群(自我形成的外胚层自主性多区细胞群)中分离出SSEA4和CD104双阳性细胞，将所得到的细胞在含有EGF(表皮生长因子，Epidermal Growth Factor)和ROCK抑制剂的培养基中进行三维培养，由此获得表达泪腺的相关蛋白的细胞群。
[2]如上述[1]所述的制作方法，其中，分离出的细胞进一步为CD200阴性。
[3]一种源自干细胞的泪腺组织的制作方法，其特征在于，将角膜缘干细胞在含有EGF和ROCK抑制剂的培养基中进行三维培养，由此获得表达泪腺的相关蛋白的细胞群。
[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的制作方法，其中，培养基进一步含有TGF-β。
[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的制作方法，其中，相关蛋白为选自AQP5、LYZ、CNN1、BARX2、SOX9、SOX10、RUNX1、TFCP2L1、LTF和HTN1中的一种以上。
[6]一种移植用泪腺类器官的制造方法，其包括对利用上述[1]～[5]中任一项所述的制作方法得到的泪腺上皮细胞进行培养的工序。
[7]一种泪腺相关疾病的药剂筛选方法，其包括对利用上述[1]～[5]中任一项所述的制作方法得到的泪腺上皮细胞进行培养的工序。
另外，本发明还包含以下的[8]～[12]。
[8]一种泪液，其是由利用上述[6]所述的方法得到的泪腺上皮细胞类器官分泌的泪液。
[9]一种药物组合物，其含有上述[8]所述的泪液。
[10]一种容易分化诱导为源自干细胞的泪腺组织的细胞的选择方法，其特征在于，以上述[1]～[5]中任一项所述的制作方法中形成的细胞群的形状作为指标来进行选择。
[11]一种泪腺类器官，其利用上述[1]～[6]中任一项所述的方法得到。
[12]一种泪腺类器官，其通过对利用上述[10]所述的方法选择出的细胞进行培养而得到。
发明效果
根据本发明，能够使用干细胞得到可靠地表达包含泪腺应表达的功能蛋白的泪腺相关蛋白的组织，因此，通过使用所得到的组织，能够提供起因于泪腺自身的异常的疾病的根本性再生治疗方法和下一代的治疗方法。
另外，还能够应用于迄今为止由于难以获得泪腺细胞而未实施的、以泪腺为标靶的药剂筛选等。此外，还能够使用由所得到的泪腺组织分泌的泪液作为新的药剂的构成成分。
附图说明
图1是示出由iPS细胞诱导得到的同心圆状的四个带状结构所构成的二维组织体(SEAM)的免疫荧光染色的结果的图。
图2是示出由iPS细胞向泪腺类器官的诱导过程的示意性一例的图。
图3是示出源自iPS细胞的泪腺类器官中的基因表达分析的结果的图。
图4是示出源自iPS细胞的泪腺类器官的免疫荧光染色的结果的图。
图5是示出对源自iPS细胞的泪腺类器官的诱导条件(生长因子的种类)进行研究的结果的图。
图6是示出对源自iPS细胞的泪腺类器官的诱导条件(TGF-β浓度)进行研究的结果的图。
图7是示出对源自iPS细胞的泪腺类器官的诱导条件(集落形状)进行研究的结果的图。
图8是示出由角膜缘干细胞诱导得到的细胞的形态和基因表达分析的结果的图。
图9是示出对于将源自iPS细胞的泪腺类器官移植于裸大鼠而得到的移植片进行HE染色的结果的图。
图10是示出对于将源自iPS细胞的泪腺类器官移植于裸大鼠而得到的移植片进行免疫荧光染色和移植片提取物中的hLTF蛋白量的测定的结果的图。
图11是示出源自ES细胞的泪腺类器官的形成过程的一例的图。
具体实施方式
到目前为止，本发明人由iPS细胞获得了再现出眼整体的发生的细胞群(自我形成的外胚层自主性多区：SEAM)，从所得到的细胞群中分离出特定的祖细胞后，对该细胞进行分化诱导、根据需要进行成熟培养，由此制备出高纯度的细胞群、例如角膜上皮细胞等。在此，在对由SEAM获得的细胞进行分化诱导、成熟培养时，只要能够在与所期望的细胞群相应的生长因子的存在下进行培养，只要容器为细胞培养中使用的容器，则没有特别限定。另外，上述由iPS细胞再现出的眼的细胞群中，各细胞所对应的眼的部位是确定的，但不清楚与泪腺上皮细胞对应的祖细胞。因此，本发明人对按照上述方法得到的祖细胞向泪腺上皮细胞的分化诱导进行了深入研究，结果发现，通过将以往已知分化诱导为角膜上皮细胞的祖细胞群在特定生长因子的存在下进行三维培养，能够向泪腺上皮细胞分化诱导并得到表达与泪腺同等的功能蛋白等泪腺相关蛋白的泪腺样组织。另外，对于由iPS细胞等多能干细胞得到的细胞群以外的细胞群也同样地进行了研究，结果可知，分化诱导为角膜上皮细胞的祖细胞有多种，但在二维培养中分化诱导为角膜上皮细胞的角膜缘干细胞通过进行上述三维培养而分化诱导为泪腺上皮细胞而得到泪腺样组织。像这样通过三维培养分化诱导为泪腺上皮细胞的详细机理尚不明确，认为是由于，通过使细胞的支架形成为三维，与以往的二维培养不同，在具有管腔侧和基底膜侧的各极性的同时能够向所有方向展开，形成导管或腺泡结构等立体结构，由此诱导出特征性的泪腺上皮细胞。但是，这些推测并非对本发明进行限定。
本发明提供泪腺上皮细胞的分化诱导方法，其具有下述特征：将由SEAM得到的特定的祖细胞在特定因子的存在下进行三维培养。具体而言，从由多能干细胞得到的SEAM细胞群(自我形成的外胚层自主性多区细胞群)中分离出SSEA4和CD104双阳性细胞，将所得到的细胞在含有EGF(表皮生长因子)和ROCK抑制剂的培养基中进行三维培养，由此能够获得表达泪腺的相关蛋白的细胞群。
本发明中，首先由多能干细胞制备SEAM细胞群。
本发明中的多能干细胞是指具有可能分化为生物体内存在的所有细胞的多向分化潜能、并且还兼具增殖能力的干细胞。具体而言，可以列举例如胚胎干细胞(ES细胞)、来源于通过核移植得到的克隆胚胎的胚胎干细胞(ntES细胞)、***干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、来源于培养成纤维细胞或骨髓干细胞的多能性细胞(Muse细胞)等。优选为ES细胞、ntES细胞和iPS细胞，更优选为ES细胞和iPS细胞。多能干细胞优选为哺乳动物的多能干细胞。哺乳动物没有特别限定，可以列举人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中优选人。通过使用人多能干细胞，能够获得可应用于人的再生医疗的安全细胞种所对应的细胞群。
SEAM细胞群是指，通过将多能干细胞在无血清培养基中在不使用饲养细胞的情况下进行二维培养而得到的、由不同的外胚层系细胞种构成的同心圆状的层所形成的集落。
具体而言，例如通过使用动物细胞的培养中可使用的公知的培养基(例如DMEM培养基、BME培养基等)且不含有未调整或未纯化的血清的培养基对人iPS细胞进行二维培养而得到。此时，作为培养容器，只要是二维细胞培养中使用的容器则没有特别限定，但优选容器的内表面利用胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或层粘连蛋白片段等进行了包被。需要说明的是，培养条件没有特别限定，可以根据技术常识适当设定。
这样培养得到的SEAM细胞群是在未受到分化诱导剂、分化诱导促进剂等的来自外部的刺激的情况下由细胞自身自主分化而形成的，形成由外胚层系细胞种构成的层状的集落。集落从中心部朝向周边部包含由各自不同的外胚层系细胞种构成的同心圆状的层，包含第一层(神经外胚层系列细胞)、第二层(神经嵴系列细胞/眼胚系列细胞)、第三层(眼表面外胚层系列细胞)和第四层(表面外胚层系列细胞)。在该自主分化后，可以继续进行分化培养，此时，可以在自主分化中使用的培养基中添加后述的ROCK抑制剂、血清替代物等各种生长因子、细胞的维持增殖所需的各种营养源、分化诱导所需的各成分来进行培养。需要说明的是，作为上述的SEAM的制备方法，可以参考例如非专利文献2、3和专利文献1中记载的方法。
所得到的集落中，各层所包含的细胞种为不同的系列，因此可以利用该集落分离出特定的层中所包含的细胞来使用，也可以直接使用集落整体。
这样，本申请说明书中的SEAM细胞群是指例如如下得到的细胞群：将多能干细胞以100～700个细胞/cm2的密度接种到用层粘连蛋白511E8片段包被的板中，在StemFit(注册商标)培养基(味之素)中维持8～10天后，在分化培养基[DM；含有10％knockout血清替代物(KSR，Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(Life Technologies)、0.1mM非必需氨基酸(Life Technologies)、2mM l-谷氨酰胺(Life Technologies)、1％青霉素-链霉素溶液(Life Technologies)和55μM 2-巯基乙醇(Life Technologies)的GMEM培养基(LifeTechnologies)]中培养4周，接着在分化培养基[CDM；含有10～20ng/mL KGF(Wako)、10μMY-27632(Wako)和1％青霉素-链霉素溶液的DM培养基与CnT-20或CnT-PR培养基(不含有EGF和FGF2，CELLnTEC Advanced Cell Systems)的1:1(v/v)混合培养基]中培养4周后，根据期望将所形成的第一层和第二层除去，更换为维持培养基[CEM；含有2％B27补充剂(LifeTechnologies)、1％青霉素-链霉素溶液、10～20ng/mL KGF、10μM Y-27632的DMEM/F-12(2:1(v/v))培养基(Life Technologies)]后，进一步培养约3天～约2周，对其进行分化诱导。
接着，从所得到的SEAM细胞群中分离出SSEA4和CD104双阳性细胞。
本发明中，具有下述特征：以SSEA4和CD104的表达作为指标、使用这些标志物获得的细胞群本来分化为角膜上皮祖细胞，但通过进行后述三维培养，意外地还能够分化诱导为泪腺细胞。
作为分离方法，只要能够以上述标志物的表达作为指标从SEAM细胞群中分离出目标细胞则没有特别限定，可以按照常规方法使用各标志物特异性的抗体来容易地实施。具体而言，使用例如利用由抗体标记的磁珠、固相化有抗体的柱、使用荧光标记的抗体的细胞分选仪(FACS)进行的分离来进行分离即可。抗体可以利用市售品，也可以利用按照常规方法制作的抗体。需要说明的是，在上述基于SSEA4和CD104的阳性选择之前，可以以上述选择为参考来进行基于CD200的阴性选择，这种情况下，所分离的细胞为CD200-、SSEA4+、CD104+的细胞。
分离出的细胞也可以直接供于三维培养，但优选使其形成球体(细胞聚集块)。另外，在形成球体之前，可以将分离出的细胞基于其特征进行分类后使用。
分离出的细胞是以SSEA4和CD104的表达作为指标而选择出的细胞，但认为作为其状态，包含各种各样的细胞。因此，本发明人将分离出的细胞基于各种特征分类后对分化培养进行了研究，结果发现，根据其形状的不同，分化的进行程度不同。本发明中，例如，通过将按照平面状(扁平型)、立体状(圆顶型)等形状分类后的细胞汇总进行培养，能够控制向泪腺上皮细胞的分化诱导能力，优选使用圆顶型的细胞形成球体。
球体可以通过对分离出的细胞进行培养而形成。所使用的培养基只要是可用于动物细胞的培养的公知的培养基且为不含有未调整或未纯化的血清的培养基则没有特别限定，必要时可以添加ROCK抑制剂、KGF(角质细胞生长因子，Keratinocyte Growth Factor)、血清替代物等各种生长因子来进行。作为培养容器，出于优选抑制特异性或非特异性固定化、使细胞成为浮游状态而形成球体的原因，可以列举例如具有低粘附表面的培养容器，可以利用PrimeSurface(注册商标)96U板等。培养条件可以根据技术常识而适当设定。
这样，能够形成分离出的细胞的球体。球体的直径大约为10μm～1000μm、优选为100～500μm，具有BARX2、SOX9、KRT15等泪腺上皮细胞特异性标志物或向腺细胞的分化标志物的表达升高的特征，适合用于后续的三维培养。
三维培养中，只要能够将所得到的球体在含有EGF、ROCK抑制剂的培养基中进行培养即可，可以参考公知的三维培养方法。具体而言，可以列举例如使用水凝胶、层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、玻连蛋白、Matrigel(注册商标)、整合素、糖胺聚糖等生物相容性材料作为细胞培养载体来进行培养的方法。
为了促进向泪腺上皮细胞的分化诱导，三维培养中的培养基含有EGF、ROCK抑制剂的生长因子。关于基本培养基，只要是在自主分化中使用的培养基等能够用于上皮细胞的培养的培养基(无血清培养基)则均可以使用。另外，也可以含有血清替代物。需要说明的是，本说明书中，“ROCK抑制剂”是指抑制Rho激酶(ROCK：Rho-associated,coiled-coilcontaining protein kinase；Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶)的物质，可以利用例如N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(Y-27632)、法舒地尔(Fasudil)(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂(H-1152)、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-甲酰胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-/>二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]氧基}苯甲酰胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-甲酰胺(GSK429286A)。作为“血清替代物”，可以列举例如白蛋白(例如，富脂质白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素(例如锌、硒)、B27(注册商标)补充剂、N2补充剂等。在B27补充剂的情况下，培养基中的浓度为0.01～10重量％、优选为0.5～4重量％。
另外，本发明中，为了促进所得到的细胞的成熟化，可以含有TGF-β。只要是TGF-β则没有特别限定，可以为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3中的任意一者。培养基中的浓度为0.1～200ng/mL、优选为1～200ng/mL。
另外，培养基中，可以适当含有细胞的维持增殖所需的各种营养源、分化诱导所需的各成分。例如，作为营养源，可以含有甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蜂蜜、淀粉、糊精等碳源、以及脂肪酸、油脂、卵磷脂、醇类等烃类、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钠等氮源、食盐、钾盐、磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等无机盐类(例如，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、钼酸钠、钨酸钠、硫酸锰)、各种维生素类、氨基酸类等。这些成分含量可以根据技术常识进行调节。
培养条件可以根据技术常识而适当设定。例如在36～38℃、优选36.5～37.5℃、1～25％O2、1～15％CO2的条件下进行。
经过上述三维培养，能够获得表达泪腺的相关蛋白的细胞群(泪腺上皮细胞)。该细胞群可以为类器官(泪腺类器官)。
本发明中，泪腺的相关蛋白包含被分泌到泪液中而在眼表面发挥功能的功能蛋白。具体而言，可以列举例如LTF、LYZ、HTN1、MUC1、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、LACRT、sIgA。LTF为铁结合性糖蛋白，是具有抗菌、抗病毒活性的蛋白。LYZ是分解真细菌的细胞壁的蛋白。HTN1是具有抗菌活性的蛋白，也被用作泪腺上皮细胞的标志物。MUC家族是与眼表面的保水有关的糖蛋白。LACRT有助于眼表面细胞的增殖。sIgA在粘膜免疫中担负着中心作用。优选确认到这些之中的至少一种的表达。
另外，在所得到的细胞的基因分析中，除了与上述功能蛋白有关的分析以外，还可以确认AQP5、SOX9、SOX10、RUNX1、KRT14、TFCP2L1、CNN1、BARX2、PAX6等的表达。本发明中，将这些蛋白和上述功能蛋白包括在内记为泪腺的相关蛋白或泪腺相关蛋白。AQP5是存在于细胞膜上的具有细孔的蛋白，是泪腺中在腺泡细胞中担负着泪液的水的供给的代表性蛋白之一。SOX9、SOX10是对泪腺的发生发挥重要作用的转录因子，位于来自FGF10的信号的下游，有助于泪腺的发生。特别是SOX10有助于腺泡细胞的分化。RUNX1也是已知对泪腺的发生发挥重要作用的转录因子。KRT14是在泪腺的发生时在泪腺上皮细胞中在基底层侧的细胞中确认到表达的形成细胞骨架的蛋白，在成熟泪腺中也被用作肌上皮细胞的标志物。TFCP2L1是泪腺的导管细胞的分化所需的转录因子，CNN1是在泪腺的肌上皮细胞中表达、控制肌动球蛋白系的收缩的蛋白。另外，BARX2为转录因子，与KRT15同样地在泪腺的分化过程中表达变得显著，作为其直接的标靶有MMP2，已知其有助于泪腺组织的分支形成，有时也确认到它们的表达。本发明中，作为在所得到的细胞群中确认到表达的蛋白，只要是泪腺的相关蛋白则没有特别限定，可以列举例如选自AQP5、LYZ、CNN1、BARX2、SOX9、SOX10、RUNX1、TFCP2L1、LTF和HTN1中的一种以上。
另外，本发明还提供在上述的分化诱导方法中使用角膜缘干细胞作为供于三维培养的细胞的方式。即，本发明提供通过将角膜缘干细胞在含有EGF和ROCK抑制剂的培养基中进行三维培养来制作表达泪腺的相关蛋白的细胞群的方法。迄今为止已知角膜缘干细胞通过二维培养而分化为角膜上皮细胞，但通过三维培养分化为泪腺上皮细胞是本发明人首次发现的。在上述角膜缘干细胞的分化诱导中，为了促进所得到的细胞的成熟化，也可以使培养基中含有TGF-β。
作为角膜缘干细胞，可以从多能干细胞另行分化诱导而得到，也可以从生物体中采集，可以根据需要进行纯化等后使用。若从生物体中采集，则所得到的细胞群具有不存在产生排斥反应的可能性的优点。需要说明的是，除了所使用的细胞为角膜缘干细胞以外，三维培养的条件与上述相同。
利用本发明的制作方法得到的泪腺上皮细胞其本身能够用于研究、再生医疗等。
具体而言，例如，关于利用本发明的制作方法制造的泪腺上皮细胞，通过例如将类器官直接进行移植，可以期待在生物体内进一步成熟化，进一步形成功能性的泪腺组织。另外，通过先使类器官离散，将细胞以悬浮液的形式进行给药，使其作为泪腺组织的一部分成活，还可以期待促进再生。因此，本申请发明中包含一种移植用泪腺上皮细胞类器官的制造方法，其包括对利用本发明的制作方法制造的泪腺上皮细胞进行培养的工序。泪腺上皮细胞的培养可以与上述三维培养同样地进行，因此考虑到移植后在生物体内的成熟化，可以使用不含有TGF-β的培养基作为上述三维培养用培养基。
另外，利用本发明的制作方法制造的泪腺上皮细胞具有反映生物体的泪腺相关蛋白，因此可以对例如泪腺相关疾病的治疗剂的药效评价、发病机理的分析等做出很大贡献。作为泪腺相关疾病(由泪腺自身的异常引起的疾病)，可以列举例如干眼症、干燥综合征、GvHD、泪腺肿瘤等。
具体而言，例如，关于泪腺，已知通过提高水通道蛋白类(例如AQP5)的表达而使泪液量增加。另外，已知乳铁蛋白(LTF)量的减少与干眼症症状具有相关性，因此通过提高乳铁蛋白等泪液中的功能蛋白的表达，可以期待干眼症症状的缓解。因此，认为通过使用由本发明得到的泪腺类器官选择出使上述泪腺相关蛋白的表达、活性提高的药剂，能够适合用于干眼症治疗用药剂的筛选。因此，本申请发明中包含一种泪腺相关疾病的药剂筛选方法，其包括对利用本发明的制作方法制造的泪腺上皮细胞进行培养的工序。上述培养工序可以与泪腺上皮细胞的分化诱导时的三维培养同样地进行，因此考虑到泪腺相关蛋白的表达，可以使用不含有TGF-β的培养基作为上述三维培养用培养基。
作为本发明的筛选方法，只要包括上述培养工序则没有特别限定，可以列举例如下述方式：在通过上述培养工序得到的本发明的泪腺上皮细胞中，以编码泪腺相关蛋白的基因的表达或泪腺相关蛋白的活性作为指标，选择出促进表达或促进活性的物质作为用于治疗泪腺相关疾病的候选化合物。具体而言，例如，在接触待测物质后的本发明的泪腺上皮细胞中，测定编码泪腺相关蛋白的基因的表达量或泪腺相关蛋白的活性值，在与未接触待测物质的对照细胞中的表达量或活性值相比提高的情况下，可以将待测物质选择为用于治疗泪腺相关疾病的候选化合物。
此外，利用本发明的制作方法制造的泪腺上皮细胞反映生物体组织且分泌泪液，因此，例如也可以在试管内等回收由利用本发明的制作方法制造的泪腺上皮细胞类器官得到的泪液，作为新的药剂的构成成分来使用。因此，本申请发明还提供一种药物组合物，其含有由利用本发明的制作方法制造的泪腺上皮细胞类器官得到的泪液。作为该药物组合物，可以列举例如泪液滴眼剂、干眼症滴眼剂、抗菌滴眼剂、抗病毒滴眼剂、抗过敏滴眼剂、角膜治疗滴眼剂、甾体性抗炎滴眼剂、非甾体性抗炎滴眼剂、眼疲劳滴眼剂、白内障滴眼剂、青光眼滴眼剂等，只要含有上述泪液，则其他成分的配合、制备方法可以根据公知技术适当调节。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行详细说明，但这些实施例是本发明的一例，本发明并不限定于这些实施例。需要说明的是，下文中，室温表示25℃，各培养在36～38℃、1～25％O2、1～15％CO2的条件下进行。
实施例1眼表干细胞的诱导
由iPS细胞进行眼周围细胞的分化诱导时，使用自我形成的外胚层自主性多区(SEAM)法(Hayashi et al.Nature.2016Mar 17；531(7594):376-80.,Hayashi et al.,Nature Protocols,2017,12(4),683-696,doi:10.1038/nprot.2017.007)。
具体而言，将人iPS细胞株(201B7)以100～700个细胞/cm2的密度接种到用层粘连蛋白511E8片段包被的板中，在StemFit(注册商标)培养基(味之素)中维持8～10天后，在分化培养基[DM；含有10％knockout血清替代物(KSR，Life Technologies)、1mM丙酮酸钠(Life Technologies)、0.1mM非必需氨基酸(Life Technologies)、2mM l-谷氨酰胺(LifeTechnologies)、1％青霉素-链霉素溶液(Life Technologies)和55μM 2-巯基乙醇(LifeTechnologies)的GMEM培养基(Life Technologies)]中培养4周。接着，在分化培养基[CDM；含有10～20ng/mL KGF(Wako)、10μM Y-27632(Wako)和1％青霉素-链霉素溶液的DM培养基与CnT-20或CnT-PR培养基(不含有EGF和FGF2，CELLnTEC Advanced Cell Systems)的1:1(v/v)混合培养基]中培养4周后，更换为维持培养基[CEM；含有2％B27补充剂(LifeTechnologies)、1％青霉素-链霉素溶液、10～20ng/mL KGF、10μM Y-27632的DMEM/F-12(2:1(v/v))培养基(Life Technologies)]后，进一步培养约2周，进行分化诱导。
在SEAM诱导第6周，用PBS将孔清洗后，使用4％PFA在室温下固定30分钟。然后，用5％NST(含有5％正常驴血清、3％Triton的TBS)进行封闭后，用1％NST(含有1％正常驴血清、3％Triton的TBS)进行3天的透过处理，然后使用抗PAX6抗体(sc-53108)、抗BARX2抗体(sc-9128)进行3天一次抗体反应，清洗后对分别以Alexa Fluor 488、568标记的二次抗体处理1小时，进行染色。二次抗体反应的最后10分钟利用Hoechst 33342对核进行染色。将结果示于图1。
由图1可知，所得到的SEAM是由第一层(图中的1st)、第二层(图中的2nd)、第三层(图中的3rd)、第四层(图中的4th)构成的四层结构，眼表干细胞(PAX6/BARX2双阳性细胞)大量存在于第三层、尤其是靠近第二层的第三层部分。
实施例2向泪腺类器官的诱导
从实施例1中得到的SEAM中回收CD200-、SSEA4+、CD104+的眼表干细胞。
使用向在DMEM/F-12中添加B27补充剂的所得物中添加Y-2763210μM、KGF 20ng/mL而得到的培养基，将所得到的眼表干细胞以50000个细胞/球体接种到PrimeSurface(注册商标)96U板(住友电木)中，培养一天，形成球体(直径约560μm)。接着，将其包埋到基质胶GFR(康宁)中，进一步使用向在DMEM/F-12中添加B27补充剂的所得物中添加Y-27632 10μM、EGF 10ng/mL以及TGF-β3 100ng/mL而得到的培养基进行两周培养。将结果示于图2。
由图2确认到，由眼表干细胞形成了具有腺样结构的类器官。
实施例3泪腺类器官诱导过程中的基因表达分析
对于与实施例1同样地在StemFit中对人iPS细胞培养10天而得到的样品(iPSC)、对在SEAM诱导后8～10周得到的SSEA4/CD104双阳性的级分进行分选而得到的样品(Sort)、与实施例2同样地形成了球体的样品(Spheroid)、形成了类器官的样品(Organoid)，使用QIAzol裂解试剂(QIAGEN)分别进行回收，供于qRT-PCR，评价各阶段中的各种标志物表达。将结果示于图3。
由图3确认到，在Organoid中，与泪腺上皮细胞相关的标志物进行了表达。特别是已知在分化过程中达到高表达的BARX2、KRT15在Spheroid中高表达，之后减少，因此，与Spheroid相比，Organoid是进一步分化的状态。另外，在Organoid中，在维持PAX6的状态下高表达SOX9、RUNX1以及作为功能蛋白的HTN1，因此暗示其是进一步分化的泪腺。
实施例4泪腺类器官的免疫荧光染色
将培养得到的泪腺类器官直接或者用4％PFA进行固定处理后的泪腺类器官的切片用5％NST(包含5％正常驴血清、3％Triton的TBS)进行封闭后，利用抗PAX6抗体(sc-53108)、抗HTN1抗体(sc-28110)、抗CAL抗体(ab46794)进行一次抗体反应，清洗后，对以Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568标记的二次抗体处理1小时，进行染色。此外，二次抗体反应的最后10分钟利用Hoechst 33342对核进行染色。将结果示于图4。
由图4确认到，在类器官中，维持了PAX6的表达，作为功能蛋白的HTN1和作为肌上皮细胞标志物的CAL等可在泪腺细胞中表达的蛋白也可靠地进行了表达。
实施例5泪腺类器官的诱导条件研究(生长因子的种类)
与实施例2同样地进行三维培养时，在添加EGF 10ng/mL的效果的基础上进一步添加Y-27632 10μM、据报道参与泪腺诱导的KGF 20ng/mL、FGF10 100ng/mL、BMP7 100ng/mL来进行培养。将结果示于图5A。
另外，向同样地在DMEM/F-12中添加B27补充剂、EGF 10ng/mL、Y-27632 10μM的所得物中进一步分别添加TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3100ng/mL，进行培养。将结果示于图5B。
由图5A可知，已知参与泪腺诱导的KGF、FGF10、BMP7并没有那么推进诱导，与此相对，在添加EGF 10ng/mL和Y-27632 10μM的情况下诱导显著。由此暗示，EGF与Y-27632的组合是有效的。另外，由图5B可知，无论TGF-β的种类如何，均使该泪腺结构更加成熟化。
实施例6泪腺类器官的诱导条件研究(TGF-β浓度)
与实施例2同样地进行三维培养时，在添加有EGF 10ng/mL、Y-27632 10μM的培养基中分别以4ng/mL、20ng/mL、100ng/mL添加TGF-β3来进行培养。将结果示于图6A。
另外，利用QIAzol回收样品，与实施例3同样地进行各种基因表达分析。将代表性的结果示于图6B。
由图6A和B暗示，TGF-β即使在4ng/mL的情况下，也一定程度地推进了成熟化，与TGF-β的添加浓度相应地推进成熟化。
实施例7泪腺类器官的诱导条件研究(集落形状)
将实施例2中回收的CD200-、SSEA4+、CD104+的眼表干细胞以100～200个细胞/孔(12孔板)进行接种，在向DMEM/F-12中添加有2％B27补充剂、20ng/mL KGF和10μM Y-27632的培养基中培养29天。将通过延时摄影对集落形成的状况进行拍摄的结果示于图7A。
由图7A显示出，集落的形状有两种(扁平型：F、圆顶型：D)形状，随着培养时间的经过，该集落的形状逐渐变为扁平型(图7B示出圆顶型集落在全部集落中的比例)。另外，挑取所形成的集落，包埋到基质胶GFR(康宁)中，使用向在DMEM/F-12中添加B27补充剂的所得物中添加Y-27632 10μM、EGF 10ng/mL而得到的培养基进行三维培养时，扁平型集落保持球体(Spheriod)的状态，呈泪腺样结构的概率低，与此相对，圆顶型集落呈泪腺样结构(分支)的概率显著高(图7C)。由此推测，圆顶型集落具有更容易形成泪腺样结构的性质。
实施例8人角膜缘干细胞向泪腺类器官的诱导
将人角膜缘干细胞接种到用iMatrix-511包被的培养皿中，在向DMEM/F-12中添加B27补充剂的所得物中添加KGF 20ng/mL、Y-27632 10μM而得到的培养基中进行16天二维培养(片)。另外，使用20000个人角膜缘干细胞，与实施例2同样地形成球体，将所得到的球体包埋到基质胶GFR中，在向DMEM/F-12中添加B27补充剂的所得物中添加EGF 10ng/mL、Y-27632 10μM而得到的培养基(YE)、进一步添加TGF-β3 100ng/mL而得到的培养基(YET3)中分别进行三维培养。将结果示于图8A。
另外，使用QIAzol回收样品，与实施例3同样地进行各种基因表达分析。将代表性结果示于图8B。
由图8A和图8B可知，进行二维培养时形成角膜上皮细胞片，而通过进行三维培养，由人角膜缘干细胞形成具有腺样结构的类器官。另外确认到，通过像YE、YET3这样改变处理，泪腺上皮细胞的相关标志物的表达也阶段性地进一步增强，促进了成熟化。
实施例9对裸大鼠的移植实验和移植片的分析
将5周龄、雌性F344/NJcl-rnu/rnu(裸大鼠)的左眼窝外泪腺摘除，向该部位移植由50000个源自iPS细胞的眼表干细胞在向DMEM/F-12中添加有B27补充剂、EGF 10ng/mL、Y-27632 10μM的培养基中进行25天培养而诱导出的泪腺类器官。34天后使其安乐死后，摘除移植片(图9A、B、C)进行分析。
首先，将移植片包埋到OCT混合物中，利用10％中性缓冲***液固定后，进行HE染色(图9D)。
另外，将移植片的切片用5％NST(含有5％正常驴血清、3％Triton的TBS)封闭后，利用抗AQP5抗体(sc-9890)、抗LTF抗体(ab15811)、抗HTN1抗体(sc-28110)进行一次抗体反应，清洗后，对以Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568标记的二次抗体处理1小时，进行染色。此外，二次抗体反应的最后10分钟利用Hoechst 33342对核进行染色(图10A)。
将移植片的提取液供于hLTF ELISA(ab108882)，以裸大鼠泪腺的提取液(NC)和水(Water)作为比较对象，测定移植片中含有的hLTF蛋白的量(图10B)。
源自iPS细胞的泪腺类器官在移植后也表达泪腺组织的主要功能蛋白，充分暗示出在再生医疗中的应用可能性。
实施例10由ES细胞向泪腺类器官的诱导
与实施例1、2同样地形成类器官。具体而言，使用人ES细胞(KhES-1)与实施例1同样地制备SEAM细胞群，与实施例2同样地获得眼表干细胞后，使用向在DMEM/F-12中添加B27补充剂的所得物中添加Y-27632 10μM、KGF 20ng/mL而得到的培养基，将所得到的眼表干细胞以100000个细胞/球体接种到PrimeSurface(注册商标)96U板中，培养一天，形成球体。接着，将其包埋到基质胶GFR中，进一步使用向在DMEM/F-12中添加B27补充剂的所得物中添加Y-27632 10μM、EGF 10ng/mL而得到的培养基进行两周培养，在第1天、第3天、第14天拍摄亮视野的照片。将结果示于图11。
由图11确认到，由源自ES细胞的眼表干细胞也形成了具有腺样结构的类器官。
产业上的可利用性
根据本发明，能够由包括iPS细胞的多能干细胞制造泪腺类器官，因此对于利用细胞医疗进行的泪腺相关疾病的再生治疗和与上述疾病相关的研究极其有用。

Claims (12)

1.一种源自干细胞的泪腺组织的制作方法，其特征在于，从由多能干细胞得到的SEAM细胞群(自我形成的外胚层自主性多区细胞群)中分离出CD200阴性SSEA4阳性CD104阳性的细胞，将所得到的细胞在含有EGF(表皮生长因子)和ROCK抑制剂的培养基中进行三维培养，由此获得表达泪腺的相关蛋白的细胞群。
2.如权利要求1所述的制作方法，其中，培养基进一步含有TGF-β。
3.如权利要求1所述的制作方法，其中，相关蛋白为选自AQP5、LYZ、CNN1、BARX2、SOX9、SOX10、RUNX1、TFCP2L1、LTF和HTN1中的一种以上。
4.一种源自干细胞的泪腺组织的制作方法，其特征在于，将角膜缘干细胞在含有EGF和ROCK抑制剂的培养基中进行三维培养，由此获得表达泪腺的相关蛋白的细胞群。
5.如权利要求4所述的制作方法，其中，培养基进一步含有TGF-β。
6.如权利要求4所述的制作方法，其中，相关蛋白为选自AQP5、LYZ、CNN1、BARX2、SOX9、SOX10、RUNX1、TFCP2L1、LTF和HTN1中的一种以上。
7.一种移植用泪腺类器官的制造方法，其包括对利用权利要求1～6中任一项所述的制作方法得到的泪腺上皮细胞进行培养的工序。
8.一种泪腺相关疾病的药剂筛选方法，其包括对利用权利要求1～6中任一项所述的制作方法得到的泪腺上皮细胞进行培养的工序。
9.一种泪液的制造方法，其包括：
利用权利要求7所述的方法制作泪腺类器官的工序、以及
回收由得到的泪腺类器官分泌的泪液的工序。
10.一种药物组合物的制造方法，其包括：
利用权利要求7所述的方法制作泪腺类器官的工序、
回收由得到的泪腺类器官分泌的泪液的工序、以及
配合得到的泪液的工序。
11.一种容易分化诱导为源自干细胞的泪腺组织的细胞的选择方法，其特征在于，从由多能干细胞得到的SEAM细胞群(自我形成的外胚层自主性多区细胞群)中分离出CD200阴性SSEA4阳性CD104阳性的细胞，选择形成圆顶型集落的细胞。
12.一种具有包含导管和腺泡结构的立体结构的类器官，其利用权利要求7所述的方法得到。
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