KR101871949B1 - 장 섬유화 세포 모델의 제조방법 - Google Patents

장 섬유화 세포 모델의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101871949B1
KR101871949B1 KR1020170003630A KR20170003630A KR101871949B1 KR 101871949 B1 KR101871949 B1 KR 101871949B1 KR 1020170003630 A KR1020170003630 A KR 1020170003630A KR 20170003630 A KR20170003630 A KR 20170003630A KR 101871949 B1 KR101871949 B1 KR 101871949B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tgf
tnf
ieos
cells
intestinal
Prior art date
Application number
KR1020170003630A
Other languages
English (en)
Inventor
유준환
유종만
한수정
남명옥
Original Assignee
의료법인 성광의료재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 의료법인 성광의료재단 filed Critical 의료법인 성광의료재단
Priority to KR1020170003630A priority Critical patent/KR101871949B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101871949B1 publication Critical patent/KR101871949B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 장 상피 오가노이드를 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 형질전환성장인자-β1(TGF-β1)으로 처리하는 것을 포함하는 장 섬유화 세포 모델의 제조방법을 제공한다.

Description

장 섬유화 세포 모델의 제조방법{Process for preparing a cellular model of intestinal fibrosis}
본 발명은 장 섬유화 세포 모델의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장 상피 오가노이드를 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 형질전환성장인자-β1(TGF-β1)으로 처리하는 것을 포함하는 장 섬유화 세포 모델의 제조방법에 관한 것이다.
장 섬유화(intestinal fibrosis)는 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases, IBDs)의 공통된 합병증이다(Latella, G., et al. European review for medical and pharmacological sciences 17, 1283-1304 (2013)). 장 섬유화가 IBD 환자의 이환율 및 사망율을 증가시킬 뿐만 아니라 삶의 질 감소를 야기하는 주요한 원인임에도 불구하고, 장 섬유화를 예방 또는 치료할 수 있는 FDA 승인된 항-섬유화제는 아직 개발되어 있지 않다. 항-섬유화제를 개발하기 위하여는 이들의 효능을 확인할 수 있는 적절한 장 섬유화 실험 모델이 필요하다. 그러나 현재 사용되고 있는 섬유화 모델은 항-섬유화제의 스크리닝에 사용되는데 있어 많은 한계를 가지고 있다. 가장 널리 사용되는 장 섬유화 세포 모델은 형질전환성장인자-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1) 또는 기계적 스트레스로 섬유모세포(myofibroblasts)를 처리함으로써, 섬유모세포의 섬유화 반응을 활성화시킨다(Rodansky, E. S., et al., Experimental and molecular pathology 98, 346-351, doi:10.1016/j.yexmp.2015.03.033 (2015); Johnson, L. A. et al. Inflammatory bowel diseases 20, 154-165, doi:10.1097/01.mib.0000437615.98881.31 (2014); Speca, S. et al. Inflammatory bowel diseases 22, 279-292, doi:10.1097/mib.0000000000000618 (2016)). 그러나, 이들 모델은 3차원의 장 구조를 반영하고 있지 않기 때문에 생체내 생리(in vivo physiology)를 완전히 재현하지 않는다. 통상적으로 사용되는 트리니트로벤젠 술폰산(TNBS) 모델 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 모델을 포함한 생체내(in vivo) 장 섬유화 모델 또한 인간의 병태생리를 나타내지 못하고 또한 비효율적이고 고가이기 때문에 대규모 약물 스크리닝에 적합하지 않다(Rodansky, E. S., et al. Experimental and molecular pathology 98, 346-351, doi:10.1016/j.yexmp.2015.03.033 (2015)). 최근에는 다능성 줄기세포 유래의 오가노이드-기반 장 섬유화 모델이 개발된 바 있다(Rodansky, E. S., et al. Experimental and molecular pathology 98, 346-351, doi:10.1016/j.yexmp.2015.03.033 (2015)). 그러나, 다능성 줄기세포-유래의 오가노이드 모델을 제작하는 것은 고비용 및 장기간이 소용될 뿐 아니라 다능성 줄기세포를 취급하기 위한 높은 기술이 요구된다는 점에서 아직 이용가능하지 않다(McCracken, K. W. et al., Nat Protoc 6, 1920-1928, doi:10.1038/nprot.2011.410 (2011); Spence, J. R. et al. Nature 470, 105-109, doi:10.1038/nature09691 (2011)).
한편, 상피-중간엽 전환(epithelial to mesenchymal transition, EMT)은 상피세포가 중간엽 세포로 바뀌는 것으로 한 종류의 세포가 다른 종류의 세포로 분화하는 세포 형성성(cell plasticity)의 한 가지 형태이다. 상피세포는 상피-상피 간 혹은 상피-기질 간의 접촉부위에 부착 단백질이 있고, 세포골격 구성에 의해 세포의 위쪽과 기저쪽이 구분되는 극성을 유지하면서, 장벽의 역할을 하거나 분비와 흡수작용을 한다. 이에 반해 중간엽 세포는 개개의 세포로 떨어져서 움직이며, 극성이 없고, 결합조직이나 세포외기질을 형성하는 세포이다. 상피-중간엽 전환이 되면 상피세포가 극성을 잃고 세포모양이 정방형에서 섬유아세포형으로 바뀌고 상피세포 마커는 감소하고 중간엽 세포 마커가 증가한다. EMT는 조직에서의 역할에 따라 3가지 형으로 분류된다. 제1형은 태생기의 태아 형성과 중간엽 및 신경관을 형성하는 발달과정에 관여한다. 제2형은 조직이 손상되었을 때 조직 반응은 손상된 조직과 동일한 세포로 대체되어 손상의 흔적이 남지 않는 재생과 정상조직이 결체조직으로 대체되는 섬유증식 혹은 섬유화를 일으킨다. 제3형은 암과 연관되어 암의 발생, 침습, 전이, 재발 및 항암제 내성에 관여한다.
제2형 상피-중간엽 전환은 장 섬유화의 핵심 기전 중 하나로서 알려져 있다. 활성화된 섬유모세포는 장 섬유화에 있어서 핵심적인 작동 세포(effector cells)이며, 다량의 콜라겐-풍부 세포외기질을 생산한다. 상기 섬유모세포는 EMT에 의해 상피세포로부터 유도될 수 있다. EMT 과정에서, 상피세포는 방추체-모양의(spindle-shaped) 형태 변화를 나타내고, 비멘틴(vimentin), α-평활근 액틴(smooth muscle actin, α-SMA)과 같은 중간엽 세포 마커를 발현하며, 상피세포 마커를 잃게 된다(Rieder, F. & Fiocchi, C. Gastroenterology & hepatology 6, 228-235, doi:10.1038/nrgastro.2009.31 (2009); Kalluri, R. & Weinberg, R. A. The Journal of clinical investigation 119, 1420-1428, doi:10.1172/jci39104 (2009)). EMT가 장 섬유화의 주요 기전 중 하나일지라도, EMT-관련 장 섬유화에 근거한 기존의 시험관내 모델은 유용성이 제한되며, 이는 시험관내 배양에서 분리된 초기(primary) 상피세포의 신속한 사멸로 인하여(Grossmann, J. et al. The American journal of pathology 153, 53-62, doi:10.1016/s0002-9440(10)65545-9 (1998)), 불멸화 상피세포주를 사용하기 때문이다(Cheng, M. et al. Clinical and experimental gastroenterology 8, 13-29, doi:10.2147/ceg.s70906 (2015); Flier, S. N. et al. The Journal of biological chemistry 285, 20202-20212, doi:10.1074/jbc.M110.102012 (2010)). 불멸화는 자주 유전자 발현 프로파일의 변화 및 변경된 반응으로 이어지게 되며, 따라서 이러한 세포주는 초기(primary) 세포를 대표하지 못한다(Grabinger, T. et al. Cell death & disease 5, e1228, doi:10.1038/cddis.2014.183 (2014)).
본 발명자들은 항-섬유화제의 스크리닝에 효과적으로 사용될 수 있는 장 섬유화 세포 모델로서, 인간 생체내 생리(in vivo physiology)를 갖는 장 섬유화 세포 모델을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 장 상피 오가노이드(intestinal epithelial organoids, IEOs)에 상피-중간엽 전환(EMT) 유도제인 TGF-β1을 처리할 경우 IEOs에서 EMT를 약간 유도할 뿐 IEOs의 파괴(disruption)를 야기하지만, TNF-α 및 TGF-β1를 순차적으로 처리할 경우 IEOs에서 제2형 EMT가 효과적으로 유도되고 또한 중간엽 세포의 증식이 효과적으로 유도된다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 장 상피 오가노이드의 상피-중간엽 전환(EMT)을 통한 장 섬유화 세포 모델의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 장 상피 오가노이드를 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 형질전환성장인자-β1(TGF-β1)으로 처리하는 것을 포함하는 장 섬유화 세포 모델의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 처리는 장 상피 오가노이드를 TNF-α를 함유하는 배지 중에서 1∼3 일 동안 배양한 후, TNF-α 및 TGF-β1을 함유하는 배지 중에서 1∼5 일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 TNF-α를 함유하는 배지는 TNF-α를 8∼64 ng/ml의 농도로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 TNF-α 및 TGF-β1을 함유하는 배지는 TNF-α를 8∼64 ng/ml의 농도로 포함하고, TGF-β1을 2∼16 ng/ml의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 장 상피 오가노이드는 체외로 배출된 인간 또는 동물의 소장 또는 대장으로부터 크립트를 분리하는 단계; 및 상기 크립트를 마트리겔과 혼합하여 3차원 배양을 수행하는 단계를 포함하는 배양방법에 의해 얻어질 수 있다.
TNF-α 및 TGF-β1이 장 상피 오가노이드에서 제2형 상피-중간엽 전환을 효과적으로 유도한다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌으며, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 오가노이드-기반 상피-중간엽 전환(organoid-based epithelial to mesenchymal transition, OEMT) 모델은 항-섬유화제의 스크리닝에 효과적으로 사용될 수 있는 장 섬유화 세포 모델로서 사용될 수 있다. 본 발명의 제조방법에 따라 얻어지는 장 섬유화 세포 모델은 인간 생체내 생리(in vivo physiology)를 갖는 3차원 모델이며, 또한 비용-효율적으로 간단히 수행될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 TGF-β1 처리에 의한 IEOs의 파괴를 나타낸다. 도 1a는 IEOs의 세포 구성성분을 장 상피를 구성하는 다양한 세포 마커로 염색한 결과를 나타낸다[바(bar): 50 μm]. 도 1b는 TGF-β로 처리 또는 비처리된 IEOs를 나타내는 대표적인 이미지를 나타낸다[바(bar): 100 μm]. 도 1c는 TGF-β1-매개 IEO 파괴의 농도-의존성을 나타낸다. 살아있는 오가노이드 및 파괴된 오가노이드의 수는 TGF-β1 처리 농도별로 계수하였다. 도 1d는 TGF-β1-매개 IEO 파괴의 시간-의존성을 나타낸다. 살아있는 오가노이드 및 파괴된 오가노이드의 수는 처리 후의 시간에 따라 계수하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내며; 바(bar) 당 3개의 샘플이다.
도 2는 TNF-α의 전처리가 TGF-β 처리된 IEOs에서 중간엽 변화를 상승적으로 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 2a는 TNF-α 및 TGF-β1으로 처리된 IEOs에서 중간엽 변화 및 이동 세포의 시간-경과(Time-course) 이미지를 나타낸다[바(bar): 100 μm, 적색 화살표: 이동 세포(migrating cells)]. 도 2b는 α-SMA 및 Ki67의 발현을 TGF-β 및 TNF-α 처리된 IEOs에서 측정한 결과를 나타낸다[바(bar): 50μm]. 도 2c는 모든 콜로니 중 α-SMA 양성 콜로니의 백분율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 2d는 모든 콜로니 중 Ki67 양성 콜로니의 백분율을 측정한 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내며; 바(bar) 당 4개의 샘플이다. **p < 0.01, *p<0.05.
도 3은 TNF-α의 전처리가 마우스 대장으로부터 유래된 TGF-β 처리된 IEOs에서 중간엽 변화를 상승적으로 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 3a는 TNF-α 및 TGF-β1으로 처리된 cIEOs에서 중간엽 변화 및 이동 세포의 시간-경과(Time-course) 이미지를 나타낸다[바(bar): 100 μm, 적색 화살표: 이동 세포(migrating cells)]. 도 3b는 α-SMA 및 Ki67의 발현을 TGF-β 및 TNF-α 처리된 cIEOs에서 측정한 결과를 나타낸다[바(bar): 50μm]. 도 3c는 모든 콜로니 중 α-SMA 양성 콜로니의 백분율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 3d는 모든 콜로니 중 Ki67 양성 콜로니의 백분율을 측정한 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내며; 바(bar) 당 4개의 샘플이다. **p < 0.01, *p<0.05.
도 4는 본 발명의 제조방법의 모식도를 나타낸다. 도 4에서 적색점(red spots)은 장 상피 오가노이드를 나타낸다.
본 발명은 장 상피 오가노이드를 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 형질전환성장인자-β1(TGF-β1)으로 처리하는 것을 포함하는 장 섬유화 세포 모델의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법을 모식도로 나타내면 도 4와 같다.
장 상피 오가노이드(IEOs)에 상피-중간엽 전환(EMT) 유도제인 TGF-β1을 처리할 경우 IEOs에서 EMT를 약간 유도할 뿐 IEOs의 파괴를 야기하였으나, TNF-α 및 TGF-β1를 순차적으로 처리할 경우 IEOs에서 제2형 EMT가 효과적으로 유도되고 또한 중간엽 세포의 증식이 효과적으로 유도된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 특히, 대장암 세포인 LIM1863 세포에 관한 종래의 연구에 따르면(Bates, R. C. & Mercurio, A. M. Molecular Biology of the Cell 14, 1790-1800, doi:10.1091/mbc.E02-09-0583 (2003)), TNF-α가 TGF-β와 상승적으로 작용하여 침습성 대장암(invasive colon carcinoma)(즉, 제3형 EMT)으로의 변화를 유도한다. 그러나, 장 상피 오가노이드에 대한 TNF-α 및 TGF-β1의 처리는 침습성 암세포로의 변화(tumor development)가 아닌 중간엽 변화(mesenchymal changes)만을 유도한다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 오가노이드-기반 상피-중간엽 전환(organoid-based epithelial to mesenchymal transition, OEMT) 모델은 항-섬유화제의 스크리닝에 효과적으로 사용될 수 있는 장 섬유화 세포 모델로서 사용될 수 있다. 본 발명의 제조방법에 따라 얻어지는 장 섬유화 세포 모델은 인간 생체내 생리(in vivo physiology)를 갖는 3차원 모델이며, 또한 비용-효율적으로 간단히 수행될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 처리는 장 상피 오가노이드를 TNF-α를 함유하는 배지 중에서 1∼3 일 동안, 바람직하게는 약 2일 동안 배양(1차 배양)한 후, TNF-α 및 TGF-β1을 함유하는 배지 중에서 1∼5 일 동안, 바람직하게는 약 3일 동안 배양(2차 배양)함으로써 수행될 수 있다.
상기 1차 배양 및 2차 배양에 사용되는 배지로는 장 상피 오가노이드의 배양, 증식에 통상적으로 사용되는 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스의 장 상피 오가노이드의 경우 IntesticultTM OGM 마우스 기초 배지(StemCell Technologies, Cambridge, MA)가 사용될 수 있으며, 인간의 장 상피 오가노이드의 경우 인간 장 오가노이드 배양 배지가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 1차 배양에서 사용되는 배지 중의 장 상피 오가노이드의 양은 EMT 유도에 적합한 양으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 24웰 플레이트의 웰 당 100∼300 개의 범위로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1차 배양에서 사용되는 배지 중의 TNF-α 농도는 8∼64 ng/ml의 범위, 바람직하게는 약 32 ng/ml 일 수 있다. 또한, 상기 2차 배양에서 사용되는 배지 중의 TNF-α 및 TGF-β1의 농도는 각각 8∼64 ng/ml의 범위, 바람직하게는 약 32 ng/ml; 및 2∼16 ng/ml 농도의 범위, 바람직하게는 약 8 ng/ml일 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 사용되는 상기 "장 상피 오가노이드(intestinal epithelial organoids, IEOs)"는 공지의 방법에 따라 장 크립트(intestinal crypts) 또는 장 줄기세포(intestinal stem cells)로부터 얻어질 수 있고 또한 3차원 배양될 수 있다(Ootani, A. et al. Nat Med 15, 701-706, doi:10.1038/nm.1951 (2009), Sato, T. et al. Nature 459, 262-265, doi:10.1038/nature07935 (2009) 등). 3차원 배양되는 인간의 장 상피 오가노이드는 인간의 생체내 생리(in vivo physiology)를 재현하며, 이는 IEOs가 장 줄기세포로부터 분화 및 증식되는 모든 유형의 장 상피세포를 포함하고 있기 때문이다. 일 구현예에서, 상기 장 상피 오가노이드는 체외로 배출된 인간 또는 동물의 소장 또는 대장으로부터 크립트(crypts)를 분리하는 단계; 및 상기 크립트를 마트리겔과 혼합하여 3차원 배양을 수행하는 단계를 포함하는 배양방법에 의해 얻어질 수 있다. 상기 체외로 배출된 인간의 소장 또는 대장은 예를 들어, 각종 검사를 위해 위장관 내시경 등을 통하여 소장 또는 대장으로부터 배출된 생검 조직 등을 말한다. 상기 크립트 분리 및 3차원 배양은 상기한 공지의 방법에 따라 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 물질 및 시험방법
(1) 시험동물
본 연구는 차의과학대학교 동물실험윤리위원회(CHA University Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정 및 지침에 따라 승인 및 수행되었다. 동물의 고통을 최소화하고 또한 사용되는 동물의 수를 감소시키기 위한 모든 노력을 다하였다. 웅성 C57Bl/6 마우스는 오리엔트 바이오(Orient Bio, 성남, 대한민국)로부터 구입하였으며, 12시간 명/암 주기로 사료와 물을 자유롭게 허용하면서 차의과학대학교의 동물시설에서 사육하였다.
(2) 마우스 소장 유래의 IEOs의 제조
각각 체중 20∼25 g의 5-7 주령의 C57Bl/6 마우스를 사용하여 IEOs를 제조하였다. 마우스를 경추탈골에 의해 치사시킨 후, 소장을 분리하였다. 소장을 근위 단부(proximal end)로부터 원위 단부(distal end)까지 세로방향으로 자르고, 약 5 mm 길이 조각으로 가로방향으로 잘랐다. 얻어진 소장 조각을 얼음-냉각시킨 둘베코 인산완충식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, DPBS)로 상층액이 충분히 맑아질 때까지 세척하였다. 이후, 젠틀 세포 분리 시약(Gentle Cell Dissociation Reagent)(StemCell Technologies, Cambridge, MA)으로 처리하고 70 um 세포 여과기(cell strainer)로 여과하여 크립트(crypts)를 분리하였다. 분리된 크립트를 마트리겔(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)과 1:1의 비율로 혼합하고, 48-웰 플레이트에 넣었다. 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 마트리겔을 중합시킨 후, 배지로서 IntesticultTM OGM 마우스 기초 배지(StemCell Technologies, Cambridge, MA) 400 ul를 첨가한 다음, 상기 플레이트를 가습 인큐베이터(5% CO2)에서 37℃에서 유지시켰다. 배지는 2일마다 교체하였다.
(3) 마우스 대장 유래의 IEOs의 제조
크립트의 분리를 제외하고는, 상기한 바와 동일하게 마우스 대장 유래의 IEOs의 제조를 수행하였다. 대장(colon)으로부터 크립트의 분리를 위하여, 대장 조각을 얼음-냉각시킨 크립트 킬레이트 완충액(DPBS 중 2mM EDTA)과 함께 30분간 인큐베이션하고, 분리 완충액((DPBS 200 ml 중 D-솔비톨 2 g 및 수크로오즈 3 g)으로 몇분 동안 격렬하게 뒤집었다(inverted). 분리된 크립트를 마트리겔(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)과 혼합하고, 48-웰 플레이트에 넣고, IntesticultTM OGM 마우스 기초 배지에서 유지시켰다.
(4) 사이토카인의 순차적 처리에 의한 OEMT의 유도
마우스 TGF-β1(R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 재조합 마우스 TNF-α(Biolegend, San Diego, CA)를 본 시험에서 사용하였다. IEOs(100∼300개/웰)를 IEO 배양 배지(IntesticultTM OGM 마우스 기초 배지)에 접종하여 1일 동안 배양한 다음, 32 ng/ml의 TNF-α를 함유하는 IEO 배양 배지로 배지를 교체하여 2일 동안 배양(1차 배양)하였다. 이후, 8 ng/ml의 TGF-β1 및 32 ng/ml의 TNF-α를 함유하는 IEO 배양 배지로 배지를 교체한 후 추가로 3일 동안 배양하였다.
(5) 면역형광분석 ( Immunofluorescence )
배양 배지를 제거하고, 마트리겔 중의 오가노이드를 DPBS로 세척하였다. 마트리겔이 파괴될 때까지 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. PBS 완충액 중의 0.1% 트윈-20 및 0.2% 트리톤-X100을 사용하여 투과화(permeabilization)를 수행한 다음, DPBS 중의 5% BSA를 사용하여 비특이적 결합을 감소시켰다. 샘플을 4℃에서 1차 항체로 밤새 결합시켰다. 다음날, 샘플을 2차 항체로 실온에서 2시간 동안 결합(embeded)시켰다. 염색을 위해 사용된 항체는 다음가 같다: Mucin 2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Ki67 항체(Abcam, Cambridge, MA), Lgr5(Abgent, San Diego, CA), E-카드헤린(E-cadherin)(Santa Cruz Biotechnology), 크로모그라닌 A(Santa Cruz), β-카테닌(Abcam), 라이소자임(Diagnostic Biosystems, Fremont, CA), α-SMA(Sigma-Aldrich), 비멘틴(BD Biosciences), 및 Alexa Flour 488 컨쥬게이티드 항-토끼 IgG 및 Alexa Flour 594 컨쥬게이티드 항-마우스 IgG(Life Technologies, Gaithersburg, MD).
(6) 통계분석
2 군간의 차이는 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)로 평가하였다. 3개 이상의 군은 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후, Student-Newman-Keuls post hoc test로 비교하였다. 차이는 p<0.05에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
2. 시험결과
(1) TGF - β1 처리는 농도 및 시간 의존적으로 IEOs의 파괴를 유도하였다.
IEOs의 TGF-β1 매개 EMT를 탐색하기 위하여, 마우스 소장으로부터 분리한 크립트 유래의 IEOs를 배양하였다. 증식세포(proliferating cells), 장줄기세포(intestinal stem cells), 고블릿 세포(goblet cells), 파네트 세포(paneth cells), 장내분비 세포(enteroendocrine cells), 및 상피 세포(epithelial cells)에 대한 마커로서, 각각 K0i67, Lgr5, muc-2, 라이소자임, 크로모그라닌 A(ChgA), 및 β-카테닌에 대하여 IEOs를 면역염색시켰다. 면역염색 결과는 이들 모든 세포가 상기 IEOs에 존재함을 나타내었다(도 1a).
IEOs에서 TGF-β1의 효과를 확인하기 위하여, IEOs의 최초 접종으로부터 2일 후에 IEO 배양 배지에 1 ng/ml의 TGF-β1을 첨가하고, 형태 변화를 관찰하였다. 비히클(DPBS)만 처리한 대조 IEOs에 비하여 TGF-β1으로 처리된 IEOs에서 파괴되거나 혹은 사망한 오가노이드의 수가 더 높은 것이 관찰되었다(도 1b). TGF-β1-매개 IEO 파괴의 농도-의존성을 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 ng/ml의 TGF-β1 농도로 측정하였으며, 살아있는 IEOs 및 사망한 IEOs를 처리 후 12시간 간격으로 정량하였다. 도 1c 및 1d에 나타낸 바와 같이, TGF-β1은 농도-의존적 및 시간-의존적으로 IEOs의 파괴를 유도하였다. 이러한 결과는, 암세포주에 대한 종래의 보고, 즉 상피세포주에서의 병리적 EMT(pathological EMT)의 유도(Yang, Y., et al. Oncogene 25, 7235-7244, doi:10.1038/sj.onc.1209712 (2006))와는 대조적으로, TGF-β1 처리는 주로 IEOs의 파괴 및 세포 사망을 야기한다는 것을 보여 준다.
(2) TNF -α의 전처리는 TGF - β1 처리된 IEOs에서 중간엽 표현형 변화(mesenchymal phenotypic changes)를 상승적으로 유도할 수 있다.
IEOs의 초기 접종으로부터 1일째 및 2일째에 IEOs를 각각 TNF-α 및 TGF-β으로 처리하였을 때, 중간엽 변화 및 이동이 관찰되는지 여부를 측정하였다. TNF-α 및 TGF-β1으로 처리된 IEOs에서의 중간엽 변화 및 이동 세포의 수는 TNF-α 없이 TGF-β1으로 처리된 IEOs에 비하여 더 많았다(도 2a). TNF-α 및 TGF-β1 처리된 IEOs를 비멘틴, α-SMA 및 Ki67에 대하여 면역염색하였을 때, 거의 모든 중간엽 변화된 콜로니들이 중간엽 및 증식 마커를 나타내었다(도 2b). TGF-β1 처리군에 비하여 TNF-α 및 TGF-β1 처리군에서 α-SMA 양성 콜로니의 약 1.57배 증가(n=4, p<0.05)(도 2c), 및 Ki67 양성 콜로니의 약 2.89배 증가(n=4, p<0.05)(도 2d)가 관찰되었다. 이러한 결과는 암세포 유래의 오가노이드에 대한 종래의 보고와는 차이를 나타낸다. 즉, 대장암 세포인 LIM1863 세포에 관한 종래의 연구는 기질적으로 유래된 TNF-a가 TGF-β와 상승적으로 작용하여 침습성 대장암 생성(invasisve colon carcinogenesis)을 야기한다는 것을 밝힌 바 있다(Bates, R. C. & Mercurio, A. M. Molecular Biology of the Cell 14, 1790-1800, doi:10.1091/mbc.E02-09-0583 (2003)). 그러나, 상기 결과는 TNF-α 전처리가 TGF-β1 처리된 IEOs에서 암세포로의 변화(tumor development)가 아닌 중간엽 변화(mesenchymal changes)를 유도하는데 효과적임을 나타낸다.
(3) TNF -α의 전처리는 마우스 대장 유래의 TGF - β1 처리된 IEOs에서 중간엽 표현형 변화를 상승적으로 유도할 수 있다.
마우스 소장 유래의 TGF-β1 처리된 IEOs의 중간엽 변화가 TNF-α에 의해 상승적으로 유도되었으므로, TNF-α 전처리가 마우스 대장 유래의 TGF-β1 처리된 IEOs(cIEOs)에서 중간엽 변화를 촉진하는지 여부를 측정하였으며, 상기한 시험과 동일한 방법으로 cIEO 시험을 수행하였다. cIEO를 배양에서 1일째에 TNF-α 처리 및 상기 cIEO 배양에서 2일째에 TGF-β1 처리 후에, 중간엽 변화 및 이동이 관찰되는지 여부를 측정하였다.
TNF-α 및 TGF-β1으로 처리된 cIEOs에서의 중간엽 변화 및 이동 세포는 TNF-α 없이 TGF-β1으로 처리된 cIEOs에 비하여 더 많았다(도 3a). TNF-α 및 TGF-β1 처리된 cIEOs를 비멘틴, α-SMA 및 Ki67에 대하여 면역염색하였을 때, 거의 모든 중간엽 변화된 콜로니들이 중간엽 및 증식 마커를 나타내었다(도 3b). TGF-β1 처리군에 비하여 TNF-α 및 TGF-β1 처리군에서 α-SMA+ 콜로니의 약 2.0배 증가(n=4, p<0.01)(도 3c), 및 Ki67 양성 콜로니의 약 1.7배 증가(n=4, p<0.05)(도 3d)가 관찰되었다. 이러한 결과는 IEOs와 유사하게 TNF-α 전처리가 TGF-β1 처리된 cIEOs에서 중간엽 변화(mesenchymal changes)를 유도하는데 효과적임을 나타낸다.
3. 고찰
최근 Clever 그룹 등은 분리된 장 크립트가 크립트-융모 구조를 갖는 IEOs를 생성하는 장기간 배양 조건을 확립한 바 있다(Sato, T. et al. Nature 459, 262-265, doi:10.1038/nature07935 (2009); 및 Sato, T. & Clevers, Science (New York, N.Y .) 340, 1190-1194, doi:10.1126/science.1234852 (2013)). 이러한 IEOs를 사용하여, 본 발명자들은 제2형 EMT에 근거한 장 섬유화의 새로운 IEO 모델(OEMT 모델)을 제작하였다.
이전의 연구는 몇가지 상피세포주에서 강력한 EMT 유도제로서 TGF-β1을 사용하였다(Speca, S. et al. Inflammatory bowel diseases 22, 279-292, doi:10.1097/mib.0000000000000618 (2016); Cheng, M. et al. Clinical and experimental gastroenterology 8, 13-29, doi:10.2147/ceg.s70906 (2015); Yang, Y., et al. Oncogene 25, 7235-7244, doi:10.1038/sj.onc.1209712 (2006)). 본 발명자들은 TGF-β1 처리에 의해 IEOs에서 EMT를 유도하려고 시도하였으나, TGF-β1는 농도 및 시간-의존적으로 IEOs를 주로 파괴하였다. TGF-β1 인큐베이션(1 ng/ml)의 48시간 후에 거의 90%의 콜로니에서 파괴된 IEOs가 나타났다. 흥미롭게도 파괴된 IEO 유래의 콜로니의 10%에서, 방추체-모양의(spindle-shaped), 중간엽-유사의 세포 이동을 발견하였다. 이들 콜로니는 비멘틴 및 α-SMA에 대하여 양성이었으며, 이는 EMT-유래의 중간엽 세포임을 시사한다. 그러나, EMT 효율(α-SMA 양성 콜로니의 백분율)은 도 2(IEO 유래 콜로니에서 14%) 및 도 3(cIEO 유래 콜로니에서 21%)에 나타낸 바와 같이 상대적으로 높지 않았다. 이러한 결과는 TGF-β1이 IEOs에서 EMT를 유도할 수 있으나, 충분하지는 않다는 것을 나타낸다.
이어서, 본 발명자들은 TGF-β1 처리된 IEOs에 있어서 EMT의 효율을 개선하기 위하여 노력하였다. 상기 시험결과는 IEOs에서 EMT의 자극에 있어서 TNF-α의 중요한 역할을 시사한다. TNF-α 및 TGF-β1의 순차적인 처리에 의하여, TGF-β1만을 처리한 것에 비하여, IEOs에서 64% 및 cIEOs에서 95%로 EMT의 효율이 개선되었다. 최종적으로 본 발명자의 OEMT 모델에서 EMT가 IEOs에서는 23% 및 cIEOs에서는 41%로 나타났다.
인간의 생체내 생리(in vivo physiology)를 재현하는 IEO 배양 모델을 제조하는데 있어 많은 진보가 있음에도 불구하고, 현재까지 오가노이드-기반의 적절한 장 섬유화 모델은 없다. 최근, 다능성 줄기세포 유래의 오가노이드-기반 장 섬유화 모델이 개발된 바 있다(Rodansky, E. S., et al. Experimental and molecular pathology 98, 346-351, doi:10.1016/j.yexmp.2015.03.033 (2015)). 그러나, 다능성 줄기세포-유래의 오가노이드 모델을 제작하는 것은 고비용 및 장기간이 소용될 뿐 아니라 높은 기술이 요구된다는 점에서 아직 이용가능하지 않다(McCracken, K. W. et al., Nat Protoc 6, 1920-1928, doi:10.1038/nprot.2011.410 (2011); Spence, J. R. et al. Nature 470, 105-109, doi:10.1038/nature09691 (2011)). 본 발명에 따른 OEMT 모델은 장 크립트 유래의 IEOs에 TNF-α 및 TGF-β1의 순차적인 처리를 사용하는 간단한 방법으로 쉽게 제작될 수 있다. 48-웰 플레이트 및 더 작은 규모로 본 발명의 OEMT 모델을 배양할 수 있다는 것은 EMT 관련 섬유화를 저해하는 수많은 항-섬유화 약물 후보물질의 스크리닝을 가능하게 함으로써 경제적으로 정량 데이터를 생성할 수 있다. 결론적으로, 본 발명에 따라 얻어지는 오가노이드-기반 상피-중간엽 전환(organoid-based epithelial to mesenchymal transition, OEMT) 모델은 항-섬유화제의 스크리닝에 비용-효율적으로 사용될 수 있는 장 섬유화 세포 모델로서 사용될 수 있다.

Claims (5)

  1. 장 상피 오가노이드를 종양괴사인자-α(TNF-α)를 함유하는 배지 중에서 1∼3 일 동안 배양한 후, 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 형질전환성장인자-β1(TGF-β1)을 함유하는 배지 중에서 1∼5 일 동안 배양하는 것을 포함하는 장 섬유화 세포 모델의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 TNF-α를 함유하는 배지가 TNF-α를 8∼64 ng/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 TNF-α 및 TGF-β1을 함유하는 배지가 TNF-α를 8∼64 ng/ml의 농도로 포함하고, TGF-β1을 2∼16 ng/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항 및 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장 상피 오가노이드가 체외로 배출된 인간 또는 동물의 소장 또는 대장으로부터 크립트를 분리하는 단계; 및 상기 크립트를 마트리겔과 혼합하여 3차원 배양을 수행하는 단계를 포함하는 배양방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
KR1020170003630A 2017-01-10 2017-01-10 장 섬유화 세포 모델의 제조방법 KR101871949B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170003630A KR101871949B1 (ko) 2017-01-10 2017-01-10 장 섬유화 세포 모델의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170003630A KR101871949B1 (ko) 2017-01-10 2017-01-10 장 섬유화 세포 모델의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101871949B1 true KR101871949B1 (ko) 2018-06-27

Family

ID=62790076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170003630A KR101871949B1 (ko) 2017-01-10 2017-01-10 장 섬유화 세포 모델의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101871949B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200001843A (ko) * 2018-06-28 2020-01-07 연세대학교 산학협력단 타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법
WO2021071270A1 (ko) 2019-10-11 2021-04-15 오가노이드사이언스 주식회사 편도 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Curr Protoc Mouse Biol., 2014, Vol. 3, p. 217-240*
The American Journal of Pathology, Vol. 179, No. 5, p. 2660-2673, November 2011*

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200001843A (ko) * 2018-06-28 2020-01-07 연세대학교 산학협력단 타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법
KR102099402B1 (ko) 2018-06-28 2020-04-09 오가노이드사이언스 주식회사 타액선 줄기세포의 기능 강화용 배양 조성물 및 이를 이용한 타액선 줄기세포 기능 강화 방법
WO2021071270A1 (ko) 2019-10-11 2021-04-15 오가노이드사이언스 주식회사 편도 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gener Lahav et al. Melanoma‐derived extracellular vesicles instigate proinflammatory signaling in the metastatic microenvironment
Virant-Klun et al. Small putative NANOG, SOX2, and SSEA-4-positive stem cells resembling very small embryonic-like stem cells in sections of ovarian tissue in patients with ovarian cancer
Wilson et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids
Becker et al. Divergent fate and origin of neurosphere-like bodies from different layers of the gut
CN110191947A (zh) 工程化肠组织和其用途
Tunesi et al. Optimization of a 3D dynamic culturing system for in vitro modeling of frontotemporal neurodegeneration-relevant pathologic features
KR101871949B1 (ko) 장 섬유화 세포 모델의 제조방법
Xiang et al. Effects of Ginsenoside Rg1 Regulating Wnt/β‐Catenin Signaling on Neural Stem Cells to Delay Brain Senescence
Zhao et al. Migration and differentiation of mouse embryonic stem cells transplanted into mature cochlea of rats with aminoglycoside-induced hearing loss
EP3645022A1 (en) Single breast cell-derived organoids
Zhao et al. Chemical conversion of human epidermal stem cells into intestinal goblet cells for modeling mucus-microbe interaction and therapy
Ganguly et al. Mucin 5AC–Mediated CD44/ITGB1 Clustering Mobilizes Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells to Modulate Pancreatic Cancer Stromal Heterogeneity
CN114181886B (zh) 三维培养***在巴马猪和食蟹猴肠上皮类器官中的应用
WO2019006136A1 (en) ORGANOIDS DERIVED FROM A SINGLE VESIC CELL
Kim et al. Activation of Wnt signalling reduces the population of cancer stem cells in ameloblastoma
US11834680B2 (en) Single kidney cell-derived organoids
KR20190007700A (ko) 줄기세포 3차원 공배양을 통한 타액선 오가노이드 형성 방법
US20200362312A1 (en) Generation, proliferation and expansion of epithelial cells from primary tissue into mucosoid cultures
Liang et al. The differentiation of amniotic fluid stem cells into sweat glandlike cells is enhanced by the presence of Sonic hedgehog in the conditioned medium
Wang et al. Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the Smad expression of hepatic fibrosis rats
Zhao et al. Dedifferentiation of human epidermal melanocytes into melanoblasts in vitro
Chen et al. Hematopoietic stem and multipotent progenitor cells produce IL-17, IL-21 and other cytokines in response to TLR signals associated with late apoptotic products and augment memory Th17 and Tc17 cells in the bone marrow of normal and lupus mice
Salik et al. Comparative study of keratinocyte primary culture methods from paediatric skin biopsies for RNA‐sequencing
Kim et al. Differential expression of p63 isoforms in normal skin and hyperproliferative conditions
WO2023060681A1 (zh) 一种用于***原代细胞的培养基和培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant