JP2018085999A - 幹細胞のための培養培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】成体幹細胞集団を拡大及び/又は分化させるための培養培地であり、i.Rスポンジンのいずれか1つ、及び/又はRスポンジン模倣体、並びにii.TGF−βシグナル伝達を直接的又は間接的に負に調節する1種又は複数種の阻害剤を含む培養培地。前記阻害剤が、ALK5、ALK4、TGF−β受容体キナーゼ1及びALK7から選択される1種又は複数種のセリン/スレオニンプロテインキナーゼに結合し、かつその活性を低減する培養培地。更にBMP阻害剤、Wntアゴニスト、受容体型チロシンキナーゼリガンド、Bock阻外剤、ニコチンアミド及びガストリンから選択される1種以上の付加的成分を含む、培養培地。
【選択図】なし
Description
本発明は、幹細胞の培養培地および培養方法、特に幹細胞、例えばヒト上皮幹細胞の集団を拡大させるための培養培地および方法の分野にある。
幹細胞集団を拡大させるための培養培地および方法の関心は高い。幹細胞集団には多くの用途がある。例えば、幹細胞およびその分化した子孫は、細胞アッセイ、薬物スクリーニング、および毒性アッセイにおいて使用することができる。幹細胞はまた、細胞療法、例えば、損傷組織を治療するための再生医療における細胞療法の可能性も示している。幹細胞はまた、移植目的では、例えば、糖尿病などの治療用の膵β細胞移植のための分化細胞源として働くこともできる。さらに、効率的な細胞培養培地は研究目的で細胞集団を提供および維持するのに重要である。
i. Rスポンジン1〜4のいずれか1つおよび/またはRスポンジン模倣体; ならびに
ii. TGF-βシグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する1種または複数種の阻害剤
を含む、成体幹細胞集団を拡大および/または分化させるための培養培地を提供する。
i) 本発明の1つまたは複数のオルガノイドまたは細胞集団; ならびに
ii) 本発明の培養培地および/または細胞外マトリックス
を含む組成物を提供する。
[本発明1001]
以下を含む、成体幹細胞集団を拡大および/または分化させるための培養培地:
i. Rスポンジン1〜4のいずれか1つおよび/またはRスポンジン模倣体; ならびに
ii. TGF-βシグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する1種または複数種の阻害剤。
[本発明1002]
1種または複数種の阻害剤が、ALK5、ALK4、TGF-β受容体キナーゼ1、およびALK7からなる群より選択される1種または複数種のセリン/スレオニンプロテインキナーゼに結合し、かつその活性を低減する、本発明1001の培養培地。
[本発明1003]
TGF-βシグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する1種または複数種の阻害剤が、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、SD-208、LY-36494、およびSJN-2511からなる群より選択される、本発明1001または本発明1002の培養培地。
[本発明1004]
p38シグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する阻害剤をさらに含む、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1005]
p38シグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する1種または複数種の阻害剤が、SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257、およびBIRB-796からなる群より選択される、本発明1004の培養培地。
[本発明1006]
A83-01およびSB-202190またはA83-01およびSB-203580を含む、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1007]
阻害剤が1nM〜100μM、10nM〜100μM、100nM〜10μM、または約1μMの濃度で添加される、例えば、1種または複数種の阻害剤の総濃度が10nM〜100μM、100nM〜10μM、または約1μMである、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1008]
BMP阻害剤、Wntアゴニスト、受容体型チロシンキナーゼリガンド、Rock阻害剤、ニコチンアミド、およびガストリンより選択される1種または複数種の付加的な成分を含む、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1009]
Rスポンジン1〜4のいずれか1つおよび/またはRスポンジン模倣体、BMP阻害剤(例えばノギン(Noggin))、TGF-β阻害剤、受容体型チロシンキナーゼリガンド(例えばEGF)、ニコチンアミド、Wntアゴニスト(例えばWnt(3a))を含み、かつ任意で、p38阻害剤、ガストリン、FGF10、HGF、およびRock阻害剤より選択される1種または複数種の付加的な成分を含む、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1010]
BMP阻害剤が、ノギン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、DAN、DANシステインノットドメインを含むDAN様タンパク質、スクレロスチン/SOST、およびα-2マクログロブリンからなる群より選択される、本発明1008または本発明1009の培養培地。
[本発明1011]
Wntアゴニストが、Wnt-3a、GSK阻害剤(例えばCHIR99021)、Wnt5、Wnt-6a、ノリン(Norrin)、および他の任意のWntファミリータンパク質からなる群より選択される、本発明1008または本発明1009の培養培地。
[本発明1012]
受容体型チロシンキナーゼリガンドが、***促進増殖因子、例えば上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子-α(TGF-α)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、肝細胞増殖因子(HGF)、およびケラチノサイト増殖因子(KGF)からなる増殖因子ファミリーより選択される***促進増殖因子である、本発明1008または本発明1009の培養培地。
[本発明1013]
Rock阻害剤が、R-(+)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物(Y-27632)、5-(1,4-ジアゼパン-1-イルスルホニル)イソキノリン(ファスジルまたはHA1071)、および(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]-ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン二塩酸塩(H-1152)からなる群より選択される、本発明1008または本発明1009の培養培地。
[本発明1014]
プロスタグランジンシグナル伝達経路アクチベーター、例えばPGE2および/またはAAを付加的に含む、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1015]
テストステロン、例えば(ジヒドロ)テストステロンを付加的に含む、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1016]
基本培地、Wnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、TGF-β阻害剤、ニコチンアミド、および好ましくはp38阻害剤を含む、またはこれらからなる、腸細胞を培養するための本発明1001〜1015のいずれかの培養培地。
[本発明1017]
基本培地、Wnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、TGF-β阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、FGF-10、および好ましくはp38阻害剤を含む、またはこれらからなる、胃細胞を培養するための本発明1001〜1015のいずれかの培養培地。
[本発明1018]
基本培地、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、ノギン、ニコチンアミド、EGF、FGF10、HGF、ガストリン、TGF-β阻害剤、およびPGE2、および好ましくはWnt-3aを含む、またはこれらからなる、肝臓細胞を拡大させるための本発明1001〜1015のいずれかの培養培地。
[本発明1019]
基本培地、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、ノギン、EGF、FGF10、ガストリン、TGF-β阻害剤、および好ましくはエキセンディン4およびWnt-3aを含む、またはこれらからなる、膵臓細胞を拡大させるための本発明1001〜1015のいずれかの培養培地。
[本発明1020]
基本培地、EGF、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、ノギン、ニコチンアミド、TGF-β阻害剤、および好ましくはWnt-3aおよびFGF-10を含む、またはこれらからなる、前立腺細胞を培養するための本発明1001〜1015のいずれかの培養培地。
[本発明1021]
テストステロン、例えば(ジヒドロ)テストステロンをさらに含む、本発明1020の前立腺細胞を培養するための培養培地。
[本発明1022]
関心対象の対応する非癌組織タイプに由来する細胞を培養するのに用いられる培養培地の成分を含むか、または該成分からなり、
任意で、関心対象の組織タイプの非癌細胞を培養するのに用いられる該培地からWnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン、TGF-β阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、ガストリン、FGF10、およびHGFのうちの1つまたは複数が排除されている、
関心対象の組織タイプに由来する腺癌細胞または癌腫細胞などの癌細胞、例えば癌幹細胞を培養するための前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1023]
関心対象の組織タイプに由来する幹細胞を拡大させるのに用いられる培養培地の成分を含むか、または該成分からなるが、Wnt、Rスポンジン、BMP阻害剤、TGF-β阻害剤、受容体型チロシンキナーゼリガンド、p38阻害剤、およびニコチンアミドのうちの1つまたは複数が排除されている、関心対象の組織に由来する幹細胞を分化させるための前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1024]
基本培地、EGF、ノギン、TGF-β阻害剤、およびp38阻害剤を含む、またはこれらからなる、腸細胞を分化させるための本発明1023の培養培地。
[本発明1025]
基本培地、ノギン、EGF、ガストリン、TGF-β阻害剤、DAPTもしくはDBZなどのγ-セクレターゼ阻害剤、および好ましくはWnt-3aを含む、またはこれらからなる、肝臓細胞を分化させるための本発明1023の培養培地。
[本発明1026]
基本培地、ノギン、EGF、FGF10、ガストリン、TGF-β阻害剤、γ-セクレターゼ阻害剤、および好ましくはエキセンディン4を含む、またはこれらからなる、膵臓細胞を分化させるための本発明1023の培養培地。
[本発明1027]
細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックスと接触している、前記本発明のいずれかの培養培地。
[本発明1028]
細胞外マトリックスが、Matrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスである、本発明1027の培養培地。
[本発明1029]
本発明1001〜1026のいずれかの培養培地、および細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックス、例えばMatrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスを含む、組成物。
[本発明1030]
前記本発明のいずれかの培養培地または組成物を含有する、密閉封止された容器。
[本発明1031]
幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを拡大および/または分化させるための、本発明1001〜1028のいずれかの培養培地の使用。
[本発明1032]
幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドが、1つまたは複数の腸幹細胞、小腸陰窩、結腸陰窩、胃幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、および前立腺幹細胞からなる群より選択される、本発明1031の使用。
[本発明1033]
幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを正常組織から得ることができる、本発明1031または本発明1032の使用。
[本発明1034]
幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを、疾患組織、例えば腺腫、癌腫、腺癌、嚢胞性線維症患者の腸、または炎症性腸疾患患者の腸から得ることができる、本発明1031または1032の使用。
[本発明1035]
単一の幹細胞または幹細胞集団を本発明1001〜1028のいずれかの培養培地中で培養する工程を含む、単一の幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を拡大させるための、好ましくはオルガノイドを得るためにそれらを拡大させるための方法。
[本発明1036]
以下の工程を含む、本発明1035の方法:
幹細胞、幹細胞集団、または単離された組織断片を用意する工程;
本発明1001〜1028のいずれかの培養培地を用意する工程;
該幹細胞を該培養培地と接触させる工程;
適切な条件下で該細胞を培養する工程。
[本発明1037]
細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックス、例えばMatrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスと、幹細胞、幹細胞集団、または単離された組織断片、および培養培地とを接触させる工程を含む、本発明1035の方法。
[本発明1038]
培養培地が細胞外マトリックスの中に拡散される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
以下の工程を含む、本発明1035〜1038のいずれかの方法:
幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を第1の拡大培地中で培養する工程;
該幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を培養し続け、かつ該培地に、TGF-β阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、およびWntより選択される因子の1つまたは複数、好ましくは全てを含まない分化培地を補充する工程。
[本発明1040]
以下の工程を含む、小腸オルガノイドまたは結腸オルガノイドを得るための本発明1035〜1038のいずれかの方法:
小腸または結腸の幹細胞または組織断片を本発明1017の培養培地中で拡大させる工程; および任意で、
拡大された小腸または結腸の幹細胞または組織断片を本発明1024の培養培地中で分化させる工程。
[本発明1041]
胃の幹細胞または組織断片を本発明1016の培養培地中で培養する工程を含む、胃オルガノイドを得るための本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1042]
以下の工程を含む、肝臓オルガノイドを得るための本発明1035〜1039のいずれかの方法:
肝臓の細胞または組織断片を本発明1019の培養培地中で拡大させる工程; および任意で、
拡大された肝臓の細胞または組織断片を本発明1025の培養培地中で分化させる工程。
[本発明1043]
以下の工程を含む、膵臓オルガノイドを得るための本発明1035〜1039のいずれかの方法:
膵臓の細胞または組織断片を本発明1020の培養培地中で拡大させる工程; および任意で、
拡大された膵臓の細胞または組織断片を本発明1026の培養培地中で分化させる工程。
[本発明1044]
前立腺の幹細胞または組織断片を本発明1019の培養培地中で培養する工程を含む、前立腺オルガノイドを得るための本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1045]
腺癌または癌腫の幹細胞または組織断片を本発明1022の培養培地中で培養する工程を含む、腺癌オルガノイドまたは癌腫オルガノイドを得るための本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1046]
Rock阻害剤が、最初の1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間、任意で1日おきに培養培地に添加される、本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1047]
本発明1001〜1028のいずれかの培養培地を用いて、幹細胞を、3ヶ月間またはそれより長く、例えば4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、またはそれより長く培養する工程を含む、本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1048]
本発明1035〜1047のいずれかの方法によって得ることができるオルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1049]
本発明1001〜1028のいずれかの培養培地中で培養された場合に、少なくとも3ヶ月間、例えば少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間、またはそれより長く培養状態で生存することができる、本発明1048のオルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1050]
少なくとも3ヶ月間、例えば少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間、またはそれより長く培養されている、本発明1048のオルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1051]
1週間につき少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍の割合で拡大する、本発明1048〜1050のいずれかのオルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1052]
ヒトオルガノイドまたはヒト細胞集団である、本発明1048〜1051のいずれかのオルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1053]
正常オルガノイドもしくは正常細胞集団である、または疾患オルガノイドもしくは疾患細胞集団、例えば疾患を有するヒトもしくは動物から採取された幹細胞を培養することによって得られた疾患オルガノイドもしくは疾患細胞集団である、本発明1048〜1052のいずれかのオルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1054]
-5℃より低い、-10℃より低い、-20℃より低い、-40℃より低い、-60℃より低い、-80℃より低い、-100℃より低い、または-150℃より低い温度で、例えば約-180℃で凍結および保存される、本発明1048〜1053のいずれかのオルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1055]
中心管腔を取り囲む上皮細胞を含む三次元オルガノイドであるオルガノイドであって、任意で該上皮細胞が別個の***領域および分化領域に存在する、該オルガノイド、好ましくは本発明1048〜1054のいずれかのオルガノイド。
[本発明1056]
単層、任意で、折り畳まれた単層の領域および重層細胞の領域に並べられた上皮細胞を含む三次元オルガノイドである、本発明1055のオルガノイド。
[本発明1057]
非上皮細胞が存在しない、本発明1048〜1056のいずれかのオルガノイド。
[本発明1058]
正常インビボ組織の全ての分化細胞タイプが存在する、本発明1048〜1057のいずれかのオルガノイド。
[本発明1059]
小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、胃オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、または前立腺オルガノイドである、本発明1048〜1058のいずれかのオルガノイド。
[本発明1060]
以下を含む組成物:
i) 本発明1048〜1059のいずれかの1つまたは複数のオルガノイドまたは細胞集団; ならびに
ii) 本発明1001〜1028のいずれかの培養培地および/または細胞外マトリックス。
[本発明1061]
薬物スクリーニング、ターゲットバリデーション、ターゲット発見、毒物学、毒性スクリーニング、個別化医療、再生医療、またはエクスビボ細胞/臓器モデルにおける使用のための、例えば疾患モデルとしての使用のための、本発明1048〜1059のいずれかのオルガノイド、または本発明1048〜1054のいずれかの細胞集団、または本発明1029もしくは本発明1060の組成物。
[本発明1062]
再生医療または個別化医療が、哺乳動物、好ましくはヒトへのオルガノイド、細胞集団、または組成物の移植を含む、本発明1061の使用のためのオルガノイド、細胞集団、または組成物。
本発明によれば、1種または複数種のセリン/スレオニンプロテインキナーゼ標的に結合しかつその活性を低減する少なくとも1種または複数種の阻害剤を含み、少なくとも3ヶ月間、好ましくは、少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間、またはそれより長く幹細胞集団の連続増殖を可能にする作用を有する、幹細胞集団を拡大させるための培養培地が提供される。
本発明の第1の局面に従って用いられる培養培地は、TGF-βシグナル伝達またはp38シグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する任意の阻害剤を含む。好ましい態様において、本発明の培養培地は、TGF-βシグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する阻害剤を含む。一部の態様において、本発明の培養培地は、TGF-βを直接的または間接的に負に調節する阻害剤およびp38シグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する阻害剤を含む。さらなる態様において、本発明の培養培地はRスポンジンまたはRスポンジン模倣体を付加的に含む。
を有するDSLペプチド(Dontu et al., 2004. Breast Cancer Res 6. R605-R615)である。前記DSLペプチドは、好ましくは、10μM〜100nMまたは少なくとも10μMおよび100nM以下の濃度で用いられる。Notchアゴニストを添加すると、特に、培養して最初の週にNotchアゴニストを添加すると、培養効率が2〜3倍増加する。前記Notchアゴニストは、好ましくは、前記幹細胞を培養して最初の7日間、1日おきに培養培地に添加される。したがって、一部の態様において、本発明は、Notchアゴニストが、最初の1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6、日間、または7日間、任意で、1日おきに培養培地に添加される、幹細胞を培養するための方法および/またはオルガノイドを得るための方法を提供する。一部の態様において、Notchアゴニストは、最初の2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、または10日間を過ぎた後は培養培地に添加されない。
1つの態様において、細胞培養培地は、ALK5に結合しかつその活性を低減するTGFβ阻害剤およびp38に結合しかつその活性を低減するp38阻害剤を含む。例えば、1つの態様において、細胞培養培地は、A83-01および/またはSB202190、好ましくは、A83-01+SB202190を含む。驚いたことに、本発明の培養培地中にA83-01+SB202190を一緒に使用すると、ヒト結腸オルガノイドの継代数を相乗的に増やすことが見出された。1つの態様において、細胞培養培地はWENR+A83-01+SB202190を含む。1つの態様において、細胞培養培地はWENR+A83-01+SB202190+ニコチンアミドを含む。1つの態様において、細胞培養培地はWENRg+ニコチンアミド+A83-01+SB202190(「g」はガストリンである)を含む。1つの態様において、細胞培養培地はWENR+A83-01+ニコチンアミド+FGF10を含む。1つの態様において、細胞培養培地はWENRg+A83-01+ニコチンアミド+FGF10を含む。1つの態様において、細胞培地はWENRg+A83-01+ニコチンアミド+FGF10+SB202190を含む。1つの態様において、細胞培養培地は結腸オルガノイドを得るために用いられる。この態様に記載のように細胞培養培地を用いて上皮細胞を培養することによって得ることができる結腸オルガノイドも提供される。
特に好ましい培養培地が本明細書の実施例において説明される。本発明の培養培地は、例えば、下記のように異なる組織との使用に合わせることができる。
一部の態様において、小腸陰窩、例えば、マウス小腸陰窩のための培養培地は、EGF、例えば、マウスEGF;BMP阻害剤、例えば、マウスノギン;およびRスポンジン、例えば、ヒトRスポンジン-1または4を付加的に含む基本培地、例えば前記の基本培地を含むか、または該基本培地からなる。一部の態様において、この培養培地は、TGF-β阻害剤(例えば、A83-01)および/またはp38阻害剤(例えば、SB202190)をさらに含む。一部の態様において、結腸陰窩、例えば、マウス結腸陰窩のための培養培地は、Wntアゴニスト、例えば、組換えヒトWnt-3AまたはWnt-3A条件培地;EGF、例えば、マウスEGF;BMP阻害剤、例えば、マウスノギン;およびRスポンジン、例えば、ヒトRスポンジン-1または4を付加的に含む基本培地、例えば前記の基本培地を含むか、または該基本培地からなる。一部の態様において、この培養培地は、TGF-β阻害剤(例えば、A83-01)および/またはp38阻害剤(例えば、SB202190)をさらに含む。
一部の態様において、結腸癌細胞のための培養培地は、Wntアゴニスト、例えば、組換えヒトWnt-3AまたはWnt-3A条件培地;EGF;BMP阻害剤、例えば、ノギン;Rスポンジン、例えば、ヒトRスポンジン-1;TGF-β阻害剤、例えば、A83-01;p38阻害剤、例えば、SB202190;ガストリン;およびニコチンアミドを付加的に含む基本培地、例えば前記の基本培地を含むか、または該基本培地からなる。
一部の態様において、マウス腸腺腫などの腸腺腫のための培養培地は、マウスEGFなどのEGFを付加的に含む基本培地、例えば前記の基本培地を含む。
一部の態様において、本発明は、基本培地、Wnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、TGF-β阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、FGF-10、および好ましくはp38阻害剤を含むか、またはこれらからなる、胃細胞を培養するための培地を提供する。
一部の態様において、前立腺幹細胞を拡大させるための培養培地は、テストステロン、任意で、ジヒドロテストステロン(本明細書においてDHTとも呼ばれる)を含む。テストステロンはアンドロゲングループからのステロイドホルモンである。ヒトでは、テストステロンのかなり多くの部分が5α還元を受けて、より強力なアンドロゲンであるジヒドロテストステロンを形成する。テストステロン、ジヒドロテストステロン、またはテストステロン模倣体(例えば、アンドロゲン受容体に対するテストステロン結合の活性を模倣する分子)を本発明の培養培地に添加することができる。したがって、テストステロンという用語が用いられる場合、常に、ジヒドロテストステロンまたはテストステロン模倣体に取り替えることができる。本発明者らは、前立腺幹細胞のための培養培地にテストステロンを添加すると幹細胞集団の分化だけでなく、継続的拡大も増加することを示した(例えば、図41〜45を参照されたい)。テストステロンが増殖を抑制し、終末分化を維持するように作用することによって細胞分化において重要な役割を果たしていると文献が開示しているので、これは極めて驚くべきことである(Mirochnik et al. PLoS One, 7(3), e31052, 2012; Niu et al. Oncogene 29, 3593-3604, 2010)。当業者であれば、前立腺のための培養培地にテストステロンを添加すると、これ以上の拡大能力のない完全に分化したオルガノイドが得られると予想するだろう。これは、結腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、および肝臓オルガノイドが分化培地中で分化した時に観察されるものと似ている。しかしながら、対照的に、本発明者らは、テストステロンが分化を増大させるが、幹細胞の拡大も継続し続けることを発見した。したがって、驚いたことに、テストステロンを含む培養培地中で増殖させたオルガノイドは、幹細胞ならびに分化細胞、すなわち、管腔細胞および基底細胞を含む。
一部の態様において、本発明は、基本培地、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、ノギン、EGF、FGF10、ガストリン、TGF-β阻害剤、好ましくは、エキセンディン4およびWnt-3aを含むか、またはこれらからなる、膵臓細胞を拡大させるための培養培地を提供する。
一部の態様において、バレット食道用の培養培地は、Wntアゴニスト、例えば、組換えヒトWnt-3AまたはWnt-3A条件培地;EGF;BMP阻害剤、例えば、ノギン;Rスポンジン、例えば、ヒトRスポンジン-1;TGF-β阻害剤、例えば、A83-01;p38阻害剤、例えば、SB202190;ガストリン;ニコチンアミド;およびFGF、例えば、ヒトFGF10(すなわち、HISC+FGF) を付加的に含む基本培地、例えば前記の基本培地を含むか、または該基本培地からなる。一部の態様において、この培養培地からガストリンが排除される。
一部の態様において、肝臓細胞を第1の「拡大」培養培地(本明細書においてEMとも呼ばれる)の中で増殖させ、好ましくは、その後に、細胞を第2の「分化」培養培地(本明細書においてDMとも呼ばれる)の中で培養することができる。しかしながら、一部の態様において、DM培地中で分化を行う工程は、例えば、細胞が移植され、インビボで分化される一部の方法では行われない。同様に、膵臓、小腸、および結腸などの他の組織用の拡大培養培地および分化培養培地がある(前記を参照されたい)。
本発明の1つの局面において、***促進増殖因子として上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、および好ましくは、FGF10、ニコチンアミド、好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくは、R-スポンジン1〜4が加えられた、動物細胞またはヒト細胞のための基本培地を含むか、または該基本培地からなる細胞培養培地が提供される。この培地はEM2と呼ばれる。この「EM2」培地は肝臓細胞を拡大させるのに好ましい。
1つの局面において、本発明は、EGF、BMP阻害剤、R-スポンジン、Wntが加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むか、または該基本培地からなる細胞培養培地を提供する。好ましくは、BMP阻害剤はノギンであり、EM1培地は「ENRW」(EGF、ノギン、R-スポンジン、およびWnt(例えば、Wnt3A))と呼ばれる。この培地はEM1と呼ばれる。一部の態様において、EM1は、PGE2および/またはAAなどのプロスタグランジン経路アクチベーターを付加的に含む。一部の態様において、EM1はA83-01などのTGF-β阻害剤を含む。より好ましくは、EM1はプロスタグランジン経路アクチベーターおよびTGF-β阻害剤を付加的に含む。本発明者らは、Wntおよびノギンを含有する培地が、細胞の初期拡大を刺激するのに理想的であることを見出した。したがって、一部の態様において、EM1培地は1継代または1週間しか用いられないが、細胞に有害でないので約1年間使用できることも予想される。したがって、一部の態様において、EM1培地は、0日目〜10日目、例えば、0〜7日目、0〜6日目、0〜5日目、0〜4日目、0〜3日目、0〜2日目、0〜1日目に細胞を培養するのに用いられるか、1週間以上、例えば、2週間、3週間、4週間以上、または1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、12ヶ月間以上用いられる。この場合、0日目は、細胞の起源組織から細胞が単離された日であり、1日目はその次の日である。一部の態様において、EM1培地は培養の最初の日のみ、または最初の2日間のみ用いられる。一部の態様において、EM1培地は、1継代以上、例えば、1継代、2継代、3継代、4継代、5継代、6継代、7継代、8継代、9継代、10継代、15継代、20継代、25継代、30継代以上、例えば、20〜30継代、30〜35継代、32〜40継代、またはそれより長く用いられる。一部の態様において、EM1培地は、凍結工程後に、または最適な増殖と両立しない培地もしくは温度の変化を伴う他の任意の輸送工程後に用いられる。この「EM1」培地は肝臓細胞を拡大させるのに好ましい。
***促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGF(例えば、FGFR2もしくはFGFR4に結合することができるFGF)、好ましくは、FGF10、およびHGF、
プロスタグランジン経路アクチベーター、例えば、PGE2および/またはAA;
TGF-β阻害剤;
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン、および好ましくは;
BMP阻害剤、好ましくは、ノギン;ならびに
Wntアゴニスト、好ましくは、R-スポンジン1および/またはWnt-3a
が加えられた、動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むか、または該基本培地からなる細胞培養培地が提供される。
***促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくは、FGF10、およびHGF
プロスタグランジン経路アクチベーター、例えば、PGE2および/またはAA、
TGF-β阻害剤;
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン、および好ましくは、
BMP阻害剤、より好ましくは、ノギン、ならびに
Wntアゴニスト、より好ましくは、R-スポンジン1および/またはWnt-3a
が加えられた、動物細胞またはヒト細胞のための基本培地を含むか、または該基本培地からなる、細胞培養培地を提供する。
***促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGF10、およびHGF、
プロスタグランジン経路アクチベーター、例えば、PGE2および/またはAA、
TGF-β阻害剤;
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン、
BMP阻害剤、より好ましくは、ノギン、ならびに
Wntアゴニスト、より好ましくは、R-スポンジン1およびWnt-3a
が加えられた、動物細胞またはヒト細胞のための基本培地を含むか、または該基本培地からなる第1の好ましい培養培地を包含する。
別の局面において、以下が加えられた、動物細胞またはヒト細胞のための基本培地を含むか、または該基本培地からなる第2の細胞培養培地が提供される: EGF、TGF-β阻害剤、Notch阻害剤、ならびにプロスタグランジン経路アクチベーター、例えば、PGE2および/またはAA。本発明者らは、この培地が細胞を分化させるのに有用であると発見した。細胞を分化させるのに用いられる培地は、本明細書においてDMと呼ばれることがある。
***促進増殖因子として上皮細胞増殖因子、FGF10、およびHGF、
Notch 阻害剤;
TGF-β 阻害剤;ならびに
プロスタグランジン経路アクチベーター、例えば、PGE2および/またはAA
が加えられた、動物細胞またはヒト細胞のための基本培地を含むか、または該基本培地からなる。
本発明による細胞培養培地は、細胞外マトリックス上での上皮幹細胞または単離された陰窩の生存および/または増殖および/または分化を可能にする。一部の態様において、本発明による細胞培養培地は、細胞外マトリックス上での本発明のオルガノイド、例えば、陰窩-絨毛オルガノイド、結腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、胃オルガノイド、バレット食道オルガノイド、腺癌オルガノイド、または結腸癌腫オルガノイドの生存および/または増殖および/または分化を可能にする。一部の態様において、本発明による細胞培養培地は、細胞外マトリックス上での本発明のオルガノイド、例えば、小腸(陰窩-絨毛)オルガノイド、結腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、胃オルガノイド、バレット食道オルガノイド、腺癌オルガノイド、癌腫オルガノイド、結腸癌腫オルガノイド、前立腺オルガノイド、または前立腺癌腫オルガノイドの生存および/または増殖および/または分化を可能にする。好ましくは、TGF-β阻害剤および/またはp38阻害剤が存在する態様において、細胞培養培地は、生存および/または増殖、好ましくは、本発明の細胞集団またはオルガノイドの生存および増殖を可能にする。好ましくは、最初に、TGF-β阻害剤および/またはp38阻害剤が細胞培養培地に存在するが、次いで、(例えば、培地の補給時に添加を行わないことによって)培地から除去される態様は、生存および/または分化、好ましくは、本発明の細胞集団またはオルガノイドの生存および分化を可能にする。
本発明はまた、幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを拡大および/または分化させるための本発明の培養培地の使用を提供する。
幹細胞は成体ヒトおよびマウスの多くの臓器において見出される。個々の組織における成体幹細胞の正確な特徴に大きなばらつきがある場合があるが、成体幹細胞は少なくとも以下の特徴を共有する: 未分化表現型を保持していること; 子孫が、関連組織に存在する全ての系列に分化できること; 一生を通じて自己維持能を保持していること; および損傷後に関連組織を再生できること。幹細胞は幹細胞ニッチという特殊な位置に存在する。幹細胞ニッチは、前記幹細胞集団を維持するための適切な細胞間接着およびシグナルを提供する。本発明による幹細胞は好ましくはLgr5を発現する。
小腸の自己複製性上皮は順序よく並べられて陰窩および絨毛になる(Gregoreff and Clevers, 2005 Genes Dev 19, 877-90)。陰窩-絨毛軸に沿って各細胞は極性があり、それによって、腸絨毛の上部または結腸陰窩の上の位置にある細胞は最も分化しており、アポトーシスによって連続して管腔の中へ失われる。陰窩の基部にある幹細胞が連続増殖し、陰窩の中間にある前駆細胞が大規模に増殖することによって、脱落した細胞は確実に適切に置き換えられる。その結果生じる上皮ターンオーバー時間はマウスで5日である。自己複製幹細胞は、陰窩底部の付近に存在し、全ての系列に分化することができる速やかに増殖するTA細胞(transit amplifying cell)を生じると長い間知られてきた。幹細胞の推定数は陰窩1つあたり4〜6個である(Bjerknes and Cheng, 1999 Gastroenterology 116, 7-14)。TA細胞から3つの分化細胞タイプである腸細胞、杯細胞、および腸内分泌細胞が形成し、陰窩-絨毛軸に沿って互いに密着した帯の中で移動を続ける。絨毛1本1本が複数の異なる陰窩からの細胞を受け入れる。4番目の主要な分化細胞タイプであるパネート細胞は陰窩底部に存在する。
陰窩は、当業者に公知のプロトコールによって、十二指腸、空腸、回腸、および結腸を含む小腸および大腸、ならびに胃の幽門領域および体部領域から単離することができる。例えば、陰窩は、単離された組織を、基底膜およびストローマ細胞タイプとのカルシウム依存性相互作用およびマグネシウム依存性相互作用から細胞を解離するキレート剤とインキュベートすることによって単離することができる。組織を洗浄した後、ガラススライドを用いて上皮細胞層を粘膜下層から分離し、切り刻む。この後に、トリプシン、または、より好ましくはEDTAおよび/またはEGTAの中でインキュベーションを行い、例えば、濾過および/または遠心分離工程を用いて未消化の組織断片および単一の細胞を陰窩から分離する。トリプシンの代わりにコラゲナーゼおよび/またはディスパーゼIなどの他のタンパク質分解酵素を使用することができる。膵臓および胃の断片を分離するために類似の方法が用いられる。本明細書に記載の他の組織の断片を単離するために類似の方法が用いられてもよい。本発明の培養培地は、このような組織断片を培養するのに適している(実施例1を参照されたい)。
幹細胞およびその分化した子孫を臨床および研究に適用するには、適切な質の細胞集団を提供する再現性のある幹細胞培養方法が必要である。一般的に、幹細胞のインビトロ拡大は、そのインビボ対応物に可能な限りよく似た細胞集団を提供することを目標としている。この特性は本明細書において細胞の「ゲノム完全性および表現型完全性」と呼ばれる。疾患細胞、例えば、癌細胞または嚢胞性線維症細胞の培養によって得られたオルガノイドもまたそのインビボ対応物に似ている、すなわち、その疾患遺伝子型および/または表現型を維持している、したがって、その意味では、その「ゲノム完全性および表現型完全性」も維持している、すなわち、インビボ状況を思い出させる疾患に特徴的な遺伝子不安定性または表現型不安定性を維持している。したがって、一部の態様において、本発明は、健常組織から得られた「正常」オルガノイドを提供する。他の態様において、本発明は、疾患組織から得られた「疾患」オルガノイド、例えば、癌オルガノイド(例えば、結腸癌腫オルガノイドもしくは腺癌オルガノイド)または嚢胞性線維症小腸オルガノイドを提供する。
マウス遺伝子が本明細書において言及される時、本発明のヒトオルガノイドは類似した遺伝子プロファイルを有し得るが、マウス遺伝子の代わりにヒト遺伝子対応物が用いられる。したがって、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルを有するが、対応するヒト遺伝子に関するヒトオルガノイドも本発明によって提供される。当業者は、本明細書において列挙されたマウス遺伝子のヒト対応物を容易に取得することができるだろう。
「発現している」という用語は細胞内のマーカーの存在について述べるために用いられる。発現していると見なされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在しなければならない。「検出可能なレベル」とは、PCR、ブロッディング、またはFACS分析などの標準的な実験方法の1つを用いてマーカーを検出できることを意味する。30回のPCRサイクル後に、細胞内で少なくとも約100コピー/細胞の発現レベルに相当する発現が妥当に検出することができれば、遺伝子は本発明の集団の細胞によって発現されているとみなされる。「発現する」および「発現」という用語は対応する意味を有する。この閾値より少ない発現レベルでは、マーカーは発現していないとみなされる。本発明の細胞におけるマーカーの発現レベルと、例えば、胚性幹細胞などの別の細胞における同じマーカーの発現レベルとの比較は、好ましくは、同じ種から単離された2つの細胞タイプを比較することによって行うことができる。好ましくは、この種は哺乳動物であり、より好ましくは、この種はヒトである。このような比較は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)実験を用いて都合よく行うことができる。
本発明の一部の態様では、当技術分野において公知なように、通常、大きな細胞クラスターではなく、単一細胞懸濁液または小さな細胞クラスター(2〜50個の細胞/クラスター)が播種される。このような細胞は***した時に、細胞増殖を促進する密度で支持体上に播種される。典型的には、単一細胞が単離される時、少なくとも1〜500細胞/ウェルのプレーティング密度が用いられ、ウェルの表面は0.32cm2である。クラスターが播種される時、プレーティング密度は、好ましくは、250〜2500細胞/cm2である。リプレーティングのために、約2500細胞/cm2〜約5,000細胞/cm2の密度が用いられてもよい。リプレーティングの間、当技術分野において公知なように、通常、大きな細胞クラスターではなく単細胞懸濁液または小さな細胞クラスターが播種される。
本発明の一部の態様において、培養細胞の細胞運命を分化に向けて変えるように、拡大培地のある特定の成分を取り除くことができる。未分化状態の維持および/または幹細胞もしくは前駆細胞の遺伝子プログラムの活性化を担う培養培地の任意の成分を培養培地から取り除いてもよい。
幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を第1の拡大培地において培養する工程、
幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を培養し続ける工程、および
培地に分化培地を補充する工程
を含み、分化培地は、TGF-β阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、およびWntより選択される因子の1つまたは複数、好ましくは、全てを含まない。
前記の細胞はオルガノイドに成長する。したがって、本発明の方法によって得ることができるオルガノイドは本発明のさらなる局面である。本明細書に記載のオルガノイドも提供される。オルガノイドは好ましくはヒトオルガノイドである。本発明者らの知る限りでは、これは、長い期間(すなわち、少なくとも3ヶ月間、好ましくは、少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間、またはそれより長い培養;本明細書に含まれる実施例を参照されたい)の後に機能し、かつ生存しているヒトオルガノイドが得られた初めての出来事である。機能は、好ましくは、本明細書において定義されるような組織特異的マーカーの存在および/または前記オルガノイドの構造を特徴とする。得られるオルガノイドの最終量は培養期間と相関関係があるので、当業者であれば、本発明は先駆的な発明であり、潜在的に、例えば、再生医療において新たな可能性を開くことを理解するだろう。したがって、少なくとも3ヶ月間(例えば、少なくとも4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間以上)の培養の後に機能し、かつ生存する本明細書に記載のオルガノイドが提供される。例えば、少なくとも3ヶ月間(例えば、少なくとも4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間以上)の培養の後に、その構造、マーカー発現、および機能の少なくとも1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、または3つ)を保持している本明細書に記載のオルガノイドが提供される。
幹細胞の拡大によって得ることができる本発明のオルガノイドは、そのインビボ対応物に似た細胞集団を提供する。
小腸陰窩-絨毛オルガノイドでは、オルガノイドの構造配置はインビボ陰窩-絨毛の構造とよく似ている。すなわち、陰窩底部においてLgr5+ 幹細胞およびそのニッチ細胞(パネート細胞)が隣接し、これに続いて陰窩底部の真上にTA細胞があり、絨毛側面、最後には、分化細胞、例えば、絨毛の残りを構成し、絨毛上部へと向かってなおさらに分化した腸細胞が続く。本発明によるオルガノイドは、少なくとも1つの芽および中心管腔を有する細胞層を有し得ることが分かる。matrigelの外側にあるオルガノイドは、おそらく、必要な増殖因子に接近しやすいためにmatrigel中心にあるオルガノイドより大きくなる傾向がある。構造上、本発明によるオルガノイドは形が細長くなることが多い。共焦点顕微鏡観察下では、この構造はケラチン陽性に染色されることがある。本発明によるオルガノイドは、極性化した核および小さな細胞質を有する細胞を含むことがある。陰窩-絨毛オルガノイドは一般的に単層である。
結腸オルガノイドは、陰窩-絨毛オルガノイドに似た細胞組成を示す。したがって、前記の陰窩-絨毛オルガノイドのコメントは結腸オルガノイドに準用される。例えば、図1および図2を参照されたい。
本発明の膵臓オルガノイドは好ましくは出芽を示す。一部の態様において、膵臓オルガノイドは、直径が100〜1000マイクロメートル、例えば、200〜900マイクロメートル、300〜1000マイクロメートル、400〜700マイクロメートルである。膵臓オルガノイドは好ましくは単層である。島構造または管構造の非常に初期のものしかない。出芽構造は、健常な増殖状況および幹細胞の維持を示す。
腺癌オルガノイドおよび結腸癌オルガノイドは、一般的に、出芽構造の代わりに嚢胞構造を形成する。これは、優れた細胞ニッチ支持体が存在しないことを思い出させる。EFG+ノギンと共に培養された腺腫陰窩は最初の10日間で約16倍の拡大を示す。腺腫(腺癌)オルガノイドおよび結腸癌オルガノイドは有用な研究ツールおよび薬物スクリーニングモデルとなり得る。
本発明のBEオルガノイドは出芽構造を含む(例えば、図5を参照されたい)。形態学的に、本発明のオルガノイド中の細胞は、その対応するインビボ組織対応物のように見える。
本発明の培養培地中で増殖させたマウス胃オルガノイドは、分化細胞タイプを含む上皮領域によって内壁が覆われた中心管腔を取り囲む、(幹細胞および前駆細胞によって形成された)胃腺基部様領域を含む単層上皮を含むか、または該単層上皮からなる三次元オルガノイドである。任意で、前記オルガノイドには非上皮細胞が存在しない。
EGF、ノギン、Rスポンジンを含む培養条件下で、マウス前立腺オルガノイドは、管腔を有する三次元嚢胞構造を形成する。やがて、層は内側に折り畳まれ、(重層)上皮細胞からなる3〜4つの層が形成される。外層は主にCK5+ 基底上皮細胞からなるのに対して、内層は主にCK8+ 管腔上皮細胞からなる。幹細胞区画は特定されていない。すなわち、全ての領域が***細胞を含有する。したがって、一部の態様において、テストステロンの非存在下で増殖させた前立腺オルガノイドは、***上皮細胞からなる重層を含む。さらなる態様において、前立腺オルガノイドは、CK5+ 基底上皮細胞を含む細胞からなる外層およびCK8+ 管腔上皮細胞を含む内層を含む。一部の態様において、テストステロンの非存在下で増殖させた前立腺オルガノイドは幹細胞を含有しない。
本発明者らは、前立腺オルガノイドの培養条件に(ジヒドロ)テストステロンを添加すると、細胞の大半は、2つの層に折り畳まれる上皮単層を形成するCK8+ 管腔細胞に分化することを示した。テストステロンの存在下で増殖させた前立腺オルガノイドは、主に、別の基底細胞層を有する管腔細胞または別の基底細胞層を有しない管腔細胞からなる。この構造はインビボ構造に似ている。分化細胞および***細胞ならびに幹細胞および前駆細胞が存在する。したがって、一部の態様において、例えば、テストステロンを含む培地中で培養された時に、前立腺オルガノイドは、嚢胞構造および管腔を含む三次元オルガノイドである。一部の態様において、前立腺オルガノイドは、上皮単層を形成するCK8+ 管腔細胞を含む。一部の態様において、単層は2つ以上の層に折り畳まれる。他の態様において、オルガノイドは重層細胞領域を含んでもよい。一部の態様において、前立腺オルガノイドは、***中の幹細胞集団を維持しながら分化細胞を含む。一部の態様において、オルガノイドの形は細胞出発材料または組織出発材料の起源(単離前の前立腺内での位置)によって決まる。前立腺は、前記の様々な上皮構造(重層または折り畳み)を示す様々な葉または領域からなる。インビトロ培養後に、オルガノイドは、オルガノイドが得られた前立腺部分の様々な肉眼で見える構造(重層または折り畳み)をある程度まで維持するように見える。
構造上、本発明によるマウス肝臓オルガノイドは形が細長くなることが多い。本発明によるマウス肝臓オルガノイドは、胆管によく似た構造を有する単一の細胞上皮層である1つまたは複数の出芽構造を含むことがある。共焦点顕微鏡観察下では、この構造はケラチン陽性に染色されることがある。本発明によるマウス肝臓オルガノイドは、極性化した核および小さな細胞質を有する細胞を含むことがある。オルガノイドは、多数の層から形成される部分を有することがある。このような細胞は、多くの場合、細胞のより中心に核、すなわち、極性化していない核を有する傾向がある。多層部分にある細胞は、細胞間に隙間すなわち管腔を含むように自己組織化することがある。一部の態様では、本発明のヒト肝臓オルガノイドは一般的に嚢胞構造を有する。
a) 以下の幹細胞マーカーの少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)、好ましくは、全てを発現する: lgr5、lgr4、epcam、Cd44、Tnfrsf19、Sox9、Sp5、Cd24a、Prom1、Cdca7、およびElf3; ならびに/または
b) 以下の幹細胞マーカーを発現しない: lgr6; ならびに/または
c) 本発明の拡大培地中で増殖させた時に以下の肝細胞マーカーまたは胆管細胞マーカーの少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19)、好ましくは、全てを発現する: Hnf1a、Hnf1b、Hnf4a、Hhex、Onecut1、Onecut2、Prox1、Cdh1、Foxa2、Gata6、Foxm1、Cebpa、Cebpb、Cebpd、Cebpg、Glu1、Krt7、Krt19、およびMet; ならびに/または
d) 本発明の拡大培地中で増殖させた時に以下の遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17)を発現しない: afp、Ins1、Ins2、Gcg、Ptf1a、Cela1、Cela2a、Cela3b、Neurod1、Neurod2、Neurog1、Neurog2、Neurog3、Amy2a4、Igflr、Igf2、およびCd34; ならびに/または
e) 以下のリプログラミング遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、もしくは3)を発現する: Klf4、Myc、およびPou5f1; ならびに/または
f) 以下のリプログラミング遺伝子を発現しない: Sox2。遺伝子の発現は、好ましくは、発現をmRNAレベルで、例えば、マイクロアレイを用いて測定することによって検出される。
a) 以下の幹細胞シグネチャー遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9)、好ましくは、全てを発現する: LGR4、TACSTDl/Epcam、CD44、SOX9、SP5、CD24、PROM1、CDCA7、およびELF3; ならびに/または
b) 以下のリプログラミング遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4)、好ましくは、全てを発現する: KLF4、MYC、POU5F1、およびSOX2; ならびに/または
c) 以下の肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19)、好ましくは、全てを発現する: HNF1A、HNF1B、HNF4A、HHEX、ONECUT1、ONECUT2、PROX1、CDH1、FOXA2、GATA6、FOXM1、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、GLUL、KRT7、KRT19、およびMET; ならびに/または
d) 以下の肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6)、好ましくは、全てを発現しない: NEUROG2、IGF1RおよびCD34、AFP、GCG、およびPTF1A、例えば、NEUROG2、IGF1R、およびCD34を発現しない; ならびに/または
e) 以下の肝細胞特異的遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18)、好ましくは、全てを発現する: TTR、ALB、FAH、TAT、CYP3A7、APOA1、HMGCS1、PPARG、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C9、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F8、CYP4V2、およびSCARB1。遺伝子の発現は、好ましくは、発現をmRNAレベルで、例えば、マイクロアレイを用いて測定することによって検出される。
陰窩-絨毛オルガノイド、結腸陰窩オルガノイド、および膵臓オルガノイドは、典型的には、幹細胞および/または前駆細胞を含む。したがって、これらのオルガノイドはある特定の遺伝子発現パターンを共有する。一部の態様において、以下のマーカーの1つもしくは複数(例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7)または全てを検出することができる: LGR5、LGR4、epcam、Cd44、Sox9、Cd24a、およびCD133/Prom1、任意でTnfrsf19。別の態様において、以下の前駆細胞遺伝子の1つもしくは2つまたは全ての発現を検出することができる: Pdx1、Nkx2.2、およびNkx6.1。分化後、陰窩-絨毛オルガノイド、結腸陰窩オルガノイド、および膵臓オルガノイドの遺伝子発現パターンは、分化したオルガノイドが組織特異的成体マーカー、例えば、膵臓においてインシュリンを発現する時に分岐すると予想される。
本発明の一部の態様において、オルガノイドは、増殖性細胞、パネート細胞、腸細胞、および杯細胞を含む全ての分化した上皮細胞タイプを含む陰窩-絨毛様伸長部分を含む。一部の態様において、本発明の陰窩-絨毛オルガノイドは筋線維芽細胞も他の非上皮細胞も含有しない。本発明の陰窩-絨毛オルガノイドは、好ましくは、陰窩-絨毛様構造の中に腸の吸収細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、およびパネート細胞を含む腸細胞を含む。好ましくは、以下のマーカーの少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5、または6)を検出することができた(図2eおよび図14を参照されたい): SMOC2、CDCA7、OLFM4、ASCL2、AXIN2および/またはLgr5、Tnfrsf19、CD24a、Sox9、CD44、Prom1。一部の態様において、マーカーRNF43およびZNRF3を検出することができる。一部の態様において、SMOC2、CDCA7、OLFM4、ASCL2、AXIN2、および/またはLgr5の1つもしくは複数(例えば、1、2、3、4、もしくは5)または全てが、陰窩において少なくとも2倍、3倍、または4倍アップレギュレートされるのに対して、陰窩において少なくとも1/2、1/3、または1/4にダウンレギュレートされるマーカーには、ABCG1、ENPP3、CSTE、MUC17、および/またはAPOA1の少なくとも1つもしくは複数(例えば、1、2、3、もしくは4)または全てが含まれる。この文脈で「アップレギュレーション」とは、腸の絨毛または結腸陰窩の上部を基準とする。幹細胞に対する分化したオルガノイド細胞の遺伝子発現を比較したマイクロアレイ分析から、小腸陰窩-絨毛オルガノイドおよび結腸オルガノイドは、腸幹細胞遺伝子の発現を含む腸陰窩の同等の分子シグネチャーを有することが明らかになった。したがって、本発明はまた、陰窩-絨毛オルガノイドについて前述された分子シグネチャーを有する結腸オルガノイドも提供する。インビトロで培養されたオルガノイドは、新鮮に単離された小腸陰窩と類似した発現プロファイルをはっきりと示し、公知の幹細胞マーカーを発現する。
一部の態様において、結腸オルガノイドは、腸内分泌細胞(例えば、クロマグラニン(chromagranin)A染色を用いて検出可能)、杯細胞(ムチン2染色を用いて検出可能)を含有する。一部の態様において、結腸オルガノイド中の細胞の10%未満(例えば、0.01〜5%、0.1〜3%)が腸内分泌細胞である。一部の態様において、結腸オルガノイド中の細胞の30%未満(例えば、1〜25%、1〜15%、5〜10%)が杯細胞である。一部の態様において、腸内分泌細胞および/または杯細胞の分布は図1dに示した通りである。
膵臓は、管細胞、腺房細胞、および内分泌細胞の3種類の細胞タイプを含有する。内分泌細胞は、血流に分泌され、身体の糖代謝を助けるホルモングルカゴン、インシュリン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチド(PP)を産生する。腺房細胞は、消化酵素を産生する外分泌系の一部であり、管細胞は、腺房細胞と消化器官とをつなぐ膵管に由来する。発生中に、ランゲルハンス島は、膵管から現れる前駆内分泌細胞から生じ、分化後に凝集してランゲルハンス島を形成すると考えられている。ランゲルハンス島は、α細胞、β細胞、δ細胞、およびPP細胞を含む。
本発明のBEオルガノイドはKi67+ である。
一部の態様において、本発明の胃オルガノイドはLgr5の天然発現を示す。一部の態様において、本発明の胃オルガノイドは、少なくともLgr5、ならびにCK19、ネスチン、ソマトスタチン、CXCR4+、CD133+、DCAMKL-1、CD44、Sord、Sox9、CD44、Prss23、Sp5、Hnf1α、Hnf4a、Sox9、KRT7、およびKRT19からなる群からの幹細胞マーカーの1つまたは複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、または17)の天然発現を示す。または、もしくはさらに、一部の態様において、胃オルガノイドは、CD133+、DCAMKL-1およびCD44のうちの1つまたは複数(例えば、1、2、または3)の天然発現を特徴としてもよい。または、もしくはさらに、胃オルガノイドはCD44およびSox9を特徴としてもよい。
一部の態様において、本発明の前立腺オルガノイド、例えば、マウス前立腺はLgr5の天然発現を示す。一部の態様において、前立腺オルガノイドは、管腔前立腺マーカー、例えば、サイトケラチン18(CK18)およびサイトケラチン8(CK8)の天然発現を示す。一部の態様において、本発明の前立腺オルガノイドはアンドロゲン受容体(AR)の天然発現を示す。一部の態様において、前立腺オルガノイドは基底マーカー、例えば、p63および/またはサイトケラチン5(CK5)を発現する。一部の態様において、テストステロン(例えば、DHT)が培地に添加された時、基底マーカーLgr5およびTnfrsf19の発現は、テストステロン(例えば、DHT)の非存在下で増殖させたオルガノイドと比較してダウンレギュレートされる。前立腺特異的転写因子NKX3.1は全ての条件において発現している。したがって、一部の態様において、本発明の前立腺オルガノイドは前立腺特異的マーカーNkx3.1の天然発現を示す。
一部の態様において、本発明の培地および方法によって作製されたオルガノイドは、外因子に応答してインビボ細胞運命決定を模倣する。好ましくは、本発明に従って作製された細胞およびオルガノイドは組織特異的機能も有する。
膵臓オルガノイドは、好ましくは、内分泌膵臓機能および外分泌膵臓機能を有し、例えば、インシュリン、グルカゴン、およびソマトスタチンのうちの1つまたは複数(例えば、1、2、または3つ全て)を発現する。これらのホルモンの発現は一組の内分泌膵臓特異的転写因子によって厳しく調節され、最も重要な内分泌膵臓特異的転写因子はPdx1およびNeuroDである。外分泌膵臓は、特に、消化酵素アミラーゼ、膵臓リパーゼ、およびキモトリプシンの産生を担う腺房区画および管区画によって形成される。これらの遺伝子の発現も特異的な外分泌膵臓遺伝子であるPtf1aによって調節される。
陰窩-絨毛オルガノイドは、好ましくは、分泌機能および自己複製機能を有する。例えば、陰窩-絨毛オルガノイドは、好ましくは、ムチン、酵素分泌およびホルモン分泌、例えば、リゾチーム、コレシストキニン、セクレチンおよび胃抑制性ペプチド、ならびに他の糖タンパク質を分泌する。
ヒト胃は、解剖学的および機能的に2つの主な領域に分けられる。腸に近接する幽門洞は主に保護粘液を産生し、ガストリンなどのホルモンを分泌する。胃体部は塩酸およびペプシノーゲンなどの胃酵素を分泌する。両領域の胃上皮は、腺と呼ばれる陥入部において組織化されている。これらの腺には胃幹細胞、前駆細胞、および分化細胞がある。分化細胞の正確な組成は解剖学的領域の機能によって変化する。幽門洞では、腺は主にムチン6産生細胞およびホルモン産生内分泌細胞からなる。体部では、ペプシノーゲン産生主細胞および酸分泌壁細胞が粘液産生細胞と低密度の内分泌細胞との間に分散している。胃腺間の表面領域は、主に表面ムチン5を産生する粘液産生細胞によって占められる。
一部の態様において、前立腺オルガノイドは、2つの別個の上皮系列である基底細胞および管腔細胞を含むか、またはこれらからなる。一部の態様において、基底細胞および管腔細胞は前立腺液を分泌する。
本発明の文脈の中で、組織断片は、成体組織、好ましくは、ヒト成体組織の一部、例えば、ヒト成体の小腸、結腸、または膵臓の一部である。本発明の文脈においてヒト成体組織のさらなる例には、胃、肝臓、および前立腺が含まれる。組織は正常(健常)な組織でもよく、疾患組織または感染組織でもよい。したがって、好ましくは、本明細書において特定されたオルガノイドは組織断片でない。オルガノイドは、好ましくは、成体組織に由来する細胞、好ましくは、成体組織に由来する上皮幹細胞、任意で、成体組織断片に由来する上皮幹細胞、より好ましくは、Lgr5を発現する成体組織または成体組織断片に由来する上皮幹細胞を用いて得られる。したがって、本発明の文脈において組織断片は好ましくはLgr5+ 幹細胞を含む。
本発明者らは、ALK4、ALK5、ALK7、またはp38キナーゼの阻害剤を、以前に述べられた幹細胞培養培地に添加すると、培養プレーティング効率が少なくとも50%および場合によっては100%超、改善されることを初めてここで示した(表2を参照されたい)。本発明者らはまた、両阻害剤(ALK阻害剤およびp38阻害剤、例えば、A83-01およびSB-202190)を培養培地に含めると培養期間が相乗的に延びることも示した。
増殖速度は細胞集団倍加レベルで評価することができる。集団倍加レベルとは、集団内の細胞がインビトロで最初に単離されてから倍加した回数の総数をいう。集団倍加レベルは細胞を数えることによって求めることができる。または、増殖速度は細胞増殖アッセイによって評価することができる。例えば、細胞増殖アッセイでは、特異的蛍光プローブが、BrdUの取り込みによってDNA合成活性を特定し、Ki67発現によって細胞増殖状態を測定する(Thermo Scientific* Cellomics, Millipore)。
である。
好ましい態様において、オルガノイドは、少なくとも2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、または1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、またはそれより長く培養することができる。好ましい態様において、オルガノイドは、少なくとも2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、または1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、12ヶ月間、またはそれより長く培養することができる。別の好ましい態様において、オルガノイドは、単一の細胞、好ましくは、Lgr5を発現する単一の細胞から生じ、より好ましくは、単一の細胞は、関心対象の核酸分子を含む核酸構築物を含む。
本発明は、薬物スクリーニング、(薬物)ターゲットバリデーション、(薬物)ターゲット発見、毒物学および毒性スクリーニング、個別化医療、再生医療において使用するための、および/またはエクスビボ細胞/臓器モデル、例えば、疾患モデルとして使用するための本発明のオルガノイドまたは拡大された細胞集団の使用を提供する。
オルガノイドのさらなる重要な使用は粘膜ワクチン接種の開発における使用である。粘膜ワクチンは、粘膜を介して投与されるワクチンである。これは、鼻、口、または直腸などの任意の粘膜表面でよい。これらは、吸入器、スプレー、または他の外部補助器具を介して投与することができる。これには、例えば、発展途上国において重要な場合がある、ワクチンの投与に医療従事者が必要とされないなどの注射を上回るいくつかの明白な利点がある。
好ましくはハイスループット目的で、前記の本発明の拡大された幹細胞集団またはオルガノイド、例えば、陰窩-絨毛オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは、マルチウェルプレート、例えば、96ウェルプレートまたは384ウェルプレートの中で培養される。前記オルガノイドに影響を及ぼす分子を特定するために分子ライブラリーが用いられる。好ましいライブラリーは、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー(例えば、LOPAP(商標), Sigma Aldrich)、脂質ライブラリー(BioMol)、合成化合物ライブラリー(例えば、LOP AC(商標), Sigma Aldrich)、または天然化合物ライブラリー(Specs, TimTec)を含む。さらに、幹細胞の子孫における1種または複数種の遺伝子の発現を誘導または抑制するために遺伝子ライブラリーを使用することができる。これらの遺伝子ライブラリーは、cDNAライブラリー、アンチセンスライブラリー、およびsiRNAライブラリーまたは他の非コードRNAライブラリーを含む。細胞は、好ましくは、ある特定の期間、複数の濃度の試験薬剤に曝露される。曝露期間の終わりに、培養物が評価される。「影響を及ぼす」という用語は、増殖、形態学的変化、および細胞死の低減または消失を含むが、これに限定されない細胞における任意の変化をカバーするために用いられる。前記の本発明の拡大された幹細胞集団またはオルガノイド、例えば、陰窩-絨毛オルガノイドまたは膵臓オルガノイドはまた、特異的に上皮癌腫細胞を標的とするが、前記の本発明の拡大された幹細胞集団またはオルガノイド、例えば、陰窩-絨毛オルガノイドまたは膵臓オルガノイドを標的としない薬物を特定するのに使用することもできる。
本発明の拡大された細胞集団(例えば、オルガノイド)を、例えば本発明の培養培地で、任意で21日間未満にわたって、培養する工程;
前記の本発明の拡大された細胞集団(例えば、オルガノイド)を候補分子の1つまたは候補分子のライブラリーに曝露する工程;
前記の拡大された細胞集団(例えば、オルガノイド)を、任意の効果について、例えば、増殖の低減もしくは消失などの任意の細胞変化、形態学的変化、および/または細胞死について評価する工程;
前記効果を引き起こす候補分子を、潜在的な薬物または化粧料として特定する工程
を含む方法を提供する。
(a)患者において関心対象の疾患組織から生検材料を得る工程;
(b)本発明のスクリーニング方法を用いて適切な薬物をスクリーニングする工程; および
(c)工程(b)において得られた薬物を用いて前記患者を治療する工程
を含む方法が提供される。
一部の態様において、本発明のオルガノイドまたは本発明の培養培地および方法を用いて増殖させた細胞をターゲット発見に使用することができる。健常組織または疾患組織から生じたオルガノイドの細胞が標的特定に用いられてもよい。本発明のオルガノイドは、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患(例えば、クローン病)、癌腫、腺腫、腺癌、結腸癌、糖尿病(例えば、I型またはII型)、バレット食道ゴーシェ病、α-1-アンチトリプシン欠損症、レッシュ・ナイハン症候群、貧血、シュバッハマン・ボディアン・ダイアモンド症候群、真性多血症、原発性骨髄線維症、糖原貯蔵症、家族性高コレステロール血症、クリグラー・ナジャー症候群、遺伝性高チロシン血症、ポンペ病、進行性家族性胆汁うっ滞、ハーラー症候群、SCIDまたは漏出SCID、オーメン症候群、軟骨毛髪形成不全症、単純ヘルペス脳炎、硬皮症、骨形成不全症、ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、先天性角化異常症などの薬物標的の発見に用いられてもよい。本発明の培地および方法に従って培養された細胞およびオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表していると考えられている。この理由から、本発明の培地および方法に従って培養された細胞およびオルガノイドは、特定の疾患において新規の(分子)標的を発見するツールになり得る。
疾患組織および/または正常組織から得られた患者特異的オルガノイドを、ハイスループットスクリーニングにおいて特定された分子のターゲットバリデーションに使用することができる。同じことが、ハイスループットスクリーニングにおいて可能性のある治療薬として特定された化合物のバリデーションについても当てはまる。ハイスループット創薬細胞株研究からの偽陽性などについて試験するために、オルガノイド培養システムにおいて拡大された初代患者材料の使用が有用な場合がある。
さらに、潜在的な新規の薬物または公知もしくは新規の栄養補助食品の毒性アッセイにおけるCaco-2細胞などの細胞株の使用の代わりに、前記の拡大された幹細胞集団(例えば、本発明のオルガノイド)、例えば、陰窩-絨毛オルガノイドまたは膵臓オルガノイドを使用することができる。
さらに、病原体、例えば、適切な組織培養または動物モデルが現在ないノロウイルスを培養するために、前記の拡大された幹細胞集団(例えば、本発明のオルガノイド)、例えば、陰窩-絨毛オルガノイドまたは膵臓オルガノイドを使用することができる。
拡大された幹細胞集団(例えば、本発明のオルガノイド)、例えば、陰窩-絨毛オルガノイドまたは膵臓オルガノイドを含む培養物は、再生医療において、例えば、放射線後および/もしくは手術後の腸上皮修復において、炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎に罹患している患者における腸上皮の修復において、ならびに短腸症候群に罹患している患者における腸上皮の修復において有用である。小腸/結腸の遺伝性疾患を有する患者における腸上皮の修復において、さらなる使用が存在する。膵臓オルガノイドを含む培養物もまた、再生医療において、例えば、膵臓またはその一部の摘出後の移植片として、ならびに糖尿病Iおよび糖尿病IIなどの糖尿病の治療に有用である。
本発明はまた、幹細胞集団を拡大させるための方法であって、
a)幹細胞集団を用意する工程;
b)本発明による培養培地を用意する工程;
c)幹細胞を培養培地と接触させる工程; および
d)適切な条件下で細胞を培養する工程。
を含む方法を提供する。
a)単離された組織断片を用意する工程;
b)本発明による培養培地を用意する工程;
c)単離された組織断片を培養培地と接触させる工程; および
d)適切な条件下で細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
幹細胞、幹細胞集団、または単離された組織断片を用意する工程;
本発明による培養培地を用意する工程;
幹細胞を培養培地と接触させる工程;
適切な条件下で細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
第1の拡大培地中で幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を培養する工程;
幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を培養し続ける工程、および
培地に分化培地を補充する工程
を含み、分化培地が、TGF-β阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、およびWntより選択される因子の1つまたは複数、好ましくは、全てを含まない、方法を提供する。
関心対象の前記組織に適した本発明の培養培地中で、関心対象の前記組織から幹細胞または組織断片を拡大させる工程; および任意で、
関心対象の前記組織に適した本発明の培養培地中で、拡大された幹細胞または組織断片を分化させる工程
を含む方法を提供する。
本発明は、本発明による培養培地および幹細胞を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明による培養培地およびオルガノイドを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明による培養培地および細胞外マトリックスを含む組成物を提供する。
前記では「GI」番号を使用した。GI番号または「GenInfo Identifier」は、配列がNCBIのデータベースに加えられた時に、NCBIによって処理されたそれぞれの配列記録に連続して割り当てられた一連の数字である。GI番号は配列記録のアクセッション番号と全く異なる。(例えば、訂正のために、またはさらなるアノテーションもしくは情報を加えるために)配列が更新された時には、新たなGI番号が与えられる。したがって、ある特定のGI番号に関連した配列は決して変更されない。
ヒト上皮幹細胞のための改善された培養培地および方法のニーズに対処するために、本発明者らは、ある特定の癌、例えば、結腸直腸癌において破壊されていることが知られているシグナル伝達経路を調べた。これらの経路は癌において細胞運命に影響を及ぼし、インビトロ細胞培養条件下での細胞運命の決定にも役割を果たしている可能性があると仮説を立てた。
*活性スケール(4日間培養した後のプレーティング効率を対照と比較した):
0 = 変化なし; 1+ = <50%増加; 2+ = 50〜100%増加; 3+ = >100%増加;
1- = 0〜50%; 2- = 50〜100%減少; 3- = >100%減少。
**WENRは、EGF+ノギン+R-スポンジン+Wnt-3aを含む。
***培養培地に対して最大の改善を示した化合物を太字で強調した。
マウス結腸培養システムの確立
マウス結腸培養システムを確立しようとして、本発明者らは本発明者らの小腸培養条件を探索した(本明細書ではENR:EGF+ノギン+R-スポンジンと名付けた)。本発明者らの実験において、ENR培養条件下で結腸上皮の初期増殖がよく観察されたが、いつも失敗に終わった。マウス結腸の遠位部分から単離された上皮を用いてオルガノイド形成を研究した。ENR条件下では、単一の遠位結腸陰窩のプレーティング効率は小腸より非常に低く(1〜3%対>90%)、これらのオルガノイドを継代することができなかった。最近、本発明者らは、パネート細胞が数種類のWntリガンドを産生し(Gregorieff A et al. Gastroenterology 2005;129:626-38)、これらのパネート細胞によるWnt産生が腸幹細胞の維持に必須であることを示した(Sato T et al. Nature; 469:415-8)。結腸オルガノイドにおけるWntシグナル伝達状況を確かめるために、本発明者らは、Axin2-lacZマウス(忠実なWntレポーター)(Lustig B et al. Mol Cell Biol 2002;22: 1184-93)またはLgr5-GFPノックインマウス(Lgr5はWnt依存性幹細胞マーカーである)(Barker N et al. Nature 2007; 449:1003-7)に由来する結腸陰窩を培養した。
改善されたマウス結腸陰窩培養の成功に力を得て、本発明者らは培養条件をヒト結腸陰窩に適用した。当初、これらの陰窩は生存していたが、その後、ほとんどの陰窩が7日以内に分解した。ヒト結腸陰窩のプレーティング効率を高めるために、本発明者らは、候補増殖因子、ホルモン、およびビタミン(図12のリスト)をスクリーニングした。これらのうち、本発明者らは、ガストリンおよびニコチンアミド(NAD+の前駆体。サーチュイン活性を抑制することが見出された(Denu JM. Trends Biochem Sci 2005;30:479-83))が培養効率を改善することを見出した(図12)。プレーティング効率に対するガストリンの効果はほんのわずかであった。しかしながら、このホルモンは腸分化を妨げず、本発明者らは、全てのヒト腸の培養条件においてガストリンを含めることにした(以下「g」と省略する)。重要なことに、ニコチンアミド(10mM)は、最初の7日間を超える培養期間の延長に必須であった(図2a)。この培養条件下で、ヒト結腸オルガノイドを少なくとも1ヶ月間拡大させることができた。1ヶ月以降、結腸オルガノイドは出芽オルガノイド構造から嚢胞構造へと形態を変えた(図2b左)。形態学的変換と一致して増殖は連続して減少した。時として、嚢胞オルガノイドはその増殖能を回復した。しかしながら、最終的に、全てのオルガノイドが3ヶ月以内に増殖を停止した。乳腺上皮細胞またはケラチノサイトなどの他の初代培養システムでは2段階の増殖停止が観察され、死亡段階(mortality stage)1(M1;老化)および死亡段階2(M2;危機(crisis))と呼ばれている(Shay et al.,2006)。この条件で培養されたヒト腸オルガノイドでは、Wntが取り除かれた後でも多系列分化は観察されなかった(データ示さず)。
HISC条件下では、本発明者らは分化細胞を観察しなかった。マウス結腸オルガノイドにおいて見られたように、ヒトオルガノイドの成熟腸細胞分化にはWntを取り除くことが必要であった(図3a上パネルおよび図7)。しかしながら、杯細胞および腸内分泌細胞の分化は依然としてブロックされた。本発明者らは、ニコチンアミドおよびSB202190がこの分化を強力に阻害するが、2つの試薬が取り除かれるとオルガノイドは成熟した杯細胞および腸内分泌細胞を産生できることを見出した(図3a(中央パネルおよび下パネル)、図3b、ならびに図7)。Wnt、ニコチンアミド、およびSB202190の同じ分化阻害効果がヒト小腸オルガノイドにおいて観察された。リゾチーム+ パネート細胞が小腸オルガノイドにおいて観察されたが、結腸オルガノイドでは観察されなかった(図3d)。インビボでのp38阻害剤処理は杯細胞分化を阻害し、腸上皮増殖を増やすと報告されている(Otsuka M. Gastroenterology 2010;138: 1255-65, 1265 e1-9)。実際に、本発明者らは、p38阻害剤で処理された腸オルガノイドにおいて同じ表現型を観察した(図3d対e)。本発明者らは、Notch阻害に対するヒト腸オルガノイドの応答をさらに調べた。本発明者らは、γ-セクレターゼ阻害剤(ジベンザゼピン;DBZ)またはNotch経路転写因子CSLのコンディショナルターゲッティングによるNotch阻害がインビボで腸幹細胞を枯渇させ、腸上皮増殖を終結させ、杯細胞過形成を誘導すると以前に示した(van Es JH et al. Nature 2005;435:959-63)。実際に、DBZ処理されると腸オルガノイドはその増殖を止め、ほとんどの細胞は3日以内に杯細胞に変わった(図3g対f)。
最近、本発明者らは、Lgr5-GFP-ires-CreERT2xAPCflox/floxマウスにおいてタモキシフェン誘導性Cre活性化がなされるとLgr5幹細胞からマウス腸腺腫が効率的に形成されたことを報告した(Barker N et al. Genes Dev 2008;22:1856-64)。本発明者らは、誘導して10日後に腸腺腫を単離し、培養条件を最適化した。腺腫は出芽することなく嚢胞オルガノイド構造を効率的に形成した。APC消失がWnt経路を構成的に活性化するので、本発明者らは、R-スポンジン1が腺腫オルガノイド増殖に必要でないと予想した。実際に、このことが観察された。さらに、正常小腸の長期培養に必須のノギンは腺腫オルガノイドにおいて必要でなかった。興味深いことに、本発明者らは、腺腫オルガノイドにおいてノギンが取り除かれた7日後にLgr5-GFPの消失を観察したがAxin2-LacZの消失を観察しなかった(図4a、bおよびデータ示さず)。ER培地中で増殖させた時に正常腸オルガノイドについて同様の観察がなされた(Sato T et al. Nature 2009;459:262-5)。このことから、ノギンは、BMPシグナル阻害による可能性が最も高いが、Lgr5発現を維持するのに必要であるが、腺腫オルガノイドの拡大には必要でないことが分かった。腸陰窩から単離された新鮮に単離されたLgr5高細胞はインビトロでオルガノイド増殖を開始することができる(が、Lgr5低細胞はインビトロでオルガノイド増殖を開始することができない)(Sato T et al. Nature 2009;459:262-5)。腺腫内での同様のLgr5ヒエラルキーの存在を確かめるために、本発明者らは、EN培養オルガノイドからLgr5-GFP高細胞、GFP低細胞、およびGFP-ve細胞を単離し、これらのオルガノイド形成能を調べた。7日間の培養後に、Lgr5-GFP高は最も高いオルガノイド形成率を示した。だが、Lgr5-GFP低または-veもまたかなりの効率でオルガノイドを形成した(図4c)。注目すべきことに、ソーティングされたGFP-ve腺腫細胞はLgr5-GFP高オルガノイドを生じることができた((図8))。
バレット食道は、化生の結果として正常な扁平細胞上皮と置き換わった円柱上皮が下部食道に存在することを特徴とする(Odze RD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2009;6:478-90)。バレット食道の顕著な組織学的な特徴は食道に腸杯細胞が存在することである。バレットと腸上皮との類似性を利用して、本発明者らは小さなバレット上皮(BE)生検材料をヒト結腸培養条件に供した。これらの培養条件下では、正常な食道扁平細胞は一過的に1週間増殖したが、オルガノイドを継代することができなかった。HISC条件下ではバレット食道上皮を最大1ヶ月間維持することができた(図5a)。BEオルガノイドは、老化したヒト結腸オルガノイドと区別がつかない嚢胞オルガノイド構造を形成し、典型的には、培養1ヶ月後に増殖を停止した。FGF10をHISC条件に添加すると、BEオルガノイドは出芽構造の形成が可能になり、培養期間を有意に延ばした(>3ヶ月間)(図5b、c)。ヒト腸オルガノイドとは対照的に、ニコチンアミドおよびSB202190が取り除かれて4日後に、BEオルガノイドはKi67+ のままであり、最小数のPAS+ およびムチン+ 細胞を有した。取り除いた後に4日間、γ-セクレターゼ阻害剤DBZ(10uM)で処理すると増殖はブロックされ、杯細胞分化が誘導された(図5d〜g)。このことによって、このような阻害剤の局所送達が、分化療法によってバレット食道病変を除去するための有用な治療方針となり得るという本発明者らの以前の提唱が裏付けられた(Menke V et al. Disease models & mechanisms 2010;3:104-10)。注目すべきことに、本発明者らは時としてリゾチーム+ パネート細胞を観察した(図10)。このことから、BEオルガノイドは多系列分化を保持していることが分かる。
ここで開発されたプロトコールは、小腸、結腸、腺腫(腺癌)、およびバレット食道から単離された初代ヒト上皮細胞の頑強な、かつ長期の培養を可能にする(表3)。
マウス膵臓オルガノイド用の培養培地においてTGF-β阻害剤の使用も試験した。使用した拡大培地は、DMEM/F12培地(P/S、Glutamax、10mM Hepes、B27、N2、およびN-アセチルシステインが添加された)、EGF(50ng/ml)、R-スポンジン(10%)、ノギン(100ng/ml)、FGF10(100ng/ml)、A8301(TGF-β阻害剤、500nM)、ならびにガストリン(10μM)であった。これは、実施例2において使用された前記のHISC培養物の培地と、Wntアゴニスト(Rスポンジン以外)もニコチンアミドも無く、FGF10が加えられている点でわずかに異なる。しかしながら、これらの培養培地は多数の重要な成分(ENR+ガストリン+TGF-β阻害剤)を共有し、いずれの場合でもTGF-β阻害剤の添加は有利である。これらの条件で増殖させた膵臓オルガノイドは3ヶ月を超えて拡大し、少なくとも5回、継代することができた。
拡大培地におけるBMP阻害剤ノギンの役割を調べるために、本発明者らは、常にEGFRA培地中で培養された、したがって、ノギンの存在下で培養されたことがない膵臓オルガノイドにおける初期内分泌マーカーおよび管マーカーのmRNAレベルを、常にEGFRAN培地中で培養された(すなわち、常にノギンの存在下で培養された)オルガノイドにおける同じマーカーの発現レベルと比較した。本発明者らはまた、ノギンが添加された膵臓オルガノイドまたは培養物からノギンが除去された膵臓オルガノイドにおける、これらのマーカーのmRNAレベルも比較した。具体的には、膵臓オルガノイドの1つの試料をEGFRA培地中で培養し、次いで、ノギンを添加し、オルガノイドを、さらに2日間または4日間培養した。膵臓オルガノイドの別の試料をEGFRAN培地中で培養し、次いで、ノギンを除去し、さらに2日間または4日間培養した。遺伝子発現を比較し、結果を図17Aに示した。ノギンはケラチン7およびケラチン19(管マーカー)の発現を低減することが見出された。このことから、ノギンは管表現型への分化をブロックすることが分かる(白色および濃い灰色の試料におけるケラチンレベルは黒色の試料より低い)。インシュリン産生細胞の発生に必須のいくつかの転写因子(すなわち、Sox9、Hnf6、Hnf1a、Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1、およびHnf1b)の発現レベルはノギンの影響を受けなかった。ノギンは培養物が完全な管表現型を獲得するのを阻止し、インシュリン産生細胞への将来の分化を阻止する可能性が高いが、ノギンはいくつかの管特徴をインシュリン産生前駆細胞の特徴と組み合わせて維持しながら細胞が拡大するのを可能にするので、本発明者らはノギンを拡大培地に含める。
実施例1記載のプロトコールを用いて拡大された膵臓オルガノイド(図18Aを参照されたい)を免疫不全マウスの腎被膜下に移植した。
ER条件下またはENRW条件下で、肝臓オルガノイド培養物を自己複製させ、1年まで毎週、維持および拡大させることができる(図20A)。1年後の核型分析は染色体異常の証拠を示さない。分析した細胞の66%超が正常な染色体数を示し、13%が肝細胞の特徴的な形質である倍数性も示した(図20B)。
試薬
培養実験に使用した試薬を表4に示した。
以前に述べられたように、Lgr5-EGFP-ires-creERT2マウス(Barker N et al. Nature 2007;449:1003-7)、APCfl/fl (Sansom OJ et al. Genes Dev 2004;18:1385-90)、Axin2-lacZマウス(Lustig B et al. Mol Cell Biol 2002;22:1184-93)、C57B/6野生型マウス(6〜12週齢)の遺伝子型を同定し、これらを実験に使用した。Lgr5-EGFP-ires-creERT2マウスをAPCfl/flマウスと交雑させた。Cre酵素活性をタモキシフェン(2mg/マウス)の腹腔内注射によって誘導した。タモキシフェン誘導の4週間後にマウスを安楽死させた。マウスの小腸および結腸を縦方向に切開し、冷PBSで洗浄し、陰窩単離のためにさらに処理した。腸腺腫を含有する領域を実体顕微鏡を用いて特定し、外科用メスで切断し、冷PBSで洗浄した。
外科的に切除された腸組織を、Diaconessen Hospital UtrechtまたはUMCU Hospitalにいる30人の患者から得た。
上清が透明になるまで、腸断片(マウス正常結腸、ヒト正常小腸および結腸)を冷PBSでさらに洗浄した。次に、組織断片を、2mM EDTA冷キレート化緩衝液(5.6mM Na2HP04、8.0mM KH2P04、96.2mM NaCL、1.6mM KCl、43.4mMスクロース、54.9mM D-ソルビトール、0.5mM DL-ジチオスレイトールを含む蒸留水)の中で氷上で30分間インキュベートした(Gregorieff A Gastroenterology 2005(129)626-638)。EDTA緩衝液を除去した後に、腸陰窩を単離するために、組織断片を10mlピペットを用いて冷キレート化緩衝液中で勢いよく再懸濁した。組織断片を通常重力下で1分間、沈殿させ、倒立顕微鏡観察による検査のために上清を除去した。再懸濁/沈降手順は典型的には6〜8回であり、陰窩を含有しない上清を捨てた。陰窩を含有する上清を、ウシ血清アルブミンでコーティングした50mlファルコンチューブに収集した。単離された陰窩をペレット化し、冷キレート化緩衝液で洗浄し、単一の細胞から陰窩を分離するために150〜200gで3分間、遠心分離した。
単離された腸陰窩、バレット上皮、および結腸癌細胞を血球計を用いて計数した。陰窩、上皮断片、または単一の細胞を氷上でmatrigel(低増殖因子、フェノールレッドフリー; BD bioscience)に埋め込み、48ウェルプレート(500個の陰窩/断片または1000個の単一の細胞/25μl matrigel/ウェル)に播種した。matrigelを37℃で10分間、重合し、以下の最適化された増殖因子の組み合わせを含有する250μl/ウェル基本培地(ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES、Glutamax、1xN2、1xB27(全てInvitrogenから)、および1mM N-アセチルシステイン(Sigma)が添加されたAdvanced DMEM/F12)被せた: マウス腸腺腫についてはマウスEGF、マウス小腸陰窩についてはENR(マウスEGF、マウスノギン、ヒトR-スポンジン-1)、マウス結腸陰窩についてはWENR(組換えヒトWnt-3AまたはWnt-3A条件培地+ENR)、ヒト小腸/結腸陰窩についてはHISC(ヒト腸幹細胞:WENR+ガストリン+ニコチンアミド+A83-01+SB202190)、バレット上皮についてはHISC+ヒトFGF10。結腸癌細胞は不均一な挙動を示し、増殖因子、マウスEGFおよび/またはA83-01および/またはSB202190の添加を必要としない。細胞選別実験のために、アノイキスを避けるために最初の2日間、Y-27632(10μM;Sigma)を培地に含めた。試薬および各増殖因子の濃度を図12に示した。各臓器について最適化された増殖因子および低分子阻害剤の組み合わせのまとめを図12に示した。
オルガノイドの画像は、Leica SP5、倒立顕微鏡(Nikon DM-IL)を用いて共焦点顕微鏡観察によって、または実体顕微鏡(Leica, MZ16-FA)によって撮影した。免疫組織化学の場合、試料を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で1時間、固定し、パラフィン切片を標準的な技法で処理した。前述のように免疫組織化学を行った。ホールマウント免疫染色の場合、陰窩オルガノイドを、Recovery solution(BD bioscience)を用いてMatrigelから単離し、4%PFAで固定した後に、0.1%Triton X-100で透過処理した。一次抗体は、マウス抗Ki67(1:250, Monosan)、ウサギ抗Muc2(1:100, Santa Cruz)、ウサギ抗リゾチーム(1:1,000, Dako)、ウサギ抗シナプトフィジン(1:100, Dako)、および抗クロモグラニンA(1:100, Santa Cruz)であった。二次抗体はペルオキシダーゼ結合抗体またはAlexa-568結合抗体であった。EdU染色は製造業者のプロトコール(Click-IT; Invitrogen)に従った。DNAをDAPI(Molecular Probes)で染色した。三次元画像を共焦点顕微鏡観察によって取得し、Volocityソフトウェア(Improvision)によって再構築した。
データはアクセッション番号GSE28907でGEOデータベースに寄託された。
肝臓オルガノイドのインビトロ生存、増殖、および拡大は、基本培地へのプロスタグランジンE2(PGE2)またはアラキドン酸(AA)の添加によって強力に向上した。
GSK3阻害剤であるCHIR99021は培養培地に有効なWntアゴニストだと示された。特に、CHIR99021は、結腸オルガノイドおよび肝臓オルガノイド用の培養培地における適切なWnt代用品であることが示された。
前立腺上皮の単離(マウスプロトコール)
番号のついた工程は図47に対応する。
i)マウスから成熟前立腺を単離し、泌尿生殖洞を単離するために、最低8週齢の雄マウスを屠殺する。
ii)血管および結合組織を破壊/切断し、尿道の底部を切開することによって精嚢を除去する。
iii)尿道の底部付近にある膀胱を破壊/切断することによって膀胱を取り除く。
iv)残っている精嚢および脂肪組織を穏やかに引っ張り、切断することによって取り除く。残しておくべきものは、前立腺葉(前立腺葉のうち6つ)および中央にあるピンク色の構造、尿道である。
v)ピンク色で容易に認められる(写真の中では濃く染色されている)尿道を取り出す。前立腺葉を注意深く引っ張る。そのため、前立腺葉は尿道とくっついていない。引っ張ってばらばらにするだけで、それぞれの葉が1つ1つ分離する。または、前立腺全体を用いて続ける。
次に、前立腺(葉)を小さな断片に切り刻む。前立腺を1mlの10mg/mlコラゲナーゼII(ADMEM/F12に溶解)の中で1 1/2時間、37℃で消化する。コラゲナーゼ消化後には上皮細胞の「指状」構造しか残らないはずである。
-ADMEM/F12で洗浄する。
-塊を沈殿させ、上清を取り出す(低速遠心分離によって、ほとんどの間葉が取り除かれる)。
-50xG、4℃で5分間、遠心分離する。
-1mlトリプシン(TLE)に再懸濁し、37℃で約30分間、消化する。
確実に消化するために10分ごとに上下にピペッティングする。
-ADMEM/F12で洗浄する。
-ENRまたはENR+1nMジヒドロテストステロンの中で培養を開始する(約5000細胞/ウェルで播種する)(0.1nM〜10uM)。本発明者らは上限を知らない。
-または、FACSによって特定の細胞タイプの単離を続ける。
前記の方法に従ってENR+ジヒドロテストステロンの中で培養した前立腺上皮細胞は今までに35週間維持することができた。テストステロンの存在下で培養物はテストステロン非存在下と同様に拡大する。しかしながら、テストステロンの存在下では、幹細胞、TA細胞、および分化細胞を含む全ての細胞タイプが存在する。すなわち、幹細胞集団を維持しながら分化が増大する。テストステロンの存在下で増殖させた前立腺オルガノイドはまたインビボ臓器にもよく似ている(図41および図42を参照されたい)。さらに、IHCおよびRT-PCRから、テストステロンの存在下で増殖させた前立腺オルガノイドは基底細胞および管腔細胞を両方とも含有することが分かる。
1. TGFβ受容体キナーゼ1、ALK4、ALK5、ALK7、p38を含む群より選択される1種または複数種のセリン/スレオニンプロテインキナーゼ標的に結合しかつその活性を低減する少なくとも1種または複数種の阻害剤を含み、かつ少なくとも3ヶ月間の連続増殖を可能にする、幹細胞集団を拡大させるための培養培地。
2. 少なくとも1種または複数種の阻害剤が、
a) ALK5に結合しかつその活性を低減する阻害剤; および
b) p38に結合しかつその活性を低減する阻害剤
を含む、態様1記載の培養培地。
3. 阻害剤が、細胞アッセイによって評価された時に、阻害剤の標的に結合し、かつ該標的の活性を95%超低減する薬剤である、態様1または態様2記載の培養培地。
4. 阻害剤が100nM未満のIC50値を有する、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
5. 阻害剤が、競合的に; 非競合的に; 不競合的に; または混合阻害によって作用する、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
6. 阻害剤が競合的に作用し、かつセリン-スレオニンプロテインキナーゼ標的のATP結合ポケットに結合する、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
7. 阻害剤が、a) 低分子阻害剤; b) タンパク質もしくはペプチド; c) アンチセンスオリゴヌクレオチド; またはd) アプタマーである、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
8. 低分子阻害剤が50〜800Daの分子量を有する、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
9. 阻害剤がピリジニルイミダゾールまたは2,4-二置換プテリジンまたはキナゾリン由来阻害剤である、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
10. 阻害剤が10nM〜10μMの濃度で添加される、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
11. 阻害剤が、SB-202190、SB-203580、SB-206718、SB-227931、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257、BIRB-796、A83-01、LY364947、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY364947、SD-093、およびSJN2511を含む化合物の群より選択される、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
12. SB-202190またはSB-203580が50nM〜100uMの濃度で添加される、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
13. 幹細胞がヒト幹細胞である、前記態様のいずれかに記載の培養培地。
14. 幹細胞が上皮幹細胞である、前記態様のいずれかに記載の培養培地。
15. ヒト上皮幹細胞が、a) 膵臓幹細胞; b) 腸幹細胞; またはc) 結腸幹細胞である、態様14記載の培養培地。
16. 幹細胞がオルガノイドの一部または単離された組織断片を形成する、前記態様のいずれかに記載の培養培地。
17. 幹細胞が癌幹細胞である、前記態様のいずれかに記載の培養培地。
18. 1ヶ月後、2ヶ月後、または3ヶ月後、またはそれより後で、幹細胞集団中の正常核型を有する細胞のパーセンテージが90%超である、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
19. 1ヶ月後、2ヶ月後、または3ヶ月後、またはそれより後で、幹細胞集団中の正常表現型を有する細胞のパーセンテージが90%超である、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
20. 幹細胞が3ヶ月間より長く、例えば6ヶ月間より長く生存する、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
21. 幹細胞が12〜36時間、18〜30時間、または約24時間の平均集団倍加時間を有する、前記態様のいずれか一つに記載の培養培地。
22. 動物細胞またはヒト細胞のための基本培地、ならびに
a) 1種または複数種の骨形成タンパク質(BMP)阻害剤;
b) 1種または複数種の***促進増殖因子; および
c) 1種または複数種のWntアゴニスト
を含む、前記態様のいずれかに記載の培養培地。
23. ガストリンおよび/またはニコチンアミドを含む、前記態様のいずれかに記載の培養培地。
24. 以下の工程を含む、幹細胞集団を拡大させるための方法:
a) 幹細胞集団を用意する工程;
b) 前記態様のいずれか一つに記載の培養培地を用意する工程;
c) 幹細胞を培養培地と接触させる工程; および
d) 適切な条件下で細胞を培養する工程。
25. 前記態様のいずれかに記載の培養培地および幹細胞を含む、組成物。
26. 本発明による培養培地および細胞外マトリックスを含む、組成物。
27. 前記態様のいずれかに記載の1種または複数種の阻害剤を含む、培養培地サプリメント。
28. 前記態様のいずれかに記載の培養培地または態様27記載の培養培地サプリメントを含有する、密閉封止された容器。
29. FGF10をさらに含む培養培地であって、バレット食道上皮を培養するための態様1〜23のいずれかに記載の培養培地。
30. 移植目的または他の治療用途における使用のための、前記態様のいずれかに記載の培養培地を用いて得られた幹細胞またはオルガノイド。
31. β細胞を含む膵臓オルガノイド。
32. α細胞、δ細胞、およびPP細胞をさらに含む、態様31記載の膵臓オルガノイド。
33. α細胞、β細胞、δ細胞、およびPP細胞を含む、態様31または32のいずれか一つに記載の膵臓オルガノイド。
34. Pdx1、Nkx2.2、およびNkx6.1のうちの1つ、2つ、または3つ全てを発現する、態様31または33のいずれか一つに記載の膵臓オルガノイド。
35. NeuroD、Pax6、およびMafaのうちの1つ、2つ、または3つ全てを発現する、態様31〜34のいずれか一つに記載の膵臓オルガノイド。
36. Ngn3を付加的に発現する、態様35記載の膵臓オルガノイド。
37. 患者にオルガノイドを移植した後にインシュリンを分泌することができる膵臓オルガノイド、例えば態様31〜36のいずれか一つに記載の膵臓オルガノイド。
38. 糖尿病などのインシュリン欠乏障害を有する患者の治療における使用のための、態様31〜37のいずれか一つに記載の膵臓オルガノイド。
39. 態様31〜37のいずれか一つに記載の膵臓オルガノイドを患者に移植する工程を含む、糖尿病などのインシュリン欠乏障害を有する患者を治療する方法。
40. 陰窩-絨毛オルガノイド、結腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、胃オルガノイド、バレット食道オルガノイド、腺癌オルガノイド、および結腸癌腫オルガノイドからなる群より選択される、ヒトオルガノイド。
41. 損傷上皮、例えば微絨毛封入体病(microvillous inclusion disease)(MVID)患者の損傷上皮の治療における使用のための、態様1〜23のいずれかに記載の培養培地を用いて得られた小腸オルガノイドまたは陰窩-絨毛オルガノイド。
42. ***促進増殖因子(例えば、EGF)などの1種または複数種の受容体型チロシンキナーゼリガンド、ニコチンアミド、および好ましくはWntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1〜4および/またはCHIR99021、ならびにa) PGE2および/もしくはAAなどのプロスタグランジン経路アクチベーターおよびb) A83-01などのTGF-β阻害剤の一方または両方が添加された、動物細胞またはヒト細胞のための基本培地を含む、または該基本培地からなる、肝臓培地。
Claims (62)
- 以下を含む、成体幹細胞集団を拡大および/または分化させるための培養培地:
i. Rスポンジン1〜4のいずれか1つおよび/またはRスポンジン模倣体; ならびに
ii. TGF-βシグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する1種または複数種の阻害剤。 - 1種または複数種の阻害剤が、ALK5、ALK4、TGF-β受容体キナーゼ1、およびALK7からなる群より選択される1種または複数種のセリン/スレオニンプロテインキナーゼに結合し、かつその活性を低減する、請求項1記載の培養培地。
- TGF-βシグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する1種または複数種の阻害剤が、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、SD-208、LY-36494、およびSJN-2511からなる群より選択される、請求項1または請求項2記載の培養培地。
- p38シグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する阻害剤をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- p38シグナル伝達を直接的または間接的に負に調節する1種または複数種の阻害剤が、SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257、およびBIRB-796からなる群より選択される、請求項4記載の培養培地。
- A83-01およびSB-202190またはA83-01およびSB-203580を含む、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- 阻害剤が1nM〜100μM、10nM〜100μM、100nM〜10μM、または約1μMの濃度で添加される、例えば、1種または複数種の阻害剤の総濃度が10nM〜100μM、100nM〜10μM、または約1μMである、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- BMP阻害剤、Wntアゴニスト、受容体型チロシンキナーゼリガンド、Rock阻害剤、ニコチンアミド、およびガストリンより選択される1種または複数種の付加的な成分を含む、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- Rスポンジン1〜4のいずれか1つおよび/またはRスポンジン模倣体、BMP阻害剤(例えばノギン(Noggin))、TGF-β阻害剤、受容体型チロシンキナーゼリガンド(例えばEGF)、ニコチンアミド、Wntアゴニスト(例えばWnt(3a))を含み、かつ任意で、p38阻害剤、ガストリン、FGF10、HGF、およびRock阻害剤より選択される1種または複数種の付加的な成分を含む、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- BMP阻害剤が、ノギン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、DAN、DANシステインノットドメインを含むDAN様タンパク質、スクレロスチン/SOST、およびα-2マクログロブリンからなる群より選択される、請求項8または請求項9記載の培養培地。
- Wntアゴニストが、Wnt-3a、GSK阻害剤(例えばCHIR99021)、Wnt5、Wnt-6a、ノリン(Norrin)、および他の任意のWntファミリータンパク質からなる群より選択される、請求項8または請求項9記載の培養培地。
- 受容体型チロシンキナーゼリガンドが、***促進増殖因子、例えば上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子-α(TGF-α)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、肝細胞増殖因子(HGF)、およびケラチノサイト増殖因子(KGF)からなる増殖因子ファミリーより選択される***促進増殖因子である、請求項8または請求項9記載の培養培地。
- Rock阻害剤が、R-(+)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物(Y-27632)、5-(1,4-ジアゼパン-1-イルスルホニル)イソキノリン(ファスジルまたはHA1071)、および(S)-(+)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]-ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン二塩酸塩(H-1152)からなる群より選択される、請求項8または請求項9記載の培養培地。
- プロスタグランジンシグナル伝達経路アクチベーター、例えばPGE2および/またはAAを付加的に含む、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- テストステロン、例えば(ジヒドロ)テストステロンを付加的に含む、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- 基本培地、Wnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、TGF-β阻害剤、ニコチンアミド、および好ましくはp38阻害剤を含む、またはこれらからなる、腸細胞を培養するための請求項1〜15のいずれか一項記載の培養培地。
- 基本培地、Wnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、TGF-β阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、FGF-10、および好ましくはp38阻害剤を含む、またはこれらからなる、胃細胞を培養するための請求項1〜15のいずれか一項記載の培養培地。
- 基本培地、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、ノギン、ニコチンアミド、EGF、FGF10、HGF、ガストリン、TGF-β阻害剤、およびPGE2、および好ましくはWnt-3aを含む、またはこれらからなる、肝臓細胞を拡大させるための請求項1〜15のいずれか一項記載の培養培地。
- 基本培地、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、ノギン、EGF、FGF10、ガストリン、TGF-β阻害剤、および好ましくはエキセンディン4およびWnt-3aを含む、またはこれらからなる、膵臓細胞を拡大させるための請求項1〜15のいずれか一項記載の培養培地。
- 基本培地、EGF、Rスポンジン1〜4のいずれか1つ、ノギン、ニコチンアミド、TGF-β阻害剤、および好ましくはWnt-3aおよびFGF-10を含む、またはこれらからなる、前立腺細胞を培養するための請求項1〜15のいずれか一項記載の培養培地。
- テストステロン、例えば(ジヒドロ)テストステロンをさらに含む、請求項20記載の前立腺細胞を培養するための培養培地。
- 関心対象の対応する非癌組織タイプに由来する細胞を培養するのに用いられる培養培地の成分を含むか、または該成分からなり、
任意で、関心対象の組織タイプの非癌細胞を培養するのに用いられる該培地からWnt-3a、EGF、ノギン、Rスポンジン、TGF-β阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、ガストリン、FGF10、およびHGFのうちの1つまたは複数が排除されている、
関心対象の組織タイプに由来する腺癌細胞または癌腫細胞などの癌細胞、例えば癌幹細胞を培養するための前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。 - 関心対象の組織タイプに由来する幹細胞を拡大させるのに用いられる培養培地の成分を含むか、または該成分からなるが、Wnt、Rスポンジン、BMP阻害剤、TGF-β阻害剤、受容体型チロシンキナーゼリガンド、p38阻害剤、およびニコチンアミドのうちの1つまたは複数が排除されている、関心対象の組織に由来する幹細胞を分化させるための前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- 基本培地、EGF、ノギン、TGF-β阻害剤、およびp38阻害剤を含む、またはこれらからなる、腸細胞を分化させるための請求項23記載の培養培地。
- 基本培地、ノギン、EGF、ガストリン、TGF-β阻害剤、DAPTもしくはDBZなどのγ-セクレターゼ阻害剤、および好ましくはWnt-3aを含む、またはこれらからなる、肝臓細胞を分化させるための請求項23記載の培養培地。
- 基本培地、ノギン、EGF、FGF10、ガストリン、TGF-β阻害剤、γ-セクレターゼ阻害剤、および好ましくはエキセンディン4を含む、またはこれらからなる、膵臓細胞を分化させるための請求項23記載の培養培地。
- 細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックスと接触している、前記請求項のいずれか一項記載の培養培地。
- 細胞外マトリックスが、Matrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスである、請求項27記載の培養培地。
- 請求項1〜26のいずれか一項記載の培養培地、および細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックス、例えばMatrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスを含む、組成物。
- 前記請求項のいずれか一項記載の培養培地または組成物を含有する、密閉封止された容器。
- 幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを拡大および/または分化させるための、請求項1〜28のいずれか一項記載の培養培地の使用。
- 幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドが、1つまたは複数の腸幹細胞、小腸陰窩、結腸陰窩、胃幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、および前立腺幹細胞からなる群より選択される、請求項31記載の使用。
- 幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを正常組織から得ることができる、請求項31または請求項32記載の使用。
- 幹細胞、幹細胞集団、組織断片、またはオルガノイドを、疾患組織、例えば腺腫、癌腫、腺癌、嚢胞性線維症患者の腸、または炎症性腸疾患患者の腸から得ることができる、請求項31または32記載の使用。
- 単一の幹細胞または幹細胞集団を請求項1〜28のいずれか一項記載の培養培地中で培養する工程を含む、単一の幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を拡大させるための、好ましくはオルガノイドを得るためにそれらを拡大させるための方法。
- 以下の工程を含む、請求項35記載の方法:
幹細胞、幹細胞集団、または単離された組織断片を用意する工程;
請求項1〜28のいずれか一項記載の培養培地を用意する工程;
該幹細胞を該培養培地と接触させる工程;
適切な条件下で該細胞を培養する工程。 - 細胞外マトリックス、またはインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって細胞外マトリックスを模倣する3Dマトリックス、例えばMatrigel(商標)(BD Biosciences)などのラミニン含有細胞外マトリックスと、幹細胞、幹細胞集団、または単離された組織断片、および培養培地とを接触させる工程を含む、請求項35記載の方法。
- 培養培地が細胞外マトリックスの中に拡散される、請求項37記載の方法。
- 以下の工程を含む、請求項35〜38のいずれか一項記載の方法:
幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を第1の拡大培地中で培養する工程;
該幹細胞、幹細胞集団、または組織断片を培養し続け、かつ該培地に、TGF-β阻害剤、p38阻害剤、ニコチンアミド、およびWntより選択される因子の1つまたは複数、好ましくは全てを含まない分化培地を補充する工程。 - 以下の工程を含む、小腸オルガノイドまたは結腸オルガノイドを得るための請求項35〜38のいずれか一項記載の方法:
小腸または結腸の幹細胞または組織断片を請求項17記載の培養培地中で拡大させる工程; および任意で、
拡大された小腸または結腸の幹細胞または組織断片を請求項24記載の培養培地中で分化させる工程。 - 胃の幹細胞または組織断片を請求項16記載の培養培地中で培養する工程を含む、胃オルガノイドを得るための請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程を含む、肝臓オルガノイドを得るための請求項35〜39のいずれか一項記載の方法:
肝臓の細胞または組織断片を請求項19記載の培養培地中で拡大させる工程; および任意で、
拡大された肝臓の細胞または組織断片を請求項25記載の培養培地中で分化させる工程。 - 以下の工程を含む、膵臓オルガノイドを得るための請求項35〜39のいずれか一項記載の方法:
膵臓の細胞または組織断片を請求項20記載の培養培地中で拡大させる工程; および任意で、
拡大された膵臓の細胞または組織断片を請求項26記載の培養培地中で分化させる工程。 - 前立腺の幹細胞または組織断片を請求項19記載の培養培地中で培養する工程を含む、前立腺オルガノイドを得るための請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
- 腺癌または癌腫の幹細胞または組織断片を請求項22記載の培養培地中で培養する工程を含む、腺癌オルガノイドまたは癌腫オルガノイドを得るための請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
- Rock阻害剤が、最初の1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間、任意で1日おきに培養培地に添加される、請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜28のいずれか一項記載の培養培地を用いて、幹細胞を、3ヶ月間またはそれより長く、例えば4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、またはそれより長く培養する工程を含む、請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
- 請求項35〜47のいずれか一項記載の方法によって得ることができるオルガノイドまたは細胞集団。
- 請求項1〜28のいずれか一項記載の培養培地中で培養された場合に、少なくとも3ヶ月間、例えば少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間、またはそれより長く培養状態で生存することができる、請求項48記載のオルガノイドまたは細胞集団。
- 少なくとも3ヶ月間、例えば少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、または少なくとも12ヶ月間、またはそれより長く培養されている、請求項48記載のオルガノイドまたは細胞集団。
- 1週間につき少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍の割合で拡大する、請求項48〜50のいずれか一項記載のオルガノイドまたは細胞集団。
- ヒトオルガノイドまたはヒト細胞集団である、請求項48〜51のいずれか一項記載のオルガノイドまたは細胞集団。
- 正常オルガノイドもしくは正常細胞集団である、または疾患オルガノイドもしくは疾患細胞集団、例えば疾患を有するヒトもしくは動物から採取された幹細胞を培養することによって得られた疾患オルガノイドもしくは疾患細胞集団である、請求項48〜52のいずれか一項記載のオルガノイドまたは細胞集団。
- -5℃より低い、-10℃より低い、-20℃より低い、-40℃より低い、-60℃より低い、-80℃より低い、-100℃より低い、または-150℃より低い温度で、例えば約-180℃で凍結および保存される、請求項48〜53のいずれか一項記載のオルガノイドまたは細胞集団。
- 中心管腔を取り囲む上皮細胞を含む三次元オルガノイドであるオルガノイドであって、任意で該上皮細胞が別個の***領域および分化領域に存在する、該オルガノイド、好ましくは請求項48〜54のいずれか一項記載のオルガノイド。
- 単層、任意で、折り畳まれた単層の領域および重層細胞の領域に並べられた上皮細胞を含む三次元オルガノイドである、請求項55記載のオルガノイド。
- 非上皮細胞が存在しない、請求項48〜56のいずれか一項記載のオルガノイド。
- 正常インビボ組織の全ての分化細胞タイプが存在する、請求項48〜57のいずれか一項記載のオルガノイド。
- 小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、胃オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、または前立腺オルガノイドである、請求項48〜58のいずれか一項記載のオルガノイド。
- 以下を含む組成物:
i) 請求項48〜59のいずれか一項記載の1つまたは複数のオルガノイドまたは細胞集団; ならびに
ii) 請求項1〜28のいずれか一項記載の培養培地および/または細胞外マトリックス。 - 薬物スクリーニング、ターゲットバリデーション、ターゲット発見、毒物学、毒性スクリーニング、個別化医療、再生医療、またはエクスビボ細胞/臓器モデルにおける使用のための、例えば疾患モデルとしての使用のための、請求項48〜59のいずれか一項記載のオルガノイド、または請求項48〜54のいずれか一項記載の細胞集団、または請求項29もしくは請求項60記載の組成物。
- 再生医療または個別化医療が、哺乳動物、好ましくはヒトへのオルガノイド、細胞集団、または組成物の移植を含む、請求項61記載の使用のためのオルガノイド、細胞集団、または組成物。
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