KR102085559B1

KR102085559B1 - 은이 버섯 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102085559B1
Application number: KR1020180089108A
Authority: KR
Inventors: 최재환; 이승지; 김용재; 박혜경; 이우람; 김유선; 변경수
Original assignee: 주식회사 인투바이오
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2020-03-06
Also published as: KR20190014477A

Abstract

본 발명은 은이 버섯 다당체를 유효성분으로 포함하는 필라그린 및 인볼루크린 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

은이 버섯 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도{Tremella fuciformis extraxt, preparation method thereof and Use the same}

본 발명은 은이 버섯 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인볼루크린 및 필라그린 생성 촉진에 효과적인 은이 버섯 열수 추출물, 이의 제조방법 및 화장료 조성물로서의 용도에 관한 것이다.

은이 버섯(Tremella fuciformis)은 흰목이 과에 속하는 식물로 원산지는 중국, 일본, 한국 등이며 구릉지대 및 산간부 활엽수의 썩은 나무에 발생한다. 자실체의 지름은 3-8 cm로 순백색이고 반투명한 젤라틴과 유사하며, 인간의 귀와 유사한 형태로 인해 은이(銀耳)라 불린다. 중국 전통 약학 이론과 중국 고대 한방 의학서에 의하면 은이 버섯은 만성 기관지염의 치료에 사용될 뿐만 아니라, 당, 송시대에는 미용식품으로 섭취하였다고 기록되었다.

은이 버섯은 칼슘, 철분 등의 무기질을 함유하고 있으며 자체 중량의 500배에 이르는 수분을 함유하고 있기 때문에 보습제로서 매우 뛰어난 기능을 보유하고 있다. 또한 피부 미세혈관의 노화를 방지하여 주름을 감소시키고 잔주름을 예방하는 효과가 있어 화장품의 원료로 사용되고 있다. 은이 버섯은 균류에서 생성되는 당류인 트레할로스(trehalose)와 콜라겐(collagen)을 함유하고 있고 식유섬유와 항산화제인 폴리페놀(polyphenol)류를 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

대한민국 등록특허공보 1516384호에서는 흰목이 버섯 추출물을 젤 또는 용액 상태로 제조하고, 나노입자화하여 점증제로서 화장품 조성물의 첨가제로 사용하는 구성을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허공보 10-2011-0052095호에서는 흰목이 버섯 추출물 및 히아루론산을 유효성분으로 함유시킨 피부 보습용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허공보 1257993호에서 효소를 이용하여 제조함으로써 신경세포 회복, 신경세포 손상 억제 및 기억증진용 용도로 사용하는 구성을 개시하며, 대한민국 공개특허공보 10-2005-0059956호에서 천연물질 5종과 함께 혼합되어 치매 예방용 용도로 사용하는 구성이 개시되었다. 또한, Park 등은 은이 버섯의 열수 추출물이 알츠하이머와 같은 퇴행성 신경질환의 제제로의 사용 가능성을 제시하였으며(Mycobiology 35(1): 11-15, 2007), Kim 등은 흰목이와 흑목이 버섯 추출물의 유리라디칼 소거 활성능을 측정하여 항산화 능력을 규명하였다(Food Engineering Progress 15(1), 6-14, 2011.02).

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 필라그린 및 인볼루크린 생성 촉진에 효과적인 은이 버섯 추출물을 포함하는 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 은이 버섯 추출물의 용도를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 은이 버섯 열수 추출물을 포함하는 인볼루크린 및 필라그린 생성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 은이 버섯은 진균으로 발효시킨 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 진균은 아스퍼질러스 속 곰팡이 균주일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 진균은 아스퍼질러스 니제르, 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 아와모리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 열수 추출물은 열수 추출 후 펙티나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 베타클루카나제, 아라비나제 및 자일란나제 중에서 선택되는 1종 이상으로 1-4일간 효소 처리한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 각질층 두께를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 조성물은 조성물 고형분 100 중량%에 대하여 갈락토오스 3-7 중량%, 글루코사민 8-15 중량% 및 갈락토사민 10-20 중량%를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 은이 버섯을 세절하여 열수 추출한 뒤, 여과하고, 건조하는 단계를 포함하는 은이 버섯 열수 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 멸균한 은이 버섯에 진균을 접종하고, 27-37℃에서 2-4일간 발효시키는 단계; 및 2) 상기 발효시킨 은이 버섯을 80 내지 110℃의 물에서 5 내지 24시간 동안 열수 추출하는 단계;를 포함하는 은이 버섯 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 2) 단계는 열수 추출물을 펙티나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 베타클루카나제, 아라비나제 및 자일란나제 중에서 선택되는 1종 이상의 효소로 1-4일간 처리하는 것을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 은이 버섯 열수 추출물을 포함하는 피부 노화, 피부염, 피부 탄력 저하, 주름, 홍반, 피부 보습저하 및 각질층이 얇아지는 증상 중에서 선택되는 1종 이상의 증상 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 노화는 피부 광노화 및 피부 열화 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 은이 버섯 추출물, 은이 버섯 추출물의 효소처리 물 및 고상 발효된 은이 버섯의 추출물은 피부 분화에 관여하는 필라그린 및 인볼루신의 생성을 촉진하므로 자외선 또는 외상 등 여러 가지 요인으로 인해 손상된 피부의 재생을 촉진할 수 있다. 뿐만 아니라, 광 독성이 없고, 피부 감작성 및 안점막 자극이 없으므로 산업상 유용하게 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 당 성분 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 분자량 분석 결과이다.
도 3는 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 아미노산 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 인볼루크린 단백질 발현 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 필라그린 단백질 발현 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 TNF-α 발현 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 열에 의해 유발된 노화 피부섬유아세포의 콜라겐 분해효소 발현 억제효과를 MMP-1 생성 저해를 통해 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 콜라겐 합성 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 산화 질소 발생 저해 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 홍반 감소 효과를 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 주름개선 효과를 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 탄력 개선 및 보습개선 효과를 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 피부자극 테스트 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예 1에 따른 은이 버섯 다당체의 알러지 테스트 결과이다.

피부는 외부를 덮고 있으며, 표피, 진피 및 피하지방층으로 구성된 신체기관으로서, 외부 환경으로부터 몸을 보호하고, 감각, 체온 조절 등 다양한 기능을 가지고 있다. 인볼루크린은 표피의 과립층 및 유극증 상부에서 발현되는 용해성 세포질단백질 성분으로서, 각질형성세포 말기 분화 초기에 발현되는 피부 분화의 중요한 바이오 마커이며, 필라그린은 단백질과 결합하는 기질역할을 하는 히스티딘이 풍부한 단백질의 일종으로 표피의 수분함량 유지 및 분화에 중요한 역할을 하는 바이오 마커이다. 본 발명의 발명자들은 피부와 관련된 바이오 마커를 조절할 수 있는 조정물을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 은이 버섯 열수 추출물을 포함하는 인볼루크린 및 필라그린 생성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 은이 버섯 열수 추출물은 인볼루크린과 필라그린의 생성을 동시에 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 은이 버섯 열수 추출물은 은이 버섯의 열수 추출물을 주정으로 처리하여 얻은 침전물일 수 있다.

상기 은이 버섯 추출물은 다당체를 포함할 수 있으며, 상기 다당체는 인볼루크린 및 필라그린 생성을 촉진시키는데 작용하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 은이 버섯은 진균으로 발효시킨 것일 수 있으며, 상기 진균은 바람직하게는 아스퍼질러스 속(Aspergillus spp .) 곰팡이 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 니제르, 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 아와모리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 아스퍼질러스 니제르일 수 있다.

본 발명에 의하면, 진균류, 특히, 아스퍼질러스 속 균주로 발효시킨 은이 버섯을 이용하여 열수 추출하는 경우, 다른 진균류에 발효시킨 것에 비해 인볼루크린과 필라그린의 생성을 더욱 촉진시키고, 콜라겐 생합성의 증가와 염증 마커의 감소 효과가 향상된 은이 버섯 열수 추출물을 얻었다.

본 발명에 의하면, 상기 발효는 통상적으로 사용되는 진균 발효 방법이면 특별히 제한은 없으나, 바람직하게는 고상 발효일 수 있다. 은이 버섯을 진균 발효시키는 경우, 추출물 내의 다당체의 구성이 달라질 수 있으며, 인볼루크린 및 필라그린 생성을 촉진시키는 데에 효과적인 분자량이 적은 다당체의 비율이 증가되는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 열수 추출물은 열수 추출 후 펙티나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 베타클루카나제, 아라비나제 및 자일란나제 중에서 선택되는 1종 이상으로 1-4일간 효소 처리한 것일 수 있다.

상기 열수 추출물을 효소로 처리하는 경우, 추출물 내의 다당체의 구성이 달라질 수 있으며, 인볼루크린 및 필라그린 생성을 촉진시키는 데에 효과적인 분자량이 적은 다당체의 비율이 증가되는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 조성물은 인볼루크린 및 필라그린 생성을 촉진시킴으로써 피부 각질층의 두께를 증가시키고, 피부 보습 저하를 방지하고, 콜라겐 생성을 촉진시키며, 손상된 피부 조직을 회복 또는 재생시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 은이 버섯을 열수 추출한 뒤, 여과하고, 건조하는 단계를 포함하는 은이 버섯 열수 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 은이 버섯은 채취한 상태의 것을 사용하여도 무방하나, 건조된 것일 수도 있다. 상기 건조는 통상적인 건조 방법으로 건조한 것일 수 있으며, 예를 들어, 감압 또는 동결건조일 수 있고, 바람직하게는 동결건조일 수 있다.

또한, 추출 수율을 향상시키기 위하여 상기 은이 버섯을 세절하거나 분말화할 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 열수 추출은 은이 버섯은 80 내지 110 ℃에서 2시간 내지 12시간 동안 추출하여 얻은 것일 수 있다. 상기 온도 범위인 것이 유용성 성분의 함량이 극대화된 추출물을 얻을 수 있어 바람직하다. 상기 얻어진 추출물은 여과하여 불순물을 제거할 수 있다. 여과는 은이 버섯 가공 상태에 따라 여과포를 선택하여 여과할 수 있으며, 예를 들어, 200 내지 800 메쉬의 여과포를 사용하여 여과시킬 수 있다. 또한, 유용성 성분의 함량이 보다 증가시키고, 불순물의 함량을 최소화하기 위해 마이크로 필터와 같은 고성능 필터를 사용하여 추가 정제할 수 있다. 상기 마이크로 필터는 0.3 내지 1 ㎛ 범위의 필터일 수 있으며, 본 발명에서는 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다.

본 발명에 의하면, 은이버섯 1 중량부에 대하여 물 20 내지 50 중량부를 사용하여 추출하는 것일 수 있다. 상기 범위인 것이 유용성 성분의 함량이 극대화된 추출물을 얻을 수 있어 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 노화는 자외선과 같은 광원에 의한 피부 손상(피부 광노화) 또는 생체 적합성 온도를 벗어난 고열, 예를 들어 40 ~ 45℃ 등의 온도에 의한 피부 손상(피부 열화)일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 자외선과 같은 광원에 의해 손상된 세포 및/또는 생체 적합 온도를 벗어난 열에 의해 손상된 세포의 재생 또는 활성을 증가시킬 수 있으므로, 피부 노화의 개선용 화장료 조성물로서 유용하다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 피부 세포의 콜라겐 합성율을 증가시키고, 콜라겐 분해효소 발현을 저해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 탄력 저하 방지 및/또는 주름 개선용 화장료 조성물로서 유용하다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 염증, 예를 들어 LPS로 유도된 염증과 같은 화학적 염증 및/또는 자외선 자극으로 유발된 염증과 같은 물리적 염증을 완화시킬 수 있으며, 자외선에 의해 유발된 홍반 및/또는 피부발작을 감소시키거나 완화시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 피부장벽인자의 활성 및 피부보습인자의 활성을 통해 피부 보습, 주름개선, 피부 탄력증진의 개선에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 화장료는 공지된 바의 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 스킨, 유액, 에센스, 로션, 바디로션, 바디젤, 바디에센스, 바디세정제, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징 겔, 팩, 마사지크림, 마사지겔, 영양크림, 수면크림 및 수분크림으로 이루어진 군 중에서 선택되는 제형일 수 있다.

또한 각 제형의 화장료 조성물에 있어서 상기 유색미 미강 발효물 외에 다른 성분들을 사용목적 또는 제형의 특징에 따라 임으로 선정하여 배합할 수 있으며, 그 제형의 제제화에 필요에 따라 효과를 떨어뜨리지 않는 범위에서 첨가물을 더 포함할 수 있다.

상기 첨가물은 예를 들어 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 방향제, 보존제, 중화제, 에몰리언트제, 피부보호제, 피부컨디셔닝제, 방부제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 살균제, 산화 안정화제, 실리콘, 소포제, 비타민, 곤중 기피제, 중합제, 추진제, 염기성화제, 산성화제, 착색제, 안료 및 충전제로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.

실시예 1. 은이 버섯 추출물

세절한 건조 은이 버섯(Tremella fuciformis) 100 g 및 물 3.5 kg을 추출기에 넣고 100 ℃로 8시간 동안 추출한 뒤, 400 mesh 여과포로 여과하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 2.1 kg의 여과수용액을 얻었다. 이를 동결건조하여 고형분 3.8 g을 수득하였다.

실시예 2. 효소처리 은이 버섯 추출물

실시예 1에서 제조한 은이 버섯 여과 수용액 2 kg에 펙티나제(TCI, 일본) 200 g을 첨가하고 65℃에서 72시간 동안 효소처리 하였다. 반응을 정지시키고, 400 mesh 여과지로 1차 여과하고, 0.45 μm 필터로 2차 여과하여 1.6 kg의 여과 수용액을 얻었다. 이를 동결건조하여 고형분 2.4g을 수득하였다.

실시예 3. 고상 발효처리 은이 버섯 추출물

세절한 건조 은이 버섯(Tremella fuciformis) 100 g에 물 2.0 kg을 넣은 후, 1차 멸균한 뒤, 누룩에서 분리한 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger)를 1.0×10⁸ 수준으로 처리하였다. 다음으로 30℃에서 60 내지 64시간 동안 발효한 후, 오토클레이브에서 2차 멸균하였다. 발효물 및 물 3.5 kg을 추출기에 넣고, 100℃에서 8시간 동안 추출한 뒤, 400 mesh 여과지로 1차 여과하고, 0.45 μm 필터로 2차 여과하여 2.8 kg의 여과 수용액을 얻었다. 이를 동결건조하여 고형분 3.3g을 수득하였다.

시험예 1. 성분 분석

당 성분 분석

실시예 1 내지 3의 추출물의 당 성분 분석을 위해 Bio LC(Dionex사, USA)를 이용하였으며 CarboPac PA10 (4 × 250 ㎜, Dionex) 컬럼을 사용하고 ED50 with integrated amperometry 검출기를 통해 분석하였다. 이동상은 16 mM NaOH를 사용하였으며 Flow rate는 1.0 mL/min 이였다.

하기 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 추출물은 주성분이 β-글루칸으로 구성되어 있으며, 그 이외에도 만노오즈 및 퓨코오즈도 함유된 것으로 확인되었다. 실시예 2 및 3의 경우, 퓨코오즈, 글루코오즈 및 만노오즈의 함량이 감소되었으며, 갈락토오즈, 글루코사민 및 갈락토사민의 함량이 증가된 것으로 나타났다.

성분	실시예 1(%)	실시예 2(%)	실시예 3(%)
퓨코오즈	2.98	2.18	1.91
글루코오즈	0.70	0.60	0.50
만노오즈	29.30	24.20	19.34
갈락토오즈	0	1.64	4.20
글루코사민	0.03	8.54	10.50
갈락토사민	0.00	6.41	15.30

분자량 분석

실시예 1의 추출물의 분자량을 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 추출물에는 약 50만Da의 분자량을 갖는 다당체로 주로 구성되어 있고, 이 이외에도 저분자 올리고당이 함유된 것이 확인되었다.

아미노산 분석

실시예 1의 추출물의 분자량을 측정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 추출물에는 아스파트산, 글루탐산, 세린, 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 트레오닌, 알라닌, 프롤린, 티로신, 발린, 메티오닌, 시스테인, 이소루신, 루신, N-루신, 페닐알라닌, 리신 등의 다양한 아미노산이 함유된 것으로 확인되었다.

시험예 2. 생리활성 평가

시험예 2.1 세포배양

HaCaT 세포를 60 mm dish에 분주하고 37℃의 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 UV-B를 20 mJ 조사하고 실시예 1 내지 3의 추출물을 각각 0, 125, 250 및 500 ppm으로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 및 배양액을 회수하여 아래의 방법들을 이용하여 생리활성을 평가하였다.

시험예 2.2 Western blot을 이용한 인볼루크린 ( Involucrin ) 단백질 발현분석

피부는 각질층, 투명층, 과립층, 유극증 및 기저층의 5개 층으로 구성된다. 인볼루크린은 표피의 과립층 및 유극증 상부에서 발현되는 용해성 세포질단백질 성분으로서, 각질형성세포 말기 분화 초기에 발현되는 피부분화의 중요한 바이오 마커이다.

HaCaT 세포에 UV-B를 조사한 후 실시예 1 내지 3의 추출물을 0, 125, 250, 500 ppm으로 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 회수하여 분리한 단백질로 전기영동을 실시하였다. 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 이송한 후, 항-인볼루크린을 1차 항체로 사용하고, HRP-conjugated anti-mouse antibody 및 HRP-conjugated anti-rabbit antibody를 2차 항체로 사용한 후 화학 발광 염색 방법으로 단백질 발현을 분석하였다.

시료 농도	실시예 1	실시예 2	실시예 3
0 ppm(UVB 처리X)	1.000	1.000	1.000
0 ppm(UVB 처리O)	0.718	0.718	0.718
125 ppm	0.937	0.975	1.081
250 ppm	1.052	1.112	1.254
500 ppm	1.156	1.184	1.514

표 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물은 자외선에 의해 저하된 인볼루크린의 활성을 향상시키는 것으로 나타났으며, 특히 500 ppm의 농도로 처리한 경우, 실시예 1의 추출물은 인볼루크린의 활성이 47% 이상 증가시켰으며, 실시예 3이 추출물은 110% 이상 증가시키는 것을 확인하였다.

시험예 2.3 Western blot을 이용한 필라그린 ( Filaggrin ) 단백질 발현분석

필라그린은 단백질과 결합하는 기질역할을 하는 히스티딘이 풍부한 단백질의 일종으로 표피의 수분함량 유지 및 분화에 중요한 역할을 하는 바이오마커이다.

1차 항체로 항-인볼루크린 대신에 항-필라그린을 사용하여 시험예 2.2의 방법으로 필라그린 단백질 발현을 분석하였다.

농도	실시예 1	실시예 2	실시예 3
0 ppm(UVB 처리X)	1.000	1.000	1.000
0 ppm(UVB 처리O)	0.641	0.641	0.641
125 ppm	1.689	1.983	2.241
250 ppm	2.062	2.141	2.678
500 ppm	2.359	2.574	2.988

표 3 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 자외선에 의해 필라그린의 활성이 저하되었으나, 실시예 1 내지 3의 추출물의 처리로 필라그린의 활성이 증가되었다. 500 ppm의 농도로 처리한 경우, 실시예 1의 추출물은 필라그린 활성이 3.6배 이상 증가하였으며, 실시예 3의 추출물은 필라그린 활성이 4.6배 이상 증가하였다.

상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 은이 버섯 추출물이 피부 각질층을 증가시켜, 외부 자극으로부터 피부를 보호하는 효과가 있음을 시사한다.

시험예 2.4 TNF -α, IL-6 및 MMP -1 mRNA 발현분석

RT-PCR을 이용한 인간 TNF-α, IL-6 및 MMP-1 mRNA 발현분석

UV-B를 20 mJ/cm²으로 조사 후 실시예 1 내지 3의 추출물을 0, 125, 250, 500 ppm으로 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 회수하고, 트리졸을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA와 RT PreMix를 이용하여 cDNA를 합성한 후, cDNA는 PCR PreMix와 TNF-α, IL-6 및 MMP-1 각각의 primer를 섞은 후 PCR을 실행하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하여 분석하였다.

RT-qPCR 을 이용한 인간 TNF-α, IL-6 및 MMP-1 mRNA 발현분석

UV-B를 20 mJ/cm²으로 조사 후 실시예 1 내지 3의 추출물을 0, 125, 250, 500 ppm으로 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 회수하고, 트리졸을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA와 RT PreMix를 이용하여 cDNA를 합성한 후, cDNA는 Real time PCR Master Mix와 TNF-α, IL-6 및 MMP-1 각각의 TaqMan probe를 섞은 후 qPCR을 실행하였다. 시험결과는 ΔCt값을 통해 결과를 분석하였다.

ELISA assay를 이용한 인간 TNF-α, IL-6 및 MMP-1의 합성량을 측정

UV-B를 20 mJ/cm²으로 조사 후 실시예 1 내지 3의 추출물을 0, 125, 250, 500 ppm 처리하여 24시간 배양한 후 세포 및 세포배양액을 회수하여 인간 TNF-α, 인간 IL-6 및 인간 MMP-1의 ELISA kit를 이용하여 TNF-α, IL-6 및 MMP-1의 합성량을 각각 측정하고 배양된 세포로부터 단백질량을 구하여 단백질량 대비 TNF-α, IL-6 및 MMP-1의 합성량을 측정하였다.

표 4는 TNF-α의 합성량, 표 5는 IL-6의 합성량, 표 6은 MMP-1의 합성량을 평가한 결과이다.

농도	실시예 1(%)	실시예 2(%)	실시예 3(%)
0 ppm(UVB 처리X)	100.00	100.00	100.00
0 ppm(UVB 처리O)	148.59	148.59	148.59
125 ppm	123.31	131.44	121.49
250 ppm	121.66	123.56	110.65
500 ppm	113.44	110.22	100.61

농도	실시예 1(%)	실시예 2(%)	실시예 3(%)
0 ppm(UVB 처리X)	100.00	100.00	100.00
0 ppm(UVB 처리O)	398.61	398.61	398.61
125 ppm	289.94	444.04	274.64
250 ppm	257.64	401.24	241.98
500 ppm	220.41	380.74	180.81

농도	실시예 1(%)	실시예 2(%)	실시예 3(%)
0 ppm(UVB 처리X)	100.00	100.00	100.00
0 ppm(UVB 처리O)	130.74	130.74	130.74
125 ppm	105.68	101.24	102.45
250 ppm	98.28	94.75	91.24
500 ppm	81.06	78.21	75.66

표 4 내지 표 6 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 자외선에 의해 유도된 염증 반응은 실시예 1 내지 3의 추출물에 의해 억제되었다. 실시예 1의 추출물을 500 ppm의 농도로 처리하는 경우에는 TNF-α의 발현양이 대조군(비처리)에 비하여 5배 가량을 억제되는 것으로 나타났으며, 실시예 3의 추출물을 500 ppm의 농도로 처리한 실험군에서는 염증 반응을 대부분 억제하는 것으로 나타났다. 상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 은이 버섯 추출물이 자외선에 의한 피부자극을 완화시키는 효과가 우수하다는 것을 입증한다.

시험예 2. 5 열에 의해 유발된 노화억제 효과 검증

열에 의해 손상된 피부조직의 개선 효과를 입증하기 위해서 42 ℃으로 처리된 피부섬유아세포에 실시예 1의 추출물을 0, 125, 250, 500 ppm 처리하여 열로 유발된 노화 피부섬유아세포의 콜라겐 분해 효소 발현 억제 효과를 확인하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 생체온도인 37 ℃에서는 MMP-1 농도가 70 ng/ml이하였으나, 42 ℃에서는 MMP-1 농도가 증가되었다. 한편, 실시예 1의 추출물 처리 농도에 따라 MMP-1 농도가 감소하였으며, 500 ppm의 농도로 처리하는 경우에는 약 20% 감소하였다.

시험예 2.6 콜라겐 합성량 측정

실시예 1 내지 3의 추출물을 0, 62.5, 125, 250 ppm 처리하여 24시간 배양한 후 세포 및 세포배양액을 회수하여 콜라겐 합성량을 측정하였다.

농도	실시예 1(%)	실시예 2(%)	실시예 3(%)
0 ppm	100	100	100
62.5 ppm	112	116	118
125 ppm	115	120	124
250 ppm	120	125	138

표 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 은이 버섯 다당체 처리 농도가 증가함에 따라, 콜라겐 합성량이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히, 은이 버섯을 아스퍼질러스 속 균주로 고상 발효 전처리를 수행하는 경우, 콜라겐 합성량을 더욱 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

시험예 2.6 LPS 로 유도된 염증반응 테스트

LPS로 염증반응을 유도시킨 뒤에, 실시예 1의 추출물을 0, 100, 300, 1000 ppm 처리하여 LPS로 유도된 염증 반응을 억제하는지 확인하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 염증반응을 완화시켰으며, 1000 ppm의 농도로 처리하는 경우에는 약 28%의 억제 효과가 나타났다.

시험예 2.7 홍반 감소 효과 검증

누드 쥐 모델을 두 집단으로 분리하고, 한 집단은 5% 실시예 1의 추출물로 처리하고, 다른 한 집단은 미처리하면서 피부조직에 7일 동안 자외선을 조사하여 홍반을 유발시켰다. 하기 도 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 추출물은 미처리 집단에 비하여 10% 이상 홍반이 감소되었다.

시험예 2.8 Primos 를 이용한 주름 개선 효과 검증

주름 개선 효과를 확인하기 위해, 5% 실시예 1의 추출물로 8주간 처리하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 8주차에 주름이 약 5.4% 감소한 것이 확인되었다.

시험예 2.9 탄력 개선 및 보습 개선효과 검증

5% 실시예 1의 추출물로 8주간 처리하여 탄력 개선 및 보습 개선효과를 검증하였다. 도 12a, 12b에 나타낸 바와 같이, 8주차에 탄력이 약 5.1% 증가하였으며, 보습도가 8.5% 상승한 것이 확인되었다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명에 따른 은이 버섯 추출물, 효소처리 은이버섯 추출물 및 고상발효 은이 버섯 추출물이 필라그린 및 인볼루크린 생성을 촉진하고, 콜라겐 생성을 증가시키며, MMP-1, 산화질소 및 TNF-α와 같은 염증생성 인자의 발현을 억제하여 피부의 재생, 보습, 진정, 탄력증가, 광노화 예방 및 열노화 예방에 효과적임을 입증하였다.

시험예 3. 피부자극 테스트

시험예 3.1 자극 테스트

피부자극을 테스트하기 위하여 다양한 연령대(20, 30, 40, 50 대)에 대해서 실시예 1 내지 3의 추출물을 각각 1%, 3%, 5%로 처리하여 피부자극을 확인하였다. 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 추출물은 모두 무자극 제품군에 속하는 것으로 나타났다.

시험예 3.2 알러지 테스트

피부자극을 테스트하기 위하여 다양한 연령대(20, 30, 40, 50, 60 대)에 대해서 3% 실시예 1 내지 3의 추출물로 처리하여 피부 누적첩포 실험을 실시하였다. 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 추출물은 모두 무알러지 제품군에 속하는 것으로 나타났다.

Claims

아스퍼질러스 니제르(Aspergillus niger)로 발효된 은이 버섯의 열수 추출물을 포함하는 인볼루크린 및 필라그린 생성 촉진용 조성물.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 열수 추출물은 열수 추출 후 펙티나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 베타클루카나제, 아라비나제 및 자일란나제 중에서 선택되는 1종 이상으로 1-4일간 효소 처리한 것인, 인볼루크린 및 필라그린 생성 촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 각질층 두께를 증가시키는 것을 특징으로 하는 인볼루크린 및 필라그린 생성 촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
조성물 고형분 100 중량%에 대하여 갈락토오스 3-7 중량%, 글루코사민 8-15 중량% 및 갈락토사민 10-20 중량%를 포함하는 것인 인볼루크린 및 필라그린 생성 촉진용 조성물.
제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부 광노화, 피부 열화, 피부염, 피부 탄력 저하, 주름, 홍반, 피부 보습저하 및 각질층이 얇아지는 증상 중에서 선택되는 1종 이상의 증상 개선용 화장료 조성물.
삭제
1) 멸균한 은이 버섯에 아스퍼질러스 니제르(Aspergillus niger)를 접종하고, 27-37℃에서 2-4일간 발효시키는 단계; 및
2) 상기 발효시킨 은이 버섯을 80 내지 110℃의 물에서 5 내지 24시간 동안 열수 추출하는 단계;를 포함하는 은이 버섯 추출물의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 2) 단계의 열수 추출물을 펙티나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 베타클루카나제, 아라비나제 및 자일란나제 중에서 선택되는 1종 이상의 효소로 1-4일간 처리하는 것을 더 포함하는, 은이 버섯 추출물의 제조방법.
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