KR102477052B1

KR102477052B1 - 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102477052B1
Application number: KR1020160158747A
Authority: KR
Inventors: 이지언; 주일우
Original assignee: (주)모아캠
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2022-12-14
Also published as: KR20180059317A

Abstract

본 발명의 항염 효과, 항알러지 효과, 피부 세포 보호효과, 광노화 억제효과, 보습효과, 피부 재생 효과, 피부 자극완화 및 피부면역력 증가 효과를 가지는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 선복화로부터 추출한 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 이의 제조방법{Skin external composition containing a proteinpolysaccharide or oligo collagen peptide derived from an inula flower and the method for preparing the same}

피부는 인체를 보호하는 1차적 기관이면서, 신체의 표면을 덮고 있는 가장 넓은 기관으로서, 표피, 진피 및 피하조직으로 구성된다. 이중, 표피의 가장 바깥층에 위치하는 각질층은 각질과 지질로 구성되어 있으며, 유해물질 침투나 수분증발을 억제하고, 박테리아나 외부 자극으로부터 인체를 보호한다. 또한 진피 윗부분에 많이 분포하는 섬유아세포는 탄력과 보호의 기능을 갖고 있는 섬유단백질인 콜라겐과 엘라스틴을 만들어 내는 역할을 하고 있다.

한편, 환경오염 및 다양한 외부 요인으로 피부손상, 면역력 등 피부재생 능력이 약해져, 각질층과 지질층이 손상되고 경피 수분 손실이 급격하게 증가하며, 피부건조, 주름생성, 가려움증, 세균감염에 따른 염증이 발생되기도 한다. 사람의 각질형성 세포나 표피 내의 대식세포인 랑게르한스 세포에서는 외부의 물질에 의해 다양한 사이토카인을 만들어 방출할 수 있는데, 이러한 사이토카인은 피부의 자극유발이나 국소적인 염증반응의 진행에 필수적이다(J. Appl. Toxicol., 1996, 16, 65-70). 실제로 자극성 접촉피부염에서 IL-6(Interleukin-6), IL-1(Interleukin-1), TNF-α(Tumornecrosis factor-α) 등이 증가된다고 보고된 바 있다(Contact Dermatitis, 1996, 35, 355-360). 또한 알러지 유발물질에 의해서도 IL-6(Interleukin-6)가 특이하게 증가되며, 특정 화학물질이 피부에 도포될 때도 IL-6, TNF-α가 유도된다는 것이 보고된 바 있다. TNF-α는 외부의 자극이나 감염원에 대해 염증세포 또는 면역세포에서 주로 분비되는 대표적인 사이토카인(cytokines)으로서, IL-1과 함께 감염, 염증, 자가면역, 알레르기성 질환의 매개에 중심적인 역할을 수행하는 염증 촉진 사이토카인(proinflammatory cytokine)이다. TNF-α에 의해 매개되는 피부에서의 만성 염증질환에는 건선, 습진 또는 지루성 피부염 등이 있으며, 급성 염증 질환으로는 접촉성 피부염 등이 포함된다. 피부재생 및 상처치유는 손상된 조직이 정상적으로 복구하기 위한 일련의 순차적인 과정 즉 염증기(inflammatory stage), 증식기(proliferation stage) 및 리모델링기(remodeling stage)로 이루어진다(Kokane DD, Evaluation of wound healing activity of root Mimosapudica, J Ethnopharmacol, 2009, 124(2),311-315).

여러 종류의 식물 및 허브가 상처치유, 피부재생을 증진시키기 위해 사용되고 있으며, 또한 더 나은 전통의학 치료 및 약용식물 탐색이 진행 중이나 (Lodhi S, Wound healing potential of Tephrosia purpurea(Linn.) Pers. in rats, J Ethnopharmacol, 2006, 108(2),204-210; Majumdar M, Evaluation of Tectona grandis leaves for wound healing activity, Pak J Pharm Sci, 2007, 20(2),120-124), 선복화에서 추출한 단백다당체 및 이를 효소처리하여 올리고화(저분자화)한 올리고당/펩타이드 복합체의 효능에 대해서는 구체적으로 알려진 바가 없다.

Lodhi S, Wound healing potential of Tephrosia purpurea(Linn.) Pers. in rats, J Ethnopharmacol, 2006, 108(2),204-210; Majumdar M, Evaluation of Tectona grandis leaves for wound healing activity, Pak J Pharm Sci, 2007, 20(2),120-124

본 발명은 우수한 항염 효과, 항알러지 효과, 피부세포 보호효과, 광노화 억제효과, 보습효과, 피부 재생 효과, 피부 자극완화 및 피부 면역력 증가 효과를 가지는 피부 외용제 또는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 선복화로부터 단백다당체를 추출하는 방법 및 상기 단백다당체를 효소 가수분해시켜 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 얻는 방법을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 선복화를 열수 추출하여 선복화 단백다당체를 얻는 방법 및 상기 선복화 단백다당체를 올리고화하여 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 얻는 방법을 제공한다.

본 발명은 우수한 항염 효과, 항알러지 효과, 피부세포 보호효과, 광노화 억제효과, 보습효과, 피부 재생 효과, 피부 자극완화 및 피부 면역력 증가 효과를 가지는 선복화의 단백다당체 및 올리고당/펩타이드 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제, 화장료 조성물을 제공한다.

도 1은 FT-IR을 이용한 선복화 단백다당체의 IR 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 2 및 3은 선복화 단백다당체 또는 올리고당/펩타이드 복합체가 TNF-알파 억제에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 비만세포 탈과립 억제에 선복화 다당체와 또는 올리고당/펩타이드 복합체가 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 섬유아세포 증식에 선복화 다당체와 또는 올리고당/펩타이드 복합체가 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 필라그린 유전자 발현에 선복화 다당체와 또는 올리고당/펩타이드 복합체가 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 TRAC 발현에 선복화 다당체와 또는 올리고당/펩타이드 복합체가 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 인간 β-디펜신-2(HBD-2) 발현에 선복화 다당체와 또는 올리고당/펩타이드 복합체가 미치는 영향을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에 있어서, 선복화는 국화과의 금불초(Inula britannica var. japonica(Thunb.) Franch. & Sav)의 꽃을 말린 약재를 말한다. 선복화는 뭉친 기를 순환시켜 풀어주어 가래나 기침, 딸꾹질, 트림, 천식, 만성기관지염, 급성늑막염, 가슴이 답답한 증상에 쓰며 입덧, 유암, 유옹 등에 사용되며, 약리작용으로 기관지의 항경련작용, 이뇨작용 등이 보고되어 있다.

본 발명에 있어서, 사용되는 선복화는 건조된 선복화이다.

본 발명은 유효성분으로서 선복화로부터 얻은 단백다당체 또는 올리고당/펩타이드 복합체를 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 선복화 단백다당체는 선복화의 추출물로부터 얻은 것이며, 구체적으로, 하기의 단계들을 포함하는 방법으로 얻은 것이다.

(a1) 선복화에 추출 용매를 가하여 추출물을 얻는 추출 단계,

(b1) 상기 추출물을 여과하여 농축액을 얻는 농축 단계,

(c1) 상기 농축액에 알코올성 용매를 첨가하여 선복화 단백다당체를 침전시키고, 이를 분리한 다음 용매를 건조하여 단백다당체를 얻는 단계.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (a1) 추출 단계에서 추출 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 글리세린, 부틸렌글리콜, 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 물이 사용되고, 보다 바람직하게는 열수가 사용된다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (a1) 단계에서의 추출은 상온 또는 고온에서 이루어지고, 바람직하게는 20 내지 100℃의 온도에서 이루어지며, 보다 바람직하게는 50 내지 85℃의 온도에서 이루어지는 열수 추출이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (b1) 농축 단계에서 여과는 여과체를 사용할 수 있다. 상기 여과체의 메시(mesh)는 단위가 200 내지 500, 바람직하게는 300 내지 400, 가장 바람직하게는 350일 수 있다.

본 명세서에 있어서 메시(mesh) 단위는 1인치 길이에 들어가는 여과 구멍의 개수를 의미한다.

대안적으로, 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (b1) 농축 단계에서 여과는 원심분리기를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (c1) 조성물 수득 단계의 용매는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 선복화 단백다당체의 분자량은 20 내지 10,000 Da이며, 바람직하게는 평균 분자량이 4,500~5,000 Da이며, 보다 바람직하게는 약 4,760 Da이다. 또한, 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 선복화 단백다당체의 단백질 함량은 75~80%이고, 당 함량은 10~15%이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 선복화 단백다당체에서 당 성분은 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 만노오스(mannose), 푸코오스(fucose), N-아세틸갈락토사민(N-Acetylgalactosamine), N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine), N-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic acid), 자일로오스(xylose), 람노오스(rhamnose), 아라비노오스(arabinose), 프록토오스(fructose)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 함유할 수 있다.

바람직하게, 상기 선복화 단백다당체의 주요 구성 당은 하기 화학식 1로 표시되는 글루코스일 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 선복화 단백다당체를 올리고화(저분자화)하여 얻는 것이며, 구체적으로, 하기의 단계들을 포함하는 방법으로 얻은 것이다.

(a2) 선복화에서 유래된 단백다당체에 효소를 첨가하여 선복화 단백다당체 분해물을 얻는 효소 분해 단계,

(b2) 상기 효소의 활성을 실활시킨 다음, 상기 선복화 단백다당체 분해물을 회수하는 단계,

(c2) 상기 (b2) 단계에서 회수한 선복화 단백다당체 분해물을 여과하여 여과액을 수집하는 단계, 및

(d2) 상기 여과액을 농축시키고 건조하여 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 얻는 단계.

상기 (a2) 효소 분해 단계에서, 첨가된 효소와 선복화 단백다당체의 효소 분해 반응을 통하여 선복화 단백다당체가 저분자로 분해된다.

효소 분해 반응이 완료되면 (b2) 단계의 효소 활성을 실활시키는 과정을 거치게 되며, 이 때 효소 활성 실활은 고온(예를 들어, 75~90℃) 처리함으로써 이루어질 수 있다.

효소 활성을 실활시킨 다음, 선복화 단백다당체의 분해물을 회수하고, 이어서 상기 분해물의 여과 공정을 진행한다.이때 여과는 여과체를 사용할 수 있다. 상기 여과체의 메시(mesh)는 단위가 50 내지 300, 바람직하게는 100 내지 150, 보다 바람직하게는 140일 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 (c2) 단계에서 상기 선복화 단백대당체 분해물의 여과는 연속식 원심분리기를 사용하여 침전물을 제거하는 공정을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 선복화 단백다당체에 효소를 이용하여 분해시킨 선복화 단백다당체의 가수분해물이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 효소는 β-글루코시다제(β-glucosidase), α,β-아라비노시다제(α,β-arabinosidase), α,β-라모시다제(α,β-rhamosidase), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase), 아미노펩티다제(Aminopeptidase), 프롤리나제(Prolinase), 프롤리데이스(Prolidase) 등의 펩티다제(Peptidase), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 키모트립신(Chymotrypsin; 프로테아제의 일종), 파파인(Papain; 펩티다제의 일종), 브로멜린(Bromelin; 프로테아제의 일종), 피신(Ficin; 프로테아제의 일종) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 펩티다제 또는 프로테아제일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한 이 외에도 알카라제(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 프로테아제 NP(Protease NP), 아라자임(Arazyme) 등의 다양한 분해 효소가 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 효소는 펩티다제(Peptidase), 프로테아제(Protease), 펙티나제(pectinase), 나린지나제(naringinase) 및 셀룰라제(cellulase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 복합 효소일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 분자량은 20 내지 4,000 Da이며, 바람직하게는 평균 분자량이 1,850~2,100 Da이며, 보다 바람직하게는 약 1,960 Da이다. 또한, 본 발명의 일 실시상태에 있어서, 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 단백질 함량은 55~65%이고, 당 함량은 5~12%이며, 하이드록시프롤린 함량은 0.1~0.5%이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 포함되는 상기 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 함량은 각각 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.001 내지 20 중량%이다. 0.001중량% 미만이면 효과적인 효능 전달이 미약하고, 20중량% 초과이면 화장료 제형 중에서 다른 원료와의 상용성 문제가 발생하기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 항염, 항알러지용이다. 구체적으로, 상기 피부 외용제 조성물은 비만세포의 탈과립 억제효과, 항염 자극에 의한 NO 억제 효과, LPC 자극에 의해 감소된 각질세포 및 섬유아세포의 증식률을 증가시킴으로써 피부를 재생하고, 피부의 상처를 치유할 수 있다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부세포 보호용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 보습용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 재생용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 자극완화 및 피부면역력 증가용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 광노화 억제용이다.

본 발명의 일 실시상태에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물이다. 상기 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형 (리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말 (foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 구체적으로 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 젤, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 수중유(O/W) 제형, 유중수(W/O) 제형, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.

또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 선복화를 열수 추출하여 선복화 단백다당체를 얻는 단계를 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법은 특별한 언급이 없는 한 전술한, 피부 외용제 조성물의 선복화 단백다당체에 관한 설명이 적용된다.

본 발명의 선복화 단백다당체를 올리고화하여 선복화 올리고 콜라겐펩타이드를 얻는 단계를 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법은 특별한 언급이 없는 한 전술한, 피부 외용제 조성물의 선복화 단백다당체에 관한 설명이 적용된다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기위해 실시예, 비교예, 시험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예로 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

[제조예 1] 선복화 단백다당체의 제조

건조된 선복화(입수처: 건화약품)에 3차 증류수를 가하고, 이를 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, 일본)를 이용하여 250~500 rpm, 60~80℃ 조건에서 3시간 동안 교반하면서 추출하였다. 추출한 후, 350mesh 여과후 원심 탈수기를 사용하여 잔사를 제거한 추출액을 얻고, 이 추출액을 추출액 부피의 1/10 내지 4/10로 농축하여 농축액을 얻었다. 이어서 이러한 농축액에 에탄올을 서서히 가하여 에탄올 침전반응을 진행하였다. 이때 에탄올의 첨가속도는 50~200ml/min이 바람직하고, 에탄올의 양은 농축액의 2~5배정도가 바람직하며, 분산기(T.K.Homodisper, Primix, Model 2.5)를 이용하여, 1,000 내지 1,500rpm, 25℃ 조건에서 분산시킨 후, 30분 내지 1시간 동안 정치하여 다당체를 침전시켰다. 에탄올 침전 반응이 완료되면 에탄올을 제거하고 세척공정을 거쳐 얻어진 선복화 단백다당체를 40 내지 50℃에서 진공 건조하여, 파우더 형태의 선복화 다당체를 수율 약 4%로 얻었다. 이와 같이 수득된 선복화 단백다당체를 “시료 1”이라 한다.

[제조예 2] 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 제조

상기 제조예 1의 과정을 거쳐 제조한 시료 1에 3차 증류수에 가하여 녹인 후 가수분해 효소를 상기 선복화 다당체 분말과 1:0.6의 비율(w/w)로 첨가하였다. 이때, 상기 가수분해 효소는 프로테아제와 아미노펩티다제를 1:1의 중량 비율로 혼합하여 사용하였으며, 효소를 첨가하고 55℃, 180rpm에서 6시간 교반하여 가수분해를 실시하였다. 가수분해가 완료되면 80℃에서 2시간 실활하여 반응을 종료시킨 후 140 메쉬의 여과체를 이용하여 여과한 다음, 여액을 모아 10,000rpm에서 15분 동안 원심분리를 하였다. 그 후 상등액을 1.2μm, 0.45μm의 여과 필터를 차례로 이용하여 여과하고 난 뒤, 농축시킨 다음 동결건조하여 선복화 단백다당체의 가수분해물인 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 수득하였다. 이와 같이 수득된 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 수율 97%로 얻었다(이 수율은 선복화 다당체 분말과 증류수 혼합된 액에 대한 것이다). “시료 2”라 한다.

[제조예 3] 선복화 에탄올 추출물의 제조

선복화를 70% 에탄올(선복화 무게의 15배)을 첨가한 후 약 70~80℃ 환류 장치 하에서 2~3시간 동안 끓이면서 추출하였다. 추출완료 후 선복화를 제거한 추출액을 회전식 감압농축기로 농축하고 동결건조하여 고체 상태의 선복화 에탄올 추출물을 제조하였다. 이와 같이 수득된 선복화 에탄올 추출물을 “시료 3”이라 한다.

[참고예 1] 선복화 단백다당체의 성분분석

상기 제조예 1에 의하여 제조된 시료 1의 단백질 함량, 당 함량, 구성당측정, 분자량 측정, FT-IR을 이용하여 하기와 같이 선복화 단백다당체의 성분을 분석하였다.

1) 단백질 함량 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

선복화 단백다당체의 총 단백질 함량을 측정하기 위해 BCA Assay법을 수행하였다.

BCA Assay는 단백질이 구리 이온(Cu² ⁺, Cu¹ ⁺)을 환원(Reduction)시킬 수 있는 성질을 이용한 것으로 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서 보라빛의 화합물(Cu⁺/BCA chromophore)을 생성하게 되는데, 이 보랏빛 화합물은 특정 파장 562 nm에서 최대 흡광도를 보인다. 따라서, 단백질의 양이 많을수록 보랏빛 화합물(Cu⁺/BCA chromophore)이 더 많이 생기며 562nm에서의 흡광도가 증가함을 이용, 단백질의 양을 측정한다. 실험방법은 하기와 같다.

우선 micro BCA protein assay reagent kit(Pierce, cat. no. 23227)를 이용하여, 96 마이크로플레이트 웰에 각각 150 μl 씩 표준액, 희석된 시료를 넣은 후 bicinchoninic acid(BCA) kit WR(Working Reagent) 시약을 첨가하여 30초간 볼텍싱(voltexing)하였다. 그 후 37℃에서, 2시간 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성하고 단백질 정량을 하였다. 결과는 하기 표 1과 같다.

시료	단백질 함량(%)
선복화 단백다당체 (시료 1)	76.64

상기 표 1과 같이 시료1의 단백질 함량은 76.64%로 확인되었다.

2) 당 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다.

선복화 단백다당체의 총 당 함량을 측정하기 위해 페놀-설페이트법을 수행하였다. 페놀-설페이트법은 환원당을 진한 황산으로 처리하면 탈수되어 푸르푸랄 또는 그 유도체가 형성되는데 이 유도체의 흡광도를 490nm에서 측정하여 정량하는 방법으로 실험방법은 하기와 같다.

우선 시료 0.5 ml에 5% 페놀을 0.5 ml 가한 후 황산 2.5 ml를 강하게 넣는다. 그 후 볼텍스 믹서를 사용하여, 30초간 볼텍싱한 후 25℃에서 20분간 방치하고 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정한 다음, 검량선을 작성하고 총 당량 정량을 하였다. 검량 표준선은 글루코스 표준품(Sigma, USA)을 사용하였고, 결과는 하기 표 2와 같다.

시료	당 함량(%)
선복화 단백다당체 (시료 1)	12.27

상기 결과와 같이 시료1의 당 함량은 12.27%로 확인되었다.

3) 구성당 및 그 함량 측정

상기 제조예 1에 의하여 제조된 선복화 단백다당체를 구성하는 당의 종류를 알아보기 위하여, 2.5mg의 선복화 단백다당체(제조예 1)를 1ml의 3차 증류수에 용해한 후 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)을 이용하여 가수분해시켰다. 그 후 CarboPacTM PA1 컬럼과 Bio LC(HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 이용하여 18mM NaOH 단일용매 기울기로 분석하였으며, 유속은 1 ml/min로 표준물질 1 mM 혼합물(푸코오스, 람노오스, 아라비노오스, 갈락토스, 글루코스, 프록토오스)을 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 선복화 단백다당체를 구성하는 당의 종류를 확인한 후 그 결과를 표 3에 나타내었다.

선복화 단백다당체(제조예 1)
번호	당 종류	함량(mg/시료 1mg)
1	자일로오스	0.00123
2	람노오스	0.00305
3	아라비노오스	0.00755
4	갈락토스	0.01537
5	글루코스	0.03510
6	만노오스	0.00737

4) 분자량 측정은 하기와 같이 분석하였다.

본 발명의 선복화 단백다당체(시료 1)의 분자량을 확인하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피를 수행하였다. PL aquagel OH-60, Mixed-M(7.5 x 300 mm, VARIAN, USA) 컬럼과 고압액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200, 1260 Series HPLC/GPC, Agilent, USA), RID 검출기(Agilent Technologies 1260 Series, RID, Agilent, USA)를 이용하여, 이동상 탈이온수(DeIonized Water), 컬럼 온도 35℃, 분당 1.0 ㎖ 유속, 검출기 온도 35℃ 의 조건으로 검출하였으며, 표준물질로 각 분자량별 PEG(Poly Ethylene Glycol)를 사용하여 시료의 컬럼 내 지연시간에 따른 분자량의 검량선을 작성하고, 시료 1의 분자량 분포를 확인하였다.

그 결과, 선복화 단백다당체의 분자량 범위는 20에서 10,000 Da로 다양하게 분포되어 있음이 밝혀졌으며, 선복화 단백다당체 내에서의 분자량 분포는 80% 내지 90%의 분자량 범위는 417~9109 Da이고, 10% 내지 20%의 분자량 범위는 22~173 Da으로 포함되어 있었다. 분자량 분포에 의한 평균 분자량은 하기 표 4와 같이 약 4,760 Da인 것으로 밝혀졌다.

	검량곡선식	R² Value	Mw(Da)
선복화 단백다당체 (시료 1)	y=-0.5081x + 12.692	0.992	4,760

5) FT-IR을 이용한 선복화 단백다당체의 IR 분석

본 발명의 선복화 단백다당체의 분자 구조 분석을 위해, 분광학적 분석법인 FT-IR분석(적외선 분광법)을 이용하여 하기와 같이 실험하였다. 제조예 1에서 얻어진 선복화 다당체 시료 0.001g을 KBr(Potassium bromide, FT-IR grade, Sigma) 0.5g과 함께 막자사발로 고르게 분쇄하였다. 그 후 소량을 펠렛 주형에 넣고 유압기를 사용하여 펠렛으로 만들었다. FT-IR(IR 100/200, ThermoFisher Scientific, 영국)을 이용하여 적외선 스펙트럼을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 3,300~3,400 cm^-1에서 당고리의 전형적인 O-H의 신축(stretching) 진동, 2,900 cm^-1 부근에서 C-H 신축진동을 확인할 수 있었다. 1,000~1,100 cm^-1에서는 C-H와 C-O 변각운동이 일어나는 것, 850~800 cm^-1 부근의 피크는 글루코오스(Glucose), 갈락토오스(Galactose) 등의 C-O-C 결합을 확인할 수 있었다.

[참고예 2] 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 성분분석

상기 제조예 2에 의하여 제조된 시료 2의 단백질 함량, 콜라겐 펩타이드 함량, 분자량, 아미노산 함량 측정을 하기와 같이 실험하여 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 성분을 분석하였다.

1) 단백질 함량 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 총 단백질 함량을 측정하기 위해 BCA Assay법을 수행하였다.

방법은 상기 참고예 1의 1)에 기재된 바와 동일하며, 결과는 하기 표 5과 같다.

시료	단백질 함량(%)
선복화 올리고당/펩타이드 복합체(시료 2)	59.80

상기 표 5과 같이 시료2의 단백질 함량은 59.80%로 확인되었다.

2) 당 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다.

선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 총 당 함량을 측정하기 위해 페놀-설페이트법을 수행하였다.

방법은 상기 참고예 1의 2)에 기재된 바와 동일하며, 결과는 하기 표 6과 같다.

시료	당 함량(%)
선복화 올리고당/펩타이드 복합체(시료 2)	9.74

상기 결과와 같이 시료 2의 당 함량은 9.74%로 확인되었다.

3) 구성당 및 그 함량 측정

상기 제조예 2에 의하여 제조된 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 구성하는 당의 종류를 알아보기 위하여, 상기 참고예 1의 3)에 기재된 바와 동일한 방법으로 선복화 올리고당/펩타이드 복합체(시료 2)를 구성하는 당의 종류를 확인한 후 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

선복화 올리고당/펩타이드 복합체(제조예 2)
번호	당 종류	함량(mg/시료 1mg)
1	자일로오스	0.00143
2	람노오스	0.00315
3	아라비노오스	0.00775
4	갈락토스	0.01527
5	글루코스	0.03520
6	만노오스	0.00837

4) 분자량 측정은 하기와 같이 분석하였다.

본 발명의 선복화 올리고당/펩타이드 복합체(시료 2)의 분자량을 확인하기 위하여, 상기 참고예 1의 4)에 기재된 바와 동일한 방법으로 겔 투과 크로마토그래피를 수행하였다.

그 결과, 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 분자량 범위는 20에서 4,000 Da로 다양하게 분포되어 있음이 밝혀졌으며, 선복화 올리고당/펩타이드 복합체내에서의 분자량 분포는 80% 내지 90%의 분자량 범위는 579~3762 Da이고, 10% 내지 20%의 분자량 범위는 25~210 Da으로 포함되어 있었다. 분자량 분포에 의한 평균 분자량은 하기 표 8와 같이 약 1,960 Da인 것으로 밝혀졌다.

	검량곡선식	R² Value	Mw(Da)
선복화 올리고당/펩타이드 복합체(시료2)	y=-0.5081x + 12.692	0.992	1,960

5) 하이드록시프롤린 분석 및 콜라겐 펩타이드 함량 측정은 하기와 같이 분석하였다.

본 발명의 선복화 올리고당/펩타이드 복합체(시료 2)의 콜라겐 펩타이드 함량을 확인하기 위하여 고압액체크로마토그래피를 수행하였다. 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 1% 용액을 6N HCl로 10배 희석하여 121℃에서 24시간 동안 Heating block(DMB1, Misung science, Korea)으로 가수분해하였으며, Eclipse XDB-C18(4.6 x 150 mm, Agilent, USA) 컬럼과 고압액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA), FLD 검출기(FLD, Agilent, USA)를 이용하여, Agilent사의 아미노산 분석법 조건(Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC analysis of amino acids, John W.Henderson 외 3인)으로 분석하였고, 표준물질로 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린(H54409-2, Sigma, USA)을 사용하여 하이드록시프롤린 함량의 검량선을 작성, 본 발명의 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 내 하이드록시프롤린 함량을 확인하였다.

그 결과, 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 1% 용액의 10배 희석 용액 내 하이드록시프롤린 함량은 3.02 ㎍/㎖을 나타내었으며, 이를 콜라겐 함량으로 환산하면, 하기 표 89와 같이 22.4 ㎍/㎖이다. 이는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체(시료 2)가 콜라겐을 약 0.224% 함유함을 의미한다.

	검량곡선식	R² Value	Hydroxyproline (㎍/㎖)	콜라겐 (㎍/㎖)
선복화 올리고당/펩타이드 복합체 1% 함유 용액	y=0.8705x + 31.783	0.999	3.02	22.4 (콜라겐 함량=100/13.5 x 하이드록시프롤린 함량)

6) 아미노산 함량 측정은 하기와 같이 분석하였다.

본 발명의 올리고당/펩타이드 복합체(시료 2)의 아미노산 성분 및 함량을 확인하기 위하여 고압액체크로마토그래피를 수행하였다. 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 1% 용액을 6N HCl로 10배 희석하여 121℃에서 24시간 동안 Heating block(DMB1, Misung science, Korea)으로 가수분해 하였으며, Eclipse XDB-C18(4.6 x 150 mm, Agilent, USA) 컬럼과 고압액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA), FLD 검출기(FLD, Agilent, USA)를 이용하여, Agilent사의 아미노산 분석법 조건(Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC analysis of amino acids, John W.Henderson 외 3인)으로 분석하였으며, 표준물질로 Agilent Amino acid standard 17종을 사용하여 각각 아미노산의 검량선을 작성하여 본 발명의 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 내 아미노산 성분 및 각 아미노산의 함량을 확인하였다. 그 결과, 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 1% 용액 내 아미노산 성분 및 총합은 하기 표 10과 같다.

명칭	선복화 올리고당/펩타이드 복합체 1% 함유 용액(μg/ml)	선복화 올리고당/펩타이드 복합체(%)
Asp	-	-
Glu	2.66	0.0266
Ser	0.36	0.0036
His	0.19	0.0019
Gly	10.74	0.1074
Thr	0.26	0.0026
Arg	9.45	0.0945
Ala	-	-
Tyr	0.29	0.0029
Cys	-	-
Val	3.29	0.0329
Met	-	-
Phe	0.98	0.0098
Ile	1.30	0.0130
Leu	2.72	0.0272
Lys	-	-
Pro	-	-
총합	32.24	0.3224

[시험예 1] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 항염 활성 측정

본 발명에 따른 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 농도별 항염증 효과를 확인하기 위하여 그람음성균의 내독소인 LPS를 처리하여 염증을 유발하고 LPS 처리 후 발생되는 염증매개물질인 TNF-알파의 양이 평가물질에 의해 감소되는 정도를 평가하였다. 구체적인 방법은 아래와 같다.

Raw 264.7 세포(한국세포주은행(KCLB)， 한국)을 5×10⁵ cell/well의 농도로 96 웰 플레이트에 접종하고 배양하였다. 24시간 이후 시료를 처리하고，6시간 후에 LPS를 처리하여 24시간 후에 세포를 배양한 배지를 well당 50 μL씩 취해 마우스 TNF-알파 ELISA kit(R&D Systems)를 이용하여 분석하였고, 분석 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.

본 실험 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 선복화 다당체와 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 시료의 TNF-알파가 감소함을 확인하였다.

또한 도 3과 같이 TNF-알파 억제능 측정 결과 선복화 에탄올 추출물을 단독으로 사용하는 경우보다, 선복화 다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 선복화 에탄올 추출물과 혼합하여 사용하게 되면 더 좋은 항염 효능을 나타낸다는 것을 확인하였다.

[시험예 2] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 항알러지 활성 측정

RBL-2H3 세포는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 2.5×10⁵ cell/well의 농도로 96 웰 플레이트에 접종하고 배양하였다. 접종 시 DNP-IgE 항체 10ng/ml을 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 반응 후 배지를 제거하고 PBS로 3회 세정한 후 타이로드 완충액(Tyrode's buffer; 10mM Hepes, 130mM NaCl, 5mM KCl, 1.4mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 5.6mM 글루코스, 및 0.1% BSA, pH 7.4)에 선복화 추출물을 각각 넣고 30분간 반응시킨 후 0.2μg/ml DNP-BSA를 첨가한 후 20분간 배양기에서 반응시키고, 반응의 정지를 위해서 얼음 위에 10분간 플레이트를 올려놓은 후, 상등액을 회수하여 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출을 저해하는지 여부를 측정하였다. 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출은 상등액 50μl와 시트르산염 완충액(0.1M 시트르산염, pH 4.5)에 1.3 mg/ml의 p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드를 포함하는 기질용액(substrate solution) 동일 양 (50μl)을 37℃ 배양기에서 60분 동안 반응시킨 후, 0.2M 글리신(pH 10.7) 100μl를 이용하여 반응을 중단시킨 다음, 405nm에서 측정하였다. 비만세포 탈과립 방출양은 대조군 대비 %로 나타내었다.

포르볼 12'-미리스테이트 13'-아세테이트(PMA)로 유도하여 실험한 결과를 도 4에 나타내었으며 IgE 자극원을 처리한 경우는 도 5에 나타내었다.

본 실험 결과 도 4 와 도 5 에 나타낸 바와 같이 선복화 다당체와 올리고 시료에서 비만세포 탈과립 억제 효과를 확인하였다.

[시험예 3] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 피부재생 효과 측정

본 발명의 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 피부재생 효과 측정하기 위하여 WST-1 Proliferation assay system에 의한 세포 증식활성에 대한 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

선복화 단백다당체와 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 시료를 DMEM 용매에 녹여 최종농도 5μg/㎖, 10μg/㎖, 20μg/㎖를 사용하였다. HDF-a(ATCC)를 각각 10% FBS, 100ug/ml 페니실린을 포함한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 5 X 10³ cells/well 농도의 HDF-a를 96 웰 플레이트에 접종하여 24 시간 동안 안정화시킨 후, 선복화 단백다당체와 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 시료를 농도별 처리하여 24 시간 동안 배양한 후에, 세포에 Premix-WST 용액(Takara Bio Inc., Otsu Shiga, Japan)을 처리하여 440nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 도 6에 나타내었다.

본 실험 결과, 도 6 에 나타낸 바와 같이, 선복화 단백다당체와 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 시료를 섬유아세포에 처리시, 무처리군에 비하여 향상된 증식 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

[시험예 4] 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 보습 활성 측정

IL-4 처리에 의한 필라그린 발현 변화에 따른 선복화 단백다당체와 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 보습효과를 확인하기 위하여 각질형성세포에 시료를 전처리 한 후 IL-4를 50 ng/ml 농도로 처리 하여 유전자 레벨에서의 필라그린의 발현양 변화를 확인하였다.

평가를 위하여 무처리 대조군, IL-4 자극원을 처리한 대조군을 함께 사용하며 반응이 종결된 후, 상등액을 수집하고 세포를 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 세척하고, RNA mini kit(Applid Biosystems)를 이용하여 RNA를 추출하였으며, 튜브에 모은 후 High Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applid Biosystems) 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 그 후 시험 세포 및 대조군 세포를 RT-PCR하여 필라그린 유전자 발현 수준을 분석하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

본 실험 결과 도 7 에 나타낸 바와 같이 IL-4 자극원을 처리하였을 때 필라그린 발현양이 줄어들지만, 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 처리하게 되면, 필라그린 발현양이 상당히 증가한다는 것을 확인하였다.

[시험예 5] 본 발명에 따른 피부 외용제의 피부자극 완화 효능 측정(TARC(thymus and activation-regulated chemokine) 저해 효과)

인간 각질형성세포(human keratinocyte, HaCaT) 세포주에 키우기 위해 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 배지를 이용하였다. 각질형성세포는 37℃, 5％ CO₂ 배양기에서 키웠다. 24-웰 플레이트에 세포의 농도가 4.5×10⁴ cells/well이 되도록 각 웰에 접종한 다음, 시험물질(대조군포함)을 일정시간 처치한 후 자극원(stimulator)(INF-γ + TNF-α)를 처치하여 37℃에서 24 시간 배양하였다. 원심분리한 후 상층액을 취하고, TARC(Thymus and activation regulated chemokine)의 생성을 ELISA Kit(R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 측정 결과는 도 8에 나타내었다.

본 실험 결과 도 8 에 나타낸 바와 같이 자극원을 처리하였을 때 TARC가 유도되며 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 처리 시 TRAC 발현양이 감소함을 확인하였다.

[시험예 6] 피부면역 강화 효능(β-디펜신 분비 촉진 확인 시험)

인간 각질형성세포(human keratinocyte, HaCaT)를 키우기 위해 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 배지를 이용하였다. 6-웰 플레이트에 세포의 농도가 2×10⁵ cells/well이 되도록 각 웰에 접종한 후 48시간 동안 배양하고, 1.7mM 칼슘 클로라이드(calcium chloride)와 상기 제조예 1~3을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.

평가를 위하여 무처리 대조군과 함께 사용하며 반응이 종결된 후, 상등액을 수집하고 세포를 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 세척하고, 트립신-EDTA 용액을 이용하여 세포를 회수한 다음, 튜브에 모은 후 High Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applid Biosystems) 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 그 후 시험 세포 및 대조군 세포를 RT-PCR하여 HBD-2 mRNA 발현 수준을 분석하였으며, 그 결과를 도 9 에 나타내었다.

도 9 에 나타낸 바와 같이 피부 면역물질인 인간 β-디펜신-2(HBD-2) 발현량을 정량한 결과 선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 처리하였을 때 피부 면역 물질의 발현이 무처리군에 비해 증가하였다.

이하, 본 발명에 따른 조성물의 제형예를 설명하나, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예1] 유연화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	선복화 단백다당체 및 선복화 올리고당/펩타이드 복합체 중 1종 이상	1.00
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

[제형예2] 수렴화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체	1.50
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

[제형예3] 영양화장수

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체	0.05
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

[제형예4] 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체	1.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

[제형예5] 팩

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	선복화 단백다당체 또는 선복화 올리고당/펩타이드 복합체선복화 다당체 및/또는 선복화 올리고	0.05
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

Claims

선복화 단백다당체 또는 선복화 단백다당체의 효소 분해 산물인 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서,
상기 선복화 단백다당체는 선복화를 50~85℃의 온도에서 열수 추출하여 수득한 것이며,
상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 상기 선복화 단백다당체를 단백질 가수분해효소로 가수분해시켜 수득한 것이고,
상기 단백질 가수분해효소는 아미노펩티다제(Aminopeptidase), 프롤리나제(Prolinase), 프롤리데이스(Prolidase), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 키모트립신(Chymotrypsin), 파파인(Papain), 브로멜린(Bromelin), 피신(Ficin), 알카라제(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 프로테아제 NP(Protease NP) 및 아라자임(Arazyme)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상이며,
상기 선복화 단백다당체 및 상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 각각 자일로오스, 람노오스, 아라비노오스, 갈락토스, 글루코스 및 만노오스를 포함하고,
상기 선복화 단백다당체는 평균 분자량이 4,500~5,000Da이며, 단백질 함량이 75~80%이고, 당 함량이 10~15%이며,
상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 평균 분자량이 1,850~2,100Da이고, 단백질 함량이 55~65%이며, 당 함량이 5~12%이고, 하이드록시프롤린 함량이 0.1~0.5%인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 선복화 단백다당체의 함량은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여, 0.01 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 함량은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여, 0.01 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 선복화를 70~80℃의 온도에서 알코올 수용액으로 추출하여 수득한 선복화 추출물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 알코올 수용액은 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 항염 또는 항알러지용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 세포 보호용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 광노화 억제용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 보습용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 재생용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 자극 완화용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 면역 강화용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 선복화 단백다당체는 선복화에 추출 용매인 물을 가하여 50~85℃의 온도에서 열수 추출하여 얻은 추출물을 300~400 메쉬(mesh)의 여과체로 여과하여 얻은 농축액에 에탄올을 첨가하여 선복화 단백다당체를 침전시킨 후, 40~50℃의 온도에서 진공 건조하여 수득한 것임을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 상기 선복화 단백다당체에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 50℃의 온도에서 가수분해시켜 얻은 가수분해산물을 75~90℃의 온도로 처리하여 상기 단백질 가수분해효소의 활성을 실활시킨 후, 100~150 메시(mesh)의 여과체로 여과하여 수집한 1차 여과액을 원심분리하여 얻은 상등액을 1.2μm 여과필터 및 0.45μm 여과필터로 순차적으로 여과하여 얻은 2차 여과액을 농축시키고 동결건조하여 수득한 것임을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
선복화 단백다당체, 및 선복화 단백다당체의 효소 분해 산물인 선복화 올리고당/펩타이드 복합체의 제조방법으로서,
(a) 선복화에 추출 용매인 물을 가한 후 50~85℃의 온도에서 열수 추출하여 추출물을 얻는 추출 단계;
(b) 상기 추출물을 300~400 메시(mesh) 여과체로 여과하여 농축액을 얻는 농축 단계;
(c) 상기 농축액에 에탄올을 첨가하여 선복화 단백다당체를 침전시킨 후, 40~50℃의 온도에서 진공 건조하여 파우더 형태의 선복화 단백다당체를 얻는 단계;
(d) 상기 파우더 형태의 선복화 단백다당체에 증류수를 첨가하여 용해시킨 후 단백질 가수분해효소를 첨가하여 50℃의 온도에서 가수분해시켜 선복화 단백다당체의 가수분해산물을 얻는 효소 분해 단계;
(e) 상기 단백질 가수분해효소의 활성을 75~90℃의 온도에서 실활시킨 다음, 상기 선복화 단백다당체의 가수분해산물을 회수하는 단계;
(f) 상기 (e) 단계에서 회수한 선복화 단백다당체의 가수분해산물을 100~150 메시(mesh) 여과체로 여과하여 1차 여과액을 수집하는 단계;
(g) 상기 1차 여과액을 원심분리하여 얻은 상등액을 1.2μm 여과필터 및 0.45μm 여과필터로 순차적으로 여과하여 2차 여과액을 수집하는 단계; 및
(h) 상기 2차 여과액을 농축시키고 동결건조하여 선복화 올리고당/펩타이드 복합체를 얻는 단계;를 포함하며,
상기 단백질 가수분해효소는 아미노펩티다제(Aminopeptidase), 프롤리나제(Prolinase), 프롤리데이스(Prolidase), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 키모트립신(Chymotrypsin), 파파인(Papain), 브로멜린(Bromelin), 피신(Ficin), 알카라제(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 프로테아제 NP(Protease NP) 및 아라자임(Arazyme)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상이고,
상기 선복화 단백다당체 및 상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 각각 자일로오스, 람노오스, 아라비노오스, 갈락토스, 글루코스 및 만노오스를 포함하며,
상기 선복화 단백다당체는 평균 분자량이 4,500~5,000Da이고, 단백질 함량이 75~80%이며, 당 함량이 10~15%이고,
상기 선복화 올리고당/펩타이드 복합체는 평균 분자량이 1,850~2,100Da이고, 단백질 함량이 55~65%이며, 당 함량이 5~12%이고, 하이드록시프롤린 함량이 0.1~0.5%인, 제조방법.