KR102055909B1 - 락토바실러스 에시도필러스 fnc1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 에시도필러스 fnc1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주는 저온에서의 생육, 저장성이 좋고, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대한 항균능이 있어, 돼지 살모넬라 감염증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물로 용이하게 이용가능하다.

Description

락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물{Lactobacillus acidophilus FNC1 or Composition for preventing or treating porcine salmonellosis comprising the same}
본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 활성을 나타내는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 저온 저항성을 가지는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 유효성분으로 포함하여 사계절 내내 이용가능한 사료용 첨가제에 관한 것이다.
Salmonella속 균은 Salmon과 Smith(1886)에 의해 Hog Cholera에 감염된 돼지로부터 Salmonella cholerasuis를 처음 보고한 이래 전세계적으로 분포되어 있으며, 사람을 포함한 포유동물에 감염되어 패혈증, 설사, 폐렴 등을 야기시키는 인수공통전염병의 병원체이다. Salmonella속 균의 전파는 식육, 오염된 환경을 통하여 건강한 동물과 사람에게 감염되고 있으며, 항생제 오용과 남용에 따른 내성균(Salmonella typhimurium DT104, ACSSuT)의 출현이 증가되어 가축질병의 치료 예방과 사람의 공중보건상 중요시 되고 있다.
살모넬라균은 사람, 동물에 감염되며 또한 환경에도 흔히 존재할 수 있는 병원균으로서 식중독에 관련되는 주요 혈청형은 Salmonella typhimurium 및 Salmonella enteritidis 등이다. 유럽 및 미국 등에서 1984년 이후 살모넬라에 의한 식중독의 발생빈도가 증가하기 시작하였고, 1988년 이후로 전세계적으로 Salmonella enteritidis에 의한 식중독의 폭발적인 발생으로 살모넬라 식중독에 대한 관심이 크게 고조되어 왔다.
Salmonella typhimurium 감염 돼지의 전형적인 임상증상은 감염 후 2일 동안 체온증가, 장염 및 설사가 수반된다. 모든 연령의 돼지가 Salmonella typhimurium에 취약하나, 이유기 및 성장 마무리 단계에 있는 새끼돼지는 가장 일반적으로 영향을 받고 심한 임상 증상을 나타낸다. 질병에서 회복된 후 돼지들은 흔히 발육이 멈추거나 느려져 돼지 농부들에게 상당한 경제적 손실을 주게 된다. 또한, 감염되었지만 박테리아가 분명히 건강한 돼지에 남아 어떤 임상증상도 없이 유지될 수도 있다. 이러한 동물들은 쉽게 감지할 수 없어서 오염의 근원이 된다. 따라서 돼지 살모넬라 감염은 양돈 산업에 중요한 손상을 주고 그 효율성에 부정적 영향을 미쳐서 돼지생산 시스템에 경제적 손실을 야기한다.
이에 본 발명자들은 인위적인 발효제가 첨가되지 않은 숙성된 동치미로부터 새로운 균주인 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 분리 및 동정하였으며, 살모넬라 균주에 대해 항균 활성 효과 및 돼지 장 상피세포 부착능력이 뛰어나 돼지 살모넬라 감염증에 예방 또는 치료 효과를 나타내어 치료용 조성물로 사용될 수 있다. 또한 상기 균주는 저온 저항성 효과를 가져 사계절 내내 사료용 첨가제로 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
한국등록특허 제10-1873682호 (발명의 명칭 : 면역 증강 효과를 갖는 신규한 락토바실러스 에시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) KNU-02 균주 및 이의 용도, 출원인 : 경북대학교 산학렵력단, 등록일자 : 2018.06.26.) 한국등록특허 제10-0240687호 (발명의 명칭 : 락토바실러스 애시도필러스 KY 2104 및 그 용도, 출원인 : 주식회사한국야쿠르트, 이은선, 등록일자 : 1999.10.28.)
본 발명의 목적은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다. 보다 자세하게는 본 발명의 목적은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 항균 활성을 나타내는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 저온 저항성을 가지는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 유효성분으로 포함하며 사계절 내내 이용가능한 사료용 첨가제를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주에 관한 것이다. 상기 균주는 2018년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC18722P).
상기 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 생육을 억제하는 것일 수 있다.
상기 균주는 서열번호 1 및 2 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함할 수 있다.
상기 균주는 5 내지 20℃에서 저온 저항성을 나타내는 것일 수 있다.
상기 균주는 돼지 장 상피세포에 대해 부착능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것일 수 있다.
상기 배양액은 MRS 배지; 또는, 배지 최종부피 1L 기준 효모추출물(yeast extract) 1 내지 2g, 펩톤(peptone) 0.5 내지 1g, KH2PO4 0.1 내지 0.3g, K2HPO4 0.1 내지 0.3g, NaCl 0.1 내지 1g, 포도당(glucose) 4 내지 6g, 아세트산 나트륨(sodium acetate) 0.1 내지 1g 및 폴리소르베이트 0.05 내지 0.2g을 포함하는 배지;에서 배양된 것일 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료용 첨가제에 관한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 동결건조제제에 관한 것일 수 있다.
상기 동결건조제제는 탈지유(skim milk) 11.3 내지 13 중량%, 락토오스(lactose) 1 내지 2 중량%, 녹말(starch) 1 내지 2 중량% 및 CMC(Carboxymethyl Cellulose) 0.1 내지 1 중량%를 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주는 인위적인 발효제가 첨가되지 않은 숙성된 동치미로부터 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주는 5 내지 37℃에서 배양될 수 있으며 pH 6.0 내지 7.0에서 배양될 수 있다. 배양시간은 24 내지 36 시간이 바람직하다. 상기 균주 또는 이의 배양액은 MRS 배지 또는 본 발명의 최적배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 최적배지에서 배양하는 것이 좋다. 상기 최적배지는 배지 최종부피 1L 기준 효모추출물(yeast extract) 1 내지 2g, 펩톤(peptone) 0.5 내지 1g, KH2PO4 0.1 내지 0.3g, K2HPO4 0.1 내지 0.3g, NaCl 0.1 내지 1g, 포도당(glucose) 4 내지 6g, 아세트산 나트륨(sodium acetate) 0.1 내지 1g 및 폴리소르베이트 0.05 내지 0.2g을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 최적배지는 각각의 원료 첨가 후 최종 부피가 1L가 되도록 물을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 폴리소르베이트는, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65, 80, 85 중에서 선택될 수 있다. 상기 폴리소르베이트의 중량평균 분자량은 1500 이하로서, 바람직하게는 500~1500, 더 바람직하게는 1000~1500일 수 있고, 점도는 바람직하게는 100~600 mPa.s (25℃), 더 바람직하게는 250~450 mPa.s (25℃)인 것을 사용할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 돼지 살모넬라 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 동물의 연령, 성별, 체중과 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료용 첨가제를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 락토바실러스 에시도필러스이며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주(기탁번호 KCTC18722P)이다.
본 발명의 사료용 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레늄 등으로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 동결건조제제를 제공한다. 상기 동결건조제제는 탈지유(skim milk) 11.3 내지 13 중량%, 락토오스(lactose) 1 내지 2 중량%, 녹말(starch) 1 내지 2 중량% 및 CMC(Carboxymethyl Cellulose) 0.1 내지 1 중량%를 포함하는 것이 바람직하며 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주 또는 이의 배양액이 82 내지 86 중량% 포함될 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 또는 이를 포함하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는 상기 균주는 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 활성을 나타내고 저온 저항성을 가져 약학 조성물 또는 사계절 내내 이용가능한 사료용 첨가제로 제조가 가능하며, 축산 농가에서 돼지 사육시 용이하게 이용가능하다.
도 1은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주와 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC3151 균주를 5℃에서 배양할 때의 배양 일수에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주와 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC3151 균주를 15℃에서 배양할 때의 배양 일수에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주와 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC3151 균주를 20℃에서 배양할 때의 배양 일수에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 표 3의 medium 1의 배지 조성으로 하여 배양할 때의 배양 시간에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 표 3의 medium 2의 배지 조성으로 하여 배양할 때의 배양 시간에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 표 3의 medium 3의 배지 조성으로 하여 배양할 때의 배양 시간에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 표 3의 medium 4의 배지 조성으로 하여 배양할 때의 배양 시간에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 동결건조 후 저장 안정성을 확인하기 위해 저장기간에 따른 생균 수 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 우수 균주 선발
인위적인 발효제가 첨가되지 않은 숙성된 동치미를 분리원으로 하여 유기산 생성능이 우수한 유산 균주를 선발하였다.
유산 균주의 순수분리는 spread-plate method와 streak-plate method를 이용하여 분리하였다. 식염수로 연속 희석(Serial dilution)하고 0.5%의 CaCO3가 첨가된 MRS agar 배지(Peptone 10g/L, Beef extract 10g/L, Yeast extract 5g/L, Glucose 20g/L, Tween 80 1g/L, Ammonium citric acid 2g/L, Sodium acetate 5g/L, Magnesium sulfate 7H2O 0.2g/L, Manganese sulfate 4H2O 0.05g/L, Dipotassium hydrogen phosphate 2g/L, CaCO3 5g, Agar 15g/L)에 도말한 후 15℃로 설정된 항온 항습기에서 48시간 배양하였다. 형성된 colony 주위에 가장 큰 투명환을 보이는 1종의 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 MRS agar 배지에 계대한 후 37℃ 항온 항습기에서 48시간 배양한 후 각 plate에서 한 colony를 채취하여 5ml의 MRS broth에 접종한 후 37℃에서 180rpm으로 교반하면서 48시간 동안 배양하였다. 선발배양에서 가장 큰 투명환을 보인 균주는 ㈜마크로젠에 의뢰해 염기서열을 분석하였다. 분석된 실험균주의 16S rRNA 염기서열은 BLAST database (http://www.ncbi.nlm.nih.gob/blast/)와 EMBOSS Align(www.ebi.ac.uk/)을 사용하여 유사성을 비교하여, 최종적으로 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus)임이 확인되었다. 이렇게 분석된 16S rRNA의 염기서열은 하기의 서열번호 1 및 2와 같으며 선별한 균주의 계통도를 하기 도 1에 나타내었다. 서열번호 1은 범용 프라이머(Universal Primer)로써 907R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3')을 이용하여 분석한 것이며, 서열번호 2는 범용 프라이머로써 785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3')을 이용하여 분석한 것이다.
서열번호 1 :
Figure 112018107754793-pat00001
서열번호 2 :
Figure 112018107754793-pat00002
이렇게 확인된 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하였다. (기탁번호 KCTC18722P)
실험예 1. 신규 균주의 살모넬라 균주에 대한 항균 활성 실험
상기 실시예 1에서 선별한 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 이용하여 돼지 살모넬라 감염증의 원인균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 활성 실험을 실시하였다.
먼저 미리 제작된 살모넬라 타이피뮤리움 균주가 0.15%(O.D600nm 0.4) 첨가된 연질 아가(soft agar)를 15ml 씩 페트리 디쉬(9cm)에 부어 배지를 굳힌 다음 중앙에 천공한 후 각 천공 부위에 상기 실시예 1에서 선별한 균주의 배양액(1.0ㅧ105 CFU/ml) 100μl씩 접점한 후 4℃에서 18시간 동안 정치하여 충분히 확산되도록 한 후 37℃ 항온 항습기에서 24시간 배양하여 천공 주변에 형성된 투명환의 지름을 측정하였다.
또한, 비교를 위하여 대조군으로는 한국생물자원센터(Korea Collection for Type Cultures)에서 분양받은 락토바실러스 에시도필러스 KCTC3151 (Lactobacillus acidophilus KCTC3151) 균주를 이용하였으며 이를 하기 표 1에 나타내었다.
균주 투명환의 지름 (cm)
락토바실러스 에시도필러스 FNC1 2.3
락토바실러스 에시도필러스 KCTC3151 1.4
상기 표 1에 나타냈듯이 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주의 투명환의 지름이 락토바실러스 에시도필러스 KCTC3151 균주보다 큰 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 보다 살모넬라 타이피뮤리움에 대한 우수한 항균 활성의 효과를 가진다는 것을 확인하였다.
실험예 2. 신규 균주의 저온 저항성 확인 실험
상기 실시예 1에서 선별한 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주의 저온 저항성을 확인하는 실험을 실시하였다.
대조군으로는 한국생물자원센터(Korea Collection for Type Cultures)에서 분양받은 락토바실러스 에시도필러스 KCTC3151 (Lactobacillus acidophilus KCTC3151) 균주와 비교하였다.
상기 균주와 대조균 균주는 각각 MRS agar 배지에서 온도조건을 5℃, 15℃ 및 20℃로 하여 3일간 배양하였으며 1일 간격으로 생균 수를 측정하였다. 이를 하기 표 2와 도 2 내지 4에 나타내었다.
균주 온도조건 배양 일수에 따른 생균 수 변화 (CFU/ml)
초기 1일 2일 3일
락토바실러스 에시도필러스 FNC1 5 ℃ 3.10E+05 1.58E+06 6.70E+06 1.60E+07
15 ℃ 3.10E+05 2.22E+07 6.80E+07 1.82E+08
20 ℃ 3.10E+05 4.20E+07 1.10E+08 4.60E+08
락토바실러스 에시도필러스 KCTC3151 5 ℃ 3.50E+05 6.80E+05 1.58E+06 9.50E+06
15 ℃ 3.50E+05 1.65E+06 8.06E+06 3.15E+07
20 ℃ 3.50E+05 8.30E+06 5.10E+07 1.18E+08
표 2와 도 2 내지 4에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주가 락토바실러스 에시도필러스 KCTC3151 균주보다 모든 온도조건에서 높은 생균 수를 나타냈으며 이는 저온 저항성이 보다 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 신규 균주의 배양배지 최적화
상기 실시예 1에서 선별한 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 상업적으로 배양하기 위한 최적의 배양 배지 조성을 확립하기 위하여 배지 조성을 달리해가며 배양을 실시하였다. 4개의 조건으로 배지를 제작하였으며 각각의 배지 조성을 하기 표 3에 나타냈다. 배양방법은 1 ton 배양기에서 통기속도 0.4 vvm, 온도 37℃ 및 교반속도 100 rpm의 조건에서 pH 6.5로 맞춘 후 24시간 동안 배양을 진행하였으며 시간별 배양액을 채취하여 MRS agar 배지에 연속희석법을 적용하여 생균 수 분석과 분광 광도계를 이용하여 Optical Density 600nm로 배양액의 탁도를 측정하였다. 배지별 배양 시간에 따른 균주의 생균 수 변화를 하기 표 4 및 도 5 내지 8에 나타내었다.
배지 조성 (g/L) medium 1 medium 2 medium 3 medium 4
yeast extract 0.8 0.8 1.5 1.5
peptone 1 1 1 1
KH2PO4 0.2 0.2 0.2 0.2
K2HPO4 0.2 0.2 0.2 0.2
NaCl 0.5 0.5 0.5 0.5
Glucose 2.5 5 2.5 5
Sodium acetate 0.5 0.5 0.5 0.5
Tween 80 0.1 0.1 0.1 0.1
구분 배양 시간에 따른 생균 수 변화 (CFU/ml)
0 hour 4 hour 8 hour 12 hour 24 hour
medium 1 3.30E+06 4.10E+07 1.10E+08 3.50E+08 8.80E+08
medium 2 1.50E+06 2.20E+07 8.90E+07 2.10E+08 9.50E+08
medium 3 3.10E+06 5.80E+07 3.60E+08 8.80E+08 3.50E+09
medium 4 2.10E+06 3.10E+07 2.10E+08 3.60E+09 1.10E+10
상기 표 4 및 도 5 내지 8에 나타냈듯이 medium 4에서 가장 높은 생균 수와 OD값을 통해 medium 4의 배지 조성이 가장 좋다는 것을 확인하였다.
실험예 4. 돼지 장 상피세포(IPECJ2) 부착능력 실험
상기 실시예 1에서 선별한 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 대상으로 축산용(양돈)에 적용시 생균제로서의 효과를 검증하기 위하여 돼지 장 상피세포에 대한 부착능력을 평가하였다.
부착능력 검증을 위해 돼지 장 상피세포인 IPECJ2 Cell line을 비활성화된 10% 우태아혈청(FBS), 1% L-glutamine, penicillin G (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 mg/ml)이 첨가된 RPMI 1640(Gibco, USA) 배지를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃에서 배양하였다. 장 상피세포는 well 당 1.0×105 cells/ml이 되도록 24 well-plate에 분주하고 2일에 한번 배지를 교환하여 완전하게 단일층(monolayer)을 형성할 때까지 배양하였다. 단일층의 장 상피세포에 25℃의 PBS(Phosphate buffer saline)를 이용하여 5회 세척한 후, RPMI 1640 배지를 0.5ml 첨가하였다. 여기에 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주 배양액을 첨가하여 접종 후 최종 균수가 1.0×108 CFU/ml이 되도록 계산하여 첨가하였다. 5% CO2 농도로 유지되는 37℃ 항온 항습기에서 2시간 정치 배양한 후, well plate에 PBS buffer를 적량 첨가한 후 3분간 200rpm으로 교반하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 세포주에 부착되지 않은 균주를 완전히 제거하였다. 이후 0.2% Trypsin-EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid) 용액을 첨가하여 plate에서 세포주를 탈락시킨 후 식염수(saline)을 이용하여 연속 희석(serial dilution)한 후 MRS agar 배지에 도말한 후 37℃ 항온 항습기에서 48시간 배양한 후 세포주에 부착된 균수를 확인하였으며 이를 하기 표 5에 나타내었다.
균주 (CFU/ml) %
초기 Un-adhesion LAB Adhesion LAB
락토바실러스
에시도필러스 FNC1		 1.70E+07 1.70E+07 2.05E+04 0.12
락토바실러스
에시도필러스 KCTC3151		 1.80E+07 1.80E+07 3.03E+03 0.016
상기 표 5에 나타냈듯이 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 균주의 돼지 장 상피세포 부착능력이 락토바실러스 에시도필러스 KCTC3151 균주보다 높은 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 축산용으로 적용시 장기적인 섭취에 따른 균주의 장 정착이 가능할 것으로 확인되었다.
실험예 5. 동결건조 보호제 조성 최적화
상기 실시예 1에서 선별한 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주의 저장 안정성 향상을 위하여 동결건조 보호제 조성의 최적화을 위한 실험을 진행하였으며, 하기 표 6의 동결건조 보호제 조성을 적용하여 동결건조를 진행한 후 생균 수 분석을 통해, 사멸율을 최소화 할 수 있는 보호제 조성을 확인하였다.
구분 동결건조 보호제 조성
Skim milk Lactose Starch CMC FNC1 균주
(CFU/ml)
보호제 1 6.7% 1.5% 1.5% 0.2% 4.58E+11
보호제 2 10.0% 1.5% 1.5% 0.2% 7.70E+11
보호제 3 10.5% 1.5% 1.5% 0.2% 5.10E+11
보호제 4 11.0% 1.5% 1.5% 0.2% 4.00E+11
보호제 5 11.3% 1.5% 1.5% 0.2% 9.00E+11
보호제 6 13.3% 1.5% 1.5% 0.2% 6.40E+11
보호제 7 15.0% 1.5% 1.5% 0.2% 5.00E+11
보호제 8 16.0% 1.5% 1.5% 0.2% 6.20E+11
보호제 9 17.5% 1.5% 1.5% 0.2% 7.90E+11
보호제 10 20.0% 1.5% 1.5% 0.2% 4.20E+11
상기 표 6에 나타냈듯이, 동결건조 보호제 조성에 따른 동결건조 후 생균 수 분석 결과 동결건조 보호제 5의 조성인 Skim milk 11.3%, Lactose 1.5%, Starch 1.5%, CMC(Carboxymethyl Cellulose) 0.2% 조건에서 생존율이 가장 높고 우수하다는 것을 확인하였다.
실험예 6. 저장 안정성 분석
상기 실험예 5에서 보호제 5의 동결건조 보호제 조성을 적용하여 제작한 동결건조 분말을 알루미늄 포장지에 100g 씩 첨가한 후 밀봉하여 40℃ 항온 항습기에서 최대 습도가 되도록 증류수를 바닥에 첨가하고, 288일이 동안 저장하며 생균 수를 분석하여 저장 안정성을 확인하였다.
저장 일자 락토바실러스 에시도필러스 FNC1 (CFU/ml)
0 day 5.15E+10
3 day 5.00E+10
9 day 4.88E+10
18 day 4.64E+10
36 day 4.51E+10
72 day 4.33E+10
144 day 3.99E+10
288 day 3.51E+10
상기 표 7에 나타낸 바와 같이 저장 기간이 길어져도 초기 생균 수와 크게 차이가 나지 않는 것으로 보아 저장 안정성이 우수하다는 것을 확인하였다.
실험예 7. 사료용 첨가제를 첨가한 사료의 제조
본 발명의 신규 균주인 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 상기 실험예 5에서 보호제 5의 조성으로 동결건조한 분말을 사료용 첨가제로 하여 통상 시중의 배합사료 판매점 또는 대리점에서 구입할 수 있는 갓난 돼지(이유기용)용 배합사료에 3 중량% 혼합하여 사료용 첨가제가 첨가된 사료를 제조하였다.
또한, 비교를 위해 상기 방법과 동일하게 사료용 첨가제가 첨가된 사료를 제조하되 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC3151 균주를 이용하여 제조하였다. 이를 하기 표 8에 나타내었다.
구분 내용
제조예 1 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주를 동결건조한 분말 3 중량%와 배합사료를 혼합한 사료
비교제조예 1 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC3151 균주를 동결건조한 분말 3 중량%와 배합사료를 혼합한 사료
실험예 8. 사료용 첨가제 적용 실험
상기 실험예 7에서 제조한 사료를 갓난 돼지에게 급여하여 갓난 돼지의 살모넬라 감염증에 대한 효과를 확인하기 위해 실험을 실시하였다.
일반적으로 축산농가에서 갓난 돼지 이유시기를 28령에 하는 경우가 많아, 본 발명의 사료용 첨가제를 시험하는데 있어서도 이유시기를 28령으로 하여 42령이 될 때까지 시험을 수행하였다.
갓난 돼지 360두를 60두 씩 하기 표 9와 같이 6군으로 나누고 사육 환경의 변화를 고려하여 여름(7월) 및 겨울(12월)에 각각 사료를 급여하였다.
여기서 대조군은 어떠한 사료용 첨가제를 첨가하지 않은 사료이다.
구분 조건 이유시 평균 체중(28령) 최종 평균 체중(42령) 1일 평균
사료섭취량		 설사 자돈 수
제조예 1 여름 7.28kg 13.80kg 510g 5
겨울 7.30kg 13.75kg 512g 4
비교제조예 1 여름 7.29kg 13.60kg 508g 8
겨울 7.28kg 13.55kg 509g 9
대조군 여름 7.31kg 13.40kg 510g 12
겨울 7.29kg 13.45kg 512g 15
상기 표 9에 나타낸 바와 같이 제조예 1의 본 발명의 균주를 포함하는 사료용 첨가제를 혼합한 사료를 급여한 갓난 돼지가 비교제조예 1 및 대조군의 사료를 급여한 갓난 돼지보다 설사 증상을 나타내는 자돈의 수가 적은 것을 확인할 수 있었으며 이는 돼지 살모넬라 감염증에 대해 우수한 효과가 있다는 것을 알 수 있다. 또한 여름 및 겨울 모두 효과가 있다는 것을 통해 사계절 내내 이용 가능하다는 것을 확인하였다.
[수탁기관]
기탁기관명 : 생물자원센터
수탁번호 : KCTC18722P
수탁일자 : 20181025
<110> FNC Bio inc. <120> Lactobacillus acidophilus FNC1 or Composition for preventing or treating porcine salmonellosis comprising the same <130> 0341 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 862 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus acidophilus <400> 1 gtcccgtcgt cgagctcagc gtcagttgca gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt 60 cttccatata tctacgcatt ccaccgctac acatggagtt ccactctcct cttctgcact 120 caagaaaaac agtttccgat gcagttcctc ggttaagccg agggctttca catcagactt 180 attcttccgc ctgcgctcgc tttacgccca ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt 240 attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtgactttct ggttgattac cgtcaaataa 300 aggccagtta ctacctctat ccttcttcac caacaacaga gctttacgat ccgaaaacct 360 tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga ctttcgtcca ttgtggaaga ttccctactg 420 ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct cagtcccaat gtggccgatc agtctctcaa 480 ctcggctatg catcattgcc ttggtaggcc gttaccctac caactagcta atgcaccgcg 540 gggccatccc atagcgacag cttacgccgc cttttataag ctgatcatgc gatctgcttt 600 cttatccggt attagcacct gtttccaagt ggtatcccag actatggggc aggttcccca 660 cgtgttactc acccatccgc cgctcgcgtt cccaacgtca tcaccgaagt gaatctgttg 720 gttcagctcg ctcgacttgc atgtattagg cacgccgcca gcgttcgtcc tgagcggaaa 780 accaccctca tataaaaggg ctggggaata aaaaaggata aaagggtggg ggagggttgg 840 ttagccccga gggttgcgcg ct 862 <210> 2 <211> 1042 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus acidophilus <400> 2 gtgaagtgac gtgtcggatt tattgggcgt aagcgagcgc aggcggaaga ataagtctga 60 tgtgaaagcc ctcggcttaa ccgaggaact gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga 120 agaggagagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag 180 tggcgaaggc ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa 240 caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt 300 tccgcctctc agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa 360 ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 420 cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatctag tgcaatccgt agagatacgg 480 agttcccttc ggggacacta agacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 540 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcat tagttgccag cattaagttg 600 ggcactctaa tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tgggggatga cgtcaagtca 660 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagtacaa cgaggagcaa 720 gcctgcgaag gcaagcgaat ctcttaaagc tgttctcagt tcggactgca gtctgcaact 780 cgactgcacg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg gtgaatacgt 840 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccaatgggga gtctgcaatg cccaaagccg 900 gtggcctaac cttcggggaa ggagccgtct aaggcagggc agatgactgg gggtgaagtc 960 gtaacaaggt agccctagga gaacctgcgg tgacaccccc cccttcttat ataaaagggg 1020 gggggggcgg gcgttttgct gt 1042

Claims (9)

  1. 5 내지 20℃에서 저온 저항성을 나타내고, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주 (기탁번호 KCTC18722P).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1 및 2 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 돼지 장 상피세포에 대해 부착능력을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) FNC1 균주.
  5. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배양액은 MRS 배지; 또는, 배지 최종부피 1L 기준 효모추출물(yeast extract) 1 내지 2g, 펩톤(peptone) 0.5 내지 1g, KH2PO4 0.1 내지 0.3g, K2HPO4 0.1 내지 0.3g, NaCl 0.1 내지 1g, 포도당(glucose) 4 내지 6g, 아세트산 나트륨(sodium acetate) 0.1 내지 1g 및 폴리소르베이트 0.05 내지 0.2g을 포함하는 배지;에서 배양된 것을 특징으로 하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료용 첨가제.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조성물이 동결건조제제인 것을 특징으로 하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서
    상기 동결건조제제는 탈지유(skim milk) 11.3 내지 13 중량%, 락토오스(lactose) 1 내지 2 중량%, 녹말(starch) 1 내지 2 중량% 및 CMC(Carboxymethyl Cellulose) 0.1 내지 1 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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