CN114107134B - 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一株侧孢短芽孢杆菌，其命名为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1‑0716，该菌已于2021年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211397。该菌株是从药源植物金银花组织中筛选分离得到，该菌抑菌谱广、抑菌性能好、具有良好的耐受性，安全性良好，并且具有良好的抗炎、保护肠道、防治肠炎的功能。

Description

一株侧孢短芽孢杆菌及其应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一株侧孢短芽孢杆菌及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着养殖业向高密度和集约化发展，畜禽的养殖环境越来越恶劣，严重影响动物生产水平和健康状况。抗生素的滥用导致耐药细菌产生、药物残留及环境污染等，对人体健康产生安全隐患。因此，研究应用新型绿色添加剂用以替代抗生素已成为饲料添加剂研究的热点话题。
芽孢杆菌具有抵抗力强、营养要求低、生长繁殖速度快、外界环境适应能力强等优点。能抑制外来病原微生物在胃肠道内的定植或增殖，调整动物肠道菌群紊乱、减少肠道疾病发生进而提高机体抗病能力。此外研究表明芽孢杆菌还能在机体内调节肠道菌群平衡、增强机体免疫功能，分泌多种酶类和维生素，有效促进营养物质的消化吸收。作为一种新型绿色微生态制剂，芽孢杆菌有着十分广泛的应用前景和较大的市场需求。侧孢短芽孢杆菌在自然界中分布广泛，对无脊椎动物具有致病性，对很多有害微生物具有抑制作用，农业部2014年(农业部公告第2045号《饲料添加剂品种目录(2013)》)公布了30余种用于饲料添加剂的微生物，其中侧孢短芽孢杆菌(原名侧孢芽孢杆菌)被列入目录，可用于肉鸡、肉鸭、猪和虾的养殖，广泛应用于农业进行病虫害防治。
益生菌作为微生态制剂通过动物机体直接摄入而发挥作用，益生菌的安全性是其能否应用的先决条件。目前，益生菌的评价主要从安全性和有效性入手，主要包括体内和体外评价。体外有效性评价主要从菌株的抑菌活性、耐受性等方面评价证实菌株的益生功效。益生菌的体内有效性评价是建立在体外有效性评价基础上的，无论菌株体外的功效有多好，如果在体内没有功效，也不能说明菌株具备益生特性。
肠道与动物的健康生长有着密切的联系，保护好肠道的健康，对动物生长有着重要的作用。肠道是高等动物最主要的消化吸收场所，健康的肠道对动物生长发育极其重要。肠道黏膜还有丰富的血管网络，发生于肠道的炎症极易引发动物机体多***炎症。同时肠道炎症的发生会严重影响动物机体的消化吸收功能，造成动物营养不良、消瘦、生长受阻，甚至死亡，给养殖生产带来巨大损失。当机体处于应激等不良状态或病原微生物异常增殖时，肠道的屏障功能极易受到影响，导致失衡，损伤超过机体的自我修复水平，从而导致疾病的发生。病原菌作用于肠黏膜上皮细胞，引起其损伤和凋亡进而导致病原进入黏膜下层，激活肠黏膜中的免疫相关细胞，促其分泌炎性细胞因子和趋化因子，引起炎症，导致肠损伤。目前，芽孢杆菌体外抑菌、安全性评价等方面的报道较多，但应用于动物肠道炎症干预及修复方面的报道较少。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一株侧孢短芽孢杆菌，该菌抑菌谱广，对常见畜禽病原菌比如大肠杆菌、沙门菌、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌等具有良好的抑菌效果，对溶藻弧菌、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌等水产常见病原菌也表现出良好的抑菌效果；并且，该菌具有良好的安全性和稳定性；以及在动物实验中表现出了良好的抗炎、防治肠炎(包括急性肠炎、溃疡性结肠炎等)、改善肠道紊乱的作用，能够发挥良好的防治结肠萎缩、防止肠道损伤等保护肠道健康的作用，表现出良好的应用前景。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一株侧孢短芽孢杆菌，其命名为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1-0716，该菌株已于2021年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCC NO：M20211397。
本发明的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716是从山东省临沂市平邑县地方镇金银花茎中分离筛选所得，是一株药源植物内生菌。本发明所述侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716为革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，能够形成特有的独木舟状伴生芽孢。该菌在37℃培养24h，形成浅黄色菌落，湿润有光泽，紧贴培养基，不凸起，边缘整齐。BLCC1-0716为好氧菌，可以利用肠道内的氧气造成厌氧环境，可促进兼性厌氧菌乳酸菌的增殖。
对本发明的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716进行鉴定，发现其具有表4所示的生化特性：
表4、侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的生理生化鉴定结果
Figure BDA0003426488950000021
注：+：阳性；-：阴性。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供一种较为适宜侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的培养基，其组成为：0.5％葡萄糖、1.0％蛋白胨、0.5％牛肉膏、0.5％氯化钠，调pH至6.5，120℃条件下灭菌30min，其中所述百分数为质量百分数。
良好的安全性是使用微生物的重要前提，因此，在本发明的实施方式中，发明人验证了侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的安全性，结果发现，以108-1010CFU/只的剂量处理小鼠，小鼠的体态、内脏等均无损伤，体重也无显著性差异，表明该菌至少在灌胃100亿以内的剂量对小鼠是安全的。
以及，在本发明的一些实施方式中，发明人经过实验发现，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716表现出对胆盐的良好耐受性，表现为以不同浓度胆盐处理该菌，短时处理时活菌数几乎没有损失，直至作用4小时后，随着胆盐浓度升高，BLCC1-0716的存活率开始下降，0.1％浓度胆盐作用4小时存活率为99.87％；0.3％浓度胆盐作用4h，存活率可达73.57％；0.5％浓度胆盐作用4h，存活率依然可达45.00％。
在本发明的一些实施方式中，发明人实验发现，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716表现出良好的耐酸性能，能够在人工胃液和人工肠液中良好的生存。其中，在37℃条件下作用4h，pH2.5条件下存活率可达75.86％，pH3.5条件下存活率为97.44％，pH4.5条件下存活率为103.13％；在人工肠液中4h的存活率高达289.38％，在人工胃液中4h的存活率高达120.28％。
益生菌作为饲料添加剂，在具有抑菌作用的同时，还要具有良好的抗逆性。胃肠道作为动物的一个消化吸收的重要器官，其微生物区系的平衡对维持动物机体的健康起着重要的作用。益生菌经口服进入动物机体，必须先经过胃然后到小肠定植，因此，益生菌能够抵抗较强的酸性环境和较高浓度的胆盐是其能够在肠道中良好存活和正常发挥作用的重要前提。经试验证明，本发明的菌株BLCC1-0716耐酸、耐胆盐及在人工胃肠液中的耐受性良好，可顺利通过胃进入小肠发挥作用，提高动物机体性能。
以及，本发明的一些实施方式中，发明人还发现菌株BLCC1-0716表现出了良好的耐热性能，具体表现在菌株BLCC1-0716在85℃的高温水浴中处理15min，其菌株存活率依然可高达98.1％。良好的耐热性利于菌株的保存以及后期的制剂处理，克服了目前大多数益生菌不耐热、难以常温下存活和保存、以及难以制剂化的缺陷，具有良好的市场应用前景。
以及，在本发明的一些实施方式中，发明人发现菌株BLCC1-0716具有良好的抑菌效果，抑菌谱广，对测试的至少14种病原菌表现出良好的抑菌活性，这些病原菌包括但不限于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、沙门菌、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌等，对这些菌的抑菌圈均在12mm以上，尤其针对产气荚膜杆菌、副溶血弧菌以及环状芽孢杆菌的抑菌能力更强，其抑菌圈均达到了18mm以上，这表明BLCC1-0716可以用于防治畜禽养殖过程中由病原微生物比如畜禽常见大肠杆菌、沙门菌、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌等引起的坏死性肠炎等疾病；以及可以用于防治水产类病原微生物溶藻弧菌、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌等病原菌引起的鱼类出血性败血症、溃疡等疾病。
在本发明的第二方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)BLCC1-0716的应用，具体地，所述应用选自下述1)至6)中的至少一项：
1)侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1-0716或其发酵物或其代谢产物在制备抗炎的产品中的应用；
2)侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1-0716或其发酵物或其代谢产物在制备防治腹泻的产品中的应用；
3)侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1-0716或其发酵物或其代谢产物在制备防治肠炎的产品中的应用；其中，所述肠炎包括病原菌导致的肠炎和非病原菌导致的肠炎，所述病原菌导致的肠炎比如由病原微生物比如畜禽常见大肠杆菌、沙门菌、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌等引起的肠炎；所述非病原菌导致的肠炎比如急性肠炎和溃疡型肠炎(溃疡性结肠炎)；
4)侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1-0716或其发酵物或其代谢产物在制备调整消化道菌群的产品中的应用；其中，所述调整消化道菌群尤其指防治肠炎状态下的消化道菌群紊乱，所述肠炎优选为急性肠炎和溃疡型肠炎；
5)侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1-0716或其发酵物或其代谢产物在制备防治结肠萎缩的产品中的应用；其中，所述结肠萎缩为肠炎导致的结肠萎缩；和/或，
6)侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)BLCC1-0716或其发酵物或其代谢产物在制备保护肠道的产品中的应用；其中，所述保护肠道是指在肠道发生炎症、病菌性肠炎以及非病菌性肠炎比如急性肠炎和溃疡性肠炎时对肠道所起的保护作用，这些保护作用包括但不限于保持肠道组织结构的完整，比如保持肠壁组织清晰、绒毛结构完整、轮廓清晰、排列整齐、腺体结构完整、隐窝正常等等。所述肠道尤其指结肠。
在本发明的上述应用中，所述侧孢短芽孢杆菌以其发酵物或菌体或其代谢产物进行应用。本发明所述发酵物用于指代发酵产品。相应的发酵物可以从发酵培养侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的过程中获得，基于培养形式的差异，可以为固体发酵物或液体发酵物，液体发酵物也可称为发酵液或培养液；本发明所述的发酵物中包含菌体及其代谢产物。在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为上清液，并且在本发明中，上清液内含有侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的代谢产物。
在本发明的上述应用中，所述产品可以为药品、食品、保健品或饲料添加剂。
在本发明的一些实施方式中，本发明进行了一些动物实验，本发明分别构建了动物急性肠炎模型和溃疡性结肠炎模型，并验证了侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的作用。其中，在针对LPS致急性肠炎模型的实验结果中可以发现，灌胃不同浓度的(3×106～108CFU/只)侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716能够缓解小鼠腹泻、降低腹腔注射10mg/kg剂量LPS引起的小鼠血清细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平、并提升抑制炎性因子IL-10的水平，因此推测BLCC1-0716可通过这两条途径来抑制炎症产生和缓解炎症；以及侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716能够改善LPS引发的上消化道菌群紊乱、可提高兼性厌氧菌乳酸菌的数量，降低肠道病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的数量。在针对DSS致溃疡型肠炎模型的实验结果中可以发现，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716能够抑制DSS引起的小鼠体重的减轻、能够抑制DSS诱导的小鼠结肠的萎缩，并改善小鼠结肠炎疾病活动指数，预防并改善DSS引发的结肠结构的破坏，比如抑制和改善DSS导致的结肠上皮坏死脱落、肠壁变薄、肠腺结构严重破坏、腺体凌乱、肠绒毛断裂、缺失严重，仅剩下黏膜肌层，黏膜肌层间质水肿的不良状况。以上结果表明侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716能够在动物肠道内良好的定植生存，并能够有效缓解动物的肠道炎症、减轻腹泻和改善肠道病变，具有防治非病原菌导致的肠炎比如急性肠炎、溃疡型结肠炎等的作用，且改善防治效果良好。
此外，本发明的菌株BLCC1-0716具有良好的抑菌性能，因此也可用作抑菌剂或用于制备发挥抑菌作用的产品使用。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种菌剂或饲料，其包含上述第一方面中所述的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716和/或其发酵物和/或其代谢产物。所述菌剂或饲料中可以包含侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716，也可以包含其发酵物或发酵液，也可以包含其代谢产物。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供了一种特别适宜于侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的培养基，其组成为：0.5％葡萄糖、1.0％蛋白胨、0.5％牛肉膏、0.5％氯化钠，调pH至6.5，120℃条件下灭菌30min，所述百分数为质量百分数。
以及，相应地，在本发明的实施方式中，本发明提供了获得侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716发酵物或发酵液的方法，包括：将侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716接种至适宜的培养基上，静置培养。所述培养基可以为固体培养基也可以为液体培养基。适宜的培养基以及培养条件如上文中所述。在此基础上，本领域技术人员也可进行适宜调整。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物组合物或药物制剂，其包含上述第一方面中所述的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716和/或其发酵物和/或其代谢产物。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述药物组合物或药物制剂中包含本发明所述的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716，以及，在此基础上，所述药物组合物或药物制剂还可以包含至少一种药物载体或药学上可接受的辅料，或者其他治疗有效的试剂。其中，合适的药用辅料可以是本领域已知的种类，比如溶剂、缓冲剂、稀释剂等等，例如可以是作者Paul JSheskey等人编著的《药用辅料手册》(Handbook of Parmaceutical Excipients)中所记载的。药物组合物或药物制剂可以为固体、半固体或者液体形式，其可根据本领域已知的任何常规方法进行制备。所述饲料中还可以进一步包含粮食类物质、微量元素、蛋白质等。
在本发明的一些实施方式中，所述菌剂可以制备成菌粉或菌液，所述菌粉中可以进一步包含冻干保护剂，所述冻干保护剂的加入量为发酵液离心后所获得的菌体重量的40-60％，所述冻干保护剂可采用本领域常规的冻干保护剂，比如脱脂奶粉、蔗糖等。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种治疗肠炎的方法，其包括向受试者施用有效剂量的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716或包含该菌株的菌剂、药物组合物、药物制剂或饲料等。所述肠炎包括病原菌导致的肠炎(如上文中所定义)或非病原菌导致的肠炎(比如急性肠炎和溃疡性结肠炎)；所述施用方式为口服或灌胃。
在本发明的一些实施方式中，进行灌胃时，以菌液的形式更容易实现，所述菌液可以是含有菌体的液体比如水溶液或其他安全且易于使用的溶液或混悬液形式。进行口服时，可以以液态形式或非液态形式服用。
所述“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选小鼠、人或畜禽类动物，比如猪、牛、羊、马、驴、骆驼、兔、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等。
所述“有效剂量”是指能够引发动物产生有益效果或改善病症比如腹泻、便血、结肠萎缩、菌群失调的量，在本发明的一些实施方式中，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的有效剂量为1×106～1010CFU/mL，优选为1×106～108CFU/mL。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716不仅抑菌谱较广，对于常见的畜禽类致病菌、水产病原菌均具有良好的体外抑菌作用，能够治疗由这些病原菌引发的疾病(比如肠炎)；而且BLCC1-0716耐受性良好，具有良好的耐酸、耐胆盐的特性，能够在人工胃肠液中很好的存活，说明其能够良好的在动物肠道内定植，并且具有良好的耐热性能，在常温及不高于85℃的环境下良好存活，易于存贮和制剂化生产。同时，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716安全性能好，除了能够抑制病原菌引发的疾病外，还对急性肠炎、溃疡型结肠炎等非病原菌导致的肠炎表现出良好的治疗和改善作用，能够缓解动物肠道炎症，保护和改善肠道病变、改善菌群紊乱、提高动物抗病能力且饲喂安全。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1：实施例1中，金银花叶(左)、根(中)、茎(右)内生菌分离情况图。
图2：实施例1中，BLCC1-0716和BLCC1-0155对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果图。
图3：实施例2中菌株BLCC1-0716的菌落及镜检图。
图4：实施例2中菌株BLCC1-0716***进化分析图。
图5：实施例5小鼠溃疡型肠炎模型构建期间小鼠体重变化折线图。
图6：实施例5小鼠溃疡型肠炎模型小鼠的便血照片。
图7：实施例5中不同浓度DSS对小鼠结肠形态的影响。
图8：实施例5小鼠溃疡型肠炎功效评价实验中饮用DSS后各组小鼠体重变化。
图9：实施例5小鼠溃疡型肠炎功效评价实验中不同处理组的小鼠结肠组织切片观察。
图10：实施例6小鼠溃疡型肠炎功效对比评价实验中饮用DSS后各组小鼠体重变化。
图11：实施例6小鼠溃疡型肠炎功效对比评价实验中不同处理组的小鼠结肠长度情况。
图12：实施例6小鼠溃疡型肠炎功效对比评价实验中不同处理组的小鼠结肠组织切片观察。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、菌株的筛选
1、材料与方法
1.1样品：药源植物金银花根、茎、叶等组织材料。
1.2病原菌
供试菌种如表1所示。
表1病原菌编号及来源
Figure BDA0003426488950000071
1.3分离培养基
改良的MRS培养基：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、葡萄糖2％、磷酸氢二钾0.2％、乙酸钠0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.05％、吐温-80 0.1％、pH值6.5；用于分离乳酸菌。
LB培养基：0.5％葡萄糖、1.0％蛋白胨、0.5％牛肉膏、0.5％氯化钠，调pH至6.5；用于分离芽孢杆菌等细菌。
PDA培养基：马铃薯20％(煮汁)，葡萄糖20g，琼脂15g，pH自然；用于分离真菌。
1.4发酵培养基
乳酸菌发酵培养基为MRS液体培养基；芽孢杆菌等细菌发酵培养基为LB液体培养基；真菌发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)；指示菌发酵培养基：同芽孢杆菌培养基。
1.5试验方法
1.5.1样品采集与处理
采集金银花枝条、叶片及树皮等，置于无菌塑料袋中，在24h内进行表面消毒处理。
1.5.2内生菌的分离和纯化
采用组织块法(比如可参照文献严铸云,庞蕾,罗静,汪杨丽,陈新,万德光.银杏内生真菌菌种的分离及鉴定[J].华西药学杂志,2006(05):425-427.严铸云,庞蕾,罗静,汪杨丽,陈新,万德光.银杏内生真菌菌种的分离及鉴定[J].华西药学杂志,2006(05):425-427中的处理方式.)对所采集的植物组织进行内生菌的分离。取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净，稍干后取其根、茎、叶切成适宜大小的小段，在75％乙醇中浸泡l min，无菌水漂洗3次后用2.5％NaClO消毒，茎、叶消毒2min，皮消毒3min，最后再用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。去边缘，切成约0.5cm×0.5cm的小块贴放于分离培养基上，每皿4～6块，置37℃和28℃恒温培养箱中培养2d-7d，待培养基上植物组织周围长出菌落后，挑取转移至新的培养基平板上划线法纯化，纯化的单菌落至斜面4℃保存，或者甘油管及冻干粉保存。在内生菌分离过程中，设两类空白对照(可参照文献何佳,刘笑洁,赵启美,陈钧.植物内生真菌分离方法的研究[J].食品科学,2009,30(15):180-183.中的记载进行设置)，以保证所得菌株为植物内生菌。
1.5.3具抑菌效果菌株的筛选
上清液的制备：将上述纯化的菌种分别接种在LB斜面培养基中，37℃培养复壮，24h后传代到装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃恒温振荡培养(180r/min)24h，然后接种到装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃恒温振荡(180r/min)培养，5000r/min离心分离菌体和上清液，上清液即为代谢产物；然后用管碟法对代谢产物进行抑菌活性测定。
双碟的制备：取直径90mm的平底双碟，注入灭菌的营养琼脂(1.5％)15mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取营养琼脂(浓度为0.8％，冷至50℃左右)与37℃24h培养的指示菌液适量混匀，取6mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。
加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的待测样品上清液(300μL)，每个样品三个重复。将加完样的双碟小心放入37℃恒温箱内，培养16h后取出测量抑菌圈直径。
2、结果
2.1金银花内生菌分离情况
从金银花根、茎、叶中分离得到12株菌，分离情况如图1所示。
2.2具抑菌效果的菌株筛选结果
表2金银花内生菌抑菌效果筛选结果
Figure BDA0003426488950000081
Figure BDA0003426488950000091
注：①抑菌圈直径为2次重复试验的平均值；(-)无抑制效果；(+)4<Φ<10mm；(++)10mm≤Φ<14mm；
(+++)14mm≤Φ<24mm。
②低活性：抑菌圈Φ<10mm；中等活性：抑菌圈(++)10mm≤Φ<14mm；高活性：抑菌圈Φ≥14mm。
表2示出了金银花内生细菌的抗菌试验结果。从表中可以看出，12株内生菌对1种以上指示菌有较好的抑菌作用，占总数的27.91％；对3种以上指示菌有抑菌作用的有7株，占总数的16.28％；有2株内生菌对4种病原菌具有抑制作用，占总数的4.65％，且具有抑菌作用的菌株均对沙门菌有较好的抑菌作用。从抑菌效果来看，对革兰氏阴性菌的活性大于革兰氏阳性菌。对金黄色葡萄球菌有抑制作用的有5株，占总菌株的11.63％；对大肠杆菌有抑制作用的有6株，占总数的13.95％；对沙门菌有抑制作用的有12株，占总数的27.91％；对嗜水气单胞菌有抑制作用的有7株，总菌株的16.28％。综合抑菌活性及抑菌谱，菌株JYH-J4体外抑菌性能较好，为便于保藏管理，该菌株编号为BLCC1-0716(因此，在本发明的实施方式中，菌株JYH-J4与菌株BLCC1-0716指代同一株菌)。
2.3菌株BLCC1-0716抑菌谱确定
表3金银花内生菌BLCC1-0716抑菌结果
Figure BDA0003426488950000092
如表3所示，菌株BLCC1-0716对大肠杆菌BLCC8-0102、金黄色葡萄球菌BLCC8-0004及产气荚膜梭菌BLCC8-0044的抑菌圈直径分别为15mm、15mm、22.5mm，显著大于程福亮(中国专利CN105039223A，发明名称“一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用”)等报道的枯草芽孢杆菌BLCC1-0155对大肠杆菌(12.5mm)、金黄色葡萄球菌(9.0mm)、产气荚膜梭菌(18.0mm)的抑菌直径，其中，BLCC1-0716和BLCC1-0155对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果如图2所示。以及，BLCC1-0716对畜禽常见大肠杆菌、沙门菌等病原微生物体外抑菌性能较好，对化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌等也有较好的体外抑菌性能，可以有效的防治畜禽养殖过程中由该类病原微生物引起的坏死性肠炎等疾病。除此之外，BLCC1-0716还对溶藻弧菌、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌等水产常见病原菌具有良好的抑菌效果，可用于该类病原微生物引起的鱼类出血性败血症、溃疡等疾病的防治。
实施例2、菌种鉴定及安全试验
1、材料与方法
1.1菌种：本发明实施例1筛选的菌株BLCC1-0716。
实验动物：健康雌性昆明种小白鼠(体重20±2g)40只，购自济南彭悦实验动物繁育有限公司。
1.2细菌的常规生化鉴定：除特别说明外，一般形态、生理生化试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《微生物学实验手册》进行。
1.3菌株的16S rDNA鉴定
1.3.1 16S rDNA的扩增与序列分析
目的菌株接种于新鲜的发酵培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16SrDNA序列扩增。所用引物为细菌16S rDNA通用引物27F/1492R，PCR反应体系(50μL)为：Mixture 25μL(含TaqDNA聚合酶及dNTP等，购于天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。
1.3.2***发育分析
登录GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对菌株16S rDNA测序结果利用Blast进行检索，并下载相关属种的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等软件进行同源性分析，并构建***进化树。
1.4安全性试验
灌胃菌液的制备：BLCC1-0716纯培养物接种于LB培养基中，37℃、180rpm条件下培养24h，将菌液转置无菌离心管中，4000rpm离心5min，收集菌体，分别加入无菌生理盐水及上清液混匀，调至活菌数浓度分别为5.0×108CFU/mL(低剂量组)、5.0×109CFU/mL(中剂量组)、5.0×1010CFU/mL(高剂量组)。
试验方法：清洁级雌性昆明小鼠适应环境3天后，进行随机分组，分为对照组、不同剂量组，每组10只。分组时做好标记，对照组使用生理盐水，不同剂量组分别灌胃上述不同活菌数的菌悬液，每只0.2mL，每天灌胃1次。试验中观察小鼠的各项指标，并做好记录。饲喂一周后进行剖杀，计算小鼠体重变化，解剖观察肝脏、脾脏及肾脏有无病变。
2、结果
2.1菌株BLCC1-0716菌落及镜检形态
挑取菌株BLCC1-0716纯培养物种接于LB培养基中，37℃培养24h，形成浅黄色菌落，湿润有光泽，紧贴培养基，不凸起，中央略凸起，边缘整齐。革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，能够形成特有的独木舟状伴生芽孢。其中，菌株BLCC1-0716的菌落及镜检图如图3所示。
2.2菌种的生理生化鉴定
经细菌的生化反应，菌株BLCC1-0716生理生化性状结果如表4所示。
表4侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716的生理生化鉴定结果
Figure BDA0003426488950000111
注：+：阳性；-：阴性。
如表4所示，菌株BLCC1-0716生理生化性状鉴定结果符合侧孢短芽孢杆菌性状。综合菌落、菌体形态及生理生化鉴定结果，菌株初步判定为侧孢短芽孢杆菌。
2.3菌株BLCC1-0716的16S rDNA鉴定结果
菌株BLCC1-0716的16S rDNA PCR的条带约为1.5kb的单一扩增产物。将该序列与GenBank的核酸数据作同源性比对。结果表明，该序列与GenBank中公布的已知侧孢短芽孢杆菌DQ122932.2、KP209409.1、MN907467.1 16S rDNA序列的同源率为100％。菌株BLCC1-0716***进化分析图如图4所示。结合16S rDNA序列分析，菌株BLCC1-0716被鉴定为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)。其中，菌株BLCC1-0716的核苷酸序列如SEQ IDNO:1中所示。
2.4菌株BLCC1-0716安全性试验
采用随机无差异原则进行分组，每只小鼠经口灌胃不同浓度：5.0×108CFU/mL(低剂量组)、5.0×109CFU/mL(中剂量组)、5.0×1010CFU/mL(高剂量组)菌悬液，空白对照组灌胃等量生理盐水(CK生理盐水组)。试验期为7d，小鼠自由采食；试验期结束后，小鼠脱颈椎处死，解剖观察肝脏、脾脏、肾脏变化，分析结果如表5所示。
表5试验结束后小鼠体重及脏器系数结果
Figure BDA0003426488950000112
注：同列数据肩标字母相同或无字母标注时表示差异不显著(P>0.05)。
由表5看出，经口给予不同剂量侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716受试物7d后，各组小鼠的体重无显著性差异。试验组小鼠体态正常，肝脏、脾脏和肾脏均无肉眼可见变化，脏器系数无显著差异，表明该菌株在灌胃1亿至100亿的剂量对小鼠是安全的。以上结果说明筛选的菌株BLCC1-0716的安全性良好，适于做后续实验备选菌种。
实施例3、菌种耐受性测定
1、材料和方法
1.1菌种：本发明实施例1筛选出的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716；
1.2培养基同实施例1的LB培养基
1.3方法
1.3.1胆盐耐受性测定
取1mL 37℃摇床培养24h的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716种子液(芽孢率80％左右)至50mL液体LB培养基，加入不同体积的胆盐母液，使胆盐终浓度分别为0.1％、0.3％和0.5％，37℃培养4h，分别于0h和4h取样进行活菌计数。
1.3.2耐酸性能测定
取0.3mL 37℃摇床培养的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716种子液(芽孢率80％左右)至15mL不同pH值(2.5、3.5、4.5)的液体LB培养基，37℃培养4h，分别于0h和4h取样进行活菌计数。
1.3.3人工胃肠液耐受性测定
侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716按10％接种量接至人工胃液、肠液中，37℃180rpm培养4h，取样进行活菌计数。
人工胃液的配制：9.5％～10.5％的盐酸4.1mL，加250mL水稀释，使pH值达到2.0，加2.5g胃蛋白酶，0.2μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存待用。
人工肠液的配制：磷酸二氢钾3.4g，加250mL水溶解，用0.4％的氢氧化钠溶液调pH值至6.8，每100mL液体中加入1g胰蛋白酶，混匀后，0.2μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存待用。
1.3.4耐热性能测定
侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716种子液接种到液体LB培养基中，37℃、180rpm培养24h，镜检芽孢率达80％取样，发酵液85℃处理15min，梯度稀释进行活菌计数，计算热处理存活率。
2、结果
2.1胆盐耐受性测定
表6菌株BLCC1-0716耐胆盐存活率(％)
Figure BDA0003426488950000121
2％接种量检测菌株37℃条件下作用4h对不同浓度胆盐的耐受性，正常条件下芽孢杆菌增殖1～2个数量级。作用4h后，随着胆盐浓度的升高，存活率呈下降趋势。由表6可知，0.1％浓度的胆盐作用4小时存活率为99.87％；0.3％浓度的胆盐作用4h，存活率为73.57％；0.5％浓度的胆盐作用4h，存活率为45.00％。
2.2耐酸性能测定
表7菌株BLCC1-0716耐酸存活率(％)
Figure BDA0003426488950000131
2％接种量检测菌株37℃条件下作用4h对不同pH耐受性，正常条件(pH6.5)下芽孢杆菌增殖1～2个数量级。不同pH条件下培养4h，pH2.5条件下存活率为75.86％；pH3.5条件下存活率为97.44％；pH4.5条件下存活率为103.13％。(见表7)
2.3人工胃肠液耐受性测定
表8菌株BLCC1-0716人工胃肠液耐受性活菌数及存活率
Figure BDA0003426488950000132
10％接种量检测菌株37℃条件下作用4h对人工胃、肠液耐受性，由表8可知，菌株BLCC1-0716对人工胃液耐受性较好，作用4h存活率为120.28％；与人工肠液作用4h存活率为289.38％。
2.4耐热性能测定
表9菌株BLCC1-0716耐热性能测定
Figure BDA0003426488950000133
由表9可知，菌株BLCC1-0716在85℃水浴中处理15min存活率为98.10％。饲用芽孢杆菌大多数情况下添加到饲料中才能广泛的应用到养殖一线，制粒温度一般为85℃瞬时冷却。本发明菌株经85℃作用15min，活菌数没有明显变化，该菌株能克服市场上大多数益生菌不耐热的缺点，具有良好的市场应用前景。
实施例4、菌株BLCC1-0716对小鼠急性肠炎效果验证
1小鼠急性肠炎模型的构建
1.1材料
脂多糖LPS(大肠杆菌055型)，购自sigma公司；ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；雌性昆明小鼠40只，购自济南彭悦实验动物繁育有限公司。
1.2方法：
表10模型构建小鼠分组及处理
Figure BDA0003426488950000134
Figure BDA0003426488950000141
18g左右的昆明小鼠40只，预饲3d，体重无差异原则，随机分为4组，每组10只，分组及处理如表10所示，分组的当天记为试验的第1天，试验的第6d时腹腔注射不同浓度LPS0.1mL，观察症状，分别于注射LPS后1h、4h眼球取血测定相关指标。
检测指标：一般行为指标(小鼠表型)、腹泻率、血清细胞因子(IL-6、INF-α、IL-1β)。
1.3结果
1.3.1小鼠注射LPS后不同时间段腹泻率变化情况
表11不同组别小鼠LPS处理后腹泻率变化
Figure BDA0003426488950000142
注射不同剂量LPS后，小鼠表观症状明显，注射LPS后1h各组均有小鼠表现腹泻症状，低剂量组(I组)、中剂量组(II组)、高剂量组(III组)腹泻率分别为10％、40％、60％，行动懒怠，以高剂量组(III组)尤为明显，腹部收缩；注射LPS后4h各组小鼠均腹泻，精神不济，其中高剂量组(III组)体温均降低，濒临死亡。
1.3.2小鼠注射LPS后不同时间段血清细胞因子变化
分别于注射LPS后1h、4h眼球取血，3000rpm离心10min，小心吸取血清，ELISA试剂盒测定注射LPS不同时间后血清中白介素IL-6、IL-1β及肿瘤坏死因子TNF-α水平变化，结果如下表所示:
表12不同组别小鼠LPS处理后1h、4h血清细胞因子水平变化(pg/mL)
Figure BDA0003426488950000143
注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)；肩标字母相同或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
如表12所示，注射LPS后1h，与空白组相比，I、II组血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高。与空白组相比，I组IL-6、IL-1β、TNF-α水平分别比空白组高0.93％、16.24％、5.18％，但差异均不显著(P>0.05)；II组IL-1β、TNF-α水平显著高于空白组(P<0.05)，IL-6水平较空白组高13.52％，差异不显著(P>0.05)；III组TNF-α水平显著高于空白组(P<0.05)，且随着LPS注射剂量的升高，TNF-α水平升高，但该组IL-6、IL-1β水平与空白组相比略低或者差异不显著。
注射LPS后4h，与空白组相比，注射LPS组(I、II、III)血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高，I组IL-6、IL-1β、TNF-α水平分别比空白组高4.57％、11.02％、4.52％，但差异均不显著(P>0.05)；II组IL-6、IL-1β、TNF-α水平分别比空白组高3.32％、19.31％、3.67％，其中IL-1β水平显著高于空白组(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平与空白组差异不显著(P>0.05)；III组血清促炎症相关因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均显著高于空白组(P<0.05)。
小结：小鼠腹腔注射不同浓度(5～20mg/kg)LPS后在1～4h范围内均可出现呆卧、精神萎靡、腹泻等症状，一般行为观察与文献报道一致(谭娅,甘麦邻,范源,王婧,张雄,黄波,朱砺,尚以顺,史开志.金荞麦对脂多糖诱导小鼠小肠炎症的保护作用[J].中国畜牧兽医,2020,47(02):597-604)，且血清促炎因子水平有随着LPS注射剂量加大而升高的趋势，且LPS 10mg/kg注射剂量构建小鼠肠炎模型表型适中，血清促炎症因子水平稳定，本研究暂定小鼠腹腔注射LPS 10mg/kg注射剂量构建小鼠肠炎模型。
2菌株BLCC1-0716对小鼠急性肠炎功效评价
2.1材料
小鼠品类、购买途径及LPS、ELISA试剂盒同实施例4的1.1部分。
2.2方法
80只18g左右的雌性昆明小鼠预饲3天，随机分为8组，分别为空白组(CK组)，LPS组(模型组)，菌株BLCC1-0716处理组(剂量分别为3×106CFU/只、3×107CFU/只、3×108CFU/只)，各组处理如表13所示，期间自由饮水，每3d称一次体重，各组灌胃处理12d后，CK、Y11、Y12、Y13组一次性腹腔注射生理盐水0.1mL，LPS、Y11P、Y12P、Y13P组一次性腹腔注射10mg/kg剂量LPS(0.1mL)，观察4h，取样测定以下指标。
表13分组及各组处理情况
Figure BDA0003426488950000151
检测指标：一般行为指标(腹泻率、失重、精神、被毛状态)、血清细胞因子(IL-6、INF-α、IL-1β、IL-10)及肠道菌群(大肠杆菌、乳酸菌)变化。
2.3结果
2.3.1处理期间小鼠体重变化
表14处理期间小鼠体重变化
Figure BDA0003426488950000161
如表14所示，各处理组小鼠体重变化无显著差异，至处理结束时各组小鼠体重差异不显著。
2.3.2小鼠腹泻率情况
表15各处理组小鼠腹泻情况
Figure BDA0003426488950000162
如表15所示，注射生理盐水组(CK、Y11、Y12、Y13组)均没有发生腹泻，注射LPS组(LPS、Y11P、Y12P、Y13P组)均发生腹泻，注射LPS同时灌胃侧孢短芽孢杆菌的处理组Y11P、Y12P、Y13P组的腹泻率(70％～80％)均低于模型组(90％)，说明灌胃侧孢短芽孢杆菌具有缓解小鼠腹泻的作用，且以107CFU/只剂量效果较好。
2.3.3各组小鼠血清细胞因子水平变化
各组小鼠注射LPS后4h眼球取血3000rpm离心10min，小心吸取血清，ELISA试剂盒测定血液中促炎因子白介素IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子TNF-α及抑炎因子IL-10水平变化，结果如表16所示：
表16不同组别小鼠血清细胞因子水平(pg/mL)
Figure BDA0003426488950000171
注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
由表16可知，模型组小鼠血清细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-10水平均高于空白组，说明腹腔注射10mg/kg剂量LPS可以引起小鼠血清促炎因子及抑炎因子水平升高，LPS模型构建成功。
Y11P、Y12P、Y13P组的IL-6水平均低于模型组，但差异不显著(P>0.05)，其中Y11P组的IL-6水平最低，为82.30pg/mL，比模型组低5.89％，但差异不显著(P>0.05)；血清细胞因子IL-1β水平，除模型组外，Y11P、Y12P、Y13P组间差异均不显著，其中Y13P组IL-1β水平最低，为93.51pg/mL，比模型组低6.49％，但差异不显著(P>0.05)；在各LPS处理组中血清细胞因子TNF-α水平以Y11P组最低，为661.56pg/mL，比模型组低9.88％，差异显著(P<0.05)，Y12P组及Y13P组TNF-α水平分别比模型组低6.78％、6.35％，但差异均不显著(P>0.05)。
LPS为革兰氏阴性菌的主要成分，是介导***性炎症反应综合症的主要启动因子。在灌胃不同剂量侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716均能一定程度上降低血清细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，其发挥抑制炎症的作用可能是通过下调TNF-α、IL-6和IL-1β的水平来抑制炎症的产生。
在各LPS处理组中，Y12P组血清细胞因子IL-10水平最高，为282.17pg/mL，比模型组高1.43％，比空白组的269.76pg/mL高4.60％，且差异显著，说明灌胃3×107CFU/只的侧孢短芽孢杆菌，可以在一定程度上缓解腹腔注射10mg/kg剂量LPS引起的小鼠炎症。IL-10是一种多能干细胞因子，IL-10在炎症通路上是抑制炎症发展的重要调节因子，在炎症性肠病患者中，可以检测到IL-10的表达水平超出正常。本研究注射LPS后各组小鼠血清IL-10水平均高于空白组，说明各组小鼠均启动自身抑制炎症***，以灌胃3×107CFU/只剂量组小鼠IL-10水平最高，这也与之前测定的本组小鼠腹泻率最低相吻合。
如上可知，灌胃不同浓度侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716能够降低腹腔注射10mg/kg剂量LPS引起的小鼠血清细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平、并提升抑制炎性因子IL-10的水平，因此推测BLCC1-0716可通过这两条途径来抑制炎症产生和缓解炎症。综合表观及血清指标，采用灌胃发酵液3×106或3×107CFU/只小鼠作为腹腔注射LPS炎症模型的预防保护剂量。
2.3.4各组小鼠肠道内容物菌群变化
表17不同组别小鼠上消化道内容物菌群分析
Figure BDA0003426488950000181
注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
各组小鼠上消化道菌群变化如表17所示。其中，针对乳酸菌，以灌胃Y11组最高，与空白组相当，与模型组差异显著(P<0.05)；Y12、Y13组均低于Y12P、Y13P组，可能是因为LPS引起小鼠肠道菌群失调，灌胃的残量芽孢杆菌消耗上消化道中的氧，促进兼性厌氧菌乳酸菌的增殖；Y11P、Y12P、Y13P组肠道乳酸菌数量均高于模型组，说明灌胃芽孢杆菌可以促进注射LPS后小鼠肠道菌群失调环境下乳酸菌的增殖。针对大肠杆菌，消化道内容物中大肠杆菌的数量Y11、Y11P、Y12、Y12P、Y13、Y13P组均显著低于模型组(LPS组)，其中以Y12组最低，且显著低于模型组(P<0.05)。针对金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌数量以空白组最低，为2.8×104CFU/g，以模型组56.5×104CFU/g最高；Y12、Y12P组金黄色葡萄球菌数量较少，且两组间差异不显著(P>0.05)。
综合来看，灌胃不同浓度的侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716发酵液能够起到缓解小鼠腹腔注射LPS引起的上消化道菌群紊乱的功效，可提高兼性厌氧菌乳酸菌的数量，降低肠道病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的数量，且以灌胃3×107CFU/只效果较好。
灌胃不同浓度侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716发酵液在一定程度上可以缓解腹腔注射10mg/kg剂量LPS引起的小鼠炎症，综合表观症状、肠道菌群及血清指标，后续试验采用灌胃发酵液3×107CFU/只小鼠作为腹腔注射LPS炎症模型的预防保护剂量。
实施例5、菌株BLCC1-0716对小鼠溃疡型肠炎功效评价
1小鼠溃疡型肠炎(UC)模型构建
1.1试验材料
小鼠品类、购买途径同实施例4的1.1部分。
葡聚糖硫酸钠(DSS)购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，MW:36000～50000
1.2方法
30只18g左右的雌性昆明小白鼠，饲喂基础饲料，自由饮水，适应性饲养1周后，随机分为空白组(CK组)、3％DSS自由饮用组、5％DSS自由饮用组。空白组小鼠自由饮水；3％DSS组小鼠自由饮用3％DSS水溶液，5％DSS组小鼠自由饮用5％DSS水溶液，分组及处理情况见表18。连续饲喂9d，第9天晚上对小鼠进行断粮不断水处理。造模期间每日观察小鼠的一般状况、体重、粪便性状和隐血情况。第10天早上脱颈椎处死小鼠，分离结肠，肉眼观察病变情况，测量结肠长度。
表18小鼠不同分组及处理
Figure BDA0003426488950000191
1.3结果
1.3.1小鼠粪便及便血情况
造模实验共进行9天。3％DSS组和5％DSS组小鼠每天分别饮用约600mL DSS水溶液。试验期间，小鼠精神状态正常，未出现死亡。其中，第4天开始，3％DSS组和5％DSS组小鼠，个别出现软便(见表19)。试验结束时，试验组均出现软便和便血情况(图6)，说明小鼠出现急性结肠炎症状。
表19小鼠粪便及便血情况统计
Figure BDA0003426488950000192
1.3.2小鼠体重情况
造模期间，空白组小鼠体重增加。3％DSS组小鼠体重呈现先增加后减少的趋势，在第9天出现体重下降，但与空白组差异不显著(P>0.05)(见表20)。5％DSS组小鼠在第7天体重开始下降，且第8天、第9天显著低于空白组(P＜0.05)(图5)。
表20小鼠每日体重指标
Figure BDA0003426488950000201
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
1.3.3小鼠结肠特征
结肠萎缩是溃疡性结肠炎的一个重要病理特征。本研究发现，3％DSS组和5％DSS组小鼠结肠均有不同程度的萎缩，与空白组比较均明显缩短(P＜0.05)(图7)。其中，空白组小鼠结肠长度最长，为10.03cm；5％DSS组结肠最短，为7.70cm；3％DSS组小鼠结肠为8.62cm(表21)。
表21小鼠结肠长度统计
Figure BDA0003426488950000202
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
综合小鼠体重、粪便特征及结肠性状，3％DSS组和5％DSS组小鼠均出现溃疡型结肠炎症状，说明小鼠UC模型构建成功，其中5％DSS组小鼠急性结肠炎症症状更明显，后期选用5％DSS开展菌株的动物体内效果评价试验。
2菌株BLCC1-0716对小鼠溃疡型肠炎功效评价
2.1材料
小鼠品类购买途径及DSS同实施例5的1.1部分。
2.2方法
30只18g左右的雌性昆明小白鼠，饲喂基础饲料，适应性喂养3天。随机分为CK组、UC模型组，BLCC1-0716组。从分组开始，试验前7天，每天灌胃200μL1.5×108CFU/mL BLCC1-0716菌液，CK组(空白组)和UC模型组每天灌胃200μL生理盐水，期间各组小鼠自由饮水。从第8天开始，空白组每天灌胃200μL生理盐水，自由饮水，模型组每天灌胃200μL生理盐水，自由饮用5％DSS水溶液，BLCC1-0716菌株组在灌胃200μL菌液的同时自由饮用5％DSS水溶液，为期10d(见表22)。试验期间每日观察小鼠的一般状况、体重、粪便性状和隐血情况。试验结束后，脱颈椎处死小鼠，眼球取血，分离结肠，肉眼观察病变情况，测量结肠长度。
表22试验分组及处理
Figure BDA0003426488950000211
表23 DAI评分标准
Figure BDA0003426488950000212
2.3结果
2.3.1小鼠体重变化
在生长过程中，体重持续上升是正常趋势，体重有下降波动，则可能是小鼠受到外界物质刺激，导致自身出现免疫反应所致。试验过程中，除CK组小鼠自由饮水外，其余各试验组小鼠自第8d开始自由饮用5％DSS水溶液，至试验结束时小鼠体重变化如图8所示。
试验小鼠每天称量一次体重，记录其体重变化。CK组小鼠在整个试验期间由于没有DSS的诱导刺激，该组小鼠体重持续上升。饮用DSS期间，UC模型组、BLCC1-0716组小鼠体重先增加后减少的趋势，在饮用第5天后，UC模型组、BLCC1-0716组小鼠体重呈下降趋势。试验结束时，UC模型组小鼠体重下降最显著，与空白组对比，下降了3.56g，且差异显著(P<0.05)，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716组小鼠与空白组相比体重下降1.58g，差异不显著(P>0.05)。从试验结果可以看出，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716具有抑制自由饮用DSS引起的小鼠体重减轻的功效。
2.3.2小鼠结肠长度变化情况
试验结束后脱颈椎处死解剖小鼠，取出完整结肠，去除残留粪便，测量结肠长度。
表24小鼠结肠长度
Figure BDA0003426488950000213
注：不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
除CK组结肠组织完好，肠腔内粪便成型，BLCC1-0716组和UC模型组均出现出血，肠腔内粪便减少，CK组结肠最长为11.03cm，UC模型组结肠长度为7.81cm，比空白组短3.22cm，BLCC1-0716组结肠长度为9.58cm，比UC模型组长1.77cm，且差异显著(P<0.05)。正常小鼠的结肠长度为10-11cm，而UC模型组明显缩短了小鼠的结肠长度到7.8cm左右，可能是DSS的诱导导致小鼠产生了炎症。相比于UC模型组，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716加长了结肠长度，与UC模型组相比，侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716组小鼠结肠长度提高了22.66％。本试验结果表明侧孢短芽孢杆菌可以调控DSS诱导的小鼠结肠长度。
2.3.3小鼠结肠炎疾病活动指数(DAI)
试验结束时对小鼠粪便进行DAI评分。结果如表25所示，评分标准见表23。
表25小鼠DAI评分
Figure BDA0003426488950000221
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
从表25看出，空白组小鼠的DAI评分基本维持在0.25左右，没有什么变化，其它各组小鼠由于葡聚糖硫酸钠(DSS)的诱导，出现大便松散，粪便上出现褐红色血迹，倦卧懒动，并随着造模时间的延长小鼠体重持续下降，大便不成形，且粘附于***，出现肉眼可见血便，DAI评分较高。粪便DAI评分BLCC1-0716组比UC模型组低26.95％，说明侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716对自用饮用DSS导致的小鼠结肠炎有一定的治疗作用。
2.3.4血清细胞因子水平变化
各组小鼠自用饮用DSS 10d眼球取血，ELISA试剂盒测定各炎症因子水平，结果如表26所示。
表26各组小鼠自由饮用DSS后血清细胞因子水平变化(pg/mL)
Figure BDA0003426488950000222
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
小鼠自由饮用DSS处理10d后，立即眼球取血，血清细胞因子IL-1β水平以UC模型组最高，为67.41pg/mL，比空白组高12.41％，但差异不显著(P>0.05)；BLCC1-0716组比UC模型组低3.04％，但差异不显著(P>0.05)；血清TNF-α水平以UC模型组最高，为400.41pg/mL，显著高于空白组(p<0.05)，BLCC1-0716组为360.15pg/mL，比UC模型组低10.05％，但差异不显著(P>0.05)；血清IL-6水平以空白组最低，显著低于UC模型组的80.20pg/mL(p<0.05)，BLCC1-0716组为68.49pg/mL，显著低于UC模型组(p<0.05)；血清IL-10水平以BLCC1-0716组最高，为197.11pg/mL，比UC模型组高3.11％，但差异不显著(P>0.05)。
2.3.5小鼠结肠组织观察
各组小鼠均取结肠相同部位进行组织切片，观察结果如图9所示。
如图9中所示，空白组小鼠结肠壁清晰，肠绒毛结构完整，轮廓清晰，排列整齐、尖锐，腺体结构完整，排列整齐，隐窝正常，无炎细胞浸润。UC模型组小鼠结肠上皮坏死脱落，肠壁变薄，肠腺结构严重破坏、腺体凌乱，肠绒毛断裂、缺失严重，仅剩下黏膜肌层，黏膜肌层间质水肿。BLCC1-0716组较模型组具有特别明显的改善，表现为肠壁清晰、绒毛结构基本完整，轮廓基本清晰，排列相对整齐，腺体结构基本完整，排列基本整齐，隐窝正常，炎细胞浸润少，但逊色于空白对照组。
实施例6、菌株BLCC1-0716对小鼠溃疡型肠炎功效的对比评价
1材料
小鼠品类购买途径及DSS同实施例5的1.1部分。
菌株：BLCC1-0716及同批次筛选的体外抑菌性能相对较好的菌株JYH-Y3。
2方法
40只18g左右的雌性昆明小白鼠，饲喂基础饲料，适应性喂养3天。随机分为CK组、UC模型组，JYH-Y3、BLCC1-0716组，分组及处理情况见表27，试验方法及处理同实施例5的2.2部分。试验期间每日观察小鼠的一般状况、体重、粪便性状和隐血情况。试验结束后，脱颈椎处死小鼠，眼球取血，分离结肠，肉眼观察病变情况，测量结肠长度。
表27试验分组及处理
Figure BDA0003426488950000231
3结果
3.1小鼠体重变化
试验过程中，除CK组小鼠自由饮水外，其余各试验组小鼠自第8d开始自由饮用5％DSS水溶液，至试验结束时共处理10d，小鼠体重变化如图10所示。
试验小鼠每天称量一次体重，记录其体重变化。空白组小鼠在整个试验期间由于没有DSS的诱导刺激，该组小鼠体重持续上升。饮用DSS期间，UC模型组、JYH-Y3组、BLCC1-0716组小鼠体重先增加后减少的趋势，在饮用第5天后，UC模型组、JYH-Y3组、BLCC1-0716组小鼠体重呈下降趋势。至试验结束时，空白组、UC模型组、JYH-Y3及BLCC1-0716组小鼠终体重分别为33.37g、28.99g、31.11g及32.09g。UC模型组小鼠体重下降最显著，与空白组对比，下降了4.38g，差异显著(P<0.05)。JYH-Y3组与侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716组小鼠与空白组相比体重分别下降2.26、1.28g，差异均不显著(P>0.05)，但BLCC1-0716组体重下降小于JYH-Y3组。从试验结果可以看出，菌株JYH-Y3与BLCC1-0716均具有抑制自由饮用DSS引起的小鼠体重减轻的功效，且侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716效果优于JYH-Y3。
3.2小鼠结肠长度变化情况
试验结束后脱颈椎处死解剖小鼠，取出完整结肠，去除残留粪便，测量结肠长度，结果如图11所示。空白对照CK组小鼠肠道呈肉粉色，有健康光泽，粪便呈现颗粒状。经DSS诱导，模型组小鼠粪便不成形，部分小鼠出现血便。结肠长度变短，充血，结肠壁增厚，生成溃疡面等都会使结肠长度缩短，因此，结肠长度被认为与肠炎病情严重程度呈负相关。BLCC1-0716组和JYH-Y3组结肠长度均长于UC模型组，且BLCC1-0716组效果最为明显，该组小鼠结肠长度显著优于JYH-Y3组(P<0.05)，同时，BLCC1-0716组小鼠结肠红肿现象减轻，无明显的结肠充血现象，粪便形态改善明显，粪便呈现颗粒状。结果表明侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716可以调控DSS诱导的小鼠结肠长度，且效果显著优于JYH-Y3。
3.3小鼠结肠组织观察
各组小鼠均取结肠相同部位进行组织切片，观察结果如图12所示。
如图12所示，空白组(CK组)小鼠结肠肠绒毛结构完整，腺体结构完整，黏膜上皮细胞排列整齐，隐窝正常，黏膜下层无水肿现象，未见炎性细胞浸润。UC模型组小鼠结肠绒毛断裂，腺结构破坏、腺体凌乱、缺失严重，小鼠结肠呈现明显的炎症反应，中性粒细胞、淋巴细胞等炎细胞浸润严重。与UC模型组相比，JYH-Y3、BLCC1-0716组炎性细胞浸润明显减少，说明JYH-Y3、BLCC1-0716均具有一定的抗炎功效，尤其BLCC1-0716组几乎未见无明显的炎性细胞浸润，并且无明显结构损伤，结构完整、轮廓清晰，与2.2部分试验结果表现出一致性。结果表明金银花内生菌BLCC1-0716、JYH-Y3均具有改善DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎引起的肠粘膜损伤、保护肠道的作用，但BLCC1-0716的效果更显著，且明显优于JYH-Y3。
从以上试验结果可看出金银花内生菌侧孢短芽孢杆菌BLCC1-0716是非常优秀的益生菌株，不仅抑菌谱较广、抑菌性能稳定，且耐受性较好，进入动物肠道后能够缓解动物肠道炎症，保护肠道，提高动物抗病能力且饲喂安全。本发明筛选到的性能优越的侧孢短芽孢杆菌，为目前养殖动物饲用抗生素禁抗替代品提供更多选择，从而保护生态环境，保障动物源性食品安全。为畜牧养殖业实现优质、高产、高效提供技术支撑，有利于控制抗生素残留，实现无药残养殖的标准化、规范化、集约化，将会获得更高的经济效益和社会效益。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司
<120> 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用
<130> 202127939
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1443
<212> DNA
<213> 侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus）BLCC1-0716
<400> 1
ggccgtggcg gctgctatac atgcaagtcg agcgagggtc ttcggaccct agcggcggac 60
gggtgagtaa cacgtaggca acctgcctgt gagactggga taacataggg aaacttatgc 120
taataccgga tagggttttg cttcgcctga agcgaaacgg aaagatggcg caagctatca 180
cttacagatg ggcctgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac 240
gatgcgtagc cgacctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaattttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc 360
cgcgtgaacg atgaaggctt tcgggtcgta aagttctgtt gttagggaag aaacagtgct 420
atttaaataa ggtagcacct tgacggtacc taacgagaaa gccacggcta actacgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg 540
cgcaggtggc tatgtaagtc tgatgttaaa gcccgaggct caacctcggt tcgcattgga 600
aactgtgtag cttgagtgca ggagaggaaa gtggtattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggcctgtaac tgacactgag 720
gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctagg tgttaggggt ttcaataccc ttagtgccgc agctaacgca ataagcactc 840
cgcctgggga gtacgctcgc aagagtgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
cactgaccgc tctagagata gagcttccct tcggggcagt ggtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1080
tttagttgcc agcattcagt tgggcactct agagagactg ccgtcgacaa gacggaggaa 1140
ggcggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200
ggttggtaca acgggatgct acttcgcgag aagatgctaa tctcttaaaa ccaatctcag 1260
ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgggagt 1380
ttgcaacacc cgaagtcggt gaggtaaccg taaggagcca gccgccgaag gtggttgttt 1440
gct 1443

Claims (11)

1.一株侧孢短芽孢杆菌，其命名为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus）BLCC1-0716，该菌已于2021年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 20211397。
2.权利要求1中所述的侧孢短芽孢杆菌在制备抗炎药品或饲料添加剂中的应用。
3.权利要求1中所述的侧孢短芽孢杆菌在制备防治腹泻的药品或饲料添加剂中的应用。
4.权利要求1中所述的侧孢短芽孢杆菌在制备防治肠炎的药品或饲料添加剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肠炎为病原菌导致的肠炎或非病原菌导致的肠炎。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非病原菌导致的肠炎选自急性肠炎和溃疡型肠炎。
7.权利要求1中所述的侧孢短芽孢杆菌在制备调整消化道菌群的药品或饲料添加剂中的应用。
8.权利要求1中所述的侧孢短芽孢杆菌在制备防治结肠萎缩的药品或饲料添加剂中的应用。
9.权利要求1中所述的侧孢短芽孢杆菌在制备保护肠道的药品或饲料添加剂中的应用。
10.一种菌剂或饲料，其包含权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌。
11.一种药物组合物或药物制剂，其包含权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌。
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