KR102027758B1 - 약독화된 돼지 인플루엔자 백신 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

약독화된 돼지 인플루엔자 백신 및 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약독화된 돼지 인플루엔자 균주, 특히 역 유전학 접근법을 통해 제조된 것, 이를 포함하는 조성물, 및 이에 제조 방법 및 용도를 제공한다. 약독화된 균주는 상응하는 맹독성 모체 바이러스에 의해 인코딩되는 HA 단백질에 대해, 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 HA 단백질을 인코딩하도록 조작된다. 대안적으로는, 약독화된 인플루엔자 균주가 투여될 수 있다.

Description

약독화된 돼지 인플루엔자 백신 및 이의 제조 방법 및 용도 {ATTENUATED SWINE INFLUENZA VACCINES AND METHODS OF MAKING AND USE THEREOF}
인용참조
본 출원은 2012 년 7 월 17 일에 출원되고, 그 전체가 본원에 참조로서 인용된 가출원 USSN 61/672,398 에 대한 우선권을 청구한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 약독화된 바이러스 백신, 특히 돼지 인플루엔자에 의해 야기되는 감염/질환에 대항하여 돼지에 대한 폭넓은, 안전한 그리고 효과적인 보호를 제공하는 약독화된 바이러스 백신에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 약독화된 바이러스의 제조 방법, 및 약독화된 바이러스의 감소된 맹독성과 연관된 핵산 변형의 확인에 관한 것이다.
본 발명은 따라서 본 발명의 바이러스; 예를 들어, 생 약독화된 바이러스를 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 바이러스는 또한 조성물에서 불활성화될 수 있으나; 바이러스는 생 약독화된 돼지 인플루엔자인 것이 유리할 수 있다. 본 발명은 그러므로 추가로 이러한 조성물을 제조 및/또는 제형화하기 위한 방법; 예를 들어, 적합한 배지 상에서 또는 내에서 바이러스를 배양 또는 성장 또는 증식시키고, 바이러스를 수확하고, 임의로 바이러스를 불활성화시키고, 및 임의로 적합한 수의학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 비히클 및/또는 아쥬반트 및/또는 안정화제와 혼련시키는 방법에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 또한 이러한 조성물의 제형화에서의 바이러스의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 바이러스 유입을 매개하는 헤마글루티닌 (HA) 에 대항하는 숙주 체액성 면역력을 회피하는 다수의 메카니즘을 가지고 있다. 게놈 분절의 재배열은 항원적 이동을 야기할 수 있는 반면, 돌연변이의 점차적인 축척은 유전적 부동을 초래한다 (Desselberger U, et al. 1978, Schild G, et al. 1974). 돌연변이체 HA 를 인지하는 이미 존재하는 항체에 대한 능력에 영향을 줄 수 있는 HA 의 항원 에피토프 중의 돌연변이 외에, HA 의 N-연결된 글리코실화 중의 돌연변이는 HA 를 둘러싸는 올리고당 층을 변경시킴으로써 항체 인지의 바이러스 회피를 촉진시킬 수 있다 (Schulze IT, 1997). 글리칸 잔기는 일부 항체의 이들의 에피토프에 대한 결합을 제한하여, 글리칸 차폐로서 알려진 현상에서 항체 인지 및 면역원성의 상실을 초래할 수 있다 (Wanzeck K, et al. 2011, Wei C-J, et al. 2010). 부가적으로, 돌연변이 및 유전적 부동은 우선적으로 글리칸에 의해 보호되지 않은 HA 구형 헤드 내의 위치에서 일어난다 (Das SR, et al. 2010). 글리칸 잔기는 또한 수용체 결합에 영향을 주고, 그 결과 바이러스 복제 동역학에 영향을 줄 수 있다.
인플루엔자 바이러스의 진화는 종종 글리코실화 부위의 수 및 위치의 개질을 포함한다 (Long J, et al. 2011). H3N2 바이러스의 경우, 글리코실화 부위의 수가 지난 40 년에 걸쳐 2 에서 10 으로 증가하였다 (4). 그러나, 증가하는 글리코실화 HA 는 마우스에서 감소된 맹독성 및 감소된 바이러스 체력과 상관성이 있다 (Das SR, et al. 2011, Vigerust DJ, et al. 2007). 증가하는 글리코실화가 HA 를 항체 중화로부터 차폐시킬 수 있는 동안, 세포 수용체에 대한 바이러스 친화성은 당연히 감소된다 (Abe Y, et al. 2004, Das SR, et al. 2011). 또한, HA 또는 뉴라미니다아제 (NA) 내의 상보적 돌연변이는 수용체 결합과 방출 활성 사이의 균형에 필요하다 (Wagner R, et al. 2000). NA 내의 상기 상보적 돌연변이는 NA 억제제에 대한 자연적 저항성의 획득과 연관된다 (Hensley SE, et al. 2011).
돼지 인플루엔자 바이러스의 수 많은 유전적 및 항원적으로 구별되는 계통이, β, γ 및 δ-클러스터 H1N1 및 H1N2 바이러스 뿐 아니라, H3N2 서브유형을 비롯하여 돼지에서 동시에 순환한다 (Lorusso A, et al. 2012). δ-클러스터는 본래 2 개의 서브클래스 (δ-I 및 δ-II) 로 다시 나뉘었지만, 더욱 최근의 연구는 3 개 이상의 항원적으로 구별되는 그룹을 나타내는 5 개의 구별되는 유전적 서브클러스터 (δ-A, δ-B, δ-C, δ-D, δ-E) 를 입증하였다 (Hause BM, et al. 2011, Vincent AL, et al. 2009).
백신 균주가 필드 유발 바이러스에 부합하는 경우 치사된 바이러스 백신이 효과적이지만, 인플루엔자의 빠른 돌연변이 속도는 백신 균주와 순환하는 바이러스 사이의 유전적 및 항원적 부합을 확보하도록 잦은 균주 변화를 필요로 한다. 부가적으로, 돼지 내를 함께 순환하는 복합 서브유형 및 계통이 각 유형의 대표를 포함하기 위해 5 개 이상의 백신 균주를 필요로 한다. 광범위한 스펙트럼 면역력을 도출하는 단일 생 백신은 돼지 건강 프로그램에서 상당한 향상을 제공한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 약독화된 백신 뿐 아니라, 돼지 인플루엔자에 의한 감염의 치료 및 예방을 위한 방법을 제공하는 것이다.
하나의 구현예에서, 백신은 그들의 모체 균주에 대해 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 HA 유전자를 발현하도록 개질된, 약독화된 인플루엔자 바이러스를 포함한다.
특정한 구현예에서, HA 유전자 및/또는 유전자 생성물은 SEQ ID NO:17 및 21; SEQ ID NO:17 및 23; SEQ ID NO:18 및 22; 또는 SEQ ID NO:18 및 24 사이에 존재하는 것과 동일한 개질을 갖는다. 또다른 구현예에서, HA 유전자 및/또는 유전자 생성물은 5 개의 개질 중 1 개 이상을 갖는다. 보다 특정한 구현예에서, HA 유전자 및/또는 유전자 생성물은 4 또는 5 개의 개질을 가져, 모체 HA 유전자 생성물에 대해, +4 및 +5 글리코실화 부위를 야기한다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 약독화된 인플루엔자를 제조하기 위해 역 유전학 시스템에서 사용하기 위한 cDNA 및/또는 플라스미드를 제공하는 것이다. 하나의 구현예에서, cDNA 및/또는 플라스미드 중 하나 이상은 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열에 대해 증가된 수의 글리코실화 부위를 갖는 HA 서열을 포함한다.
특정한 구현예에서, HA 서열은 SEQ ID NO:21 또는 23 에 언급된 바와 같다.
본 발명은 추가로 안전하고, 효과적이고, 폭넓은 보호성 면역력을 제공하는, 인플루엔자의 신규한 약독화된 균주에 관한 것이다. 모체 인플루엔자 균주에 대해, 약독화된 균주는 그들의 HA 유전자에 의해 인코딩되는 부가적인 글리코실화 부위 및/또는 추정 글리코실화 부위를 가질 수 있으며, 그의 존재는 감소된 맹독성과 연관된다.
따라서, 본 발명은 모체 바이러스에 대해, 돌연변이체 바이러스가 약독화되도록 하는 야생형/모체 바이러스에 대해 하나 이상의 핵산 서열 중에 돌연변이(들) 를 포함하는 돌연변이체 바이러스를 제공하며, 상기 모체 바이러스는 야생형 HA 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에 정의된 바와 같이, "야생형" HA 단백질은 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열에 대해 동일한 수의 글리코실화 부위 및/또는 추정 글리코실화 부위를 갖는 단백질이다.
특정한 구현예에서, 돌연변이체 바이러스는 각각 SEQ ID NO:22 또는 24 에 언급된 펩티드에 대해 인코딩하고, 맹독성 야생형/모체 바이러스에 대해, 돌연변이체 바이러스가 약독화된/비-맹독성이 되도록 하는, SEQ ID NO:21 또는 23 에 언급된 DNA 서열에 상응하는 (즉, 역 상보적이고, 티미딘 대신에 우라실을 가짐) vRNA 핵산 서열을 포함한다.
본원에 정의된, 용어 "유전자" 는 광범위하게 사용될 것이고, 코딩 및 비-코딩 서열 (즉, 업스트림 및 다운스트림 조절 서열, 프로모터, 5'/3' UTR, 인트론, 및 엑손) 모두를 포함할 것이다. 오직 유전자의 코딩 서열에 대한 참조만이 의도될 때에는, 용어 "유전자의 코딩 서열" 또는 "CDS" 는 본 명세서 전체에서 상호교환적으로 사용될 것이다. 특정 핵산, 예를 들어 SEQ ID NO:17 에 언급된 서열 (모체 바이러스 cRNA "센스" 가닥의 DNA 서열 단량체) 이 논의되는 경우, 당업자는 해당 서열의 모든 유도가능한 형태 (mRNA, vRNA, cRNA, DNA, 단백질, 등) 를 즉시 보유할 것이다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스는 음성 단일 가닥 RNA 바이러스 (ssRNA) 이다. 복제를 위해서는, 이의 음성 ssRNA (본원에 "vRNA" 로서 정의됨) 가 양성 또는 센스 RNA (본원에 "cRNA" 로서 정의됨) 로 전사되어야만 한다. 숙주 세포 조직계는 cRNA 를 사용하여 바이러스 단백질 및 vRNA 를 제조하기 위해 가담된다. 잘-공지된 유전 코드를 사용하는 당업자는 DNA 서열로부터 vRNA, cRNA, 및 펩티드 서열을 통상적으로 유도할 수 있다.
특정한 구현예에서, 약독화된 백신은 아쥬반트를 포함한다. 아쥬반트는 약독화된 백신 단독과 비교하여 도출된 면역 반응을 증가 및/또는 증폭하는 임의의 성분일 수 있다. 키토산 및 이의 유도체를 포함하는 점막 아쥬반트가 기재된 경구 약독화된 백신에 특히 유용하다.
본 발명은 추가로 약독화된 바이러스, 또는 약독화된 바이러스를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자에 대항하는 면역학적 (또는 면역원성) 또는 보호적 반응을 유도하기 위한 방법 뿐 아니라, 인플루엔자, 또는 인플루엔자에 의해 야기되는 질환 상태(들) 을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
적어도 약독화된 인플루엔자 균주 및 사용 지침을 포함하는 키트가 또한 제공된다.
상기 및 기타 구현예가 기재되고, 하기 상세한 설명으로부터 명백하고 이에 의해 포함된다.
당업자에게 본 발명의 최상의 방식을 비롯하여 본 발명의 완전하고 가능한 설명이 첨부되는 도면에 대한 참조를 포함한 명세서의 나머지에 더욱 상세히 설명된다:
도 1 은 역 유전학을 사용하여 생성되는 바이러스의 유전자형을 나타내고;
도 2 는 SEQ ID NO:18 (모체 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질) 과 SEQ ID NO:22 (n+5 글리코실화 돌연변이체의 HA 단백질) 사이의 아미노산 정렬이고;
도 3 은 모체에 대해, 그들의 HA 유전자 내에 1 내지 5 개의 부가적인 글리코실화 부위를 가지고 있는 모체 및 글리코실화 돌연변이체 인플루엔자 바이러스의 배양된 세포에서의 성장 그래프이고;
도 4 는 본 발명의 서열 (SEQ ID) 목록의 표이다.
본 발명은 미생물, 예컨대 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 생성물 (예를 들어, 단백질, 항원, 면역원, 에피토프) 의 약독화에 관여하는 뉴클레오티드 서열 및 유전자, 이러한 뉴클레오티드 서열, 생성물, 미생물의 제조 방법, 및 이의 용도, 예컨대 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 또는 면역학적 또는 면역 반응을 도출하기 위한 용도 또는 벡터로서, 예를 들어, 발현 벡터 (예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내 발현 벡터) 로서의 용도를 제공한다.
미생물의 뉴클레오티드 서열 및 유전자 내로 도입된 돌연변이는 신규하고 절묘한 (nonobvious) 약독화된 돌연변이체를 생성한다. 상기 돌연변이체는 고도의 면역원성을 가진 생 약화된 면역원성 조성물 또는 생 약독화된 백신의 제조에 유용하다.
돌연변이의 확인은 신규하고 절묘한 뉴클레오티드 서열 및 유전자 뿐 아니라, 뉴클레오티드 서열 및 유전자에 의해 인코딩된 신규하고 절묘한 유전자 생성물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 또는 인플루엔자에 의해 야기되는 질병에 대항하는 돼지에서의 안전하고 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있는 약화된 과잉글리코실화리코실화 돼지 인플루엔자 균주를 제공한다. 하나의 구현예에서, 균주는 맹독성 모체 균주에 대해 1 개 이상의 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 HA 유전자를 인코딩할 수 있다.
또다른 구현예에서, 약독화된 균주는 맹독성 모체 균주에 대해, 4 또는 5 개의 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 HA 유전자를 인코딩할 수 있다. 특정한 구현예에서, 균주 글리코실화 부위는 S71N, K90N, L173T, P287T, 및 K294T 로부터 선택되고, 아미노산 변화 위치는 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열을 갖는 HA 유전자에 기반한다.
하나의 구현예에서, 약독화된 인플루엔자 균주에 의해 생성되는 HA 단백질은 SEQ ID NO:22 에 언급된 서열 또는 SEQ ID NO:22 에 대해 적어도 90% 상동성을 가진 서열을 갖고, 단 후속 위치는 하기 아미노산: 71N, 90N, 173T, 287T, 및 294T 를 갖는다.
또다른 구현예에서, 약독화된 인플루엔자는 SEQ ID NO:24 에 언급된 서열 또는 SEQ IN NO:24 에 대해 적어도 90% 상동성을 가진 서열을 갖는 HA 단백질을 생성하고, 단 후속 위치는 하기 아미노산: 71N, 90N, 173T, 287T 를 갖는다.
또다른 양상에서, 본 발명은 과잉글리코실화리코실화 HA 단백질을 인코딩하는, 약독화된 인플루엔자 균주를 포함하는 면역학적 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 비히클, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조성물은 맹독성 돼지 인플루엔자 유발에 대항하여 돼지에서 보호적 면역 반응을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 추가로 돼지 인플루엔자 이외의 병원체와 연관된 하나 이상의 부가적인 항원을 포함한다.
또다른 구현예에서, 하나 이상의 부가적인 항원은 M. hyo, PCV2, PRRSV, SIV 또는 돼지에서 질환을 감염시키고 야기하는 또는 질환에 대한 취약성을 야기하는 기타 병원체, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 과잉글리코실화리코실화 인플루엔자 HA 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 조성물의 1 회 이상의 투여를 포함하는 동물을 백신접종하는 방법을 제공한다. 또다른 구현예에서, 돼지는 출산 전 약 3 주 내지 약 6 주의 암퇘지이다. 또다른 구현예에서, 산출된 새끼돼지는 비-백신접종된 암퇘지로부터 유래한 새끼돼지와 비교하여 감소된 이환률 및/또는 치사율을 가질 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 HA cDNA 에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 약독화된 돼지 인플루엔자의 제조를 위한 벡터를 다수 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 HA cDNA 는 맹독성 모체 돼지 인플루엔자 균주에 의해 인코딩되는 HA 에 비해 부가적인 글리코실화 부위를 인코딩한다. 하나의 특정 구현예에서, 부가적인 글리코실화 부위는 S71N, K90N, L173T, P287T, 및 K294T 로부터 선택되고, 아미노산 변화의 위치는 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열을 갖는 HA 유전자에 기반한다.
하나의 구현예에서, 약독화된 인플루엔자를 생성하기 위한 HA cDNA 는 SEQ ID NO:22 에 언급된 단백질을 인코딩한다. 또다른 구현예에서, HA cDNA 는 SEQ ID NO:24 에 언급된 단백질을 인코딩한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 세포를 감염성 인플루엔자 바이러스를 산출하기에 유효한 양으로의 본 발명의 조성물 중 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 방법은 추가로 바이러스를 단리하는 것을 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 세포를 인플루엔자 바이러스를 산출하기에 유효한 양으로의 본 발명의 조성물과 접촉시키고, 상기 바이러스를 단리하는 것을 포함하는, 유전자 전달 비히클의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 추가로 본 발명의 조성물과 접촉된 세포를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 HA cDNA 에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 약독화된 돼지 인플루엔자의 제조를 위한 벡터를 다수 포함하는 척추동물 세포를 제공하며, 상기 HA cDNA 는 맹독성 모체 돼지 인플루엔자 균주에 의해 인코딩된 HA 에 대해 부가적인 글리코실화 부위를 인코딩한다.
본 발명은 항원, 면역원 및 에피토프를 제공하는 유전자 생성물을 추가로 포함하고, 단리된 유전자 생성물로서 유용하다.
이러한 단리된 유전자 생성물 뿐 아니라, 이의 에피토프는 또한 진단 적용에서 유용한, 항체를 생성하는데 유용하다.
에피토프, 항원 또는 면역원을 제공 또는 생성할 수 있는 이러한 유전자 생성물은 또한, 면역원성 또는 면역학적 조성물 뿐 아니라, 백신에 대해 유용하다.
하나의 양상에서, 본 발명은 돌연변이가 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 개질하여, 바이러스의 약화된 맹독성을 산출하는, 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 중의 약화 돌연변이를 함유하는 바이러스를 제공한다.
특히, 본 발명은 동물에서 면역원성 반응을 도출하는 약독화된 돼지 인플루엔자 균주, 특히 돼지에서 반응을 도출하고, 유도하거나 촉진시키는 약독화된 돼지 인플루엔자 균주 및 이를 포함하는 백신을 포함한다.
관심의 특정 돼지 인플루엔자 약독화된 균주는 맹독성과 연관되는, 야생형 맹독성 모체 균주에 대해, 유전자 내에 돌연변이를 갖는다. 기재된 돌연변이를 갖는 균주 외에, 기재된 맹독성 유전자 내에 임의의 수의 돌연변이를 갖는 약독화된 균주가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다는 것이 인지된다.
또다른 양상에서, 신규한 약독화된 돼지 인플루엔자 균주는 돼지 인플루엔자 및 돼지 인플루엔자에 의해 야기되는 감염/질병에 대항하는 안전하고, 효과적인 백신으로 제형화된다.
하나의 구현예에서, 돼지 인플루엔자 백신은 추가로 아쥬반트를 포함한다. 특정한 구현예에서, 아쥬반트는 점막성 아쥬반트, 예컨대 키토산, 메틸화된 키토산, 트리메틸화된 키토산, 또는 이의 유도체 또는 조합이다.
하나의 구현예에서, 아쥬반트는 H. 파라수이스 (H. parasuis), 클로스트리듐, 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 돼지 써코바이러스 (PCV), 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV), 만헤이미아 (Mannheimia), 파스퉤렐라 (Pasteurella), 히스토피오우스 (Histophious), 살모넬라 (Salmonella), 대장균 (Escherichia coli), 또는 이의 조합 및/또는 변형을 포함하는 전체 박테리아 및/또는 바이러스를 포함한다. 여러 구현예에서, 아쥬반트는 동물의 IgM, IgG, IgA, 및/또는 이의 조합의 생성을 증가시킨다.
"항원" 또는 "면역원" 은 숙주 동물에서 특이적인 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 전체 유기체 (치사된, 약독화된 또는 생); 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역원성 특성을 가진 삽입체를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 대해 제시시 변역 반응을 유도할 수 있는 DNA 의 조각 또는 절편; 폴리펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 절편" 은 임의의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 개질된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 이것은 아미노산 이외의 화학적 부분에 의해 방해될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 개질, 예컨대 표지화 또는 생리활성 성분과의 콘쥬게이션에 의해 개질된 아미노산 중합체를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "면역원성 또는 항원성 폴리펩티드" 에는 일단 숙주에 투여되면, 단백질에 대항하여 체액성 및/또는 세포성 유형의 면역 반응을 유발할 수 있다는 점에서 면역학적으로 활성인 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는 단백질 절편은 총 단백질과 실질적으로 동일한 면역학적 활성갖는 그러한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 절편은 하나 이상의 에피토프 또는 항원 결정소를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어진다. 본원에 사용되는 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드에는 단백질의 전장 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 절편이 포함된다. "면역원성 절편" 은 하나 이상의 에피토프를 포함하여 상기 기재되는 면역학적 반응을 도출하는 단백질의 절편을 의미한다. 이러한 절편은 당업계에 잘 공지된 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) 을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 동시에 고체 지지체 상에 다수의 펩티드를 합성하고 (상기 펩티드는 단백질 분자의 일부에 상응함), 상기 펩티드가 지지체에 여전히 부착된 채로 펩티드가 항체와 반응함으로써 측정될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986 에 기재되어 있다. 유사하게, 형태학적 에피토프는 예컨대, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 형태를 측정함으로써 쉽게 확인된다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols, supra 을 참조한다. T. 파르바 (T. parva) 의 단백질에 특히 적용가능한 방법은 본원이 그 전체가 참조로서 인용되는 PCT/US2004/022605 에 충분히 기재되어 있다.
본원에 논의되는 바와 같이, 본 발명은 항원성 폴리펩티드의 활성 절편 및 변이체를 포함한다. 따라서, 용어 "면역원성 또는 항원성 폴리펩티드" 는 폴리펩티드가 본원에 정의된 면역학적 반응을 생성하도록 기능한다면, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 추가로 포함한다. 용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기로의 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나, 또다른 생물학적으로 유사한 잔기인 식의 핵산 서열 내의 뉴클레오티드의 대체를 나타낸다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 특성이 보존되는, 즉, 아미노산의 계열 내에서 일어나는 치환일 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 4 개의 계열: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 무극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비전하 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신으로 나누어진다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 종종 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예에는 하나의 소수성 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또다른 소수성 잔기에 대한 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또다른 극성 잔기에 대한 치환, 예컨대 아르기닌의 라이신에 대한, 글루탐산의 아스파르트산에 대한, 또는 글루타민의 아스파라긴에 대한 치환 등; 또는 아미노산의 생물학적 활성에 큰 영향을 주지 않을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 보존성 대체가 포함된다. 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 미미한 아미노산 치환을 갖는 단백질이 따라서 참조 폴리펩티드의 정의 내에 있다. 상기 기잴에 의해 제조된 모든 폴리펩티드가 본원에 포함된다. 용어 "보존성 변이" 에는 또한 미치환된 모체 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함하나, 단, 치환된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체는 또한 미치환된 폴리펩티드와 면역반응한다.
용어 "에피토프" 는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 합텐 상의 부위를 말한다. 상기 용어는 또한 "항원 결정소" 또는 "항원 결정소 부위" 와 상호교환적으로 사용된다. 동일한 에피토프를 인지하는 항원은 또다른 항원의 표적 항원에 대한 결합을 차단하기 위한 하나의 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역어세이에서 확인될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응" 은 관심의 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 발달이다. 통상, "면역학적 반응" 은 하나 이상의 하기 효과를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 관심의 조성물 또 백신에 포함되는 항원 또는 항원에 대해 특이적으로 유도되는 항체, B 세포, 조력자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 저항성이 향상될 및/또는 질환의 임상적 심각성이 감소되는 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 통상 나타내지는 증상 및/또는 임상적 질환 징후의 감소 또는 결핍, 감염된 숙주에서의 빠른 회복 시간 및/또는 저하된 바이러스 역가에 의해 입증될 것이다.
"동물" 은 포유류, 새 등을 의미한다. 동물 또는 숙주에는 포유류 및 인간이 포함된다. 동물은, 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 양류 (예를 들어, 양), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 흰담비, 물개 및 생선으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 동물이 포함된다.
다르게 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수형 관사에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 지시대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 "및" 이 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서, 특히 청구항 및/또는 단락에서, "~ 을 포함한다", "~ 이 포함되는", "~ 을 포함함" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "~ 에 포함된다", "~ 에 포함되는", "~ 에 포함됨" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배재한다는 점에 유의한다.
조성물
본 발명은 동물에서 반응을 도출하는, 유도하는 또는 촉진하는, 약독화된 돼지 인플루엔자 균주 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 돼지 인플루엔자 백신 또는 조성물에 관한 것이다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 혼성체인 RNA 또는 DNA 를 말한다. 용어는 또한 RNA/DNA 혼성체를 포함한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 분절, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보솜, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 개질된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 기타 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 컨쥬게이션에 의한 것과 같은 중합 후에, 표지화 성분으로 추가로 개질될 수 있다. 본 정의에 포함되는 다른 유형의 개질은 캡, 하나 이상의 자연 발생적 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지화 성분, 기타 폴리뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부착시키는 수단의 도입이다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성으로부터 수득될 수 있거나 또는 미생물로부터 유도될 수 있다.
용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열, 및/또는 이들의 발현에 필요한 조절 서열이 포함된다. 예를 들어, 유전자는 또한 mRNA 또는 기능적 RNA 를 발현하는, 또는 조절 서열을 포함하는 특정 단백질을 인코딩하는 핵산 분절을 말한다.
"단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질 또는 세포기관) 은 성분이 자연 발생하는 유기체의 세포에서 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리된 또는 정제되어지는 성분, 예를 들어, 다른 염색체 및 염색체-외 DNA 및 RNA, 단백질, 및 세포기관을 말한다. "단리된" 핵산 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 용어에는 또한 재조합 기술 뿐 아니라 화학적 합성에 의해 제조된 핵산 및 단백질이 포함된다.
용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 하는 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 상기 기재된 바와 같이 성질이 보존성일 것이다.
"재조합" 이라는 용어는 자연에서 발견되지 않는 배치로의 또다른 폴리뉴클레오티드에 연결되거나 자연에서 발생하지 않는 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"이종" 이라는 용어는 비교되어 지는 실재의 나머지와 일반적으로 구별되는 실재로부터 유래하는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 유전학 유전자조작 기술에 의해 상이한 근원으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 도입될 수 있고, 그러므로 이종 폴리뉴클레오티드이다. 고유의 코딩 서열로부터 제거되고 고유의 서열 이외의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 프로모터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 부가적인 서열, 예컨대 동일한 전사 단위 내의 부가적인 인코딩 서열, 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 5'UTR, 3'UTR, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위, 동일 또는 상이한 프로모터의 조절 하의 부가적인 전사 단위, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 상동 재조합, 및 형질전환을 가능하게 하는 서열, 및 본 발명의 구현예를 제공하는데 바람직할 수 있는 임의의 이러한 구축물을 포함할 수 있다.
사용 방법 및 제조 물품
본 발명은 하기 방법 구현예를 포함한다. 하나의 구현예에서, 약독화된 돼지 인플루엔자 균주 및 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물을 백신접종하는 방법이 기재된다. 본 구현예의 하나의 양상에서, 동물은 돼지이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 하나 이상의 공통의 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 하나 이상의 프라임 투여 및 하나 이상의 부스트 투여로 구성되는 프라임-부스트 섭생이 사용될 수 있다. 전형적으로는 프라임 투여에 사용된 면역학적 조성물 또는 백신은 부스트로서 사용되는 것과 사실상 상이하다. 그러나, 동일한 조성물이 프라임 투여 및 부스트로서 사용될 수 있다는 것을 유념한다. 상기 투여 프로토콜을 "프라임-부스트" 라고 부른다.
프라임-부스트 섭생은 하나 이상의 공통의 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체 또는 절편을 사용하는 하나 이상의 프라임 투여 및 하나 이상의 부스트 투여를 포함한다. 프라임-투여에 사용되는 백신은 이후의 부스트 백신으로서 사용되는 것과 특성이 상이할 수 있다. 프라임 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게는, 부스트 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.
포유류인 표적 종에 대한 조성물의 투여량 부피, 예를 들어, 바이러스 항원에 기반한 돼지 (pig/swine) 조성물의 투여량 부피는 일반적으로 약 0.1 내지 약 2.0 ml, 약 0.1 내지 약 1.0 ml, 약 0.5 ml 내지 약 1.0 ml 이다.
백신의 효율은 동물, 예컨대 돼지를, 돼지 인플루엔자의 맹독성 균주로 유발시킴으로써 최종 면역화 후 약 2 내지 4 주에 시험될 수 있다. 동종 및 이종 균주 모두가 백신의 효능을 시험하기 위한 유발에 사용된다. 동물은 IM 또는 SC 주사, 분사에 의해, 코-내로, 눈-내로, 기관-내로, 및/또는 경구로 유발될 수 있다. 관절, 폐, 뇌, 및/또는 입으로부터의 샘플은 유발 전 및 후에 수집될 수 있고, 돼지 인플루엔자-특이적 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다.
프라임-부스트 프로토콜에 사용되는 본 발명의 약독화된 바이러스 균주를 포함하는 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 비히클, 희석제 또는 부형제에 함유되어 있다. 본 발명의 프로토콜은 동물을 돼지 인플루엔자로부터 보호하고 및/또는 감염된 동물에서의 질환 진행을 예방한다.
다양한 투여는 바람직하게는 1 내지 6 주 간격으로 실시된다. 바람직한 시간 간격은 3 내지 5 주이고, 하나의 구현예에 따르면 최선으로 4 주이고, 연간 부스트가 또한 구상된다. 동물, 예를 들어 돼지는, 첫번째 투여 시간에 적어도 3 내지 4 세일 수 있다.
본원의 설명이 예로서 제공되며 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것이 당업자에게 이해되어야만 한다. 본원의 설명 및 당업계의 지식으로부터, 당업자는 각각의 주사 프로토콜에 대해 사용되어야만 하는 투여 횟수, 투여 경로, 및 투여량을, 임의의 과도한 실험 없이 결정할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 약독화된 돼지 인플루엔자 면역학적 조성물 또는 백신 및 동물에서 면역 반응을 도출하기 위해 유효한 양으로 전달 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는 동물에서 돼지 인플루엔자에 대항하여 면역학적 또는 보호적 반응을 도출 또는 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 발명의 또다른 구현예는 본 발명의 약독화된 돼지 인플루엔자 균주를 포함하는 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 도출하기 위해 유효한 양으로 전달 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는 동물에서 돼지 인플루엔자에 대항하여 면역학적 또는 보호적 반응을 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 발명의 또다른 양상은 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 프라임-부스트 백신접종을 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 2 개 이상의 바이알: 본 발명에 따른 프라임-백신접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유하는 제 1 바이알, 및 본 발명에 따른 부스트-백신접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유하는 제 2 바이알을 포함할 수 있다. 키트는 유리하게는 부가적인 프라임-백신접종 또는 부가적인 부스트-백신접종을 위해 부가적인 제 1 또는 제 2 바이알을 함유할 수 있다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 0.9% NaCl (예를 들어, 식염수) 용액 또는 인산염 완충액일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기타 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제에는 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 벡터 (또는 시험관 내에서 본 발명의 벡터로부터 발현되는 단백질) 의 투여를 용이하게 하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 잇다; 유리하게는, 담체, 비히클 또는 부형제는 트랜스펙션을 용이하게 하고/거나 벡터 (또는 단백질) 의 보존을 개선할 수 있다. 투여량 및 투여 부피는 일반적 설명에서 본원에 논의되고, 또한 임의의 과도한 실험 없이, 당업자의 지식과 연관하여 본 명세서로부터 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 면역학적 조성물 및 백신은 하나 이상의 아쥬반트를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기 위한 적합한 아쥬반트는 (1) 아크릴 또는 메타크릴산의 중합체, 말레 무수물 및 알케닐 유도체 중합체, (2) 면역자극 서열 (ISS), 예컨대 하나 이상의 비-메틸화된 CpG 단위를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀젼, 예컨대 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" 출판: M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 의 페이지 147 에 기재된 SPT 에멀젼, 및 동일한 문헌의 페이지 183 에 기재된 에멀젼 MF59, (4) 4 차 암모늄 염, 예를 들어, DDA 를 함유하는 양이온성 지질, (5) 사이토카인, (6) 수산화알루미늄 또는 알루미늄 포스페이트, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원 내에 참조로서 인용되고 도입된 임의의 문헌에서 논의된 기타 아쥬반트, 또는 (9) 이의 임의의 조합 또는 혼합물이다.
하나의 구현예에서, 아쥬반트에는 점막 내벽을 통해 개선된 흡수를 촉진하는 것이 포함된다. 일부 예에는 MPL, LTK63, 독소, PLG 마이크로입자 및 여러 기타물질이 포함된다 (Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627). 하나의 구현예에서, 아쥬반트는 키토산일 수 있다 (Van der Lubben et al. 2001; Patel et al. 2005; Majithiya et al. 2008; US Patent Serial No. 5,980.912).
참조문헌:
Figure 112015016122035-pct00001
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본 발명은 이제 하기 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1 - 과잉글리코실화리코실화 돼지 인플루엔자 바이러스의 구축
재료/방법.
인플루엔자-유사 질환을 나타내는 돼지로부터 임상 샘플 (코 면봉채취물 또는 폐 조직) 을 수집하고,바이러스 단리 및 특징분석에 적용하였다 (정규 진단 시험). 바이러스 단리를 37℃, 5% CO2 에서, 5% 우태혈청을 함유하는 DMEM 에서 성장한 돼지 고환 (ST) 세포 상에서 수행하였다. 바이러스 증식을 위해서는, DMEM 에서 우태혈청을 생략하였다. 293T 및 MDCK 세포를 10% 우태혈청을 함유하는 DMEM 에서 증식시켰다. 5x MagMax-96 Viral Isolation Kit (Life Technologies) 를 사용하여 감염된 세포 배양물 수확액으로부터 RNA 를 수확하였다.
완전한 바이러스 게놈을 이전에 기재된 다중분절 역전사 PCR 방법을 이용하여 증폭시켰다 (Zhou B, et al. 2009). 바이러스 cDNA 라이브러리를 NEBNext Fast DNA Fragmentation and Library Prep Set 4 키트를 제조자의 지침 (New England Biolabs) 에 따라 사용하여 제조하였는데, 단 키트 어댑터는 바코드 어댑터 (Ion Xpress Barcode Adaptor 1-16 Kit, Life Technologies) 로 교체하였다. DNA 서열분석 주형을 Ion Xpress Template Kit version 2.0 (Life Technologies) 을 사용하여 제조하고, Ion Torrent Personal Genome Machine (Life Technologies) 을 사용하여 서열분석하였다. 콘티그 (Contig) 를 SeqMan NGen 소프트웨어 (DNAStar) 를 사용하여 어셈블리하였다. 전장 HA 를 인코딩하는 콘티그를 BLAST 분석에 의해 확인하였다. 전장 HA DNA 서열을 ClustalW 방법을 사용하여 정렬시켰다. 계통발생 분석은 이웃-연결 방법을 사용하는 MEGA 5.0 를 사용하여 수행하였고, 위상기하학은 1000 부트스트랩 (bootstrap) 복제물로 입증하였다 (Tamura K, et al. 2011). HA 유전자 서열은 Genbank 에 접근 번호 JQ638655-JQ638665 로 기탁되었다.
역 유전학. 분자 생물학의 문맥에서, "역 유전학" 은 클로닝된 cDNA 로부터 유래된 게놈을 가지고 있는 바이러스의 생성으로서 정의된다 (리뷰를 위해, Neumann et al., J. Gen. Viral., 83:2635; 2002 를 참조함). 본 연구에서, 삼중 재조합체 (reassortant) 내부 유전자 카세트 (TRIG) 돼지 인플루엔자 바이러스 (A/돼지/노쓰캐롤라이나/3793/08(H1N1)) 를 TRIG 돼지 인플루엔자 바이러스 역 유전학 시스템을 제작하기 위한 주형으로서 사용하였다. 모든 8 개의 절편을 PCR 로 증폭시키고, BsmBI 로 소화시키고, 이전에 기재된 바와 같이 유사하게 소화된 pHW2000 내로 라이게이션하였다 (Hoffmann E, et al. 2001). 플라스미드를 가지고 있는 삽입물을 제한 소화에 의해 확인하고, 서열분석하여 A/돼지/노쓰캐롤라이나/3793/08 와의 일치성을 입증하였다. 10-0036-2 로부터의 HA 및 NA 유전자 (SEQ ID NO:7 & 11) 를 또한 pHW2000 (Hoffmann et al 2000, PNAS 97(11):6108-6113) 내로 클로닝하고, A/돼지/노쓰캐롤라이나/3793/08 로부터 유래되는 폴리머라아제 염기성 2 (PB2), 폴리머라아제 염기성 1 (PB1), 폴리머라아제 산 (PA), 핵단백질 (NP), 매트릭스 (M) 및 비-구조적 유전자 (NS) 를 가지고 있는 플라스미드와 함께 트랜스펙션하여, 역 유전학-유래 10-0036-2 (RG 10-0036-2, 도 1) 를 제조하였다. 부위 지정 돌연변이생성을 Quik Change II 부위 지정 돌연변이생성 키트 (Agilent Technologies) 를 사용하여 10-0036-2 로부터 HA 유전자를 함유하는 플라스미드 상에 수행하여, 부가적인 1-5 N-연결된 글리코실화 부위를 가진 돌연변이체를 제작하였다 (표 1, 도 2). 글리칸은 N-X-S/T (식 중, N 은 아미노산 아스파라긴이고, X 는 임의의 아미노산이고, S/T 는 세린 또는 트레오닌임) 의 N-연결된 글리코실화 모티프의 문맥에 위치하는 아스파라긴 (N) 잔기에서 단백질에 부가된다.
표 1. 부위 지정 돌연변이생성을 사용하여 RG10-0036-2 의 HA 유전자 내로 조작된 부가적인 N-연결된 글리코실화 부위
Figure 112015016122035-pct00005
재조합 바이러스의 구제를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Hoffmann E, et al. 2000). 간략하게는, 293T 및 MDCK 세포를 6-웰 플레이트 내에 5% FBS 를 함유하는 Opti-MEM I 에서 각각 293T 및 MDCK 의 대략 1 x106 세포를 트랜스펙션 전에 대략 18 시간 동안 함께 배양하였다. 8 개의 플라스미드 각각의 100 나노그램을 100 μL 의 Opti-MEM I 내에 모으고, 3 μL 리포펙타민 (Lipofectamine) (Invitrogen) 을 함유하는 100 μL Opti-MEM 과 조합하고, 실온에서 15 분 인큐베이션한 후, Opti-MEM I 의 1 mL 로 희석하고 6-웰 플레이트의 단일 웰에 옮겼다. 플레이트를 37℃ 에서 5% CO2 와 함께 6 시간 동안 인큐베션한 후, 트랜스펙션 혼합물을 Opti-MEM I 로 대체하였다. 트랜스펙션 후 24 시간에, 1.5 mL 을 컨플루언트 (confluent) MDCK 세포의 6-웰 플레이트로 옮기고, 1 μg/mL 의 TPCK-처리된 트립신을 함유하는 DMEM 1.5 mL 을 첨가하였다. 감염 후 제 5 일에 바이러스를 수확하고, 이들의 역가를 HA 어세이에 의해 측정하였다. 구제된 바이러스의 HA 유전자를 서열분석하여 올바른 서열을 입증하였다.
결과. 바이러스 10-0036-2 에 대해 N28, N40, N104, N142, N176, N303, N497 및 N556 에서의 위치에서 발견된 예상되는 N-연결된 글리코실화 부위 (N-X-S/T) 의 유전적 분석. 부위 지정 돌연변이생성을 부가적인 1-5 N-연결된 글리코실화 부위를 HA 의 구형 헤드 부분에 부가하기 위해 사용하였다 (표 1). 세포 배양물로부터 바이러스 구체 후, 돌연변이체 바이러스를 ST 세포에 대한 성장 연구에 의해 특징분석하였다. 약독화된 바이러스가 종종 시험관 내에서 감소된 성장 속도 및 역가를 나타내기 때문에 성장 연구를 수행하였다. 4 또는 5 개의 부가적인 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 돌연변이체 바이러스는 그러한 성장 결함을 나타내서, 부가적인 글리코실화가 바이러스를 약독화시키는 것으로 제안한다. 약독화된 바이러스를 그 다음, 이들의 맹독성을 생체 내에서 평가하고 상기 돌연변이체 바이러스에 대항하는 면역 반응을 특징분석하기 위해 돼지에서 평가하였다.
실시예 2 - 돼지에서 약독화된 돼지 인플루엔자 백신의 효능
재료 & 방법. 60 마리의 3-주령의 매우 건강한 돼지 (IDEXX FlockChek ELISA 에 의해 SIV 혈청반응음성으로 확인됨) 를 개별 공간에서 15 마리의 4 개 그룹으로 분리하였다. 제 0 일 (d0) 에, 돼지를 2 mL 의 6.0 TCID50/mL 바이러스로 비강내로 접종하였다. 그룹 1 은 세포 배양 배지 (DMEM) 로 감염된 모의 (mock) 이었다. 그룹 2 는 10-0036-2 n+5 를 받았다. 그룹 3 은 10-0036-2 n+4 (4 개의 부가적인 글리코실화 부위를 가진 돌연변이체; n+5 와 유사하나 돌연변이 A881C 가 결여됨 [K294T]) 를 받았다. 그룹 4 는 역 유전학 제작된 10-0036-2 모체 (돌연변이 없음) 를 받았다. 돼지를 제 0 일에 면봉채취 (코) 하고, 샘플을 활성 감염이 없음을 확인하기 위해 SIV 검출을 위해 QPCR 에 의해 실행하였다. 결과를 표 2 에 요약한다. 표 2 및 3 의 경우, 상이한 글자를 가진 그룹은 통계학적으로 상이한 평균 (P<0.05) 을 갖는다. 예를 들어, "A" 는 "B" 와 통계학적으로 상이하고, "BC" 는 "A" 와 통계학적으로 상이하지만 "B" 또는 "C" 는 아니다.
표 2. 백신접종 연구
Figure 112015016122035-pct00006
코 면봉채취물을 제 1, 3 및 5 일에 수집하였다. 각 그룹으로부터 5 마리의 돼지를 제 5 일에 안락사시키고, 폐 샘플을 수집하였다. 제 1 일로부터의 면봉채취물을 QPCR 에 의해 분석하였다. 제 3 및 5 일로부터의 면봉채취물 뿐 아니라 폐 샘플을 SIV 에 대해 적정하였다. 폐를 병리조직학 분석 및 IHC 를 위해 대학교 진단연구소 (University Diagnostic lab) 에 보냈다. 제 21 일에 돼지를 상기와 같이 재-백신접종하였다. 상기 결과는 시험관 내 성장 연구와 일치하게, 4 또는 5 개의 부가적으로 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하는 돌연변이체가 돼지에서 약독화되고 무맹독성이라는 것을 입증하였다. 코 면봉채취물 역가는 바이러스가 생체 내에서 복제가능하지만, 폐 내의 바이러스의 부재 및 폐 손상의 결여는 복제가 상부 기도에 제한된 것을 암시하는 것으로 나타났다. 온도 민감성을 부여하는 기타 인플루엔자 유전자 내의 돌연변이는 감염이 상부 기도에 제한되고, 인간 생 약독화된 인플루엔자 백신 FluMist™ 에 기반하는 것임을 나타냈다.
제 31 일에, 돼지를 필드 단리물 12-1110-1 (H3N2) 로 유발하였다. 유발 연구의 결과를 표 3 에 요약하였다. 유발을 위해 (Richt et al 2006, J.Virology 80(22):11009-11018 에 필적하게 수행됨) 2 mL 의 4.6 TCID50/mL 를 비강 내로 전달하였다. 혈액 및 코 면봉채취물을 유발 31 일 전에 수집하였다. 코 면봉채취물을 제 0 및 1 일에 수집하고, QPCR 에 의해 분석하였다. 코 면봉채취물을 제 3 및 5 일에 수집하고, SIV 역가를 적정에 의해 측정하였다. 모든 돼지를 제 5 일에 안락사시키고, 폐 샘플을 적정에 의해 분석하였다. 폐 샘플을 상기와 같이 분석하였다.
표 3. 유발 연구
Figure 112015016122035-pct00007
상기 결과는 돌연변이체 n+4 또는 n+5 로 백신접종된 돼지가 적정 및 IHC 에 의해 폐에서 바이러스의 결여 뿐 아니라, 폐 병반에 대한 증거 없음에 의해 질환으로부터 보호되었다는 것을 입증한다. 나이브 (Naive) (음성 대조군) 돼지는 H3N2 유발 바이러스에 쉽게 감염되었고, 고전적인 인플루엔자 질병을 나타냈다. 모체 바이러스 10-0036-2 로 미리 감염된 돼지는 또한 H3N2 유발로부터 보호되었다.
* * * * * * * *
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기재하였으므로, 상기 단락에 의해 정의된 본 발명이 이의 많은 명백한 변형이 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어남 없이 가능하므로, 상기 설명에 언급된 특정 설명에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
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Asp Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met 50 55 60 Asp Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Ile Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Ile Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Thr Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Val 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala 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Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Ser Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Ile Arg Val 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Ser Leu 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Thr Arg Ser Arg Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Val Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Glu Gln Ser Arg Ile Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Leu Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Ile Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asn Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn 755 <210> 3 <211> 2271 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 3 atggatgtca acccgactct acttttccta aaggttccag cgcaaaatgc cataagcacc 60 acattccctt atactggaga tcctccatac agccatggaa caggaacagg atacaccatg 120 gacacagtca acagaacaca ccagtattca gaaaaaggga aatggacgac aaacacagag 180 actggggcac cccagctcaa cccgattgat ggaccactac ccgatgataa tgaaccaagt 240 gggtatgcac aaacagactg tgtcctggag gccatggctt tccttgaaga atcccaccca 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caacaaggaa gaaaattgag aaaataaggc ctctcctaat agatggcaca 1200 gcatcattga gccctgggat gatgatgggc atgttcaaca tgctaagtac ggttttggga 1260 gtctcaatac tgaatcttgg acaaaagaaa tacaccagga caacatactg gtgggatgga 1320 ctccaatcct cagacgattt tgccctcata gtaaatgcac caaatcatga gggaatacaa 1380 gcaggagtgg atagattcta caggacctgc aagttagtag ggatcaacat gagcaaaaag 1440 aagtcctata taaataagac tgggacattt gaattcacaa gcttttttta tcgctatggg 1500 tttgtagcta attttagcat ggagctgccc agttttggag tgtctggaat aaacgaatca 1560 gctgatatga gcatcggagt aacagtgata aagaacaaca tgataaataa tgatcttgga 1620 cctgcaacag cccagatggc cctccagttg ttcatcaaag actacagata cacatataga 1680 tgccatagag gggacacaca aatccagacg agaagatcat tcgagctaaa gagcctgtgg 1740 aatcaaactc aatcaaaggc aggattatta gtatctgatg gaggaccaaa tttatacaat 1800 atccggaatc ttcacattcc tgaagtctgc ttaaaatggg agctaatgga tgaggattat 1860 cggggaagac tttgtaatcc cctgaatccc tttgtcagcc ataaagagat tgattctgta 1920 aacagtgctg tggtgatgcc agcccatggt ccagccaaaa gtatggagta tgatgccgtt 1980 gcaactacac 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atacaataaa aagttggaga 660 aacaaaatat taagaacaca agagtcagaa tgtgtttgta tgaacggttc ttgttttact 720 gtattaactg atggcccaag caatgggcaa gcatcgtaca aaatattcaa gatggaaaaa 780 ggaaaaataa ttaaatcaat tgagctggat gcacccaatt accactatga ggaatgctcc 840 tgttatcctg atgcaggcaa agtaatgtgt gtttgcagag acaactggca tgcctcgaac 900 cggccatggg tctctttcga tcagaatctt aattatcaaa tagggtacat atgcagtggg 960 gttttcggtg ataacccgcg ttctaatgat ggaaagggca attgtggccc agtacattct 1020 aatggagcaa atggagtgaa aggattctca tataaatatg gtaatggtgt ttggatagga 1080 aggactaaaa gtatcaactc cagaagtgga tttgaaatga tttgggatcc aaatgggtgg 1140 actggaactg atagtagttt ctctatgaag caggatatta tagcattaac tgattggtca 1200 ggatacagtg gaagttttgt ccaacatcct gaattaacag gaatgaattg cataaggccc 1260 tgtttctggg tagaattaat cagagggcaa cccaaggaaa acaccatctg ggctagcgga 1320 agcagcatct ctttctgtgg tgtaaatggt gaaaccgcaa gctggtcatg gccagacgga 1380 gctgatctgc cattcaccat tgacaag 1407 <210> 12 <211> 469 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 12 Met Asn Thr Asn Gln Arg Ile 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<221> SITE <222> (267) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 20 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ala Thr Met Cys Phe Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Val Thr Asn 20 25 30 Val Thr Leu His Phe Asn Gln Tyr Glu Cys Asn Tyr Pro Pro Asn Asn 35 40 45 Gln Val Ile Leu Cys Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu 50 55 60 Ile Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys 65 70 75 80 Leu Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Lys Ile Thr Gly 85 90 95 Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly 100 105 110 Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys 115 120 125 Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Arg His 130 135 140 Ser Asn Asp Thr Val His Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met 145 150 155 160 Asn Glu Leu Gly Ile Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile 165 170 175 Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val 180 185 190 Cys Ile Thr 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Ser Met Gly Val Tyr Asn 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 27 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA gene of Influenza 10-0036-2 (n+2, relative to parent) <400> 27 atgaaagtaa aactaatggt tctgttatgt acatttacag ctacatatgc agacacaata 60 tgtgtaggct accatgccaa caactcaact gacactgttg acacagtact tgagaagaat 120 gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagcc acaatggaaa actatgtcta 180 ctaaaaggaa tagctccact acaattgggt aattgcagcg ttgccggatg gatcttagga 240 aacccagagt gcgaattgct gatttccaat gaatcttggt cctacattgt agaaacacca 300 aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcacag actatgaaga actgagggag 360 caattgagtt cagtatcttc atttaagagg ttcgaaatat tccccaaaga gagctcatgg 420 cccaaccaca ccgtaaccgg agtgtcatca tcatgctccc ataacgggaa aagcagcttc 480 tacagaaatt tgctatggct gacggtgaag aacggtctgt acccaaacct gagcaagtcc 540 tatacaaaca aaaaggagaa agaagtcctt gtactatggg gtgttcatca cccatctaac 600 ataggggacc aaagggccct ctatcataca gaaaatgctt atgtctctgt agtgtcttca 660 cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaagac ccaaggtgag aaatcaggaa 720 ggaagaatca actactactg gaccctgcta gaacccgggg atacaataat atttgaggca 780 aatggaaatc taatagcacc aaggtatgcc ttcgaactga gtaagggttt tggatcagga 840 atcatcacat caaatgcacc aatgggtgaa tgtaatgcaa agtgtcaaac acctcaggga 900 gctataaaca gcagtcttcc tttccagaat gtacacccag taacaatagg agagtgccca 960 aagtatgtca aaagtgcaaa attaaggatg gttacaggac taaggaacac cccatccatt 1020 caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg aaggagggtg gactggaatg 1080 gtagatggtt ggtatggtta tcaccatcag aatgagcaag gatctgggta tgctgcagac 1140 caacaaagca cacaaaatgc cattaatggg attacaaaca aggtgaattc tgtgattgaa 1200 aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagaattca acaaactgga aagaagaatg 1260 gaaaacttaa ataaaaaggt tgatgatggg tttctagaca tttggacata taatgcagaa 1320 ttgttagttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc atgactccaa cgtgaagaat 1380 ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaaa aataatgcca aagaaatagg aaacgggtgt 1440 tttgaattct atcataagtg taacgatgaa tgcatggaga gtgtgaaaaa tggaacttat 1500 gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg agaaaattga tggagtgaaa 1560 ttggaatcaa tgggagtcta taatatcctg gcgatctact caacagtcgc cagttcccta 1620 gttcttttag tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt gttccaatgg gtctttacag 1680 tgtagaatat gcatc 1695 <210> 28 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA predicted AA of Influenza 10-0036-2 (n+2, relative to parent) <400> 28 Met Lys Val Lys Leu Met Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Val Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Asn Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Thr Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Lys Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Val Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175 Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Lys Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Leu Tyr 195 200 205 His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asn Gln Glu 225 230 235 240 Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Glu 260 265 270 Leu Ser Lys Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285 Gly Glu Cys Asn Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Lys Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Thr Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Gln Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Asn 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 29 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA gene of Influenza 10-0036-2 (n+1, relative to parent) <400> 29 atgaaagtaa aactaatggt tctgttatgt acatttacag ctacatatgc agacacaata 60 tgtgtaggct accatgccaa caactcaact gacactgttg acacagtact tgagaagaat 120 gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagcc acaatggaaa actatgtcta 180 ctaaaaggaa tagctccact acaattgggt agttgcagcg ttgccggatg gatcttagga 240 aacccagagt gcgaattgct gatttccaat gaatcttggt cctacattgt agaaacacca 300 aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcacag actatgaaga actgagggag 360 caattgagtt cagtatcttc atttaagagg ttcgaaatat tccccaaaga gagctcatgg 420 cccaaccaca ccgtaaccgg agtgtcatca tcatgctccc ataacgggaa aagcagcttc 480 tacagaaatt tgctatggct gacggtgaag aacggtctgt acccaaacct gagcaagtcc 540 tatacaaaca aaaaggagaa agaagtcctt gtactatggg gtgttcatca cccatctaac 600 ataggggacc aaagggccct ctatcataca gaaaatgctt atgtctctgt agtgtcttca 660 cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaagac ccaaggtgag aaatcaggaa 720 ggaagaatca actactactg gaccctgcta gaacccgggg atacaataat atttgaggca 780 aatggaaatc taatagcacc aaggtatgcc ttcgaactga gtaagggttt tggatcagga 840 atcatcacat caaatgcacc aatgggtgaa tgtaatgcaa agtgtcaaac acctcaggga 900 gctataaaca gcagtcttcc tttccagaat gtacacccag taacaatagg agagtgccca 960 aagtatgtca aaagtgcaaa attaaggatg gttacaggac taaggaacac cccatccatt 1020 caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg aaggagggtg gactggaatg 1080 gtagatggtt ggtatggtta tcaccatcag aatgagcaag gatctgggta tgctgcagac 1140 caacaaagca cacaaaatgc cattaatggg attacaaaca aggtgaattc tgtgattgaa 1200 aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagaattca acaaactgga aagaagaatg 1260 gaaaacttaa ataaaaaggt tgatgatggg tttctagaca tttggacata taatgcagaa 1320 ttgttagttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc atgactccaa cgtgaagaat 1380 ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaaa aataatgcca aagaaatagg aaacgggtgt 1440 tttgaattct atcataagtg taacgatgaa tgcatggaga gtgtgaaaaa tggaacttat 1500 gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg agaaaattga tggagtgaaa 1560 ttggaatcaa tgggagtcta taatatcctg gcgatctact caacagtcgc cagttcccta 1620 gttcttttag tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt gttccaatgg gtctttacag 1680 tgtagaatat gcatc 1695 <210> 30 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA predicted AA of Influenza 10-0036-2 (n+1, relative to parent) <400> 30 Met Lys Val Lys Leu Met Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Val Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Thr Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Lys Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Gly Val Ser Ser Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Val Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175 Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Lys Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Leu Tyr 195 200 205 His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asn Gln Glu 225 230 235 240 Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Glu 260 265 270 Leu Ser Lys Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285 Gly Glu Cys Asn Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Lys Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Thr Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Gln Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Asn 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565

Claims (20)

  1. 인플루엔자 또는 인플루엔자에 의해 야기되는 질병에 대항하여 돼지에서 안전하고 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있는 약독화된 돼지 인플루엔자 균주로서, 맹독성 모체 균주에 대해 4 개 이상의 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 HA 유전자를 인코딩하고, 글리코실화 부위가 S71N, K90N, L173T 및 P287T 를 포함하고, 아미노산 변화(들) 의 위치가 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열을 갖는 맹독성 모체 균주에 의해 인코딩되는 HA 유전자에 기반하는 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 글리코실화 부위가 K294T 를 더 포함하는 균주.
  3. 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO:22 에 언급된 서열을 갖는 또는 SEQ ID NO:22 에 대해 적어도 90% 상동성을 가진 서열을 갖는 HA 단백질을 인코딩하는 균주로서, 단 후속 위치는 하기 아미노산: 71N, 90N, 173T, 287T, 및 294T 를 갖는 균주.
  4. 제 3 항에 있어서, HA 단백질이 SEQ ID NO:22 에 언급된 서열을 갖는 균주.
  5. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:24 에 언급된 서열을 갖는 또는 SEQ ID NO:24 에 대해 적어도 90% 상동성을 가진 서열을 갖는 HA 단백질을 인코딩하는 균주로서, 단 후속 위치는 하기 아미노산: 71N, 90N, 173T, 287T 를 갖는 균주.
  6. 제 5 항에 있어서, HA 단백질이 SEQ ID NO:24 에 언급된 서열을 갖는 균주.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 약독화된 균주를 포함하는, 맹독성 돼지 인플루엔자 유발에 대항하여 돼지에서 보호적 면역 반응을 제공하는 면역학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 비히클, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 돼지 인플루엔자 이외의 돼지 병원체와 연관되거나 이로부터 유래된 하나 이상의 부가적인 항원을 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 부가적인 항원(들) 이 돼지에서 M. hyo, PCV2, PRRSV, SIV 또는 돼지에서 질환을 감염시키고 야기하는 또는 질환에 대한 취약성을 야기하는 기타 병원체에 대항하는 면역 반응을 도출할 수 있는 조성물.
  11. 제 8 항의 조성물의 1 회 이상의 투여를 포함하는 인간을 제외한 동물을 백신접종하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 동물이 출산 전 3 주 내지 6 주의 암퇘지인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 산출된 새끼돼지가 비-백신접종된 암퇘지로부터 유래한 새끼돼지와 비교하여 감소된 이환률 및/또는 치사율을 갖는 방법.
  14. 인플루엔자 바이러스 HA cDNA 에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 약독화된 돼지 인플루엔자의 제조를 위한 벡터를 다수 포함하는 조성물로서, 상기 HA cDNA 가 맹독성 모체 돼지 인플루엔자 균주에 의해 인코딩되는 HA 에 비해 4 개 이상의 부가적인 글리코실화 부위를 인코딩하고, 글리코실화 부위가 S71N, K90N, L173T 및 P287T 를 포함하고, 아미노산 변화의 번호지정이 SEQ ID NO:18 에 언급된 서열을 갖는 맹독성 모체 균주에 의해 인코딩되는 HA 유전자에 기반하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 글리코실화 부위가 K294T 를 더 포함하는 조성물.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 약독화된 인플루엔자를 제조하기 위한 HA cDNA 가 SEQ ID NO:22 또는 24 에 언급된 단백질을 인코딩하는 조성물.
  17. 세포를 감염성 인플루엔자 바이러스를 산출하기에 효과적인 양으로 제 14 항 또는 제 15 항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
  18. 제 17 항의 벡터를 다수 포함하는 세포.
  19. 삭제
  20. 삭제
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