CN104582725A - 减毒的猪流感疫苗及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了减毒的猪流感毒株，特别是经由反向遗传学方法产生的那些，包含其的组合物，以及其生产和使用方法。相对于由相应的剧毒亲本病毒编码的HA蛋白质，减毒的毒株经改造为编码具有另外的糖基化位点的HA蛋白质。有利地，可以施用减毒的流感毒株。

Description

减毒的猪流感疫苗及其制备和使用方法

通过引用并入

本申请要求于2012年7月17日提交的临时申请USSN 61/672,398的优先权，且通过引用将其整体并入本文。

发明领域

本发明一般涉及减毒的病毒疫苗，特别是对猪提供抵抗由猪流感引起的感染/疾病的广泛、安全和有效保护的那些疫苗。本发明进一步涉及产生减毒病毒的方法，以及与减毒病毒的毒力减少相关的核酸变异的鉴定。

本发明相应地涉及包含本发明的病毒例如减毒活病毒的免疫原性组合物或疫苗组合物。病毒还可以在组合物中被灭活；但病毒是减毒的活猪流感可以是有利的。本发明因此进一步涉及用于制备和/或配制此类组合物的方法；例如在合适培养基上或中培养或生长或繁殖病毒，收获病毒，任选地灭活病毒，且任选地与合适的兽医学或药学可接受的运载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂混合。因此，本发明还涉及病毒在配制此类组合物中的用途。

发明背景

流感病毒具有逃避针对介导病毒进入的血凝素的(HA)的宿主体液免疫的许多机制。基因组区段的重排可以导致抗原转换，同时突变的逐步累积导致遗传漂变(Desselberger U等人，1978，Schild G等人，1974)。除了可以影响预先存在的抗体识别突变型HA的能力的HA抗原性表位中的突变之外，HA的N联糖基化中的突变可以通过改变围绕HA的寡糖层来促进抗体识别的病毒逃避(Schulze IT，1997)。聚糖残基可以限制一些抗体与其表位的结合，导致在称为聚糖屏蔽的现象中的抗体识别和免疫原性的丧失(Wanzeck K等人，2011，Wei C-J等人，2010)。另外，突变和遗传漂变优先在不受聚糖保护的HA球状头部中的位置处发生(Das SR等人，2010)。聚糖残基还影响受体结合且因此可以影响病毒复制动力学。

流感病毒的进化经常包括糖基化位点的数目和位置的修饰(LongJ等人，2011)。对于H3N2病毒，糖基化位点的数目在过去40年已从两个增加到十个(4)。然而，增加糖基化的HA已与小鼠中的毒力减少和降低的病毒适合度关联(Das SR等人，2011，Vigerust DJ等人，2007)。虽然增加糖基化可以使HA屏蔽中和抗体，但关于细胞受体的病毒亲和力强制性减少(Abe Y等人，2004，Das SR等人，2011)。此外，需要HA或神经氨酸酶(NA)中的代偿突变以平衡受体结合和释放活性(Wagner R等人，2000)。NA中的这些补偿突变已与对NA抑制剂的天然抗性的获得相关(Hensley SE等人，2011)。

猪流感病毒的众多遗传和抗原上不同的谱系同时在猪中循环，包括β、γ和δ-簇H1N1和H1N2病毒，以及H3N2亚型(Lorusso A等人，2012)。δ-簇最初再分成两个亚簇(δ-I和δ-II)，然而，最近的工作证实代表至少三个抗原上不同的组的五个不同遗传亚簇(δ-A、δ-B、δ-C、δ-D、δ-E)(Hause BM等人，2011，Vincent AL等人，2009)。

虽然当疫苗株匹配野外攻击病毒时，被杀死的病毒疫苗是有效的，但流感的快速突变率需要频繁毒株变化，以确保在疫苗株和循环病毒之间的遗传和抗原匹配。另外，猪中共循环的多重亚型和谱系经常要求五种或更多种疫苗株，以便包括每个类型的代表。引发广谱免疫的单一活疫苗提供在猪卫生计划中的显著进展。

发明概述

本发明的目的是提供减毒疫苗以及治疗和预防猪流感的感染的方法。

在一个实施方案中，疫苗包含减毒的流感病毒，其已经修饰为表达相对于其亲本株具有另外糖基化位点的HA基因。

在特定实施方案中，HA基因和/或基因产物具有与SEQ IDNOs:17和21；SEQ ID NOs:17和23；SEQ ID NOs:18和22；或SEQID NOs:18和24之间存在的相同的修饰。在另外一个实施方案中，HA基因和/或基因产物具有5种修饰中的至少1种。在更特定的实施方案中，HA基因和/或基因产物具有4或5种修饰，导致相对于亲本HA基因产物的+4和+5个糖基化位点。

本发明的另一个目的是提供用于反向遗传学***中的cDNA和/或质粒，用于产生根据本公开内容的减毒流感。在一个实施方案中，cDNA和/或质粒中的至少一种包含相对于如SEQ ID NO:18所示的序列具有增加数目的糖基化位点的HA序列。

在特定实施方案中，HA序列如SEQ ID NO:21或23中所示。

本发明进一步涉及新的流感减毒株，其提供安全、有效和广泛的保护性免疫。相对于亲本流感毒株，减毒株可以具有由其HA基因编码的另外的糖基化位点和/或假定糖基化位点，所述糖基化位点的存在与毒力降低相关。

因此，本发明提供了相对于野生型/亲本病毒，在一种或多种核酸序列中包含突变的突变型病毒，所述突变致使突变型病毒相对于亲本病毒是减毒的，所述亲本病毒包含编码野生型HA蛋白质的核酸。如本文定义的，“野生型”HA蛋白质是相对于如SEQ ID NO:18所示的序列，具有相同数目的糖基化位点和/或假定糖基化位点的蛋白质。

在特定实施方案中，突变型病毒包含vRNA核酸序列，其对应于(即，是反向互补的且具有尿嘧啶代替胸苷)SEQ ID NO:21或23所示的DNA序列，所述DNA序列分别编码如SEQ ID NO:22或24所示的肽，并且促使突变型病毒相对于剧毒野生型/亲本病毒是减毒的/无毒力的。

如本文定义的，术语“基因”将以广义使用，并且应涵盖编码和非编码序列两者(即上游和下游调节序列、启动子、5’/3’UTR、内含子和外显子)。当预期仅提及基因的编码序列时，术语“基因的编码序列”或“CDS”在本公开内容自始至终可互换使用。当讨论特定核酸例如如SEQ ID NO:17所示的序列(亲本病毒cRNA“有义”链的DNA序列等价物)时，技术人员将立即拥有该序列的所有可衍生形式(mRNA、vRNA、cRNA、DNA、蛋白质等)。例如，流感病毒是负单链RNA病毒(ssRNA)。为了复制，它的负ssRNA(本文定义为“vRNA”)必须转录为正或有义RNA(本文定义为“cRNA”)。宿主细胞机制共选择以使用cRNA产生病毒蛋白质和vRNA。技术人员使用众所周知的遗传密码可以照常规由DNA序列衍生vRNA、cRNA和肽序列。

在特定实施方案中，减毒疫苗包含佐剂。佐剂可以是与单独的减毒疫苗相比较，增加和/或增强引发的免疫原性的任何物质。粘膜佐剂包括壳聚糖及其衍生物对于公开的经口减毒疫苗特别有用。

本发明进一步提供了用于诱导针对流感的免疫学(或免疫原性)或保护性应答的方法，以及用于预防或治疗流感或由流感引起的疾病状态的方法，其包括给有此需要的动物施用所述减毒病毒或包含所述减毒病毒的组合物。

还提供了包含至少所述减毒的流感毒株和使用说明书的试剂盒。

这些及其他实施方案得到公开或由下述详述的显而易见的且由其涵盖。

附图简述

对于本领域普通技术人员，本发明的完全和披露的公开内容包括其最佳模式在说明书的其余部分包括对附图的提及中更具体地阐述，在所述附图中

图1表示使用反向遗传学制备的病毒的基因型；

图2是在SEQ ID NO:18(亲本流感病毒的HA蛋白质)和SEQ IDNO:22(n+5糖基化突变型的HA蛋白质)之间的氨基酸比对；

图3是在亲本和糖基化突变型流感病毒的培养细胞中的生长曲线图，所述糖基化突变型流感病毒相对于亲本在其HA基因中具有1至5个另外的糖基化位点；

图4是本公开内容的SEQ ID的表格列表。

发明详述

本发明提供了涉及对微生物例如病毒(例如流感)减毒的核苷酸序列和基因，由核苷酸序列编码的产物(例如蛋白质、抗原、免疫原、表位)，用于产生此类核苷酸序列、产物、微生物的方法及其例如用于制备疫苗或免疫原性组合物或者引起免疫学或免疫应答或者作为载体例如作为表达载体(例如体外或体内表达载体)的用途。

在微生物的核苷酸序列和基因内引入的突变产生新型和非显而易见的减毒突变体。这些突变体用于产生减毒的活免疫原性组合物或具有高度免疫原性的减毒活疫苗。

突变的鉴定提供新型和非显而易见的核苷酸序列和基因，以及由核苷酸序列和基因编码的新型和非显而易见的基因产物。

在一个实施方案中，本发明提供了减毒的高糖基化猪流感毒株，其能够在猪中提供针对流感或由流感引起的疾病的安全有效的免疫应答。在一个实施方案中，毒株可以编码相对于剧毒亲本株具有至少1个另外的糖基化位点的HA基因。

在另一个实施方案中，减毒株可以编码相对于剧毒亲本株具有4或5个另外糖基化位点的HA基因。在特定实施方案中，毒株糖基化位点选自S71N、K90N、L173T、P287T和K294T，其中氨基酸变化的位置是基于具有如SEQ ID NO:18所示的序列的HA基因。

在一个实施方案中，通过减毒的流感毒株产生的HA蛋白质具有如SEQ ID NO:22所示的序列或与SEQ ID NO:22具有至少90％同源性的序列，条件是下述位置具有下述氨基酸：71N、90N、173T、287T和294T。

在另一个实施方案中，减毒流感产生具有如SEQ ID NO:24所示的序列或与SEQ ID NO:24具有至少90％同源性的序列的HA蛋白质，条件是下述位置具有下述氨基酸：71N、90N、173T、287T。

在另一个方面，本发明提供了包含减毒的流感毒株的免疫原性组合物，其编码高糖基化的HA蛋白质。在一个实施方案中，该组合物可以进一步包含药学或兽医学可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

在一个实施方案中，该组合物在猪中提供针对剧毒猪流感攻击的保护性免疫应答。在一些实施方案中，该组合物进一步包含与除猪流感外的病原体相关的至少一种另外的抗原。

在另一个实施方案中，至少一种另外的抗原选自M.hyo、PCV2、PRRSV、SIV或能够在猪中感染且引起疾病或对疾病的敏感性的其他病原体，或其组合。

在一个实施方案中，本发明提供了给动物接种疫苗的方法，其包括至少一次施用包含编码高糖基化的流感HA蛋白质的序列的组合物。在另一个实施方案中，猪是分娩前约3周至约6周的母猪。在另外一个实施方案中，与来自未接种疫苗的母猪的仔猪相比较，所得到的仔猪可以具有降低的发病率和/或死亡率。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含用于产生减毒的猪流感的多种载体的组合物，所述多种载体包括包含与流感病毒HA cDNA可操作地连接的启动子的载体，其中相对于由剧毒亲本猪流感毒株编码的HA，所述HA cDNA编码另外的糖基化位点。在一个特定实施方案中，另外的糖基化位点选自S71N、K90N、L173T、P287T和K294T，并且氨基酸变化的位置是基于具有如SEQ ID NO:18所示的序列的HA基因。

在一个实施方案中，用于产生减毒流感的HA cDNA编码如SEQID NO:22所示的蛋白质。在另一个实施方案中，HA cDNA编码如SEQID NO:24所示的蛋白质。

在一个实施方案中，本发明提供了制备流感病毒的方法，其包括：使细胞与对于获得传染性流感病毒有效的量的本发明组合物之一接触。在一个实施方案中，该方法进一步包括分离病毒。

在另一个实施方案中，本发明提供了制备基因递送媒介物的方法，其包括：使细胞与对于获得流感病毒有效的量的本发明组合物接触，并且分离病毒。本发明进一步提供了与本发明组合物接触的细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了包含用于产生减毒猪流感的多种载体的脊椎动物细胞，所述多种载体包括包含与流感病毒HA cDNA可操作地连接的启动子的载体，其中所述HA cDNA编码相对于由剧毒亲本猪流感毒株编码的HA而言另外的糖基化位点。

本领域进一步涵盖基因产物，其提供抗原、免疫原和表位，并且用作分离的基因产物。

此类分离的基因产物以及其表位也用于生成抗体，所述抗体用于诊断应用中。

可以提供或生成表位、抗原或免疫原的此类基因产物也用于免疫原性或免疫学组合物，以及疫苗。

在一个方面，本发明提供了在核苷酸序列或基因中含有减毒突变的病毒，其中所述突变修饰由基因编码的多肽或蛋白质的生物活性，导致病毒的毒力减弱。

特别地，本发明涵盖减毒的猪流感毒株和包含其的疫苗，所述减毒的猪流感毒株在动物中引发免疫原性应答，特别是在猪中引发、诱导或刺激应答的减毒的猪流感毒株。

相对于野生型剧毒亲本株，特别感兴趣的猪流感减毒株具有在基因中与毒力相关的突变。除具有公开突变的毒株之外，认识到在公开的毒力基因中具有任何数目突变的减毒株均可以用于本发明的实践中。

在另一个方面，将新型减毒的猪流感毒株配制成针对猪流感和由猪流感引起的感染/疾病的安全有效疫苗。

在一个实施方案中，猪流感疫苗进一步包含佐剂。在特定实施方案中，佐剂是粘膜佐剂例如壳聚糖、甲基化壳聚糖、三甲基化壳聚糖或其衍生物或组合。

在一个实施方案中，佐剂包含完整细菌和/或病毒，包括副猪嗜血杆菌(H.parasuis)、梭菌属(clostridium)、猪流感病毒(SIV)、猪环状病毒(PCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、嗜组织菌属(Histophious)、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、或其组合和/或变体。在几个实施方案中，佐剂增加动物的IgM、IgG、IgA和/或其组合的产生。

“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可以包含被杀死的、减毒的或活的完整生物体；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性特性的***片段的重组载体；在呈递给宿主动物后能够诱导免疫应答的DNA小片或片段；多肽、表位、半抗原或其任何组合。备选地，免疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。

术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸残基的聚合物。所述聚合物可以是线性或分支的，它可以包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被除氨基酸外的化学部分间断。该术语还涵盖已经天然或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分或生物活性组分缀合。

如本文使用的术语“免疫原性或抗原性多肽”包括免疫活性的多肽，其意义是一旦施用于宿主，它就能够诱发针对蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，蛋白质片段是这样的，使得它具有与总蛋白质基本上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一种表位或抗原决定簇，或者基本上由至少一种表位或抗原决定簇组成，或者由至少一种表位或抗原决定簇组成。如本文使用的，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指蛋白质的片段，其包括一种或多种表位并且因此引发上文描述的免疫学应答。此类片段可以使用本领域众所周知的任何数目的表位作图技术进行鉴定。参见例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(GlennE.Morris，编辑，1996)。例如，线性表位可以通过例如下述进行测定：在固体支持物上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的部分，并且在肽仍附着至支持物的同时，使肽与抗体反应。此类技术是本领域已知的，并且在例如美国专利号4,708,871；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986中描述。类似地，构象表位通过例如经由x射线晶体学和2维核磁共振测定氨基酸的空间构象容易地鉴定。参见例如，Epitope Mapping Protocols，同上。尤其可应用于小泰勒虫(T.parva)的蛋白质的方法在通过引用全文并入本文的PCT/US2004/022605中充分描述。

如本文讨论的，本发明涵盖抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性或抗原性多肽”进一步考虑了对序列的缺失、添加和置换，只要多肽作用于产生如本文定义的免疫学应答。术语“保守变化”指示氨基酸残基被另一种生物学相似的残基的替换，或核酸序列中的核苷酸的替换，从而使得所编码的氨基酸残基不改变或是另一种生物学相似的残基。在这点上，特别优选的置换一般在性质中是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些置换。例如，氨基酸一般分成四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。保守变化的例子包括一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水性残基，或一个极性残基置换另一个极性残基，例如精氨酸置换赖氨酸，谷氨酸置换天冬氨酸，或谷氨酰胺置换天冬酰胺等等；或氨基酸由结构相关氨基酸的类似保守替换，其对生物活性没有主要作用。具有与参考分子基本上相同的氨基酸序列，但具有基本上不影响蛋白质的免疫原性的微小氨基酸置换的蛋白质因此在参考多肽的定义内。所有通过这些修饰产生的多肽均包括在本文中。术语“保守变化”还包括使用置换的氨基酸代替未置换的亲本氨基酸，条件是针对置换多肽产生的抗体也与未置换多肽免疫反应。

术语“表位”指特异性B细胞和/或T细胞对其响应的抗原或半抗原上的位点。该术语还可与“抗原决定簇”或“抗原决定位点”互换使用。识别相同表位的抗体可以在简单免疫测定法中进行鉴定，所述免疫测定法显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原的结合的能力。

针对组合物或疫苗的“免疫学应答”是宿主中针对目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，“免疫学应答”包括但不限于下述效应中的一种或多种：特异性针对目的组合物或疫苗中包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主展示治疗性或保护性免疫学应答，从而使得对新感染的抗性将得到增强和/或疾病的临床严重性得到降低。此类保护将通过通常下述证实：通常由受感染宿主展示的症状和/或临床疾病征兆的降低或缺乏，更快速的恢复时间和/或在受感染宿主中降低的病毒滴度。

“动物”意指哺乳动物、鸟等等。如本文使用的动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可以选自马科(例如马)、犬科(例如犬、狼、狐狸、郊狼、豺)、猫科(例如狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫、以及其他猫科动物包括猎豹和山猫)、羊科(例如绵羊)、牛科(例如牛)、猪科(例如猪)、禽类(例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类(例如原猴、眼镜猴、猴、长臂猿、猿)、雪貂、海豹和鱼。术语“动物”还包括在所有发育阶段中的个别动物，包括新生儿、胚胎和胎儿阶段。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。单数术语“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。类似地，单词“或”意欲包括“和”，除非上下文另有明确说明。

应当指出在本公开内容且特别是权利要求和/或段落中，术语例如“包含”等等可以具有美国专利法中归于其的含义；例如，它们可以意指“包括”等等；并且术语例如“基本上由……组成”具有美国专利法中归于其的含义，例如它们允许未明确叙述的元件，但排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新型特征的元件。

组合物

本发明涉及猪流感疫苗或组合物，其可以包含减毒的猪流感毒株和医学或兽药学可接受的运载体、赋形剂或媒介物，其在动物中引发、诱导或刺激应答。

术语“核酸”和“多核苷酸”指其为线性或分支、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交物。该术语还涵盖RNA/DNA杂交物。下述是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其他糖和连接基团例如氟核糖和硫醇盐、以及核苷酸分支。核苷酸的序列可以在聚合后例如通过与标记组分缀合进一步修饰。在该定义内包括的其他类型的修饰是帽、天然存在的核苷酸中的一种或多种被类似物的置换、和将多核苷酸附着至蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的方式的引入。多核苷酸可以通过化学合成获得或衍生自微生物。

术语“基因”广泛地用于指与生物功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因包括如在基因组序列中的内含子和外显子，或如cDNA中的仅编码序列和/或其表达所需的调节序列。例如，基因还指表达mRNA或功能RNA，或编码特异性蛋白质且包括调节序列的核酸片段。

“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)指已与其中天然存在组分的生物体的细胞中的其他生物组分基本上分离或纯化的组分，例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包含通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。

术语“保守变化”指示氨基酸残基被另一个生物学相似的残基的替换，或核酸序列中的核苷酸替换，从而使得编码的氨基酸残基不改变或是另一个生物学相似的残基。在这点上，特别优选的置换一般在性质中是保守的，如上所述。

术语“重组体”意指具有半合成或合成起源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以自然界中未发现的排列与另一种多核苷酸连接。

“异源的”意指衍生自它待与之比较的实体的剩余部分遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可以通过基因工程技术置于衍生自不同来源的质粒或载体内，并且是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出且与除天然序列外的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。

本发明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在相同转录单位内的另外编码序列，控制元件例如启动子、核糖体结合位点、5’UTR、3’UTR、转录终止子、多腺苷酸化位点，在相同或不同启动子控制下的另外转录单位，允许宿主细胞的克隆、表达、异源重组和转化的序列，以及如提供本发明的实施方案可能期望的任何此类构造。

使用方法和制造物品

本发明包括下述方法实施方案。在一个实施方案中，公开了给动物接种疫苗的方法，其包括给动物施用组合物，所述组合物包含减毒的猪流感毒株和药学或兽医学可接受的运载体、赋形剂或媒介物。在这个实施方案的一个方面，动物是猪。

在本发明的一个实施方案中，可以采用初免-加强方案，其包含使用至少一种共同多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初免施用和至少一次加强剂施用。通常，在初免施用中使用的免疫组合物或疫苗在性质中不同于用作加强剂的那些。然而，应当指出相同组合物可以用作初免施用和加强剂施用。该施用方案被称为“初免-加强”。

初免-加强方案包含使用至少一种共同多肽和/或其变体或片段的至少一次初免施用和至少一次加强施用。在初免施用中使用的疫苗在性质中可以不同于用作以后加强剂疫苗的那些。初免施用可以包括一次或多次施用。类似地，加强施用可以包含一次或多次施用。

基于病毒抗原，用于其为哺乳动物的靶物种的组合物的剂量体积，例如家猪或猪组合物的剂量体积，一般为约0.1至约2.0ml，约0.1至约1.0ml，和约0.5ml至约1.0ml。

疫苗的功效可以在末次免疫接种后约2至4周通过用猪流感的剧毒株攻击动物例如猪进行测试。同源和异源毒株两者均用于攻击，以测试疫苗的功效。动物可以通过IM或SC注射、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或经口进行攻击。来自关节、肺、脑和/或口的样品可以在攻击前和后进行收集，并且可以分析猪流感特异性抗体的存在。

用于初免-加强方案中的包含本发明的减毒病毒株的组合物包含在药学或兽医学可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂中。本发明的方案保护动物不受猪流感和/或阻止受感染动物中的疾病进展。

多次施用优选相隔1至6周进行。优选时间间隔为3至5周，并且根据一个实施方案最佳为4周，还设想了每年一次的加强剂。动物例如家猪在第一次施用时可以是至少3-4周龄。

本领域技术人员应当理解本文公开内容提供作为例子并且本发明并不限于此。根据本文公开内容和本领域的知识，技术人员可以确定施用次数、施用途径和待用于每种注射方案的剂量，而无需任何过度实验。

本发明的另一个实施方案是用于执行在动物中引发或诱导针对猪流感的免疫学或保护性应答的方法的试剂盒，其包括以在动物中引发免疫应答的有效量的减毒的猪流感免疫组合物或疫苗和执行递送方法的说明书。

本发明的另一个实施方案是用于执行在动物中诱导针对猪流感的免疫学或保护性应答的方法的试剂盒，其包括包含以在动物中引发免疫应答的有效量的本发明的减毒猪流感毒株的组合物或疫苗和执行递送方法的说明书。

本发明的另外一个方面涉及如上所述的根据本发明用于初免-加强疫苗接种的试剂盒。该试剂盒可以包含至少两个小瓶：第一小瓶含有根据本发明用于初免疫苗接种的疫苗或组合物，并且第二小瓶含有根据本发明用于加强疫苗接种的疫苗或组合物。该试剂盒可以有利地含有另外的第一或第二小瓶用于另外的初免疫苗接种或另外的加强疫苗接种。

医学或兽医学可接受的运载体或媒介物或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如，医学或兽医学可接受的运载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可以用于本发明的方法的其他医学或兽医学可接受的运载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。医学或兽医学可接受的运载体或媒介物或赋形剂可以是促进载体施用的任何化合物或化合物组合(或在体外由本发明载体表达的蛋白质)；有利地，运载体、媒介物或赋形剂可以促进载体(或蛋白质)的转染和/或改善载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文中在一般描述中讨论，并且还可以通过技术人员由与本领域知识结合阅读的本公开内容确定，而无需任何过度实验。

根据本发明的免疫组合物和疫苗可以包含一种或多种佐剂，或者基本上由一种或多种佐剂组成。用于本发明的实践中的合适佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化的CpG单位的寡聚脱氧核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳状液，例如在由M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995公开的“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页上描述的SPT乳状液，和在相同著作的第183页上描述的乳状液MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在引用且通过引用并入本申请的任何文件中讨论的其他佐剂，或(9)其任何组合或混合物。

在一个实施方案中，佐剂包括促进通过粘膜衬里的改善吸收的那些。一些例子包括MPL、LTK63、毒素、PLG微粒和几种其他佐剂(Vajdy，M.Immunology and Cell Biology(2004)82，617–627)。在一个实施方案中，佐剂可以是壳聚糖(Van der Lubben等人2001；Patel等人2005；Majithiya等人2008；美国专利序列号5,980.912)。

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本发明目前将通过下述非限制性例子进一步描述。

实施例

实施例1–高糖基化的猪流感病毒的构建

材料/方法

从显示出流感样疾病的猪中收集临床样品(鼻拭子或肺组织)，并且提交用于病毒分离和表征(常规诊断测试)。对在含有5％胎牛血清的DMEM中在37℃与5％CO₂下生长的猪睾丸(ST)细胞执行病毒分离。对于病毒繁殖，从DMEM中省略胎牛血清。293T和MDCK细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中繁殖。使用5x MagMax-96Viral Isolation Kit(Life Technologies)，从受感染的细胞培养收获流体中收获RNA。

使用先前描述的多区段逆转录PCR方法(Zhou B等人，2009)，扩增完整病毒基因组。使用NEBNext Fast DNA Fragmentation andLibrary Prep Set 4试剂盒，根据制造商的说明书(New EnglandBiolabs)制备病毒cDNA文库，除了试剂盒衔接子替换为有条形码的衔接子(Ion Xpress Barcode Adaptor 1-16Kit，Life Technologies)之外。使用Ion Xpress Template Kit版本2.0(Life Technologies)制备DNA测序模板，并且使用Ion Torrent Personal Genome Machine(Life Technologies)测序。使用SeqMan NGen软件(DNAStar)装配重叠群。通过BLAST分析鉴定编码全长HA的重叠群。使用ClustalW方法比对全长HA DNA序列。使用MEGA 5.0，使用邻近连接方法执行***进化分析，并且用1000个自举重复(Tamura K等人，2011)验证树形布局。HA基因序列在登记号JQ638655-JQ638665下保藏于Genbank。

反向遗传学。在分子生物学的背景下，“反向遗传学”定义为生成具有衍生自克隆的cDNA的基因组的病毒(关于综述，参见Neumann等人，J.Gen.Viral.，83:2635；2002)。在本研究中，三联内部重排基因盒(TRIG)猪流感病毒(A/swine/North Carolina/3793/08(H1N1))用作模板，以产生TRIG猪流感病毒反向遗传学***。所有八个区段均进行PCR扩增，用BsmBI消化且如前所述(Hoffmann E等人，2001)连接到类似消化的pHW2000内。具有***片段的质粒通过限制性消化进行鉴定并且测序，以验证与A/swine/North Carolina/3793/08的同一性。来自10-0036-2的HA和NA基因(SEQ ID NOs:7和11)也克隆到pHW2000(Hoffmann等人2000，PNAS 97(11):6108-6113)内，并且连同具有衍生自A/swine/North Carolina/3793/08的聚合酶基础2(PB2)、聚合酶基础1(PB1)、聚合酶酸(PA)、核蛋白(NP)、基质(M)和非结构基因(NS)的质粒一起转染，以产生反向遗传学衍生的10-0036-2(RG 10-0036-2，图1)。使用Quik Change II SiteDirected Mutagenesis试剂盒(Agilent Technologies)，对含有来自10-0036-2的HA基因的质粒执行定点诱变，以制备具有另外的1-5个N联糖基化位点的突变体(表1，图2)。在位于N-X-S/T的N联糖基化基序的背景下的天冬酰胺(N)残基处，将聚糖加入蛋白质中，其中N是氨基酸天冬酰胺，X是任何氨基酸，并且S/T是丝氨酸或苏氨酸。

表1.使用定点诱变改造到RG10-0036-2的HA基因内的另外的N链糖基化位点

重组病毒的挽救如先前所述(Hoffmann E等人，2000)执行。简言之，在转染前大约18小时，在含有5％FBS的Opti-MEM I中在含有大约1x10⁶细胞的每种293T和MDCK的6孔板中共培养293T和MDCK细胞。各一百纳克的八种质粒在100μL Opti-MEM I中合并，并且与含有3μL Lipofectamine(Invitrogen)的100μL Opti-MEM组合，并且在用Opti-MEM I稀释至1mL前在室温下温育15分钟，并且转移至6孔板的单个孔。在转染混合物替换为Opti-MEM I前，使板在37℃与5％CO₂下温育6小时。在转染后24小时，将1.5mL转移至汇合的MDCK细胞的6孔板，并且加入含有1μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶的1.5mL DMEM。在转染后第5天时收获病毒，并且通过HA测定法确定其滴度。测序挽救的病毒的HA基因，以验证正确序列。

结果。对于病毒10-0036-2，预测的N联糖基化位点(N-X-S/T)的遗传分析发现在N28、N40、N104、N142、N176、N303、N497和N556处的位点。定点诱变用于将另外的1-5个N联糖基化位点加入HA的球状头部部分(表1)。在来自细胞培养的病毒挽救后，通过在ST细胞上的生长研究表征突变型病毒。执行生长研究，因为减毒病毒通常在体外证实减少的生长率和滴度。具有4或5个另外的N联糖基化位点的突变型病毒显示此类生长缺陷，提示另外的糖基化使病毒减毒。减毒病毒接下来在猪中进行评估，以评估其在体内的毒力且表征针对这些突变型病毒的免疫应答。

实施例2–减毒的猪流感疫苗在猪中的功效

材料与方法。六十只3周大的高度健康的猪(通过IDEXXFlockChek ELISA证实SIV血清阴性)分成在分开室中的15只的4组。在第0天(d0)时，用2mL 6.0TCID₅₀/mL病毒鼻内接种猪。组1用细胞培养基(DMEM)模拟感染。组2接受10-0036-2n+5。组3接受10-0036-2n+4(具有4个另外的糖基化位点的突变型；类似于n+5，但缺乏突变A881C[K294T])。组4接受反向遗传学制备的10-0036-2亲本(无突变)。猪在第0天时进行擦拭(鼻)，并且样品通过QPCR就SIV检测运行，以验证无活动性感染。结果概括于表2中。对于表2和3，具有不同字母的组具有统计上不同的方式(P<0.05)。例如，“A”统计上不同于“B”，并且“BC”统计上不同于“A”，而不是“B”或“C”。

表2.疫苗接种研究

在第1、3和5天时收集鼻拭子。来自每组的五只猪在第5天时实施安乐死，并且收集肺样品。来自第1天的拭子通过QPCR进行分析。来自第3和5天的拭子以及肺样品就SIV进行滴定。将肺送往University Diagnostic实验室用于组织病理学分析和IHC。在第21天时，如上对猪再进行接种疫苗。这些结果证实含有4或5个另外的N联糖基化位点的突变体在猪中是减毒和无毒力的，与体外生长研究一致。鼻拭子滴定指示病毒能够在体内复制，然而，在肺中不存在病毒和缺乏肺损伤提示复制限制于上呼吸道。赋予温度敏感性的其他流感基因中的突变已显示使感染限制于上呼吸道，并且是人流感减毒活疫苗FluMist^TM的基础。

在第31天时，用野外分离物12-1110-1(H3N2)攻击猪。攻击研究的结果概括于表3中。对于攻击(与Richt等人2006，J.Virology 80(22):11009-11018可比较地执行)，鼻内递送2mL 4.6TCID50/mL。在第31天时在攻击前收集血液和鼻拭子。在第0和1天时收集鼻拭子，并且通过QPCR进行分析。在第3和5天时收集鼻拭子，并且通过滴定确定SIV滴度。所有猪均在第5天时实施安乐死，并且通过滴定分析肺样品。肺样品如上进行分析。

表3.攻击研究

这些结果证实如通过滴定和IHC在肺中的病毒缺乏，以及无肺损害的证据而显示的，用突变型n+4或n+5接种疫苗的猪被保护免于疾病。首次用于实验的(阴性对照)猪容易被H3N2攻击病毒感染，并且证实典型流感疾病。先前由亲本病毒10-0036-2感染的猪也被保护免于H3N2攻击。

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因此已详细描述本发明的优选实施方案，应当理解通过上述段落限定的本发明并不限于上文说明书中所述的具体细节，因为其许多显而易见的变化是可能的，而不背离本发明的精神或范围。

Claims (20)

1.一种减毒的猪流感毒株，其能够在猪中提供针对流感或由流感引起的疾病的安全有效的免疫应答。

2.权利要求1的毒株，其编码相对于剧毒亲本株具有至少1个另外的糖基化位点的HA基因。

3.权利要求2的毒株，其编码相对于剧毒亲本株具有至少4个另外的糖基化位点的HA基因。

4.权利要求3的毒株，其中所述糖基化位点选自S71N、K90N、L173T、P287T和K294T，并且其中所述氨基酸变化的位置是基于由具有如SEQ ID NO:18所示的序列的剧毒亲本株编码的HA基因。

5.权利要求4的毒株，其编码具有如SEQ ID NO:22所示的序列或与SEQ ID NO:22具有至少90％同源性的序列的HA蛋白质，条件是下述位置具有下述氨基酸：71N、90N、173T、287T和294T。

6.权利要求5的毒株，其中所述HA蛋白质具有如SEQ ID NO:22所示的序列。

7.权利要求4的毒株，其编码具有如SEQ ID NO:24所示的序列或与SEQ ID NO:24具有至少90％同源性的序列的HA蛋白质，条件是下述位置具有下述氨基酸：71N、90N、173T、287T。

8.权利要求7的毒株，其中所述HA蛋白质具有如SEQ ID NO:24所示的序列。

9.一种免疫组合物，其包含权利要求4-8中任一项的减毒株。

10.权利要求9的组合物，其进一步包含药学或兽医学可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂，并且其在猪中提供针对剧毒猪流感攻击的保护性免疫应答。

11.权利要求10的组合物，其进一步包含与除猪流感外的猪病原体相关或衍生自与除猪流感外的猪病原体的至少一种另外的抗原。

12.权利要求11的组合物，其中所述至少一种或多种另外的抗原能够在猪中引发针对M.hyo、PCV2、PRRSV、SIV或能够在猪中感染且引起疾病或对疾病的敏感性的其他病原体的免疫应答。

13.一种给动物接种疫苗的方法，其包括至少一次施用包含权利要求10的组合物。

14.权利要求13的方法，其中所述猪是分娩前约3周至约6周的母猪。

15.权利要求14的方法，其中与来自未接种疫苗的母猪的仔猪相比较，所述所得到的仔猪具有降低的发病率和/或死亡率。

16.一种包含用于产生减毒的猪流感的多种载体的组合物，所述多种载体包括包含与流感病毒HA cDNA可操作地连接的启动子的载体，其中相对于由剧毒亲本猪流感毒株编码的HA，所述HA cDNA编码另外的糖基化位点。

17.权利要求16的组合物，其中所述另外的糖基化位点选自S71N、K90N、L173T、P287T和K294T，并且所述氨基酸变化的数是基于由具有如SEQ ID NO:18所示的序列的剧毒亲本株编码的HA基因。

18.权利要求17的组合物，其中用于产生减毒流感的所述HAcDNA编码如SEQ ID NO:22或24所示的蛋白质。

19.一种制备流感病毒的方法，其包括：使细胞与对于获得传染性流感病毒有效的量的权利要求16-18中任一项的组合物接触。

20.一种细胞，其包含权利要求19的多种载体。