CN1829799A - 含polii启动子和核酶的重组流感载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用包括PolII启动子和多个核酶序列的载体用于制备流感病毒的组合物，例如在缺少辅助病毒时。

Description

含POLII启动子和核酶的重组流感载体

相关申请的相互参照

本申请要求2003年5月28日申请的美国申请系列号60/473,797的申请日的根据35U.S.C.§119(e)的益处，其公开内容在此引入作为参考。

政府权利的声明

本发明是在美国政府基金资助下(国立***反应和传染病公共卫生服务学会(the National Institute of Allergy and Infectious DiseasesPublic Health Service)基金AI-47446)作出的。政府可以享有本发明的某些权利。

发明背景

负义RNA病毒分为七个家族(弹状病毒科(Rhabdoviridae)、副粘病毒科、丝状病毒科、波那病毒科(Bornaviridae)、正粘病毒科、本扬病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))，它包括常见的人病原体，如呼吸道合胞病毒、流感病毒、麻疹病毒和埃博拉病毒，以及对家禽和家畜产业有主要经济影响的动物病毒(例如新城疫病毒和牛瘟病毒)。前四个家族的特征在于非节段基因组，而后三个分别具有包含六至八个、三个或两个负义RNA节段的基因组。负义RNA病毒(negative-sense RNA virus)的共同特征是它们RNA基因组的负极性；即，病毒RNA(vRNA)与mRNA互补，因此其自身没有传染性。为了启动病毒转录和复制，vRNA不得不分别通过病毒聚合酶复合体和核蛋白转录为正义mRNA或cRNA；对于甲型流感病毒，病毒聚合酶复合体包括三个聚合酶蛋白PB2、PB1和PA。在病毒复制过程中，cRNA用作新vRNA分子合成的模板。对于所有负链RNA病毒，vRNA和cRNA的5′和3′末端非编码区对病毒基因组的转录和复制是关键的。与细胞或病毒mRNA转录物不同，cRNA和vRNA两者既不在5′末端加帽，也不在3′末端聚腺苷酸化。

许多病毒蛋白的基本功能已在生物化学上和/或在病毒感染方面被阐明。然而，反向遗传学***显著地增长了我们对负链节段和非节段RNA病毒关于它们的病毒复制和致病性，以及活减毒病毒疫苗发展的认识。反向遗传学，该术语用于分子病毒学时，定义为具有来源于克隆cDNAs的基因组的病毒的产生(对于综述，见Neumann et al.，2002)。

为了启动负链RNA病毒的病毒复制，vRNA(s)或cRNA(s)必须与聚合酶复合体和核蛋白共表达。狂犬病病毒是完全从克隆cDNA产生的第一个非节段负义RNA病毒：Schnell et al.(1994)通过编码全长cRNA的cDNA构建体和都处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的L、P和N蛋白的蛋白表达构建体的共转染产生了重组狂犬病病毒。用提供T7RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染导致传染性狂犬病病毒的产生。在这个T7聚合酶***中，在T7 RNA聚合酶控制之下的全长cRNA的初级转录产生非加帽cRNA转录物。然而，形成T7RNA聚合酶的最佳起始序列的三个胍核苷酸(guanidine nucleotides)附于5′末端。为了产生对生产性感染循环必不可少的cRNA转录物正确的3′末端，cRNA转录物3′末端的精确自身催化切割使用肝炎6核酶(HDVRz)序列。

自从Schnell et al.(1994)首次报道以来，使用类似技术的反向遗传学***引发许多非节段负链RNA病毒的产生(Conzelmann，1996；Conzelmann，1998；Conzelmann et al.，1996；Marriott et al.，1999；Munoz et al.，2000；Nagai，1999；Neumann et al.，2002；Roberts et al.，1998；Rose，1996)。最初的援救(rescue)方法包括从稳定转染的细胞系(Radecke et al.，1996)或从蛋白表达质粒(Lawson et al.，1995)表达T7RNA聚合酶，或热休克方法以增加援救效率(Parks et al.，1999)。基于T7聚合酶***，Bridgen和Elliott(1996)从克隆cDNAs产生了布尼奥罗病毒(本扬病毒科家族)并证明了通过T7聚合酶***人工产生节段负义RNA病毒的可行性。

1999年，以细胞RNA聚合酶I为基础产生了基于质粒的反向遗传学技术用于完全从克隆cDNAs产生节段甲型流感病毒而(Fodor et al.，1999；Neumann and Kawaoka，1999)。RNA聚合酶I-一种核仁酶，合成核糖体RNA，核糖体RNA如同流感病毒RNA，不含有5′帽或3′polyA结构。含有侧翼连接RNA聚合酶I启动子和终止子序列的流感病毒cDNA的构建体的RNA聚合酶I转录导致流感vRNA合成(Fodor etal.，1999；Neumann and Kawaoka，1999；Neumann and Kawaoka，2001；Pekosz et al.，1999)。该***效率很高，转染后48小时，每毫升质粒转染的细胞上清液产生10⁸个以上传染性病毒颗粒。然而，RNA聚合酶I的宿主细胞特异性限制了RNA聚合酶I***的应用。例如，人RNA聚合酶I启动子的启动子序列不被异源RNA聚合酶I识别，例如鼠RNA聚合酶I(Grummt et al.，1982；Learned et al.，1982)。

因此，需要的是完全从克隆cDNAs制备节段、负链RNA病毒的改进方法，例如正粘病毒如甲型流感病毒。

发明概述

本发明提供了至少一个下列分离的和/或纯化的载体：包含与连接转录终止序列的流感病毒PA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB2 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒HA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NP cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒M cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NS cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NA和NB cDNA可操作连接的启动子的载体，或包含与连接转录终止序列的流感病毒BM2 cDNA可操作连接的启动子的载体，其中该载体包含RNA聚合酶II启动子，该启动子连接第一个(5′)核酶序列，该序列连接病毒cDNA，该病毒cDNA连接第二个(3′)核酶序列，该第二个核酶序列连接转录终止序列。本发明范围内的核酶包括但不限于四膜虫核酶、RNase P、锤头核酶、发夹核酶、肝炎核酶，以及合成的核酶(对于示范核酶见Kumar et al.(1995)；Pley etal.(1994)；Chowrira et al.(1994)；Kijima et al.(1995)；和U.S.Patent Nos.5,631,115 and 5,683,902)。包含RNA聚合酶II启动子的载体中的核酶序列可以相同或不同，并且，当使用多个包含RNA聚合酶II启动子的载体时，每个载体可以包含相对于任何其它载体相同或不同的核酶序列。类似地，一个载体中的RNA聚合酶II启动子可以相同或不同于不同载体中的RNA聚合酶II启动子。cDNA相对于启动子可以是正义或反义方向。因此，本发明的载体可以编码正粘病毒蛋白(正义)或vRNA(反义)。可以使用任何合适的启动子或转录终止序列表达蛋白，例如病毒蛋白、非病毒病原体蛋白或治疗蛋白。

在一个实施方案中，用于制备vRNA的一个或多个载体包含RNA聚合酶II启动子。在另一个实施方案中，用于制备vRNA的一个或多个但不是所有载体包含不同于RNA聚合酶II启动子的启动子，启动子包括但不限于RNA聚合酶I启动子，例如人RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子或T3启动子。如果存在，优选包含RNA聚合酶II启动子的vRNA载体中的转录终止序列是RNA聚合酶II转录终止序列，其位于3’核酶序列的3’。不包含RNA聚合酶II启动子的vRNA载体的优选转录终止序列包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。尽管可预想任何病毒的基因都可以用在本发明的载体或方法中，但是优选，载体包含流感cDNA，例如甲型(例如任何甲型流感基因，包括任何15HA或9NA亚型)、乙型或丙型流感DNA(见Fields Virology的45和46章(Fields et al.(eds.)，Lippincott-Raven Publ.，Philadelphia，PA(1996)，在此特别引入作为参考)。

本发明提供了一种包含本发明的多个正粘病毒载体的组合物。在本发明的一个实施方案中，该组合物包含：a)选自包含与连接转录终止序列的流感病毒PA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB2 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒HA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NP cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒M cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作连接的启动子的载体的至少两个载体，其中至少一个载体包含RNA聚合酶II启动子，其连接第一个核酶序列的5’，第一个核酶序列连接对应于病毒编码序列的序列的5’，该序列连接第二个核酶序列的5’，第二个核酶序列连接转录终止序列的5’；和b)选自编码流感病毒PA的载体、编码流感病毒PB1的载体、编码流感病毒PB2的载体和编码流感病毒NP的载体的至少两个载体。任选，b)的载体包括编码NP、NS、M的一个或多个载体，例如M1和M2、HA或NA。

在本发明的另一个实施方案中，该组合物包含：a)选自包含与连接转录终止序列的流感病毒PA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB2 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒HA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NP cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NA和NB cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒M cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NS cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒BM2 cDNA可操作连接的启动子的载体的至少两个载体，其中至少一个载体包含RNA聚合酶II启动子，其连接第一个核酶序列的5’，第一个核酶序列连接对应于包括病毒编码序列的病毒序列的序列的5’，该序列连接第二个核酶序列的5’，第二个核酶序列连接转录终止序列的5’；和b)选自编码流感病毒PA的载体、编码流感病毒PB1的载体、编码流感病毒PB2的载体和编码流感病毒NP的载体的至少两个载体。任选，b)的载体包括编码NP、NS、M、HA或NA的一个或多个载体。

优选，编码病毒蛋白的载体进一步包含转录终止序列。优选包含流感病毒cDNA的载体的启动子包括RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子和T3启动子，然而，vRNA的至少一个载体包含RNA聚合酶II启动子。包含RNA聚合酶II启动子的vRNA载体包含侧翼连接核酶序列的病毒编码序列，和任选RNA聚合酶II转录终止序列，其连接3’核酶序列的3’。在一个实施方案中，一个或多个但不是所有用于制备vRNA的载体包括转录终止序列，例如RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。在一个实施方案中，至少2个和优选更多，例如3、4、5、6、7或8个用于制备vRNA的载体包含RNA聚合酶II启动子、第一个核酶序列、其连接对应于包括病毒编码序列的病毒序列的序列的5′，该序列连接第二个核酶序列的5′，该第二个核酶序列连接转录终止序列的5′。每个vRNA载体中的RNA聚合酶II启动子可以相同或不同于任何其它vRNA载体中的RNA聚合酶II启动子。类似地，每个vRNA载体中的每个核酶序列可以相同或不同于任何其它vRNA载体中的核酶序列。在一个实施方案中，单个载体中的核酶序列不相同。优选，载体包含流感DNA，例如甲型、乙型或丙型流感DNA。

本发明的另一个实施方案包括进一步包含载体的如上所述的本发明组合物，该载体包含与5′正粘病毒序列连接的启动子，其任选包括5′正粘病毒编码序列或其部分，其连接期望的核酸序列，例如期望的cDNA，其与3′正粘病毒序列连接，任选包括3′正粘病毒编码序列或其部分，其连接转录终止序列。优选，期望的核酸序列如cDNA是反义方向。这种组合物导入允许正粘病毒复制的宿主细胞产生包含对应于载体序列的vRNA的重组病毒，该载体包含5′正粘病毒序列，任选包含5′正粘病毒编码序列或其部分，其连接cDNA，其连接3′正粘病毒序列，任选包含3′正粘病毒编码序列或其部分。这种用于制备vRNA的载体中的启动子可以是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子和T3启动子，和任选该载体包含转录终止序列，如RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。在一个实施方案中，包含期望cDNA(感兴趣的cDNA)的载体包含RNA聚合酶II启动子，其连接第一个核酶序列，其连接感兴趣的cDNA，其连接第二个核酶序列，其连接转录终止序列。在另一个实施方案中，该载体包含RNA聚合酶II启动子，其连接第一个核酶序列，其连接5′正粘病毒序列，任选包括5′正粘病毒编码序列或其部分，其连接感兴趣的cDNA，其连接3′正粘病毒序列，任选包括3′正粘病毒编码序列或其部分，其连接第二个核酶序列，其连接转录终止序列。在另一个实施方案中，感兴趣的cDNA可以存在于用于蛋白表达的载体中。感兴趣的cDNA，无论在用于制备vRNA还是蛋白的载体中，都可以编码免疫原性表位，如对癌症治疗或疫苗或基因治疗有用的表位。

本发明的多个载体可以物理连接或每个载体可以存在于单独的质粒或其它例如线性核酸送递载体(delivery vehicle)中。

本发明也提供了制备流感病毒的方法。该方法包括使细胞接触有效产生传染性流感病毒量的本发明的多个载体，例如依次或同时，例如使用本发明的组合物。本发明也包括从接触该组合物的细胞中分离病毒。因此，本发明进一步提供了分离的病毒，以及接触本发明的组合物或病毒的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明包括在接触用于制备vRNA或蛋白的载体的其它载体之前，使细胞接触一个或多个用于制备vRNA或蛋白的载体。

如下文所述，完全从克隆的cDNAs制备甲型流感病毒。此外，对于其它病毒可以使用相同方法完全从克隆的cDNA制备非节段负链RNA病毒(即副粘病毒科、弹状病毒科和丝状病毒科)，或其它节段负链RNA病毒，例如沙粒病毒科和本扬病毒科。

本发明的方法允许流感病毒的容易操作，例如减毒突变导入病毒因组。此外，因为流感病毒诱导强烈的体液和细胞免疫，所以本发明大大提高了这些病毒作为疫苗载体，尤其是考虑到病毒天然变异体的可得性，它们可以顺序使用，允许基因治疗重复使用。

因此，本发明提供了分离和纯化的载体或质粒，它表达或编码流感病毒蛋白，或表达或编码流感vRNA-天然和重组vRNA。因此，本发明的载体或质粒可以包含感兴趣的基因或开放阅读框，例如，编码用作疫苗的免疫原性肽或蛋白的外源基因。优选，表达流感vRNA的载体或质粒包含适于在特定宿主细胞中表达的启动子，例如鸟类或哺乳动物宿主细胞，如犬科动物、猫科动物、马、牛、绵羊或灵长类动物细胞，包括人细胞，或优选适于在一个以上宿主中表达的启动子。也优选，包含对制备流感vRNA有用的DNA的一个或多个载体或质粒包含RNA聚合酶II转录终止序列。对于包含感兴趣的基因或开放阅读框的载体或质粒，优选该基因或开放阅读框侧翼连接5′和3′流感病毒序列，分别包括流感病毒的5′和3′非编码序列，和在一个实施方案中，侧翼连接5′和3′流感病毒序列的基因或开放阅读框可操作连接RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶II转录终止序列。当制备病毒时，包含基因或开放阅读框的载体或质粒可以代替流感病毒基因的载体或质粒或可以是除所有流感病毒基因的载体或质粒之外的载体或质粒。

在此描述的不需要辅助病毒感染来制备病毒的方法在病毒诱变研究和疫苗(例如对于AIDS、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、鼻病毒、丝状病毒、疟疾、疱疹和***)和基因治疗载体(例如对于癌症、AIDS、腺苷脱氨酶、肌营养不良、鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷和中枢神经***肿瘤)的制备中有用。因此，提供了医学治疗(例如疫苗或基因治疗)中使用的病毒。

本发明也提供了一种免疫个体抵抗病原体的方法，例如，细菌、病毒或寄生虫或恶性肿瘤。该方法包括给该个体施用有效免疫该个体的量的至少一种本发明分离的病毒，任选与佐剂结合。该病毒包括包含病原体编码的多肽或肿瘤特异性多肽的vRNA。

也提供了一种提高或增加哺乳动物中内源性蛋白表达的方法，该哺乳动物具有以内源性蛋白量降低或缺乏为特征的指征或疾病。该方法包括给该哺乳动物施用有效提高或增加该哺乳动物中内源性蛋白的量的本发明分离的病毒。优选，该哺乳动物是人。

附图简述

图1.建立的反向遗传学***的示意图。在RNP转染方法(A)中，使用体外合成vRNA将纯化的NP和聚合酶蛋白装配入RNPs。用RNPs转染细胞，随后是辅助病毒感染。在RNA聚合酶I方法(B)中，含有RNA聚合酶I启动子的质粒，编码待援救vRNA的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒转染细胞。由RNA聚合酶I进行的细胞内转录产生合成的vRNA，在辅助病毒感染后它被包装入子代病毒颗粒。在两个方法中，转染体病毒(即含有来源于克隆cDNA的RNA的病毒)选自辅助病毒群。

图2.产生RNA聚合酶I构建体的示意图。PCR扩增来源于流感病毒的cDNAs，用BsmBI消化并克隆入pHH21载体的BsmBI位点(E.Hoffmann，Ph.D.thesis，Justus，Liebig-University，Giessen，Germany)，该载体含有人RNA聚合酶I启动子(P)和小鼠RNA聚合酶I终止子(T)。终止子序列(^*T)上游的胸苷核苷酸表示流感病毒RNA的3′末端。甲型流感病毒序列以粗体字显示。(SEQ ID NOs：26-37)

图3.建议的产生节段负义RNA病毒的反向遗传学方法。含有RNA聚合酶I启动子、八个病毒RNA节段每一节段的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒连同蛋白表达质粒转染入细胞。尽管可以用表达PA、PB1、PB2和NP的质粒产生传染性病毒，但是所有剩余结构蛋白(括号中显示)的表达增加病毒制备效率，取决于所产生病毒。

图4.转染体病毒(transfectant virus)感染的细胞中FLAG表位的检测。抗体染色用来鉴定PR8-WSN-FL79(A，D)或A/WSN/33野生型病毒(B，E)感染的MDCK细胞中的NA，或模仿感染(mock-infected)的MDCK细胞(C，F)上的NA。感染后九小时，细胞用低聚甲醛固定，用Triton X-100处理并与抗FLAG(A-C)或抗WSN NA(D-F)单克隆抗体培养。阳性样品(A，D和E)中强烈的高尔基染色(红色)明显。

图5.PA突变体的回收。RT-PCR扩增每个病毒的PA基因，使用产生1226bp片段(mRNA的677至1903位，泳道1、3、5)的引物，然后用限制性酶Bspl20I(mRNA的846位，泳道4、7)或PvuII(mRNA的1284位，泳道2、6)消化。PCR产物中Bsp120I或PvuII位点的存在分别产生169bp和1057bp或607bp和619bp的片段。MW＝分子量标记。

图6A和6B.用来扩增流感序列的引物(SEQ ID NOS：1-16)。

图7.产生编码GFP蛋白的流感病毒样(VLP)RNA的pPolI-GFP质粒。这个质粒在甲型流感病毒节段5的5′和3′非编码区之间含有反义方向的GFP基因(来源于pEGFP-NI；Clontech，Palo Alto，CA)，侧翼连接人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子。各个蛋白表达质粒和含有RNA聚合酶I启动子、编码GFP报道基因的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒转染入293T细胞。由RNA聚合酶I进行的细胞内转录产生负极性GFP vRNA，由颠倒字母指示。收获含有VLPs的上清液，与流感辅助病毒混合并接种入MDCK细胞。

图8.甲型流感病毒的PA、PB1、PB2和NP蛋白将由RNA聚合酶I产生的GFP RNA包壳化，导致GFP表达。用表达PB2、PB1、PA和NP蛋白(A)的质粒或用除表达NP蛋白(B)的质粒外的所有质粒，连同用于细胞内合成报道基因vRNA的RNA聚合酶I-GFP基因质粒转染293T细胞。转染后固定细胞48小时，用荧光显微镜确定GFP表达。

图9.传染性流感VLPs的产生。用九个质粒转染293T细胞，每个质粒表达不同的病毒结构蛋白质(A)，或用省去NP(B)的构建体的八个质粒连同RNA聚合酶I-GFP基因质粒转染293T细胞。转染后四十八小时，收集含VLP的上清液，与A/WSN/33辅助病毒混合，并接种入MDCK细胞。在感染后10小时固定细胞，用荧光显微镜确定GFP表达。

图10.使用Cre重组酶在细胞中表达流感NS2蛋白的简图，用重组DNA分子(augment)其基因组。细胞基因组包含重组DNA分子，该分子包含与位点特异性重组位点(例如，loxP)相连的启动子，该位点连接转录终止序列，该序列以与第一位点特异性重组位点相同方向连接第二位点特异性重组位点，该第二位点特异性重组位点连接NS2基因。

图11.复制有缺陷的流感病毒的制备。

图12.pCAGGS-2Ribo-1的载体图。在脊椎动物细胞中，RNA聚合酶II驱动双核酶盒的RNA转录，该盒处于强大的鸡β-肌动蛋白启动子/CMV增强子盒控制之下。病毒cDNA克隆在锤头核酶位点(HamRz)下游和HDV核酶位点(HDVRz)上游。

图13.产生用于反向遗传学的全长vRNA的RNA聚合酶II/双核酶***的示意图。RNA聚合酶II产生的初级mRNA转录物包括侧翼连接两个核酶位点(HamRz和HDVRz)的vRNA。核酶引起的自身催化切割产生具有正确5′和3′末端的vRNA，它用作病毒转录和复制中的模板。

图14.从克隆cDNAs产生HK3PB2-627E病毒。HK3/PB2-627E的PA、PB1、NP、M、NS、NA和HA vRNAs由RNA聚合酶I***合成，而PB2vRNA由RNA聚合酶II/双核酶***提供。由蛋白表达构建体表达的病毒NP和聚合酶蛋白复制并转录vRNAs，导致所有病毒蛋白的合成和复制流感病毒的产生。

图15.从克隆cDNAs产生WSN/HK3PB2-627E病毒。A/WSN/33的PA、PB1、NP、M、NS、NA和HA vRNAs由RNA聚合酶I***合成，而WSN/HK3PB2-627E的PB2 vRNA由RNA聚合酶II/双核酶***提供。由蛋白表达构建体表达的病毒NP和聚合酶蛋白复制并转录vRNAs，导致所有病毒蛋白的合成和复制流感病毒的产生。

图16.示范的锤头(HH)、发夹(HP)和HDV核酶序列(SEQ IDNOS：23-25)。实线箭头表明自身加工位点。

发明详述

定义

这里使用的术语“分离的和/或纯化的”是指本发明载体、质粒或病毒的体外制备、分离和/或纯化，使得它与体内物质不相结合，或基本上从体外物质中纯化。分离的病毒制剂通常由体外培养和增殖获得并且基本上没有其它传染物。如这里使用的“基本上没有”意思是对于特定传染物，使用该物质的标准检测方法，处于检测水平之下。“重组”病毒是已经体外操作过，例如使用重组DNA技术而向病毒基因组中引入改变的病毒。如这里使用的术语“重组核酸”或“重组DNA序列或节段”是指核酸，例如DNA，它源自或分离自一种来源，可以随后体外化学改变，因此它的序列不是天然存在的，或对应于天然存在序列，该天然存在序列不是位于天然基因组中它们所处的位置。“源自”一种来源的DNA的实例是被鉴定为有用片段，并且然后以基本上纯的形式化学合成的DNA序列。这种“分离”自一种来源的DNA的实例是有用DNA序列，该序列被化学方法从所述来源切除或除掉，例如通过限制性内切酶的使用，使得它可以用基因工程方法被进一步操作，例如扩增，用于本发明。

流感病毒复制

甲型流感病毒具有编码总共十个蛋白的八个单链负义病毒RNAs(vRNAs)的基因组。流感病毒生活史从血球凝集素(HA)与宿主细胞表面上含有唾液酸的受体结合开始，后面是受体介导的胞吞作用。晚期内涵体的低pH触发HA构象变化，由此暴露HA2亚单位(所谓的融合肽)的N-末端。融合肽启动病毒和内涵体膜的融合，基质蛋白(M1)和RNP复合物释放到细胞质。RNPs由包壳化RNA的核蛋白(NP)和由PA、PB1和PB2蛋白形成的病毒聚合酶复合体组成。RNPs被运输到细胞核，在那里发生转录和复制。RNA聚合酶复合体催化三个不同的反应：具有5′帽和3′polyA结构的mRNA合成、全长互补RNA(cRNA)的合成和使用cDNA作为模板的基因组RNA的合成。然后新合成的vRNAs、NP和聚合酶蛋白装配到RNPs，从细胞核输出，并运输至胞质膜，在那里发生子代病毒颗粒的出芽。神经氨酸酶(NA)蛋白在感染后期起着决定性作用，通过从睡液酸寡糖除去唾液酸，由此从细胞表面释放新装配的病毒粒子并防止病毒颗粒自身聚集。尽管病毒装配包括蛋白-蛋白和蛋白-vRNA交互作用，但是这些交互作用的性质基本上未知。

尽管乙型和丙型流感病毒在结构上和功能上类似于甲型流感病毒，但是它们有一些差异。例如，乙型流感病毒不含具有离子通道活性的M2蛋白。类似地，丙型流感病毒不含具有离子通道活性的M2蛋白。然而，CM1蛋白可能具有这个活性。离子通道蛋白的活性可以用本领域熟知方法测定，参见例如Holsinger et al.(1994)和WO01/79273。

首戈托病毒(Thogotovirus)

首戈托病毒(THOV)代表正粘病毒科中的一个新属。它们由壁虱传播并且已经在家畜中发现，包括骆驼、山羊和牛。因此，THOV可以在壁虱和脊椎动物细胞中复制。THOV基因组包含单链负义RNA的六个节段。由三个最大的节段编码的蛋白显示与流感病毒聚合酶蛋白PB2、PB1和PA具有显著同源性。节段5编码与流感病毒NP相关的蛋白。由节段4编码的THOV糖蛋白与流感病毒HA或NA都没有同源性，但是它显示与杆状病毒糖蛋白具有序列相似性。认为最小的节段编码基质蛋白并且与任何流感病毒蛋白都不相似。如同流感病毒，vRNA的3′和5′末端是启动子活性所需的，并且这个活性分别位于vRNA的3′和5′末端的末端14和15个核苷酸。

THOV的mRNA合成由源自宿主细胞的帽结构启动。然而，与流感病毒对比，仅仅帽结构(无另外的核苷酸)从细胞mRNAs切割下来(Albo et al.，1996；Leahy et al.，1997；Weber et al.，1996).体外切割试验揭示vRNA的5′和3′末端是核酸内切酶活性所需的(Leahy et al.，1998)，但是模型cRNA启动子的添加不刺激核酸内切酶活性(Leahy etal.，1998)，这对于流感病毒已证明(Cianci et al.，1995；Hagen et al.，1994)。对于THOV提出“钩”结构(Leahy et al.，1997；Weber et al.，1997)，类似于对于流感病毒提出的瓶塞钻结构(Flick et al.，1996)。然而，仅仅在THOV vRNA启动子中发现这个“钩”结构。cRNA启动子序列不允许cRNA 5′末端的2和9位之间，和3和8位之间形成碱基对。在3和8位允许这些核苷酸之间碱基配对的改变刺激核酸内切酶活性，它是提出的“钩”结构的强力支持证据(Leahy et al.，1998)。此外，这个结构对于THOV生活史的调节可能是决定性的；vRNA启动子形成“钩”结构，可以刺激PB2核酸内切酶活性，因此允许转录。相比之下，cRNA启动子可能不形成“钩”结构且可能因此不能刺激核酸内切酶活性，由此导致复制。

本扬病毒科

本扬病毒科包括在人类中引起出血性或脑炎性发热(例如，Riftfever valley，Hantaan，La Crosse，和Crimean-Congo出血热)的几个病毒。球状和被膜病毒粒子含有三个单链负义RNA节段(Elliott，1997中综述)。最大节段(L)编码病毒RNA聚合酶蛋白(L蛋白)，而M节段编码两个病毒糖蛋白G1和G2，和一个非结构蛋白(NSm)。最小的节段(S)编码核壳蛋白(N)和第二个非结构蛋白(NSs)。病毒复制和转录发生在细胞质中，和新装配的病毒粒子通过高尔基体的膜出芽。

Bridgen & Elliott(1996)建立了反向遗传学***以完全从克隆cDNAs制备传染性布尼奥罗病毒。他们遵循Schnell et al.(1994)对于狂犬病病毒首次描述的策略：编码正义反基因组RNA(而不是编码负义基因组RNA)的cDNA在表达病毒聚合酶和核蛋白的细胞中进行细胞内转录。Bridgen & Elliott(1996)用表达T7聚合酶的牛痘病毒感染HeLaT4+细胞和用表达由S、M和L节段编码的蛋白的质粒转染这些细胞。然后他们用编码全长反基因组cDNAs的三个质粒转染这些细胞，该cDNAs侧翼连接T7聚合酶启动子和肝炎δ病毒核酶。为增加本扬病毒颗粒相对于牛痘病毒颗粒的数量，作者使用其中布尼奥罗而不是牛痘病毒复制的蚊子细胞。这个规程不仅可以用于基因工程改造本扬病毒科，而且可以用于产生用不同本扬病毒科菌株共感染细胞不易获得的重排列病毒。

为研究本扬病毒启动子元件和转录和复制所需的病毒蛋白，Dunnet al.(1995)在布尼奥罗S RNA节段的5′和3′非翻译区之间负义方向克隆了CAT基因。用表达由L和S节段编码的蛋白的构建体转染细胞，然后用体外转录的RNA转染，其引起CAT活性。本扬病毒S段以重叠阅读框编码两个蛋白-N和NSs。为确定这两个蛋白是否是转录和复制所需的，检测仅表达N或NSs的构建体的CAT活性。N蛋白表达连同L蛋白引起CAT活性，而用NSs表达构建体没有检测到CAT活性。因此，L和N蛋白对于本扬病毒样RNA的转录和复制足够。

如流感病毒一样，本扬病毒RNAs的末端序列互补且非常保守。因此认为这些序列元件定义本扬病毒启动子并且对于启动子活性是决定性的。病毒RNA 3′末端五个核苷酸的缺失急剧降低CAT表达(Dunnet al.，1995)。相比之下，5′末端两个核苷酸的添加或3′末端11或35个核苷酸的添加不消除CAT表达(Dunn et al.，1995)。因此，如同流感病毒聚合酶复合体，本扬病毒聚合酶蛋白显然可以内部启动转录和/或复制。

可用于本发明的细胞系和流感病毒

根据本发明，支持流感病毒有效复制的任何细胞可以用于本发明，包括表达减少或降低水平的一个或多个唾液酸的突变体细胞，唾液酸是流感病毒受体。该方法获得的病毒可以制备成重排列病毒。

优选，细胞是WHO认证的或可证明的传代细胞系。证明这种细胞系的必要条件包括关于家系、生长特征、免疫标记、病毒易感性、致肿瘤性和储藏条件中的至少一种的表征，而且通过在动物、蛋和细胞培养物中检测。这种表征用来证实该细胞没有可检测的外来物质。在一些国家，可能也需要细胞核学。此外，优选致肿瘤性在处于与用于疫苗制备的相同传代水平的细胞中检测。在被灭活或减毒用于疫苗制备前，优选用已表明得到一致结果的方法纯化病毒(参见例如世界卫生组织，1982)。

优选建立待使用的细胞系的完整表征，因此可以包括为终产物的纯度所作的适当检测。可以用于表征待用于本发明的细胞的资料包括(a)关于它的起源、衍生和传代史的信息；(b)关于它的生长和形态特征的信息；(c)外来物质的检测结果；(d)区别特征，如允许从其它细胞系中清楚辨认细胞的生物化学、免疫和细胞遗传模式；和(e)致肿瘤性的检测结果。优选，宿主细胞的传代水平或群体倍增尽可能低。

优选细胞中生产的病毒在疫苗或基因治疗配制前被高度纯化。通常，纯化方法将导致细胞DNA、其它细胞组分和外来物质的广泛清除。还可以使用广泛降解或变性DNA的方法。参见例如Mizrahi，1990。

疫苗

本发明的疫苗可以包含免疫原性蛋白，包括任何病原体的糖蛋白，例如来自一个或多个细菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明的流感病毒可以是流感病毒或其它病毒病原体的疫苗载体，包括但不限于慢病毒如HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒如CMV或HSV或***病毒。

通过超滤作用浓缩完全病毒粒子疫苗，然后通过区带离心或层析纯化。纯化前或后，使用例如***或β-丙内酯灭活。

亚单位疫苗包含纯化糖蛋白。可以如下制备这种疫苗：使用用洗涤剂处理成片段的病毒悬液，通过例如超速离心法纯化表面抗原。因此亚单位疫苗主要含有HA蛋白以及NA。使用的洗涤剂可以是阳离子洗涤剂，例如溴化十六烷基三甲铵(Bachmeyer，1975)、阴离子洗涤剂如脱氧胆酸铵(Laver & Webster，1976；Webster et al.，1977)；或非离子型洗涤剂如名为TRITON X100的被商品化的洗涤剂。也可以在用蛋白酶如菠萝蛋白酶处理病毒粒子后分离血球凝集素，然后用如Grandand Skehel(19721)描述的方法纯化。

片段疫苗包含已受到溶解脂质的试剂处理的病毒粒子。可以如下制备片段疫苗：在搅拌下，通过与洗涤剂有关的脂质溶剂如***或氯仿处理如上获得的纯化病毒的水悬液，灭活或不灭活。病毒被膜脂质的溶解导致病毒颗粒的破碎。恢复水相，其含有片段疫苗，主要组成是它们的原始脂质环境被消除的血球凝集素和神经氨酸酶和核或它的降解产物。然后如果尚未灭活，那么灭活残余传染性颗粒。

灭活疫苗.通过使用已知方法灭活本发明的复制病毒提供本发明的灭活流感病毒疫苗，所述方法例如但不限于***或β-丙内酯处理。可用于本发明的灭活疫苗类型可以包括全病毒(WV)疫苗或亚病毒粒体(SV)(片段)疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒，而SV疫苗含有纯化病毒，其用溶解含有脂质的病毒被膜的洗涤剂破坏，随后是残余病毒的化学灭活。

此外，可以使用的疫苗包括含有分离的HA和NA表面蛋白的疫苗，被称为表面抗原或亚单位疫苗。通常，对SV和表面抗原(即纯化的HA或NA)疫苗的反应类似。含有与流行病毒免疫上相关的NA抗原和无关的HA的实验灭活WV疫苗看来不如常规疫苗有效(Ogra etal.，1977)。优选含有全部两个相关表面抗原的灭活疫苗。

活减毒病毒疫苗.减毒活流感病毒疫苗还可以用于预防或治疗流感病毒感染，按照已知的方法步骤。优选减毒作用是根据已知方法通过来自减毒供体病毒的减毒基因转移至复制的分离物或重排列病毒而一步实现的(参见例如Murphy，1993)。由于对甲型流感病毒的抗性是通过对HA和NA糖蛋白的免疫反应的发展调节的，因此编码这些表面抗原的基因必须来自重排列病毒或高生长临床分离物。减毒基因源自于减毒亲本。在这个方法中，优选给予减毒作用的基因不编码HA和NA糖蛋白。否则，这些基因不能转入具有临床病毒分离物的表面抗原的重排列病毒。

已经评价了很多供体病毒可重复地减毒流感病毒的能力。作为非限制性实例，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应(cold adapted，ca)供体病毒可以用于减毒疫苗制备(参见例如Edwards，1994；Murphy，1993)。另外，通过ca供体病毒与本发明的有毒力复制病毒的交配可以产生减毒活重排列病毒疫苗。然后在25℃选择重排列后代，(限制有毒力病毒的复制)，在H2N2抗血清存在下，其抑制具有减毒A/AA/6/60(H2N2)ca供体病毒的表面抗原的病毒复制。

已经在人中评价了一大系列H1N1和H3N2重排列体并令人满意地发现：(a)有传染性、(b)对于血清阴性的儿童和免疫激发的成人减毒、(c)有免疫原性和(d)遗传稳定。ca重排列体的免疫原性与它们的复制水平相当。因此，通过新野生型病毒进行的ca供体病毒的六个可转移基因的获得可重复将这些病毒减毒用于接种易感成人和儿童。

通过定点诱变可以将其它减毒突变引入流感病毒基因以援救具有这些突变基因的传染性病毒。减毒突变可以引入基因组的非编码区，以及编码区。这种减毒突变还可以引入除HA或NA之外的基因，例如PB2聚合酶基因(Subbarao et al.，1993)。因此，还可以产生具有通过定点诱变引入的减毒突变的新供体病毒，和这种新供体病毒可以用在减毒活重排列体H1N1和H3N2疫苗候选物的减毒，以类似于上述对于A/AA/6/60 ca供体病毒的方式。类似地，可以用本发明的流感病毒将其它已知和合适的减毒供体菌株重排列而获得适用于哺乳动物接种的减毒疫苗(Ewami et al.，1990；Muster et al.，1991；Subbarao et al.，1993)。

优选这种减毒病毒保留编码基本上类似于原始临床分离物的抗原决定簇的来自病毒的基因。这是因为减毒疫苗的目的是提供与病毒的原始临床分离物基本上相同的抗原性，同时传染性丧失至该疫苗在接种的哺乳动物中引起最小的诱导严重病情的改变的程度。

因此该病毒可以根据已知方法被减毒或灭活，配制和给予，作为疫苗在动物中诱导免疫反应，例如哺乳动物。测定这种减毒或灭活疫苗是否维持与临床分离物或由此而来的高生长菌株相似的抗原性的方法是本领域熟知的。这种已知方法包括清除表达供体病毒的抗原决定簇的病毒的抗血清或抗体的使用；化学选择(例如，金刚烷胺或rimantidine)；HA和NA活性和抑制；和DNA筛选(如探针杂交或PCR)以证实编码抗原决定簇的供体基因(例如HA或NA基因)不存在于减毒病毒中。参见例如，Robertson et al.，1988；Kilbourne，1969；Aymard-Henry et al.，1985；Robertson et al.，1992。

药物组合物

适于接种或肠胃外或口服给药的本发明的药物组合物包含减毒或灭活的流感病毒，任选进一步包含无菌水或非水溶液、悬浮剂和乳剂。如本领域所知，该组合物可以进一步包含助剂或赋形剂。参见例如，Berkow et al.，1987；Goodman et al.，1990；Avery′s Drug Treatment，1987；Osol，1980；Katzung，1992。本发明的组合物通常以单独剂量(单位剂量)形式存在。

常规疫苗通常含有约0.1至200μg，优选10至15μg进入它们的组合物的来自每个菌株的血球凝集素。形成本发明疫苗组合物的主要成分的疫苗可以包含甲型、乙型或丙型病毒或其任何组合，例如三个类型中的至少两个、不同亚型中的至少两个、同一类型中的至少两个、同一亚型中的至少两个，或不同的分离物或重排列体。人甲型流感病毒包括H1N1、H2N2和H3N2亚型。

肠胃外给药的制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮剂和/或乳剂，其可以含有本领域已知的助剂或赋形剂。无水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。载体或封闭敷裹可用于增加皮肤渗透性和提高抗原吸收。口服给药的液态剂型通常可以包含含有液态剂型的脂质体溶液。悬浮脂质体的合适形式包括乳剂、悬浮剂、溶液、糖浆和酏剂，其含有本领域通常使用的惰性稀释剂，如纯净水。除了惰性稀释剂，这种组合物还可以包括佐剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、或甜味剂、调味剂或芳香剂。参见例如Berkowet al.，1992；Goodman et al.，1990；Avery′s，1987；Osol，1980和Katzung，1992。

当本发明的组合物用于给个体施用时，它可以进一步包含盐、缓冲液、佐剂或提高该组合物功效所期望的的其它物质。对于疫苗，可以使用佐剂，可以增加特异性免疫反应的物质。通常，助剂和组合物在呈递给免疫***前混合，或分开呈递，但是进入所免疫生物的相同部位。Osol(1980)中提供了适合用于疫苗组合物的物质实例。

通过混合至少两个流感病毒菌株的复制流感病毒可以提供疫苗中的异质性，如2-50个菌株或其中的任何范围或值。优选具有现代抗原性组成的甲型或乙型流感病毒株。根据本发明，使用本领域已知技术可以提供流感病毒单一菌株中变异的疫苗。

根据本发明的药物组合物可以进一步或另外包含至少一种化疗化合物，例如，对于基因治疗，免疫抑制剂、抗炎药或免疫增强剂，和对于疫苗，化疗药物包括但不限于γ球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨硫脲、甲吲噻腙、利福平、病毒唑、嘧啶类似物、嘌呤类似物、磷甲酸、膦酰乙酸、无环鸟苷、双脱氧核苷、蛋白酶抑制剂、或更昔洛韦。参见例如，Katzung(1992)，和其中分别在798-800和680-681页引用的参考文献。

该组合物还可以含有不定量但是少量的无内毒素的甲醛和防腐剂，已经发现它们安全并且不对给予该组合物的生物增加不期望的作用。

药物目的

组合物(或它引出的抗血清)的施用可以是“预防”或“治疗”目的。当预防性提供时，作为疫苗的本发明组合物在表现出病原体感染的任何症状之前提供。该组合物的预防性施用用来预防或减少任何随后的感染。当预防性提供时，本发明的基因治疗组合物在表现出疾病的任何症状之前提供。该组合物的预防性施用用来预防或减少与该疾病相关的一种或多种症状。

当治疗性提供时，在检测到实际感染症状之后提供减毒或灭活的病毒疫苗。化合物的治疗性施用用来减少任何实际感染。参见例如Berkow et al.，1992；Goodman et al.，1990；Avery，1987；和Katzung，1992。当治疗性提供时，在检测到该疾病的症状或迹象之后提供基因治疗组合物。化合物的治疗性施用用来减少那个疾病的症状或迹象(indication)。

因此，本发明的减毒或灭活疫苗组合物可以在感染开始之前提供(以便预防或减少预期感染)或实际感染开始后提供。类似地，对于基因治疗，该组合物可以在表现出紊乱或疾病的任何症状之前或检测到一种或多种症状之后提供。

如果接受的患者可以忍受一种组合物的施用，就说它是“药理学可接受的”。如果给予的量是生理学有意义的(physiologicallysignificant)，就说这种试剂以“治疗有效量”给予。如果本发明组合物的存在引起接受的患者生理学的可检测改变，那么它是生理学有意义的，所述改变例如提高针对传染性流感病毒的至少一个菌株的至少一种原发或继发体液或细胞免疫反应。

提供的“保护”不必是绝对的，即如果与对照患者群或组相比，有统计上显著的改善，则不需要完全预防或根除流感感染。保护可以限于减轻流感病毒感染症状的严重性或开始的快速性。

药物施用

通过被动免疫或主动免疫，本发明的组合物可以赋予对一种或多种病原体例如一种或多种流感病毒菌株的抗性。在主动免疫中，灭活或减毒活疫苗组合物预防性给予宿主(例如哺乳动物)，宿主对该给药的免疫反应保护其免于感染和/或疾病。对于被动免疫，可以回收引出的抗血清并给予怀疑具有由至少一个流感病毒菌株引起的感染的受体。本发明的基因治疗组合物可以通过主动免疫产生预防或治疗水平的期望基因产物。

在一个实施方案中，在时间和量足以引起免疫反应产生的条件下，将疫苗提供给雌性哺乳动物(怀孕或分娩时或之前)，该反应用来保护该雌性哺乳动物和胎儿或新生儿(通过抗体穿过胎盘或位于母亲的乳汁中而被动掺入)。

因此本发明包括预防或减轻紊乱或疾病的方法，例如由病原体的至少一个菌株引起的感染。如这里使用的，说疫苗预防或减轻疾病，如果它的施用引起该疾病的症状或情况的全部或部分减轻(即抑制)，或引起个体对该疾病的全部或部分免疫性。如这里使用的，说基因治疗组合物预防或减轻疾病，如果它的施用引起该疾病的症状或情况的全部或部分减轻(即抑制)，或引起个体对该疾病的全部或部分免疫性。

本发明的至少一种灭活或减毒流感病毒或其组合物可以以实现预定目的的任何方式给予，使用如前所述的药物组合物。

例如，这种组合物的施用可以通过各种肠胃外途径，如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经口或透皮途径。肠胃外给药可以通过弹丸注射或随时间逐步输注。使用本发明药物组合物的优选模式是通过肌内或皮下应用。参见例如，Berkow et al.，1992；Goodmanet al.，1990；Avery，1987和Katzung，1992。

预防、抑制或治疗流感病毒相关病理的典型方案包括给予有效量的如这里描述的疫苗组合物，以单次治疗给予，或在达到和包括一周至大约24个月的时间内，或其中的任何范围或值，以提高或增强剂量重复给予。

根据本发明，组合物的“有效量”是足以实现期望生物效应的量。可以理解有效剂量将依赖于受体的年龄、性别、健康和体重，并行治疗的类型，如果有，治疗的频率，和需要的效果的性质。以下提供的有效剂量范围不意欲限制本发明并且代表优选剂量范围。然而，如本领域技术人员理解和可确定的，最优选剂量将根据个体受试者而调整。参见例如，Berkow et al.，1992；Goodman et al.，1990；Avery′s，1987；Ebadi，1985和Katsung，1992。

哺乳动物(例如人)或鸟类成年生物的减毒病毒疫苗的剂量可以是大约10³-10⁷噬斑形成单位(PFU)/kg或其中的任何范围或值。灭活疫苗剂量可以从约0.1至200μg，例如，50μg血球凝集素蛋白。然而，剂量应该是使用现存疫苗作为起点，用惯用方法确定的安全和有效的量。

每剂复制病毒疫苗的免疫活性HA的剂量可以被标准化而含有合适量，例如1-50μg或其中的任何范围或值，或由美国公众医务处(PHS)推荐的量，通常是对于年长儿童、3岁，每个成分15μg，和对于＜3岁的年长儿童，每个成分7.5μg。NA的量也可以被标准化，然而，在加工纯化和贮存期间这个糖蛋白可以不稳定(Kendal et al.，1980；Kerr etal.，1975)。每0.5ml疫苗剂量优选含有大约10-500亿病毒颗粒，和优选100亿颗粒。

将通过下列实施例进一步描述本发明。

实施例1

材料和方法

细胞和病毒。293T人胚肾细胞和Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)分别维持在补充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和含有5％新生牛血清的改良Eagle培养基(MEM)中。所有细胞维持在37℃、5％CO₂中。流感病毒A/WSN/33(H1N1)和A/PR/8/34(H1N1)在10日龄蛋中繁殖。

质粒的构建。为了产生RNA聚合酶I构建体，源自A/WSN/33或A/PR/8/34病毒RNA的克隆cDNAs引入RNA聚合酶I的启动子和终止子序列之间。简言之，通过PCR用含有BsmBI位点的引物扩增克隆cDNAs，用BsmBI消化，并克隆入含有被BsmBI位点隔开的人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子的pHH21载体的BsmBI位点(图2)。PCR扩增A/WSN/33菌株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因，分别使用下列质粒：pSCWPB2、pGW-PB1和pSCWPA(全部从University of California Los Angeles的Dr.DebiNayak获得)和pWH17、pWNP152、pT3WNA15(Castrucci et al.，1992)、pGT3WM和pWNS1。使用pcDNA774(PB1)(Perez et al.，1998)作为模板扩增流感A/PR/8/34病毒的PB1基因。引物序列参见图6。为了保证该基因不含不需要的突变，用自动测序仪根据制造商推荐的方案对PCR得到的片段进行测序(Applied Biosystem Inc.，CA，USA)。如(Huddleston et al.，1982)描述克隆编码A/WSN/33病毒的HA、NP、NA和M1基因的cDNAs并亚克隆入真核表达载体pCAGGS/MCS(受鸡β-肌动蛋白启动子控制)(Niwa et al.，1991)，分别产生pEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NPO-14、pCAGGS-WNA15和pCAGGS-WSN-Ml-2/1。PCR扩增来自A/PR/8/34病毒的M2和NS2基因并克隆入pCAGGS/MCS，产生pEP24c和pCA-NS2。最后，pcDNA774(PB1)、pcDNA762(PB2)和pcDNA787(PA)用来表达在巨细胞病毒启动子(Perezet al.，1998)控制之下的PB2、PB1和PA蛋白。

传染性流感颗粒的产生。用最多17个质粒以不同量，使用Trans ITLT-1(Panvera，Madison，Wisconsin)，根据制造商的规程转染293T细胞(1×10⁶)。简言之，DNA和转染试剂混合(2μl Trans IT-LT-1每μgDNA)，在室温孵育45分钟并添加到细胞中。六小时后，用含有0.3％牛血清白蛋白和0.01％胎牛血清的Opti-MEM(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)替代DNA-转染试剂混合物。在转染后不同时间，从上清液收获病毒并在MDCK细胞上滴定。由于用这个方法不要求辅助病毒，因此分析回收的转染病毒无需噬斑纯化。

产生病毒的质粒转染细胞的百分比的测定。转染后二十四小时，用0.02％ EDTA将293T细胞分散为单细胞。然后细胞悬液稀释10倍并转移到24孔板中MDCK细胞的融合单层。用血细胞凝集试验检测病毒。

免疫染色试验。用流感病毒感染后九小时，细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次并用3.7％仲甲醛(在PBS中)在室温下固定20分钟。接下来，用0.1％ Triton X-100处理它们并如Neumann et al.(1997)描述进行加工。

结果

质粒驱动的病毒RNA节段、三个聚合酶亚单位和NP蛋白的表达引起的传染性病毒的产生。尽管用从纯化病毒粒子提取的RNPs的混合物转染细胞产生传染性流感颗粒，但是当使用八个不同体外产生的RNPs时，这个策略不太可能有效。为了完全从cDNAs制备传染性流感病毒，体内产生八个病毒RNPs。因此，制备含有A/WSN/33病毒的全长病毒RNAs的cDNAs的质粒，该cDNAs侧翼连接人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子。原则上，这八个质粒转染真核细胞应该导致全部八个流感vRNAs合成。接着蛋白表达质粒共转染产生的PB2、PB1、PA和NP蛋白应当将vRNAs装配为被复制和转录的功能性vRNPs，最终形成传染性流感病毒(图3)。用蛋白表达质粒(1μgpcDNA762(PB2)、1μg pcDNA774(PB1)、0.1μg pcDNA787(PA)和1μgpCAGGS-WSN-NPO/14)和1μg下列RNA聚合酶I质粒中的每种(pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M和pPolI-WSN-NS)转染1×10⁶个293T细胞。使用降低量pcDNA787(PA)的决定是基于早先的观察(Mena et al.，1996)和产生病毒样颗粒(VLPs)的最佳条件的数据(未显示数据)。293T细胞转染后二十四小时，在每ml上清液中得到7×103pfu病毒(实验1、表1)，首次显示了完全从质粒制备甲型流感病毒的反向遗传学的能力。

表1.用于从克隆cDNA制备流感病毒的质粒组^*

	实验
									RNA聚合酶  II质粒：PB1PR8-PB1PB2PAHANPNAMNS	1+-+++++++	2+-+++++++	3-++++++++	4-++++++++	5-++++++++	6-++++++++	7-++++++++	8-++++++++
蛋白表达质粒：PB1PB2PANPHANAM1M2NS2	++++-----	+++++++++	++++-----	+++++++++	+++++++++	++++++++	+--++++++	+++-+++++
									病毒滴度(pfu/ml)	7×103	7×103	1×103	3×104	0	0	0	0

^*用所示质粒转染293T细胞。二十四(实验1和2)或四十八小时(实验3-8)后，MDCK细胞中测定上清液的病毒滴度。

除非另有陈述，用代表A/WSN/33病毒RNAs的cDNAs构建质粒。

用所有病毒结构蛋白共表达制备流感病毒的效率。尽管病毒NP和聚合酶蛋白的表达足以满足质粒驱动的流感病毒的产生，但有可能效率能提高。在以前的研究中，所有流感病毒结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2和NS2)的表达产生含有编码氯霉素-转乙酰酶报道基因的人工vRNA的VLPs(Mena et al.，1996)。因此，结构蛋白整体补充的可得性，而不仅仅是病毒RNA复制和转录所需的那些，可以提高病毒制备的效率。为此目的，用最佳量病毒蛋白质表达质粒(根据VLP制备判断；未发表数据)：1μg pcDNA762(PB2)和pcDNA774(PB1)；0.1μg pcDNA787(PA)；1μg pEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NP0/14和pCAGGS-WNA15；2μg pCAGGS-WSN-M1-2/1；0.3μgpCA-NS2和0.03μg pEP24c(对于M2)，连同1μg每种RNA聚合酶I质粒(实验2、表1)转染293T细胞。除PB1基因之外，用相同组RNA聚合酶I质粒转染第二组细胞，对于PB1基因，pPolI-PR/8/34-PB1被代替试图产生重排列病毒，连同仅表达PA、PB1、PB2和NP的质粒(实验3、表1)或表达所有流感结构蛋白的质粒(实验4、表1)。WSN病毒的产量在转染后24小时(实验1和2、表1)或在36小时(未显示数据)没有可感知的差异。然而，当提供所有流感病毒结构蛋白时(实验3和4、表1)，有PR/8/34-PB1的病毒的产量得到10倍以上增加。缺乏PA、PB1、PB2、NP蛋白的表达质粒之一的阴性对照不产生任何病毒(实验5-8、表1)。因此，根据所产生的病毒，所有甲型流感病毒结构蛋白的表达可感知地提高反向遗传学方法的效率。

接下来，使用用于产生含A/PR/8/34-PB1基因的病毒的质粒组确定细胞转染后病毒生产的动力学。在三个实验的两个中，转染后24小时首次检测到病毒。那时候测量滴度＞103pfu/ml，转染后48小时增加到＞106pfu/ml(表2)。为了估计生产病毒的质粒转染细胞的百分比，在转染后24小时用EDTA(0.02％)处理293T细胞以分散细胞，然后进行有限稀释研究。在这个实验中，在这个时间点在培养上清液中没有发现游离病毒。该结果表明103.3个细胞中有一个产生传染性病毒颗粒。

表2.质粒转染293T细胞后病毒制备的动力学^*

质粒转染后数小时数	培养上清液中病毒滴度(pfu/ml)实验
				612182430364248	10000ND6×102ND8×104	2NDNDND2×1035×104＞1×105＞1×106＞1×106	2ND006×1039×1047×1055×1061×107

^*用除源自于A/PR/8/34病毒的PB1基因之外，编码A/WSN/33病毒基因的八个RNA聚合酶I质粒和如本文所述的九个蛋白表达质粒转染293T细胞。在不同时间点，我们在MDCK细胞中滴定培养上清液中的病毒。ND＝未做。

含有NA蛋白中FLAG表位的流感病毒的回收。为了证实新反向遗传学***允许将突变引入甲型流感病毒的基因组，产生含有NA蛋白中FLAG表位(Castrucci et al.，1992)的病毒。用含有编码NA蛋白和该蛋白头端底部的FLAG表位的cDNA的RNA聚合酶I质粒(pPolI-WSN-NA/FL79)，连同所需要的RNA聚合酶I和蛋白表达质粒转染293T细胞。为了证实回收的病毒(PR8-WSN-FL79)事实上确实表达了NA-FLAG蛋白，对PR8-WSN-FL79或A/WSN/33野生型病毒感染的细胞进行免疫染色试验。FLAG表位的单克隆抗体检测用PR8-WSN-FL79感染的细胞，而不检测用野生型病毒感染的细胞(图4)。PR8-WSN-FL79病毒的回收如同未标记的野生型病毒一样有效(未显示数据)。这些结果表明新反向遗传学***允许人们将突变引入甲型流感病毒基因组。

PA基因中含有突变的传染性流感病毒的产生。为了制备PA基因中具有突变的病毒，引入两个沉默突变，产生新的限制性内切酶的识别序列(mRNA的846位Bspl20I和1284位PvuII)。以前，做不到通过反向遗传学改变这个基因，因为缺乏可信的选择***。回收转染体病毒、PA-T846C和PA-A1284。通过两次连续的有限稀释生物学上克隆回收的转染体病毒。为了证实回收的病毒确实是PA基因中具有突变的转染体，通过反转录酶-PCR获得PA基因的cDNA。如图5所示，PA-T846C和PA-A1284C病毒在PA基因内具有预期的突变，如新引入的限制性位点的存在而证明。相同病毒样品和引物的无反转录步骤的PCR未能产生任何产物(未显示数据)，表明PA cDNA的确来源于vRNA，而不是用于产生病毒的质粒。这些结果阐明了如何不使用辅助病毒制备和回收具有突变基因的病毒。

讨论

在此描述的反向遗传学***允许人们完全从克隆cDNAs有效制备甲型流感病毒。Bridgen和Elliott(1996)也使用反向遗传学产生布尼奥罗病毒(本扬病毒科)，但是它仅仅含有负义RNA的三个节段，其制备效率低，10²pfu/10⁷细胞。尽管实验当中病毒产量不同，但是对于流感病毒，观察到产量始终＞10³pfu/106细胞，其含有八个节段。有上文描述的反向遗传学***高效率的几种解释。代替体外制备RNPs(Luytjeset al.，1989)，通过使用RNA聚合酶I细胞内合成vRNAs和通过质粒驱动的病毒聚合酶蛋白和NP表达，体内产生RNPs。此外，用质粒轻易转染的293T细胞(Goto et al.，1997)的使用保证了大量细胞接受病毒制备所需的所有质粒。此外，通过生长细胞中最丰富表达的酶-RNA聚合酶I生产的大量转录物可能有助于***的总效率。这些特征产生相应大量的vRNA转录物和足够量的用于vRNA衣壳化的病毒蛋白质，细胞核中RNPs的形成和这些复合物输出至细胞膜，在那里装配和释放新病毒。

以前建立的反向遗传学***(Enami et al.，1990；Neumann et al.，1994；Luytjes et al.，1989；Pleschka et al.，1996)需要辅助病毒感染，因此所需的选择方法要允许从很多辅助病毒中回收得到少量的转染体。这种策略已经用于产生具有下列源自cDNA的基因之一的流感病毒：PB2(Subbarao et al.，1993)、HA(Enami et al.，1991：Horimoto etal.，1994)、NP(Li et al.，1995)、NA(Enami et al.，1990)、M(Castrucciet al.，1995；Yasuda et al.，1994)和NS(Enami et al.，1991)。除了适用于HA和NA基因的方法之外，大多数选择方法依赖于生长温度、宿主范围限制或药物敏感性，因此限制了反向遗传学在基因产物功能分析中的应用。即使采用HA和NA基因，对于它们来说可信的抗体驱动选择***是可获得的，仍很难制备具有突出生长缺陷的病毒。相比之下，在此描述的反向遗传学***不需要辅助病毒并允许人们产生在任何基因片段内具有突变或具有严重生长缺陷的转染体。图5证明了这个优点，它是具有突变PA基因的转染体病毒的回收。该技术将任何可存活突变(viable mutation)引入甲型流感病毒基因组，将能够使研究者解决很多长期存在的问题，如病毒基因组非翻译区的调节序列的性质、病毒蛋白的结构功能关系和宿主范围限制和病毒致病性的分子基础。

尽管灭活流感疫苗是可获得的，但是它们的功效次优，部分由于它们引发局部IgA和细胞毒性T细胞反应的能力有限。现在在进行之中的冷适应活流感疫苗的临床试验提示这种疫苗被最佳减毒，因此它们不会引起流感症状，但是仍将诱导保护性免疫(Keitel & Piedra，1998中综述)。然而，初步结果表明这些活病毒疫苗不会比最好的灭活疫苗显著更有效(Keitel.& Piedra，1998综述)，为进一步改善留下空间。一种可能性将是用如上所述的反向遗传学***改变冷适应疫苗。或者，人们能使用反向遗传学从头开始制备编码内部蛋白的基因中具有多种减毒突变的“主要(master)”甲型流感菌株。在此描述的反向遗传学***的最吸引人应用可能在于在怀疑大流行的情况下，减毒活病毒疫苗的快速制备，所述大流行涉及新HA或NA亚型流感病毒。

这个新反向遗传学***将可能提高流感病毒作为疫苗载体的使用。该病毒可以被工程改造而表达除流感病毒蛋白之外的外来蛋白或免疫原性表位。人们能够例如产生具有作为第九节段的外来蛋白的病毒(Enami et al.，1991)并使用它们作为活疫苗。流感病毒不仅确实刺激强烈的细胞介导和体液免疫反应，而且它们还赋予病毒粒子表面HA和NA蛋白的宽泛排列(例如，15个HA和9个NA亚型和它们的流行变体)，允许相同目标人群的重复免疫。

通过采用牛痘-T7聚合酶***表达病毒结构蛋白和vRNA已经制备了具有编码报道基因的人工vRNA的流感VLPs(Mena et al.，1996)。使用反向遗传学，现在人们可以产生含有编码vRNA转录和复制所需蛋白(即PA、PB1、PB2和NP)的vRNAs，以及编码感兴趣蛋白的vRNAs的VLPs。这种VLPs可以作为基因送递载体。重要的是，它们缺少编码病毒结构蛋白的基因将保证VLP基因治疗后不会产生传染性病毒。由于流感病毒基因组不整合到宿主染色体中，因此VLP***将适于仅仅需要短期细胞转导情况下的基因治疗(例如对于癌症治疗)。与腺病毒载体(Kovesdi et al.，1997)对比，流感VLPs可能含有HA和NA变体，允许目标人群的重复治疗。

正粘病毒科包含甲型、乙型和丙型流感病毒，以及最近分类的首戈托病毒。在此描述的完全从克隆cDNAs产生传染性甲型流感病毒的策略将应用于任何正粘病毒，并且也许也应用于其它节段负义RNA病毒(例如本扬病毒科、沙粒病毒科)。无技术限制操作病毒基因组的能力对于病毒生活史和它们的调节、病毒蛋白的功能和病毒致病性的分子机制的研究具有深远意义。

实施例2

流感病毒蛋白PB2、PB1、PA和NP的表达导致人工病毒RNA的复制和转录。为了产生流感VLPs，使用用于流感病毒RNAs在体内细胞内合成的RNA聚合酶I***(图7)。在这个***中，编码反义方向报道基因的cDNA侧翼连接流感病毒RNA的5′和3′非编码区。这个盒***RNA聚合酶I启动子和终止子之间。这种构建体转染真核细胞通过细胞RNA聚合酶I导致报道基因转录，由此产生流感病毒样RNAs(Neumann et al.，1994)。流感病毒感染后，人工vRNAs就通过病毒聚合酶复合体复制和转录，导致报道基因表达。

为了确定PB2、PB1、PA和NP蛋白的表达是否引起由RNA聚合酶I衍生的转录物编码的报道基因表达，表达在鸡β-肌动蛋白启动子(pCAGGS-WSN-NPO/14)控制下的A/WSN/33(H1N1)病毒NP蛋白、在巨细胞病毒启动子[pcDNA762(PB2)、pcDNA774(PB1)和pcDNA787(PA)]控制下的A/PR/8/34病毒的聚合酶蛋白的质粒(每种1μg)，和RNA聚合酶I报道基因构建体(pPoII-GFP)转染人胚肾(293T)细胞。四十八小时后，30％-40％细胞表达GFP(图8)。相比之下，在缺乏聚合酶或NP蛋白的转染细胞中不能检测到GFP表达。这些结果表明NP和三个流感病毒聚合酶蛋白形成了复制和转录源自RNA聚合酶I的GFP vRNA的功能性复合体。

最佳的vRNA转录和复制。为了确定最佳报道GFP表达所需质粒DNA的量，我们调节了聚合酶蛋白和NP的表达。以前的研究表明大量PA降低转录/复制***中报道基因表达的程度(Mena et al.，1996)。因此，PA从质粒的表达以逐渐方式降低，确定0.1μg pcDNA787(PA)作为产生最强GFP表达的模板量。对于NP，RNP复合物的主要结构成分，可能需要蛋白表达质粒的量高。然而，更高量质粒不显著影响GFP阳性293T细胞的数量。此外，各种量的PB2和PB1蛋白表达质粒(从1.0至0.03μg)不影响293T细胞中的GFP表达。因此，在所有随后的实验中，使用0.1μg pcDNA787(PA)和1.0μg pcDNA774(PB1)、pcDNA762(PB2)和pCAGGS-WSN-NPO/14。

从克隆cDNAs形成流感VLPs。以前对于牛痘病毒T7RNA聚合酶***的研究表明流感VLPs的形成需要九个流感病毒蛋白：PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M1、M2和NS2(Mena et al.，1996)。相比之下，NS1蛋白对于颗粒形成是可有可无的(Mena et al.，1996)。为了建立产生VLP的有效质粒驱动***，产生编码HA、NA、M1、M2和NS2基因的cDNAs。该cDNAs克隆入真核表达载体pCAGGS/MCS(受鸡β-肌动蛋白启动子控制)，分别产生pEWSN-HA、pCAGGS-WNA15、pCAGGS-WSN-M1-2/1、pEP24c和pCA-NS2。Western印迹分析证实每种蛋白的表达。

为产生VLPs，用1.0μg每个蛋白表达质粒(除了pcDNA787(PA)，使用0.1μg)，和1μg报道基因构建体pPolI-GFP转染10⁶个293T细胞。转染后48小时收获培养上清并与A/WSN/33病毒混合以提供GFPvRNA复制和转录所需的流感病毒蛋白。然后混合物接种到MDCK细胞。培养后十小时，检测到GFP阳性的MDCK细胞，相当于450个颗粒/毫升上清液(表3)。因此，质粒驱动的所有流感病毒结构蛋白的表达导致含有GFP vRNA的传染性流感VLPs的形成。此外，GFP vRNA送递给MDCK细胞。

流感病毒的最佳装配。也研究了表达不同量RNA聚合酶I报道基因构建体，以及HA、NA、M1、M2和NS2质粒DNAs的细胞中的VLP形成。在对于pPolI-GFP的实验中，1.0μg质粒DNA产生VLPs的效率很高，而对于2.0μg或3.0μg，效率显著降低。因为在感染末期NS2和M2蛋白表达量低，所以有可能最佳VLP形成将需要相对少量的表达质粒。M2表达构建体从1.0μg降低至0.3μg导致GFP阳性的MDCK细胞数量增加十倍以上(表3)。质粒进一步降至0.03μg不增加VLPs数量。对于NS2，检测的质粒量降低(0.1μg)关系到VLPs形成效率降低(表3)。

M1蛋白是病毒粒子的主要结构成分。因此，高水平M1表达可能是VLPs有效形成所需的。在比较用1.0μg或2.0μg M1质粒DNA转染的细胞中VLP形成的实验中检验这个预测。如表3所示，更高量质粒导致GFP阳性的MDCK细胞数量增加十倍以上。表达HA和NA蛋白的两个不同量(1μg对2μg)质粒的比较没有揭示VLP形成方面任何可评估的差异，使得选择1μg每种质粒(pEWSN-HA、pCAGGS-WNA15)用于随后实验。总的说来，这些研究导致VLP形成效率＞100倍增加，最终导致每毫升上清液超过10⁴个传染性流感病毒颗粒的产生(图9)。

表3.感染VLPs形成的最佳量质粒DNA^*。

表达下列蛋白的质粒DNA的量(μg)										VLP形成的相对效率↑
											PB2	PB1	PA	HA	NP	NA	M1	M2	NS2	GFPvRNA
1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0												1
										1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	28
1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	1.0	0.03	1.0	1.0												17
										1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	28
1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	1.0	0.1	0.3	1.0												24
										1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	1.0	0.1	0.1	1.0	11
1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	1.0	0.1	1.0	1.0												28
										1.0	1.0	0.1	1.0	1.0	1.0	2.0	0.1	1.0	1.0	220

^*用全部九个流感病毒结构蛋白的表达质粒和用RNA聚合酶I-GFP基因质粒转染293T细胞，转染后四十八小时，收集含有VLP的上清液，与A/WSN/33辅助病毒混合并接种给MDCK细胞。在感染后10小时固定细胞和用荧光显微镜测定GFP表达。仅仅M1、M2和NS2质粒的量变化(粗体字母)，以确定MDCK细胞中GFP表达的最佳量。

通过计算五个显微镜视野中GFP阳性细胞的数量确定VLP形成的相对效率。选择含有1μg每种质粒(其产生450个传染性VLP/毫升上清液)的样品作为参照(值为1)。

完全从质粒制备VLPs的真实性。为了证实VLPs以与真正流感病毒相同的方式启动感染，用WSN HA的抗体中和VLPs。来源于质粒转染的293T细胞的含VLP的上清液与抗WSN HA单克隆抗体或水泡性口膜炎病毒(VSV)(阴性对照)的G蛋白的单克隆抗体库在室温下培养1小时。不被抗WSN HA单克隆抗体库中和的A/PR/8/34辅助病毒添加到混合物并接种给MDCK细胞。仅仅抗WSN-HA特异性单克隆抗体中和VLPs，表明HA介导(medicates)VLPs与细胞的附着和VLPs进入细胞。

接下来，确定VLPs形成所需蛋白的最小组。其他人已确定了，三个流感病毒聚合酶和NP对vRNA复制和转录必不可少(Honda et al.，1988)。因此，包括这四个蛋白中的每一个，但是HA、NA、M1、M2或NS2顺序省去。排除这些质粒中的任何一个不影响转染的293T细胞中GFP vRNA的复制/转录。来源于转染的缺乏HA、NA、M1或NS2蛋白的293T细胞的上清液不促进感染MDCK细胞中GFP表达，表明传染性VLPs的缺乏。省去M2来检测传染性VLPs，但是数量低(与全组结构蛋白相比，降低＞500倍)。因此，所有流感病毒结构蛋白是传染性VLPs有效形成所需的，与牛痘病毒***的研究数据一致(Mena etal.，1996)。

在VLPs的制备中，VSV糖蛋白可以替换HA和NA蛋白。用在受体结合和融合中起作用的VSV G蛋白替换流感病毒HA和NA蛋白。在用pPolI-GFP、最佳量PB2、PB1、PA、NP、M1、M2和NS2表达构建体；和1μg VSV-G构建体(pCAGGS-VSV-G)转染的293T细胞中，VSV-G蛋白对于流感病毒糖蛋白的替换没有不利影响VLP形成。相反，较高数量GFP阳性细胞可重现地得到，当VSV-G，而不是HA和NA用作病毒糖蛋白时。因此，VSV G蛋白可以有效并入流感病毒粒子并可以与HA和NA一样好地在病毒释放和进入中起作用。

产生传染性流感病毒颗粒的有效***将是这个病毒研究中的资产和基因治疗的疫苗和载体制备中的潜在资产。与现存牛痘病毒***对比，在此描述的VLP制备策略效率很高，细胞的初始转染和VLPs的产量(＞10⁴传染性颗粒/毫升上清液)的效率都很高。此外，它完全通过表达流感病毒蛋白(即缺少任何其它病毒蛋白)的质粒驱动，大大简化了结果分析。另一个主要优点是研究致死突变在病毒粒子形成、RNP复合物的包装、病毒复制的出芽和结合和融合过程中的作用的能力。此外，很可能在上文描述的***将对其它病毒同样好地运行，例如副粘病毒和弹状病毒。

流感病毒HA和NA蛋白可以被VSV糖蛋白G在功能上替代。以前，已经报道了当通过重组SV40病毒提供时，流感病毒未能并入VSVG蛋白(Naim et al.，1993)。在此描述的结果提示HA或NA都不是VLPs形成必不可少的，尽管不能排除这些糖蛋白在与其它病毒蛋白的相互作用中起作用，因此影响病毒粒子的结构，如表达无尾HAs、NAs或二者的病毒拉长的形状所提示(Garcia-Sastre et al.，1995；Jin et al.，1994；Jin et al.，1997；Mitnaul et al.，1996)。

上文描述的基于质粒的***可能对治疗性基因送递特别有用。可以制备含有编码转录和复制所需蛋白(即NP和聚合酶)的vRNA，以及编码感兴趣蛋白的vRNA的VLPs。这些颗粒是有传染性的，并可以将指定基因送递至靶细胞中，在那里它将复制和转录。因为这些颗粒不含有病毒基因的完全互补物，所以它们不能制备传染性子代病毒。这个特征，连同缺乏病毒基因组整合入宿主染色体，将确保在人类和非人类受试者中基因送递的生物安全。最后，15个HA和9个NA亚型和它们的变体的可得性将允许VLPs重复施用，因此克服对载体产生的蛋白的免疫抗性-其它病毒载体如腺病毒的重复使用所面临的主要障碍之一。质粒驱动***的更多益处将在仅需要外来蛋白短期表达的情况下实现，如在癌症治疗中。

实施例3

通过使用Cre-loxP***，人们可以产生制备复制缺陷型病毒的包装细胞系。例如，制备含有侧翼连接两个loxP位点和一个病毒基因的转录终止盒的蛋白表达载体(例如Life Technologies，Bethesda的pBS302，Maryland；和Sauer et al.，1993；Lasko et al.，1992；Pichelet al.，1993；Bolivar et al.，1977；Stuhl et al.，1981；Stuhl，1985；Fiers et al.，1978)。在启动子序列处启动的转录在转录终止位点被阻断。因此，病毒基因不被转录和翻译。用这种载体稳定转染的细胞被缺乏编码克隆入loxP***的基因的vRNA的流感病毒感染。这个病毒还含有编码Cre蛋白的另外的vRNA。这个病毒在正常细胞中没有活力，因为它缺乏它的vRNAs中的一个。然而，在包装细胞系中，从vRNA表达的Cre蛋白导致loxP位点的重组，导致转录终止位点的缺失。因此，现在转录和表达各自的病毒基因，允许病毒在这些细胞中扩增(图10)。

此外，制备表达loxP***控制的晚期病毒蛋白(即HA、NA、M1、M2和NS2)的包装细胞系(图12)。HA和NA可以被其它病毒受体结合和融合蛋白(例如Ebola GP、Marburg GP、本扬病毒科糖蛋白GP1和GP2、弹状病毒和副粘病毒的G和/或F蛋白、首戈托病毒糖蛋白和正链RNA病毒糖蛋白)替代。产生含有编码转录/复制所需蛋白(即聚合酶和NP蛋白)的vRNAs、编码感兴趣基因的vRNA和编码Cre的vRNA的病毒样颗粒。这些vRNAs包装入包装细胞系中的病毒样颗粒。

这些病毒样颗粒可以用于疫苗和基因治疗目的，因为(i)它们不含有病毒基因的全部互补物(full complement)并因此不能形成有传染性的子代颗粒，满足所关心的严格安全；(ii)它们将可能表达高水平外来蛋白；(iii)它们不表达是主要抗原的病毒糖蛋白(HA、NA)；因此抗病毒蛋白的宿主免疫反应应该被限制。

实施例4

建立了RNA聚合酶II/双核酶***，它可以导致任何脊椎动物细胞系，例如人293T细胞、鼠NA细胞或仓鼠BHK-21细胞中流感病毒的产生，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。表达甲型流感vRNA，产生含有来源于RNA聚合酶II引起的RNA转录物的节段(PB2)的甲型流感病毒。

材料和方法

细胞

293T人胚肾细胞，一种组成性表达猿猴病毒40T抗原的基因的293系衍生物(DuBridge et al.，1989)，被维持在补充10％ FCS、4mML-谷氨酰胺和抗生素的DMEM(葡萄糖浓度：4.5g/l)中。Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)生长在含有5％新生牛血清、4mM L-谷氨酰胺和抗生素的含Eagle′s盐的极限必需培养基(MEM)中。

质粒构建

RNA聚合酶II驱动的vRNA表达载体的构建是基于pCAGGS-MCS(Hatta et al.，2001；Niwa et al.，1991)，其中RNA聚合酶II调节的转录由β-肌动蛋白鸡启动子/CMV增强子盒驱动。从pX8dT(Schnellet al.，1984)扩增HDVRz盒，使用引物5′-GCATGCGAAGACTTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCT-3′(SEQ ID NO：17)和5′-AGATCTAGGGAGCTCTCCCTTAGCCATCCGA-3′(SEQ ID NO：18)并使用BglII和SphI限制性位点克隆入pCAGGS-MCS。使用pCAGGS-MCS中的EcoRI和NsiI位点，通过寡接头连接采用5′-AATTCTTTCTACTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCCGGAGTCCCGGGTCGGAGACGATGCA-3′(SEQ ID NO：19)和5′-TCGTCTCCGACCCGGGACTCCGGGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGTAGAAAG-3′(SEQ ID NO：20)产生HamRz盒。用BbsI和BsmBI消化所产生的PolII/双核酶载体pCAGGS-2Ribo-l(图12)产生线性化载体，用于***用5′-CGTCTCCGGTCAGTAGAAACAAGG-3′(SEQ ID NO：21)和5′-CGTCTCCACCCAGCAAAAGCAGG-3′(SEQ ID NO：22)通过PCR扩增获得的病毒cDNA构建体。RNA聚合酶II驱动的表达和随后的两个核酶在5′和3′末端自身催化切割产生具有正确3′和5′末端的甲型流感vRNA分子(图13)。pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E表达在第627位氨基酸含有单个Lys至Glu置换的HK483的PB2vRNA。

重组病毒的产生

Neumann et al.(1999)和Hatta et al.(2001)分别描述了重组甲型流感病毒A/WSN/33和HK3/PB2-627E的专门基于RNA聚合酶I反向遗传学***的产生。

为了产生HK3/PB2-627E(图14)或WSN/HK483 PB2 627E(图14)，用pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E(0.1μg，对于PB2节段的制备)，连同通过RNA聚合酶I制备各个病毒剩余RNA节段的质粒(每种0.1μg，pPolI质粒)转染293T细胞。也用WSN/33的PA、PB1、PB2和NP的蛋白表达构建体(每种1μg)转染这些细胞。转染后四十八小时，收集等分293T细胞上清液并在MDCK细胞中扩增病毒或用噬菌斑法在MDCK细胞上滴定。对于重组病毒的进一步分析，从病毒上清液提取病毒RNA并用RT PCR和测序反应分析PB2vRNA。作为阴性对照，从转染混合物中省去PB2的vRNA表达构建体，并使用PB2vRNA的RNA聚合酶I表达构建体代替pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E用作阳性对照。

结果

对于具有正确5′和3′末端的全长甲型流感vRNAs的合成，构建pCAGGS-2Ribo-1(图12)。然后***来源于全长病毒RNAs的cDNAs，因此它们侧翼在5′末端连接HRz和在3′末端连接HDVRz序列。用鸡β-肌动蛋白启动子/CMV增强子盒从上游控制这个双核酶盒的表达。这种构建体转染细胞后，双核酶盒，包括病毒序列，就被细胞RNA聚合酶II转录，和转录物两个末端的自身催化核酶切割导致正确vRNA的产生(图13)。

为了检验这个方法的可行性，构建质粒pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E。这个构建体编码在两个核酶位点之间第627位氨基酸含有Glu的HK3/PB2-627E的PB2 vRNA。在反向遗传学方法中，通过12个质粒在293T细胞中共表达来检测这个构建体：PB2 vRNA由pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E表达，HK3/PB2-627E(PA、PB1、NP、M、NS、NA、HA)的剩余vRNAs由RNA聚合酶I***表达；蛋白表达质粒提供A/WSN/33的PA、PB1、PB2和NP(图14)。作为阴性对照，从转染混合物中省去PB2的vRNA表达构建体，和作为阳性对照，用PB2vRNA的RNA聚合酶I表达构建体(pPolI-PB2/483-627E)代替pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E。转染后四十八小时，等分293T细胞上清液与MDCK细胞培养。四十八小时内，在来源于pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E或pPolI-PB2/483-627E转染的293T细胞的上清液中观察到细胞病变效应(CPE)，表明这些细胞中流感病毒的产生。在缺乏PB2vRNA表达质粒下没有见到CPE。为证明流感病毒粒子的确由表达流感vRNAs的RNA聚合酶I和RNA聚合酶II/双核酶构建体的组合产生，从MDCK细胞上清液中分离vRNA并对PB2RT-PCR产物第627位氨基酸进行测序。重组病毒的确含有pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E编码的PB2基因。

为进一步证明RNA聚合酶I/双核酶***的功能，用制备HK3/PB2-627E的PB2 vRNA的pCAGGS-2Ribo-PB2/483-627E和制备A/VSN/33的PA、PB1、NP、M、NS、NA、HA vRNAs的pPolI质粒，连同A/WSN/33的PA、PB1、PB2和NP蛋白表达的质粒转染293T细胞(图15)。转染后48小时，在293T细胞的上清液中得到5×10³pfu/ml病毒，类似于在pPolI质粒表达所有vRNAs包括PB2vRNA的阳性对照中观察到的。

讨论

这个研究证明RNA聚合酶II/双核酶***可以产生具有正确(authentic)5′和3′末端的甲型流感vRNAs。在这个***中，强大的鸡β-肌动蛋白启动子/CMS增强子盒驱动编码甲型流感vRNA的RNA转录物的表达，其在vRNA的5′末端(HRz)和3′末端(HDVRz)侧翼连接核酶序列。这个初级RNA转录物在核酶位点的自身催化切割导致甲型流感vRNAs的产生。

使用这个***，产生了具有来源于RNA聚合酶II/双核酶***的PB2 vRNA的重组甲型流感病毒。因此，这个实验清楚地证明由RNA聚合酶II/双核酶***产生的甲型流感vRNA分子的功能，表明RNA聚合酶II/双核酶***应该允许完全从克隆的cDNA产生甲型流感病毒和/或其它节段RNA病毒。

该新RNA聚合酶II/双核酶***提供了几个优于迄今为止所描述的对于负链RNA病毒的两个反向遗传***的主要优点。RNA聚合酶II启动子没有宿主细胞特异性。因此，这个RNA聚合酶II/双核酶反向遗传学***可以用于任何脊椎动物细胞系。相比之下，RNA聚合酶I具有宿主特异性：人RNA聚合酶I未能由小鼠启动子启动转录，反之亦然(Grummt et al.，1982；Learned et al.，1982)。此外，与T7聚合酶***相比，RNA聚合酶II/双核酶***提供了不需要表达反式(intrans)RNA聚合酶和病毒RNA末端精确休整的优点。对于许多病毒来说，病毒RNA基因组精确3’末端的合成对于有效的病毒产生是决定性的。然而在T7 RNA聚合酶***中，一至三个G核苷酸的添加是有效转录所需的，它在很多情况下降低触发病毒复制的效率，因此降低反向遗传学引起的重组病毒的产生。RNA聚合酶II/双核酶***合成具有与真正病毒RNAs相同末端的RNA分子。

总之，RNA聚合酶II/双核酶***显示出人工合成正确甲型流感vRNA的能力。这首次描述了产生具有源于基于RNA聚合酶II的反向遗传学***的RNA节段的节段负链RNA病毒。由于RNA聚合酶II/双核酶***不受宿主细胞物种限制的影响，因此它将可能对疫苗的制备具有重大影响，此情况下由于生物安全预防措施，仅仅可以使用非常有限数量的细胞系。鸡胚成纤维细胞可能被批准用于活疫苗的制备；因此这些细胞中的候选菌株通过反向遗传学产生。因为人RNA聚合酶I启动子在鸡胚成纤维细胞中不是功能性的(未显示数据)，所以基于RNA聚合酶I的反向遗传学***在这个***中将不会成功。RNA聚合酶II/双核酶***将可能克服这些限制并提供广泛使用反向遗传学***进行流感和其它负链RNA病毒的疫苗制备的基础。

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所有出版物、专利和专利申请并入这里作为参考文献。虽然在上述说明书中，已经描述了本发明涉及的其某些优选实施方案，并且为了说明，已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说，本发明可以有另外的实施方案并且在此描述的某些细节可以相当大地变化而不背离本发明的基本原则将是显而易见的。

                           序列表

<110>Kawaoka，Yoshihiro

     Hamm，Stefan

     Ebihara，Hideki

     WARF-Wisconsin Alumni Research Foundation

<120>含POLII启动子和核酶的重组流感载体

<130>800.037WO1

<150>US 60/473,797

<151>2003-05-28

<160>37

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>1

cacacacgtc tcgtattagt agaaacaagg tcgtttttaa actattcgac actaattgat    60

ggccatccga attcttttgg                                                80

<210>2

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>2

cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggtc aattatattc aatatggaaa gaataaaaga    60

actaagg                                                              67

<210>3

<211>89

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>3

cacacacgtc tcgtattagt agaaacaagg cattttttca tgaaggacaa gctaaattca    60

ctatttttgc cgtctgagct cttcaatgg                                      89

<210>4

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>4

cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggca aaccatttga atggatgtca atccgacttt    60

acttttc                                                              67

<210>5

<211>103

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>5

ccaacccgtc tcctattagt agaaacaagg tacttttttg gacagtatgg atagcaaata    60

gtagcattgc cacaactatc tcaatgcatg tgtgaggaag gag                     103

<210>6

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>6

ccaacccgtc tccgggagcg aaagcaggta ctgattcaaa atggaagatt ttgtgcgaca    60

atgcttc                                                              67

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>7

cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttttcc                          40

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>8

cacacacgtc tccgggagca aaagcagggg aaaataaaaa caacc                    45

<210>9

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>9

cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtatttttct ttaattg                  47

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>10

cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt agataatcac tc                       42

<210>11

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>11

cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg agttttttga acaaac                   46

<210>12

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>12

cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggag tttaaatgaa tccaaacc                 48

<210>13

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>13

cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg tagtttttta ctccagc                  47

<210>14

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>14

cacacacgtc tccgggagca aaagcaggta gatattgaaa g                        41

<210>15

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>15

cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttttta ttattaaata agc           53

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>16

cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt gacaaagaca taatgg                   46

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>17

gcatgcgaag acttgggtcg gcatggcatc tccacctcct                          40

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>18

agatctaggg agctctccct tagccatccg a                                   31

<210>19

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡接头

<400>19

aattctttct actctgatga gtccgtgagg acgaaacccg gagtcccggg tcggagacga    60

tgca                                                                 64

<210>20

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡接头

<400>20

tcgtctccga cccgggactc cgggtttcgt cctcacggac tcatcagagt agaaag        56

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>21

cgtctccggt cagtagaaac aagg                                           24

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>22

cgtctccacc cagcaaaagc agg                                            23

<210>23

<211>96

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的锤头(HH)序列

<400>23

gggcgaaagc ccagaagguc cugaugaggc cgaaaggccg aagaggucaa agcucgaaag    60

cgagaguagu cgagaugaaa gcaucuccug accuca                              96

<210>24

<211>115

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的发夹(HP)序列

<400>24

gggcgaaagc ccagaagguc cugaugaggc cgaaaggccg aaacuccagu ggcaguccug    60

uugaaaaaca gagaagccaa ccagagaaac acacguugug guauauuacc uggua        115

<210>25

<211>110

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的HDV核酶序列

<400>25

gggcgaaagc ccagaagguc cugaugaggc cgaaaggccg aaacuccaaa gggucggcau    60

ggcaucucca ccuccucgcg guccgaccug ggcuacuucg guaggcuaag              11O

<210>26

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体序列

<400>26

gggttattgg agacggtacc gtctcctccc ccc                                 33

<210>27

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体序列

<400>27

ggggggagga gacggtaccg tctccaataa ccc                                 33

<210>28

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(18)

<223>n＝A，T，C或G

<400>28

cgtctcntat tagtagaa                                                  18

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(17)

<223>n＝A，T，C或G

<400>29

ttttgctccc ngagacg                                                   17

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(17)

<223>n＝A，T，C或G

<400>30

cgtctcnggg agcaaaa                                                   17

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(18)

<223>n＝A，T，C或G

<400>31

ttctactaat angagacg                                                  18

<210>32

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<400>32

tattagtaga a                                                         11

<210>33

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<400>33

gggagcaaaa                                                           10

<210>34

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<400>34

gggttattag tagaa                                                     15

<210>35

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<400>35

ttttgctccc ccc                                                       13

<210>36

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<400>36

ggggggagca aaa                                                       13

<210>37

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的载体/流感病毒cDNA序列

<400>37

ttctactaat aaccc                                                     15

Claims (41)

1.一种包含多个正粘病毒载体的组合物，包含

a)选自包含与连接转录终止序列的流感病毒PA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒HA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NP cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒M cDNA可操作连接的启动子的载体、或包含与连接转录终止序列的流感病毒NS cDNA可操作连接的启动子的载体的至少两个载体；其中至少一个载体包含RNA聚合酶II启动子，该启动子连接第一个核酶序列，该第一个核酶序列连接病毒cDNA，该病毒cDNA连接第二个核酶序列，该第二个核酶序列连接转录终止序列；和

b)选自包含与编码流感病毒PA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA节段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NP的DNA节段可操作连接的启动子的载体和任选地，选自包含与编码流感病毒HA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA节段可操作连接的启动子的载体或包含与编码流感病毒NS2的DNA节段可操作连接的启动子的载体的至少两个载体。

2.一种包含多个正粘病毒载体的组合物，包含

a)选自包含与连接转录终止序列的流感病毒PA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒HA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NP cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NB和NA cDNA可操作连接的启动子的载体、或包含与连接转录终止序列的流感病毒M cDNA可操作连接的启动子的载体、或包含与连接转录终止序列的流感病毒NS cDNA可操作连接的启动子的载体的至少两个载体；其中至少一个载体包含RNA聚合酶II启动子，该启动子连接第一个核酶序列，该第一个核酶序列连接病毒cDNA，该病毒cDNA连接第二个核酶序列，该第二个核酶序列连接转录终止序列；和

b)选自包含与编码流感病毒PA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA节段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NP的DNA节段可操作连接的启动子的载体和任选地，选自包含与编码流感病毒HA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA和NB的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M的DNA节段可操作连接的启动子的载体或包含与编码流感病毒NS2的DNA节段可操作连接的启动子的载体的至少两个载体。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述HA是甲型HA。

4.权利要求1或2的组合物，其中所述HA是乙型HA。

5.权利要求1或2的组合物，其中a)的多个载体包含RNA聚合酶II启动子。

6.权利要求1或2的组合物，其中a)的所有载体包含RNA聚合酶II启动子。

7.权利要求1或2的组合物，其中a)的每个载体在分开的质粒上。

8.权利要求1或2的组合物，其中b)的每个载体在分开的质粒上。

9.权利要求1或2的组合物，其中a)的一个或多个载体，但不是所有载体的启动子是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子或T3启动子。

10.权利要求9的组合物，其中所述RNA聚合酶I启动子是人RNA聚合酶I启动子。

11.权利要求9的组合物，其中不包含RNA聚合酶II启动子的一个或多个载体的转录终止序列是RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。

12.权利要求1或2的组合物，其中b)的每个载体进一步包含RNA转录终止序列。

13.权利要求1至12任一项的组合物，进一步包括包含启动子的载体，该启动子与5′正粘病毒序列连接，5′正粘病毒序列包含与感兴趣的cDNA连接的5′正粘病毒非编码序列，该cDNA连接3′正粘病毒序列，该3′正粘病毒序列包含与转录终止序列连接的3′正粘病毒非编码序列。

14.权利要求13的组合物，其中所述感兴趣的cDNA是正义方向。

15.权利要求13的组合物，其中所述感兴趣的cDNA是反义方向。

16.权利要求1至12任一项的组合物，进一步包括包含RNA聚合酶II启动子的载体，该启动子连接第一个核酶序列，该第一个核酶序列连接5′正粘病毒序列，该5′正粘病毒序列包含与感兴趣cDNA连接的5′正粘病毒非编码序列，该cDNA连接3′正粘病毒序列，该3′正粘病毒序列包含3′正粘病毒非编码序列，该3′正粘病毒非编码序列连接第二个核酶序列，该第二个核酶序列连接转录终止序列。

17.权利要求13或16任一项的组合物，其中所述感兴趣的cDNA包含编码病原体的免疫原性多肽或肽或治疗多肽或肽的开放阅读框。

18.一种制备流感病毒的方法，包括：将细胞与有效产生传染性流感病毒量的权利要求1至17任一项的组合物相接触。

19.权利要求18的方法，进一步包括分离该病毒。

20.通过权利要求19的方法获得的病毒。

21.一种制备基因送递载体的方法，包括：将细胞与有效产生流感病毒量的权利要求13至17任一项的组合物相接触，和分离该病毒。

22.通过权利要求21的方法获得的病毒。

23.接触权利要求1至2任一项的组合物的细胞。

24.权利要求20或22的病毒所感染的细胞。

25.一种载体，包含RNA聚合酶II启动子，该启动子连接第一个核酶序列，该第一个核酶序列连接流感病毒cDNA，该流感病毒cDNA连接第二个核酶序列，其中该流感病毒cDNA是流感病毒PA cDNA、流感病毒PB1 cDNA、流感病毒PB2 cDNA、流感病毒NP cDNA、流感病毒HA cDNA、流感病毒NA cDNA、流感病毒M1 cDNA、流感病毒M2 cDNA、流感病毒NS2 cDNA、流感病毒BM2 cDNA或流感病毒NS cDNA。

26.权利要求25的载体，进一步包含与所述第二个核酶序列连接的RNA聚合酶II转录终止序列。

27.一种制备流感病毒的方法，包括使细胞接触包含与连接转录终止序列的流感病毒PA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB2 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒HA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NP cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒McDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NS cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA节段可操作连接的启动子的载体、和包含与编码流感病毒NP的DNA节段可操作连接的启动子的载体，以产生传染性病毒，其中包含病毒cDNA的至少一个载体中的启动子包括RNA聚合酶II启动子，该启动子连接第一个核酶序列，该第一个核酶序列连接病毒cDNA，该病毒cDNA连接第二个核酶序列，该第二个核酶序列连接转录终止序列。

28.权利要求27的方法，进一步包括包含与编码流感病毒HA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA节段可操作连接的启动子的载体和包含与编码流感病毒NS2的DNA节段可操作连接的启动子的载体。

29.一种制备流感病毒的方法，包括使细胞接触包含与连接转录终止序列的流感病毒PA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒PB2 cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒HA cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NP cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NB和NAcDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒M cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与连接转录终止序列的流感病毒NS cDNA可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒HA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M的DNA节段可操作连接的启动子的载体、和包含与编码流感病毒NS2的DNA节段可操作连接的启动子的载体，其中包含病毒cDNA的至少一个载体包含RNA聚合酶II启动子，该启动子连接第一个核酶序列，该第一个核酶序列连接病毒cDNA，该病毒cDNA连接第二个核酶序列，该第二个核酶序列连接转录终止序列。

30.权利要求29的方法，进一步包括包含与编码流感病毒HA的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA和NB的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M的DNA节段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒BM2的DNA节段可操作连接的启动子的载体和包含与编码流感病毒NS2的DNA节段可操作连接的启动子的载体。

31.权利要求27至30任一项的方法，进一步包括包含与5’流感病毒序列连接的启动子的载体，该5’流感病毒序列包含5’流感病毒非编码序列，该非编码序列连接感兴趣的cDNA或其片段，该cDNA或其片段连接3’流感病毒序列，该3’流感病毒序列包含与转录终止序列连接的3’流感病毒非编码序列。

32.权利要求27至30任一项的方法，进一步包括包含RNA聚合酶II启动子的载体，该启动子连接第一个核酶序列，该第一个核酶序列连接5′流感病毒序列，该5′流感病毒序列包含与感兴趣cDNA或其片段连接的5′流感病毒非编码序列，该cDNA或其片段连接3′流感病毒序列，该3′流感病毒序列包含3′流感病毒非编码序列，该3′流感病毒非编码序列连接第二个核酶序列，该第二个核酶序列连接转录终止序列。

33.权利要求31或32的方法，其中所述感兴趣的cDNA包含编码病原体的免疫原性多肽或肽或治疗多肽或肽的开放阅读框。

34.权利要求27至33任一项的方法，其中所述HA是甲型HA。

35.权利要求27至33任一项的方法，其中所述HA是乙型HA。

36.权利要求27或29的方法，其中a)的所有载体包含RNA PolII启动子。

37.权利要求27至33任一项的方法，进一步包括分离该病毒。

38.通过权利要求27至37任一项的方法获得的病毒。

39.接触权利要求38的病毒的细胞。

40.权利要求38的病毒所感染的细胞。

41.一种免疫个体对抗病原体的方法，包括给该个体施用有效免疫该个体的量的权利要求38的病毒。

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