KR102006501B1 - 대황 유래 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 하는 항균성 조성물 - Google Patents

대황 유래 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 하는 항균성 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대황(Eisenia bicyclis) 유래 플로로탄닌 화합물을 포함하는 항균성 조성물에 관한 것으로, 대황 유래의 7-플로로엑콜, 푸코푸로엑콜-A, 디옥시노데히드로엑콜, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 한다. 본 발명의 상기 화합물들은 항생제 내성균에 대한 항균활성을 나타낸다. 또한, 암피실린, 페니실린, 및 옥사실린 등의 ß-락탐계 항생제의 MRSA에 대한 항균활성을 회복시킴으로써 ß-락탐계 항생제와의 병행 사용에 의해 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 병원성 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 식품, 식품 첨가제, 음료, 화장료 조성물, 화장품 첨가물 또는 세정제의 용도로 사용될 수 있다.

Description

대황 유래 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 하는 항균성 조성물 {Antibiotics Composition Containing Phlorotannins from Eisenia bicyclis}
본 발명은 대황 유래 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 하는 항균성 조성물에 관한 것으로서, 상기 항균제 조성물은 특히 MRSA(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus)에 대해 매우 우수한 항균활성을 갖는 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.
항생제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 상세하게는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 뛰어난 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미한다. 항생제의 성분은 주로 곰팡이로부터 추출된 것이 주를 이루었으며, 오늘날 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위해 많이 사용되고 있다. 가장 대표적인 항생제로는 영국인 의사 알렉산더 플레밍이 1928년에 제조한 페니실린이다. 페니실린은 인류가 세균에 본격적으로 대응하기 위해 제조한 최초의 항생제였다. 페니실린 이후에 개발된 대표적인 항생제로는 페니실린 보다 효과가 탁월한 것으로 인정되는 메티실린(methicillin)이 있다. 메티실린은 페니실린의 화학구조를 일부 변경하여 제조한 것이다.
상기 메티실린은 베타-락탐계 항생제로 분류되며, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린-결합 단백질(penicillin-binding proteins, PBPs)와 결합을 형성한 후 이 단백질의 활성을 제거함으로써 약효를 발휘하는 것이다.
항생제 내성세균이란 특정 항생제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말한다. 예를 들어, 상기한 페니실린의 약효가 전혀 듣지 않는 페니실린 내성 황색포도상구균이 이에 해당된다. 이 외에도, 1961년 최초로 학계에 보고되었으며, 그 후로 전세계적으로 주요 병원내 감염균이 되고 있는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)이 있다. 상기 MRSA는 페니실린이나 메티실린의 항생제에도 내성을 나타낼 수 있는 독특한 유전자를 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 MRSA는 주로 건강한 사람에게는 감염이 되지 아니하고 주로, 면역력이 약한 환자나 수술을 마친 환자에게 감염이 되나, 감염이 되는 경우에는 패혈증이나 폐렴을 일으켜 사망케 하는 것으로 보고되어 있다.
최근에는 건강한 사람들도 MRSA에 감염되는 일이 증가하고 있다. 미국 의학계나 공중보건학계는 MRSA와 같이 여러 항생제에도 약효가 듣지 않는 병원균(다약제 내성 병원균)에 의한 감염의 증대를 크게 우려하고 있다.
한국특허 10-2012-0033443
본 발명은 여러 가지 균류에 대해 우수한 항균활성을 가지며, 특히 MRSA(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus)에 대한 강한 항균활성을 갖는 대황 유래 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균성 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대황(Eisenia bicyclis) 유래의 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균성 조성물을 제공한다. 이러한 항균성 조성물은 특히 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 또는 동물 사료용 조성물로서 이용될 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 항균성 조성물은 대황(Eisenia bicyclis) 유래의 7-플로로엑콜, 푸코푸로엑콜-A, 디옥시노데히드로엑콜 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 플로로탄닌 화합물을 유효성분으로 한다.
일 예에서, 상기 플로로탄닌 화합물은 대황(Eisenia bicyclis)의 추출물, 분획물, 미생물 발효물, 또는 정제물로부터 얻을 수 있다.
일 예에서, 상기 플로로탄닌 화합물은 대황(Eisenia bicyclis)의 메탄올 조추출물의 n-헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 및 n-부탄올 분획물 중에서 선택된 분획물로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 상기 에틸 아세테이트 분획물로부터 얻을 수 있다.
일 예에서, 상기 플로로탄닌 화합물은 메티실린계 내성 황색포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 항균활성을 갖는다.
일 예에서, 상기 플로로탄닌 화합물은 메티실린계 내성 황색포도상구균에서 PBP2a 단백질의 합성을 저해한다.
일 예에서, 본 발명의 항균성 조성물은 암피실린, 페니실린, 및 옥사실린 등의 ß-락탐계 항생제를 더욱 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 항균성 조성물은 약제학적, 화장학적, 식품학적 조성물로 이용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 대황 유래의 플로로탄닌 화합물들은 항생제 내성균에 대한 항균활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 상기 화합물들은 암피실린, 페니실린, 및 옥사실린 등의 ß-락탐계 항생제의 MRSA에 대한 항균활성을 회복시킴으로써 ß-락탐계 항생제와의 병행 사용에 의해 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 항균성 조성물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 병원성 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 식품, 식품 첨가제, 음료, 화장료 조성물, 화장품 첨가물 또는 세정제의 용도로 사용될 수 있다. 특히 대황은 천연물질로서 식용 가능하므로 이로부터 유래한 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.
도 1는 대황의 메탄올 추출과 순차 분획의 단계도이다.
도 2은 대황 추출물의 에틸 아세테이트 분획물로부터 분리된 화합물 1-6 의 순서도이다.
도 3는 대황으로부터 분리된 플로로탄닌 화합물 1내지 6의 구조이다.
도 4a 및 b는 각각 DMSO-d 6 중 화합물 1의 1H-NMR 스펙트럼 (a) 및 13C-NMR 스펙트럼 (b) 이다.
도 5a 및 b는 각각 DMSO-d 6 중 화합물 2의 1H-NMR 스펙트럼 (a) 및 13C-NMR 스펙트럼 (b) 이다.
도 6a 및 b는 각각 DMSO-d 6 중 화합물 3의 1H-NMR 스펙트럼 (a) 및 13C-NMR 스펙트럼 (b) 이다.
도 7a 및 b는 각각 DMSO-d 6 중 화합물 4의 1H-NMR 스펙트럼 (a) 및 13C-NMR 스펙트럼 (b) 이다.
도 8a 및 b는 각각 DMSO-d 6 중 화합물 5의 1H-NMR 스펙트럼 (a) 및 13C-NMR 스펙트럼 (b) 이다.
도 9a 및 b는 각각 DMSO-d 6 중 화합물 6의 1H-NMR 스펙트럼 (a) 및 13C-NMR 스펙트럼 (b) 이다.
도 10은 MRSA에 대한 플로로푸코푸로엑콜-A의 항균효과의 SEM 프로파일이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
용어 “항균 조성물”이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람 양성균 및 그람 음성균의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.
용어 “추출물”은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
용어 “약”이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, “포함하다” 및 “포함하는”이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대황(Eisenia bicyclis)으로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균성 조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 갈조류인 대황으로부터 분리한 플로로탄닌 화합물이 MRSA의 페니실린 결합 단백질 2a (PBP2a) 단백질의 불활성 또는 합성을 저해하는데 관여함으로써 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 갖는다.
본 발명의 원료가 되는 대황(Eisenia bicyclis)은 갈조류에 속하는 해양식물로서, 다시다목 미역과의 바닷말에 속하는 해조류이고, 통상적으로 길이는 서식처의 수심에 따라 차이가 있으나 큰 것은 1 내지 1.5m 이상이고, 4년까지 사는 다년생으로 유체는 주로 봄에 나타나고, 일반적으로 일본과 우리나라 특히, 울릉도나 독도 인근 해안에서 채집할 수 있으며, 채집한 대황은 적절한 용매로 추출하며 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 종래 항산화, 항염즘, 항암 등의 다양한 생리활성에 대한 연구가 많이 보고되어 있지만 항균에 관한 연구는 미미한 편이다.
이에 본 발명에서는 대황에서 병원 감염증의 주된 원인균 중의 하나인 메티실린계 내성 황색포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 항균 활성을 확인하고 대황으로부터 anti-MRSA 활성을 가지고 있는 단일물질로서 특정한 플로로탄닌 화합물들(7-플로로엑콜, 푸코푸로엑콜-A, 디옥시노데히드로엑콜)을 분리하였다.
상기 추출을 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등의 탄소수 1 내지 4의 알콜이나, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 디클로로메탄(dichloromethane), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.
또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 부탄올, 디클로로메탄, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸 에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 바람직하게는 상기 분획용매는 바람직하게는 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올일 수 있다. 상기 분획시 용매는 1종 이상 사용할 수 있다. 본 발명의 대황 추출물은 통상의 해조류 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법 또는 열수 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 수득한 대황 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있고, 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킬 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 대황 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
본 발명의 일예로, 상기 대황 추출물은 대황의 염분 및 불순물을 제거한 후, 건조하여 건조시료를 제조하고, 상기 건조시료에 메탄올을 첨가하여 조추출액을 얻으며, 상기 조 추출액을 감압 농축하여 추출물을 제조할 수 있다. 이 때, 상기 대황의 염분 및 불순물의 제거는 유수를 이용하여 씻어내서 수행할 수 있으며, 상기 건조시료는 상기 염분 및 불순물을 제거한 대황을 건조한 후에 분쇄하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 대황 건조시료는 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있다. 또한, 상기 대황 추출물은 수득된 추출액을 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킨 것일 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 대황 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
본 발명의 대황 유래 플로로탄닌 화합물들(7-플로로엑콜, 푸코푸로엑콜-A, 디옥시노데히드로엑콜)은 MRSA에 대한 항균활성을 나타낸다. 본 발명자들은 플로로탄닌 화합물들이 가지고 있는 MRSA에 대한 항균기작을 조사하기 위하여 MRSA에 대한 감수성이 없는 ß-락탐계 항생제와의 병행 사용에 의한 시너지 효과를 조사하였다. 그 결과 암피실린, 페니실린, 및 옥사실린 등의 ß-락탐계 항생제의 MRSA에 대한 항균활성의 회복이 확인되었다(실험예 9, 10 참조). 이 결과는 본 발명의 플로로탄닌 화합물들이 ß-락탐계 항생제 내성에 관여하는 MRSA의 페니실린 결합 단백질 2a (PBP2a) 단백질의 불활성 또는 합성을 저해하는데 관여한다는 것을 의미한다. 이러한 추론을 분자생물학적인 기법으로 규명하기 위하여 PBP2a 단백질의 합성에 관여하는 관련 유전자 및 MRSA의 ß-락탐계 항생제 내성에 관여하는 유전자들의 전사와 단백질 합성에 대한 본 발명의 플로로탄닌 화합물들의 영향을 RT-PCR 및 western blot을 이용하여 조사하였다(실험예 11 참조). PBP2a의 합성에 관여하는 mec operon (mecA , mecI , mecR1)의 유전자 전사가 본 발명의 플로로탄닌 화합물들에 의한 농도 의존적 저해가 관찰되었다. 또한, mecA 유전자의 최종 생산물인 PBP2a 합성도 플로로탄닌 화합물 농도 의존적으로 억제되는 것을 western blot을 통해 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 플로로탄닌 화합물들이 직접적으로 MRSA에서 ß-락탐계 항생제의 세포내 수송을 억제하는 PBP2a 단백질의 합성을 저해함으로서 ß-락탐계 항생제에 대한 항생제 감수성을 회복시킨다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 항균성 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 대황 추출물을 0.001 중량% 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균성 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
상기 항균성 조성물은 병원성 미생물, 구체적으로는 각종 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 항균성 조성물일 수 있고, 보다 상세하게는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ,MRSA),대장균(E.coli), 클레브시엘라균(Klebsiella . sp), 바실러스균(Bacillus . sp), 마이크로커커스균(Micrococcus . sp), 스테필로로코코스균(Staphylococcus . sp), 엔테로박터균(Enterobacter . sp), 비브리오균(Vibrio . sp) 또는 에드워드지엘라균(Edwardsiella. sp)에 대해 항균활성을 갖는 항균성 조성물이며, 바람직하게는 메티실린 내성 황색포도상구균, 대장균(E. coli), 폐렴간균 (Klebsiella . pnermoniae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, B. subtilis), 마이크로커커스 루테우스(Micrococcus leuteus, M. luteus), 스테필로코코스 오레어스(Staphylococcus aureus , S. aureus), 엔테로박터 아이로게네스(Enterobacter aerogenes , E. aerogenes), 장염비브리오균(Vibrio parahemolyticus , V. parahemolyticus) 또는 에드워드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda, E. tarda)에 대해 항균활성을 갖는 항균성 조성물이고, 가장 바람직하게는 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 항균성 조성물이다.
상기 메티실린 내성 황색포도상구균이란 그람 양성구균에 속하는 병원성 세균으로, 이중 페니실린계 항생제인 메티실린(methicillin),β 옥사실린(oxacillin) 또는 나프실린(nafcillin)에 내성을 보이는 내성을 보이는 균을 의미한다. 상기 메티실린 내성 황색포도상구균은 세팔로스포린계 항생제(cephalosporins) 및 이미페넘(imipenem)을 포함한 대부분의 베타-락탐계 항생제(β-lactam class of antibiotics)에 내성이 있으며, 아미노글리코사이드, 퀴놀론 항생제 등 대부분의 항생제에도 내성이 있는 경우가 흔하다. 상기 메티실린 내성 황색포도상구균은 농양이나 창상감염 등의 피부 감염 뿐만 아니라 폐렴, 패혈증 등의 중증 감염의 원인 균으로 보고되어 있으며, 이에 의한 감염을 치료하기 위해서는 반코마이신(vancomycin)이나 테이코플라닌(teicoplanin)과 같은 극히 제한된 항생제를 사용할 수 있는 있는 것으로 보고 되어 있다.
상기 메티실린 내성 황색포도상구균에 의한 감염에 의해 폐렴, 폐화농증, 농흉 등의 호흡기감염증, 패혈증, 균혈증, 감염성 심내막염, 장관감염증, 난치성 욕창 또는 창상감염 등이 발병되는 것으로 보고 되어 있다.
상기 메티실린 내성 황색포도상구균은 인체의 어느 부위에서도 정착하여 감염을 일으킬 수 있으므로, 접촉전파(contact transmission)에 의한 감염 뿐만 아니라, 공기전파(airborne transmission)에 의한 감염도 가능하며, 특히 피부의 방어기전이 손상된 수술환자나 화상 환자에게 잘 정착하여 치명적인 감염을 일으킬 수 있고, 병원에서 오랜 시간을 근무하는 의료인의 경우, 비강내 정착율이 높아 공기전파에 의한 감염도 가능한 것으로 보고 되어 있다.
상기 대장균이란 사람이나 동물의 장 속에 사는 세균으로 특히, 대장에 많이 존재하여 대장균이라 부르며, 장 이외의 부위에서는 질병을 유발하는, 구체적으로는 방광염, 신우염, 복막염 또는 패혈증 등을 일으킬 수 있는 병원균이며, 전염성 설사를 일으키는 대장균의 경우 병원성 대장균이라고 한다.
상기 폐렴간균은 폐렴의 원인이 되는 병원균으로 그람 음성의 짧은 간균을 말한다.
상기 장염비브리오균은 식중독을 일으키는 주요 원인균으로 6월 내지 10월에 연안과 염하구의 해수, 퇴적토, 무척추 생물 등에서 주로 발견되며, 주로 꼬막, 바지락, 물미역, 피조개, 새우, 낙지, 물치 또는 망둥이 등을 감염시킨다. 상기한 어패류 등에 부착된 장염비브리오균은 냉장고, 도마, 행중, 칼등의 조리기구 및 조리자의 손을 통하여 다른 식품을 오염시킬 수 있으며, 사람이 오염된 이들 식품을 섭취하는 식중독 등이 발병될 수 있다.
상기 에드워드지엘라균은 장내세균과의 세균인 그람 음성균으로 주로 어류에서 소화관의 장애를 일으키는 원인균이며, 특히 에드워드지엘라 타르다균은 에드와드 병의 원인균이다. 상기 에드와드 병은 고수온기에 2년어 이상의 대형어류에 발생하며, 외관증상으로는 두부의 궤양, 복부의 팽만 또는 발적, 안구의 백탁 또는 돌출 등이 있고, 내부증상으로는 복수가 차있거나 생식소 특히 난소의 발적과 경화가 특징 등이 있으며, 이병에 의한 누적 폐사율은 20 내지 30% 에 달한다.
본 발명의 항균성 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 어류 또는 어패류 등의 해양 생물에 적용되어 어류 또는 어패류 등의 폐사율을 낮추고 생산성을 증가할 뿐만 아니라 인간 등의 해양 생물을 섭취하는 타 동물의 2차 감염을 예방할 수 있다.
상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배성 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 절지동물에 속하는 게, 새우, 대하 등의 갑각류, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류, 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 인간, 돼지, 소 염소 등의 포유류일 수 있다.
본 발명의 항균성 조성물은 대황 유래 플로로탄닌 화합물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.
상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 중량% 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 중량% 내지 10 중량%일 수 있다.
본 발명의 상기 항균성 조성물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 병원성 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 식품, 식품 첨가제, 음료, 화장료 조성물, 화장품 첨가물 또는 세정제의 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균성 조성물을 포함하는 메티실린 내성 황색포도상구균의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병은 황색포도상구균의 감염에 의해 발병할 수 있는 각종 감염성 질병을 의미하며, 바람직하게는 폐렴, 폐화농증, 농흉 등의 호흡기감염증, 패혈증, 균혈증, 감염성 심내막염, 장염, 장관감염증, 난치성 욕창 또는 창상감염 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폐렴, 패혈증, 균혈증, 감염성 심내막염, 및 장염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 대황 유래 플로로탄닌 화합물 이외에 제형 및 사용방법에 따라 약리학적으로 사용가능한 담체나 부형제를 부가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 조성물 단독으로 또는 메티실린 내성 황색포도상구균에 의한 감염의 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다. 이 경우 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물 내 대황 추출물의 함량은 0.001 중량% 내지 99 중량%일 수 있다. 조성물 내 유효성분의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우 효과적인 효능을 위해선 다량의 투여가 필요할 수 있으며, 99 중량% 초과하는 경우 사용량에 비해 효능이 일정할 수 있어 비경제적일 수 있다. 또한, 사용방법 및 사용목적에 따라 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 대황 추출물의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있으나, 이의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으므로 하기 기술한 바에 한정되는 것은 아니다. 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS) 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
상기 약리학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제를 사용할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르, 리퀴드 파라틴 및 생리식염수가 있다.
구체적으로는 제형에 따라 경구투여의 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있고, 비경구투여의 경우, 멸균된 수용액, 비수성용제 또는 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등을 사용할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁제는 일예로 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등 일 수 있으며, 상기 좌제는 일예로 위텝솔, 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지 또는 글리세로제라틴 등일 수 있다.
또한, 추가로 본원발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 담체와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 투여대상은 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 극피동물, 절지동물, 연체동물 및 어류를 포함하는 해양생물 및 상기 해양생물을 섭취할 수 있는 포유류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 해양생물은 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 절지동물에 속하는 게, 새우, 대하 등의 갑각류, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류를 포함하는 양식 가능한 어패류일 수 있고 상기 포유류는 인간을 포함한 상기 양식 가능한 어패류를 섭취할 수 있는 돼지, 소, 염소 등의 사육이 가능한 가축과 꿩, 닭 등의 가금류일 수 있다.
본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 투여량 또는 사용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 바람직하며, 예컨대 1일 유효 투여량은 통상적으로, 10mg/kg 내지 5000mg/kg이며 바람직하게는 100mg/kg 내지 3000mg/kg이고, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있으며, 바람직하게는 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.
투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.
본 발명의 메티실린 내성 황색포도상구균 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 우수한 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 효과에 의한 감염의 예방 또는 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라, 천연 해조류인 대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이므로 장기간 복용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균성 조성물을 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.
상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배성 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 게, 새우, 대하 등의 갑각류를 포함하는 절지동물, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류, 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 돼지, 소, 염소 등의 포유류일 수 있다.
상기 동물 사료용 조성물은 상기 대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균성 조성물에 곡물, 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료, 당분 또는 유제품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 곡물은 구체적으로는 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀일 수 있고, 상기 식물성 단백질 사료는 구체적으로는 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것일 수 있으며, 상기 동물성 단백질 사료는 구체적으로는 혈분, 육분, 골분 및 생선분일 수 있고, 상기 당분 또는 유제품은 구체적으로는 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분일 수 있다.
상기 동물 사료용 조성물은 추가로 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성창 촉진제 또는 질병 예방제와 같은 성분을 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 조성물에 포함되는 항균성 조성물은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 최종 생산된 사료 1kg을 기준으로 상기 항균성 조성물이 0.1g 내지 100g 포함될 수 있다.
또한, 상기 사료용 조성물은 성분들의 분쇄정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질로 제조될 수 있으며, 상기 조성물은 메시(mesh)로 공급되거나 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성시킬 수 있으며, 저장을 위해 펠렛화, 팽창화 또는 압출 공정을 거칠 수 있으며, 저장의 용이성을 위해 바람직하게는 과잉의 물을 건조 제거될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균성 조성물을 포함하는 세정제를 제공한다. 상기 세정제는 바람직하게는 의류용 세제, 식기 세척제, 식품 세정제, 가전제품 세척제일 수 있다. 상기 항균성 조성물은 천연성분으로 인체에 유해하지 아니하므로, 더욱 바람직하게는 주방용품 또는 식품세척 등을 포함하는 각종 생활용품의 세척이나 항균성 부여를 목적으로 사용할 수 있다.
상기 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택된 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 세정제 등 다른 유효성분이나 색소, 계면활성제, 방부제 등의 첨가제와 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 분말화, 과립화, 정제화 또는 액상화하여 제조될 수 있으며, 제품화를 위하여 포장을 위해 통상의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 세정제 중 항균성 조성물의 사용량은 사용목적과 적용형태, 적용부위, 적용대상물품 등에 따라 적절히 사용될 수 있으며, 예를 들면 전체 조성물 기준으로 0.01 중량부 내지 50 중량부를 포함할 수 있으나, 상기 항균성 조성물의 함량은 이에 한정되는 것은 아니다. 본원 발명의 항균성 조성물은 천연성분으로 인체에 유해하지 아니하므로, 그 제품의 특성상 적용목적을 달성할 수 있는 경우라면 다양한 양으로 사용가능하다.
또한, 본 발명은 상기 항균성 조성물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 이러한 식품 조성물은 유효성분인 대황 유래 플로로탄닌 화합물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 참갈고리풀 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호를 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물 L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 참갈고리풀 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 참갈고리풀 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 참갈고리풀 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 참갈고리풀 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 참갈고리풀 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
<1-1> 대황 분획물의 추출
본 실험에 사용된 대황은 2010년 9월말에 울릉물산에서 구입하여 실험에 사용하였다. 증거표본 (voucher specimen)은 부경대 식품공학과 식품미생물교실에 보관되어 있다. 대황을 물에 씻어내어 소금을 제거하고 건조시킨 후 한일 믹서기 (HMF-1000A; Hanil Electronics, Seoul, Korea)로 분말화하였다. 다시 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 대황분말 1.0 kg에메탄올 10L를 가하여 70℃로 3시간 동안 중탕, 여과후에 rotary evaporator (Eyela, Tokyo, Japan) 로 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 건조된 메탄올 추출물을 1 L H2O-메탄올(9 : 1)에 재용해하고 여기에 1 L의 n-헥산을 가하여 n-헥산 추출물과 수용성 추출물로 분획하여 n-헥산 추출물을 얻고, 수용성 분획에 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올을 순차적으로 첨가하여 최종적으로 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 수용성 추출물을 얻었다.
<1-2> 미생물 및 배양
실험에 사용된 모든 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 한국미생물보존센터(KCCM) 에서 분양 받아 사용하였다. 실험에 사용한 균주는 한 종의 methicillin 감수성 Staphylococcus aureus KCTC 1927과 두 종의 methicillin 내성 Staphylococcus aureus (KCCM40510, KCCM 40511)를 사용하였고, Tryptic soy broth 와 Mueller-Hinton broth 를 최소억제농도(minimum inhibitory concentration) assay에 Mueller-Hinton agar를 disc diffusion 실험에 사용하였다.
<1-3> 폴리페놀 화합물의 함량
폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Ciocalteu 법을 이용하여 측정하였다. 즉, 메탄올 추출물을 1 mg/mL에 녹인 다음 0.1 mL 를 취하고 여기에 0.5 mL Folin-ciocalteu reagent를 첨가하여 잘 혼합한 후 3분간 실온에 방치하였다. 정확히 3분 후 Na2CO3 포화용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 실온에서 45분 방치한 후 8분간원심부리 후 상징액을 765 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이때 총 폴리페놀 화합물은 phloroglucinol를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. phloroglucinol를 이용한 표준곡선의 식은 다음과 같다. y = 0.0428x - 0.3600
<1-4> 디스크 디퓨전 어세이( Disk diffusion assay )
항균활성은disc diffusion 방법에 의해 확인하였다. 공시균주들은 600 nm 에서 흡광도가 0.5가 될때까지 Tryptic soy 배지에 세균을 배양하였다. 약 104 CFU/mL 의 균주를 포함하는 1 mL의 배양액을 Mueller-Hinton agar 플레이트에 spreading 하였고, 1mg의 추출물을 함유하는 paper disc를 플레이트에 올려두었다. 37℃에서 24시간 배양후에 억제환의 지름을 측정하였다.
<1-5> mecA gene 의 검출
메티실린 및 모든 베타락탐계 항생제에 본질적으로 불활성인 페니실린-결합 단백질 2a (PBP2a)을 인코딩하는 mecA 유전자를 검색하기 위해 MSSA와 MRSA 공시균주들을 37℃에서 18시간 배양하였다. 그리고, 3 mL의 배양액에서 chromosomal DNA를 Accu - Prep Genomic DNA Extraction Kit를 이용하여 추출하였다. The chromosomal DNA는 PCR reaction template으로 이용되었다. PCR은 두개의 합성 oligonucleotides는 다음과 같다.
- sense는 5'-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3'
- antisense는 5'-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3'
DNA는 30 cycle의 denaturation (94℃, 30 s) annealing (50℃, 30 s) 그리고 polymerization (72℃, 60 s)로 증폭되었다. 증폭된 PCR product는 약 500 bp이다.
<1-6> 최소억제농도 측정
MIC는 overnight 배양 후에 미생물의 visible 생장을 저해하는 낮은 농도를 말한다. 추출물과 vancomycin의 MIC 분석은 Mueller-Hinton 배지를 이용한 two-fold serial dilution method를 사용하여 수행하였다. MIC는 37℃ 에서 20-24 hr 의 배양후에 visible 생장을 저해하는 낮은 농도로 정의된다.
<1-7> 대황으로부터 phlorotannins 의 분리 및 정제
UV spectra 는 Hitachi U-2000 spectrophotometer를 사용하여 구하였다. 1 H 및 13 C NMR spectra는 600 과 150 MHz로 Varian VNS600으로 측정하였다. chemical shift는 내부 표준물질로서 tetramethylsilane(TMS)를 DMSO-d 6 로 사용하여 상대적인 ppm으로 나타내었다. 장치에 프로그램되어 있는 표준 펄스규격은 2D 측정을 위해 사용되었다. 짝지음 상수인 J CH 값은 Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) spectra에서 8 Hz로 세팅되었다.
NMR matrix agent 로 3-nitrobenzyl alcohol 이 사용된 Fast 질량분석(FAB-MS)는 Micromass Auto Spec OA-TOF spectrometer로 측정되었다. High-performance liquid chromatography (HPLC) 분석은 YMC-Pack ODS A-302 column을 이용하고 분석하였고, 40℃℃ with 1% formic acid과 아세토나이트릴을 이용하여 280 nm에서 측정하였다. Column chromatography는 LiChroprep RP-18 과 Sephadex LH-20를 이용하여 분석하였다. Thin-layer chromatography (TLC)는 Kieselgel 60 F254 plates를 이용하여 10% 황산용액을 이용하여 UV조사를 통하여 spot을 검출하였다.
<1-8> SEM ( Scanning Electron Microscopy ) 분석
항 MRSA 물질의 처리에 의해 미생물 형상의 변화를 모니터하기 위해 Scanning Electron Microscope를 이용하였다. 표본은 2% phosphate buffered glutaraldehyde 로 고정하였고, 0.05 M phosphate buffer 로 세척한 후 1% buffered osmium tetroxide 로 다시 고정하였다. 고정된 샘플은 에탄올로 탈수시켰다. 건조된 표품은 SCD-005 sputter-coater에서 금으로 코팅되었고 Field Emission Scanning Electron Microscope로 15 kV의 가속전압으로 측정하였다.
<1-9> MRSA 에 대한 플로로푸코푸로엑콜 -A과 β-락탐계 항생제의 시너지 효과
암피실린, 페니실린, 및 옥사실린을 포함하는 β-lactam계 항생제와 플로로푸코푸로엑콜-A(PFF)와의 상호작용을 알아보기 위해 checkerboard method를 이용하여 실시하였다. Synergistic 효과는 fractional inhibitory concentration (FIC) index를 이용하여 측정되었다. FIC는 다음과 같이 항생제 또는 PFF 단독으로 사용되어는 MIC로 계산되었다.
FIC는 FIC index에서 파생되어 합하여졌고, 그것은 index 값이 다음과 같을때 시너지를 나타낸다.
synergism ≤≤0.5, indifference >0.5 to ≤≤4, antagonism >4.
FICA = MICA in combination / MICA , FICB = MICB in combination / MICB
FIC Index = FICA + FICB
<1-10> RNA 분리 및 RT - PCR 분석
약재내성과 관련이 있는 유전자의 전사에 플로로푸코푸로엑콜-A의 억제 효과를 규명하기 위해서, MRSA 균들은 플로로푸코푸로엑콜-A의 다양한 농도로 처리되었다. 균체를 모은 후에 Total RNA는 manufacturer’s specifications를 따라 zirconia beads 와 RNAwiz 키트로 균체로부터 분리하였다. RNA 농도는 260nm에서 측정하였다. 10 mM dithioothreitol (DTT), 2.5 mM 의 각각의 dNTPs, 그리고 reaction buffer를 첨가한 후에 0.2-1.4 μg 의 total RNA 와 1.4 μg 의 random primer 로 65℃에서 5 min간 denature하였고, 30 sec간 차게한 뒤 2분 동안 37℃에서 preincubate하였다. 남아있는 cRNA는 37℃에서 20 min간 2 units의 RNase H의 첨가로 제거하였다. 100 units의 Superscript II reverse transcriptase를 첨가한 뒤 50 min 간 37℃에서 반응시켰다. 반응은 70℃에서 15 min동안 중지시켰다. 1.5%의 RT products 가 PCR buffer (pH 8.4, 20 mM Tris, 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM dNTPs, 2 pM primers 그리고 0.1 μL Taq DNA polymerase가 포함되어 있는 PCR 반응에 첨가되었다. 28 PCR cycles 이 95℃ 에서 denaturation 되고 각각의 primer에 제시된 온도에 맞게 annealing 72℃ 에서 extension 되었다.
Primer sequences 는 다음과 같다. mecA (554 bp, PCR product, annealing temperature: 51.9℃) F; 5'-ATGAGATTAGGCATCGTTCC-3', R; 5'-TGGATGACAGTACCTGAGCC-3'; mecI (268 bp PCR product, annealing temperature: 49.5℃) F; 5'-CTGCAGAATGGGAAGTTATG-3', R; 5'-ACAAGTGAATTGAAACCGCC-3'; mecR1 (235 bp PCR product, annealing temperature: 53.9℃) F; 5'-AAGCACCGTTACTATCTGCACA-3', R: 5'-GAGTAAATTTTGGTCGAATGCC-3'; femA (372 bp PCR product, annealing temperature: 52.6℃) F; 5'-CATGATGGCGAGATTACAGGCC-3', R; 5'-CGCTAAAGGTACTAACACACGG-3'; GAPDH (514 bp PCR product, annealing temperature: 51.0℃) F; 5'-ATGACCCCTTCATTGACC-3', R; 5'-GAAGATGGTGATGGGATT TC-3' (Lee et al., 2007; Lei et al., 2007).
<1-11> 웨스턴 블롯 분석
약재내성과 관련이 있는 단백질, PBP2a 발현에 플로로푸코푸로엑콜-A의 억제 효과를 규명하기 위해서, MRSA 균들은 플로로푸코푸로엑콜-A의 다양한 농도로 처리되었다. 균체를 모은 후에 bacterial lysates는 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM ethyleneglycoltetraacetic acid (EGTA), 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 그리고 0.25 M sucrose로 구성되어 있는 lysis buffer를 이용하여 준비하였다. 균체는 lysis buffer로 20 sec동안 두 번의 sonication으로 재부유시켰다. 13,000xg로 10분 동안 원심분리한 후 상징액을 cell lysate로 사용하였다. 단백질 농도는 Bradford protein assay로 측정하였다. 동량의 2X SDS-PAGE sample buffer (pH 7.5, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% SDS, 150 mM NaCl) 가 cell lysate가 함유되어 있는 튜브에 첨가되었고, 튜브는 3분 동안 끓였다. cellular proteins는 10% SDS겔에서 전기영동 하였다.
통계분석
모든 경우에서 분석은 세 번 수행하였고, 결과는 세 번 측정한 것의 평균값으로 나타내었다. 표준편차 역시 계산되었다. 결과는 analysis of variance (ANOVA)에 의해 다중비교로 처리되었다. ANOVA는 통계프로그램 SPSS version 12.0를 이용하였다. 평균값들 사이의 유의한 차이는 Duncan’s Multiple Rangetest를 이용하여 나타내었다. 유의한 차이는 P < 0.05 수준에서 정의되어 있다.
< 실험예 1>
대황추출물의 순차분획
대황추출물을 순차분획하여 나온 분획물의 무게를 정리하였다(도 1 참조). 동결건조된 대황분말을 메탄올 추출(3 times × 1.0 L)한 후, 유기용매로 분획하여 헥산 분획물(42.3 g), DCM-분획물(2.5 g), EtOAc-분획물(23.8 g), 부탄올 분획물(26.5 g) 및 H2O 분획물(69.1 g)을 얻었다.
< 실험예 2>
메탄올 추출과 순차분획물의 총폴리페놀 ( TP ) 함량 분석
순차분획물의 총폴리페놀 함량에 대하여 하기 표 1에 정리하였다. 대황(E. bicyclis ) 추출물 중에서, TP 함량은 EtOAC-분획물이 가장 높았고 (739.2 mg PGEs/g of dry basis), 다음으로 DCM-분획물 (394.2 PGEs/g of dry basis), BuOH-분획물 (247.7 mg PGEs/g of dry basis), 헥산-분획물 (56.1 PGEs/g of dry basis) 및 H2O-분획물 (52.9 PGEs/g of dry basis)의 순으로 나타났다. 이러한 결과는 총폴리페놀 함량의 순서가 하기 표 2에 나타난 항균활성의 순서와 유사하다는 것을 알 수 있다. 따라서, 대황 추출물의 항균활성은 폴리페놀의 함량과 관련이 있다고 사료된다.
Figure 112012048201619-pat00001
† MeOH, 메탄올 추출물; DCM, 디클로로메탄-분획물 EtOAc, 에틸 아세테이트-분획물 BuOH, 부탄올-분획물 H2O, 물-분획물
*데이터는 3회 분석한 것의 평균값 ± 표준편차이다.
<실험예 3>
대황추출물의 항 MRSA 활성분석
Disk diffusion assay를 통해 대황추출물 및 순차분획물의 항균활성을 측정하였다. 분획물들 중 에틸 아세테이트 분획물의 항 MRSA 활성이 가장 강하게 나타났고, 다음으로 DCM-, BuOH- 및 헥산 분획물의 순이었으며(표 1 및 표 2 참조), 물 분획물에서는 항 MRSA 활성이 관찰되지 않았다.
Figure 112012048201619-pat00002
aMeOH, 메탄올 추출물; DCM, 디클로로메탄-분획물 EtOAc, 에틸 아세테이트-분획물 BuOH, 부탄올-분획물 H2O, 물-분획물
b대황 메탄올 추출물 및 그 분획물을 디스크(직경 6 mm) 상에 로딩함 .
c데이터는 2회 실험의 평균값임.
d, 항균활성이 관찰되지 않음
< 실험예 4>
대황추출물의 MIC 측정
MRSA에 대한 항균활성을 양적으로 평가하기 위해, MIC(최소억제농도)를 통해 대황추출물 및 순차분획물의 항균활성농도를 측정하였다. 표 3에는 MSSA 및 MRSA를 포함한 병원균에 대한 대황추출물의 MIC 값이 나타나 있다. 가장 높은 항-MRSA 활성을 나타내는 것은 EtOAc-분획물로 관찰되었고, 이는 디스크 디퓨젼 분석의 결과와 일치한다. 본 결과로부터 EtOAc-분획물의 항 MRSA 활성이 가장 강하게 나타나는 것을 알 수 있다.
Figure 112012048201619-pat00003
* MeOH, 메탄올 추출물; DCM, 디클로로메탄-분획물 EtOAc, 에틸 아세테이트-분획물 BuOH, 부탄올-분획물 H2O, 물-분획물
< 실험예 5>
대황으로부터 플로로탄닌의 분리
in vitro 분석에서 가장 강한 항-MRSA 활성을 나타내는 에틸 아세테이트 분획물로부터 항-MRSA 활성과 관계된 화합물을 분리하였다. 먼저, EtOAc-분획물(23.8 g)을 Sephadex LH-20 컬럼에서 메탄올(MeOH)을 용매로 하여 크로마토그래피를 수행하여 7개의 분획 추출물(EF01―EF07)을 수득하였다 (도 2). 분획 추출물 EF02 및 EF03를 were subjected to column chromatography over a LiChroprep RP-18 컬럼 (1.1 cm i.d. ×37 cm)에서 aqueous MeOH으로 컬럼크로마토그래피하여 순수 화합물 1 (55.4 mg) 및 2(3.6 mg)를 얻었다. EF04 및 EF05 분획추출물을 Sephadex LH-20 컬럼 (1.1 cm i.d. × 38 cm) 및 LiChroprep RP-18 (1.1 cm i.d. × 37 cm)에서 aqueous MeOH로 크로마토그래피하여 순수 화합물 3 (6.3 mg) 및 4 (5.6 mg)를 얻었다. 유사하게, EF07 분획추출물을 Sephadex LH-20 column (1.1 cm i.d. × 38 cm) 크로마토그래피 및 LiChroprep RP-18 (1.1 cm i.d. × 37 cm)에서 aqueous MeOH로 크로마토그래피하여 순수 화합물 5 (3.6 mg) 및 6 (32.9 mg)을 얻었다.
< 실험예 6>
대황으로부터 분리된 화합물 동정
실험예 5에서 에틸 아세테이트 분획물로부터 연속적 크로마토그래피를 통해 수득한 6개의 화합물은 하기와 같다; 화합물 1은 엑콜이고, 화합물 2는 푸코푸로엑콜-A, 화합물 3은 7-플로로엑콜, 화합물 4는 디옥시노데히드로엑콜, 화합물 5는 플로로푸코푸로엑콜-A 및 화합물 6은 디엑콜이다(도 3 참조). 또한, 도 4 내지 9은 H-NMR 스펙트럼 (a) 및 13C-NMR 스펙트럼(b) 결과이고, 하기는 FAB-MS, HPLC를 통해 분리된 플로로탄닌들의 동정된 결과이다.
화합물 1 (엑콜, EK): pale brown powder, FAB-MS m/z 373 [M + H]+. C18H12O9. 1H-NMR (DMSO-d 6, 600 MHz) δ: 9.46 (1H, s, OH-9), 9.41 (1H, s, OH-4), 9.14 (2H, s, OH- 2, 7), 9.11 (2H, s, OH-3′, 5′), 6.14 (1H, s, H-3), 5.96 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 5.80 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-6), 5.79 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-4′), 5.72 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2′, 6′). 13C-NMR (DMSO-d 6, 100 MHz) δ: 160.6 (C-1′), 159.0 (C-3′, 5′), 153.2 (C-7), 146.3 (C-9),146.1 (C-2), 142.8 (C-5a), 142.1 (C-4), 137.4 (C-10a), 123.4 (C-1), 122.9 (C-9a), 122.5 (C-4a), 98.7 (C-8), 98.4 (C-3), 96.4 (C-4′), 93.9 (C-2′), 93.8 (C-6), 93.7 (C-6′) see 표 4 및 도 4.
화합물 2 (푸코푸로엑콜-A, FFA): pale brown powder, FAB-MS m/z 479 [M + H]+. C22H14O11. 1H NMR (DMSO-d 6, 600 MHz) δ: 10.05 (1H, s, OH-14), 9.85 (1H, s, OH-4), 9.73 (1H, s, OH-10), 9.44 (1H, s, OH-2), 9.14 (2H, s, 3′, 5′-OH), 8.21 (1H, s, 8-OH), 6.72 (1H, s, H-13), 6.47 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-11), 6.29 (1H, s, H-3), 6.25 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-9), 5.83 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4′), 5.77 (2H, d, J = 2.4 Hz, H-2′, 6′). 13C-NMR (DMSO-d 6, 100 MHz) δ: 160.2 (C-1′), 158.8 (C-3′, 5′), 158.2 (C-11a), 157.6 (C-10), 150.4 (C-12a), 150.2 (C-8), 146.8 (C-2), 144.3 (C-14), 141.9 (C-4), 136.8 (C-15a), 133.6 (C-5a), 126.1 (C-14a), 122.6 (C-4a), 122.4 (C-1), 103.1 (C-6), 102.4 (C-7), 98.2 (C-3), 98.0 (C-9), 96.3 (C-4′), 94.6 (C-13), 93.7 (C-2′, 6′), 90.5 (C-11); see 표 4 도 5.
화합물 3 (1-(3′,5′-dihydroxyphenoxy)-7-(2″4″6-trihydroxyphenoxy)-2,4,9-trihydroxydibenzo-1,4-dioxin, 7-플로로엑콜, 7-P): light-brown powder, , FAB-MS m/z 497 [M + H]+. C24H16O12. 1H NMR (DMSO-d 6, 600 MHz) δ: 9.56 (1H, s, OH-9), 9.38 (1H, s, OH-4), 9.17 (1H, s, OH-2), 9.10 (2H, s, OH-3′, 5′), 9.09 (1H, s, OH-2″, 9.08(1H, s, OH- 6″, 8.98 (1H, s, OH-4″, 6.14 (1H, s, H-3), 6.01 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-8), 5.86 (2H, s, H-3″ 5″, 5.80 (1H, t, J =2.4 Hz, H- 4′ ), 5.79 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-6), 5.73 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2′, 6′). 13C- NMR (DMSO-d 6, 100 MHz) δ: 160.2(C-1′), 158.7(C-3′,5′), 154.8(C-6″, 154.7(C-4″, 154.5(C-7), 151.3(C-2″, 145.9(C-9), 145.8(C-2), 142.3(C-5a), 141.8(C-4), 137.0(C-10a), 123.9(C-9a), 123.1(C-4a), 122.5(C-1″, 122.2(C-1), 98.3(C-3), 98.1(C-8), 96.2(C-4′), 94.8(C-3″, 94.7(C-5″, 93.6(C-2′, 6′), 93.4(C-6); see 표 4 및 도 6.
화합물 4 (디옥시노데히드로엑콜, DD): pale brown powder, FAB-MS m/z 371 [M + H]+. C18H10O9. 1H-NMR (DMSO-d 6, 600 MHz) δ: 9.73 (1H, s, OH-1), 9.59 (1H, s, OH-9), 9.56 (1H, s, OH-6), 9.24 (1H, s, OH-3), 9.23 (1H, s, OH-11), 6.10 (1H, s, H-7), 6.04 (1H, d, J = 2.7 Hz, H-2), 6.01 (1H, d, J = 2.7 Hz, H-10), 5.84 (1H, d, J = 2.7 Hz, H-4), 5.82 (1H, d, J = 2.7 Hz, H-12). 13C-NMR (DMSO-d 6, 100 MHz) δ: 153.3 (C-3), 153.0 (C-11), 146.3 (C-1), 146.1 (C-9), 142.1 (C-4a), 141.7 (C-12a), 140.1 (C-6), 137.2 (C-7a), 131.6 (C-13b), 125.9 (C-5a), 122.6 (C-8a), 122.4 (C-13a), 122.2 (C-14a), 98.8 (C-2, 10), 97.5 (C-7), 93.9 (C-4, 12) see 표 4 및 도 7.
화합물 5 (플로로푸코푸로엑콜A, PFF): light-brown powder, FAB-MS m/z 603 [M + H]+. C30H18O14. 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) δ: 10.12 (1H, s, OH-14), 9.85 (1H, s, OH-4), 9.42 (1H, s, OH-10), 9.25 (1H, s, OH-2), 9.18 (2H, s, OH-3″5″, 9.15 (2H, s, OH-3′, 5′), 8.20 (1H, s, OH-8), 6.72 (1H, s, H-13), 6.42 (1H, s, H-9), 6.30 (1H, s, H-3), 5.83 (2H, t, J = 2.4 Hz, H-4′, 4″, 5.77 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2′ , 6′), 5.73 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2″ 6″. 13C- NMR (DMSO-d 6, 100 MHz) δ: 159.8 (C-1′), 159.5 (C-1″,158.6 (C-3″ 5″, 158.4 (C-3′, 5′), 150.4 (C-10), 149.9 (C-12a), 149.1 (C-11a), 146.5 (C-2), 146.1 (C-8), 144.3 (C-14), 141.6 (C-4), 136.4 (C-15a), 133.5 (C-5a), 125.9 (C-14a), 122.2 (C-1, 4a), 119.7 (C-11), 103.0 (C-7), 102.8 (C-6), 98.7 (C-9), 97.8 (C-3), 96.1 (C-4″, 95.9 (C-4′), 94.4 (C-13), 93.3 (C-2′), 93.3 (C- 6′), 93.1 (C-2″ 6″ ; see 표 4 및 도 8.
화합물 6(di엑콜, DE): pale brown powder, FAB-MS m/z 743 [M + H]+. C36H22O18.1H-NMR (DMSO-d 6, 600 MHz) δ: 9.65 (1H, s, OH-9), 9.55 (1H, s, OH-9″, 9.45 (1H, s, OH-4″, 9.40 (1H, s, OH-4), 9.31 (2H, s, OH -3 5, 9.23 (1H, s, OH-2″, 9.18 (1H, s, OH-2), 9.17 (1H, s, OH-7″, 9.10 (2H, s, OH-3′, 5′), 6.16(1H, s, H-3″), 6.14(1H, s, H-3), 6.02 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 5.99 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8″, 5.95 (2H, s, H-2 6, 5.82 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-6), 5.81 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-6″, 5.80 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-4′), 5.72 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2′, 6′). 13C-NMR (DMSO-d 6, 100 MHz) δ: 160.2 (C-1′), 158.7 (C-3′) 158.6 (C-5′), 155.8 (C-1, 154.2 (C-7), 153.0 (C-7″, 151.1 (C-3 5, 146.0 (C-2, 9″, 145.8 (C-2″ 9), 142.5 (C-5a″, 142.3 (C-5a), 141.9 (C-4″, 141.8 (C-4), 137.2 (C-10a), 137.0 (C-10a″, 124.2 (C-4, 124.0 (C-9a), 123.2 (C-4a), 123.1 (C-4a″, 122.6 (C-9a″, 122.2 (C-1, 1″, 98.3 (C-3), 98.2 (C-3″, 98.0 (C-8, 8″, 96.1 (C-4′), 94.4 (C-2 6, 93.8 (C-6″, 93.6 (C-2′, 6′), 93.5 (C-6) see 표 4 및 도 9.
< 실험예 7>
에틸아세테이트 순차분획물에서 분리된 화합물 1- 6 의 Spectroscopic 특성
하기 표 4는 에틸아세테이트 순차분획물에서 분리된 화합물 1-6의 NMR 수치 및 데이터이다.
분리된 플로로탄닌(1-6) in DMSO-d 6에 대한 13C NMR (600MHz) 데이터
Position 화합물 1 화합물 2 화합물 3 화합물 4 화합물 5 화합물 6
1 123.4 122.4 122.2 146.3 122.2 122.2
2 146.1 146.8 145.8 98.8 146.5 146.0
3 98.4 98.2 98.3 153.3 97.8 98.3
4 142.1 141.9 141.8 93.9 141.6 141.8
4a 122.5 122.6 123.1 142.1 122.2 123.2
5a 142.8 133.6 142.3 125.9 133.5 142.3
6 93.8 103.1 93.4 140.1 102.8 93.5
7 153.2 102.4 154.5 97.5 103.0 154.2
7a 137.2
8 98.7 150.2 98.1 146.1 98.0
8a 122.6
9 146.3 98.0 145.9 146.1 98.7 145.8
9a 122.9 123.9 124.0
10 157.6 98.8 150.4
10a 137.4 137.0 137.2
11 90.5 153.0 119.7
11a 158.2 149.1
12 93.9
12a 150.4 141.7 149.9
13 94.6 94.4
13a 122.4
13b 131.6
14 144.3 144.3
14a 126.1 122.2 125.9
15a 136.8 136.4
1' 160.6 160.2 160.2 159.8 160.2
2' 93.9 93.7 93.6 93.3 93.6
3' 159.0 158.8 158.7 158.4 158.7
4' 96.4 96.3 96.2 95.9 96.1
5' 159.0 158.8 158.7 158.4 158.6
6' 93.7 93.7 93.6 93.3 93.6
1 122.5 159.5 122.2
2 151.3 93.1 145.8
3 94.8 158.6 98.2
4 154.7 96.1 141.9
4a 123.1
5 94.7 158.6
5a 142.5
6 154.8 93.1 93.8
7 153.0
8 98.0
9 146.0
9a 122.6
10a 137.0
1 155.8
2 94.4
3 151.1
4 124.2
5 151.1
6 94.4
< 실험예 8>
MRSA 에 대한 대황에서 분리된 플로로탄닌들에 대한 MIC 수치
표 5은 플로로푸코푸로엑콜-A 및 β-락탐에 대한 MIC 결과이고, 표 6은 플로로대황에서 분리된 플로로탄닌들에 대한 MIC 결과이다.
Figure 112012048201619-pat00004
Figure 112012048201619-pat00005
EK, 엑콜 FF, 푸코푸로엑콜-A; PE, 7-플로로엑콜 DD, 디옥시노데히드로엑콜 PFF, 플로로푸코푸로엑콜-A; DE, 디엑콜.
< 실험예 9>
MSSA 및 MRSA 에 대한 PFF 와 β- lactam 계 항생제의 시너지 효과
하기 표 7은 MSSA 및 MRSA 에 대해 분리된 플로로탄닌 중에서 비교 상대적으로 항균활성이 높은 플로로푸코푸로엑콜-A와 β-lactam계 항생제의 시너지 효과에 대한 결과이다.
Figure 112012048201619-pat00006
A, 플로로푸코푸로엑콜-A 없음; B 내지 C 및 b 내지 c, 각각 12.5 및 25 /ml에서의 플로로푸코푸로엑콜-A. a) FIC index는 synergism ≤0.5, indifference >0.5 to ≤4, antagonism >4를 의미함.
상기 결과를 참조하면, PFF (25 /mL)은 β-락탐의 MRSA에 대한 MIC를 현저하게 감소시킨다. 즉, PFF의 존재 하에서 베타 락탐계 항생제들은 항균 활성이 복구된다는 것을 의미한다. 이 결과는 MRSA에 대한 반코마이신(2 /mL)의 결과보다 낮은 것으로서, 이를 통해 PFF가 항생제 내성균의 제어를 위한 대체 식물요법제(phytotherapeutic)와 같은 치료제 개발에 이용 가능한 것으로 판단된다.
< 실험예 10>
MRSA 에 대해 PFF 에 의한 cell morphology
도 10은 MRSA에 대해서 PFF가 cell morphology에 대한 영향을 농도별로 처리하여 SEM 으로 찍은 사진이다. 도 11에서 (A) KCCM 40510 (B) KCCM 40511이고, (a) 대조군, x30,000 확대 (b) 플로로푸코푸로엑콜-A 16 μg/mL로 처치 (c) 플로로푸코푸로엑콜-A 32 μg/mL로 처치 (d) 플로로푸코푸로엑콜-A 64 μg/mL로 처치한 결과이다.
< 실험예 11>
약재내성에 관련이 있는 PBP2a 단백질의 발현에 유전자 전사에 미치는 PFF 의 억제영향
도 11 및 12은 PFF가 유전자 전사와 약재내성에 관련이 있는 PBP2a 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 RT-PCR과 western blot을 이용하여 확인한 결과이다. PBP2a의 합성에 관여하는 mec operon (mecA, mecI, mecR1)의 유전자 전사가 플로로푸코푸로엑콜-A에 의한 농도 의존적 저해가 관찰되었다. 또한, mecA 유전자의 최종 생산물인 PBP2a 합성도 플로로푸코푸로엑콜-A 농도 의존적으로 억제되는 것을 western blot을 통해 확인하였다. 이러한 결과로부터 플로로푸코푸로엑콜-A가 직접적으로 MRSA에서 ß-락탐계 항생제의 세포내 수송을 억제하는 PBP2a 단백질의 합성을 저해함으로서 ß-락탐계 항생제에 대한 항생제 감수성을 회복시킨다는 결론을 도출하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 대황(Eisenia bicyclis)의 메탄올 조추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 및 정제하여 수득한 7-플로로엑콜(phloroeckol), 푸코푸로엑콜(fucofuroeckol)-A 및 디옥시노데히드로엑콜(dioxinodehydroeckol)을 유효성분으로 포함하는 메티실린계 내성 황색포도상구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 항균성 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 메티실린계 내성 황색포도상구균에서 PBP2a 단백질의 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 ß-락탐계 항생제를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적, 화장학적, 식품학적 조성물의 유효성분인 것을 특징으로 하는 조성물.
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